JP2016194445A - トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ラテックス免疫凝集法を用いた、血液等の生体試料中のＴＡＴを高感度かつ特異的に定量するための試薬および方法を提供すること。【解決手段】トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）測定試薬であって、ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体、および、ラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体を含み、測定時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されていることを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。【選択図】図７

Description

本発明は、生体試料中のトロンビン（Ｔ）・アンチトロンビン（ＡＴ）複合体(ＴＡＴ)を測定する試薬および方法に関する。

トロンビン・アンチトロンビン複合体(ＴＡＴ)は血液凝固が進行するときに血液中に産生されるタンパク質複合体で、血液中のＴＡＴの定量は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）等の血栓症などの診断にとって有用である。現在主流のＴＡＴ定量法は、シーメンス社のエンザイグノスト（登録商標）ＴＡＴ ｍｉｃｒｏ等の酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)を用いる試薬キット、およびＬＳＩメディエンス社のステイシア（登録商標） ＣＬＥＩＡ
ＴＡＴ等の化学発光酵素免疫測定法(ＣＬＥＩＡ)を用いる試薬キットがあるが、いずれも固相・液相分離(Ｂ／Ｆ分離)が必要な測定法で、煩雑な洗浄作業が要り、手作業あるいは専用機器が必要であり、測定感度などの点でも改善の余地がある。

特許文献１〜５には、ＥＬＩＳＡやラテックス免疫凝集法によってＴＡＴを測定する方法が報告されているが、いずれも実検体中のＴＡＴを定量するには不十分であり、実検体中のＴＡＴを定量するために測定反応時のｐＨの測定結果に対する影響について検討した例はなく、これまでに、ラテックス免疫凝集法によりＴＡＴを測定する際に、反応を酸性側のｐＨで行った例はない。

特開２００１−２８９８５０号公報 特開平７−２３８０９９号公報 特開２００２−３１６９９９号公報 特開平３−４８１５８号公報 特開２００１−２２８１５３号公報

本発明は、Ｂ／Ｆ分離や洗浄作業を必須としないラテックス凝集法を用いた、生体試料中のＴＡＴの測定試薬および測定方法を提供することを課題とする。
ＴＡＴの測定については、ＤＩＣ診断基準の感度・特異度の向上の観点から、また、ＴＡＴ測定値が正常であればＤＩＣは否定的とする除外診断用としての使用可能性の観点から、その臨床的有用性が認められている。しかし、現在は煩雑な手技を必要とするＥＬＩＳＡ法や専用機器を必要とするＣＬＥＩＡ法が主流であることが、測定の普及が遅れている原因ともされている。
従って、測定が簡便なラテックス凝集法において、高感度・高精度に生体試料中のＴＡＴを測定する試薬及び方法が求められていた。
また、その臨床的意義を考慮した場合、ＣＬＥＩＡ法と同等の数ナノグラム単位で測定できる検出感度が必要であるが、ＣＬＥＩＡ法と同等の感度をラテックス凝集法で達成することは、使用する粒子の特性などその測定原理から考えて、非常に困難な課題である。
また、ラテックス凝集法ではＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法等のように、洗浄等によるＢ／Ｆ分離の工程を含まないため、遊離アンチトロンビン等、本来目的とする測定対象物質以外との交差反応性を克服することが、試薬や測定法の構築をする際の課題である。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ラテックス免疫凝集法を用いた生体試料中のＴＡＴの測定法において、凝集反応を弱酸性の条件で行うことで、生体試料中のＴＡＴを高感度かつ特異的に測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下を提供する。
[１] トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）測定試薬であって、
ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第１の抗体、および
ラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第２の抗体を含み、
測定時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されていることを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
[２] 前記第１の抗体が結合したラテックス粒子および前記第２の抗体が結合したラテックス粒子を含む第１試薬、ならびに、
ｐＨが５．８〜６．６の緩衝液を含む第２試薬を含む、[１]に記載のＴＡＴ測定試薬。
[３] 生体から分離された試料中に存在する試料中のＴＡＴを測定する方法であって、[
１]または[２]に記載のＴＡＴ測定試薬を用いてラテックス免疫凝集反応をｐＨが５．８
〜６．６の条件で行うことによりＴＡＴを測定することを特徴とする方法。

本発明によれば、反応時のｐＨを弱酸性に保つことで、感度、特異性ともに高性能の試薬の調製が可能である。ｐＨが高くなると、生食ブランク・血漿ブランク・ＴＡＴ反応性がｐＨ依存的に下がる傾向が見出された。ｐＨが中性よりも高いと反応性が落ちるというのは、本発明者らが見出した意外な効果であった。従って、反応時のｐＨを弱酸性域にすることで、高い反応性を持ち、特異性の高い試薬の提供が可能となった。

