JP2011027751A - モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011027751A JP2011027751A JP2010249274A JP2010249274A JP2011027751A JP 2011027751 A JP2011027751 A JP 2011027751A JP 2010249274 A JP2010249274 A JP 2010249274A JP 2010249274 A JP2010249274 A JP 2010249274A JP 2011027751 A JP2011027751 A JP 2011027751A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human immunoglobulin
- antibody
- monoclonal antibody
- hybridoma
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/545—Synthetic resin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
- G01N33/541—Double or second antibody, i.e. precipitating antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/686—Anti-idiotype
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
【解決手段】ヒト免疫グロブリンMに反応するモノクローナル抗体の選別において、溶液状態での反応性を評価指標とし、1種類でヒト免疫グロブリンMを凝集することができ、実用的な免疫凝集測定を達成できる新規のモノクローナル抗体を得、前記課題を解決した。
【選択図】なし
Description
また、本発明は非特異反応の抑制剤及びこれを用いた免疫学的測定方法に関し、より詳細にはヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応の抑制剤及びこれを用いた免疫学的測定方法に関する。
一方、免疫応答の最初期に産生されるヒト免疫グロブリンMは、血漿中に概ね50〜200mg/dL(500〜2000μg/mL)含まれ、基準濃度範囲外の低値では多発性骨髄腫や蛋白漏出性胃腸症、高値では膠原病やマクログロブリン血症というようにさまざまな疾患の可能性を示すマーカーとなっている。
ヒト免疫グロブリンM診断薬に関しても免疫凝集測定方法を原理とする製品が複数実用化されているが、これまではポリクローナル抗体が用いられてきた。
ポリクローナル抗体は多様な反応性を有する抗体の集合体であり、アナライト分子上の複数のエピトープ(抗原決定基)に結合するため凝集力が強く、分子内に同一のエピトープが複数存在しないアナライトの免疫凝集測定方法に最適な抗体である。しかしながらその反面、複数のエピトープと結合するポリクローナル抗体は特異性が低いという大きな課題を有している。実際にヒト免疫グロブリンを例にとると、体内には免疫グロブリンGをはじめとして構造の類似した5種類の免疫グロブリンが存在するため、免疫グロブリンM特異的なポリクローナル抗体を調製する際には、その他の免疫グロブリンと交差反応する抗体画分を除去する処理操作が欠かせず、膨大な手間と労力を要していた。
一方、単一の抗体から構成されるモノクローナル抗体は特定のエピトープに結合するため特異性が高く、調製が容易で性能が安定しているうえに、近年では遺伝子組換えを利用した修飾や改変も容易となったことから、診断用途のみならず治療分野でもその存在感を高めており、その適用領域はますます拡大している。
原理的には、同一のエピトープを複数持つアナライトの免疫凝集測定方法においてモノクローナル抗体の利用も可能であるが、分子内に同一エピトープが10箇所存在するような免疫グロブリンMに関しては、モノクローナル抗体では効率的に凝集を形成できないと考えられており、免疫凝集測定方法にモノクローナル抗体が利用されることはなかった。血漿免疫グロブリンMは図1に示すようにY字形の単位構造5個が、Y字形の尾部を中心に先端部を外周側に向けて配位し星型を形成している。Y字形は免疫グロブリンの単位構造であり、ヒンジ部分が柔軟に可動することはよく知られているが、さらに非特許文献1の電子顕微鏡像に示されるように、5個のY字型単位構造が(b)Y字形の尾部を中心に先端部を外周側に向けて平面状に配位した星型構造や、(c)Y字形の尾部を支点として先端部を同一方向に向けて配位した「かに形」と記述される構造を形成できることから、Y字形尾部の接合部も柔軟に可動することが確認されている。
このように免疫グロブリンM分子中の各サブユニットの接合部は柔軟に可動し、立体的な構造が容易に変化するため、抗免疫グロブリンMモノクローナル抗体は、二分子の免疫グロブリンMに結合して分子間架橋を形成せずに、大部分が図2に示したように一分子の免疫グロブリンM上の二箇所のエピトープと結合するいわゆる分子内架橋の状態となってしまう。したがって、ヒト免疫グロブリンMの免疫凝集測定方法において、モノクローナル抗体では効率的に凝集を形成することができないと考えられ、やむを得ず複数のエピトープに結合するポリクローナル抗体が利用されてきた。また、モノクローナル抗体を用いることができたとしても、それは複数のモノクローナル抗体を組み合わせてポリクローナル抗体の作用をさせる例であり(例えば特許文献4実施例3)、1種類のモノクローナル抗体でヒト免疫グロブリンMを凝集させるような性質を有するモノクローナル抗体の存在はこれまで知られていなかった。また、これまで抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製時の選別操作は、ヒト免疫グロブリンMあるいは抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を固相化した条件下で評価した反応性の強さを指標としており、溶液状態における両者の反応性が指標とされることはなかった(特許文献1〜3)。
非特異反応とは被験試料中の因子によって特異反応にもとづかない結合が促進されたり、特異的な免疫反応が妨げられたりする現象で測定過誤の原因となる。非特異反応の原因因子として異好性抗体やリウマチ因子(RF)の存在が明らかとなっている。
異好性抗体とは、免疫学的測定方法の主成分である動物由来抗体に対して反応性を示すヒト抗体の総称であり、HAMA(ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体)が代表的なものとして知られている。その成因としては、食事や動物との接触、生物学的製剤の投与といったような無自覚下における抗原感作によって産生されるケースに加え、抗原未感作の抗体が異好性を示す可能性もあるため解明されていない部分も多い。一方、リウマチ因子は関節リウマチ患者に出現し、結合部位も特定されていることから、異好性抗体とは別の概念として捉えられているが、動物由来抗体に対して反応性を示すという性質は共通しており、非特許文献2に記載されたようにその実体はいずれもヒトの免疫グロブリンGや免疫グロブリンMであることが知られている。
これまでも異好性抗体による非特異反応の対策として、非特許文献3、4記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を成分とする異好性阻止試薬HBRが製品化されており、免疫学的測定方法を原理とする各種検査で利用されてきた。
また、測定に用いる抗体と同種動物から調製したヒト免疫グロブリンM型自然抗体に対するポリクローナル抗体を添加する特許文献5の非特異反応の抑制策や、リウマチ因子の反応部位に対する各種動物抗体を添加する特許文献6記載の非特異反応抑制策も考案されている。しかしながらいずれもポリクローナル抗体の利用であるため、各種動物に免疫するための大量の抗原を長期的に要するうえに、前者は自然抗体による非特異反応しか抑制できず、後者が認識するRF因子の反応部位はそもそも可変性を持つため、その非特異反応の抑制効果は限定的である。実際、免疫学的測定方法を利用した検査項目および検査数の増加に伴い、従来の対策法では非特異反応の抑制効果が十分に発揮されない検体が見出されるようになってきた。
また、本発明は、ヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応の抑制剤及びこれを用いた免疫学的測定方法を提供することを課題とする。
また、本発明のさらに別の目的は、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、1種類でヒト免疫グロブリンMを凝集できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を添加することにより、非特異反応を抑制し正確な測定値を得ることを特徴とする免疫学的測定方法、測定試薬及び測定キットに関する。
具体的には本発明は、以下の構成を有する。
(1)ヒト免疫グロブリンMと特異的に反応し、溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
(2)以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体の製造方法によって取得された前記(1)に記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
