WO2014051144A1 - 免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬 - Google Patents

免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2014051144A1
WO2014051144A1 PCT/JP2013/076585 JP2013076585W WO2014051144A1 WO 2014051144 A1 WO2014051144 A1 WO 2014051144A1 JP 2013076585 W JP2013076585 W JP 2013076585W WO 2014051144 A1 WO2014051144 A1 WO 2014051144A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
fragment
antigen
reaction
insoluble carrier
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/076585
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智恵 片岡
弘至 高橋
忠晃 吉田
義正 坂場
Original Assignee
積水メディカル株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 積水メディカル株式会社 filed Critical 積水メディカル株式会社
Priority to US14/431,888 priority Critical patent/US10067127B2/en
Priority to CN201380061521.1A priority patent/CN105102981B/zh
Priority to EP13840321.7A priority patent/EP2902782B1/en
Priority to KR1020157010899A priority patent/KR102176382B1/ko
Priority to JP2014538671A priority patent/JP6431766B2/ja
Publication of WO2014051144A1 publication Critical patent/WO2014051144A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing a non-specific reaction, an inhibitor, and an immunological measurement method using the same, and more particularly, to an immunological measurement method using an insoluble carrier carrying a fragment antibody against an antigen to be detected.
  • the present invention relates to a method for suppressing nonspecific reaction and an inhibitor.
  • an antibody prepared in advance using the detection target substance (antigen) as an immunogen is used to detect the detection target antigen present in the test sample.
  • immunological assay methods In particular, the immunoaggregation method and the immunochromatography method using an insoluble carrier carrying an antibody are highly versatile measurement methods applied to diagnostic items in various clinical tests because of their excellent measurement sensitivity and operability. With recent improvements in measurement accuracy, suppression of non-specific reactions in immunological measurement methods has become an issue for in vitro diagnostic drug development.
  • Non-specific reaction is a phenomenon in which some factor in a test sample reacts with an antibody that is a component of an in vitro diagnostic agent based on the immunological measurement method, and generates an incorrect signal. Cause interference.
  • the presence of heterophilic antibodies and rheumatoid factor (RF) has been clarified as a causative factor of nonspecific reaction.
  • a heterophilic antibody is a generic term for human antibodies that are reactive with animal-derived antibodies, which are the main components of immunological measurement methods, and HAMA (human anti-mouse immunoglobulin antibody) is representative. Known as.
  • antibodies in human samples that have not been antigen-sensitized may show heterophilicity in addition to cases where they are produced by sensitization in the absence of awareness, such as diet, contact with animals, or administration of biological products. Since the nature is also pointed out, the actual situation is that the detailed or unified clarification has not been made.
  • rheumatoid factor appears in patients with rheumatoid arthritis, and its binding site is identified as the Fc site of immunoglobulin (antibody). It is common in that it has a property of showing reactivity to antibodies, and as described in Non-Patent Document 1, it is known that all of them are human IgG and IgM (so-called autoantibodies).
  • the non-specific reaction is reduced by using a fragment antibody (described later in definition) in which the Fc portion has been removed and fragmented into Fab or F (ab ′) 2
  • the method is known and is particularly effective in suppressing the influence of rheumatoid factors.
  • the anti-human IgM monoclonal antibody HBR described in Non-Patent Documents 2 and 3 has been commercialized by SCANTIBODIES. ing.
  • Patent Document 1 a method described in Patent Document 1 in which a polyclonal antibody against an IgM-type natural antibody prepared from the same species as the antibody used in the measurement is added, and a method described in Patent Document 2 in which various animal antibodies are added to the reaction site of rheumatoid factor.
  • Patent Document 3 A non-specific reaction suppression method described in Patent Document 3 using an anti-human IgM monoclonal antibody capable of agglutinating human IgM has been devised.
  • the conventional countermeasure method alone cannot sufficiently suppress the non-specific reaction, and a specimen in which the countermeasure method itself causes the non-specific reaction has been found.
  • the present invention relates to a method for suppressing a non-specific reaction, an inhibitor, and an immunoassay method using the same, and more specifically, a non-specific characteristic of an immunoassay method using an insoluble carrier carrying a fragment antibody. It is an object to provide a method for suppressing reaction and an inhibitor.
  • an object of the present invention relates to a method for suppressing a nonspecific reaction by a denatured fragment antibody.
  • the present inventors surprisingly, even if the modified fragment antibody is not derived from the same full-length antibody as the fragment antibody supported on the insoluble carrier, it may be an antibody against the antigen to be detected. It has been found that the non-specific reaction suppressing effect aimed at by the present invention is exhibited. Accordingly, another object of the present invention relates to an inhibitor of a nonspecific reaction including a denatured fragment antibody, and still another object relates to an immunoassay and an immunoassay reagent using the inhibitor. Specifically, the present invention has the following configuration.
  • fragment antibody Antigen-antibody reaction of an antigen to be detected in a sample with an antibody fragment containing an antigen recognition site for the antigen (hereinafter, “an antibody fragment containing an antigen recognition site for an antigen to be detected” is simply referred to as “fragment antibody”)
  • the method of detecting by a) contacting the sample with a modified form of the fragment antibody; b) contacting the sample with the fragment antibody supported on an insoluble carrier simultaneously with the step a) or after the step a);
  • the detection method comprising: [2] The detection method according to [1], wherein the modified fragment antibody has the same or different recognition epitope as the fragment antibody supported on the insoluble carrier.
  • a non-specific reaction suppression method in a method for detecting an antigen to be detected in a sample by an antigen-antibody reaction with the fragment antibody a) contacting the sample with a modified form of the fragment antibody; b) contacting the sample with the fragment antibody supported on an insoluble carrier simultaneously with the step a) or after the step a);
  • a non-specific reaction suppression method comprising: [5] The nonspecific reaction suppression method according to [4], wherein the modified fragment antibody has the same or different recognition epitope as the fragment antibody supported on the insoluble carrier.
  • the nonspecific reaction suppression method according to any one of [4] to [7], wherein the nonspecific reaction is a reaction that cannot be suppressed by a nonspecific reaction inhibitor including a full-length antibody.
  • a reagent for detecting an antigen to be detected in a sample by an antigen-antibody reaction 1) An insoluble carrier carrying a fragment antibody against the antigen to be detected 2) The reagent comprising a modified form of the fragment antibody against the antigen to be detected.
  • the reagent according to [12], wherein the modified fragment antibody has the same or different recognition epitope as the fragment antibody supported on the insoluble carrier.
  • the reagent according to [12] or [13], wherein the fragment antibody supported on the insoluble carrier of 1) is one in which at least two types of fragment antibodies having different recognition sites are supported on the insoluble carrier.
  • the nonspecific reaction avoidance method of the present invention has made it possible to suppress nonspecific reactions that cannot be suppressed by conventional methods using intact antibodies.
  • immunological measurement methods and immunological measurement reagents containing the non-specific reaction inhibitor of the present invention suppress non-specific reactions that could not be avoided with known inhibitors. Can be measured.
  • a fragment antibody is a fragment derived from an antibody containing a Fab structure which is an antigen recognition site, and Fab and F (ab ′) 2 are frequently used. Fragment antibodies are generally prepared by removing intact Fc from intact antibodies (full-length unfragmented antibodies) treated with pepsin or papain according to conventional methods. Even if it is modified, there is no particular limitation.
  • the insoluble carrier is not particularly limited, but those selected from insoluble carrier particles made of a synthetic polymer latex, metal colloid, silica, alumina, carbon black, ceramics, or a magnetic material are preferable.
  • the synthetic polymer include polystyrene, styrene-sulfonic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer, vinyl acetate-acrylic acid ester. It is preferable that it is 1 or more types chosen from a copolymer.
  • both the labeled part of the labeled antibody and the membrane of the detection line part It can be included in an insoluble carrier on which the fragment antibody referred to in the present invention is immobilized.
  • the method for supporting the fragment antibody on an insoluble carrier is not particularly limited, and any of the commonly used physical bonding methods and chemical bonding methods can be used.
  • the antibody supported on the insoluble carrier requires at least two kinds of antibodies having different recognition sites for the antigen when the antigen is not a multivalent antigen.
  • one or more of the fragment antibodies may be used, and all of them may be fragment antibodies. In the examples described later, those in which two kinds of fragment antibodies are each supported on an insoluble carrier are exemplified.