ラテックス凝集法によるＴＡＴ測定方法の模式図。 間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図。 間接阻害ＥＬＩＳＡ法によるクローンＴＡＴ−５の各抗原への結合性を評価した結果を示す図。 各抗体を結合させたラテックス試薬によるＴＡＴへの反応性の評価結果を示す図。 各抗体を結合させたラテックス試薬による遊離アンチトロンビンへの交差反応性の評価結果を示す図。 ｐＨを６．０〜７．２の間で変化させた場合のベースの吸光度の変化を示す図。 ｐＨを６．０〜７．２の間で変化させた場合の血漿ベースを差し引いたＴＡＴ反応性への影響を示す図。 ｐＨを５．７〜６．２の間で変化させた場合のベースの吸光度の変化を示す図（第１試薬の緩衝液をＢｉｓ−Ｔｒｉｓにした場合）。 ｐＨを５．７〜６．２の間で変化させた場合のベースの吸光度の変化を示す図（第１試薬の緩衝液をＭＥＳにした場合）。 本発明の試薬を用いて臨床検体を評価した測定結果と、ＣＬＥＩＡ法を用いて臨床検体を評価した測定結果の相関を示す図。

以下に、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体を第１抗体、トロンビン
側に結合してＴＡＴを認識する抗体を第２抗体として構成する、ＴＡＴ測定試薬の一例を、実施の一態様として記載するが、本願発明の範囲はこれに限定されるものではない。

例えば、本発明のＴＡＴ測定試薬は、トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）測定試薬であって、ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第１抗体、および、ラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第２抗体を含み、測定時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されていることを特徴とする。ラテックス粒子に結合させる抗体は、２種類の粒子にそれぞれ２種類の抗体を結合させてもよいし、１種類の粒子に複数種類の抗体を結合させてもよいし、１種類の抗体を複数種類の粒子に結合させたものを混合して使用することもできる。

第１抗体としては、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体を使用する。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離アンチトロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
ここで、本願発明においてアンチトロンビン側に結合するとは、試料中に最も多く存在している遊離した状態のアンチトロンビンが、遊離トロンビンと結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のアンチトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するアンチトロンビンを複合体型構造アンチトロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するアンチトロンビンを遊離型構造アンチトロンビン（遊離アンチトロンビン）と称した場合、アンチトロンビン側に結合するとは、複合体型構造アンチトロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造アンチトロンビンは、複合体型構造アンチトロンビンと異なる構造を有する。それは、遊離型構造アンチトロンビンは、遊離トロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在するためである。

第２抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよく、トロンビンに対して特異的に反応する抗体を使用することができる。試料中において、遊離トロンビンはほとんど存在しないため、遊離トロンビンに対して交差反応性を有する抗体であっても利用できることが多い。当業者であれば、適宜選択して使用することができる。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離トロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
ここで、本願発明においてトロンビン側に結合するとは、試料中に存在している遊離した状態のトロンビンが、アンチトロンビンに結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するトロンビンを複合体型構造トロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するトロンビンを遊離型構造トロンビンと称した場合、トロンビン側に結合するとは、複合体型構造トロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造トロンビンは、複合体型構造トロンビンと異なる構造を有する可能性が考えられる。それは、遊離型構造トロンビンは、アンチトロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在することによる。

上記の第１抗体及び第２抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれも使用することができる。これらの抗体は、当業者であれば、公知の手法に従って取得することができる。
抗体作製用に免疫原を免疫する動物としては、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等が使用可能であり、特にポリクローナル抗体作製にはウサギ、ヤギなどが好まし
い。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であり、この場合はマウス、ラット或いはウサギ等が好ましい。
免疫原としては、上述したように、ＴＡＴを使用してもよいし、ビトロネクチンが結合したＶＴＡＴを免疫原として作製した抗体を本願発明の使用することもできる。また、第１抗体の場合はアンチトロンビンを、第２抗体の場合にはトロンビンを使用してもよい。
これらの免疫原は、生体から採取された試料を原料として精製されたＴＡＴを使用してもよいし、遊離トロンビンと遊離アンチトロンビンを混合してｉｎｖｉｔｒｏで合成したＴＡＴを使用してもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得られるＴＡＴでもよいし、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを免疫原として使用してもよい。
また、立体構造の違いを部分的なペプチドのみで免疫させることが可能である場合、具体的に抗体の結合部位を特定して抗体を作製したい場合には第１抗体の場合はアンチトロンビン、第２抗体の場合はトロンビンの部分ペプチドを用いて作製することもできる。その場合の抗原としてのペプチド配列の選択やペプチド断片の合成方法、免疫方法は既知の方法を使用することができる。