工程1)ヒト免疫グロブリンMを抗原として抗ヒト免疫グロブリンM抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程2)工程1で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンMと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程3)工程2で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
(3)以下の(a)又は(b)の抗体。
(a)FERM BP−11134であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
(b)上記(a)の抗体と交差反応性を有する前記(1)に記載の抗体。
(4)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体に由来する機能性断片。
(5)前記(1)〜(3)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び/または前記(4)に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を用いることを特徴とする、試料中のヒト免疫グロブリンMを測定する免疫凝集測定方法。
(6)前記(1)〜(3)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び/または前記(4)に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を用いることを特徴とする、試料中のヒト免疫グロブリンMを測定する免疫凝集測定試薬及び測定キット。
(7)前記(1)又は(2)に記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
(8)FERM BP−11134であるハイブリドーマ。
(9)以下の工程を含むことからなる、抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体の製造方法。
工程1)ヒト免疫グロブリンMを抗原として抗ヒト免疫グロブリンM抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程2)工程1で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンMと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程3)工程2で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
(10)前記(1)〜(3)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び/または前記(4)に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を含む、ヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応の抑制剤。
(11)試料中の測定対象成分を測定用抗体又は測定用抗原との抗原抗体反応により測定を行う免疫学的測定方法において、前記(1)〜(3)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び/または前記(4)に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を含む、ヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応の抑制剤の添加により、前記抗原抗体反応以外のヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応を抑制することを特徴とする免疫学的測定方法。
(12)測定用抗体又は測定用抗原が不溶性担体に担持されていることを特徴とする、前記(11)に記載の免疫学的測定方法。
(13)不溶性担体がラテックス、金属コロイド、シリカからなる前記(12)に記載の免疫学的測定方法。
(14)前記(1)〜(3)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び/または前記(4)に記載のモノクローナル抗体に由来する機能性断片を含む、ヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応の抑制剤及び試料中の測定対象成分を測定するための測定用抗体または測定用抗原を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬及び測定キット。
(15)測定用抗体又は測定用抗原が不溶性担体に担持されていることを特徴とする、前記(14)に記載の免疫学的測定試薬及び測定キット。
(16)不溶性担体がラテックス、金属コロイド、シリカからなる前記(15)に記載の免疫学的測定試薬及び測定キット。
また、本発明のモノクローナル抗体の選択方法は、溶液状態における凝集性の強さを指標に選択されるため、精度高く目的とするモノクローナル抗体を得ることができ効率的である。
本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンMと特異的に反応し、溶液状態でヒト免疫グロブリンM分子同士の分子間架橋を形成し、1種類で免疫凝集測定が可能という特性を有するモノクローナル抗体であれば特に限定されない。ここでヒト免疫グロブリンMと特異的に反応するとは、ヒト免疫グロブリンMとは抗原抗体反応を起こすが、他のヒト免疫グロブリンとは抗原抗体反応を起こさないことをいう。これまで免疫凝集の形成有無に着目した免疫グロブリンMに対するモノクローナル抗体の探索は行われておらず、本発明の1種類でヒト免疫グロブリンMを凝集できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体は新規である。
また、従来の抗免疫グロブリンMモノクローナル抗体は2分子の免疫グロブリンの分子間を架橋するのではなく、1分子の免疫グロブリンの分子内を架橋することしかできなかった。しかし、本発明の1種類でヒト免疫グロブリンMを凝集できるモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンMの分子間を架橋できるため、ヒト免疫グロブリンMの影響を効率的に中和し、ヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応を強力に抑制することが可能となり、後述するように、非特異反応の抑制剤として好適に用いることができる。
このような本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体の具体例としては、FERM BP−11134であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体が挙げられ、さらに、FERM BP−11134であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と交差反応性を有する抗体も本発明の抗体の範囲に含まれる。FERM BP−11134であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と交差反応性を有する抗体には、当該抗体と同一のエピトープ(抗原決定基)のアミン酸配列を特異的に認識しうる抗体が含まれる。
本発明には、酵素的消化により得られる該モノクローナル抗体のFab部分を含む機能性断片や遺伝子組換えによって作製される該モノクローナル抗体のFab部分を含む機能性断片に関わらず、該モノクローナル抗体に由来するFab部分を含む機能性断片を有するものであれば利用できる。従って、本発明の機能性断片の「機能性」の意味は、具体的にはヒト免疫グロブリンMとの結合能を有することをいう。
本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体断片を用いたヒト免疫グロブリンMの免疫凝集測定方法の測定対象試料は、生体試料であればよく、例えば血液、血清、血漿、尿などの体液である。
本発明のヒト免疫グロブリンMの免疫凝集測定方法は、本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体と測定対象試料を任意の方法で混合して免疫凝集を形成させ、ヒト免疫グロブリンMを測定する測定方法であれば特に限定はない。また免疫凝集の形成をより促進させるために該モノクローナル抗体とはエピトープの異なる他の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を併用しても良く、併用するモノクローナル抗体の特性に関しては特に制限がない。
本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体断片を用いたヒト免疫グロブリンMの免疫凝集測定試薬及びキットは、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分や免疫学的凝集を増強する成分を含んでもよい。前記試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分としては、例えば、酢酸,クエン酸,リン酸,トリス,グリシン,ホウ酸,炭酸,グッドの緩衝液や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などがあげられ、前記免疫学的凝集を増強する成分としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどがあげられる。
