JPH0459587B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は磁気的に引きつけることができる物質
特に粒状の磁気的に引きつけることができる分析
目的用の試薬を作るのに使うのに適した物質の製
法に関するものである。

例えば生物学的起原の液体中の抗原（および付
着体）、抗体（および他の結合たんぱく質）およ
び医薬のようなその他の物質を、標識を付けた試
薬を使つた競争的結合反応によつて検定すること
はよく知られている。この検定は錯体中に結合し
ているかまたは結合しないで溶液中に残つている
かいずれかの標識の量を測定することによつて行
われる。このような方法の１つの例はよく知られ
ている放射免疫検定技法であり、これでは放射性
の標識が使われる。酵素および発螢光団のような
他の標識を使う同様な技法が知られている。

これらの方法では反応混合物の残りから生成す
る錯体を分離するか、または反応混合物の残りか
ら遊離の結合していない標識付きの反応体を分離
するかいずれかが、いずれかの部にある標識の量
を測定するために一般に必要である。この分離を
容易に実施できることはまれでありそしてこれが
このような検定における誤差源になる。

この問題を避けるかあるいは少なくとも減らす
考えらか本発明者は、粒子の周辺表面にそれに共
有結合した試薬をもつ磁気的に引きつけることが
できる粒子を免疫検定に使うことを提案した。
（その詳細についてはベルギー特許第852327号を
参照されたい。）この粒子は（反応混合物の標識
付き成分と試薬との間の反応の生成物もいつしよ
に）反応混合物の残りからきれいにそして容易に
分離することができる。そして引続いてこの残り
の中または粒子上の標識が測定される。

これまでに提議されているこの方法の限界また
は不利益な点は試薬をつけた磁気粒子の調製がし
ばしば時間と手数がかゝるという事実にある。こ
の粒子は通常セルロースである重合体基質中に埋
め込まれた磁気的に引きつけることができる物質
から成り、そして特殊な試薬をそれに結合するた
めには、セルロースは先ず活性化されそれから試
薬と反応されねばならないが、それには通常２官
能性の架橋基を使う。中間段階に活性化されたセ
ルロース粒子はどんな有用時間に対しても貯蔵す
ることはできない。その結果調製の２つの段階
（活性化とこれに続く反応）はその都度行わねば
ならないということである。

本発明者によりこの問題を回避する方法が今や
発見された。特に本質的に１工程で、ある試薬を
結合できる貯蔵安定な反応性の磁気性物質が考え
出された。

すなわち本発明は、磁気的に吸引可能な固体を
その中に埋め込んでもつポリアクロレインマトリ
クスから成る粒子の表面に遊離のアミノ基または
スルフヒドリル基をもつ試薬が結合した免疫検定
用磁気吸引性粒状試薬を提供する。本発明のこの
粒状試薬の粒子は、(イ)磁気的に吸引可能な固体の
存在下にアクロレインを重合させて前記固体が均
一に埋め込まれたポリアクロレインマトリクスを
形成し、(ロ)該ポリアクロレインマトリクスを粉砕
して粒子状と成すことにより、貯蔵安定な反応性
の磁気吸引性粒子として得られたものである。こ
の粒子を適当な反応条件下で遊離のアミノ基また
はスルフヒドリル基をもつ試薬と接触させること
により、本質的に１工程で、粒子の表面に試薬が
直接に結合した本発明粒状試薬が得られる。アク
ロレインの重合は通常触媒と開始剤を使い何らの
溶媒もなしに行うことができ、すなわち塊状重合
である。

Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチレンジアミンの
存在下にアクロレインの遊離基によつて重合体基
質を作ることは本発明の非常に好ましい特徴であ
る。アクロレインがこのように例えばFe₃O₄の存
在下に重合する場合には、均質な塊状重合体／
Fe₃O₄組成物が容易に生成される。この組成物は
次いで容易に粒子サイズに粉砕することができ
る。