図１を参照して、ラテックス凝集法による測定方法を説明する。図１に示すように、ＴＡＴのアンチトロンビン側に第１抗体が結合し、ＴＡＴのトロンビン側に第２抗体が結合した場合に、ラテックス凝集が起こり、その時の吸光度の値に基づいてＴＡＴ濃度の測定ができる。

第１抗体は、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体であればよいが、血中でのＴＡＴの存在量が遊離アンチトロンビンの存在量と比べてごく微量なので、遊離アンチトロンビンとの交差反応性が小さい抗ＴＡＴ抗体を用いることが好ましい。

第１抗体として使用し得る、遊離アンチトロンビンとの交差反応性が小さい抗ＴＡＴ抗体としては、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗ＴＡＴ抗体が挙げられる。第１抗体のＴＡＴに対する反応性は遊離アンチトロンビンに対する反応性より少なくとも１００倍以上であればよく、１，０００倍以上であることが好ましく、１０，０００倍以上であることがより好ましい。交差反応性は少ないほどよいので上限は特にないが、例えば、１００，０００倍未満、または５０，０００倍未満であってもよい。

生体内におけるＴＡＴとＴＡＴを形成していない遊離アンチトロンビンの存在割合は健常人の測定値幅を参考として１：６０，０００〜１：１１０，０００の間と考えられるが、一般的には約１：１００，０００で存在していると考えられる。また、敗血症や肝疾患患者においてその存在割合が変化する場合が知られているが、遊離アンチトロンビン量が少なくなる場合でも１：５０，０００程度であるとされている。従って、第１抗体が遊離アンチトロンビンにも反応性を示すとＴＡＴの定量が困難になる。そこで、ＴＡＴを定量するには、遊離アンチトロンビンへの反応性が低い抗体を使用する必要があり、ＴＡＴに対する反応性は、計算上、遊離アンチトロンビンへの反応性の５０，０００〜１００，０００倍以上であることが必要と考えられるところ、以下の実施例において示すように、本発明では、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であれば、その抗体を第１抗体として用いることで、ＴＡＴの定量が十分可能であることを見出した。

本発明において、「ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上」とは、各抗原に対する親和性の比が１００倍以上である場合や、後述の、間接阻害ＥＬＩＳＡで評価したときの、一定割合の阻害率を示すのに必要な抗原量の比が１
００倍以上である場合などが挙げられる。

ＴＡＴに対する反応性が、遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗ＴＡＴ抗体を間接阻害ＥＬＩＳＡで評価またはスクリーニングする場合について説明する。
まず、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体（第１抗体の候補抗体）を用意する。このような抗体は、後述のハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法等により抗ＴＡＴ抗体を得たのち、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体を選択すればよい。もちろん、あらかじめ、結合部位がアンチトロンビン側である抗ＴＡＴ抗体が存在する場合はそれを以下の評価系に供すればよい。

すなわち、候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴ、又はＴＡＴの反応を阻害し得る抗原を含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。

例えば、まず、該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、一定量のＴＡＴをプレート等の基材に固相する。基材に固相する抗原（ＴＡＴ）の量は、当業者であれば、使用する抗原の分注量と評価対象の抗体の種類との関係を考慮して、適宜設定することができる。
該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、各濃度（例えば０．０４〜１μｇ／ｍＬ）の上記第１抗体の候補抗体を、上記ＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて、基材上のＴＡＴに結合した抗体の量を測定する。吸光度が１．０付近（表１の記載方法だと１０００）となる抗体濃度を決定する。この抗体濃度を、抗原による阻害時の抗体濃度とすることができる（表３；反応時濃度（μｇ／ｍＬ））。
次に上記方法で決定した濃度の候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴまたは遊離アンチトロンビンを含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。
なお、抗体残存率は、抗原による吸収が未実施の時に得られる検出値を１００％として算出できる。

抗体の遊離アンチトロンビンに対する反応性が高い場合はＴＡＴに結合できる抗体の量が減るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が少なくなり（抗体残存率が低くなり）、一方、抗体が遊離アンチトロンビンに対する反応性が低い場合はＴＡＴに結合できる抗体が多く残るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が多くなる（抗体残存率が高くなる）。
この抗体残存率を、最初にＴＡＴと抗体とを反応させた（阻害反応をＴＡＴで行った）後に、反応液を固体化ＴＡＴと反応させたときの抗体残存率と比較する。

