KR20220166575A - 진단키트 및 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 양자점-압타머 복합체에 관한 것으로, 표면에 양자점이 결합된 비드; 상기 양자점과 결합하는 단백질; 및 상기 단백질과 결합하는 압타머;를 포함하는, 양자점-압타머 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 양자점-압타머 복합체를 사용하는 분석물 검출방법 및 이를 수행하기 위한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 진단시스템의 정확도를 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은, 양자점-압타머 복합체에 관한 것으로, 특히, 진단키트 등 분석물 검출에 사용할 수 있는 양자점-압타머 복합체와 이를 이용한 분석물 검출방법 및 진단키트에 관한 것이다.
면역학적 분석법을 이용하는 진단시스템에서는 항원-항체 등 특이적 반응을 이용하는데 타겟 물질과 특이적 결합을 하는 결합체가 타겟 외의 물질과 비특이반응이 일어나 검출 결과에 오류를 발생시키며 진단시스템의 정확도를 떨어뜨린다는 문제가 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로, 시료를 계면활성제, 젤라틴 등 적합한 시약 처리를 하는 전처리 단계를 거치거나, 비특이반응을 일으키는 물질에 따라서는 비특이반응 저해제의 첨가, 특이적 반응을 저해하지 않는 모노클론 항체의 첨가 등의 방법이 알려져 있다.
이와 관련하여 한국등록특허 제 10-2176382 호는 면역학적 검출방법에 있어서 비특이반응을 제거하기 위하여 항원 인식 부위를 포함하는 항체 단편을 변형시켜 위 항체 단편과 인식 에피토프가 상이한 변형체를 먼저 시료와 접촉시켜 전처리하는 방법을 제시하고 있으며, 일본공개특허 제 2020-085755 호는 면역크로마토그래피 진단시스템에 있어서 시료 중에 비특이 반응 억제제가 존재하는 경우에도 컨트롤 라인의 시그널 강도에 영향을 주지 않기 위하여 접합패드에 블로킹제를 포함시키고 컨트롤 라인에 블로킹제에 대해 특이적으로 결합가능한 물질을 고정시키는 방법에 대하여 제시하고 있다.
그러나 저해물질 사용 시 압타머 등 타겟물질과 특이적 결합을 하는 물질의 타겟팅 성능이 크게 감소하여 문제가 된다. 따라서 양자점 표면에 압타머 컨쥬게이션 시에 압타머의 성능을 저해시키지 않고 비특이반응을 제거할 수 있는 방법이 요구된다.
본 발명의 양자점-압타머 복합체는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 표면에 양자점이 결합된 비드; 상기 양자점과 결합하는 단백질; 및 상기 단백질과 결합하는 압타머;를 포함하는 양자점-압타머 복합체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 A) 표면에 양자점이 결합된 비드와 단백질을 혼합하여 단백질 코팅된 양자점 비드를 형성하는 단계; 및 B) 상기 단백질 코팅된 양자점 비드와 압타머를 혼합하여 단백질에 압타머를 결합시키는 단계;를 포함하는 양자점-압타머 복합체의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 분석물 검출 시 신호발생물질로 사용하는 분석물 검출방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기한 명확한 목적 이외에 이러한 목적 및 본 명세서의 전반적인 기술로부터 이 분야의 통상인에 의해 용이하게 도출될 수 있는 다른 목적을 달성함을 그 목적으로 할 수 있다.
본 발명의 양자점-압타머 복합체는 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, 표면에 양자점이 결합된 비드; 상기 양자점과 결합하는 단백질; 및 상기 단백질과 결합하는 압타머;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 비드는 실리카 비드일 수 있다.
또한, 상기 비드는 상기 양자점과 정전기적 결합을 형성할 수 있다.
그리고, 상기 비드와 양자점 사이의 정전기적 결합은 상기 비드 표면의 아민 양전하와 상기 양자점의 카르복실 음전하 사이의 정전기적 결합일 수 있다.
또한, 상기 표면에 양자점을 갖는 비드는 평균입경이 1 내지 2000 nm, 10 내지 1800 nm, 또는 50 내지 1000 nm일 수 있다.
또한, 상기 양자점은 비드를 감싸는 양자점층을 형성할 수 있다.