また、本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体調製後の構造改変や修飾に関して、該モノクローナル抗体のヒト免疫グロブリンMとの反応特性を大きく損なわない限り特に制限はない。
本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を産生するために用いるハイブリドーマは、ヒト免疫グロブリンMと特異的に反応し、かつ溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナルを産生できるハイブリドーマであればいずれでもよく、産生されるモノクローナル抗体が溶液状態においてヒト免疫グロブリンMとの免疫凝集形成能の高いものが選択される。すなわち、本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体は以下の工程1)〜3)を経て製造される。
工程1)ヒト免疫グロブリンMを抗原として抗ヒト免疫グロブリンM抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程2)工程1で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態においてヒト免疫グロブリンMと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程3)工程2で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
上記工程2で選択されたハイブリドーマとしては、例えばFERM BP−11134が挙げられる。
上記製造工程におけるハイブリドーマの選択は、より具体的には精製抗体を用いて溶液状態のヒト免疫グロブリンと反応させることで、溶液状態における免疫凝集形成能の違いによる選択工程が挙げられるが、本選択工程の前に、精製抗体を用いずにハイブリドーマ培養上清などを用い、まずELISA法などの固相状態における抗ヒト免疫グロブリンM抗体産生ハイブリドーマの選択工程を予め行えば、より効率的に本発明の抗体産生ハイブリドーマを選択することができる。
このような選択工程を経て得られた抗体は、ヒト免疫グロブリンMに特異的に反応し、かつ、溶液状態において1種類でヒト免疫グロブリンMとの間に分子間架橋を形成して免疫凝集体を形成できるという性質を有する。
本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンMに特異的に反応し、かつ、1種類でヒト免疫グロブリンを凝集させるという性質を用いる用途であればいずれにも適用することができ、上述のヒト免疫グロブリンMの免疫凝集測定方法のほかに、ヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応の抑制剤としての使用が好適な例として挙げられる。本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンMと1:1で分子内架橋しないことからヒト免疫グロブリンMを効率的に中和でき、ヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応の抑制剤として好適に用いることができるのである。本発明の抗体が、従来の非特異反応の阻止剤をもってしても抑制できなかったようなヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応を抑制できるメカニズムは、明確でないものの、溶液状態のヒト免疫グロブリンMを凝集できるという性質が大きく関わっているものと考えられる。例えば、溶液状態のヒト免疫グロブリンMを凝集できるという性質を有する抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体は、異好性抗体型、リウマチ因子(RF)型等に関わらず、ヒト免疫グロブリンM分子内で普遍的に存在するエピトープを認識している可能性が考えられる。
したがって、本発明でいうヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応とは、ヒト免疫グロブリンMが原因となっている全ての非特異反応を指し、前記非特異反応には、異好性抗体やリウマチ因子(RF)となって動物由来抗体と反応してしまうヒト免疫グロブリンMのように発生機序が公知の非特異反応に加え、機序が不明の非特異反応も含まれる。このように、本発明の抑制剤は、前記原因の因子の実体がヒト免疫グロブリンMである全ての非特異反応を対象とする。
(1)抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
精製ヒト免疫グロブリンM(CHEMICON社製)100μgを1回の免疫に使用した。初回免疫はヒト免疫グロブリンMとフロインドの完全アジュバンドを等量混合して調製したエマルジョン200μLを用い、これをBALB/cマウスの腹腔に注射した。追加免疫にはフロインドの不完全アジュバンドを使用して同様に調製したエマルジョン200μLを用い、2週間間隔で3回免疫を繰り返した。マウス眼底静脈より採血した血液中の抗体価をELISA法にて測定し、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に供した。4回目の免疫から2週間後にヒト免疫グロブリンM100μgを生理食塩液200μLに溶解したものをマウス腹腔に注射し、3日後に脾臓を摘出した。脾臓をRPMI1640培地中でほぐした後、1500rpmで遠心分離して脾細胞を回収した。これを牛胎児血清フリーのRPMI1640培地で3回以上洗浄後、15%牛胎児血清を含むRPMI1640培地2mLを加えて懸濁し、脾細胞懸濁液とした。脾細胞とミエローマ細胞SP2/O−AG14を6対1の割合で混合した後、50%ポリエチレングリコール存在下で細胞融合させ、ハイブリドーマ(融合細胞)を得た。1500rpmの遠心分離で沈殿部を集め、GKN液(グルコース2g、塩化カリウム0.4g、塩化ナトリウム8g、リン酸水素二ナトリウム1.41g及びリン酸二水素ナトリウム二水和物0.78gを精製水に溶かして1リットルとしたもの)に懸濁、遠心分離により洗浄後、沈殿部を回収した。これを15%牛胎児血清を含むRPMI1640培地30mLに懸濁したものを1ウェルあたり100μL、及びフィーダー細胞としてBALB/cマウスの胸腺細胞を2.5×106個/mL含むHAT培地を1ウェルあたり200μL96穴マイクロプレート3枚にそれぞれ分注し、37℃にて5%炭酸ガス培養器中でハイブリドーマを培養した。
培養上清中の抗ヒト免疫グロブリンM抗体の存在を、ヒト免疫グロブリンMを固相化したELISA法で確認した。10日後に全てのウェルでハイブリドーマの増殖を確認した。詳細には、10μg/mLのヒト免疫グロブリンM及び150mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.2;以下、PBSと略す)100μLを前記ハイブリドーマの増殖が確認された96穴マイクロプレートに分注し、4℃で1晩放置した。次に、この96穴マイクロプレートを0.05%Tween20及び1%牛血清アルブミンを含むPBS300μLで3回洗浄した後、各ウェルの培養上清を50μL/ウェル加え室温で1時間放置した。その後、当該プレートを0.05%Tween20を含むPBS(以下、PBS−Tと略す)で3回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギ抗体(SouthernBiotech社)を50μL/ウェル加え、室温で1時間放置した。その後、当該プレートをPBS−Tで3回洗浄後、0.2%オルトフェニレンジアミン及び0.02%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液(pH5.0)50μL/ウェルを加え、室温で15分間放置後、4.5N硫酸50μL/ウェルを加えて反応を停止させ、各ウェルの波長492nmにおける吸光度を測定し、ブランクと差のあるウェルを陽性ウェルとして選択した。
単クローン化は限界希釈法で行った。すなわちフィーダー細胞としてBALB/cマウスの胸腺細胞を1ウェルあたり106個ずつ分注した96穴マイクロプレートに、前記陽性ウェル中のハイブリドーマを10個/mLとなるように希釈したものを0.1mLずつ分注した。培地は、初回はHAT培地を、2回目以降は15%牛胎児血清を含むRPMI1640を用い、37℃にて5%炭酸ガス培養器中で10日間培養した。ELISA法による陽性ウェルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各3回繰り返して抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ26種類(A-Z)を得た。
(2)モノクローナル抗体の生産