  • Non-specific reaction The non-specific reaction suppression method of the present invention does not occur in an immunological assay consisting of an insoluble carrier carrying an intact antibody, but manifests in an insoluble carrier carried by fragmenting the same antibody and utilizing the intact antibody.
  • Nonspecific reactions that cannot be suppressed by conventional methods can be effectively suppressed.
  • Examples of conventional non-specific reaction inhibitors using intact antibodies include agents that suppress non-specific reactions derived from HAMA, heterophilic antibodies, and rheumatoid factor (RF). Examples include inhibitors comprising human IgG antibodies and anti-human IgM antibodies, and more specifically, monoclonal antibodies produced by the heterophilic blocking reagent HBR (SCANTIBODIES) and hybridoma FERM BP-11134 are used as active ingredients. Inhibitors may be mentioned.
  • Denatured fragment antibody There are no particular limitations on the method of denaturing fragment antibodies, and heating, acid, alkali, reducing agent, chaotropic salt, etc. that are generally used for denaturation of proteins can be applied. Among them, treatment methods exhibiting irreversible denaturation effects. Is preferred. The order of fragmentation and denaturation may be modified after fragmenting the full-length antibody, or may be fragmented after modifying the full-length antibody. In the present specification, “denatured fragment antibody” is sometimes referred to as “denatured fragment antibody” or “denatured fragment antibody”, and unless otherwise noted, it is used interchangeably.
  • the degree of denaturation of the fragment antibody As for the degree of denaturation of the fragment antibody, the reactivity of the antigen recognition site is inactivated, or the reactivity is lower than the fragment antibody supported on the carrier, and the main reaction for antigen measurement is suppressed to a practical level or less. Without it, it ’s good.
  • protein components such as BSA, sericin, and blocking peptide fragments (Toyobo Co., Ltd.) and glycerol can coexist in order to adjust the degree of denaturation.
  • the non-specific reaction inhibitor of the present invention can be applied to any immunoassay method using an insoluble carrier carrying a fragment antibody, and can be used as a sample pretreatment agent or an immunological method. It can be suitably used as a part of the components of the measuring method / reagent.
  • Specific examples of the immunological measurement method include a widely used particle-enhanced immunoagglutination method, an immunochromatography method that is a simple test method, a chemiluminescence method using a dedicated instrument, a fluorescent enzyme method, and the like.
  • the buffer, protein, peptide, amino acid, nucleic acid, lipid, phospholipid, saccharide, inorganic are within the range that does not interfere with the nonspecific reaction inhibitory effect. Salts, surfactants, preservatives and the like may be included.
  • the non-specific reaction suppression method of the present invention can be applied to any substance as long as it can produce a fragment antibody having a measurement target substance as an antigen.
  • substances to be measured include proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates, nucleic acids, haptens and the like, but there are no particular limitations as long as they are theoretically measurable molecules.
  • Examples include CRP (C-reactive protein), Lp (a), MMP-3 (matrix metalloproteinase 3), anti-CCP (cyclic citrullinated peptide) antibody, antiphospholipid antibody, RPR, type IV collagen, PSA, BNP ( Brain natriuretic peptide), NT-proBNP, insulin, microalbumin, cystatin C, RF (rheumatic factor), CA-RF, KL-6, PIVKA-II, FDP, D-dimer, SF (soluble fibrin), TAT (thrombin) -Antithrombin III complex), PIC, PAI, factor XIII, pepsinogen I / II, phenytoin, phenobarbital, carbamazepine, valproic acid, theophylline and the like.
  • CRP C-reactive protein
  • Lp a
  • MMP-3 matrix metalloproteinase 3
  • anti-CCP cyclic citrullinated peptide
  • the concentration of the antigen to be measured that can suppress the non-specific reaction varies depending on the type of each antigen, the type of antibody, and other conditions, but for example, it exhibits its effect particularly in the range including the normal concentration in serum. More desirably, when the measurement target is PSA, the inhibitory effect is exhibited at a concentration level of 4 to 5 ng / mL, which is considered to be a clinical cutoff value of 2 to 5 ng / mL as in Examples described later. It is more desirable.
  • the detection of the present invention in addition to qualitative detection for examining the presence or absence of the antigen to be detected in the sample, quantitative detection (that is, measurement) for quantitatively examining the amount of the antigen to be detected in the sample. Is also included. Therefore, in the present specification, unless otherwise specified, the terms “detection”, “quantification”, and “measurement” are to be interpreted in a broad sense including proof and / or quantification of the presence of the antigen to be detected. To do.
  • Example 1 Analysis of specimen exhibiting non-specific reaction and suppression of non-specific reaction according to the present invention
  • 63279 (hybridoma deposit number FERM BP-11454 is produced)
  • Monoclonal antibody A fragment antibody was purified from IgG according to a conventional method. Specifically, 63279 IgG solution was mixed with 0.2M citric acid solution (pH 3.5) in an equal amount, 1/130 amount (w / w) pepsin of IgG was added and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Neutralize by adding 1/10 volume of 2M Tris solution. The final solution was subjected to gel filtration to obtain purified 63279F (ab ′) 2 .
  • treatment solution containing non-specific reaction inhibitor consisting of intact antibody
  • Non-specific reaction inhibitor in HEPES buffer containing potassium chloride, BSA and PVP-K90 to a final concentration of 100 ⁇ g / mL
  • a treatment solution was prepared by adding HBR (SCANTIBODIES) and anti-IgM monoclonal antibody 73224 (monoclonal antibody produced by hybridoma deposit number FERM BP-11134). All of these non-specific reaction inhibitors are full-length IgG, ie intact antibodies.
  • Example 2 Immunological assay reagent containing non-specific reaction inhibitor of the present invention
  • denatured F of various anti-PSA monoclonal antibodies ( ab ′) 2 was prepared and a fragment antibody showing an inhibitory effect on the nonspecific reaction was searched for to obtain denatured 63284F (ab ′) 2 . Since the 63284 antibody can be subjected to sandwich ELISA measurement in combination with the 63279 antibody used in Example 1, the recognized epitope differs from the 63279 antibody.
  • the 2- bound latex solution was adjusted with a 5 mM MOPS buffer solution (pH 7.0) so that the absorbance at a wavelength of 600 nm was 1.5 Abs / mL, and mixed in an equal amount to obtain a second test solution.
  • MOPS buffer solution pH 7.0
  • FIG. 1 shows calibration curves for each reagent. Compared with the control reagent containing no denatured fragment antibody, the absorbance of the reagent containing denatured 63279F (ab ′) 2 was reduced to about half. This was presumed to be due to competition with 63279F (ab ′) 2 -binding latex and inhibition of aggregation due to the remaining reactivity with PSA in the modified 63279F (ab ′) 2 .
  • the sensitivity reduction when using the first test solution containing the fragment antibody (63279F (ab ′) 2 and 63291F (ab ′) 2 ) constituting the measurement system and the modified 63284F (ab ′) 2 having a different recognition epitope is 10 %.
  • Table 2 shows specimen Lot. The measured value of 101409 is shown. It was confirmed that the control reagent had a value higher by 30% or more than the displayed value, whereas the reagent of the present invention containing the denatured fragment antibody all suppressed the influence of nonspecific reaction.
  • the normal concentration of PSA is 4 ng / mL or less, and it is clinically important to ensure the accuracy of the measured values near this concentration.
  • nonspecific reaction inhibitor of the present invention when a fragment antibody whose recognition epitope is different from that of the main component of an immunological measurement reagent such as modified 63284F (ab ′) 2 can be used, the effect on the reagent sensitivity Is small and suitable.
  • Example 3 Analysis of Nonspecific Reaction Sample and Suppression of Nonspecific Reaction According to the Present Invention 2
  • Anti-MMP-3 monoclonal antibody 82208 (monoclonal antibody produced by hybridoma accession number FERM BP-11517) was purified from IgG according to the method of Example 1, and absorbance at a wavelength of 600 nm. was adjusted to 5 Abs / mL with 5 mM MOPS buffer (pH 7.0) to obtain 82208F (ab ′) 2 -bound latex solution.
  • the non-specific reaction suppression method of the present invention makes it possible to suppress non-specific reactions caused by fragment antibodies that could not be suppressed by conventional methods using intact antibodies.
  • Hybridoma 63279 producing 63279 antibody The name and address of the depository institution that deposited the biological material National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, 1-chome, East 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305-8666) Date of deposit of biological materials at Loi depository February 19, 2010 (February 19, 2010) (original deposit date) January 31, 2012 (January 31, 2012) (Date of transfer to deposit under the Budapest Treaty by original deposit) Deposit number FERM BP-11454 assigned by the depository in Thailand (2) Hybridoma 63291 producing the 63291 antibody The name and address of the depository institution that deposited the biological material National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, 1-chome, East 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305-8666) Date of deposit of biological materials at Loi depository February 19, 2010 (February 19, 2010) (original deposit date) January 31, 2012 (January 31, 2012) (Date of transfer to

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片（以下、「抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片」を単に「抗原に対するフラグメント抗体」という）との抗原抗体反応により検出する方法であって、フラグメント抗体に起因する非特異的反応が抑制された検出方法を提供することを課題とする。　試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対するフラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法であって、ａ）試料と、前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、ｂ）ａ）の工程の後に、試料と、不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体とを接触させる工程と、を含むことにより非特異的反応を抑制した検出方法を提供する。

Description

免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬
　本発明は非特異的反応の抑制方法、抑制剤およびこれを用いた免疫学的測定方法に関し、より詳細には検出対象抗原に対するフラグメント抗体を担持した不溶性担体を用いる免疫学的測定法に特徴的な非特異的反応の抑制方法、抑制剤に関する。
　体外診断薬の分野で汎用される被験試料中の検出対象物質の検出方法として、予め検出対象物質（抗原）を免疫原として作成された抗体を用い、被験試料中に存在する検出対象抗原を検出する免疫学的測定法が挙げられる。とりわけ抗体を担持した不溶性担体を利用する免疫凝集法や免疫クロマトグラフ法は、測定感度や操作性に優れることから、さまざまな臨床検査における診断項目に適用される汎用性の高い測定方法である。
近年の測定精度の向上に伴ない、免疫学的測定方法における非特異的反応の抑制が体外診断薬開発の課題となっている。非特異的反応とは被験試料中の何らかの因子が、免疫学的測定方法を原理とする体外診断薬の構成成分である抗体と反応することにより、誤ったシグナルを発生する現象で、正確な測定を妨害する原因となる。非特異的反応の原因因子として異好性抗体やリウマチ因子（ＲＦ）の存在が明らかとなっている。
　異好性抗体とは、免疫学的測定方法を構成する主成分である動物由来抗体に対して反応性を示すヒト抗体の総称であり、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体）が代表的なものとして知られている。その成因については、食事や動物との接触、生物学的製剤の投与といった無自覚下における抗原感作によって産生される場合に加え、抗原未感作のヒト試料中の抗体が異好性を示す可能性も指摘されているため、詳細あるいは統一した解明がなされていないのが実状である。一方、リウマチ因子は関節リウマチ患者に出現し、その結合部位は免疫グロブリン（抗体）のＦｃ部位と特定されていることから、異好性抗体とは別の概念として捉えられているが、動物由来抗体に対して反応性を示すという性質を有する点では共通しており、非特許文献1に記載されたようにその実体はいずれもヒトのＩｇＧやＩｇＭ（いわゆる自己抗体）であることが知られている
　これまで体外診断薬に使用する抗体として、Ｆｃ部分を除去し、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２に断片化したフラグメント抗体（定義後記）を使用することで、非特異的反応を低減する方法が知られており、特にリウマチ因子の影響抑制に効果的である。さらにＦａｂに結合する異好性抗体による非特異的反応を抑制する添加剤として非特許文献２、３記載の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体を成分とする異好性阻止試薬ＨＢＲがＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社より製品化されている。さらにまた測定に用いる抗体と同種動物から調製したＩｇＭ型自然抗体に対するポリクローナル抗体を添加する特許文献１の方法や、リウマチ因子の反応部位に対する各種動物抗体を添加する特許文献２記載の方法、１種類でヒトＩｇＭを凝集できる抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体を利用する特許文献３記載の非特異的反応抑制方法が考案されている。
　しかしながら従来の対策法だけでは非特異的反応を充分抑制できず、対策法そのものが非特異的反応の原因となっている検体が見出されるようになってきた。
特開平１１－２８７８０１号公報 特開平０７－０１２８１８号公報 ＷＯ２０１０／０２６７５８号パンフレット
臨床化学 ;第23巻補冊175a-1～175a-10 (1994） 異好性阻止試薬HBRに関わる宣伝資料（長瀬産業1993） CLIN.CHEM. 45/7,942-956 （1999)
　本発明は非特異的反応の抑制方法、抑制剤およびこれを用いた免疫学的測定方法に関し、より詳細にはフラグメント抗体を担持した不溶性担体を用いる免疫学的測定法に特徴的な非特異的反応の抑制方法、抑制剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討をおこなったところ、フラグメント抗体を担持した不溶性担体を利用した測定方法において、断片化されていない全長の抗体（以下、インタクト抗体ということがある）を利用した従来の対策方法では抑制できない非特異的反応を示す試料に対して、フラグメント抗体を担持した不溶性担体と接触させる前あるいは同時に、変性させたフラグメント抗体を接触させることで非特異的反応を抑制できることを見出し本発明の完成に至った。したがって本発明の目的は、変性させたフラグメント抗体による非特異的反応の抑制方法に関する。
　また、本発明者らは、驚くべきことに前記変性させたフラグメント抗体が、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と同一の全長の抗体に由来するものでなくても、検出対象抗原に対する抗体であれば本発明の目的とする非特異的反応の抑制効果を示すことを見出した。したがって本発明の別の目的は、変性させたフラグメント抗体を含む非特異的反応の抑制剤に関し、さらに別の目的は前記抑制剤を利用した免疫学的測定法および免疫学的測定試薬に関する。
　具体的には本発明は以下の構成を有する。
〔１〕試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片（以下、「検出対象抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片」を単に「フラグメント抗体」という）との抗原抗体反応により検出する方法であって、
ａ）試料と、前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と、不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体とを接触させる工程と、
を含む前記検出方法。
〔２〕フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる〔１〕記載の検出方法。
〔３〕ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、〔１〕または〔２〕に記載の検出方法。
〔４〕試料中の検出対象抗原を、前記フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制方法であって、
ａ）試料と前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体を接触させる工程と、
を含む非特異的反応抑制方法。
〔５〕フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる〔４〕記載の非特異的反応抑制方法。
〔６〕ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、〔４〕または〔５〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔７〕非特異的反応が、測定に使用するフラグメント抗体に起因する反応である、〔４〕～〔６〕のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
〔８〕非特異的反応が、全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤では抑制できない反応である、〔４〕～〔７〕のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
