JPH0228603B2

JPH0228603B2 -

Info

Publication number: JPH0228603B2
Application number: JP56104198A
Authority: JP
Inventors: Masao Karya; Eijiro Tagami; Hisanori Kanayama
Original assignee: Japan Synthetic Rubber Co Ltd
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1981-07-02
Filing date: 1981-07-02
Publication date: 1990-06-25
Also published as: JPS585658A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は光学的測定装置に適用する免疫血清学
的検査試薬（以下検査試薬と記す。）用担体に関
する。近年、医療分野に於て疾病の診断のために微量
物質、特に抗原及び抗体を迅速、簡便、精度よく
定量することが非常に重要な課題となつている。
さらに血液が被検体の場合にはできるだけ少量の
血液で検査定量できる方法が望まれており、特に
小児科領域での免疫化学的測定の場合にはその要
求が非常に強いのが現状である。抗原又は抗体などの血清学的活性物質を担体に
吸着あるいは結合させて（以下本操作を感作と記
す）免疫血清学的凝集反応若しくは凝集抑制反応
を行い、対応する抗体又は抗原などの存在を検査
する免疫血清学的検査は簡便かつ鋭敏な方法であ
り広く利用されている。この検査試薬用担体とし
てポリスチレンなどの重合体粒子を用いることは
よく知られたことである。さらにスルホン酸基、
アミド基などの官能基で変性した重合体粒子も用
いられている（例えば、特開昭55−131008号公
報、特公昭56−9161号公報）。これらの検査試薬
用担体に要求される性能としては、抗原又は抗体
などを検査試薬用担体に感作した検査試薬のラテ
ツクス状態でのコロイド化学的安定性と免疫血清
学的凝集反応性とが挙げられる。しかし検査試薬
のラテツクス状態でのコロイド化学的安定性を向
上させると免疫血清学的凝集反応性は低下し（感
度の低下）、逆に免疫血清学的凝集反応性を高め
るためにコロイド化学的安定性を低下させると非
特異的に凝集し実用に供し得なくなる。このよう
に互いに相反するコロイド化学的安定性と免疫血
清学的凝集反応性とを同時に満足させる検査試薬
用担体を得ることは従来極めて困難であつた。特に近年、免疫血清学的検査の分野において抗
原又は抗体などの微量物質を定性的だけではなく
定量的に測定することが重要な課題となつてい
る。従来は検査試薬をラテツクス状態でガラス板
上で被検体と混合し反応させ、検査試薬の凝集状
態を肉眼で観察することによつて検査目的物質を
定性的に検出していたが、この凝集状態を肉眼で
観察することの代りに光学的測定装置、例えば分
光光度計、濁度計、準弾性光散乱測定装置などを
用いて光学的特性値を測定することによつて定量
的に検出しようとする試みが多くなされている。
例えば検査試薬が凝集する現象を利用して上澄液
の濁度の減少率を測定する方法及び検査試薬の凝
集による吸光度や散乱強度を測定する方法などが
知られている（CROATICA CHEMICA ACTA
42（1970）P.457〜466、Immunochemistry12
（1975）P.349〜351、特開昭53−24015、同54−
109494など）。これらの方法は検査試薬の免疫血
清学的凝集反応による反応系の吸光度、散乱光強
度などの光学的特性値を測定することによつて定
量化しようとするものであるが、いずれの方法も
凝集反応による反応系の光学的特性の変化が小さ
いために精度、再現性などに問題があつた。また