各ハイブリドーマの約105個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら1晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を20mMトリス緩衝液(pH8.0)に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したDEAE−セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム0〜300mMの濃度勾配で溶出させ、精製抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を得た。A-Zのハイブリドーマが産生した抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体をそれぞれa-zとして以下の試験に用いた。
(1)評価例1 固相状態での反応性評価(従来型の評価法)
1μg/mLのヒト免疫グロブリンMを含むPBS50μLを96穴マイクロプレートに分注し室温で1時間放置し、ヒト免疫グロブリンMをマイクロプレートに固定した。次に3%BSA(ウシ血清アルブミン)を含むPBS200μLでブロッキングした後、各抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を1μg/mL含むPBS50μLをウェルに加え室温で1時間放置した。その後、PBS−Tで3回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体を50μL/ウェル加え、室温で1時間放置し、PBS−Tで3回洗浄後、2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルフォン酸(ABTS)(KPL社製)基質液を50μL/ウェル加え、室温で20分間放置後、1%SDS水溶液50μL/ウェルを加えて反応を停止させ、波長405nmにおける吸光度を測定し、吸光度から各抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体の反応性の強さを順位で示した(表1)。
200μg/mLのヒト免疫グロブリンMを含むPBS150μLに各抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体溶液(精製抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体400μg/mL、3%ポリエチレングリコール6000、5mMクエン酸三ナトリウム、2.5mM塩化カルシウム(無水)を含む100mMトリス塩酸緩衝液pH8.0)750μLを加えて攪拌し、10分後に日立U−3310分光光度計を用いて主波長340nm、副波長800nmの2波長で吸光度を測定した(吸光度2)。対照としてヒト免疫グロブリンMを含まないPBS150μLに各抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体溶液750μLを加えて攪拌し、同一条件で吸光度を測定した(吸光度1)。吸光度2から吸光度1を減じて、ヒト免疫グロブリンM特異的な免疫凝集にともなう吸光度変化量を算出した(表1)。
吸光度変化量から、抗体tは、ヒト免疫グロブリンMと特異的に反応し、かつ溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナルであることがわかった。なお、従来型の評価法である固相状態の反応性評価では抗体k、zの反応性の強さが突出しており、6番目の強さではあるものの、強さがkの半分以下である本発明のモノクローナル抗体tが選択される可能性は低い。また同時に、溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できるという特性は反応性の強さに必ずしも一致していないことから、従来型の固相状態による反応性の評価のみでは本発明の特性を持つモノクローナル抗体を見出すことは極めて困難であることがわかる。なお、抗体tを産生するハイブリドーマTは、受託番号FERM BP−11134として寄託されている。
抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体による免疫凝集及び非特異反応の抑制剤としての利用可能性の確認
(1)ヒト免疫グロブリンM溶液の調製
ヒト免疫グロブリンM(CHEMICON社製)を200μg/mL含む溶液を、PBSを用いて倍々の段階希釈を行い、100、50、25μg/mLのヒト免疫グロブリンM溶液を調製した。
(2)抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体t溶液の調製
3%のポリエチレングリコール6000、5mMのクエン酸三ナトリウム、2.5mMの塩化カルシウム(無水)を含むpH8.0の100mMトリス塩酸緩衝液(以下、抗体希釈液という)を用いて、本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体tを最終濃度400μg/mLとなるように希釈し抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体t溶液を調製した。対照として抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体tの代わりに非特異反応の阻止剤として用いられている抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を成分とする異好性阻止試薬HBR(SCANTIBODIES LABORATORY,INC.製、輸入元は長瀬産業株式会社)を最終濃度400μg/mLとなるように抗体希釈液で希釈し、異好性阻止試薬HBR溶液を調製した。
(3)測定方法
日立7170形自動分析装置を用いて、免疫凝集測定を実施した。具体的には(1)で調製した各濃度のヒト免疫グロブリンM溶液30μLに、(2)で調製した抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体t溶液150μLまたは異好性阻止試薬HBR溶液150μLを加えて攪拌後37℃で加温し、主波長340nm副波長800nmで10分間の吸光度変化量を感度(mAbs)として測定した。結果を図3に示す。
(4)結果
本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体t(社内管理番号73224)においてヒト免疫グロブリンM濃度25μg/mLから濃度依存的な感度上昇が認められ、1種類でヒト免疫グロブリンMの実用的な免疫凝集測定が可能であることが確認された。なお、対照とした異好性阻止試薬HBRにおいては感度上昇が全く認められず、ヒト免疫グロブリンMを凝集できないことが確認された。このことより、本発明の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体は従来の非特異反応の阻止剤に用いられていた抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体とは明らかに異なる性質で、従来の非特異反応の阻止剤では抑制できなかったようなヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応を抑制できる可能性が示唆された。
以下、いくつかの免疫反応測定における、本発明の非特異反応の抑制効果を確認した(実施例2〜4)。
抗PSAモノクローナル抗体を利用したPSA測定用ラテックス試薬で確認された非特異反応に対する本発明の抑制効果を、汎用自動分析装置を利用した感度測定で確認した。PSAは前立腺の腺上皮細胞で特異的に産生される分子量約34,000の糖タンパク質で、高齢男性が罹患する代表的な悪性腫瘍のひとつである前立腺癌のスクリーニング(検診)に応用されている。
(1)試薬
(1−1)第一試薬
(i)基本試薬
0.5M KCl、0.1% BSA(ウシ血清アルブミン)を含む30mM HEPES 緩衝液(pH7.0)
(ii)本発明試薬
上記基本試薬に一種類でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体t溶液を抗体の最終濃度25、50、100μg/mLになるように添加した試薬
(iii)対照試薬
基本試薬に市販の異好性阻止試薬HBR、または抗ヒト免疫グロブリンMヤギポリクローナル抗体(MBC社製)を最終濃度25、50、100μg/mLになるように添加した試薬
(1−2)第二試薬
ナノピア(登録商標)PSA PSAラテックス試液 第2液(積水メディカル株式会社)
(2)測定装置
日立7170形自動分析装置:
パラメータ条件
(i)検体−第一試薬−第二試薬の量:4μL−100μL−100μL
(ii)分析法:2ポイントエンド法(測光ポイント19−34)
(iii)測定波長:主波長570nm/副波長800nm
(3)測定試料
(i)正常検体
女性血清を用いた。女性血中にPSAはほとんど存在しないか、存在してもごく微量であることから、陰性コントロールとして繁用される。
(ii)非特異反応検体
高値異常感度を示す女性血清を用いた。PSAは男性に特異的な抗原で、女性血清には本来見出されないものであるので、女性血清で高値異常感度を示すものは、PSA含量とは無関係にラテックス凝集が惹起された非特異反応の結果と考えられる。具体的には、市販血清(Serum from Anticoagulant−Free Whole Blood、Normal Female、TENNESSEE BLOOD SERVICES,INC.)の中から前記基本試薬と第二試薬との組み合わせにより、高い吸光度を示す女性血清をスクリーニングによって見出し、使用した。
