JPH02107968A - 磁性粒子を用いた免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的反応に関与する測定すべき物質を磁性
粒子を用いて測定する方法に関する。

〔従来の技術〕

免疫学的反応に基づく凝集、または非凝集粒子の分布パ
ターンを形成して分析する方法に混合凝集法がある。こ
れはサンプル中の抗原または抗体と担体に固定された抗
体または抗原とを反応させ凝集または非凝集粒子が反応
容器底面に沈降することにより生じる凝集パターンの差
から陽性、陰性を決定するものである。この混合凝集法
はＷｉｅｎｅｒ、Ａ、Ｓ、とＨｅｒｍａｎ、Ｍ、、Ｊ、
Ｉｎ＋ｌｌ１ｕｎｏ１．。

３６．２５５（１９３９）において報告されて以来、Ｃ
ｏｏｍｂｓ　。

Ｒ，Ｒ，Ａ、とＢｅｄｆｏｒｄ、　Ｄ、　、　Ｖｏｘｓ
ａｎｇ、　、　５　、１１１　（１９５５）およびＣｏ
ｏｍｂｓ、　Ｒ，Ｒ，Ａ、ら、　Ｌａｎｃｅｔ、ｉ、４
６１（１９５６）の報告により血液型の判定を行うまで
に発展確立された。例えば各種血液型について応用した
ものに米国特許第４６０８２４６号公報、米国特許第４
２７５０５３号公報（特公昭６２−４４２２１号公報）
や米国特許第４３２８１８３号公報がある。固体表面に
予じめサンプル中の抗原と結合反応する抗体を乾燥状態
で保持させることにより、固体表面で血液型の判定を行
って感度の向上を図ったものには米国特許第２７７０５
７２号公報がある。更にＲｏｓｅｎｆｉｅｌｄ　Ｒ，Ｅ
、ら、　Ｐａｒｉｓ、Ｐｒｏｃ、１５Ｔｈ　Ｃｏｎｇ。

Ｉｎｔｌ、Ｓｏｃ、Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏ
ｎ、２７（１９７６）では混合凝集法の原理を利用して
固体表面で赤血球抗原と抗体との反応を行っている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の技術においては凝集または非凝集粒子が自然沈降
して形成される凝集パターンを測定しているので凝集パ
ターン形成までに時間がかかる問題点があった。

本発明は従来の技術よりも短い時間で凝集パターンを形
成させることを目的とする。

〔課題を解決する手段および作用〕

第１図は本発明の概念図である。

測定すべき物質と、測定すべき物質に結合するかまたは
測定すべき物質と競合する物質を表面に保持した磁性粒
子１を反応容器２に収容する。次に、容器２の下に先端
が針状をした磁極を位置付けると、反応容器２中の磁性
粒子１は針状磁極３に引かれる力を受は反応液中を容器
底面へ移動する。磁性粒子１は容器底面までの移動の間
に１反応する。容器底面には反応した磁性粒子、未反応
の磁性粒子の分布パターンが形成されるので、この分布
パターンを目視または光学測定機で測定して測定すべき
物質の存在の有無または測定すべき物質の量を決定する
。

磁性粒子としては、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ−４５０（
ＤＹＮＡＬ社製）、エスタボールＬ）ＩＰ２３３　（ロ
ーヌプーラン社製）等の磁性ラテックス粒子や強磁性体
を含ませたゼラチン粒子（特開昭５９−１９５１６１号
公報参照）や、赤血球等の細胞内に強磁性体たとえば鉄
粉を取り込ま、せた細胞も磁性粒子として使用できる。

磁性粒子には、その表面に測定すべき物質と結合する物
質または測定すべき物質と競合する物質を結合により固
定化する。

測定すべき物質としては、リガンド、レセプターに代表
される特異結合性物質であり、抗原性を持つ物質、抗原
に結合する抗体、免疫グロブリン、免疫グロブリンに対
する抗体、細胞の膜タンパク、細胞、細胞の表面抗原に
対する抗体等が挙げられる。

本発明で用いる反応容器としては、試験管またはマイク
ロプレートが好ましく、円錐状２球面状の底面を有する
ものは凝集、非凝集粒子パターンが判断し易い。

磁性粒子の分布パターンは反応の形態により異なる。サ
ンプル中の測定物質と、感作磁性粒子との反応により凝
集塊を形成する場合は、凝集パターンは反応容器底面に
−様に粒子の像が観察され、非凝集パターンは未結合の
磁性粒子が底面の傾斜面をすべり落ちるためＵ、■底反
応容器では中心部にすべて粒子が集まった像が観察され
る。

さらに、反応容器底面全体に測定物質と、測定物質に結
合する物質の反応に関与する一方の成分を固定し、サン
プルと感作磁性粒子を加えた場合は、 ■　サンプル中の測定物質を反応容器内面全体に固定化
した物質と感作磁性粒子でサンドインチにした形の結合
は陽性であり容器底部全体に−様な像を形成する。

■　陰性は容器底部に何も結合しないので中心部に粒子
が集まった像を形成する。

サンプル中の測定物質と結合する物質を反応容器底面全
体に固定化し、サンプル中の測定物質と同じ物質を表面
に固定化した磁性粒子を用いた場合は、 ■　陽性反応は測定物質が底面に結合するため底面中心
部に磁性粒子が集まった像を形成する。

■　陰性は磁性粒子が底面の固定化物質と結合するから
底面全体に−様な像を形成する。

本発明では針状磁極を用いているから未結合の磁性粒子
の分布パターンを鮮明に形成できる。

〔実施例〕

本発明を実施例に基いて説明する。

実施例１．抗グロブリン試験（クームス法）による不規
則抗体の検出 〈０型赤血球固相プレートの作製〉 Ｕ字底マイクロプレート（ＮＵＮＣ社、製造番号４６４
３９４）に０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７
，０で１０ｔｔｇ／ｍｌに調整した小麦胚芽レクチン（
ＷＧＡ）　（生化学工業社製）を各ウェルに１００ｐｊ
ずつ添加し室温で３０分間処理した。次に、０．ＯＩＭ
ＰＢＳ、ｐＨ７，０を３００ｐＺずつ用いて５回洗浄し
室温で乾燥することにより−ＧＡＧ理プレートを得た。

次に、表１の各血液型抗原を有するヒトＯ型赤血球であ
るサージスクリーン（Ｏｒｔｈｏ社、製造番号３ＳＳ８
３７　）を生理食塩水で０．３％に調整し、これを２５
μｌ／ウエルずつＷＧＡＧ理したマイクロプレートに添
加し、室温で１０分間静置することによりサージスクリ
ーンをマイクロプレート上に吸着させた。

０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．ＯＩ
ＭＰＢＳ、　ｐＨ７，０を２００．１１ｊずつ用いて３
回洗浄した。

表１ 注）血液型抗原有り（＋）、無しく−）〈抗ヒトＩｇＧ
感作ラテツクスビーズの調整〉粒径１μ、暗褐色の磁性
ラテックスｅｓｔａｐｏｒＬＭＰ２３３　（ＲＨＯＭＥ
−ＰＯＵＬＨＮＣ社）および抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｌ
ｅ社、製造番号０６０１−００８１）をそれぞれ０．１
Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（以下、グリシン
緩衝液）　ｐｎｓ、ａにて０．４％および１題／−に調
整し、各２−を混合して３７°Ｃで１時間反応させるこ
とによりラテックスに抗ヒトＩｇＧを感作させた。次に
、このような感作ラテツクスを１％ＢＳＡを含む０．１
Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ８゜３を２耐用いて３回洗浄し
た後、同緩衝液２−を３７°Ｃで３０分間反応させるこ
とにより非特異凝集を抑制するためのブロッキングを行
った。更に、０．０１％すＪレコシネートＬＮ　（日光
ケミカＪレズ社製界面活性剤）、　０．１％ＢＳＡを含
む０．ＯＩＭＰＢＳ、ｐＨ７，０を２−ずつ用いて３回
洗浄し、同ＰＢＳ　Ｊ−中に保存した。

〈不規則抗体の検出〉 前記０型赤血球固相プレートに対し、Ｌｉ５ｓ液を６０
ｔｒｌずつおよびサンプルとして抗Ｔ、抗に抗ｐｙｉ、
抗Ｓの各抗血清（Ｏｒ　ｔｈｏ社製）又は陰性コントロ
ールとして０．ＯＬＭＰＢＳを３０μｌずつ各ウェルに
添加して３７°Ｃで３０分間反応させた。０．ＯＩＭＰ
ＢＳ、　ｐＨ７，０の２００μｌを用いて各ウェルを４
回洗浄した後、前記抗ヒトＩｇＧ　ラテックスビーズヲ
２５ｐｌ／ウェル添加した。このマイクロプレートを第
２図に示す反応促進装置の上に載せ２０秒間インキュベ
ートした。

第２図は反応促進装置の構成を示す斜視図（一部断面図
を含む）である。

８Ｘ１２ウエルを持つマイクロプレートをずれずに載置
できるよう外側を高くした支持台４には、マイクロプレ
ートの各ウェルに対応する位置に円柱状の溝５がマトリ
クス状に設けられ、この溝の中に円錐形状をした針状フ
ェライトマグネット（磁束密度２２００ガウス）６が収
容されている。マイクロプレートを支持台４の上に載せ
ると、Ｕ字状の底面の真中に針状磁極６が位置するよう
構成されている。

表２はウェル底面に形成された抗ヒトＩｇＧ　ラテック
スの分布パターンにより、ウェル底面に一様に広がった
ものを陽性（＋）、ウェル中心に集まったものを陰性（
−）として判定した結果である。表２に示す通り、判定
した抗血清の結果は表１に示した固相化抗原の表現型と
一致した。

実施例２．直接抗グロブリン試験によφ自己抗体の検出 〈赤血球固相用ＷＧＡＧ理プレートの作製〉実施例１に
記載した手順により−ＧＡＧ理プレートを作製する。

〈抗つサギＩｇＧ感作ラテックスビーズの調整〉実施例
１と同様の手順により調整するが、その際抗ヒトＩｇＧ
の代わりにここでは抗ウサギＩｇＧ（Ｘｉｒｋｅｇａａ
ｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｓ＋Ｉ
ｎｃ、＋製造番号５０−０１１５−１６　）を感作に用
いる。

〈自己抗体の検出〉 抗凝固剤を入れた被検血液より生理食塩水を用いて赤血
球を洗浄し、かつ０．３％に調整しこれより２５μｌず
つを前記−ＧＡ処理プレートに添加して室温で１０分間
静置する。次に、０．２％ゼラチンを含む０．ＯＩＭＰ
ＢＳ、　ｐＨ７，０を２００ｐ／用いて１度洗浄し、更
にウサギ由来クームス血清（Ｏｒｔｈｏ社製）を各２５
μ！添加して室温で１０分間反応させる。０．ＯＩＭＰ
ＢＳ％ｐｌ（７，０２００μｌで３度洗浄した後、前記
抗ウサギＩｇＧ　ラテックスビーズを２５μｌ／ウエル
添加し、更に実施例１と同様にして磁界をかけ、反応パ
ターンを形成させて判定を行なうことができる。

実施例３．ＨＢ、抗原の検出（１） 〈抗■Ｂ、抗体固相プレートの作製〉 Ｕ字底マイクロプレー）　（ＮＵＮＣ社、製造番号４６
４３９４　）に対し、アフィニティー精製したウサギ抗
■Ｂ、抗体を０．ＯＩＭＰＢＳ、　ｐＨ７，０で１０Ｊ
１ｇ／−に調整し、１００ｐ７／ウエル添加し３７°Ｃ
で１時間反応させ、マイクロプレートに吸着させる。０
．ＯＩＭＰＢＳ、　ｐＨ７，０を各ウェル２５０ｐｌず
つ用いて３回洗浄し、更に０．２％ＢＳＡを含む０．Ｏ
ＩＭＰＢＳ、　ｐＨ７，０を２００μ！／ウエル添加し
て３７°Ｃで１時間反応させ、ブロッキングを行う。０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．ＯＩＭＰＢＳ、　ｐ
Ｈ７，０を各ウェル２５０ｐ／用いて３回洗浄した後、
室温で乾燥して４°Ｃに保存する。

く抗ＨＢ、抗体感作ラテックスビーズの調整〉実施例１
で用いたのと同様の磁性ラテックスおよび抗ＨＢｓ抗体
をそれぞれ０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐ）１８．３によ
り０．４％および２．５尾／艷に調整し、各２−を混合
して３７゛Ｃで１時間感作反応させる。１％ＢＳＡを含
む０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐｎｌｌｌ、　３を２−用
いて３回洗浄し、更に同グリシン緩衝液２−により３７
°Ｃで３０分間反応させてブロッキングを行う、　Ｏ，
ＯＳ％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ＢＳＡを含む０．
ＯＬＭＰＢＳ、　ｐＨ７，５を２ｗ１用いて３回洗浄し
た後、同ＰＢ３４−を添加して反応に用いる。

＜）ＩＢｔ、抗原の検出〉 ＨＢ３抗原陽性血清および対照として陰性血清を原液の
まま前記ＨＢ、抗体固相プレートにそれぞれ２５ｐｌ／
ウエル添加し室温で１５分間反応させる。添加した血清
を廃棄又はそのままで更に０、ＯＩＭＰＢＳ、　ｐＨ７
，５を２００ｐｆで１回洗浄する。ここに前記抗ＨＢ、
抗体感作ラテックスビーズ２５ｐｌを添加し、実施例１
と同様にして分布パターンを形成させる。

以上の実施例においてはサンプル中の測定すべき物質を
磁性粒子に結合させ、針状磁極によりマイクロプレート
のウェル底面中心部に集めるようにして磁性粒子による
鮮明な分布パターンを形成させたから迅速かつ正確な判
定を行える。

又、第３図（Ａ）、（Ｃ）に示すようにマイクロプレー
ト７のウェル８の底面には予め抗体のような測定すべき
物質と結合する物質９を固定したので、サンプルとの反
応後にウェル８を洗浄することにより未反応の物質を除
去し、そこへ磁性粒子１０を反応させることにより、測
定すべき物質１１が存在する場合（第３１ｆｆｌ　（Ａ
）　）および存在しない場合（第３図（Ｃ））の各結合
状態を形成する。このようにして磁性粒子に対する結合
感度を向上させて安定かつ鮮明なパターンを得ることが
できる。

実施例４．ＨＢ、抗原の検出（２） 実施例３．と同様にして抗ＨＢ、抗体固相プレートの作
製および抗ＨＢ、抗体感作ラテックスビーズの調整を行
う。

〈■Ｂ１抗原の検出〉 ＨＢ、抗原陽性血清および対照として陰性血清をそれぞ
れ原液のまま抗ＨＢ、抗体固相プレートに２５ｐｌ／ウ
エル添加し、更に抗ＨＢ、抗体感作ラテックスビーズを
２５ｐｌずつ加えて室温で１５分間反応させる。０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ＢＳ＾を含む０．Ｏ
ＩＭＰＢＳ、　ｐＨ７，５を１５０μｌ／ウエル添加し
支持台４にマイフロップレートをのせてウェル中の抗Ｈ
Ｂ、抗体感作ラテックスビーズをマイクロプレート底面
に集めることにより分布パターンを形成させる。

本実施例においては第３図（Ｂ）、（Ｃ）に示すように
磁性粒子１０と針状磁極による反応の迅速性を利用して
、マイクロプレート７のウェル８の底面に対し測定すべ
き物質と結合する物質９を固定し、原液血清のような種
々の沈降性または不溶性の物質を含むサンプルとの反応
後にこれを希釈することにより、磁性粒子１０に対する
結合感度を向上させて、測定すべき物質１１が存在する
場合（第３図（Ｂ））および存在しない場合（第３図（
Ｃ））の各結合状態を形成し、安定かつ鮮明なパターン
を得るものである。従って、高濃度のサンプルでも高感
度な分析が期待できる。更に、血清中で多々問題となる
非特異凝集反応による偽陽性（フォルスポジティブ）は
上記希釈の倍率を上げることにより減少する。

実施例５．全血をサンプルとしたＨＢ、抗原の検出 実施例３．と同様にして抗ＨＢ、抗体固相プレートを作
製する。

〈抗ＨＢ、抗体感作ラテックスビーズの調整〉粒径１μ
の磁性ラテックスビーズｅｓｔａｐｏｒ（Ｒ１（ＯＮＥ
−ＰＯＵＬＩ！ＮＣ社製、製造番号ＬＭＰ２３３）を０
．１Ｍグリシン緩衝液、ｐｎｓ、３にて０．４％、２艷
に調整し、一方、アフィニティー精製したウサギ抗■Ｂ
３抗体を同グリシン緩衝液にてｌＩＰｇ／ｄに調整して
各２−を混合して３７°Ｃ１時間インキュベートする。

次に、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ
８，３を２−ずつ用いて３回洗浄し、更に２−添加し、
３７°Ｃで３００分間反応せて非特異凝集が抑制される
ようラテックス表面をブロッキングする。次に、０．０
１％サルコシネートＬＮ（日光ケミカルズ社製界面活性
剤）および０．１％ＢＳＡを含む０．０１ＭＰＢＳ、　
ｐＨ７，５を２ｄ用いて３回洗浄し、更に同ＰＢ５４ｄ
を添加して反応に備える。

〈全血サンプル〉 サブタイプがａｄであるＨＢ、抗原（ミドリ十字社製）
を陰性の抗凝固血に添加して陽性サンプルとし、未添加
の抗凝固血を陰性サンプルとして用いる。

＜ｌ（Ｂ、抗原の検出〉 抗ＨＢ８抗体固相マイクロプレートに対し、０．１％Ｂ
ＳＡおよび０．０１％サルコシネートＬＮ　（日光ケミ
カルズ社製）ならびに５％デキストラン（分子量２００
，０００〜３００，０００、和光純薬工業■）を含む０
．０１ＭＰＢＳ、　ｐＨ７，５を１００μｌ／ウエル添
加する。次に、陽性および陰性の全血サンプルを各５μ
！、更に抗ＨＢｓ抗体感作ラテックスビーズの溶液を各
２５μ！添加してそれぞれ混合させ、室温で５分間反応
させる。次に、抗ＨＢ、抗体感作ラテックスビーズをマ
イクロプレートのウェル底面に集めるよう磁界をかけ、
凝集による分布パターンを形成させる。このような分布
パターンはマイクロプレートの下方よりウェル底面を観
察等することによりＨＢ、抗原の存在を検出、確認でき
る。

本実施例においては遠心処理する場合と異なり全血中の
他の沈降性の物質に作用することなく、磁性体粒子の沈
降のみを促進して短時間に測定可能なパターンを形成す
るものである。従って、反応溶液として磁性粒子より高
比重な溶液を用いることができる。以上のことにより、
全血のように種々の沈降性または不溶性の物質を含むサ
ンプルにおいても洗浄ないし分離を行うことなく測定で
きる。

尚、本発明は上述した実施例に限定されず、永久磁石以
外にも第４図のように電磁石１２等が使用できる。第４
図は電磁石で構成した針状磁極を示す図である。

電磁石１２は円錐状の先端を有する強磁性体の周りにコ
イルを巻きつけて構成されている。マイクロプレート７
の各■底つェル８の下にこの電磁石１２を配置し、反応
時にコイルに電圧＋Ｖを一定時間印加することでウェル
８中にある磁性粒子に引力を加えることができる。更に
、磁界をかける間、反応容器は静置状態でも移送状態で
もかまわない。

〔発明の効果〕

本発明によれば針状磁極を反応容器底部の下に位置付け
たので、強制的に磁性粒子を反応容器底部へ沈降させる
ことができ短時間に鮮明な分布パターンが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の概念図、 第２図は針状磁極をマトリクス状に配置した支持台の斜
視図、 第３図（Ａ）は実施例１〜３におけるサンプルとの反応
後にウェル底面を洗浄した場合の陽性時の粒子の結合状
態を示す模式図、 第３図（Ｂ）は実施例４におけるサンプルとの反応後に
希釈した場合の陽性時の粒子の結合状態を示す模式図、 第３図（Ｃ）は実施例１〜４における陰性時の粒子の結
合状態を示す模式図、 第４図は電磁石で構成した針状磁極を示す図である。 １．１（１−−・−・−・・−磁性粒子２　　　　　反
応容器 ３．６　　　針状磁極 ４−・−・−−−一−−−−−−−−支持台５溝 ７　　　　　マイクロプレート ウェル 測定すべき物質と結合する物質 測定すべき物質 電磁石

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、測定すべき物質と、測定すべき物質に結合するかま
   たは測定すべき物質と競合する物質を表面に保持した磁
   性粒子を反応容器に収容し、反応容器下方に針状磁極を
   位置付け磁性粒子の沈降を促進させ、反応容器底部に形
   成された磁性粒子の分布パターンを測定することを特徴
   とする磁性粒子を用いた免疫学的測定方法。 ２、反応容器内面に測定すべき物質と結合するかまたは
   測定すべき物質と競合する物質が固定されていることを
   特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫学的測
   定方法。