そして、例えば、遊離アンチトロンビンを50μg/mL加えて阻害反応させたときの抗体残存率が５０％であった場合、同じ抗体残存率を示すのに必要なＴＡＴの量を上記のＴＡＴで阻害したときの結果から算出する。ＴＡＴで阻害したときに、抗体残存率５０％を達成するのに必要なＴＡＴ阻害抗原の量が0.50μg/mL未満であれば、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上とすることができる。
このようにして選択された抗ＴＡＴ抗体を第1抗体として選択することができる。なお
、第1抗体は、モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０^−８以
下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。

本発明で使用される抗体はモノクローナル抗体であるが、モノクローナル抗体には、抗体フラグメントが含まれる。前記抗体フラグメントは、所望のモノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとのモノクローナル抗体と同じ反応性を有する抗体フラグメントである。本発明で用いることのできる抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、モ
ノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。これらは、そのままラテックス粒子に固相して使用することができるが、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ’）₂フラグメントに
調製したものをラテックス粒子に固相することができる。抗体のＦｃフラグメントに対する非特異反応を回避する観点から、Ｆａｂ’やＦ（ａｂ’）₂がより好ましい。

本発明で使用する抗体は、まず、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法な
どによりＴＡＴ抗体（候補抗体）を得て、その後、ＴＡＴ抗体（候補抗体）の中から、上記のような手法及び基準で、遊離アンチトロンビンとの交差反応性が低い抗体、具体的には、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体を選択することにより得ることができる。

候補となる抗体は、例えば、公知の細胞融合法で作製されたハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得ることができる。抗体産生細胞としては、ヒトを除く動物、例えば、マウス・ラット・モルモット等から選択することができる。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。

第２抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体であれば特に制限されない。モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０^−８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。抗体を選択する方法については、第１抗体と同様にして作製した抗体を使用することができる。

第１抗体と第２抗体の組み合わせはラテックス凝集法においてＴＡＴの測定が可能であれば特に制限されないが、血漿などの生体試料中に含まれるマトリクス（バックグラウンド）の影響が最少の抗体組み合わせを選出することが好ましい。
ＴＡＴ測定試薬に求められる感度は、健常人と患者とを明確に区別できる基準値、或いはその２倍の濃度を測定できることが必要であるため、本発明の試薬は生体試料中の１０〜１５ｎｇ／ｍＬの微量のＴＡＴを定量できる試薬であることが好ましく、３〜４ｎｇ／ｍＬの微量のＴＡＴを定量できる試薬であることがより好ましく、１ｎｇ／ｍＬ程度の濃度でも定量できる試薬であることがさらに好ましい。

上記の第１抗体および第２抗体を結合させるラテックス粒子はラテックス凝集反応に使用し得るものであれば特に制限されないが、平均粒子径が０．０５μｍ〜０．５μｍであることが好ましく、０．２〜０．４μｍであることがより好ましい。
使用するラテックス粒子の種類は、１種類のラテックス粒子のみを使用してもよいし、複数種のラテックス粒子を使用してもよい。例えば、粒子径の異なるラテックス粒子を組み合わせて使用することができる。ラテックス粒子は単一粒径で製造することは実質的に困難であることから、粒子全体の平均粒子径として規定される。従って、平均粒子径０．０５μｍ〜０．５μｍという場合、当該範囲に含まれないラテックス粒子を含む場合であっても、本発明に該当する場合がある。当業者にとって、粒径が異なるラテックス粒子が
含まれることは常識の範囲内であり、当業者であれば、その粒径の分布に大きく偏りの無い粒子群を含む溶液を使用してラテックス試薬の構築することが可能である。
なお、この平均粒子径は、公知の方法で測定することが可能であり、例えば、透過型電子顕微鏡装置を用いた画像解析により算出される。

本発明に係るラテックス粒子としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ₂）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系
微粒子からなる粒子を挙げられる。

ラテックス粒子に抗体を固相する方法としては、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックス粒子とを化学結合により固相する方法や、ビオチン−アビジン反応により抗体を固相する方法も選択できる。
ラテックス粒子に抗体を結合させる際には、抗体が、上記のＴＡＴに対する反応性および特異性を維持できる条件で行う。
好適な試薬の調製が行いやすいことから、第１抗体を固相した第１のラテックス粒子、第２抗体を固相した第２のラテックス粒子として、抗体の種類ごとに固相ラテックス液を調製することもできるし、１種類のラテックス粒子に第１の抗体と第２の抗体を固相させて試薬の調製を行うこともできる。抗体とラテックス粒子をどのように固相させて試薬の調製を行うかは、当業者であれば適宜設計することができる。

