JPH0136485B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫血清学的診断試薬用に用いられて
有効なラテツクスの製造方法に関する。 ポリスチレンラテツクスに抗原又は抗体を感作
させ、これを用いて血清中の対応する抗体又は抗
原を、ラテツクスの凝集反応として検出する免疫
血清学的診断法はその簡便性と迅速性の故に、臨
床検査の分野において多くの種類の抗原又は抗体
の検出に拡大適用されている。 この目的に用いるポリスチレンラテツクスは、
一般に粒径が0.05ないし１ミクロンであり、粒径
分布が狭く粒径の揃つたものが望ましい。このよ
うなラテツクスは通常公知の乳化重合の方法を用
いて製造できるとされている。その方法とは、例
えば水中にアニオン系、ノニオン系又はカチオン
系の乳化剤の何れか１種又は２種以上を混合した
もの、スチレンモノマー、水溶性ラジカル開始剤
等を共存させて、好ましくは酸素を除いた雰囲気
で、適当な温度に適当な時間保つことである。 このようにして得られるポリスチレンラテツク
スにおいて、その安定性に寄与する乳化剤の存在
形態は重要である。一般には、重合の際に用いた
乳化剤の一部はポリスチレンラテツクス粒子の表
面に吸着されるか化学的に結合されており、他は
ラテツクス中に遊離の状態で存在しており、これ
らの状態の間には乳化剤のポリスチレンラテツク
ス粒子表面に対する吸着脱着平衡が成立してい
る。このように通常の方法で製造されるポリスチ
レンラテツクスにあつては、乳化剤は安定なラテ
ツクスの形成に不可欠である。しかしながら、遊
離の乳化剤は前述の抗原又は抗体によるラテツク
スの凝集反応に対しては不都合な影響を与えるの
である。すなわち免疫血清学的診断試薬を製造す
るには、まず前述の如くポリスチレンラテツクス
に抗原又は抗体を感作させる訳であるが、遊離の
乳化剤を含むラテツクスを用いるとこの段階です
でに凝集してしまうことがある。次に、抗原又は
抗体を感作させたラテツクスを用いて、この抗原
又は抗体に対応する抗体又は抗原をラテツクスの
凝集反応によつて検出する際には、検出されるべ
き抗体又は抗原を含む血清（陽性血清）と接触す
れば感作ラテツクスは凝集し、かかる抗体又は抗
原を含まない血清（陰性血清）と接触しても感作
ラテツクスは凝集しないことが必須要件とされる
のであるが、遊離の乳化剤を含む感作ラテツクス
の場合には陰性血清と接触しても凝集してしま
い、いわゆる非特異的凝集反応となることがはな
はだ多いのである。 勿論、ラテツクスに含まれる遊離の乳化剤は、
例えばイオン交換法や透析法の技術を用いて除く
ことは可能である。しかし、遊離の乳化剤をラテ
ツクスから除いてしまつた場合、前述の如く遊離
の乳化剤とラテツクス粒子表面に吸着された乳化
剤との間の吸着脱着平衡の成立によつてラテツク
スが安定化されているために、ラテツクスの安定
性は極端にわるくなり実際上は使用不可能となつ
てしまうのである。 叙上の如く、免疫血清学的診断試薬用ラテツク
スとしては、通常の乳化重合法で製造したポリス
チレンラテツクスは、遊離の乳化剤を含む点にお
いて実用上大きな難点を有しているのである。 本発明は上記の如き欠点のない免疫血清学的診
断試薬として用いられるラテツクスを提供するこ
とを主たる目的として鋭意研究せる結果なされた
ものであり、その要旨はスチレンとスチレンスル
ホン酸塩とを乳化剤の不存在下で、過硫酸塩を開
始剤として共重合させ、得られた前記共重合粒子
の懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱処理し、次
いで中性もしくは酸性の条件下で加熱処理を行な
うことを特徴とする、診断試薬用ラテツクスの製
造方法に存する。 本発明に用いられるスチレンスルホン酸塩とし
ては、スチレンスルホン酸ナトリウム、スチレン
スルホン酸カリウム、スチレンスルホン酸リチウ
ム、スチレンスルホン酸アンモニウム等があげら
れる。これらのスチレンスルホン酸塩のスチレン