〔９〕全長の抗体が、全長の抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体または抗ヒトＩｇＡ抗体である〔８〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔１０〕全長の抗体が、ハイブリドーマＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３４が産生するモノクローナル抗体である〔９〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔１１〕全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤が、ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）である〔９〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔１２〕試料中の検出対象抗原を抗原抗体反応により検出するための試薬であって、
１）検出対象抗原に対するフラグメント抗体を担持した不溶性担体
２）検出対象抗原に対するフラグメント抗体の変性体
を含む前記試薬。
〔１３〕フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる、〔１２〕に記載の試薬。
〔１４〕１）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、〔１２〕または〔１３〕に記載の試薬。
〔１５〕さらに、３）全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤を含む〔１２〕または〔１３〕に記載の試薬。
〔１６〕試料中の検出対象抗原を、フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制剤であって、
前記フラグメント抗体の変性体を有効成分として含む前記非特異的反応抑制剤。
　本発明の非特異的反応回避方法により、インタクト抗体を利用する従来の方法では抑制できない非特異的反応を抑制することが可能になった。
　また本発明の非特異的反応の抑制剤を含む、免疫学的測定法や免疫学的測定試薬では、既知の抑制剤では回避できなかった非特異的反応が抑制されるため、従来よりも正確な測定値を与えることができる。
各試薬の検量線を示す図である。（実施例２）
（フラグメント抗体）
　フラグメント抗体とは抗原認識部位であるＦａｂ構造を含む、抗体由来の断片であって、ＦａｂやＦ（ａｂ'）２が繁用される。フラグメント抗体は一般的に、インタクト抗体（断片化されていない全長の抗体を）を常法に従いペプシンやパパインなどで酵素処理して、Ｆｃ部分を除去することで作成されるが、遺伝子組み換えによって合成、改変されたものであっても特に制限はない。
（不溶性担体）
　不溶性担体としては、特に限定されないが、合成高分子からなるラテックス、金属コロイド、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、セラミックスまたは磁性体の材質よりなる不溶性担体粒子から選ばれるものが好ましい。前記合成高分子としては、ポリスチレン、スチレン‐スルホン酸共重合体、スチレン‐メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体、塩化ビニル‐アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル‐アクリル酸エステル共重合体から選ばれる１種以上であることが好ましい。また、メンブレンを利用し、標識抗体、抗原、および検出用抗体の３元複合体をメンブレン上の検出ラインで検出するようなイムノクロマトグラフ法においては、標識抗体の標識部分も検出ライン部分のメンブレンも本発明でいうフラグメント抗体が固定化された不溶性担体に含めることができる。
（フラグメント抗体の担体への担持）
　フラグメント抗体を不溶性担体に担持する方法としては特に限定はなく、繁用される物理的な結合法、化学的な結合法いずれも利用することができる。
　ここで、免疫凝集法を利用する検出の場合は、不溶性担体に担持させる抗体は、抗原が多価抗原でない場合には抗原に対する認識部位の異なる少なくとも２種以上の抗体が必要であり、本発明においてはフラグメント抗体が１種以上使用されていればよく、すべてがフラグメント抗体であってもよく、後述する実施例では２種のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持させたものが例示されている。
（非特異的反応）
　本発明の非特異的反応抑制方法は、インタクト抗体を担持した不溶性担体からなる免疫学的測定法では発生せず、同抗体をフラグメント抗体化して担持した不溶性担体において顕在化し、インタクト抗体を利用した従来の方法では抑制できない非特異的反応を効果的に抑制できる。インタクト抗体を利用した従来の非特異的反応抑制剤の例としては、ＨＡＭＡ、異好性抗体、リウマチ因子（ＲＦ）に由来する非特異的反応を抑制する剤が挙げられ、例えば、全長の抗ヒトＩｇＧ抗体や抗ヒトＩｇＭ抗体を成分とする抑制剤が挙げられ、より具体的には、異好性阻止試薬ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）やハイブリドーマＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３４が産生するモノクローナル抗体を有効成分とする抑制剤が挙げられる。
（フラグメント抗体の変性体）
　フラグメント抗体の変性方法には特に制限はなく、通常タンパク質の変性に一般的に用いられる加熱、酸、アルカリ、還元剤、カオトロピック塩などが適用できるが、なかでも不可逆的な変性効果を示す処理方法が好適である。また、フラグメント化と変性化の順序は、全長抗体をフラグメント化した後に変性してもよく、あるいは全長抗体を変性した後にフラグメント化してもよい。本明細書中、「フラグメント抗体の変性体」を「変性させたフラグメント抗体」あるいは「変性フラグメント抗体」ということがあるが、特にその意味を断らない限り同義で用いるものとする。
　フラグメント抗体の変性の程度としては、抗原認識部位の反応性が失活、あるいは担体に担持したフラグメント抗体よりも反応性が低下していて、抗原測定のための主反応を実用レベル以下に抑制しなければ良い。変性操作の際には、変性の程度を調整するためにＢＳＡ、セリシン、ブロッキングペプチドフラグメント（東洋紡績株式会社）のようなタンパク質成分やグリセロールを共存させることができる。
（用途）
　本発明の非特異的反応抑制剤は、フラグメント抗体を担持した不溶性担体を用いる免疫学的測定法であればいずれにも適用でき、その用途としては検体の前処理用剤として、あるいは免疫学的測定方法／試薬の構成成分の一部として好適に利用できる。免疫学測定法として具体的には、汎用される粒子増強免疫凝集法、簡易検査法である免疫クロマトグラフ法、専用機器を利用した化学発光法や蛍光酵素法などが挙げられる。
（添加剤）
　本発明の非特異的反応抑制剤ならびにそれを含む免疫学的測定試薬においてはその非特異的反応抑制効果を妨げない範囲でバッファー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、リン脂質、糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤等を含有させてもよい。
（測定対象物質または検出対象抗原）
　本発明の非特異的反応抑制法は、測定対象物質を抗原とするフラグメント抗体を作成できるような物質であればいずれの物質にも適用できる。測定対象物質としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な分子であれば特に制限はない。例としてＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ－３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ―ＲＦ、ＫＬ－６、ＰＩＶＫＡ―ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩや、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。
　本発明において、非特異的反応を抑制できる測定対象抗原の濃度は、各抗原の種類、抗体の種類その他の条件により異なるが、例えば、血清中の正常濃度を含む範囲で特にその効果を発揮することがより望ましく、測定対象がＰＳＡの場合には、後述する実施例のように２～５ｎｇ/ｍＬと臨床的なカットオフ値とされている４ｎｇ/ｍＬ付近の濃度レベルでその抑制効果を示すことがより望ましい。