本発明の試薬は、１試薬系であってもよいし、２試薬系であってもよい。本発明の試薬が１試薬系である場合は、生体試料に前記抗体を固相したラテックス粒子懸濁液を添加し、ｐＨ５．８〜６．６の条件で抗原抗体反応を生じさせることにより、生体試料中のＴＡＴを測定することができる。本発明の試薬が２試薬系である場合には、緩衝液成分を主体とした第１試薬を生体試料に添加した後、更に前記抗体を固相したラテックス粒子を含む第２試薬を添加することで、ｐＨ５．８〜６．６の条件で抗原抗体反応を生じさせ、生体試料中のＴＡＴを測定することができる。

本発明の試薬は、測定（ラテックス凝集反応）時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されている。１試薬系であれば、試薬のｐＨが５．８〜６．６に調整されていればよいし、２試薬系であれば、混合したときにｐＨが５．８〜６．６になるように構成されていればよい。例えば、緩衝液成分を主体とした第１試薬と、抗体を固相したラテックス粒子を含む第２試薬から構成される場合に、第１試薬のｐＨが５．８〜６．６に調整されており、両試薬を混合したときに、混合液のｐＨが５．８〜６．６になるような態様が挙げられる。
なお、ｐＨは６．０〜６．４であることが好ましく、６．１〜６．３であることがより好ましく、６．１５〜６．２５であることがさらに好ましく約６．２であることが特に好ましい。

ｐＨはｐＨ調節剤によって調節されてもよいが、緩衝液により調整されることが好まし
い。緩衝剤としては、ｐＨ５．８〜６．６に緩衝能を有する緩衝液であればよいが、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液などが好適に使用される。また、反応時の緩衝液濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
なお、血液試料を試薬と混合したときのｐＨが５．８〜６．６から外れる場合は、別途、ｐＨ調整剤などで調整されてもよい。

ラテックス粒子の凝集の度合いは、例えば吸光度を用いて測定し、予め求めておいた標準品の検量線からその濃度を求めることにより、検体中のＴＡＴ濃度を定量することができる。なお、吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。反応温度は１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では１０〜１５分間の反応時間で測定することができる。なお、当業者であれば、光学機器あるいは汎用自動分析機を用いた分析において、公知の方法に従って、反応温度、反応時間、測定波長、測定時間、試薬構成、ラテックス濃度、ラテックス固定化するモノクローナル抗体濃度、各種添加剤濃度を適宜決定することができる。

本発明に用いられるラテックス粒子の濃度は、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に適用できる濃度であれば特に限定されるものではないが、ＴＡＴを測定するために必要な反応時のラテックス粒子の濃度は０．００５ｗ／ｖ％〜０．２ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。

本発明の試薬に適用することのできる被検試料は、ＴＡＴを含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではないが、生体試料であることが好ましく、培養細胞でもよいが、血清、血漿の測定に特に好適に使用できる。哺乳動物由来の試料であることが好ましく、ヒト由来の試料であることがより好ましい。

本発明の試薬は、抗体を固定化したラテックス粒子や上記の緩衝液以外にも、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、凝集促進剤、非特異反応抑制剤、増感剤などを更に含有することができる。本発明の試薬に添加可能な増感剤としては、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸プロピレングリコールなどが挙げられる。また、本発明の試薬に添加可能な凝集促進剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ−グロブリンなどのグロブリン類が挙げられる。

また、第３の抗体を添加して使用することもできる。第３の抗体の使用は、例えば、ＴＡＴ測定試薬の測定可能範囲を低濃度から高濃度まで広く測定可能としたい場合において、反応速度の異なる抗体を第３の抗体として使用することが好ましく用いられる。

本発明の試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキ
シエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本発明の試薬は、標準物質として使用し得るＴＡＴを含んでもよい。ＴＡＴは生体から精製されたＴＡＴでもよいし、遺伝子組み換えなどで合成されたＴＡＴでもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得ることができる。また、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等において、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを混合してＴＡＴを合成することもできる。