또한, 상기 양자점은 단층을 형성할 수 있다.
그리고, 상기 양자점은 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴텔레나이드(CdTe), 징크설파이드(ZnS), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크텔레나이드(ZnTe), 징크옥사이드(ZnO), 징크옥사이드징크셀레나이드(ZnOZnSe), 징크옥사이드징크설파이드(ZnOZnS), 카드뮴옥사이드(CdO), 카드뮴셀레늄설파이드(CdSeS), 카드뮴셀레늄텔레나이드(CdSeTe), 카드뮴설파이드텔레나이드(CdSTe), 카드뮴징크설파이드(CdZnS), 카드뮴징크셀레나이드(CdZnSe), 카드뮴징크텔레나이드(CdZnTe), 징크셀레늄설파이드(ZnSeS), 징크셀레늄텔레나이드(ZnSeTe), 징크설파이드텔레나이드(ZnSTe), 카드뮴징크옥사이드(CdZnO), 징크셀레늄옥사이드(ZnSeO), 카드뮴셀레늄(CdSe), 카드뮴징크셀레늄설파이드(CdZnSeS), 카드뮴징크셀레늄텔레나이드(CdZnSeTe), 카드뮴셀레나이드징크설퍼(CdSeZnS), 카드뮴징크설파이드텔레나이드(CdZnSTe), 갈륨포스포러스(GaP), 갈륨아세나이드(GaAs), 갈륨니트라이드(GaN), 인듐포스포러스니트라이드(InPN), 인듐아세나이드니트라이드(InAsN), 인듐갈륨포스포러스(InGaP), 인듐갈륨아세나이드(InGaAs), 인듐갈륨니트라이드(InGaN), 인듐아세나이드니트라이드(InAsN), 인듐갈륨포스포러스(InGaP), 인듐알루미늄포스포러스안티모니(InAlPSb), 인듐갈륨포스포러스징크설파이드(InGaPZnS), 인듐갈륨포스포러스징크셀레나이드(InGaPZnSe), 인듐포스포러스징크셀레나이드(InPZnSe), 인듐포스포러스징크설파이드(InPZnS), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 단백질은 상기 양자점을 감싸는 단백질층을 형성할 수 있다.
또한, 상기 단백질층은 두께가 0.1 내지 100 nm, 0.5 내지 50 nm, 또는 1 내지 20 nm일 수 있다.
또한, 상기 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다.
또한, 상기 단백질과 양자점은 정전기적 결합을 형성할 수 있다.
그리고, 상기 단백질과 양자점 사이의 정전기적 결합은 상기 단백질의 아민 양전하와 상기 양자점의 카르복실 음전하 사이의 정전기적 결합일 수 있다.
또한, 상기 압타머는 티올기를 가질 수 있다.
또한, 상기 압타머와 상기 단백질은 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 압타머는 검출 대상 분석물과 특이적으로 결합할 수 있다.
그리고, 상기 압타머는 상기 압타머는 20 내지 100 개, 30 내지 80 개, 또는 35 내지 60 개의 염기를 갖는 염기서열일 수 있다.
그리고, 상기 압타머는 상기 단백질을 통해 상기 양자점과 간접적으로 결합할 수 있다.
한편, 본 발명의 양자점-압타머 복합체의 제조방법은,
A) 표면에 양자점이 결합된 비드와 단백질을 혼합하여 단백질 코팅된 양자점 비드를 형성하는 단계; 및
B) 상기 단백질 코팅된 양자점 비드와 압타머를 혼합하여 단백질에 압타머를 결합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 분석물 검출방법은 상기 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 분석물 검출 시 분석물 결합 및 신호발생물질로 사용하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 분석물 검출방법은 양자점-압타머 복합체를 상기 압타머가 특이적으로 결합하는 분석물을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; 분석물이 결합된 양자점-압타머 복합체를 상기 분석물과 특이적으로 결합하고 포획자에 노출시키는 단계; 및 상기 포획자에 의해 포획된 분석물이 결합된 양자점-압타머 복합체에서 발생하는 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
그리고, 상기 압타머는 상기 분석물의 제 1 결합 부위에 결합하고, 상기 포획자는 상기 분석물의 제 1 결합 부위와 다른 분석물의 제 2 결합 부위와 결합할 수 있다.