　本発明の検出には、試料中の検出対象抗原の存在の有無を調べる定性的な検出のほか、試料中の検出対象抗原の存在量を定量的に調べるような定量的な検出（すなわち測定）の意味も含まれる。したがって、本明細書において、「検出」、「定量」、「測定」という用語は、特に断りのない限り、検出対象である抗原の存在の証明および／または定量も含めて広義に解釈するものとする。
　以下、変性させたフラグメント抗体による非特異的反応の抑制方法、変性させたフラグメント抗体を含む非特異的反応の抑制剤を利用した免疫学的測定法、免疫学的測定試薬の例を挙げて本発明の一部を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例1 非特異的反応を呈する検体の分析と本発明による非特異的反応の抑制
（１）フラグメント抗体の調製
　抗ＰＳＡ（前立腺特異抗原）モノクローナル抗体６３２７９（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４５４が産生するモノクローナル抗体）ＩｇＧより、常法にしたがってフラグメント抗体を精製した。
　詳細には６３２７９ ＩｇＧ溶液を０．２Ｍクエン酸液（ｐＨ３．５）と等量混和し、ＩｇＧの１／１３０量（ｗ/ｗ）のペプシンを添加して３７℃、４時間インキュベートした後、２Ｍ　Ｔｒｉｓ溶液を１／１０容量添加して中和した。最終溶液をゲル濾過法に供し精製６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を得た。
（２）抗体結合ラテックス液の調製
　２０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を用いてそれぞれの濃度に希釈した０．４％ラテックス溶液（平均粒子径約３００ｎｍ）と波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．４Ａｂｓ/ｍＬとなるように調製した６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を等量（１容+１容）混和して約１時間撹拌後、１０％ＢＳＡを０．１容添加し約１時間撹拌した。遠心分離にて上清を除去した後、沈殿を５ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にて再懸濁ならびに、波長６００ｎｍにおける吸光度が１．５Ａｂｓ/ｍＬとなるよう調整して６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液を得た。対照として６３２７９Ｆ（ａｂ'）2に代わって６３２７９ ＩｇＧ（断片化を行っていない全長の抗体）を用いた６３２７９ ＩｇＧ結合ラテックス液を調製した。
（３）インタクト抗体からなる非特異的反応抑制物質を含む処理液の調製
　塩化カリウム、ＢＳＡ、ＰＶＰ－Ｋ９０を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に最終濃度１００μｇ/ｍＬとなるように非特異的反応抑制物質であるＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）および抗ＩｇＭモノクローナル抗体７３２２４（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３４が産生するモノクローナル抗体）を添加し処理液を調製した。これら非特異的反応抑制物質はいずれも全長ＩｇＧすなわちインタクト抗体である。
（４）変性フラグメント抗体の調製
　６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を波長２８０ｎｍにおける吸光度で４．０ Ａｂｓ/ｍＬ含むＰＢＳ溶液を６５℃で３０分間加熱し、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2溶液を得た。
（５）分析方法
　試料として、ＰＳＡ陽性反応を示す血清（ＳＬＲ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｌｏｔ．１０１４０９、表示ＰＳＡ濃度２．３６ｎｇ／ｍＬ：以下、表示値ということがある）を用いて、試料に前記（３）で調整した処理液および（２）で調整した抗体結合ラテックス液を添加し、吸光度の変化から非特異的反応の発生を確認した。ここで、ＰＳＡは同一のエピトープ分子内に複数有する多価抗原ではないため、１種類の抗体結合ラテックスのみでは、試料中のＰＳＡと抗体結合ラテックスが反応しても凝集を形成することはできないため、通常吸光度は変化しない。したがって、本分析方法で生じる吸光度変化は、非特異的凝集に起因するものと考えることができる。分析条件を以下に示す。
（分析条件）
分析装置：日立７１８０型自動分析装置
Ｓ/Ｒ比：試料－処理液－抗体結合ラテックス液＝９．６－６０－６０（単位：μＬ）
測定波長：８００／５７０ｎｍ（副波長／主波長）
分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９－３４）
（６）本発明の変性フラグメント抗体による効果の確認
　前記（５）の分析により吸光度上昇を示し非特異的反応が認められた血清検体Ｌｏｔ．１０１４０９について、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を含むＰＢＳ溶液または変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を含まないＰＢＳ溶液で適宜希釈し、それぞれ被検試料、対照試料として測定に供した。
測定結果を表１に示す。
　本結果によれば、吸光度上昇を示す検体Ｌｏｔ．１０１４０９は、６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックスとの間で、非特異的反応の発生が確認された。この非特異的反応は対照とした６３２７９ ＩｇＧ結合ラテックスとの間では認められず、またインタクト抗体からなる非特異的反応抑制物質（ＨＢＲまたは抗ＩｇＭモノクローナル抗体）によっても抑制できなかった（データ示さず）ことから、フラグメント抗体に起因する非特異的反応と推察された。
　また、検体Ｌｏｔ．１０１４０９を波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．４Ａｂｓ/ｍＬの変性６３２７９Ｆ（ａｂ'） 2を含むＰＢＳ溶液で２倍に希釈して分析に供したところ、吸光度変化はほぼゼロとなり、非特異的反応が抑制されることが確認された。なお、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'） 2を含まないＰＢＳ溶液で２倍希釈した場合には、希釈に伴う吸光度自体の低下は認められたが、非特異的反応は抑制されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２　本発明の非特異的反応抑制剤を含む免疫学的測定試薬
（１）非特異的反応抑制効果を示す変性フラグメント抗体の探索
　実施例１にしたがい、各種抗ＰＳＡモノクローナル抗体の変性Ｆ（ａｂ'）2を調製して非特異的反応の抑制効果を示すフラグメント抗体を探索し、変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を得た。６３２８４抗体は、実施例１で使用した６３２７９抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ測定が可能であることから６３２７９抗体とは認識するエピトープが異なる。
（２）第１試液の調製
　実施例１記載の処理液に波長２８０ｎｍにおける吸光度で０．０００３Ａbs/ｍＬの変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2または変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を添加し第一試液とした。変性フラグメント抗体を含まない処理液を対照の第一試液とした。
（３）第２試液の調製
　実施例１で調製した６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液と、同様の方法で調製した６３２９１（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４５５が産生するモノクローナル抗体）Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液を、それぞれ波長６００ｎｍにおける吸光度が１．５Ａｂｓ/ｍＬとなるよう５ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で調整し、等量混和して第２試液とした。認識するエピトープが異なる２種類のフラグメント抗体結合ラテックスを組み合わせることによって試料中のＰＳＡと凝集を形成でき、ＰＳＡ濃度を算出することができる。
（４）測定方法
