JPH038363B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、とくに免疫血清学的診断試薬に用い
られて有効なラテツクスの製造方法に関するもの
である。ポリスチレンラテツクスに抗原又は抗体
を感作させ、これを用いて血清中の対応する抗体
又は抗原を、ラテツクスの凝集反応として検出す
る免疫血清学的診断法は、その簡便性と迅速性の
故に、臨床検査の分野において多くの種類の抗原
又は抗体の検出に拡大適用され今日に至つてい
る。この目的に用いるポリスチレンラテツクス
は、一般に粒径が0.05〜1.0ミクロンであり、粒
径分布が狭く粒径の揃つたものが望ましい。この
ようなラテツクスは通常乳化重合の方法を用いて
製造できるとされている。その方法とは、例えば
水中にアニオン系、ノニオン系又はカチオン系の
乳化剤の何れか１種又は２種以上を混合したも
の、スチレンモノマー、水溶性ラジカル開始剤等
を共存させて、好ましくは酸素を除いた雰囲気
で、適当な温度に適当な時間保つことである。こ
のようにして得られるポリスチレンラテツクスに
おいて、その安定性に寄与する乳化剤の存在形態
は重要である。一般には、重合の際に用いた乳化
剤の一部はポリスチレンラテツクス粒子の表面に
吸着されるが化学的に結合されており、他はラテ
ツクス中に遊離の状態で存在しており、これらの
状態において乳化剤のポリスチレンラテツクス粒
子表面に対する吸着脱着平衡が成立している。こ
のように通常の方法で製造されるポリスチレンラ
テツクスにあつては、乳化剤は安定なラテツクス
の形成に不可欠である。 しかしながら、遊離の乳化剤は前述の抗原又は
抗体によるラテツクスの凝集反応に対しては不都
合な影響を与えるのである。すなわち免疫血清学
的診断試薬を製造するには、まず前述の如くポリ
スチレンラテツクスに抗原又は抗体を感作させる
訳であるが、遊離の乳化剤を含むラテツクスを用
いるとこの段階ですでに凝集してしまうことがあ
る。次に、抗原又は抗体を感作させたラテツクス
を用いて、この抗原又は抗体に対応する抗体又か
抗原をラテツクスの凝集反応によつて検出する際
には、検出されるべき抗体又は抗原を含む血清
（陽性血清）と接触すれば感作ラテツクスは凝集
し、かかる抗体又は抗原を含まない血清（陰性血
清）と接触しても感作ラテツクスは凝集しないこ
とが必須要件とされるのであるが、遊離の乳化剤
を含む感作ラテツクスの場合には陰性血清と接触
しても凝集してしまい、いわゆる非特異的凝集反
応となることがはなはだ多いのである。勿論、ラ
テツクスに含まれる遊離の乳化剤は、例えばイオ
ン交換法や透析法の技術を用いて除くことは可能
である。しかし遊離の乳化剤をラテツクスから除
いてしまつた場合、前述の如く遊離の乳化剤とラ
テツクス粒子表面に吸着された乳化剤との間の吸
着脱着平衡の成立によつてラテツクスが安定化さ
れているために、ラテツクスの安定性は極端にわ
るくなり実際上は使用不可能となつてしまうので
ある。叙上の如く、免疫血清学的診断試薬用ラテ
ツクスとしては、通常の乳化重合法で製造したポ
リスチレンラテツクスは遊離の乳化剤を含む点に
おいて実用上大きな問題点を有しているのであ
る。 本発明は上記の様に欠点のない免疫血清学的診
断試薬として用いられるラテツクスを提供するこ
とを主たる目的として鋭意研究せる結果なされた
ものであり、その要旨はスチレンを乳化剤の不存
在下に過硫酸塩を重合開始剤として、水中でPH
7.1〜7.8の弱アルカリ性条件下に重合させ、得ら
れた重合体粒子の分散液をPH7.0〜2.4の中性もし
くは酸性条件下に50〜100℃で５時間以上加熱し
て、前記重合体粒子に架橋を生じさせることを特
徴とする診断試薬用ラテツクスの製造方法に存す
る。 本発明に開始剤として用いられる過硫酸塩とし
ては、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過
硫酸ナトリウム等があげられる。これらの過硫酸
塩のスチレンに対する割合は0.08〜８重量％以下
とされるが、好ましくは0.09〜６重量％、より好
ましくは0.1〜５重量％の範囲である。本発明方
法によりラテツクス製造のための重合を行なうに
は水が仕込まれた反応器内にスチレン及び開始剤
を加えて撹拌しながら加熱し重合する。この時の
PHをアルカリ金属、又はアルカリ土類金属の水酸
化物、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等のアルカリ性
物質、具体的には水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、炭酸ナトリウム等の適宜量を溶解して弱ア
ルカリ性条件下で重合する。この時のPHは7.1〜