그리고, 상기 포획자는 지지체에 고정된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 진단키트는, 상기 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 진단키트는 측면유동검사스트립일 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같은 본 발명의 과제해결 수단에 의하면 다음과 같은 사항을 포함하는 다양한 효과를 기대할 수 있다. 다만, 본 발명이 하기와 같은 효과를 모두 발휘해야 성립되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체는 비드 하나당 다량의 양자점이 부착되어 적은 양의 비드로 높은 형광신호를 발생시킬 수 있다. 또한, 코팅단백질 위에 압타머를 연결함으로써 압타머의 타겟팅 성능 저하 문제를 개선하고, 비특이 반응을 방지함과 동시에 양자점 비드의 안정성을 확보할 수 있다. 따라서 상기 본 발명의 양자점-압타머 복합체는 다양한 센서 플랫폼에 적용이 가능하며 센서의 정확도와 민감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체는 약 200 nm크기의 양자점 비드를 활용하므로 제조공정을 간결화할 수 있으며, 일반적인 컨쥬게이션 방법 (EDC/NHS)에 비해 간단하게 컨쥬게이션이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 양자점-압타머 복합체의 구조이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 구조 및 분석물의 검출 원리를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 비특이 반응 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 비특이 반응 실험 결과로서 검출라인의 형광신호를 측정하여 비교한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 비특이 반응 실험 결과로서 검출라인의 형광신호를 측정하여 비교한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 구조 및 분석물의 검출 원리를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 비특이 반응 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 비특이 반응 실험 결과로서 검출라인의 형광신호를 측정하여 비교한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 진단키트의 비특이 반응 실험 결과로서 검출라인의 형광신호를 측정하여 비교한 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다.
다만, 아래는 특정 실시예들을 예시하여 상세히 설명하는 것일 뿐, 본 발명은 다양하게 변경될 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있기 때문에, 예시된 특정 실시예들에 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 설명되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
그리고, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 출원에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서, '포함하다', '함유하다' 또는 '가지다' 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 구성요소(또는 구성성분) 등이 존재함을 지칭하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 구성요소 등이 존재하지 않거나 부가될 수 없음을 의미하는 것은 아니다.
일반적으로 저해물질 사용시 압타머의 타겟팅 성능이 저감되는데, 본 발명은 저해물질 없이 타겟 이외의 물질과의 비특이반응을 방지함으로써 진단시스템의 정확도를 향상시키기 위한 것이다.
이를 위해 본 발명의 양자점-압타머 복합체는 표면에 양자점이 결합된 비드; 상기 양자점과 결합하는 단백질; 및 상기 단백질과 결합하는 압타머(Aptamer);를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 비드는 금속 비드, 비금속 비드, 유기물 비드, 무기물 비드, 복합 비드, 마그네틱 비드, 또는 실리카 비드일 수 있다. 또한 상기 비드는 코어와 1 이상의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조의 비드일 수 있다.
또한, 상기 비드는 상기 양자점과 공유 결합, 비공유 결합, 이온 결합, 또는 정전기적 결합을 형성할 수 있다. 특히 상기 비드 표면의 양전하 또는 음전하가 상기 양자점이 갖는 반대 전하와 정전기적 결합을 형성할 수 있다. 상기 비드와 양자점은 양전하 또는 음전하를 갖도록 개질될 수 있다.
그리고, 상기 비드와 양자점 사이의 정전기적 결합은 상기 비드 표면의 아민 양전하와 상기 양자점의 카르복실 음전하 사이의 정전기적 결합일 수 있다.
또한, 상기 표면에 양자점을 갖는 비드는 평균입경이 1 내지 2000 nm, 10 내지 1800 nm, 또는 50 내지 1000 nm일 수 있다. 또한 상기 표면에 양자점을 갖는 비드는 평균입경이 1, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100, 또는 150 nm 이상이거나 1000, 800, 600, 500, 400, 300, 또는 250 nm 이하일 수 있다. 표면에 양자점을 갖는 비드의 평균입경이 상기 범위 미만인 경우 압타머가 양자점 비드의 표면에 충분히 부착되지 않아 반응성이 저하될 가능성이 있고, 반면에 상기 범위를 초과할 경우 측면유동검사스트립과 같은 진단키트에서 비드가 원활히 전개되지 않아 반응성이 저하될 수 있다.