(4)測定方法
第一試薬として基本試薬、本発明試薬および対照試薬、第二試薬としてナノピア(登録商標)PSA PSAラテックス試液第2液を使用して、日立7170形自動分析装置で正常検体ならびに非特異反応検体を測定し感度を確認した。
(5)測定結果
図4に示す正常検体の測定においては、本発明試薬、対照試薬ともに抗ヒト免疫グロブリンM抗体や異好性阻止試薬HBRの添加濃度に関わらず感度変化が認められないことから、検体中にPSAが存在せず、また抗ヒト免疫グロブリンM抗体やHBRの添加が測定感度には一切影響を与えないことがわかる。一方、図5に示す非特異反応検体の測定においては、添加物ゼロの基本試薬で150mAbs以上の異常値が確認され、対照試薬である抗ヒト免疫グロブリンMヤギポリクローナル抗体では100μg/mLの添加まで顕著な抑制効果は認められず、抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体を成分とする市販の異好性阻止試薬HBRの添加では阻止どころか、わずかではあるが感度の増加が認められる。
抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体tを添加した本発明の試薬では、25μg/mLの添加で顕著な異常値の低下が認められ、50μg/mLの添加でほぼ完全に非特異反応が抑制されている。本発明の測定方法は、非特異反応阻止の目的で用いられた従来型の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体や、抗ヒト免疫グロブリンMポリクローナル抗体といった対策法では阻止できないヒト免疫グロブリンMに起因する非特異反応に対して、強い抑制効果を示すことが確認できた。
抗CRPモノクローナル抗体を利用したCRP測定用ラテックス試薬で確認された、非特異反応に対する本発明の抑制効果を、汎用自動分析装置を利用した測定で確認した。CRPは、非特異的な炎症マーカーとしてよく知られている。
(1)試薬
(1−1)第一試薬
(i)基本試薬
500mM塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)
(ii)本発明試薬
基本試薬に1種類でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体t溶液を抗体の最終濃度50μg/mLになるように添加した試薬
(iii)対照試薬
基本試薬に受身型の非特異反応抑制効果を示すノーマルマウスIgGまたは市販の異好性阻止試薬HBRを50μg/mL添加した試薬
(1−2)第二試薬
SSタイプ ピュアオート(登録商標)S CRPラテックス ラテックス試液第2液(積水メディカル株式会社)
(1−3)キャリブレーター
SSタイプ ピュアオート(登録商標)S CRPラテックス キャリブレーター(積水メディカル株式会社)
(2)測定装置
日立7170形自動分析装置:
パラメータ条件
(i)検体−第一試薬−第二試薬の量:3μL−150μL−50μL
(ii)分析法:2ポイントエンド法(測光ポイント19−34)
(iii)測定波長:主波長570nm/副波長800nm
(iv)キャリブレーション:スプライン
(3)測定試料
非特異反応検体1:一般血清から見出された高値異常検体
非特異反応検体2:一般血清から見出された高値異常検体
(4)測定方法
第一試薬として基本試薬、本願発明試薬および対照試薬、第二試薬としてSSタイプ ピュアオート(登録商標)S CRPラテックス ラテックス試液第2液を使用して、日立7170形自動分析装置で非特異反応検体を測定し測定値を確認した。
(5)測定結果
表2に示すように非特異反応検体1,2の正常測定値(ウサギポリクローナル抗体を利用した他社ラテックス試薬で確認した参考値。製品名:CRP-ラテックス(II)「生研」X2 デンカ生研社)に対して、基本試薬における測定値はそれぞれ5〜10倍の高値となる。ノーマルマウスIgG50μg/mLを添加した対照試薬では、非特異反応検体1で測定値の改善が認められ、非特異反応検体2では改善が認められない。したがって、非特異反応検体1は異好性抗体いわゆるHAMA検体であることがわかる。異好性阻止試薬HBRを50μg/mL添加した対照試薬においては、非特異反応検体1,2ともに測定値が正常測定値レベルまで低下し、改善が認められる。抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体tを添加した本発明試薬においても、非特異反応検体1,2ともに測定値が改善し、その効果は異好性阻止試薬HBRよりも強い。本願発明の測定方法は、異好性阻止試薬HBRが強い阻止効果を示すような従来型の非特異反応に対しても、同等以上に強い抑制効果を示すことが確認できる。
本発明の非特異抑制剤の効果をインスリン測定用ラテックス試薬においても確認を行った。
(1)抗インスリンマウスモノクローナル抗体の取得
ヒトインスリン(Fitzgerald社製 30−AI51)を免疫原として、通常のモノクローナル抗体の取得方法により、抗原認識部位の異なる2種の抗インスリンマウスモノクローナル抗体を取得し、社内管理番号66221、66412とした(以下、それぞれ66221抗体、66412抗体という)。
(2)ラテックス粒子の作製
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器(容量2L)に、蒸留水1100g、スチレン200g、スチレンスルホン酸ナトリウム0.2g、及び、蒸留水50gに過硫酸カリウム1.5gを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、70℃で攪拌しながら48時間重合した。重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を透過型電子顕微鏡装置(日本電子社製、「JEM−1010型」)を用いて10000倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低100個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。得られた平均粒子径は0.3μmであった。
(3)抗インスリンモノクローナル抗体感作ラテックス溶液の調製
1)66221抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
平均粒子径0.3μmの1.0%ラテックス溶液(5mM トリス緩衝液(pH8.5)に、0.60mg/mL66221抗体(5mM トリス緩衝液(pH8.5))を等量添加して4℃で2時間攪拌した。その後、等量の0.5%BSAを含む5mM トリス緩衝液 (pH8.5)を添加して4℃で1時間攪拌した。次に、これを遠心して上清を除去後、沈殿を5mM トリス緩衝液(pH8.5)で再懸濁して、66221抗体感作ラテックス溶液とした。
2)66412抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
66412抗体を用いて上記1)と同じ方法により66412抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。
(4)試薬
1)第一試薬の調製
(i)基本試薬
500mM塩化ナトリウム、0.2% BSAを含む5mM トリス緩衝液(pH8.5)
(ii)本発明試薬
基本試薬に、モノクローナル抗体t溶液を抗体の最終濃度が50μg/mLになるように添加した試薬
(iii)対照試薬
本発明のモノクローナル抗体tの代わりに市販の異好性阻止試薬HBRを抗体の最終濃度50μg/mLになるように添加した試薬
2)第二試薬の調製
66221抗体感作ラテックス粒子溶液及び66412抗体感作ラテックス粒子溶液を等量混合し、5mM トリス緩衝液(pH8.5)で波長600nmでの吸光度が5.0Absとなるように希釈して第二試薬とした。
(5)試料
糖負荷試験後採取された血清検体を試料とした。
(6)測定方法
(i)本発明試薬及び対照試薬の測定
第一試薬と第二試薬を組合せ、日立7170形自動分析装置を用いて、試料中のインスリン濃度を測定した。具体的には、試料10μLに第一試薬150μLを加えて37℃で5分間保温した後、第二試薬50μLを加えて攪拌した。凝集形成に伴う吸光度変化を、その後5分間にわたり、主波長570nm、副波長800nmで測定し、その吸光度変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線にあてはめ、インスリン濃度を算出した。
(ii)基準試薬の測定
試料中のインスリン濃度をルミパルス(登録商標)インシュリンーN (富士レビオ社製) を用いて、添付文書及びメーカー推奨の方法に従って測定した。このインスリンの測定値と上記本発明試薬または対照試薬との相関を図6に示す。
(7)測定結果及び考察
図6の相関図において、対照試薬(HBR)を用いた試験の相関図において乖離検体が認められるのに対し、本発明試薬を用いた本実施例では乖離が抑制され、ルミパルス(登録商標)インシュリンーNと良好な相関効果が認められた。以上より、インスリン測定においても本発明試薬は、市販の異好性阻止試薬HBRで抑制できない非特異反応を抑制することが確認された。
また、本発明のモノクローナル抗体により、高品質で安価なヒト免疫グロブリンMの免疫凝集測定試薬及び測定キットを提供する。