に対する使用割合は３重量％以下とされるが、好
ましくは0.0001％から３％、より好ましくは
0.001％から２％の範囲である。又、本発明にお
いて開始剤として用いられる過硫酸塩としては、
過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過硫酸ナ
トリウム等があげられる。これらの過硫酸塩のモ
ノマー全体に対する割合は0.01ないし１重量％の
範囲が好ましい。スチレンとスチレンスルホン酸
塩との共重合は、乳化剤の不存在下に過硫酸塩を
開始剤として行なうことができるが、この場合の
共重合を原子価が２価の金属の酸化物又は水酸化
物を含有する水溶液中で行なうことができる。 本発明において使用される原子価が２価の金属
の酸化物又は水酸化物としては、鉄、マグネシウ
ム、カルシウム、銅の酸化物又は水酸化物等があ
げられる。これらの２価の金属の酸化物又は水酸
化物の使用量は、スチレンモノマーに対し0.003
〜3.0重量％の範囲とされるのが好ましい。 本発明において、場合により原子価が２価の金
属の酸化物又は水酸化物が使用されるのは次の理
由による。 すなわち乳化剤の不存在下でスチレンとスチレ
ンスルホン酸塩を共重合させて得られるラテツク
スで粒子径のよく揃つたものを得ようとすれば、
スチレンモノマーに対する触媒量を増加するだけ
でもよい。しかしこの場合、得られたラテツクス
を用いて試薬化した際に感度が悪く、又非特異的
凝集反応を示す確率が多く、安定性にすぐれたラ
テツクス試薬が得られない。かりに非特異的凝集
反応の少ない良好なラテツクス試薬を得ようとす
れば、非常に純度の高い精製された抗体又は抗原
を用いなければならず、試薬製造に時間と手間を
要するため、高価な試薬となる。 これに対し原子価が２価の金属の酸化物又は水
酸化物を使用する場合には、これらがラテツクス
粒子の核として働き、この核のまわりをスチレン
とスチレンスルホン酸塩の共重合体が取巻いて均
一な粒子のラテツクスを形成する。 この場合においてラテツクス粒子が均一に分散
状態を保持し、分散媒に分散された際に沈降した
り浮き上つてしまつたりしないことが必要であ
る。原子価が２価の金属の酸化物又は水酸化物が
ラテツクス粒子の核として働く場合は、ラテツク
ス粒子を均一に分散できる程良い比重を有するも
のとなり、ラテツクス粒子の沈降、浮き上りを生
じないものとすることができる。 本発明方法により診断試薬用ラテツクス製造の
ための共重合を行うには水が仕込まれた反応器内
にスチレン、スチレンスルホン酸塩、及び開始
剤、更に必要に応じ原子価が２価の金属の酸化物
又は水酸化物を加えて撹拌しながら加熱すればよ
く、その際の重合反応温度は通常50〜100℃、好
ましくは60〜85℃の範囲とするのがよい。又、重
合反応に要する時間はモノマー組成、モノマー濃
度、開始剤濃度等の条件により変るが、通常５〜
50時間の範囲である。このようにしてスチレンと
スチレンスルホン酸塩の共重合体粒子の懸濁液が
得られる。 この懸濁液は前記共重合体粒子が均質に単分散
したラテツクスである。そして共重合体粒子は乳
化剤を全く含まないにも拘らず極めて安定であ
る。その理由は次のように説明できる。 即ち開始剤として過硫酸塩を用いるからポリマ
ー鎖の両端に硫酸基（SO₄ ^--）が存在することに
なり、ポリマー鎖同志の間にはこの硫酸基による
電気的反発力が作用して分散状態が安定化され
る。しかし、ポリマー鎖末端の硫酸基による電気
的反発力のみでは分散状態の安定化には不十分で
あり、これに加えてスチレンスルホン酸塩を共重
合させてポリマー鎖中にスルホン基を導入するこ
とにより、それによる電気的反発力をも加えて始
めて十分に安定な分散状態が得られるのである。 しかしながら診断試薬用ラテツクスとしては、
抗原抗体反応を鋭敏に感応し、高感度の凝集性を
有することが要求されることが多い。高感度の凝
集性を得るには分散状態が安定化しすぎないこと
が必要であり、常時は分散状態が安定しているが
抗原抗体反応を鋭敏に感応し凝集性が得られる程
度の不安定化要素を有することが必要となる。こ
のような分散状態の指標は表面荷電の程度を示す
ゼータポテンシヤルで表わされる。ラテツクスの
分散状態の安定性はゼータポテンシヤルが低い程
良くなり−60ｍＶ以下ではきわめてすぐれた安定
性が得られる。しかしこのようなゼータポテンシ
ヤル領域では安定にすぎるため抗原抗体反応にお
ける鋭敏な凝集性は得られない。そこで高感度の
凝集性を得るためにゼータポテンシヤルを−40ｍ
Ｖ近傍に調節することが必要となる。このために
は硫酸基を加水分解し水酸基を経てカルボキシル
基にするのが最適の手段である。 そこで本発明においては上記により得られた前
記共重合体粒子の懸濁液をアルカリ性の条件下で
加熱するのである。この際の加熱温度は通常50〜
90℃、好ましくは60〜80℃とするのがよく、又加
熱時間は10〜100時間とするのがよい。 そして上記加熱は、反応系をアルカリ性にして
行われるのであるが、その際の反応系のPH値が
7.5〜12.5、とくに８〜11.0の範囲に保たれるのが
よい。 このようにしてアルカリ性条件下での加熱を行
なうと、硫酸基は水酸基となる。しかしながら硫
酸基が水酸基になつた場合のゼータポテンシヤル
は−40ｍＶ近傍に保たれないものとなる。そこで
凝集性をよくするためにゼータポテンシヤルを−
40ｍＶ近傍に調整する必要がある。このためにア
ルカリ性条件下での処理により生じた水酸基をカ
ルボキシル基とするものである。このためアルカ
リ性条件下で加熱処理後、更に中性もしくは酸性
の条件下で加熱処理を行なう。この際の加熱温度
は通常60〜80℃であり、加熱時間は10〜50時間と
するのがよい。このように中性もしくは酸性の条
件下で加熱処理することにより、水酸基がカルボ
キシル基となり、ゼータポテンシヤルを−40ｍＶ
近傍に調整することができる。 本発明のラテツクスの製造方法は上述の通りの
構成であるので、乳化剤を全く含まないにもかゝ
わらず常時は安定で抗原抗体反応に鋭敏に感応し
て高凝集性が得られ、しかも粒径がよく揃つたラ
テツクスを製造することが出来るのであり、そし
て該ラテツクスは乳化剤を全く含まないために免
疫血清学的診断試薬として用いられた場合にいわ
ゆる非特異的凝集反応を起すことがなく、該診断
試薬としてすぐれた性能を有するものである。 次に本発明の実施例について説明する。 実施例 １ スチレンモノマー80ｇ、スチレンスルホン酸ナ
トリウム0.3ｇ、過硫酸カリウム0.2ｇ、水酸化マ
グネシウム2.0ｇ、イオン交換水460ｇを反応容器
に仕込み、容器を窒素ガスで置換し反応温度70℃
で24時間共重合した。共重合終了後、反応容器の
内部を空気で置換し、懸濁液のPHを8.6に調節し、
70℃で20時間アルカリ性の条件下で加熱処理した
のちさらにPHを6.0に保ちながら70℃で20時間加
熱処理したのち取り出し電子顕微鏡で粒径を観察
した結果共重合体粒子の平均粒径は0.119ミクロ
ン、粒径のバラツキは変動係数（粒径の標準偏
差／平均粒径）で表わして0.02であつた。また表
面荷電を測定した結果ゼータポテンシヤルは−40
ｍＶであつた。PH8.5のグリシン緩衝液に分散し
たラテツクス分散液１容に対し、グリシン緩衝液
で0.1％に希釈したヒトガンマグロブリン溶液１
容を混合し、37℃60分間保つた後26000×Ｇで遠
心分離して未吸着のヒトガンマグロブリンを除
き、沈降した共重合体粒子をグリシン緩衝液に再
分配して均一な感作ラテツクス分散液とした。こ
の１滴とグリシン緩衝液で種々の倍率に希釈した
リウマチ因子を含む血清１滴とをガラス板上で混
合し、３分間ガラス板をゆるやかに前後左化に傾
けて凝集反応の強さを観察し次表の結果を得た。

【表】 また、リウマチ因子を含む血清のかわりにグリ
シン緩衝液で20倍に希釈したリウマチ因子を含ま
ない血清を用いて同じ試験をした場合、凝集は全
く観察されなかつた。これらの結果から明らかな
ように、本発明の方法によつて得られたラテツク
スを用いて調製した免疫血清学的診断試薬は感度
が高く、かつ非特異的な凝集反応を起こさないも
のである。 実施例 ２ スチレンモノマー80ｇ、スチレンスルホン酸ナ
トリウム0.3ｇ、過硫酸カリウム0.2ｇ、イオン交
換水460ｇを反応容器に仕込み、容器を窒素ガス
で置換し反応温度70℃で21時間共重合した。共重
合終了後、反応容器の内部を空気で置換し、ラテ
ツクスのPHを8.0に調節し、70℃で15時間アルカ
リ性の条件下で加熱処理したのち、さらにPHを
5.0に保ちながら70℃で15時間加熱処理した後、
取り出し電子顕微鏡で粒径を観察した結果共重合
体粒子の平均粒径は0.132μｍ、粒径のバラツキは
変動係数で表わして0.016であつた。また表面荷
電を測定した結果、ゼータポテンシヤルは−42ｍ
Ｖであつた。PH8.5のグリシン緩衝液に分散した
ラテツクス分散液１容に対し、グリシン緩衝液で
0.1％に希釈したヒトガンマグロブリン溶液１容
を混合し、37℃60分間保つた後26000×Ｇで遠心
分離して未吸着のヒトガンマグロブリンを除き、
沈降したラテツクス粒子をグリシン緩衝液で種々
の倍率に希釈したリウマチ因子を含む血清１滴と
をガラス板上で混合し、３分間ガラス板をゆるや
かに前後左右に傾けて凝集反応の強さを観察し次
表の結果を得た。

【表】

【表】 また、リウマチ因子を含む血清のかわりにグリ
シン緩衝液で20倍に希釈したリウマチ因子を含ま
ない血清を用いて同じ試験をした場合、凝集は全
く観察されなかつた。これらの結果から明らかな
ように、本発明方法によつて得られたラテツクス
を用いて調製した免疫血清学的診断試薬は感度が
高く、かつ非特異的な凝集反応を起こさないもの
である。 比較例 スチレンモノマー91ｇ、ノニオン乳化剤（第一
工業製薬社製、商品名エマルジツト49）２ｇ、過
硫酸カリウム0.3ｇ、イオン交換水440ｇを反応容
器に仕込み、容器を窒素ガスで置換し反応温度70
℃で24時間重合した。得られたラテツクスの平均
粒径は0.48ミクロン、粒径のばらつきは変動係数
で表わして0.15であつた。また表面荷電を測定し
た結果、ゼータポテンシヤルは−65ｍＶであつ
た。 このラテツクスを用いた実施例１と全く同じ方
法で免疫血清学的診断試薬を調製し、リウマチ因
子を含む血清による凝集反応の強さを観察し、次
表の結果を得た。

【表】 また、リウマチ因子を含まない血清をグリシン
緩衝液で20倍に希釈したものを用いて同じ試験を
した場合、明らかな凝集がみとめられた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スチレンとスチレンスルホン酸塩とを乳化剤
   の不存在下に過硫酸塩を開始剤として共重合さ
   せ、得られた前記共重合体粒子の懸濁液をアルカ
   リ性の条件下で加熱処理し、次いで中性もしくは
   酸性の条件下で加熱処理を行なうことを特徴とす
   る、診断試薬用ラテツクスの製造方法。 ２ スチレンとスチレンスルホン酸塩とを乳化剤
   の不存在下に、原子価が２価の金属の酸化物又は
   水酸化物を含有する水溶液中で過硫酸塩を開始剤
   として共重合させることを特徴とする、特許請求
   の範囲第１項記載の診断試薬用ラテツクスの製造
   方法。 ３ スチレンスルホン酸塩の使用量がスチレンに
   対し３重量％以下である、特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の診断試薬用ラテツクスの製造方
   法。 ４ アルカリ性の条件下での加熱処理を、50〜90
   ℃で10〜100時間行なうことを特徴とする、特許
   請求の範囲第１項から第３項のいずれか記載の診
   断試薬用ラテツクスの製造方法。 ５ 中性もしくは酸性の条件下での加熱処理を、
   60〜80℃で10〜50時間行なうことを特徴とする、
   特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか記載
   の診断試薬用ラテツクスの製造方法。