또한, 상기 양자점은 비드를 감싸는 양자점층을 형성할 수 있고 상기 양자점층을 양자점 쉘이라 할 수 있다. 본 발명에 따르면 하나의 코어 비드에 다량의 양자점이 부착되어 적은 양의 비드로 높은 강도의 신호를 발생시킬 수 있다. 양자점은 비드 표면의 일부 또는 전부를 덮을 수 있다.
또한, 상기 양자점은 단층을 형성할 수 있다. 즉, 상기 비드의 반지름 방향으로 양자점 위에 양자점이 위치하지 않아, 상기 양자점층의 두께가 상기 양자점의 최대입경이 되도록 양자점이 비드 표면에 배열될 수 있다.
그리고, 상기 양자점은 12 내지 16족계 화합물, 또는 13 내지 15족계 화합물일 수 있고, 양자점을 형성할 수 있는 반도체성 화합물을 포함할 수 있다. 상기 양자점은 코어-쉘 구조를 가질 수 있다. 상기 양자점은 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴텔레나이드(CdTe), 징크설파이드(ZnS), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크텔레나이드(ZnTe), 징크옥사이드(ZnO), 징크옥사이드징크셀레나이드(ZnOZnSe), 징크옥사이드징크설파이드(ZnOZnS), 카드뮴옥사이드(CdO), 카드뮴셀레늄설파이드(CdSeS), 카드뮴셀레늄텔레나이드(CdSeTe), 카드뮴설파이드텔레나이드(CdSTe), 카드뮴징크설파이드(CdZnS), 카드뮴징크셀레나이드(CdZnSe), 카드뮴징크텔레나이드(CdZnTe), 징크셀레늄설파이드(ZnSeS), 징크셀레늄텔레나이드(ZnSeTe), 징크설파이드텔레나이드(ZnSTe), 카드뮴징크옥사이드(CdZnO), 징크셀레늄옥사이드(ZnSeO), 카드뮴셀레늄(CdSe), 카드뮴징크셀레늄설파이드(CdZnSeS), 카드뮴징크셀레늄텔레나이드(CdZnSeTe), 카드뮴셀레나이드징크설퍼(CdSeZnS), 카드뮴징크설파이드텔레나이드(CdZnSTe), 갈륨포스포러스(GaP), 갈륨아세나이드(GaAs), 갈륨니트라이드(GaN), 인듐포스포러스니트라이드(InPN), 인듐아세나이드니트라이드(InAsN), 인듐갈륨포스포러스(InGaP), 인듐갈륨아세나이드(InGaAs), 인듐갈륨니트라이드(InGaN), 인듐아세나이드니트라이드(InAsN), 인듐갈륨포스포러스(InGaP), 인듐알루미늄포스포러스안티모니(InAlPSb), 인듐갈륨포스포러스징크설파이드(InGaPZnS), 인듐갈륨포스포러스징크셀레나이드(InGaPZnSe), 인듐포스포러스징크셀레나이드(InPZnSe), 인듐포스포러스징크설파이드(InPZnS), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 단백질은 상기 양자점 또는 양자점 쉘을 감싸는 단백질층을 형성할 수 있는 것으로서 코팅단백질일 수 있다. 양자점 쉘을 감싸는 단백질층을 단백질 쉘이라 할 수 있다. 본 발명의 양자점-압타머 복합체는 코팅단백질을 일 구성요소로 포함함으로써 압타머를 양자점에 곧바로 붙인 것에 비해 압타머의 타겟팅 성능을 더욱 향상시키고 비특이 반응을 방지할 수 있으며 양자점 비드의 안정성을 확보할 수 있다.
또한, 상기 단백질층은 두께가 0.1 내지 100 nm, 0.5 내지 50 nm, 또는 1 내지 20 nm일 수 있다. 단백질층의 두께가 상기 범위 미만인 경우 타겟과의 반응 시 압타머가 3차원 구조를 형성함에 있어 입체장해로 인해 타겟 반응성이 저하될 수 있고, 반면에 상기 범위를 초과할 경우 양자점의 형광신호 세기가 감소할 가능성이 있다.
