JPH07260788A - 免疫凝集反応による抗体又は抗原の濃度定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫凝集反応に基づき検体中の抗体又は抗原
を測定する場合に、高濃度においても再現性よく測定で
きる定量方法を提供する。 【構成】 抗原又は抗体を担持させた不溶性担体を分散
した溶液と検体とを混合し、免疫凝集反応により前記不
溶性担体の凝集度を検出することにより前記抗原又は抗
体に対応する検体中の抗体又は抗原の濃度を測定する方
法において、一定の凝集度に到達するまでの経過時間を
測定して検体中の抗体又は抗原の濃度を定量する免疫凝
集反応による抗体又は抗原の濃度定量法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫凝集反応による、
検体中の抗体又は抗原の濃度定量法に関する。

【０００２】

【従来の技術】不溶性担体に抗原又は抗体を担持させた
免疫測定用試薬を用いて、血清中の抗体又は抗原との特
異的抗原抗体反応により不溶性担体の免疫凝集反応を生
じさせ、上記不溶性担体の凝集度を検出することにより
血清中の抗体又は抗原を測定することが、従来から免疫
血清学的診断法として臨床検査の分野において行われて
おり、例えばリウマチ因子、抗ストレプトリジン−Ｏ
（ＡＳＯ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）等の検査
に用いられている。

【０００３】近年、ＣＲＰ等の免疫血清学的項目につい
ての測定において、免疫凝集反応の測定上限を超える要
求もされるようになってきた。従来、より広い濃度範囲
における測定を可能にするために免疫測定用試薬の改良
や、免疫測定のための専用のシステムを用いて検量線を
補正する方法が採用されてきた。例えば、二種以上の濃
度の抗体又は抗原の標準品を測定して予め検量線を作成
することにより、不溶性担体の凝集度と抗体又は抗原の
濃度との関係が明らかにされている。しかし、これは通
常シグモイド形と呼ばれる免疫反応特有のＳ字形のカー
ブとなり、濃度測定可能範囲の高濃度側において濃度の
変化に対して凝集度の変化は小さくなり、やがて０にな
るため、高濃度で再現性よく測定することは困難であっ
た。

【０００４】さらに高濃度側においては、免疫凝集反応
は遅滞現象（以下「プロゾーン現象」ともいう）を起こ
す。この遅滞現象は、測定域をはるかに超える濃度では
測定域中の濃度を測定したときと同じ結果を与えること
がある。そのため、濃度定量に際して測定結果がプロゾ
ーン現象によるものであるかどうかを判定する必要があ
り、これに関しては特開昭６３−１９５６０号公報等に
その判定方法等が開示されている。

【０００５】しかし、これらの方法によったとしても従
来の方法による検量線を用いている限り高濃度における
再現性不良やプロゾーン現象等の免疫凝集反応特有の制
約を受けることに変わりはなく、高濃度において再現性
よく抗体又は抗原を定量することは困難であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、免疫凝集反応に基づき検体中の抗体又は抗原を測定
する場合に、高濃度においても再現性よく測定できる定
量方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、抗原又
は抗体を担持させた不溶性担体を分散した溶液と検体と
を混合し、免疫凝集反応により前記不溶性担体の凝集度
を検出することにより前記抗原又は抗体に対応する検体
中の抗体又は抗原の濃度を測定する方法において、一定
の凝集度に到達するまでの経過時間を測定して検体中の
抗体又は抗原の濃度を定量するところにある。

【０００８】本発明においては、検量線を作成する。ま
ず濃度の異なるいくつかの標準品について吸光度変化と
経過時間とをそれぞれ一定回数測定して表にする。次に
上記表に基づき各濃度においてもっとも再現性の良い経
過時間を選び、その時の吸光度変化を求める。この吸光
度変化を、経過時間及び吸光度変化をそれぞれ横軸と縦
軸にした座標平面上にプロットして検量線を作成する。
次に測定しようとする検体の経過時間と吸光度変化との
関係を表すグラフ（以下「タイムコース」ともいう）を
上記座標平面上に重ねて、その交点の濃度を測定値とす
る。

【０００９】検体中の抗体又は抗原の濃度が、例えば、
６０ｎｇ／ｍｌ以上のように非常に高い場合、免疫凝集
反応が非常に迅速に起こるため、本発明の検量線の上端
が下に落ちてくる現象が認められる。しかし、高い濃度
においてはタイムコースが正の傾きを持っており、タイ
ムコースが単調に増加している範囲では、検量線の上端
の落ちがタイムコースの傾きより急にならないかぎり検
量線とタイムコースとが多点で交わることは実質上な
い。プロゾーン現象等が起こりタイムコースが増加した
後減少して検量線と多点で交わる場合があると考えられ
るが、その場合はタイムコースが正の傾きをもっている
部分での交点をもって測定値とすることができる。

【００１０】本発明においては、上記検量線上の点はい
ずれも各濃度の凝集度について最適な再現性を有する。
従って、検体のタイムコースが上記検量線と交わるまで
の経過時間を測定することにより、上記経過時間に対応
する検量線上の点の濃度が検体中の抗体又は抗原の濃度
を与えることになる。

【００１１】本発明で使用される不溶性担体としては、
無機物質粉末、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜
片等が用いられる。無機物質粉末の素材としては、例え
ば、金、チタン、鉄、ニッケル等の金属；アルミナ等の
金属酸化物又はシリカ等のけい素酸化物等が用いられ
る。有機高分子粉末の素材としては、例えば、ポリスチ
レンスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合
体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロ
ニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル
−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニル−アク
リレート共重合体等の重合体が用いられる。特にこれら
の重合体の粒子粉末を均一に懸濁させたラテックスが好
適に用いられる。ラテックスの平均粒径は、検体中の抗
体又は抗原の検出方法、検出濃度又は検出機器等によっ
て適宜選択されるが、通常０．０５〜１．０μｍであ
り、特に０．０５〜０．５μｍが好ましい。

【００１２】本発明においては、例えば、まず上記不溶
性担体に抗体又は抗原を担持させる。使用する不溶性担
体の濃度は、光学的測定に用いる場合には、通常、０．
０５〜３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１．０ｍｇ／
ｍｌであり、目視観察に用いる場合には、通常、０．５
〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１．０〜５．０ｍｇ／
ｍｌである。この不溶性担体に担持させる抗体として
は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいず
れもが使用できる。

【００１３】これらのモノクローナル抗体及びポリクロ
ーナル抗体は、一般的な免疫及び精製の工程を採用し
て、公知の方法により得られる。例えば、モノクローナ
ル抗体はハイブリドーマを用いる方法（リンパ腫を引き
起こすＥＢウィルスを用いて特定のＢリンパ球を増やす
方法）又はマウス骨髄由来の培養細胞や酵母等の微生物
を遺伝子操作する方法等を用いることにより得られ、例
えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種
クロマトグラフィーを組み合わせて使用することにより
精製される。また、ポリクローナル抗体は、例えば、抗
原となる物質で適当な動物を免疫することにより得ら
れ、モノクローナル抗体と同様の操作を行うことにより
精製される。

【００１４】その他γ−グロブリン（免疫グロブリン）
又はＩｇＧ及びこれらの抗体のＦｃ部分を酵素により分
解し除去した抗体（例えば、Ｆ（ａｂ′）₂ ）も使用で
きる。

【００１５】使用される抗原の種類も特に限定されな
い。例えば、タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、
多糖類、脂質等が測定の目的に応じて用いられる。

【００１６】上記抗体又は抗原を上記不溶性担体に担持
させるには、通常の化学的結合又は物理的吸着により行
うことができる。

【００１７】上記不溶性担体と検体中の抗体又は抗原と
の免疫凝集反応におけるｐＨは、通常５〜１０であり、
特に６〜８が好ましい。使用される緩衝液としては、例
えば、りん酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等
の通常の緩衝液がある。反応温度は、通常０〜５０℃で
あり、２０〜４０℃が好適に用いられる。

【００１８】本発明により定量できる検体は、抗原、抗
体等の免疫学的に活性な被測定物質を含有する試料、特
に血液、胸水、腹水、リンパ液等の体液；尿、便、汗等
の排泄物、組織の抽出物等の生体試料である。上記検体
の測定すべき成分としては、免疫凝集反応しうる抗原、
抗体等の免疫学的に活性なあらゆる物質が挙げられ、従
来測定されていた物質のいずれでもよい。例えば、アン
チトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、アルファフェトプ
ロテイン（ＡＦＰ）、リウマチ因子、抗ストレプトリジ
ン−Ｏ（ＡＳＯ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、
フィブリノーゲン−フィブリン分解物（ＦＤＰ）、ヒト
繊毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、癌胎性抗原（ＣＥ
Ａ）等のタンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖
類、脂質等が挙げられる。

【００１９】本発明により検体中の抗体又は抗原を光学
的に測定するには、既知の装置が用いられる。例えば、
吸光度を測定する通常の分光光度計、光の散乱強度を測
定する装置、粒子数や粒子径を測定するための装置等が
挙げられる。免疫凝集反応を測定するための専用装置と
しては、分光光度計を組み込んだ生化学自動分析装置、
免疫比濁法による凝集反応を測定するための専用装置、
フローインジェクションを利用して凝集反応を測定する
ための専用装置、ラテックス凝集反応を測定するための
専用装置等があるが、これらの専用装置でも測定値を得
るためのプログラムを改良することにより、本発明の濃
度定量法を応用することができる。

【００２０】吸光度を測定する代わりに、散乱光を測定
する方法等も用いられる。測定は吸光度を測定する場合
と同様に３００〜１０００ｎｍの適当な波長で行うこと
ができるが、ラテックスの粒径に対して充分長い波長を
用いることが好ましい。

【００２１】

【作用】本発明においては、経過時間と凝集度の座標平
面上で検体中の抗体又は抗原の一定濃度に対して最も再
現性が良くなる点をとり、上記点を結んだ折れ線の線分
又は上記点群から得られるスプライン曲線を検量線とし
て用い、免疫凝集反応によって得られる凝集度のタイム
コースが上記検量線と交わる点から得られる濃度を測定
値とすることにより、低濃度では従来と同じ検量線とな
り、高濃度においては、理論上プロゾーン現象の影響を
受けることのない検量線となる。

【００２２】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ ラテックス凝集反応を利用したＣＲＰの測定 （１）抗ＣＲＰ抗体担持ラテックス試薬の調製 抗ヒトＣＲＰヤギ産生抗体（ＡＴＡＢ社製）を２ｍｇ／
ｍｌの濃度で０．０２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解した液５ｍｌに、平均粒径が０．１μｍのポリスチ
レン系ラテックス（固形分１０％、積水化学社製）５０
０μｌを添加し１８℃にて２時間３０分攪拌した（抗体
の不溶性担体への担持工程）。次に、ウシ血清アルブミ
ンを２％の濃度で含有し、界面活性剤を含有しないりん
酸緩衝液（０．３５Ｍ、ｐＨ６．５）５ｍｌを上記のラ
テックス溶液に混合し、室温で一晩攪拌を続けた。その
後４℃で保存した。

【００２３】（２）ＣＲＰの光学的測定 検体（ＣＲＰ高値血清（６０ｎｇ／ｍｌ；米国ＴＳＩ社
製）を５％ウシ血清アルブミンにて希釈し提供する。）
３μｌを、ウシ血清アルブミンを１％、ＰＥＧ（ポリエ
チルングリコール６０００：和光純薬社製；和光一級試
薬；平均分子量７５００）を３％の濃度で添加したりん
酸緩衝液（０．３５Ｍ、ｐＨ６．５）３５０μｌにて希
釈し３７℃にてインキュベートし、約５分後（１）で用
意したラテックス試薬２００μｌを添加、攪拌し３７℃
にてインキュベートしながら経時的に濁度を測定した。
経過時間はポイント単位で示した。１ポイントは約２０
秒で、検体を分注した時点を０ポイントとした。

【００２４】（３）検量線の作成 １．ＣＲＰラテックス試薬を用い検体濃度０、４、８、
１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４
４、４８、５２、５６及び６０ｎｇ／ｍｌの再現性を測
定した（ｎ＝６、但しｎはデータ数を示す。）。 ２．再現性のデータをもとに最も再現性の良い点を選
び、ポイントと吸光度差（以下「ΔＡＢＳ」ともいう）
の座標平面に検量線を描いた。グラフ上のデータポイン
トの濃度は左上から順に６０、５２、４８、４４、３
６、２４、２０、１６、１２、８、４、０ｎｇ／ｍｌで
ある。

【００２５】図１に示すように、従来の検量線を用いた
ものに比べてより高値まで再現性良く測定が可能となっ
た。この例では、比較例１の場合最も再現性の悪い３０
ｎｇ／ｍｌ付近において変動係数（ＣＶ）が０．３７％
であるのが０．３１％にまで改善された。高濃度側の測
定限界は許容される再現性によって決まってくるが、比
較例１では検体中の抗体又は抗原の濃度３０ｎｇ／ｍｌ
が事実上の測定限界であるのに対し、６０ｎｇ／ｍｌま
で測定が可能となった。

【００２６】比較例１ ラテックス凝集反応を利用したＣＲＰの測定 抗ＣＲＰ抗体担持ラテックス試薬の調製及びＣＲＰの光
学的測定は実施例１と同様に行った。 検量線の作成 １．ＣＲＰラテックス試薬を用い検体濃度０、４、８、
１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４
４、４８、５２、５６及び６０ｎｇ／ｍｌの再現性を測
定した（ｎ＝６、但しｎはデータ数を示す。）。 ２．従来と同様最長ポイント（３２ポイント）でのΔＡ
ＢＳと検体濃度の検量線を描いた。これを図２に示す。

【００２７】

【発明の効果】本発明は、上記構成の如くごく短い経過
時間での吸光度差をとることにより検量線を作成するの
で、検体濃度が高く、経過時間を長くとると濃度の差に
対する吸光度差は小さくなる場合でも、吸光度差を充分
大きくとれるため、高濃度域の定量が可能となり、ま
た、プロゾーン現象を起こすような領域においても、ご
く短い経過時間での吸光度差をとることにより、その濃
度を定量することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明により得られた実施例１の検量線上に３
０ｎｇ／ｍｌのＣＲＰを含む検体を測定した場合のタイ
ムコースを重ねた図。縦軸は吸光度差（×１０００
０）、横軸はポイントを示す。

【図２】比較例１の検量線。縦軸は吸光度差（×１００
００）、横軸は濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原又は抗体を担持させた不溶性担体を
   分散した溶液と検体とを混合し、免疫凝集反応により前
   記不溶性担体の凝集度を検出することにより前記抗原又
   は抗体に対応する検体中の抗体又は抗原の濃度を測定す
   る方法において、一定の凝集度に到達するまでの経過時
   間を測定して検体中の抗体又は抗原の濃度を定量するこ
   とを特徴とする免疫凝集反応による抗体又は抗原の濃度
   定量法。