本発明の非特異反応の抑制剤、これを用いた免疫学的測定方法、免疫学的測定用試薬及び測定キットでは、HAMAなどに起因する従来型の非特異反応に加えて、既知の対策で回避できなかった非特異反応に関しても、ヒト免疫グロブリンMに起因すると考えられる非特異反応であれば、測定項目に関わらず抑制することができるため、これまでの測定法よりも正確な測定値を与える。
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566)
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成20年9月19日(原寄託日)
平成21年6月9日(原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP−11134
Claims (4)
- 試料中の測定対象成分を測定用抗体又は測定用抗原との抗原抗体反応により測定を行う免疫学的測定方法において、下記(1)〜(3)に記載のモノクローナル抗体および下記(4)に記載の断片からなる群から選ばれる1以上の添加により、前記抗原抗体反応以外の非特異反応であって、HAMAに起因する非特異反応及び/又は異好性阻止試薬により抑制できない非特異反応を抑制することを特徴とする免疫学的測定方法。
(1)ヒト免疫グロブリンMと特異的に反応し、溶液状態において1種類でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
(2)以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体の製造方法によって取得された(1)に記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
工程1)ヒト免疫グロブリンMを抗原として抗ヒト免疫グロブリンM抗体産生ハイブリド
ーマを取得する工程
工程2)工程1で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブ
リンMと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づ
く免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程3)工程2で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
(3)FERM BP−11134であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体に由来するFab部分を含みヒト免疫グロブリンMとの結合能を有する断片。 - 異好性阻止試薬が、抗ヒト免疫グロブリンMポリクローナル抗体、抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体(但し、下記(1)〜(4)であるものは含まない)、ノーマルマウスIgG、からなる群より選択されるものである、請求項1に記載の免疫学的測定方法。
(1)ヒト免疫グロブリンMと特異的に反応し、溶液状態において1種類でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
(2)以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体の製造方法によって取得された(1)に記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
工程1)ヒト免疫グロブリンMを抗原として抗ヒト免疫グロブリンM抗体産生ハイブリド
ーマを取得する工程
工程2)工程1で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブ
リンMと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づ
く免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程3)工程2で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
(3)FERM BP−11134であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体に由来するFab部分を含みヒト免疫グロブリンMとの結合能を有する断片。 - 異好性阻止試薬が、HBR(SCANTIBODIES LABORATORY,INC.製)である請求項1に記載の免疫学的測定方法。
- 下記(1)〜(3)に記載のモノクローナル抗体および下記(4)に記載の断片からなる群から選ばれる1以上を含む、HAMA阻害剤。
(1)ヒト免疫グロブリンMと特異的に反応し、溶液状態において1種類でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
(2)以下の工程を含む抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体の製造方法によって取得された(1)に記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体。
工程1)ヒト免疫グロブリンMを抗原として抗ヒト免疫グロブリンM抗体産生ハイブリドーマを取得する工程
工程2)工程1で取得したハイブリドーマが産生する抗体を、溶液状態のヒト免疫グロブリンMと接触させて、当該溶液状態でヒト免疫グロブリンMとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
工程3)工程2で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
(3)FERM BP−11134であるハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の抗ヒト免疫グロブリンMモノクローナル抗体に由来するFab部分を含みヒト免疫グロブリンMとの結合能を有する断片。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010249274A JP5570391B2 (ja) | 2008-09-05 | 2010-11-08 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008228370 | 2008-09-05 | ||
JP2008228370 | 2008-09-05 | ||
JP2008272642 | 2008-10-23 | ||
JP2008272642 | 2008-10-23 | ||
JP2008286521 | 2008-11-07 | ||
JP2008286521 | 2008-11-07 | ||
JP2010249274A JP5570391B2 (ja) | 2008-09-05 | 2010-11-08 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501720A Division JP4625879B2 (ja) | 2008-09-05 | 2009-09-03 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011027751A true JP2011027751A (ja) | 2011-02-10 |
JP5570391B2 JP5570391B2 (ja) | 2014-08-13 |
Family
ID=41796939
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501720A Active JP4625879B2 (ja) | 2008-09-05 | 2009-09-03 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
JP2010249274A Active JP5570391B2 (ja) | 2008-09-05 | 2010-11-08 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501720A Active JP4625879B2 (ja) | 2008-09-05 | 2009-09-03 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20110165701A1 (ja) |
EP (2) | EP2322562B1 (ja) |
JP (2) | JP4625879B2 (ja) |
KR (1) | KR101729056B1 (ja) |
CN (1) | CN102159591A (ja) |
AU (2) | AU2009287916A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0918791A2 (ja) |
CA (2) | CA2964771C (ja) |
MX (1) | MX2011002337A (ja) |
MY (2) | MY171554A (ja) |