또한, 상기 단백질은 코팅단백질로서 차단제(blocking) 역할을 하는 비반응성 단백질일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다. 또한, 상기 단백질을 대체하여 고분자를 사용할 수 있다. 상기 단백질을 대체하여 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용할 수 있다.
또한, 상기 단백질은 상기 양자점과 공유 결합, 비공유 결합, 이온 결합, 또는 정전기적 결합을 형성할 수 있다. 특히 상기 단백질의 양전하 또는 음전하가 상기 양자점이 갖는 반대 전하와 정전기적 결합을 형성할 수 있다. 상기 단백질과 양자점은 양전하 또는 음전하를 갖도록 개질될 수 있다.
또한, 상기 단백질은 티올기(-SH)를 가질 수 있다.
그리고, 상기 단백질과 양자점 사이의 정전기적 결합은 상기 단백질의 아민 양전하와 상기 양자점의 카르복실 음전하 사이의 정전기적 결합일 수 있다.
본 발명의 양자점-압타머 복합체의 일 구성요소인 압타머(aptamer)는 표적물질에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산(DNA, RNA, 또는 변형핵산)이다. 압타머는 항체에 비해 안정성이 높아 진단 시스템에서의 활용성이 높고 크기가 작아 변형이 용이하여 바이러스 등의 변이체에 대하여 대응이 용이하다.
또한, 상기 압타머는 티올기(-SH)를 가질 수 있다.
또한, 상기 압타머와 상기 단백질은 공유 결합, 비공유 결합, 이온 결합, 또는 정전기적 결합을 형성할 수 있다. 특히 상기 압타머와 상기 단백질은 디설파이드(disulfide, -S-S-) 결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 압타머는 검출 대상 분석물과 특이적으로 결합할 수 있고, 분석물의 제 1 결합 부위와 결합하여 복합체를 형성할 수 있다.
그리고, 상기 압타머는 20 내지 100 개, 30 내지 80 개, 또는 35 내지 60 개의 염기를 갖는 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 압타머는 첨부한 서열목록 중 서열번호 1 내지 15 중 어느 하나로 표시될 수 있다. 또한, 상기 압타머는 DNA 압타머일 수 있다.
그리고, 상기 압타머는 상기 단백질을 통해 상기 양자점과 간접적으로 결합할 수 있다.
한편, 본 발명의 양자점-압타머 복합체의 제조방법은, A) 표면에 양자점이 결합된 비드와 단백질을 혼합하여 단백질 코팅된 양자점 비드를 형성하는 단계; 및 B) 상기 단백질 코팅된 양자점 비드와 압타머를 혼합하여 단백질에 압타머를 결합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체의 제조방법은 염을 이용한하여 pH 조절 단계를 생략할 수 있어 공정 단계의 지나친 증가를 막을를 줄일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 제조방법이 비록 단백질의 도입으로 공정 단계가 증가하기는 하나, 종래 양자점과 압타머의 결합을 위해 염을 이용하여 pH를 조절하는 단계를 생략할 수 있어, 공정 단계가 크게 증가하는 것은 아니다.
상기 표면에 양자점이 결합된 비드는 비드에 양자점을 부착하여 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 비드는 상기 양자점과 공유 결합, 비공유 결합, 이온 결합, 또는 정전기적 결합을 형성할 수 있다.
그리고, 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체의 제조방법은 상기 단계 A) 또는 단계 B) 이후 세정하는 단계를 각각 더 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예인 양자점-압타머 복합체(10)의 구조 및 제조 단계로서 비드 또는 양자점-압타머 복합체의 단면을 나타낸 것이다. 먼저 표면에 양자점(12)이 결합된 비드(11)를 준비하고, 여기에 단백질(13)을 부착, 코팅하여 양자점 쉘을 감싸는 코팅 단백질층인 단백질 쉘을 형성할 수 있다. 여기에 압타머(14)를 도입하고 단백질(13)과 결합을 유도하여 본 발명의 양자점-압타머 복합체(10)를 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 분석물 검출방법은 상기 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 분석물 검출 시 분석물 결합 및 신호발생물질로 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 양자점-압타머 복합체는 검출 대상인 분석물과 특이적 결합을 하는 압타머를 표면에 가지는 복합체로서 분석물 검출에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 양자점-압타머 복합체는 다량의 양자점을 포함하고 있어 매우 높은 강도의 신호를 발생시킬 수 있으므로 검출 감도가 우수하다.