実施例１ 合成ＴＡＴの調製
市販のヒトトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）とアンチトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）をＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ（日水製薬株式会社製）」、を９．６ｇ／Ｌで溶解）で希釈し、１：３のモル比で混合後、３７℃で３０分間反応させた。３０分後、ＤＦＰ（フルオロリン酸ジイソプロピル、和光純薬社製）を０．７５ｍＭになるように添加し反応を停止した。
得られた反応物には未反応のトロンビン、アンチトロンビンが含まれるため、予め５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した
Ｈｉｌｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ（ＧＥヘルスケア社製）によって精製した。
ＴＡＴ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、回収した。得られたＴＡＴは０．５％のＢＳＡを含む生理食塩水で希釈し、ＣＬＥＩＡ試薬（ステイシア(登録商標) ＣＬＥＩＡ
ＴＡＴ、ＬＳＩメディエンス社製）を用いて値付けした。これを合成ＴＡＴとして使用した。

実施例２ 抗ＴＡＴ抗体の調製
細胞融合法は、安藤民衛・岩崎辰夫/著「単クローン抗体/ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」（講談社）に従って実施した。
実施例１で調製した合成ＴＡＴ ５０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ
社製）と混合し、投与抗原とした。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、４週令）に２週間間隔で３回投与し、４回目の投与は半量の２５μｇを静注した。
１週間後、脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３−Ａｇ．８と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、メルク社製）を用いて細胞融合を実施した。
ＨＡＴ選択培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマを合成ＴＡＴに対する結合活性を指標にスクリーニングした。すなわち、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で合成ＴＡＴをそれぞれ０．２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ社製）に５０μＬ／ウェル添加した。４℃、Ｏｖｅｒ Ｎｉｇｈｔで反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗
浄し、１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。
次に、培養上清各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノ
グロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１０
００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬ添加した。
３７℃、１時間反応後、同様に５回洗浄しｏ−フェニレンジアミン溶液（和光純薬社製
）を各ウェル５０μＬ添加した。室温で５〜１０分間反応後、２Ｎ硫酸溶液で反応を停止した。
プレート分光光度計（ＥＬ３１２ｅ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）
で４９２ｎｍの吸光度を測定した。合成ＴＡＴとの反応が良好な抗体を産生している細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、スクリーニングを行い、合成ＴＡＴと反応する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。

実施例３ 抗トロンビン抗体の調製
実施例２と同様の方法で免疫抗原をトロンビンとして、抗トロンビン抗体を得た。トロンビンに対して特異的に反応する抗体を選択し、このうちの１クローンを抗トロンビン抗体（Ｔ−１）として使用した。

実施例４ 間接阻害ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の評価
間接阻害ＥＬＩＳＡ法によって、各抗体の反応性の評価を行った。間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図を図２に示す。
評価しようとする０．０４〜０．４μｇ／ｍＬの濃度のＴＡＴを認識する抗体（抗ＴＡＴ抗体）候補を阻害抗原（プロトロンビン（エンザイムリサーチ社製）、トロンビン、アンチトロンビン、合成ＴＡＴ）と混合し、インキュベートした。一部阻害された該抗体候補を一次抗体として、９６ウェルプレートに固相化した合成ＴＡＴと結合させた。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を二次抗体として結合させ、発色基質を添加し吸光度を測定した。また、発色の変化率から、抗体の残存率を計算した。
特定の抗体（ＴＡＴ−５）について、各阻害抗原を用いた時の吸光度を表１に、吸光度から計算された抗体の残存率を表２に示した。
例えば、ＴＡＴの阻害抗原濃度が１０μｇ／ｍＬの時の残存率は、２８５／１０６６×１００＝２６．７（％）となる。各抗体の各抗原濃度について残存率を算出した。なお、表中において、Ｐｒｏ−Ｔはプロトロンビンを、Ｔはトロンビンを、ＡＴはアンチトロンビンを示す。

また、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬで阻害をかけた時の残存率と同等の阻害率となるＴＡＴ抗原量を算出し比較することで、アンチトロンビンに対するＴＡＴの反応性差（倍率）を求めた。この違いが大きければ、アンチトロンビンと比較しＴＡＴに対する特異性が強いこと意味する。計算はＴＡＴの阻害曲線（阻害抗原添加濃度対数-残存率％）
を描き、スプライン関数を用いておこなった。
例えば、ＴＡＴ−５の場合、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬの残存率は、７４．０％でありその残存率と同様となるＴＡＴ抗原量は１．１４４ μｇ／ｍＬである。すなわ
ち、反応性の差は５０／１．１４４＝４４倍となる。（図３）。

その他、抗体クローン２７種類について上記倍率の計算を行った。添加ＴＡＴとアンチトロンビンの量の違い（倍率）が１００倍以上となる抗体は１３種類、１０００倍以上となる抗体は7種類、１００００倍以上となる抗体は２種類存在した。５種類の抗体につい
て、表３に示す。