試薬は遊離のアミノ基またはスルフヒドリル基
を含むものが使われる。遊離アミノ基を含む試薬
にはたんはく質たとえば抗体および酵素そしてあ
る種の抗原、ハプテン、医薬および抗生物質があ
る。このような物質の例は甲状腺ホルモンT₄お
よびT₃（チロキシンおよびトリヨードチロニン）、
３環性抗抑制剤医薬（ノルトリプチリン
nortriptyline、デシプラミンdesipramineおよび
プロトリプチリンprotriptyline）、アミノ−グリ
コシド−抗生物質（ゲンタマイシンgentamicin、
シソマイシンsysomicin、ネチルマイシン
netilmicin、アミカシンamikacin、ネオマイシン
neomicin、ストレプトマイシンstreptmicin、カ
ナマイシンkanamycinおよびトブラマイシン
tobramycin）、抗体または他の結合たんぱく質の
単離または分析のための種種の親和力吸収剤およ
び共役ハプテンの分析のために使われる固相たと
えば抗体の調製における中間体がそれである。

試薬は本質的に１工程で本発明の粒子に結合す
ることができということは本発明の非常に有利な
特徴である。すなわち例えば試薬は適当なPHの媒
質中で簡単に粒子に接触させることができるので
ある。遊離アルデヒド基を含むポリアクロレイン
は遊離アミノ基に対して“自動反応性”であり、
従つて試薬は基質と反応し直接結合する。こうし
て作られた本発明の試薬粒子はいつでも使える。
本発明によれば架橋基を使う必要（先行技術にお
ける）が避けられそして結局より簡単で、より迅
速でそしてより効果的な方法であるから、それは
非常に有利な特徴である。

本発明試薬粒子はどんな粒子サイズでもよい
が、しかし一般的にそれは１〜20μであることが
便利である。ことに連続流れ式技法に使用する場
合には、粒子の比重は流れる液体反応混合物中で
の粒子の余計な浮上や沈降を避けるように約1.4
〜3.2であるべきことが好ましい。

本発明の粒子は（すなわち試薬をそれに結合す
る前）使用前のある期間貯蔵することができる。
当業者にはよくわかつているように、貯蔵中粒子
はそれが反応するかも知れない物質と接触しない
ように保つべきである。その代りとして磁気性の
粒子を含む自動反応性の重合体基質の固体塊状物
を貯蔵することができ、次いで粒子が要求される
場合にはこの塊状物の部分を試薬との反応のため
の粒子サイズにまで粉砕することができる。この
ようにして本発明の試薬粒子はその使用直前に簡
単に新鮮に調製することができる。

本発明の試薬粒子は特に（もつぱらではない
が）液体の興味ある成分を分析するに有用であ
る。すなわちこれらの粒子は手動式または自動連
続流れ式の検定（その一般的な記載については米
国特許第2797149号を参照されたい）に使うこと
ができる。それらはまた例えば本発明者らのベル
ギー特許第852327号に記載されたように使うこと
もできる。

このようにして本発明は生物学的液体試料中の
興味ある成分を分析する方法を含み、その方法は
試料を本発明の試薬粒子と接触させる工程とそし
て磁気的手段によつてこの粒子を分離する工程と
を含むものである。

本発明は、さらにまた興味ある成分を含む液体
試料を含有する液相と本発明の試薬粒子を含む固
相とから成る反応混合物を導管に沿つて流すこ
と、この反応混合物中に反応が起り、反応混合物
の１つの成分が前記固相と反応しすなわち選択的
にそれに吸収され、導管中で粒子を流れに抗して
支えるように磁気的に取押え、したがつて流れる
液相から固相を分離しそして液相は下流へ流し、
分離された固相あるいは液相の分析によつて試料
中の興味ある成分を定量することから成る方法を
も含むものである。