　２種類の第１試液（変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2または変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を含有）と第２試液を組みあわせて測定用試薬とし、下記条件にて予めＰＳＡキャリブレーター（積水メディカル株式会社）を用いて検量線を作成し、検体Ｌｏｔ．１０１４０９のＰＳＡ濃度を測定した。分析条件を以下に示す。
(分析条件)
分析装置：日立７１８０形自動分析装置
Ｓ/Ｒ比：試料－第１試液－第２試液＝８－７６－７６　（単位：μＬ）
測定波長：８００／５７０ｎｍ（副波長／主波長）
分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９－３４）
キャリブレーター濃度：０、３．９、９．９（ｎｇ/ｍＬ）
演算式：スプライン
検体Ｌｏｔ．１０１４０９のＰＳＡ濃度は表示値を参照した。
（５）結果
　図1に各試薬の検量線を示す。
　変性フラグメント抗体を含まない対照試薬と比較して、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を含む試薬では吸光度が半分程度まで低下した。これは変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2にＰＳＡとの反応性が残存しているために、６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックスと競合し、凝集を阻害するためと推測された。一方で測定系を構成するフラグメント抗体（６３２７９Ｆ（ａｂ'）2および６３２９１Ｆ（ａｂ'）2）と認識エピトープが異なる変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を含む第一試液を使用した場合の感度低下は１０％程度であった。
　表２に各試薬による検体Ｌｏｔ．１０１４０９の測定値を示す。
　表示値に対し対照試薬では３０％以上高値となるのに対し、変性フラグメント抗体を含む本発明の試薬ではいずれも非特異的反応の影響が抑制されることが確認できた。ＰＳＡの正常濃度は４ｎｇ/ｍＬ以下であり、この濃度付近の測定値の正確性を担保することは臨床上重要である。
　特に本発明の非特異的反応抑制剤として、変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2のように免疫学的測定試薬の主成分のフラグメント抗体と認識エピトープの異なるフラグメント抗体が利用できる場合、試薬感度への影響が小さく好適である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３　非特異的反応検体の分析と本発明による非特異的反応の抑制２
（１）フラグメント抗体結合ラテックス液の調製
　抗ＭＭＰ－３モノクローナル抗体８２２０８（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５１７が産生するモノクローナル抗体）ＩｇＧより、実施例１の方法に従ってフラグメント抗体を精製し、波長６００ｎｍにおける吸光度が３．０Ａｂｓ/ｍＬとなるよう５ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で調整し、８２２０８Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液を得た。
（２）インタクト抗体からなる非特異的反応抑制物質を含む処理液の調製
　塩化ナトリウム、ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液に最終濃度１００μｇ/ｍＬとなるように非特異的反応抑制物質であるＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）および抗ＩｇＭモノクローナル抗体７３２２４を添加し処理液を調製した。
（３）変性フラグメント抗体の調製
　実施例１記載の方法に従い変性８２２０８Ｆ（ａｂ'）2溶液を得た。
（４）試料と変性フラグメント抗体処理
　ＲＦ陽性血清（ＴＲＩＮＡ社）の中から、８２２０８Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックスと非特異的反応を生じる血清を選択し、波長２８０ｎｍにおける吸光度で６．０Ａｂｓ/ｍＬの変性８２２０８Ｆ（ａｂ'） 2を含むＰＢＳ溶液またはＰＢＳで１０倍に希釈し、それぞれ被検試料、対照試料として測定に供した。
（５）分析方法
　（４）で調整した被検試料または対照試料に、（２）で調整した処理液、および（１）で調整したフラグメント抗体結合ラテックス液を添加し、吸光度の変化から非特異的反応の発生と本発明の抑制効果を確認した。本分析で生じる吸光度変化は、実施例１同様に非特異的凝集に起因するものと考えられる。分析条件を以下に示す。
(分析条件)
分析装置：日立７１８０形自動分析装置
Ｓ/Ｒ比：試料－処理液－抗体結合ラテックス液＝２．０－１００－３３（単位：μＬ）
測定波長：８００／５７０ｎｍ（副波長／主波長）
分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９－３４）
（６）結果
　結果を表３に示す。
　対照試料で非特異的反応による感度上昇が認められるのに対し、被検試料では吸光度変化はほぼゼロとなり、非特異的反応が抑制されていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１～実施例３の結果より、本発明の非特異的反応の抑制法は、検出対象抗原（アナライト）の種類やフラグメント抗体の種類に関わらず広範に適用できることが確認された。
　本発明の非特異的反応抑制方法により、インタクト抗体を利用する従来の方法では抑制できなかった、フラグメント抗体に起因する非特異的反応を抑制することが可能になった。
[寄託生物材料への言及]
（１）６３２７９抗体を産生するハイブリドーマ６３２７９
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
　独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５－８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
　平成２２年２月１９日（２０１０年２月１９日）（原寄託日）
　平成２４年１月３１日（２０１２年１月３１日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
　ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４５４
（２）６３２９１抗体を産生するハイブリドーマ６３２９１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
　独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５－８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
　平成２２年２月１９日（２０１０年２月１９日）（原寄託日）
　平成２４年１月３１日（２０１２年１月３１日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
　ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４５５
（３）８２２０８抗体を産生するハイブリドーマ８２２０８
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
　独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５－８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
　平成２４年１月２７日（２０１２年１月２７日）（原寄託日）
　平成２４年１１月２２日（２０１２年１１月２２日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
　ＦＥＲＭ ＢＰ－１１５１７
（４）抗ＩｇＭ抗体を産生するハイブリドーマ７３２２４
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
　独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５－８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
　平成２０年９月１９日（２００８年９月１９日）（原寄託日）
　平成２１年６月９日（２００９年６月９日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
　ＦＥＲＭ ＢＰ－１１１３４