7.8とされる。この時の重合温度は通常50〜100
℃、より好ましくは60〜85℃の範囲とされる。又
重合反応に要する時間はモノマー濃度、開始剤等
の組成及び濃度等の条件により変わるが、通常５
〜35時間の範囲が好適である。次に上記重合法で
得られた重合体粒子の分散液を中性もしくは酸性
条件下に加熱して前記重合体粒子に架橋を生じさ
せる。前記重合体粒子に架橋を生じさせる為の
PH、加熱温度及び加熱時間は架橋度により異なる
が、加熱温度は50〜100℃、好ましくは60〜85℃
の範囲、加熱時間は５時間以上、好ましくは５〜
30時間の範囲とするのがよい。加熱時間が30時間
以内で必要な架橋度を有する重合体粒子が得られ
るが、30時間を超えて加熱しても、経済的に損失
であること以外には特に不都合は生じない。架橋
させる為のPHは架橋度により異なるが7.0〜2.4の
範囲とされ、好ましくは6.8〜3.0の範囲である。
スチレンを乳化剤の不存在下に過硫酸塩を重合開
始剤として、水中で弱アルカリ性条件下に重合さ
せ、得られた重合体粒子の分散液を中性もしくは
酸性条件下に加熱して、前記重合体粒子に架橋を
生じさせる理由は、次の点にある。乳化剤を含ま
ないラテツクスで架橋を生じさせないラテツクス
においては重合後の保存安定性が悪いために経時
変化を起しやすい。保存安定性はラテツクスの粒
径が0.2ミクロン以上の場合、特に0.25〜1.0ミク
ロン付近において悪い。またこれらのラテツクス
を使用し試薬化した場合、限られたPH領域、緩衝
液のみしか使用できず試薬安定性（保存性）も悪
い。保存安定性を向上させる為には重合開始剤の
量を増加すれば良いが、今度は逆に粒径が大きく
なり希望する粒径が得られ難い。また保存安定性
のよい重合体粒子の分散液を使用し試薬化した場
合、今度は感度が低くまた非特異的凝集反応を示
す確率が多く、安定性にすぐれたラテツクス試薬
が得られないという相反する結果となる。かりに
非特異的凝集反応の少ない良好なラテツクス試薬
を得ようとすれば非常に純度の高い精製抗体ある
いは精製抗原を用いなければならず試薬製造に相
当な時間と手間を要する為に相当な高価な試薬と
なる。このために重合体粒子に架橋を施すことに
よつてこれらの問題点を解決しようとするもので
ある。又、重合体粒子が架橋されない場合は粒子
表面が破壊されやすいものとなり、凹凸を多数生
ずるので凍結乾燥保存を行うことができないもの
となる。しかし、これら重合体粒子に架橋を生じ
させる事により滑らかでかつ表面強度のすぐれた
球状粒子が得られるので、粒子表面を破壊する事
なく凍結乾燥保存も可能となる。 本発明方法によれば、診断試薬用ラテツクスの
保存安定性、及び試験製造時の多種の緩衝液及び
広いPH領域での試薬化が可能であるばかりでな
く、粒子表面を破壊する事なく凍結乾燥保存が可
能であるという事を見出すと共に免疫血清学的診
断試薬用ラテツクスとして遊離の乳化剤を含むラ
テツクスに見られる非特異凝集反応を生じないも
のが得られる。 実施例 １ スチレンモノマー75ｇ、過硫酸カリウム0.08
ｇ、イオン交換水450ｇを反応容器に仕込み、PH
を7.5に調製したのち反応容器を窒素ガスで置換
し反応温度70℃で24時間重合した。 次に上記重合法で得られた重合体粒子の分散溶
液をPH6.0に保ちながら70℃で24時間加熱した後、
取り出し、電子顕微鏡で粒径を観察した結果、平
均粒径は0.21ミクロン、粒径のばらつきは変動係
数で表わして0.02であつた。次にビーカに重合終
了後のラテツクスを秤量し70℃の乾燥機内で９時
間乾燥したのち取り出し試験管に入れる。次に試
験管にメチル エチル ケトンを投入後、試験管
を完全密閉したのち90℃シリコン浴に於て48時間
抽出した。次に溶解後試験管の封を開き抽出物を
取り出し70℃の乾燥機内で８時間乾燥後ゲル分率
を測定した結果6.3％であつた。架橋された重合
体粒子の顕微鏡写真を第１図に示す。次に上記ラ
テツクスを用い試薬化評価を行なつた。PH8.5の
グリシン緩衝液に分散した重合体粒子の分散液１
容に対し、グリシン緩衝液で0.1％に希釈したヒ
トガンマグロブリン溶液で１容を混合し、37℃に
60分保つた後26000Gで遠心分離して未吸着のヒ
トガンマグロブリンを除き、沈降した重合体粒子
をグリシン緩衝液に再分散して均一な感作ラテツ
クス分散液とした。この１滴とグリシン緩衝液で
種々の倍率に希釈したリウマチ因子を含む血清と
をガラス板上で混合し、３分間ガラス板をゆるや
かに前後左右に傾けて凝集反応の強さを観察し第
１表の結果を得た。

【表】 また、リウマチ因子を含む血清のかわりにグリ
シン緩衝液で20倍に希釈したリウマチ因子を含ま
ない血清を用いて同じ試験をした場合、凝集は全
く観察されなかつた。これらの結果から明らかな