検査試薬の光学的特性の経時変化がしばしば起
り、実用上支障を生じるという問題もあつた。本発明者らは上記問題を改善すべく鋭意研究し
た結果、光学的測定装置に適用する検査試薬用担
体として有用な重合体粒子を見出し本発明を完成
した。本発明の目的は良好なコロイド化学的安定性と
免疫血清学的凝集反応性を具備し凝集反応又は凝
集抑制反応による反応系の光学的特性の変化を光
学的測定装置により測定し、検査目的物質の定量
的検出を良好な感度でもつて可能ならしめる検査
試薬用担体を提供することにある。本発明に従つ
て、一般式および（式中、R¹は水素原子又はメチル基であり、
R²は水素原子、メチル基又はハロゲン原子であ
り、R³は水素原子、メチル基、カルボキシメチ
ル基、カルボキシル基、又はアルキル部分の炭素
原子数が１〜12個のアルコキシカルボニル基であ
り、R⁴は水素原子又はカルボキシル基であり、
R⁵は水素原子、メチル基、ハロゲン原子であり、
R⁶はハロゲン原子、アルキル部分の炭素原子数
が１〜12個のアルコキシカルボニル基又はシアノ
基である）で表される単量体単位を、それぞれ70〜99.5重量
％、０〜0.5重量％未満及び０〜29.5重量％含む
ランダム共重合体からなる重合体粒子であつて、
その平均粒子径が0.1〜2μｍであり、該重合体が
過硫酸塩0.1〜5.0重量部及び乳化剤０〜0.05重量
部の存在下、該重合体を構成する単量体100重量
部を連続的に、又は逐次的に添加して乳化重合す
ることにより製造されるものであることを特徴と
する光学的測定装置に適用可能な免疫血清学的検
査試薬用担体が提供される。以下に本発明を詳細に説明する。本発明の検査試薬用担体である重合体粒子は、
一般式（），（），（）の構造を有する共重合
体である。一般式(1)を生じる単量体としては、例えばスチ
レン、α−メチルスチレン、ビニルトルエンがあ
り、特にスチレンが好ましい。一般式(2)を生じる単量体としては、例えばアク
リル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン
酸、フマール酸などがあり、特にアクリル酸、メ
タクリル酸が好ましい。一般式(3)を生じる単量体としては、例えばアク
リル酸メチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸−
２−エチルヘキシル、メタクリル酸メチル、メタ
クリル酸ブチル、メタクリル酸ラウリル、アクリ
ロニトリル、ハロゲン化ビニル化合物などがあ
る。一般式(1)，(2)，(3)の構成割合は、それぞれ70〜
99.5重量％、０〜0.5重量％未満、０〜29.5重量％
である。(1)の成分が70重量％未満では、本発明の
免疫血清学的検査試薬用担体用重合体粒子として
適さない。また、(2)の成分が0.5重量％以上では
免疫血清学的な感度が不十分である。また、本発明の検査試薬用担体である重合体粒
子の平均粒子径は0.1〜2μｍが使用できる。特に
好ましくは0.2〜1.3μｍである。粒子径の分布は
狭い方が望ましい。平均粒子径が0.1μｍ未満もし
くは2μｍを越えた場合は、光学的特性値を測定
するときに精度が低下する傾向がある。上記重合体粒子は単量体100重量部に対して乳
化剤を0.05重量部以下使用し又は使用しないで、
好ましくは乳化剤を0.02重量部以下使用し又は使
用しないで乳化重合することによりラテツクス状
態で得られるものである。乳化剤を0.05重量部を
越えて用いた場合は、検査試薬として被検体と抗
原−抗体反応を行ない光学的測定装置で反応系の
光学的特性値を測定してもその精度が悪くかつ再
現性も悪いために被検体中の抗原又は抗体を定量
的に測定することができない。このような理由か
ら乳化剤を使用しない乳化重合により製造する方
法が最も好ましい。上記重合体粒子の製造方法の実施態様としては
芳香族ビニル化合物を主成分とする単量体100重
量部にアルキルメルカプタン0.2〜2.0重量部を混
合し、これを過硫酸塩0.1〜５重量部、乳化剤０
〜0.05重量部を含む水中に一括して又は連続的に
もしくは逐次添加して重合する方法を挙げること
ができる。単量体100重量部にアルキルメルカプタン0.2〜
2.0重量部を混合する際、単量体に一括混合して
もよいし単量体の一部にアルキルメルカプタンを
混合してアルキルメルカプタンを混合しない単量
体と同時に一括して又は連続的にもしくは逐次添
加してもよい。アルキルメルカプタンが0.2重量
部未満の場合は重合中に多量の凝固物が生成しや
すく、2.0重量部を越える量を加えても重合中に
凝固物が生成しやすくなる。アルキルメルカプタ
ンとしては例えばｎ−オクチルメルカプタン、ｎ
−デシルメルカプタン、ｎ−ドデシルメルカプタ
ン、ｔ−ドデシルメルカプタンなどの長鎖アルキ
ルメルカプタンがあり、アルキル基の炭素数は８
〜16が適当である。過硫酸塩としては例えば過硫酸アンモニウム、
過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウムなどを挙げる
ことができる。使用量は0.1〜５重量部が好まし
い。0.1重量部未満では重合速度が著しく遅くな
る。５重量部を越えて用いると重合体粒子の粒子
径分布が広くなり好ましくない。重合温度は50〜100℃が好ましく、特に60〜90
℃が好ましい。50℃未満の温度では重合速度が遅
く重合体粒子の粒子径分布が広くなる傾向があ
る。単量体とアルキルメルカプタンの混合物は連続
的に又は逐次添加することが望ましい。混合物を
３時間未満で添加し終ると、得られた重合体粒子
を検査試薬用担体として用いた場合、経時的に感
度が低下しやすくなる。また添加が20時間を越え
ると重合体粒子の粒子径分布が広くなる場合があ
り好ましくない。好ましくは10〜15時間で連続的
に又は逐次添加することである。上記混合物の添加は重合溶液の液面上より滴下
または流下して行なつてもよいし、また液面下よ
り注入してもよい。また、混合物の添加は所定の
時間内に均等にかつ連続的に行なわれるが、場合
により実質的に連続添加と見なし得る程度に間欠
的にすなわち逐次添加してもよい。乳化剤を使用する場合の乳化剤としてはドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸
ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシ
ルジフエニルオキサイドジスルホン酸ナトリウム
などの陰イオン乳化剤およびポリオキシエチレン
ラウリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフ
エノールエーテルなどの非イオン性乳化剤などを
挙げることができ、これらは単独又は組合せて用
いることができる。これらの内、特に好ましい乳
化剤はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、
ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルジフエニルオ
キサイドジスルホン酸ナトリウムである。重合終了後に必要に応じて脱単量体のためのス
トリツピングもしくは濃度調整のための希釈また
は濃縮を行なうことができる。また、上記により
得られるラテツクス中の重合体粒子を検査試薬用
担体として用いる場合、通常感作前に遠心分離、
限外過などの方法でラテツクス中に混在する低
分子量重合体や不純物を除去する操作を行なう。
なお本発明の検査試薬用担体及び感作することに
より得られる検査試薬は、通常水中に分散した状
態、すなわちラテツクス状態で保存するが、凍結
乾燥しておいてもよい。凍結乾燥するためにはラ
テツクスに安定剤として各種アミノ酸類、特にグ
リシン及びグルタミン酸ナトリウムをそれぞれ
0.2〜２重量％並びにデキストランを0.3〜３重量
％を加えて液体窒素あるいは液体空気中などで急
速凍結してから凍結乾燥する。上記検査試薬用担体に抗原又は抗体を感作する
ことによつて得られる検査試薬と被検体とを混合
し、抗原−抗体反応を行ない、光学的測定装置を
用いて定量的に検査目的物質を検出する方法は特
に限定するものではないが、例えば本発明者らが
見出した次記の方法が好ましいものということが
できる。すなわち上記検査試薬用担体に抗原又は抗体を
感作した検査試薬と被検体とを液体媒体中で反応
せしめ、次いで該反応混合物中の該検査試薬の濃
度が0.05重量％以下になるように希釈し、この希
釈された反応混合物に190〜600nmの波長の光を
照射して光学的特性値を測定し、あらかじめ同様
の方法で求めてある既知量の検査目的物質と光学
的特性値との関係と比較することによる抗原又は
抗体の定量的測定方法である。この方法は検査試薬量及び被検体量が微量であ
つてもその反応混合物を希釈する工程を含むため
に十分に光学的特性値を測定することができ小児
科領域などにおける貴重な被検体を節約すること
ができる。また、抗原−抗体反応を比較的高濃度
で行なうために、反応完了までに要する時間が短
かく迅速に定量的に高精度で測定することがで
き、また従来実用化されていた放射免疫反応によ
る定量的測定と異なり非常に安全な方法である。
さらにこの方法は単に抗原又は抗体のみではなく
ハプテンのごとき不完全抗原も高精度で定量的に
測定することができる。なお、本発明の検査試薬
用担体以外の担体を用いてこの測定方法を適用し
ても良好な結果を得ることができない。次にこの測定方法を詳細に説明する。本発明の検査試薬用担体に抗原又は抗体を感作
する方法は通常用いられている方法を適用するこ
とができ、抗原又は抗体が物理的に吸着されてい
てもよく、また化学的に結合されていてもよい。
さらにハプテンのような不完全抗原を感作すると
きに検査試薬用担体をカツプリング剤などで化学
的に変性した後感作してもよい。検査試薬と被検
体を反応させる液体媒体としては水が最適である
が、水と水溶性有機溶媒との混合物も使用するこ
とができ、水溶性有機溶媒としては例えばメタノ
ール、エタノール、アセトンなどを挙げることが
できる。検査試薬と被検体を反応させるときの液体媒体
中の検査試薬濃度は通常0.05重量％以上、好まし
くは0.1〜５重量％、特に好ましくは0.3〜２重量
％である。検査試薬濃度が高い程、反応時間は短
くなり検査目的物に対する感度が向上するが、５
重量％を越えると操作上の誤差が生じやすくな
る。反応は通常１時間以内に終了する。反応終了後、反応混合物中の検査試薬濃度が
0.05重量％以下通常0.002〜0.05重量％になるよう
に緩衝液などで希釈し、190〜600nmの波長の光
を照射して光学的特性値を測定する。希釈した反
応混合物中の検査試薬濃度が0.05重量％を越える
と光学的測定値の信頼性が低下する。また光学的
特性値を測定するために照射する光の波長が190
〜600nm以外の場合は被検体中の検査目的物質の
量の多少による光学的特性値の違いがほとんどな
く検査目的物質の定量を行なうことができない。
好ましい波長は200〜600nm特に250〜500nmであ
る。希釈した反応混合物の光学的特性値を測定す
るときの反応混合物の光路長は特に限定するもの
ではないが検査試薬及び被検体の使用量及び測定
の容易さを考慮すると0.5〜10mm、特に２〜５mm
が好ましい。上記によつて測定した光学的特性値はあらかじ
め同様の方法で求めてある既知量の検査目的物質
と光学的特性値との関係と比較することによつて
被検体中の検査目的物質の量を求めることができ
る。なお、上記光学的特性値とは吸光度、吸収度、
吸光率又は散乱強度などを意味するものである。本発明の検査試薬用担体は、コロイド化学的安
定性と免疫血清学的凝集反応性を具備し、抗原−
抗体反応による凝集反応又は凝集抑制反応を光学
的測定装置で測定し検査目的物質の定量的検出を
良好な感度で可能とすることができ極めて優れた
検査試薬用担体である。次に本発明の実施例を示す。なお実施例に於い
て部及び％は重量による。実施例１及び比較例１（重合体粒子の製造）撹拌機、冷却コイル、温度検出器、ジヤケツト
などを装備したステンレス製反応器（容量５）
を窒素置換した。次いで試料番号１，２，９及び
10の場合は第１表記載の成分を仕込み撹拌しなが
ら80℃で24時間重合した。また試料番号３の場合
は第１表記載の蒸留水、過硫酸カリウム、ドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム、スチレンスル
ホン酸ナトリウムを仕込み80℃にした後、スチレ
ン、メタクリル酸などのモノマー及びｔ−ドデシ
ルメルカプタンの混合液を10時間かけて連続的に
仕込みさらに90℃で３時間重合した。試料番号４
〜８及び11の場合は、スチレン94.7〜100部中の
20部を蒸留水、触媒、乳化剤とともに仕込み、80
℃で１時間反応させた後、残りのモノマー及びメ
ルカプタンを連続的に仕込んで反応させたほか
は、試料番号３と同様に重合した。いずれの場合
も重合転化率は98％以上であつた。得られたラテ
ツクスを水酸化ナトリウムでPH９に調整し、さら
にスチームストリツピング及び減圧蒸留で残留未
反応単量体を除去した。得られたラテツクスの重
合体粒子の平均粒子径を第１表に示す。重合体粒
子の粒子径は比較的揃つていた。試料の感度及び
非特異凝集性を第１表に示した。ここで、感度は
第１図における縦軸（吸光度差）の値が大で、か
つ横軸（希釈率）と直線的比例関係があるものを
◎で表わし、これが劣るものを×、その中間を
〇、△で表わした。非特異凝集性は、20名分をプ
ールした正常ヒト血清の1/40〜1/10の希釈率で、
吸光度差が0.02以下、0.02〜0.05、0.05〜0.1、0.1
以上を、それぞれ◎、〇、△、×で表わした。【表】【表】（熱会合免疫グロブリンＧ感作検査試薬の調製）１／15Mリン酸塩緩衝液（PH7.2）１容と生理
食塩液３容との混合液（以下PBSと記す）に実
施例１及び比較例１で得た試料番号１〜５号のラ
テツクスの重合体粒子の濃度が0.25％になるよう
に懸濁し、これに熱会合免疫グロブリンＧの
200μｇ／ml液を等量加え、室温で60分間保ち感
作した。感作後10000rpm30分間遠心して重合体
粒子を分取し、PBSで洗浄した後希釈液（牛血
清アルブミン0.1％を含むPBS）に重合体粒子の
濃度が0.25％になるように懸濁して、熱会合免疫
グロブリンＧ感作検査試薬を得た。（リウマチ因子の測定）リウマチ因子陽性血清を10名分混合してプール
血清を調製し、これをPBSで１：10、１：20、
１：40、１：80、１：160及び１：320に希釈し
た。この希釈血清50μに前記検査試薬を50μ
加え37℃で60分反応させ、これにPBS1.15mlを添
加希釈後石英セル（光路長５mm）に入れ分光光度
計（日立製作所製モデル200−20型）を使用し吸
光度を測定した。測定波長は、300nmを用いた。
測定値は検査試薬にPBSを1225mlを加えたもの
の吸光度を基準にし、各希釈液の吸光度との差を
求めた。結果を第１図に示す。第１図から明らか
なように実施例１の試料番号１〜３で得た重合体
粒子を使用した検査試薬はリウマチ因子陽性血清
の希釈率によつて吸光度の差が大きく変化してい
ることがわかる。これに対して比較例１の試料番
号４〜５を使用した検査試薬はリウマチ因子陽性
血清の希釈率による吸光度の差が小さいことがわ
かる。すなわちリウマチ因子（抗体）量と吸光度
変化に相関関係が存在することを示しており、あ
らかじめ第１図のように標準検量線を作成してお
き被検体を用いて同様に吸光度を測定することに
より被検体中の抗体量を高精度で測定できること
がわかる。実施例２（重合体粒子の製造）実施例１、試料番号３と同様にしてスチレン98
％、メタクリル酸２％を重合し、平均粒子径0.7μ
ｍの重合体粒子を得た。（抗β₂ミクログロブリン抗体感作検査試薬の調
製）濃度100μｇ／mlの抗β₂ミクログロブリン抗体の
PBS溶液と上記重合体粒子の濃度が0.62％の懸濁
液を等量混合し、室温で60分間保ち感作した。感
作後4000rpm15分遠心分離して重合体粒子を分取
しPBSで洗浄した後希釈液（牛血清アルブミン
0.1％を含むPBS）に重合体粒子濃度が0.62％に
なるように懸濁して抗β₂ミクログロブリン抗体感
作検査試薬を得た。（β₂ミクログロブリンの測定）上記で調整した検査試薬50μを小試験管にと
りこれに第２図に示す濃度のβ₂ミクログロブリン
抗体のPBS溶液50μを加え混合し室温にて60分
間保つた後PBS1.15mlを添加、石英セル（光路長
５mm）に入れ370nm及び60nmの波長の吸光度を
分光光度計を用いて測定した。その結果を第２図
に示す。この結果からβ₂ミクログロブリン量と吸
光度差との間に相関関係が存在することがわか
る。実施例３（熱会合免疫グロブリンＧ感作検査試薬の調整）濃度500μｇ／mlの熱会合免疫グロブリンの
PBS溶液と実施例２で製造した重合体粒子の0.62
％懸濁液を等量づつ混合し室温にて60分間保ち感
作と行つた。感作後4000rpm15分間遠心分離して
重合体粒子を分取しPBSで洗浄した後希釈液
（牛血アルブミン0.1％を含むPBS）に重合体粒子
濃度が0.62％になるように懸濁して熱会合免疫グ
ロブリンＧ感作検査試薬を得た。（リウマチ因子の測定）実施例１に述べた方法に従つて行つた。測定は
400、500、600nmで行いブランク（血清を添加し
ないもの）との吸光度差と血清中のリウマチ因子
の濃度との関係を第３図に示す。この結果からリ
ウマチ因子（抗体）量と、吸光度差の間に明白な
相関関係が存在することがわかる。また短波長側
で測定する方がより鋭敏に測定できることを示し
ている。これらの事実から上述の方法を用いれ
ば、被検体中の抗原又は抗体の標準検量線をあら
かじめ作製しておけば抗原−抗体反応により生じ
た検査試薬凝集塊を含む被検体液の吸光度を測定
することにより目的とする被検体中の抗原又は抗
体量を高精度で定量することができることがわか
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１及び比較例１で求めたリウマ
チ因子陽性血清の希釈率と吸光度差の関係を示
す。第２図は実施例２で求めたβ₂ミクログロブリ
ン濃度と吸光度差の関係を示す。第３図は実施例
３で求めたリウマチ因子陽性血清の希釈率と吸光
度差の関係を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式および（式中、R¹は水素原子又はメチル基であり、
R²は水素原子、メチル基又はハロゲン原子であ
り、R³は水素原子、メチル基、カルボキシメチ
ル基、カルボキシル基、又はアルキル部分の炭素
原子数が１〜12個のアルコキシカルボニル基であ
り、R⁴は水素原子又はカルボキシル基であり、
R⁵は水素原子、メチル基、ハロゲン原子であり、
R⁶はハロゲン原子、アルキル部分の炭素原子数
が１〜12個のアルコキシカルボニル基又はシアノ
基である）で表わされる単量体単位を、それぞれ70〜99.5重
量％、０〜0.5重量％未満及び０〜29.5重量％含
むランダム共重合体からなる重合体粒子であつ
て、その平均粒子径が0.1〜2μｍであり、該重合
体が過硫酸塩0.1〜5.0重量部及び乳化剤０〜0.05
重量部の存在下、該重合体を構成する単量体100
重量部を連続的に、又は逐次的に添加して乳化重
合することにより製造されるものであることを特
徴とする光学的測定装置に適用可能な免疫血清学
的検査試薬用担体。