Claims (16)

  1. 試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片（以下、「検出対象抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片」を単に「フラグメント抗体」という）との抗原抗体反応により検出する方法であって、
    ａ）試料と、前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
    ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と、不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体とを接触させる工程と、
    を含む前記検出方法。
  2. フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる請求項１記載の検出方法。
  3. ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、請求項１または２に記載の検出方法。
  4. 試料中の検出対象抗原を、前記フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制方法であって、
    ａ）試料と前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
    ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体を接触させる工程と、
    を含む非特異的反応抑制方法。
  5. フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる請求項４記載の非特異的反応抑制方法。
  6. ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、請求項４または５に記載の非特異的反応抑制方法。
  7. 非特異的反応が、測定に使用するフラグメント抗体に起因する反応である、請求項４～６のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
  8. 非特異的反応が、全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤では抑制できない反応である、請求項４～７のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
  9. 全長の抗体が、全長の抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体または抗ヒトＩｇＡ抗体である請求項８に記載の非特異的反応抑制方法。
  10. 全長の抗体が、ハイブリドーマＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１３４が産生するモノクローナル抗体である請求項９に記載の非特異的反応抑制方法。
  11. 全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤が、ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）である請求項９に記載の非特異的反応抑制方法。
  12. 試料中の検出対象抗原を抗原抗体反応により検出するための試薬であって、
    １）検出対象抗原に対するフラグメント抗体を担持した不溶性担体
    ２）検出対象抗原に対するフラグメント抗体の変性体
    を含む前記試薬。
  13. フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる、請求項１２に記載の試薬。
  14. １）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、請求項１２または１３に記載の試薬。
  15. さらに、３）全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤を含む請求項１２または１３に記載の試薬。
  16. 試料中の検出対象抗原を、フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制剤であって、
    前記フラグメント抗体の変性体を有効成分として含む前記非特異的反応抑制剤。
PCT/JP2013/076585 2012-09-28 2013-09-30 免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬 WO2014051144A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/431,888 US10067127B2 (en) 2012-09-28 2013-09-30 Immunological detection method and immunological detection reagent
CN201380061521.1A CN105102981B (zh) 2012-09-28 2013-09-30 免疫学检测方法和免疫学检测试剂
EP13840321.7A EP2902782B1 (en) 2012-09-28 2013-09-30 Immunological detection process and reagent for immunological detection process
KR1020157010899A KR102176382B1 (ko) 2012-09-28 2013-09-30 면역학적 검출 방법 및 면역학적 검출 시약
JP2014538671A JP6431766B2 (ja) 2012-09-28 2013-09-30 免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012218089 2012-09-28
JP2012-218089 2012-09-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014051144A1 true WO2014051144A1 (ja) 2014-04-03

Family

ID=50388529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/076585 WO2014051144A1 (ja) 2012-09-28 2013-09-30 免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10067127B2 (ja)
EP (1) EP2902782B1 (ja)
JP (1) JP6431766B2 (ja)
KR (1) KR102176382B1 (ja)
CN (1) CN105102981B (ja)
WO (1) WO2014051144A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023127881A1 (ja) * 2021-12-28 2023-07-06 積水メディカル株式会社 検出方法及び検出試薬

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105911285A (zh) * 2016-05-27 2016-08-31 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种测定类风湿因子的试剂盒
CN107247138B (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 王贤俊 一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法
CN109444426A (zh) * 2018-12-12 2019-03-08 郑州安图生物工程股份有限公司 消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法
CN113711038A (zh) * 2019-01-31 2021-11-26 积水医疗株式会社 用于生物样品中游离aim的免疫分析方法及用于检测对象中nash的方法
US20220107318A1 (en) * 2019-01-31 2022-04-07 Sekisui Medical Co., Ltd. Immunoassay method for free aim in biological sample, and assay kit
KR20220166575A (ko) 2021-06-10 2022-12-19 주식회사 제우스 진단키트 및 진단 방법

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01287801A (ja) 1988-05-13 1989-11-20 Seiko Epson Corp 磁気記憶装置
JPH02152999A (ja) * 1988-07-25 1990-06-12 Nippon Kayaku Co Ltd 免疫学的測定法における非特異的反応の除去・抑制に用いるモノクローナル抗体由来物質、その製造方法及びその使用法
JPH0712818A (ja) 1993-06-25 1995-01-17 Hitachi Chem Co Ltd 免疫学的検出方法
JPH09288108A (ja) * 1996-04-19 1997-11-04 Nippon Kayaku Co Ltd 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット
JPH11287801A (ja) * 1998-04-01 1999-10-19 Denka Seiken Co Ltd 免疫学的測定法および免疫学的測定用キット
JPH11337551A (ja) * 1998-05-22 1999-12-10 Sekisui Chem Co Ltd 非特異反応抑制剤、免疫測定試薬及び免疫測定方法
JP2007127438A (ja) * 2005-11-01 2007-05-24 Sekisui Chem Co Ltd 非特異反応抑制剤、免疫学的測定試薬免疫測定方法及び非特異反応抑制剤の製造方法
WO2010026758A1 (ja) 2008-09-05 2010-03-11 積水メディカル株式会社 モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法
JP2010254663A (ja) * 2009-03-31 2010-11-11 Toyobo Co Ltd 抗ｋｏｄｄｎａポリメラーゼ抗体及びそれを用いた非特異反応の抑制方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02259569A (ja) * 1989-03-31 1990-10-22 Nitto Denko Corp リウマチ因子測定方法
CA2093494A1 (en) * 1992-04-17 1993-10-18 Keisuke Iwata Method for the elimination of non-specific reactions in immuno-assays
EP1767942A4 (en) * 2004-06-14 2008-07-16 Kyowa Medex Co Ltd IMMUNOENZYMATIC ASSAY METHOD HAVING INHIBITED NON-SPECIFIC REACTION AND REAGENT THEREFOR
JP2007163319A (ja) * 2005-12-14 2007-06-28 Sanyo Chem Ind Ltd 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット
CN101706503A (zh) * 2009-07-08 2010-05-12 无锡博慧斯生物医药科技有限公司 人IgG和类风湿因子吸附装置及相关的人血清中IgM抗体检测方法
US9678068B2 (en) * 2010-03-01 2017-06-13 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods
KR101835918B1 (ko) * 2011-03-28 2018-03-07 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 Psa의 측정 방법 및 그의 시약

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01287801A (ja) 1988-05-13 1989-11-20 Seiko Epson Corp 磁気記憶装置
JPH02152999A (ja) * 1988-07-25 1990-06-12 Nippon Kayaku Co Ltd 免疫学的測定法における非特異的反応の除去・抑制に用いるモノクローナル抗体由来物質、その製造方法及びその使用法
JPH0712818A (ja) 1993-06-25 1995-01-17 Hitachi Chem Co Ltd 免疫学的検出方法
JPH09288108A (ja) * 1996-04-19 1997-11-04 Nippon Kayaku Co Ltd 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット
JPH11287801A (ja) * 1998-04-01 1999-10-19 Denka Seiken Co Ltd 免疫学的測定法および免疫学的測定用キット
JPH11337551A (ja) * 1998-05-22 1999-12-10 Sekisui Chem Co Ltd 非特異反応抑制剤、免疫測定試薬及び免疫測定方法
JP2007127438A (ja) * 2005-11-01 2007-05-24 Sekisui Chem Co Ltd 非特異反応抑制剤、免疫学的測定試薬免疫測定方法及び非特異反応抑制剤の製造方法
WO2010026758A1 (ja) 2008-09-05 2010-03-11 積水メディカル株式会社 モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法
JP2010254663A (ja) * 2009-03-31 2010-11-11 Toyobo Co Ltd 抗ｋｏｄｄｎａポリメラーゼ抗体及びそれを用いた非特異反応の抑制方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Advertising Material for Heterophilic Blocking Reagent HBR", 1993, NAGASE & CO., LTD.
CLIN.CHEM., vol. 45/7, 1999, pages 942 - 956
CLINICAL CHEMISTRY, vol. 23, 1994, pages 175A - 1,175A-10

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023127881A1 (ja) * 2021-12-28 2023-07-06 積水メディカル株式会社 検出方法及び検出試薬

Also Published As

Publication number Publication date
CN105102981B (zh) 2017-10-20
JPWO2014051144A1 (ja) 2016-08-25
EP2902782A4 (en) 2016-05-04
KR102176382B1 (ko) 2020-11-09
EP2902782B1 (en) 2019-02-27
CN105102981A (zh) 2015-11-25
US20150253322A1 (en) 2015-09-10
US10067127B2 (en) 2018-09-04
EP2902782A1 (en) 2015-08-05
JP6431766B2 (ja) 2018-11-28
KR20150063488A (ko) 2015-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6431766B2 (ja) 免疫学的検出方法および免疫学的検出試薬
AU2016203292B2 (en) Monoclonal antibody, and immunoassay using same
KR102302678B1 (ko) 면역 응집 측정법
EP3052936A1 (en) Immunoassays using over-labeled fluorescent probes
EP1653233B1 (en) Method for determining antibodies of a particular class using an immune complex-specific antibody
JP3899029B2 (ja) 免疫学的分析方法
JP2013125005A (ja) Ｃｋ−ｍｂ測定用ラテックス凝集免疫試薬及び測定方法
WO2022163605A1 (ja) 免疫学的測定方法
JP2004191332A (ja) 免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法
JPH0727764A (ja) Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬
JP5714791B2 (ja) 非特異反応抑制剤
EP3919509A1 (en) Method for immunological analysis of free aim in biological sample
WO2022050264A1 (ja) 免疫学的測定法
JPH10319017A (ja) 蛍光エネルギー転移を利用した物質の測定方法およびそのための試薬
WO2024048583A1 (ja) 免疫学的測定方法、非特異反応抑制方法、免疫学的測定試薬、免疫学的測定試薬キット、組成物、非特異反応抑制剤、及び使用
JP4433642B2 (ja) 非特異反応を抑制したイムノアッセイ法
WO2024004805A1 (ja) 免疫学的測定方法
JP2002350442A (ja) 免疫測定試薬及び免疫測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201380061521.1

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13840321

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014538671

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14431888

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013840321

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20157010899

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A