実施例５ ラテックス凝集法試薬によるＴＡＴ反応性の評価
実施例４の間接阻害ＥＬＩＳＡで評価したアンチトロンビン側抗体（ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５）および実施例３で得たトロンビン側抗体（Ｔ−１）をラテックス粒子に感作してその反応性を評価した。
抗体のラテックス粒子への感作はそれぞれの抗体を０．３２μｍのポリスチレンラテックス粒子に吸着させ、０．３％ ＢＳＡ溶液でブロッキング処理をしたのち遠心処理により０．０５％ アジ化ナトリウム（キシダ化学社製）溶液で洗浄後、再度０．０５％ アジ
化ナトリウム溶液に分散させて行った。
上記で作製した抗体を感作したラテックス粒子を含む試薬を調製し、ＴＡＴに対する反応性を評価した。使用した試薬の組成は、以下の通りである。第１試薬には、１００ｍＭ
Ｂｉｓ−tｒｉｓ（同仁化学社製） ｐＨ６．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ ＢＳＡを使用した。第２試薬には、各抗体感作粒子が波長７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したものを使用した。
血清中には多量のＴＡＴが含まれるため、これを０．５％のＢＳＡを含む生理食塩水で希釈しＣＬＥＩＡ試薬で値付けをしたものを血清ＴＡＴとして使用した。測定用試料としては、値付けされた血清ＴＡＴをプール血漿（ＶＩＴＲＯ ＬＯＧＩＣ社製）でＴＡＴ濃度が１０００ｎｇ／ｍＬになるように希釈したものを使用した。
測定機器としては７１７０Ｓ（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用した。測定用パラメータは、サンプル量１２μＬ、第１試薬９０μＬ、第２試薬９０μＬ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍに設定し、測光ポイント３４ポイント目の吸光度から２０ポイント目の吸光度を差し引き１００００倍したものをΔＡｂｓとして測定を実施した。
結果を図４に示す。表３で示した５種類の抗体はいずれも、ＴＡＴ無添加に対してＴＡＴ １０００ｎｇ／ｍＬの反応性がΔＡｂｓで１００以上であった。
表３におけるＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３は、ラテックス凝集法で高い反応性が確認できた。また、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５の抗体についても、前記ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３より小さいものの反応性が確認された。

実施例６ ラテックス凝集法試薬によるアンチトロンビンとの交差反応性評価
調製した試薬のアンチトロンビンとの交差反応性を実施例５に記載のヒト血清を０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈したサンプル中に更にアンチトロンビンを２５０、５００μｇ/ｍＬになるように添加したサンプルを用いて評価した。
アンチトロンビン無添加のときの反応性と各濃度のアンチトロンビンを添加した時の反応性を比較した。
測定用試薬、測定機器、測定パラメータはいずれも実施例４と同様にして実施した。評価に使用した抗ＴＡＴ抗体の種類は、ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５である。
ラテックス試薬によるアンチトロンビンへの交差反応性の評価結果を図５に示す。実施例４の間接阻害ＥＬＩＳＡで１００倍以上の特異性が得られた抗体（ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３）はアンチトロンビン濃度５００μｇ/ｍＬ添加でも７０％以上の反応
性を保持していた。一方、１００倍以下の抗体（ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５）についてはアンチトロンビン濃度の増加に伴い、いずれも極端な反応性低下が認められた（図５）。
実施例５のラテックス凝集反応系において反応性が確認された各抗体について、ＥＬＩＳＡ法によって交差反応性を確認した結果、ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３の各抗体ではラテックス凝集の両反応系において高い特異性が認められたのに対し、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５の各抗体はラテックス凝集法で反応性は見られるものの、特異性が十分ではないことが明らかとなった。
従って、実施例４の間接阻害ＥＬＩＳＡによって確認した抗体の反応性の差が１００倍以上の時に、それらの抗体は試薬としての使用に非常に有用であることが認められた。