この方法を実施するための分析装置の１つの好
ましい形は本発明者らのベルギー特許第852327号
に記載さている。

免疫検定のような生物学的検定において試薬粒
子が作用する精密な方法は、当業者には明白なよ
うに試薬の性質によつて変る。例えば標識を付け
た抗原および抗体または他の結合たんぱく質を使
つての抗原の免疫検定においては抗体は試薬粒子
上に試薬を構成することができる。標識付きおよ
び標識の付かない両方の抗原との試薬錯体はこの
ような情況下そして反応混合物から除去の際に標
識に対して検定することができる（あるいは残つ
ている反応混合物から標識に対して検定すること
ができる）。

本発明の好ましい１つの方法では、反応混合物
は第２の試薬としてその成分と錯体を形成する興
味ある成分と反応する標識を付けた物質のあらか
じめ定めた量から成り、そしてこの場合本発明の
試薬粒子上の試薬は前記の第２の試薬の過剰と結
合し、そしてまた分離された合媒物は試薬の興味
ある成分を定量するように分析される。この方法
では適当なものとして錯体かまたは過剰の未反応
の第２の試薬のいずれかに対して分析が行われ
る。これらの実施例はただ説明によつてのみ示さ
れたものであつて、多くの様々の検定方法におけ
る本発明の試薬粒子の多能性は当業者に明らかに
なるであろう。

本発明をより充分に理解できるように次の実施
例をただ説明によつて示す。

例 １ ポリアクロレインから成る本発明の粒子の調製
アクロレイン（２ｇ）と磁性化できる酸化鉄
Fe₃O₄（２ｇ）とを室温で激しく混合した。Ｎ，
Ｎ，N′，N′−テトラメチレンジアミン（100μ）
を加えそして約６〜７分間かきまぜを続けた。こ
の時間の後で重合が起り均質な固体物質を生じ
た。生成物をBraun電気コーヒ粉砕器中で細い顆
粒に砕いた。さらにMcCroneマイクロナイザー
中で30分間粉砕して適当な粒子サイズの安定な自
動反応性の生成物が得られた。

例 ２ 抗−T₄血清（γ−グロプリン留分）の本発明
の粒子への結合 例１に記載のポリアクロレイン／Fe₃O₄粒子
（１ｇ）を水（20ml）で４回洗い、次に炭酸ナト
リウム／炭酸水素ナトリウム0.1Mの緩衝液（PH
9.0）で２回洗う。緩衝液中に粒子を加えた懸濁
液を14mlの体積とする。抗−T₄血清（γ−グロ
プリン留分１ml）を粒子懸濁液を加え、そして４
℃で24時間おだやかに混合することによつて結合
を行つた。次に粒子は多極フエライト磁石上に沈
降しそして表面浮遊物は除かれた。このようにし
て生成された試薬粒子を炭酸水素塩／炭酸塩の緩
衝液で３回そして0.05Mりん三塩緩衝液（PH7.4）
で２回洗い、最後に懸濁液の体積をりん酸塩緩衝
液で20mlに仕上げた。

例 ３ 抗−ジゴキシン（anti−Digoxin）血清（γ−
グロブリン留分）の本発明の粒子への結合 抗−T₄血清の代りに抗−ジゴキシン血清（γ
−グロブリン留分）１mlを使う以外は例３におけ
るト同じ方法が続けられた。

例 ４ 抗−人の胎盤ラクトゲン血清（γ−グロブリン
留分）の本発明の粒子への結合 抗−T₄血清の代りに抗−人の胎盤ラクトゲン
血清（γ−グログリン留分）１mlを使う以外は例
２におけると同じ方法が続けられた。

例 ５ 抗−T₄ポリアクロイレン／Fe₃O₄試薬粒子を使
つてのT₄の手動式放射免疫検定 抗対希釈曲線：すべての検定用の検定希釈剤は
0.05Mりん三塩緩衝液（PH7.4）であつた。試
薬粒子の懸濁液から１連の倍増式希釈物が作ら
れた。懸濁液100ml当り５、2.5、1.25、0.625、
0.312、0.156ｇの基質を含むもである。T₄−
¹²⁵Iトレーサー溶液を50μで500cpsを与える
ように作つた。８−アニリノ−１−ナフタリン
スルホン酸を血清試料ml当り8μｇの割合でト
レーサ溶液に加えた。試薬を次の順序と量で混
合することによつて希釈曲線が作られた。

最高結合曲線： () T₄を含まない血清 50μ () T₄−¹²⁵Iトレーサー溶液（検定希釈剤中）
50μ () 抗−T₄試薬粒子懸濁液（例２）（上に概略
記した希釈で） 50μ 頂点標準結合曲線： () T₄を含まない血清（400nmL^-1）中の頂点
標準 50μ () T₄−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () 抗−T₄試薬粒子懸濁液（例３） 50μ 非特異結合曲線： () T₄を含まない血清中の20倍頂点標準濃度
（8μｍL^-1） 50μ () T₄−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () 抗−T₄試薬粒子懸濁液（例２） 50μ 試験管を１夜室温に保温した。固相の粒子はフ
エライト磁石の上につ沈降しそして表面浮上物は
棄てた。粒子を検定希釈剤で３回洗いそして最後
にWilj上で計数した。その結果を第１図に示す。

第１図ないし第３図において、縦軸『％Ｂ』は
結合計数％すなわち結合された物質についての計
数と合計数との割合を％で表わしたものであり、
そして横軸『mgSP』は固体相重量（mg）を表わ
す。

例 ６ 抗ジゴキシポリアクロレイン／Fe₃O₄試薬粒子
を使つてのジゴキシンの手動式放射免疫検定 抗体希釈曲線：１連の倍増式希釈物が試薬粒子の
懸濁液から作られた。懸濁液100ml当り５、
2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078ｇを粒
子を含むものである。ジゴキシン−¹²⁵Iトレー
サー溶液は50μに500cpsを与えるように作ら
れた。次の順序の量で試薬を混合することによ
つて希釈曲線が作られた。

最高結合曲線： () 血漿 200μ () ジゴキシン−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () 抗−ジゴキシン試薬粒子懸濁液（例３）
50μ 頂点標準結合曲線： () 血漿の頂点標準8nモルL^-1 200μ () ジゴキシン−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () 抗−ジゴキシン試薬粒子懸濁液（例３）
50μ 非特異結合曲線： () 血漿中の20倍頂点標準濃度（160nmL^-1）
200μ () ジゴキシン−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () 抗−ジゴキシン試薬粒子懸濁液（例３）
50μ 試験管を１夜室温に保温した。固相の粒子はフ
エライト磁石上に沈降しそして表面浮上物は排棄
した。粒子は検定希釈剤で３回洗いそして最後に
Wilj上で計数した。その結果を第２図に示す。

例 ７ 抗−人の胎盤ラクトゲン（Anti−HPL）ポリ
アクロレイン／Fe₃O₄試薬粒子を使つてのHPL
の手動式放射免疫検定 抵抗希釈曲線：試薬粒子の懸濁溶液から１連の倍
増式希釈物が作られた。懸濁液100ml当り５、
2.5、1.25、0.625、0.313ｇ粒子を含むものであ
る。HPL−¹²⁵Iトレーサー溶液は50μ中
500cpsなるように作られた。希釈曲線は次の量
の順序で試薬を混合することによつて作成され
た。

最高結合曲線： () 男性人間の血清 50μ () HPL−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () （前記に概述した希釈で）抗−HPL試薬粒
子懸濁液 50μ 頂点標準結合曲線： () 頂点標準（12μｇ ml^-1） 50μ () HPL−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () 抗−HPL試薬粒子懸濁液 50μ 非特異結合曲線： () 20倍頂点標準濃度（240μｇ ml^-1） 50μ () HPL−¹²⁵Iトレーサー溶液 50μ () 抗−HPL試薬粒子懸濁液 50μ 試験管は室温に１夜保温した。固相の粒子はフ
エライト磁石上に沈降しそして表面浮上物は排棄
した。粒子は検定希釈剤で３回洗浄しそして最後
にWilj上で計数された。その結果は第３図に示さ
れる。第１〜３図に示される抗体希釈曲線はT₄、
HPLおよびジゴキシンに対する抗血清はそれが
ポリアクロレインに共有結合したときにその免疫
反応性を持続していることを示している。

例 ８ 抗−HPLポリアクロレイン／Fe₃O₄試薬粒子を
使つたHPLの自動放射免疫検定 例７で特性づけられた試薬を（ベルギー特許第
852327号に記載の）自動連続流れ式装置中で使つ
た。この装置は流れくる個々の検定混合物を10分
間オンラインで保温することを利用し、それに引
続いて混合物から試薬粒子を磁気で分離すること
を行う。この分離された粒子は今や抗体に結合し
たHPLの留分をもつており、それが次にガンマ
カウンターを通つて流されてそして計数が記録さ
れる。これらのデータは標準曲線を引くのに使わ
れ、この曲線からテスト試料中のHPLの未知濃
度が内挿法で見出される。

希釈剤緩衝液 0.05Mりん酸塩緩衝液でPH7.4であり、0.25％
Tween20、0.1％アジ化ナトリウムおよび0.25％
牛の血清アルブミンを含有する。

HPL標準（50μ） 正常な男性の血清を純HPLを混合して濃度０、
１、２、４、６、８、10、12μｇ／mlを与えるよ
うにした。

HPL¹²⁵Iトレーサー（50μ） 調製された貯蔵トレーサーを緩衝剤中で希釈し
て50μ当り1700cpsの全計数を与えるようにし
た。

抗−HPLポリアクロレイン／Fe₃O₄ 粒子懸濁液（50μ） これは50μ当り0.625mg希釈剤緩衝液の濃度で
使われた。標準物の濃度の対数に対するCi／Co
％として計数をプロツトすることによつて得られ
る標準曲線が第４図に示されている。通常の方法
でこの標準曲線から未知濃度の試料が読み取れ
る。

ここで『Co』は得られるべき計数の最高数
（すなわち結合が全く起らない場合の計数）であ
り、そしてCiは標準ｉを使つたときの計数値であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は前記実施例中の例５に記載された抗−
T₄ポリアクロレイン／Fe₃O₄試薬粒子を使つた
T₄の手動式放射免疫検定の結果を示す曲線図で
ある。曲線は最高結合曲線、は頂点標準結合
曲線そしては不特定結合曲線をそれぞれ表わ
す。第２図は同じく例６に記載された抗−ジゴキ
シンポリアクロレイン／Fe₃O₄試薬粒子を使つた
ジゴキシンの手動式放射免疫検定の結果を示す曲
線図である。曲線は最高結合曲線、は頂点標
準結合曲線そしては不特定結合曲線をそれぞれ
表わす。第３図は同じく例７に記載された抗−
HPLポリアクロレイン／Fe₃O₄試薬粒子を使つた
HPLの手動式放射免疫検定の結果を示す曲線図
である。曲線は最高結合曲線、は頂点標準結
合曲線そしては不特定結合曲線をそれぞれ表わ
す。第４図は例８に記載された抗−HPLポリア
クロレイン／Fe₃O₄試薬粒子を使つて自動連続流
れ式装置における人間胎盤ラクトゲン（HPL）
の検定に対する標準曲線を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 磁気的に吸引可能な固体をその中に埋め込ん
   でもつポリアクロレインマトリクスから成る粒子
   の表面に遊離のアミノ基またはスルフヒドリル基
   をもつ試薬が結合した免疫検定用磁気吸引性粒状
   試薬。 ２ １〜20ミクロンのサイズと1.4〜3.2の比重を
   もつ前項１に記載の粒状試薬。 ３ 粒子の表面に試薬としてたんぱく質、抗原、
   ハプテンまたは酵素が結合した前項１に記載の粒
   状試薬。