WO (1) | WO2010026758A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016065795A (ja) * | 2014-09-25 | 2016-04-28 | ヤマサ醤油株式会社 | 非特異的反応阻害剤、それを用いた免疫学的測定法 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2322562B1 (en) * | 2008-09-05 | 2016-03-30 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Monoclonal antibody, and immunoassay using same |
CA2739310C (en) * | 2009-07-21 | 2014-07-08 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Insulin assay |
WO2014051144A1 (ja) | 2012-09-28 | 2014-04-03 | 積水メディカル株式会社 | 免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬 |
US9313814B2 (en) * | 2013-12-20 | 2016-04-12 | Intel Corporation | Establishing wireless communication via proximity detection |
CN104407159B (zh) * | 2014-12-15 | 2016-03-02 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒 |
CN105334318A (zh) * | 2015-11-28 | 2016-02-17 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 一种便捷式c反应蛋白检测试剂盒 |
WO2018203572A1 (ja) * | 2017-05-02 | 2018-11-08 | 田中貴金属工業株式会社 | 非特異反応抑制剤 |
JP6962834B2 (ja) * | 2018-02-21 | 2021-11-05 | 田中貴金属工業株式会社 | モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤 |
JP6943789B2 (ja) | 2018-02-21 | 2021-10-06 | 田中貴金属工業株式会社 | モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤 |
CN108531460B (zh) * | 2018-03-30 | 2020-07-14 | 四川迈克生物新材料技术有限公司 | 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 |
CN108517316B (zh) * | 2018-03-30 | 2020-08-11 | 四川迈克生物新材料技术有限公司 | 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 |
CN108330104B (zh) * | 2018-03-30 | 2019-10-18 | 四川迈克生物新材料技术有限公司 | 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 |
CN109444426A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-08 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法 |
WO2023088443A1 (zh) * | 2021-11-20 | 2023-05-25 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗人IgM抗体及其制备方法和用途 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60237363A (ja) * | 1984-05-11 | 1985-11-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 免疫グロブリンの定量方法 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4164558A (en) * | 1976-11-22 | 1979-08-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for optimizing reagents for agglutination reactions |
JPS6042400A (ja) | 1983-08-19 | 1985-03-06 | Yamasa Shoyu Co Ltd | ヒトIgMに対する単一クロ−ン抗体 |
DE3662730D1 (en) * | 1985-01-24 | 1989-05-11 | Inst Int Pathologie Cellulaire | Immunoassay method for antibodies of different classes in a liquid sample |
JPS6358260A (ja) | 1986-08-29 | 1988-03-14 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | IgM型抗体の測定法 |
US5079173A (en) * | 1987-08-19 | 1992-01-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Methods, hybridomas, monoclonal antibodies and sensitized cells for measuring hbs antigen |
JPH01144993A (ja) * | 1987-08-19 | 1989-06-07 | Shionogi & Co Ltd | HBs抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球 |
JPH01305697A (ja) | 1988-06-02 | 1989-12-08 | Yamatake Honeywell Co Ltd | 通信システム |
IE911172A1 (en) | 1990-04-27 | 1991-11-06 | Res Dev Foundation | MONOCLONAL ANTI-IgM ANTIBODIES, THEIR PRODUCTION AND USE,¹AND HYBRIDOMAS FOR PRODUCING THE SAME |
WO1993016729A1 (en) * | 1992-02-28 | 1993-09-02 | Biotransplant, Inc. | Antibodies for and treatment to prevent or reduce the severity of xenograft rejection |
JPH0712818A (ja) | 1993-06-25 | 1995-01-17 | Hitachi Chem Co Ltd | 免疫学的検出方法 |
JPH08327629A (ja) * | 1995-06-01 | 1996-12-13 | Fujirebio Inc | 検体前処理方法 |
JP4065600B2 (ja) | 1998-04-01 | 2008-03-26 | デンカ生研株式会社 | 免疫学的測定法および免疫学的測定用キット |
JP2002048798A (ja) * | 2000-05-24 | 2002-02-15 | Mitsubishi Chemicals Corp | 金属または金属化合物を含有する標識粒子を用いる測定方法 |
JP2003294753A (ja) * | 2002-04-01 | 2003-10-15 | Kyokuto Seiyaku Kogyo Kk | 凝集反応増感剤、免疫測定用試薬及び免疫測定法 |
EP1460426A1 (en) * | 2003-03-20 | 2004-09-22 | Sysmex Corporation | Method for detecting antibody against BDV (Borna disease virus) for detecting a BDV infection |
JP2004309477A (ja) * | 2003-03-26 | 2004-11-04 | Sysmex Corp | 抗体測定方法 |
WO2007013157A1 (ja) * | 2005-07-28 | 2007-02-01 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | 抗体感作ラテックス |
EP2322562B1 (en) * | 2008-09-05 | 2016-03-30 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Monoclonal antibody, and immunoassay using same |
-
2009
- 2009-09-03 EP EP09811288.1A patent/EP2322562B1/en active Active
- 2009-09-03 MY MYPI2011000680A patent/MY171554A/en unknown
