JPS59179609A - 診断試薬用ラテツクスの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫血清学的診断試薬用に用いられて有効なラ
テックスの製造方法に関する。

ポリスチレンラテックスに抗原又は抗体を感作させ、こ
れを用いて血清中の対応する抗体又は抗原を、ラテック
スの凝集反応として検出する免疫血清学的診断法はその
簡便性と迅速性の故に、臨床検査の分野において多くの
種類の抗原又は抗体の検出忙拡大適用されている。

［この目的に用いるポリスチレンラテックスは、一般に
粒径が０，０５ない′し１ミクロンでアリ、粒径分布が
狭く粒径の揃ったものが望捷しい。

このようなラテックスは通常公知の乳化重合の方法を用
いて製造できるとされている。その方法上は、例えば水
中にアニオン系、ノニオン系又はカチオン系の乳化剤の
何れか１種又は２種以上を混合したもの、スチレンモノ
マー、水溶性ラジカル開始剤等を共存させて、好ましく
は酸素を除いた雰囲気で、適当な温度に適当な時間保つ
ことである。

この上うにして得られるポリスチレンラテックスにおい
て、その安定性に寄与する乳化剤の存在形態は重要であ
る。一般には、重合の際に用いた乳化剤の一部はポリス
チレンラテックス粒子の表面に吸着されるか化学的に結
合されており、他はラテックス中に遊離の状態で存在し
ており、これらの状態の間には乳化剤のポリスチレンラ
テックス粒子表面に対する吸着脱着平衡が成立している
。このように通常の方法で製造されるポリスチレンラテ
ックスにあっては、乳化剤は安定なラテックスの形成に
不可欠である。

しかしながら、遊離の乳化剤は前述の抗原又は抗体によ
るラテックスの凝集反応に対しては不都合な影響を与え
るのである。すなわち免疫血清学的診断試薬を製造する
には、まず前述の如くポリスチレンラテックスに抗原又
は抗体を感作させる訳であるが、遊離の乳化剤を含むラ
テックスを用いると゛この段階ですでに凝集してしまう
ことがある。次に、抗原又は抗体を感作させたラテック
スを用いて、この抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原
をラテックスの凝集反応によって検出する際には、検出
されるべき抗体又は抗原を含む血清（陽性血清）と接触
すれば感作ラテツクスは凝集し、かかる抗体又は抗原を
含まない血清（陰性血清）と接触しても感作ラテツクス
は凝集しないことが必須要件とされるのであるが、遊離
の乳化剤を含む感作ラテツクスの場合には陰性血清と接
触しても凝集してしまい、いわゆる非特異的凝集反応と
なることがはなはだ多いのである。

勿論、ラテックスに含まれる遊離の乳化剤は、例えばイ
オン交換法や透析法の技術を用いて除くことは可能であ
る。しかし、遊離の乳化剤をラテックスから除いてしま
った場合、前述の如く遊離の乳化剤とラテックス粒子表
面に吸着された乳化剤との間の吸着脱着平衡の成立によ
ってラテックスが安定化されているだめに、ラテックス
の安定性は極端にわるくなり実際上は使用不可能となっ
てしまうのである。

叙上の如く、免疫血清学的診断試薬用ラテックスとして
は、通常の乳化重合法で製造したポリスチレンラテック
スは、遊離の乳化剤を含む点において実用上大きな難点
を有しているのである。

本発明は上記の如き欠点のない免疫血清学的診断試薬と
して用いられるラテックスを提供することを主たる目的
として鋭意研究せる結果なされたものであり、その要旨
はスチレンとスチレンスルホン酸塩とを乳化剤の不存在
Ｆで、過硫酸塩を開始剤として共重合させ、得られた前
記共重合体粒子の懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱処
理し、次いで中性もしくは酸性の条件下で加熱処理を行
なうことを特徴とする、診断試薬用ラテックスの製造方
法に存する。

本発明に用いられるスチレンスルホン酸塩としては、ス
チレンスルホン酸ナトリクム、スチレンスルホン酸カリ
クム、スチレンスルホン酸リチウム、スチレンスルホン
酸アンモニウム等があげられる。これらのスチレンスル
ホン酸塩のスチレンに対する使用割合は３重量％以ドと
されるが、好ましくけ０．０００１％から３％、より好
ましくけα００１％から２％の範囲である。

又、本発明において開始剤として用いられる過硫酸塩さ
しては、過ａｖアンモニウム、過硫酸カリクム、過硫酸
ナトリウム等があげられる。

これらの過硫酸塩のモノマー全体に対する割合は０．０
１ないし１重量％の範囲が好ましい。

スチレンとスチレンスルホン酸塩との共重合は、乳化剤
の不存在下に過硫酸塩を開始剤として行なうことができ
るが、この場合の共重合を原子価が２価の金属の酸化物
又は水酸化物を含有すろ水溶液中で行なうことができる
。

本発明において使用される原子価が２価の金属の酸化物
又は水酸化物々しては、鉄、マグネシウム、カルシクム
、銅の酸化物又は水酸化物等があげられる。これらの２
価の金属の酸化物又は水酸化物の使用量は、スチレンモ
ノマーに対し０．００３〜３．０重量％の範囲とされる
のが好ましい。

本発明において、場合により原子価が２価の金属の酸化
物又は水酸化物が使用されるのは次の理由による。

すなわち乳化剤の不存在Ｆでスチレンとスチレンスルホ
ン酸塩を共重合させて得られるラテックスで粒子径のよ
く揃ったものを得ようとすれば、スチレンモノマーに対
する触媒量を増加するだけでもよい。しかしこの場合、
得られたラテックスを用いて試薬化した際に感度が悪く
、又非特異的凝集反応を示す確率が多く、安定性にすぐ
れたラテックス試薬が得られない。かり忙非特異的凝集
反応の少ない良好なラテックス試薬を得ようとすれば、
非常に純度の高い精製された抗体又は抗原を用いなけれ
ばならず、試薬製造に時間と手間を要するため、高価な
試薬となる。

これに対し原子価が２価の金属の酸化物又は水酸化物を
使用する場合には、これらがラテックス粒子の核として
働き、この棟のまわりをスチレンとスチレンスルホン酸
塩の共重合体が取巻いて均一な粒子のラテックスを形成
する。

この場合においてラテックス粒子が均一に分散状態を保
持し、分散媒に分散された際に沈降したり浮き上ってし
まったりし々いことが必要である。原子価が２価の金属
の酸化物又は水酸化物がラテックス粒子の核として働く
場合は、ラテックス粒子を均一に分散できる程良い比重
を有するものとなり、ラテックス粒子の沈降、浮き上り
を生じないものとすることができる。

本発明方法により診断試薬用ラテックス製造のだめの共
重合を行うには水が仕込まれた反応器内にスチレン、ス
チレンスルホン酸塩、及び開始剤、更に必要に応じ原子
価が２価の金属の酸化物又は水酸化物を加えて撹拌しな
がら加熱すればよく、その１祭の重合反応温度は通常５
０〜１００°Ｃ１好ましくけ６０〜８５℃の範囲とする
のがよい。又、重合反応に要する時間はモノマー組成、
モノマー濃度、開始剤濃度等の条件により変るが、通常
５〜５０時間の範囲である。

このようにしてスチレンとスチレンスルホン酸塩の共重
合体粒子の懸濁液が得られる。

この懸濁液は前記共重合体粒子が均質に単分散した２テ
ツクスである。そして共重合体粒子は乳化剤を全く含ま
ないにも拘らず極めて安定である。その理由は次のよう
に説明できる。

即ち開始剤として過硫酸塩を用いるからポリマー鎖の両
端に硫酸基（５０４−）が存在することＫなり、ポリマ
ー鎖同志の間にはこの硫酸基による電気的反発力が作用
して分散状態が安定化される。しかし、ポリマー鎖末端
の硫酸基による電気的反発力のみでは分散状態の安定化
には不十分であり、これに加えてスチレンスルホン酸塩
を共重合させてポリマー鎖中にスルホン基を導入するこ
とにより、それによる電気的反発力をも加えて始めて十
分に安定な分散状態が得られるのである。

要求されることが多い。高感度の凝集性を得るには分散
状態が安定化しすぎないことが必要であり、常時は分散
状態が安定しているが抗原抗体反応を鋭敏に感応し凝集
性が得られる程度の不安定化要素を有することが必要と
なる。このような分散状態の指標は表面荷電の程度を示
すゼークポテンシャルで表わされる。ラテックスの分散
状態の安定性はゼークポテンシャルが低い程良くなり−
６０ｍ　Ｖ以下ではきわめてすぐれた安定性が得られる
。しかしこのようなゼークポテンシャル領域では安定に
すぎるため抗原抗体反応における鋭敏な凝集性Ｉ−ｉ得
られない。

そこで高感度の凝集性を得るためにゼークポテンシャル
を−４０ｍ　Ｖ近傍に調節することが必要となる。この
ためＫは硫酸基を加水分解し水酸基を経てカルボキシル
基にするのが最適の手段である。

そこで本発明においては上記により得られた前記共重合
体粒子の懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱するのであ
る。この際の加熱温度は通常５０〜９０℃、好ましくは
６０〜８０℃とするのがよく、又加熱時間は１０〜１０
０時間とするのがよい。

そして上記加熱は、反応系をアルカリ性にして行われる
のであるが、その際の反応系のＰＨ値が７．５〜１２．
５、とくに８〜１１０の範ＦＩＪ＋　Ｋ保たれるのがよ
い。

このようＫしてアルカリ性条件下での加熱を行なうと、
硫酸基は水酸基となる。しかしながら硫酸基が水酸基に
なった場合のゼータポテンシャルは一４０ｍＶ近傍に保
たれないものとなる。

そこで凝集性をよくするためにゼータポテンシャルを−
４０ｍ　Ｖ近傍に調整する必要がある。

このためにアルカリ性条件下での処理により生じた水酸
基をカルボキシル基とするものでちる。

このだめアルカリ性条件下で加熱処理後、更に中性もし
くは酸性の条件Ｆで加熱処理を行なう。

この際の加熱温度は通常６０〜８０℃であり、加熱時間
は１０〜５０時間とするのがよい。

このように中性もしくは酸性の条件下で加熱処理するこ
とにより、水酸基がカルボキシル基となり、ゼータポテ
ンシャルを−４０ｍ　Ｖ近傍に調整することができる。

本発明のラテックスの製造方法は上述の通りの高凝集性
が得られ、しかも粒径がよく揃ったラテックスを製造す
ることが出来るのであり、そして該ラテックスは乳化剤
を全く含まないために免疫血清学的診断試薬として用い
られた場合にいわゆる非特異的凝集反応を起すことがな
く、該診断試薬としてすぐれた性能を有するものである
。

次に本発明の実施例について説明する。

実施例−１ スチレンモノマー８０ｙ、スチレンスルホン酸ナトリク
ム０．３ｙ、過硫酸カリタムα２ｙ。

水酸化マグネシウム２．０９．イオン交換水４６０２を
反応容器に仕込み、容器を窒素ガスで置換し反応温度７
０℃で２４時間共重合した。共重合終了後、反応容器の
内部を空気で置換し、懸濁液のｐＨを８，６に調節し、
７０℃で２０時間アルカリ性の条件下で加熱処理したの
ちさらにｐ　Ｈを６，０に保ちながら７０℃で２０時間
加熱処理したのち取り出し電子顕微鏡で粒径を観察した
結果共重合体粒子の平均粒径は０．１１９　Ｅクロン、
粒径のバラツキは変動係数（粒径の標準偏差／平均粒径
）で表わしてα０２であった。

まだ表面荷電を測定した結果ゼータポテンシャルは−４
０ｍ　Ｖであった。ｐ　Ｈ８，５のグリシン緩衝液に分
散したラテックス分散液１容に対し、グリシン緩衝液で
０．１％に希釈したヒトガンマグロブリン溶液１容を混
合し、３７℃６０分間保った後２６．０００　Ｘ　Ｇで
遠心分離して未吸着のヒトガンマグロブリンを除き、沈
降した共重合体粒子をグリシン緩衝液に再分配して均一
な感作ラテツクス分散液とした。この１滴とグリシン緩
衝液で種々の倍率に希釈したりクマチ因子を含む血清１
滴とをガラス板上で混合し、３分間ガラス板をゆるやか
に前後左右に傾けて凝集反応の強さを観察し次表の結果
を得た。

第１表 廿：３分以内に起こる極めて強い凝集 ＋：３分以内に起こる明らかな凝集 ±：５分以内に起こる明らかな凝集 −二５分以後も凝集せず また、リフマチ因子を含む血清のかわりにグリシン緩衝
液で２０倍に希釈したリフマチ因子を含まない血清を用
いて同じ試験をした場合、凝集は全く観察されなかった
。これらの結果から明らかなように１本発明の方法によ
って得られたラテックスを用いて調製した免疫血清学的
診断試薬は感度が高く、かつ非特異的な凝集反応を起こ
さないものである。

実施例−２ スチレンモノマー８０ｙ、スチレンスルホン酸ナトリク
ム０．３９　、過硫酸カリクム０．２　ｙ。

イオン交換水４６０ｙを反応容器に仕込み、容器を窒素
ガスで置換し反応温度７０℃で２１時間共重合した。共
重合終了後、反応容器の内部を空気で置換し、ラテック
スのｐＨを８．０に調節し、７０℃で１５時間アルカリ
性の条件下で加熱処理したのち、さらにｐＨを５．０に
保ちながら７０℃で１５時間加熱処理した後、取り出し
電子顕微鏡で粒径を観察した結果共重合体粒子の平均粒
径は０．１３２／’ｍ、粒径のバラツキは変動係数で表
わして０．０１６であった。また表面荷電を測定した結
果、ゼークポテンシャルは−４２ｍ　Ｖであった。ｐ　
）１８．５のグリシン緩衝液に分散したラテックス分散
液１容に対し、グリシン緩衝液で０．１％に希釈したヒ
トガンマグロブリン溶液１容を混合し、３７℃６０分間
保った後２６０００諷Ｇで遠心分離して未吸着のヒトガ
ンマグロブリンを除き、沈降したラテックス粒子をグリ
シン緩衝液で種々の倍率に希釈したリフマチ因子を含む
血清１滴とをガラス板上で混合し、３分間ガラス板をゆ
るやかに前後左右に傾けて凝集反応の強さを観察し次表
の結果を得た。

第２表 廿＝３分以内に起こる極めて強い凝集 ＋２３分以内に起こる明らか力凝集 ±：５分以内に起こる明らかな凝集 −：５分以後も凝集せず まだ、リフマチ因子を含む血清のかわりにグリジン緩衝
液で２０倍に希釈したリクヤチ因子を含まない血清を用
いて同じ試験をした場合、凝集は全く観察されなかった
。これらの結果力・ら明らかなように１本発明方法によ
って得られたラテック゛スを用いて調製した免疫血清学
的診断試薬は感度が高く、かつ非特異的な凝集反応を起
こさないものである。

比較例 スチレンモノマー９１ｙ、ノニオン乳化剤（第一工業製
薬社製、商品名エマルジット４９）２２、過硫酸カリク
ム０．３　？　、イオン交換水４４０２を反応容器に仕
込み、容器を窒素ガスで置換し反応温度７０℃で２４時
間重合した。、得られたラテックスの平均粒径は０．４
８ミクロン、粒径のばらつきは変動係数で表わして０．
１５であった。また表面荷電を測定した結果、セ°−ク
ポテンシャルｈ　　６５　ｍ　Ｖ　ｆ　ｈつだ。

このラテックスを用いた実施例１と全く同じ方法で免疫
血清学的診断試薬を調製し、１ツクマチ因子を含む血清
による凝集反応の強さを観察し、次表の結果を得た。

第３表 また、リフマチ因子を含まない血清をり°１ノシン緩衝
液で２０倍に希釈したものを用いて同じ試験をした場合
、明らかな凝集がみとめられた。

特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者　　藤　沼　基　利

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　スチレンとスチレンスルホンｅ　塩トラ乳化剤の不
   存在下に過硫酸塩を開始剤として共重合させ、得られた
   前記共重合体粒子の懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱
   処理し、次いで中性もしくは酸性の条件下で加熱処理を
   行なうことを特徴とする、診断試薬用ラテックスの製造
   方法２、　スチレンとスチレンスルホン酸！　、！＝　
   ＝ｋ　ＩＬ　（ｌ：、　斉１の不存在下に、原子価が２
   価の金属の酸化物又は水酸化物を含有する水溶液中で過
   硫酸塩を開始剤として共重合させることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の診断試薬用ラテックスの製造
   方法 ３、　スチレンスルホン酸塩の使用量がスチレンに対し
   ３重量％以下である、特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載の診断試薬用、ラテックスの躯遣方法 先　アルカリ性の条件下での加熱処理を、５０〜９０℃
   で１０〜１００時間行なうことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項から第３項のいずれか記載の診断試薬用ラテ
   ックスの製造方法５、　中性もしくけ酸性の条件下での
   加熱処理を、６０〜８０℃で１０〜５０時間行なうこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項のいずれ
   か記載の診断試薬用ラテックスの製造方法