実施例７ 第１試薬ｐＨの影響
ラテックス試薬のｐＨによる反応性への影響を、ｐＨ５．７〜７．２の間で変えて評価した。
試薬組成としては、第１試薬として１００ｍＭ Ｂｉｓ−ｔｒｉｓまたはＭＥＳ（同仁化学社製）、７００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ ＢＳＡ、０．２０％ アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．０５％ エマルゲン１５０（花王社製）、第２試薬としてアンチトロンビン側抗体にはＴＡＴ−１、トロンビン側抗体にはＴ−１を使用し、各抗体感作粒子が７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム
溶液で希釈し混合した。ラテックス粒子への抗体感作は、粒径０．２０μｍの粒子を用いたこと以外は実施例５と同様に実施した。
測定対象サンプルの調製は、０．５％ ＢＳＡを含む生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅと表記
）、ヒトプール血漿（Ｐｌａｓｍａと表記）を使用した。また、ＣＬＥＩＡ試薬によって値付けされたヒト血清を、上記プール血漿で各濃度（１０、５０、１００ｎｇ／ｍＬ）に希釈したものを、ＴＡＴサンプルとした。測定機器、パラメータは実施例４と同様にしておこなった。
第１試薬の緩衝液としてＢｉｓ−ｔｒｉｓを使用し、ｐＨを６．０〜７．２の間で変化させた場合の反応性への影響は、以下のような傾向がみられた。まず、ｐＨ６．７でＳａｌｉｎｅ Ｂａｓｅが０以下となった（図６）。血漿ベースを差し引いたＴＡＴ反応性へ
の影響はｐＨが高くなると徐々に反応性が下がる傾向が見られた（図７）。
高感度にＴＡＴを測定できる試薬性能を目指して、ＴＡＴ濃度が５０ｎｇ／ｍＬの時のシグナル（ΔＡｂｓ）１００以上を１つの指標とすることとし、その場合、反応液中におけるｐＨは６．６以下が好ましいことが分かった（図７）。
更に、ブランクの抑制と反応性の両立を目指し、ｐＨ５．７〜６．２におけるブランク値への影響を調べた。その結果、ブランクの吸光度はＢｉｓ−ｔｒｉｓ、ＭＥＳいずれの緩衝液を用いた場合もｐＨが上昇すると低くなる傾向が見られた。特に、ｐＨ５．７から５．８の間での低下が大きく、ｐＨ６．０からｐＨ６．２の間で吸光度が１００以下となることが判明した（図８、９）。
ｐＨが高くなると、Ｓａｌｉｎｅブランク・Ｐｌａｓｍａブランク・ＴＡＴ反応性がｐＨ依存的に下がる傾向が見出された。ｐＨが中性よりも高いと反応性が落ちるというのは、本発明者らが見出した、意外な効果であった。
以上より、ブランク抑制の観点からはｐＨの下限が５．８で、ｐＨ６．２が特に好ましく、反応性維持の観点から、ｐＨの上限が６．６で、６．２が特に好ましいことが分かった。

実施例８ 臨床検体を用いた相関試験
臨床検体を使用して、本発明のＴＡＴ測定ラテックス試薬が、血中のＴＡＴ濃度測定に使用することができるか検証した。
試薬組成は以下の通り調製したものを使用した。１００ｍＭ Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ ｐＨ６．２、７００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ エマルゲン１５０、０．２０％ アルギン酸ナトリウム、０．１５％ ＢＳＡを第１試薬とした。第２試薬には実施例７と同様のものを使用した。
対照試薬には、ＣＬＥＩＡ試薬を用いて測定した。標準品には、ＴＡＴキャリブレーター（ＬＳＩメディエンス社製）をラテックス試薬、ＣＬＥＩＡ試薬ともに使用した。
使用検体は、クエン酸血漿２０検体を使用した。測定機器、パラメータはいずれも実施例４と同様にして測定した。ＣＬＥＩＡ試薬の測定機器はＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）を使用し、添付文書記載のパラメータに準じて測定を実施した。
両試薬によって測定された結果について図１０に示した。
本発明によるラテックス試薬は、３ｎｇ／ｍＬ〜１２０ｎｇ／ｍＬの範囲で、臨床検体でも従来のＣＬＥＩＡ試薬による測定試薬と良好な相関性を示した。本発明を用いればＢ／Ｆ分離などの処理を行うことなく、高感度に臨床検体での測定が可能である。

Claims (3)

1. トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）測定試薬であって、
   ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第１の抗体、および
   ラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第２の抗体を含み、
   測定時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されていることを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
2. 前記第１の抗体が結合したラテックス粒子および前記第２の抗体が結合したラテックス粒子を含む第１試薬、ならびに、
   ｐＨが５．８〜６．６の緩衝液を含む第２試薬を含む、請求項１に記載のＴＡＴ測定試薬。
3. 生体から分離された試料中に存在する試料中のＴＡＴを測定する方法であって、請求項１または２に記載のＴＡＴ測定試薬を用いてラテックス免疫凝集反応をｐＨが５．８〜６．６の条件で行うことによりＴＡＴを測定することを特徴とする方法。