ように、本発明の方法によつて得られたラテツク
スを用いて調製した免疫血清学的診断試薬は感度
が高く、かつ非特異的な凝集反応を起こさないも
のである。 実施例 ２ スチレンモノマー75ｇ、過硫酸カリウム0.45
ｇ、イオン交換水450ｇを反応容器に仕込み、PH
を7.2に調製したのち反応容器を窒素ガスで置換
し反応温度75℃で27時間重合した。 次に上記重合法で得られた重合体粒子の分散溶
液をPH4.5に保ちながら75℃で27時間加熱した後、
取り出し電子顕微鏡で粒径を観察した結果、平均
粒径は0.42ミクロン、粒径のばらつきは変動係数
で表わして0.015であつた。次にビーカに重合終
了後のラテツクスを秤量し70℃の乾燥機内で９時
間乾燥したのち取り出し、試験管に入れる。 次に試験管にメチル エチル ケトンを投入
後、試験管を完全密閉したのち90℃のシリコン浴
に於て48時間抽出した。次に溶解後試験管の封を
抽出物を取り出し70℃の乾燥機内で８時間乾燥後
ゲル分率を測定した結果13.1％であつた。架橋さ
れた重合体粒子の顕微鏡写真を第２図に示す。次
に上記ラテツクスを用い試薬化評価を行なつた。
PH8.5のグリシン緩衝液に分散した重合体粒子の
分散液１容に対し、グリシン緩衝液で0.1％に希
釈したヒトガンマグロプリン溶液１容を混合し、
37℃で60分保つた後26000Gで遠心分離して未吸
着のヒトガンマグロプリンを除き、沈降した重合
体粒子をグリシン緩衝液で種々の倍率に希釈した
リウマチ因子を含む血清とをガラス板上で混合
し、３分間ガラス板をゆるやかに前後左右に傾け
て凝集反応の強さを観察し第２表の結果を得た。

【表】 また、リウマチ因子を含む血清のかわりにグリ
シン緩衝液で20倍に希釈したリウマチ因子を含ま
ない血清を用いて同じ試験をした場合、凝集は全
く観察されなかつた。これらの結果から明らかな
ように、本発明の方法によつて得られたラテツク
スを用いて調製した免疫血清学的診断試薬は感度
が高く、かつ非特異的な凝集反応を起こさないも
のである。 比較例 １ スチレンモノマー91ｇ、ノニオン乳化剤（第一
工業製薬社製、商品名エマルジツト49）２ｇ、過
硫酸カリウム0.3ｇ、イオン交換水440ｇを反応容
器に仕込み、容器を窒素ガスで置換し反応温度70
℃で24時間重合した。得られた重合体粒子の平均
粒径は0.48ミクロン、粒径のばらつきは変動係数
で表わして0.15であつた、次にビーカに重合終了
後のラテツクスを秤量し70℃の乾燥機内で９時間
乾燥したのち取り出し試験管に入れる。実施例
１、２で示す操作手順に従いゲル分率を測定した
結果０％であつた。次に上記ラテツクスを用い実
施例１、２と全く同じ方法で免疫血清学的診断試
薬を調製し、リウマチ因子を含む血清による凝集
反応の強さを観察し、次表の結果を得た。

【表】 また、リウマチ因子を含まない血清をグリシン
緩衝液で20倍に希釈したものを用いて同じ試験を
した場合、明らかな凝集がみとめられた。 比較例 ２ スチレンモノマー75ｇ、過硫酸カリウム0.45
ｇ、イオン交換水450ｇを反応容器に仕込み、反
応容器を窒素ガスで置換し反応温度75℃で27時間
重合した。得られた重合体粒子の平均粒径は0.95
ミクロン、粒径のばらつきは変動係数で表わして
0.121であつた。次にビーカに重合終了後のラテ
ツクスを秤量し70℃の乾燥機内で９時間乾燥した
のち取り出し、試験管に入れる。実施例１、２で
示す操作手順に従いゲル分率を測定した結果０％
であつた。この場合の重合体粒子の顕微鏡写真を
第３図に示す。次に上記ラテツクスを用い実施例
１、２と全く同じ方法で免疫血清学的診断試薬を
調製し、リウマチ因子を含む血清による凝集反応
の強さを観察し、次表の結果を得た。

【表】 また、リウマチ因子を含まない血清をグリシン
緩衝液で20倍に希釈したものを用いて同じ試験を
した場合、明らかな凝集がみとめられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において得られた架橋された
スチレン重合体粒子の電子顕微鏡写真、第２図は
実施例２において得られた架橋されたスチレン重
合体粒子の電子顕微鏡写真、第３図は比較例２に
おいて得られた架橋されないスチレン重合体粒子
の電子顕微鏡写真である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ スチレンを乳化剤の不存在下に過硫酸塩を重
   合開始剤として水中でPH7.1〜7.8の弱アルカリ性
   条件下に重合させ、得られた重合体粒子の分散液
   をPH7.0〜2.4の中性もしくは酸性条件下に50〜
   100℃で５時間以上加熱して、前記重合体粒子に
   架橋を生じさせることを特徴とする、診断試薬用
   ラテツクスの製造方法。