- 2009-09-03 CA CA2964771A patent/CA2964771C/en active Active
- 2009-09-03 BR BRPI0918791A patent/BRPI0918791A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-09-03 MX MX2011002337A patent/MX2011002337A/es active IP Right Grant
- 2009-09-03 CN CN200980133001.0A patent/CN102159591A/zh active Pending
- 2009-09-03 EP EP16162318.6A patent/EP3056517B1/en active Active
- 2009-09-03 US US13/061,849 patent/US20110165701A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-03 CA CA2734704A patent/CA2734704C/en active Active
- 2009-09-03 AU AU2009287916A patent/AU2009287916A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-03 JP JP2010501720A patent/JP4625879B2/ja active Active
- 2009-09-03 KR KR1020117007735A patent/KR101729056B1/ko active IP Right Grant
- 2009-09-03 WO PCT/JP2009/004350 patent/WO2010026758A1/ja active Application Filing
- 2009-09-03 MY MYPI2018000889A patent/MY189968A/en unknown
-
2010
- 2010-11-08 JP JP2010249274A patent/JP5570391B2/ja active Active
-
2016
- 2016-05-20 AU AU2016203292A patent/AU2016203292B2/en active Active
- 2016-08-05 US US15/229,849 patent/US20160341721A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60237363A (ja) * | 1984-05-11 | 1985-11-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 免疫グロブリンの定量方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6009056860; Ph. POULETTY. et al.: 'An Anti-Human u Chain Monoclonal Antibody: Use for Detection of IgM Antibodies to Toxoplasma gondii' Journal of Immunological Methods Vol.76, 1985, p.289-298 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016065795A (ja) * | 2014-09-25 | 2016-04-28 | ヤマサ醤油株式会社 | 非特異的反応阻害剤、それを用いた免疫学的測定法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101729056B1 (ko) | 2017-04-24 |
KR20110059753A (ko) | 2011-06-03 |
CA2734704C (en) | 2017-06-20 |
BRPI0918791A2 (pt) | 2016-10-25 |
WO2010026758A1 (ja) | 2010-03-11 |
CA2964771A1 (en) | 2010-03-11 |
AU2016203292B2 (en) | 2018-06-07 |
JP5570391B2 (ja) | 2014-08-13 |
CA2964771C (en) | 2019-01-15 |
JP4625879B2 (ja) | 2011-02-02 |
EP2322562A1 (en) | 2011-05-18 |
EP2322562A4 (en) | 2012-10-10 |
EP2322562B1 (en) | 2016-03-30 |
CA2734704A1 (en) | 2010-03-11 |
AU2016203292A1 (en) | 2016-06-09 |
AU2009287916A1 (en) | 2010-03-11 |
MY171554A (en) | 2019-10-18 |
EP3056517A1 (en) | 2016-08-17 |
US20160341721A1 (en) | 2016-11-24 |
CN102159591A (zh) | 2011-08-17 |
EP3056517B1 (en) | 2017-11-29 |
MX2011002337A (es) | 2011-04-05 |
US20110165701A1 (en) | 2011-07-07 |
MY189968A (en) | 2022-03-22 |
JPWO2010026758A1 (ja) | 2012-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5570391B2 (ja) | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 | |
JP5807300B2 (ja) | 試料中のc反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬 | |
CN107102135A (zh) | 用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂 | |
JPWO2010064435A1 (ja) | ヒト体液中のシスタチンc測定方法 | |
CN111566214A (zh) | 抗人IgG4单克隆抗体及利用该抗体的人IgG4测定试剂 | |
JP7382071B2 (ja) | 糖化ヘモグロビン(%)の測定方法 | |
CN115327121A (zh) | 凝血酶-抗凝血酶复合体的测定试剂及测定方法 | |
JP5798679B2 (ja) | ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ1を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途 | |
RU2607588C2 (ru) | Способ получения агента, связывающегося с препро-вазопрессином или с его фрагментами | |
JP6242068B2 (ja) | ラテックス免疫凝集測定試薬 | |
JP4458622B2 (ja) | 免疫学的測定方法及び測定用試薬 | |
CN110579597A (zh) | 检测14-3-3 eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂盒及其应用 | |
JP7315966B2 (ja) | 生物学的試料中の遊離aimの免疫学的分析方法 | |
CN110579592A (zh) | 检测14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂盒及其应用 | |
WO2023068248A1 (ja) | I型コラーゲン架橋n-テロペプチドの免疫測定方法及び免疫測定キット、並びに抗体又はその抗体断片 | |
WO2023163176A1 (ja) | セリンプロテアーゼの検出用または測定用試薬 | |
CN114729935A (zh) | 使用免疫反应的分析物的测量方法和测量试剂 | |
CN113388034A (zh) | 脂蛋白(a)的抗原肽、其抗体及用途 | |
JPH0795067B2 (ja) | 免疫複合体の測定法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120521 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140120 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140325 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140527 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140624 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5570391 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |