JPH01118770A - タンパクの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固相免疫反応を用いた体液中のタンツクの定
量方法であって、免疫反応のツートナーを固相に結合し
、反応を界面活性剤の存在下に行うことより成る方法、
およびこの目的のための界面活性剤の使用に関する。

免疫グロブリンおよびその他の血清タンノ９りの定量に
は多くの比濁方法および濁度測定方法が知られている。

これらの検出下限は約５μｐｒｔｔｌである。この感度
では多くの診断対象に対して不十分である。

インジケータ、または当該方法における免疫化学反応成
分の一方を負荷した担体粒子を用いることにより、免疫
学的測定方法の感度を高めることは知られている。担体
材料としては、例えば赤血球、細胞培養で得た細胞、ま
たは微粒子状ｌリマー、特にαｏ２〜５＃Ｉの直径のラ
テックス粒子、を用いることができる◎ このタイプの「粒子増感された」比濁または濁度測定ア
ッセイは、約５Ｏｎ？／−の濃度まで信頼性をもってタ
ン・セフを測定することができる。

抗原の測定には固相に結合された抗体が用いられ、また
抗体の測°定には固相に結合された抗原が用いられる。

いずれの場合にも、免疫反応によりポリマー粒子が凝集
する。この結果、凝集物のサイズが増し、また散乱光信
号または反応混合物の濁度が増す。

粒子増感比濁または濁度測定アッセイまたは酵素イムノ
アッセイにおいては、免疫反応は固相で起きる。検体か
らのタンパクの非特異的吸着がこれら固相の一つの性質
である。血清または他の体液からの被分析物質（ａｎａ
ｌｙｔｅ）を測定する場合、例えばアルブミン、グロブ
リンまたはりボタンバクが固相を覆ってしまうことがあ
る。

このため固相上の免疫反応性成分が隠されてしまうこと
がある。

体液中の微量タンノ々りを測定する際にはその結果、結
果が不正確であったり、低過ぎたりまた変動したりする
ことになる。しかしながら、不正確で高過ぎる測定値も
得られる。

従来の粒子増感試薬を用いた測定では両方のケース、す
なわち不正確で低過ぎたり、また不正確で高すぎる結果
が生じ、そのため信頼性かつ再現性のある測定の妨げと
なっている。

ＥＰ−Ａ　Ｏ，１３３，２７２（ＵＳ特許４，４４８，
９０８）は、可溶性ツートナーと固相に吸着されたパー
トナ−との間の免疫反応のインキュベーション媒質に洗
剤を好ましくは０．０１％までの濃度で添加することよ
り成る方法を開示している。

驚くべきことに、固相に結合された免疫反応におけるパ
ートナ−が共有結合的に結合されている粒子増感比濁式
または濁度測定式アッセイなどの固相免疫学的反応にお
ける「血清マトリクス」Ｋ由来する干渉は、式■ ｃＨｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ−（ｃＨ２−ｃＨ２−ｏ）ｎ
−ＨＩ（式中、ＲはＯ、ＮＨまたはＣＨ＝　ＣＨ−（Ｃ
Ｈ２）ｐ−０であり、そして、ｍは３〜２６であり、 ｎは７〜４０であり、そして ｐは５〜１５である） で示される化合物の存在下に測定を行うことにより回避
できることを見出した。

従って、本発明は、水性液体中に溶解されたパートナ−
の一方な固相に共有結合された他方のツク−トナーと反
応させる際Ｋｍ反応を前記のように定義された式！で示
される化合物の存在下に行わせることより成る、免疫反
応におけるパートナ−の測定方法に関する。

式■においてＲがＯまたはＣ）（＝ＣＨ−（ＣＨ２）、
−０であり、そして。が３〜２６であり、ｎが７〜４゜
であり、そしてｐが５〜１５である化合物が好ましく、
ｍが１５〜１７であり、ｎが２５でありそしてｐが６〜
８である化合物が特に好ましい。また、ｍが６〜８であ
り、ｎが２５であり、ｐが６〜８である化合物が最も好
ましい。

更に、ｐ−２５の重合度を有するポリエチレングリコー
ルでエーテル化されたパルミチルアルコールを２０〜３
５４．、ｔ？ポリエチレングリコールｐ＝２５）でエー
テル化されたステアリルアルコールを１５〜３０％、お
よびポリエチレングリコール（ｐ＝２５）でエーテル化
されたオレイルアルコールを６０〜６０チ含有し、そし
てＨｏｅｃｈｓｔ　ＡＧ社（西独、フランクフルト）か
ら”Ｇｅｎａｐｏｌ　Ｔ　２５０の名称で市販されてい
る式Ｉの化合物の混合物も特に好ましい。

もう一つの特に好ましい式Ｉの化合物の混合物は、　Ｓ
ｉｇｍａ社から”Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸの名称で市販され
ているものである。

式■の一種または複数種の化合物は、０．０１１７１０
０９以上、３Ｐ／１ｏｏｆ以下、好ましくは０．１〜１
２／１０（ｌの液体濃度が得られる量で添加される。

反応混合物は、更に、アミノ酸、好ましくはグリシン（
好ましい濃度は０．０５〜［１２モル／ｌ）、中性塩、
好ましくは塩化す）　ＩＪウム（濃度は１０５〜０．５
モル／ｌ＞、ｔｅリエチレングリコール好ましい濃度は
４ｆ／１０（１）および／またはエイコサオキシエチレ
ンソルビタンラウレート（’Ｔｔｖｅｅｎ　２０）　（
好ましい濃度は０．２〜１　ｆ／１００　ｆ）を含有す
ることもできる。

式Ｉの化合物は、好ましくは、０１Ｍグリシン緩衝液（
ｐＨ８，０）に添加される。被検血清とのインキュベー
ションは好ましくは、室温で約３０分間行われ、そして
測定は好ましくは比濁計を用いて行われる。

共有結合された反応成分を用いると吸着された反応成分
の非特異的脱着が可能となり有利である。５ｆ／ＩＧＯ
ｒ以下の洗剤濃度を用いると、干渉作用に関する洗剤の
効果が極め℃−段と大きくなり、またこのようＫして、
干渉要因の除かれた比濁式、または濁度測定式粒子増感
アッセイを行うことができる。

同相として特に適しているのは分散液状のラテックス粒
子である。

かかる粒子への抗体または抗原の共有結合には、例えば
活性化エステルに変えることができ、またはカルゼジイ
ミドで活性化することができ、そして抗体または抗原と
反応できるカルゼキシ　゛ル基を有するラテックスを用
いることができる。

しかしながら、エポキシ、アルデヒドまたは芳香族アミ
ノ基を有するラテックスを用いることも可能であり、ア
ルデヒＰ基の場合には還元アミン化、そして芳香族アミ
７基の場合にはジアゾ化により共有結合を生じさせるこ
とができる。

ＥＰ−Ａ　Ｏ，０８０，６１４Ｋ記載されているように
、固相に結合された抗体または抗原は、抗体または抗原
をアセタール基を有するラテックスと反応させて調製す
るのが好ましい。

好ましくは固相に結合される抗体は、α−フェトプロテ
ィン（ＡＦＰ）、フェリチン、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）
、ミオグロビン、β−２マイクログロブリンまたは免疫
グロブリンＥに対するものである。

このようにして得られるＡＦＰアッセイを式Ｉの化合物
を用いずに行うと、すべてに２００ｎＳ’／ｍ／ＡＦＰ
を加えである２ｏの異なる血清について得られる結果は
大きく変動する（第１表）。平均して使用ＡＦＰの９Ｑ
、８％しか検出されない。変動係数は１７．５１と極め
て高い。

これに対し、そのＡＦＰアッセイを、Ｉ　Ｐ／１００ｍ
ｌ　”Ｃ）ｅｎａｐｏｌを添加して行うと、２００　ｎ
ｆ／１ｔｔ１入／１ｔｔえである２０の異なる血清につ
いて認められる結果は、血清にかかわらず常に正確であ
る、すなわち、導入されたＡＦＰの量が再び検出される
。（第１表参照） 第１表 比濁アッセイ測定（ＡＦＰ添加濃度：　２００ｎｔ／ｄ
）ＡＦＰ検出濃度（ｎシ曾） ２　　　　　　　　　１８１　　　　　　　　　　１９
Ｂ１８　　　　　　　　　１７５　　　　　　　　　　
　１８Ｂ平均測定値：　　　　１８１６　　　　　　　
１９６．６変動係数：　　　　　１７．５１　　　　　
　　４．７％回収率：　　　９α８チ　　　　　９８％
導入されたＡＦＰの平均回収率は９８チである。

変動係数は極めて低り４．７　％である。ＡＦＰ　９度
の回収率は正しい。

本発明のよ５に界面活性剤を添加しないＡＦ’Ｐアッセ
イの欠点は、従来技術の比濁式および濁度測定式測定に
より得られる結果がＡＦＰ存在濃２度とよく一致しない
という事実からも明らかである。実施例３におけるごと
くラテックスを用いた従来技術の比濁式ＡＦＰ測定は、
回帰分析において０．９１０の相関係数および０．８３
の勾配を有し、ＡＦＰ導入濃度に比べ満足できるもので
はない。

これに対し、同数の比濁式ＡＦＰ測定を本発明に従って
界面活性剤、すなわち”（）ｅｎａｐｏｌ　（アッセイ
緩衝液中ＩＰ／１０（１）を添加して行うと、患者血清
に導入されたＡＦＰ　ｉの回収は満足できるものである
。回帰分析における勾配は０．９９であり、また相関係
数は０．９９８である。

更に・従来技術による比濁式フェリチン測定を行い１結
果を酵素イムノアッセイ（ＡｂｂＯｔｔ社）からのもの
と比較した。それら二方法間の照合は潰延のいくもので
はない。回帰分析はα７６４の勾配および０．７２６の
相関係数を有する。血清コレクションに対する二方法間
の平均偏差は４６チである。

これに対し、このタイプのフェリチンアッセイを”Ｇｅ
ｎａｐｏｌ　（ア７−４＝イ緩衝液中１ｇ／１０（１）
を用いて行なうと、酵素イムノアッセイの結果との照合
は良いものとなる。回帰分析は０．９４５１’）勾配お
！びｏ、８５７の相関係数を示す。血清コレクションに
対する二方法間の平均偏差は２０ｍである。

以下実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ ｔ　シード・ポリマーの調製 気体導入管および気体流出管、および磁気攪拌棒を備え
た円筒状ガラス容器に３１０ｗＲ１の窒素飽和再蒸留水
を入れた。これに５００ダのステアリン酸ナトリウムを
添加しそして攪拌により溶解した。次いでこれに１５ｄ
の２５チ強度アンモニアを添加した。−Ｉをチエツクし
たところ１ｔ０９であった。排気を繰り返しそして窒素
を充填することにより重合容器から酸素を除去した。連
続的に攪拌しながら、水浴を用いてその洗剤溶液を＋７
０℃に加熱した。次に、等圧化滴下漏斗を用いて９０ｍ
１の蒸留したばかりのスチレンを窒素下に重合容器に導
入した。その混合物を＋７０℃で更に１５分間攪拌して
そのスチレンを乳化した。次にその温度を＋９０℃まで
高め、そして攪拌を１時間続けた。次いでそこに、５０
ｔｘｌの窒素飽和蒸留水に溶解された６Ｚ５＃のカリウ
ムベルオキソジサルフエートを添加した。その混合物を
＋９０℃で１３０分間放置攪拌した。

ポリスチレンをひだ付きフィルターに通した。′場合に
よってはこれにより数ｍｌのスチレンがフィルター上に
残る。このスチレンは幾分過剰に存在したため、ポリス
チレンに完全には溶解できなかったものであった。

濾過されたＩリスチレンを１ｏｌの０．０１４強度重炭
酸アンモニウム溶液（０，０１％ＮＨ４ＨＣＯ３；０．
０１重量％　ＮａＮ３含有；１０ＪＫ対し１α５＃！ｌ
の２５重ｉ％アンモニアで一１ａ、０に調整）ＶＣ対し
て５０時間透析した。透析後、４１０−のポリマー（乾
重量１７．９　？／ｄｔ　）を得た。このようにして、
使用モノマーの約８５俤が重合した。これに対し、重合
時間を５〜１０分だけ短縮することにより、完全重合ス
チレンの割合を下げると同時にポリスチレンに溶解され
たモノマーを増加させることかできた。

２、　　Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）メタク
リルアミドの合成 ４．６５Ｆの３−アミノ−１，２−プロパンジオール（
０，０５モル）を３０ｄのジメチルホルムアミＰ（無水
）Ｋ溶解した。この溶液と１′５．８ｆノに２Ｃｏ５を
、滴下漏斗および気体導入管および気体流出管を設けた
１００１１ｔｌ容三つロフラスコに入れた。

その混合物を水浴中で０℃まで冷却した。ゆるやかに攪
拌しながら、そして窒素を徐々に通じながら、５０ｄの
ジメチルホルムアミドに溶解された６、１８−のメタク
リロイルクロライ°ド（０，０６モル）を３０分間かけ
て滴加した。その混合物を氷冷しながら、更に１時間攪
拌し、次いで室温まで昇温させ、そして更ＩＣ３０分間
攪拌した。

その反応混合物をひだ付きフィルターを通して炉遇し、
そして残分を捨てた。炉液を回転蒸発器で濃縮して粘稠
油を得た。この油状物を３０−のメタノールに溶解し、
２回目の濾過を行い、そしてその炉液を再び回転蒸発器
で濃縮した。

溶媒残分な高度真空下に除去した。収量は８．５２２で
あった。

３、　シード・ポリマー上でのＮ　−（２，３−ジヒド
ロキシプロピル）メタクリルアミド（ＮＤＰＭ）の重合 実施例１の如く調製された２　１．７５−のポリスチレ
ンラテックス分散液（固体分１８．３９重量％）、およ
び５７．２５ｔｘｔの蒸留水および５０ダのＰデシル硫
酸す）　ＩＪウムを気体導入管および気体流出管および
磁気攪拌棒を設けた円筒状ｊラス容器に入れそして攪拌
して溶解した。排気を繰り返しそし【窒素を充填するこ
とＫより重合容器から酸素を除いた。ラテックス／洗剤
混合物を連続攪拌しながら水浴中で＋７０℃に加熱した
。

そこに１　ｒｎｌのカリウムイルオキシジサルフエート
溶液（蒸留水中１６　Ｗｋｇ／１ｙｔｌ　）を添加した
。

Ｏ、２　ＷＬｌのスチレン、０．４　ｒｎｌのメタクリ
ルアミドアセトアルデヒＹｌ−ｎ−ペンチルアセタール
、０．０１０ｍＪのメタクリル酸および０．４　ｍｌの
前述の２．で得られたＮ　−（２，５−ジヒドロキシプ
ロピル）メタクリルアミド（ＮＤＰＭ）、およびこれら
モノマーの溶解度を改良するための０．２　Ｐ／Ｌｌの
ジメチルホルムアミドからモノマー混合物を調製した。

その七ツマー混合物を、激しく攪拌されたポリスチレン
ラテックス懸濁液に６０分間かけて徐々に滴加した。重
合混合物の温度を＋７０℃に保った。モノマー混合物の
滴加後、前記温度で更に５時間攪拌した。これにより重
合が完了し、そしてその分散液を室温まで冷却し、ひだ
付きフィルターを用いて戸遇した。７３ｍ１のラテック
ス懸濁液が得られた。次にこれをＮａＨＣＯ３緩衝溶液
（０，２５り／！、Ｐ）（８〜８．２）に対して１７時
間透析した。７４−のラテックス分散液（固体分４．７
重量％）が得られた。。

４、　シーｒ・ポリマー上での２−ヒＰロキシプロビル
メタクリレート（ＨＰＭ）の重合前述の五に記載の方法
と同様の方法で重合を行った。前述の１．と同様にして
調製された２２．４−のポリスチレンラテックス（固体
分１７．９重量悌）、および５６．７　ｔｐｔｌの蒸留
水および５０ダのＰデシル硫酸ナトリウムより成る混合
物を調製した。これを重合容器に入れ、そして酸素を除
去した。次にそこに１−のカリウムペルオキソジサルフ
エート溶液（蒸留水中１６　＃／Ｒ１）を添加し、そし
てその混合物を＋７０℃に加熱した。

Ｏ、４　ａｌｌのスチレ／、０．４　Ｗｌｔのメタクリ
ルアミＰアセトアルデヒ）’Ｊ−ｎ−ペンチルアセター
ル、０．０２５−のメタクリル酸および０．２４の２−
ヒト。キシプロピルメタクリレート（ＨＰＭ）より成る
混合物をＵ！４製した。そのモノマー混合物を激しく攪
拌されたポリスチレンラテックス懸濁液に＋７０℃で６
０分間かけ℃徐々に滴加した。

次に同じ温度で更に５時間攪拌し続けた。

室温まで冷却しそしてひだ折りフィルターを通して濾過
して７５ｔｄのポリマーを得た。次にそれをＮａＨＣＯ
３緩衝液（０，２５ｆ／１．　ｐＨ８〜８．２　’）に
対し【約２０時間透析した。８７ｍ１のラテックス分散
液（固体分５．１　％　）を得た。

５、　ポリマーへの抗−ＡＦＰ抗体の結合抗−ＡＦＰ抗
体を、前述の五と同様にして調製されたポリマー［、Ｎ
−（２，３−ジヒドロキシプロピル）メタクリルアミド
を用いて結合した。

各場合に用いられたポリマーを固体分が４重量俤となる
ように蒸留水で希釈した。精製ＡＦＰでウサギを免疫す
ることにより得られた抗血清を既知の方法によるアフィ
ニテイクロマトグラフイにより精製した。次にそれをタ
ンパク含量が１０〜／ゴとなるまで濃縮した０ ３．４−の前記ポリマーをＱ、３４ｔ！Ｌｔの抗−ＡＦ
Ｐ抗体溶液と混合した。次Ｋ、そこに０．１７ｍ４の、
エイコサオキシエチレンソルビタンラウレート（ＲＴｗ
ｅｅｎ　２０　）の２０分強度水性溶液を添加し、そし
て再び混合を行った。次に−が約２となるように０．０
５ｍ／のＩ　Ｎ　ＨＣｌをこれに添加した。室温で３０
分のインキュベーション時間後、そこに０．８５ｄの飽
和水性燐酸水素す）　ＩＪウム溶液（ｐＨ６，５）＞よ
び０．８５ｍ／の水性ナトリウムシアノゼロハイドライ
ド溶液（２５ｑ／ｌｔｌ　）を添加し、そして十分混合
した。次いで室温で１時間イジキュペートした。

次いでこの被覆混合物を約ｓｏ、ｏｏｏｘｒで３゜分間
遠心分離した（　Ｂｅｃｋｍａｎ遠心器、２０．００　
Ｏｒ、ｐ、ｎＬ）。

上清は捨てた。残分を５ｒＩＬｔのグリシン／　ＮａＣ
ｔ緩衝液（０，１モル／ｌグリシン、０．１７モ／ｌ／
／　ｌ　ＮａＣｔ。

０．５チエイコサオキシエチレンソルビタンラウレート
（”Ｔｗｅｅｎ　２０　）　、　ｐＨ８−２）に再懸濁
した。

次いで２秒間超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｂ　１
５Ｓｏｎｙｆｉｅｒ　）。このようにして再分散された
試薬を前述のグリシン／　ＮａＣＡ緩衝液を用いて１：
６０容量比で希釈した。

＆　血清検体中のＡＦＰ濃度の測定 前述の５．と同様にして抗−ＡＦＰ抗体を本発明による
ラテックス調製物に結合することＫより調製されたＡＦ
Ｐ測定試薬を用いて、既知量を添加済みの血清中のＡＦ
Ｐを測定した。使用した標準は、３２２，０００　ｒｘ
ｆ／ＩＩｔｌのＡＦＰ濃度を有する免疫沈殿用α−フェ
トプロティン標準血清（ヒト）（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｓｒ
ｋｅ　ＡＧ社製）を得た。その標準を貯留ＡＦＰ−不合
血清中、１，０ＯＯｎｆ７シまで希釈した。

この希釈液を貯留ＡＦＰ−不含血清中、その都度容量を
倍々にしながら更に段階的に希釈した。

これによりＡＦＰ濃度が漸減する標準希釈列を得た。標
準血清、および測定されるべき患者の血清をグリシン／
塩化す）　ＩＪウム緩衝液（Ｑ、Ｉ　Ｍグリシン、α１
７Ｍ　＆Ｃ１，ｐＨ８，２）中で１：５に希釈した。測
定には、２０μｌの患者血清希釈液または標準血清希釈
液を１５０μｌの反応緩衝液（０，１Ｍグリシン、０．
１７Ｍ　ＮａＣ４，４％ポリエチレングリコール（ｐｇ
Ｇ）　＜Ｓ、　ＯＯＯｌＱ、　５　％　”Ｔｗｅｅｎ　
２０　、ｐＨ８，２）と共Ｋ　ＢＬＮキュベツト（Ｂｅ
ｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ社製）Ｋピペットで移した
。１２分間の反応時間後、それらキュベツトを次いでレ
ーデ−比濁計（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ社製）
で測定した。

標準血清の測定についての基準プロットを半対数紙に描
き、そして患者血清についての測定値の評価に用いた。

実施例２ １　ポリマーへの抗−フェリチン抗体の結合実施例ｔ４
と同様にして２−ヒＰロキシプロビルメタクリレートを
用いて調製されたポリマーを固体分が４重量係となるよ
う蒸留水で希釈した。精製肝フェリチンで羊を免疫する
ととＫより得られた抗血清を既知方法によるアフィニテ
イクロマトグラフィにより精製した。次いでそれをタン
パク含量が１２ダ／−となるまで濃縮した。

０．５−の前述のポリマーを（等張塩化ナトリウム溶液
を用いて５　＃／ｄまで希釈された）０．０５０ｍ／の
抗−肝フエリチン抗体溶液と混合した。次いでそこに０
．０２５−のエイコサオキシエチレンソルビタンラウレ
ート（”Ｔｗｅｅｎ　２０　）の２゜チ強度水性溶液を
添加し、そして混合を再び行つた０−が約２となるよう
に０．０１０ｔＪの１ＮＨＣｔをそこに添加した。室温
で３０分間のインキュベーション時間後、そこに０．１
２５ｔＪの飽和水性燐酸水素ナトリウム溶液（…＆、５
）および０．１２５−の水性ナトリウムシアノゼロバイ
ドライＰ溶液（２５■／ａ／）を添加し、そして十分混
合した。

次いで室温で１時間インキュベートした。次いでこの被
覆混合物を約ｓｏ、ｏｏｏｘｙで３０分間遠心分離した
（　Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離器、２０．００　Ｏｒ、ｐ
、ｍ、）。

上清は捨てた。残分をα７５ｍ１のグリシン／ＮａＣｔ
緩衝液（α１Ｍグリシン、０．１７Ｍ　ＮａＣ１１０，
５％エイコサオキシエチレンソルビタンラウレート　゛
（”Ｔｗｅｅｎ　２０　）ｐＨ８，２）　Ｋ再懸濁した
。

次いで２秒間超音波（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｂ　１５５ｏｎ
ｙｆｉｅｒ　）処理した。このようにして再分散された
試薬をまず、α０５Ｍイミダゾール＋６チスクロース十
〇、１チヒトアルブミンを用いて１：３ｏ容量比で希釈
し、そして更に蒸留水で１：２に希釈した。

λ　血清検体中の７工リチン濃度の測定抗肝フェリチン
抗体をラテックス調製物に結合することにより調製され
た７エリチン測定試薬を用いて患者血清中の７エリチン
を測定した。

標準には、Ｅｎｚｙｇｎｏｓ　ｔアッセイ（Ｂｅｈｒｉ
ｎｇｗｅｒｋａ　ＡＧ社製）のフェリチン標準を用いた
。このフェリチン標準は２０．０００ｎν讐を含有した
。その標準を貯留フェリチン不含血清中でまず１０．０
０　Ｏｎｆ／Ｊに１次いで更に１．２５０　ｒｄ／ｘｌ
に希釈した。後者を用いて等比希釈列（倍々希釈で５つ
の希釈段階）を作った。標準血清、およびｄ１ｊ定すべ
き患者血清をグリシン／塩化ナトリウム緩衝液（Ｑ、１
Ｍグリシン、０．１７Ｍ　ＮａＣｔ、　ＰＨ８，２）中
で１＝５に希釈した。測定に当たっては、２０μｊの患
者血清希釈液または標準血清希釈液を、ＢＬＮキュベツ
ト（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ社製）中でｓ　　
１％”ＧｅｎａｐｏｌＴ　２５０　（Ｈｏｅｃｈｓｔ　
ＡＧ社製）を添加した１５０μｌの反応緩衝液（０，１
７Ｍ　ＮａＣ２，０，１Ｍグリシン、０．１１％Ｎａア
ジド十０．２％ＢＳＡ＋α０２％ベンズアミジニウムク
ロライド、４％ＰＥＧ　６，０００，０．５％”Ｔｗｅ
ｅｎ２Ｏ、ｐＨ８，２）と混合し、そしてその混合物を
室温で３０分間インキエベートした。次にそれらキュベ
ツトをレーザー比濁計（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　Ａ
Ｇ社製）で測定した。

標準血清測定用の基準プロットを半対数紙に描き患者血
清についての測定値の評価に用いた。

特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）水性液体中に溶解されたパートナーの一方を固相に
   共有結合的に結合された他方のパートナーと反応させる
   際に該反応を式 I ＣＨ＿３−（ＣＨ＿２）＿ｍ−Ｒ−（ＣＨ＿２−ＣＲ＿
   ２−Ｏ）＿ｎ−Ｈ　 I （式中、ＲはＯ、ＮＨまたはＣ
   Ｈ＝ＣＨ−（ＣＨ＿２）＿ｐ−Ｏであり、そしてｍは３
   〜２６であり、ｎは７〜４０であり、そしてｐは５〜１
   ５である） で示される化合物の存在下に行わせることを特徴とする
   免疫化学反応におけるパートナーの測定方法。 ２）ＲがＯまたはＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ＿２）＿ｐ−Ｏで
   あり、そしてｍが３〜２６であり、ｎが７〜４０であり
   、そしてｐが５〜１５である請求項１記載の方法。 ３）ＲがＯまたはＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ＿２）＿ｐ−Ｏで
   あり、そしてｍが１５〜１７であり、ｎが２５であり、
   そしてｐが６〜８である請求項１記載の方法。 ４）ＲがＯまたはＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ＿２）＿ｐ−Ｏで
   あり、そしてｍが６〜８であり、ｎが２５であり、そし
   てｐが６〜８である請求項１記載の方法。 ５）ポリエチレングリコール（重合度ｐ＝２５）でエー
   テル化されたパルミチルアルコールを２０〜３５％、ポ
   リエチレングリコール（ｐ＝２５）でエーテル化された
   ステアリルアルコールを１５〜３０％およびポリエチレ
   ングリコール（ｐ＝２５）でエーテル化されたオレイル
   アルコールを３０〜６０％含有する式 I の化合物の混
   合物が用いられる請求項１記載の方法。 ６）＾ＲＬｕｂｒｏｌＰＸの名称で市販されている式
   I の化合物の混合物が用いられる請求項１記載の方法。 ７）式 I の化合物が、０．０１／１００ｇ（液体）以
   上の濃度となるような量で添加される請求項１記載の方
   法。 ８）反応の際にグリシンが０．０５〜０．２モル／ｌの
   濃度で、中性塩が０．０５〜０．５モル／ｌの濃度で、
   ポリエチレングリコールが４ｇ／１００ｇの濃度で、お
   よび／またはエイコサオキシエチレンソルビタンラウレ
   ート（＾ＲＴｗｅｅｒ２０）が０．２〜１ｇ／１００ｇ
   の濃度で存在する請求項１記載の方法。 ９）緩衝物質および請求項１記載の式 I の化合物を含
   有する請求項１記載の方法を行うための剤。 １０）免疫化学反応におけるパートナーの一方が固相に
   共有結合的に結合される免疫化学的方法への請求項１記
   載の式 I の化合物の使用。