본 발명의 분석물 검출방법은 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 공지의 분석물 검출방법에 접목시킨 것일 수 있다. 분석물은 항원, 항체, 병원균, 바이러스, 단백질, 올리고뉴클레오티드 등일 수 있고 제한되지 않는다. 따라서 본 발명은 신호발생물질로 표지된 특이적 결합체를 사용하는 공지의 검출방법에 대하여 광범위하게 응용이 가능하다. 특히 측방유동분석법 등 신속진단시스템 또는 ELISA 대체 면역진단시스템에 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 분석물 검출방법은 비특이반응이 적고 신호가 강하여 복수의 테스트 라인을 구비하지 않아도 재현성을 갖추면 정량분석이 가능한 장점이 있다.
그리고, 상기 분석물 검출방법은 양자점-압타머 복합체를 상기 압타머가 특이적으로 결합하는 분석물을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; 분석물이 결합된 양자점-압타머 복합체를 상기 분석물과 특이적으로 결합하는 포획자에 노출시키는 단계; 및 상기 포획자에 의해 포획된 분석물이 결합된 양자점-압타머 복합체에서 발생하는 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
그리고, 상기 압타머는 상기 분석물의 제 1 결합 부위에 결합하고, 상기 포획자는 상기 분석물의 제 1 결합 부위와 다른 분석물의 제 2 결합 부위와 결합할 수 있다. 상기 포획자는 분석물의 제 2 결합 부위와 특이적 결합하는 항체, 압타머, 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
그리고, 상기 포획자는 지지체에 고정된 것일 수 있다.
그리고, 상기 지지체는 진단 시스템에서 사용되는 공지의 소재일 수 있고, 예컨대 니트로셀룰로오스 멤브레인일 수 있다.
그리고, 상기 신호는 시각적 신호일 수 있고, 예컨대 형광, 인광, 또는 발광 신호일 수 있다.
본 발명의 분석물 검출방법은 측방유동분석법(Lateral Flow Assay; LFA)에 적용 시 우수한 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 도입한 측방유동분석스트립의 구조는 도 2와 같이 나타낼 수 있다. 일반적으로 측방유동분석스트립(200)은 시료주입패드(201), 신호발생물질이 포함된 접합패드(202), 검출라인(203), 대조라인(204), 및 선택적으로 흡수패드(205)가 존재할 수 있다. 본 발명에 따르면 접합패드(202)에는 상기 양자점-압타머 복합체(10)가 있을 수 있다. 항원, 항체, 바이러스 등 검출 대상이 되는 분석물을 포함할 가능성이 있는 시료(100)를 시료주입패드(201)에 투입하면 모세관 현상에 따라 검출라인(203) 방향으로 유동이 발생하며, 접합패드(202)에서 시료와 양자점-압타머 복합체(10)가 접촉하여 시료 내 분석물(20)이 존재할 경우 이것이 양자점-압타머 복합체(10)의 압타머와 결합하여 하나의 복합체를 형성하고 검출라인(203)으로 이동한다. 검출라인(203)에는 제 1 결합부재(40)와 제 2 결합부재(50)를 통해 지지체(60)에 고정되어 있는 포획자(30)가 존재하며, 포획자(30)는 검출물인 분석물(20)과 특이적 결합이 가능한 물질이어서 분석물(20)과 결합한 양자점-압타머 복합체(10)가 상기 포획자(30)에 노출될 경우 분석물(20)이 포획자(30)와 결합하여 검출라인(203)에 분석물(20)과 결합한 양자점-압타머 복합체(10)가 포획된다. 이 때 포획자(30)와 결합하는 분석물(20)의 결합부위는 양자점-압타머 복합체(10)의 압타머와 결합하는 분석물(20)의 결합부위와 다른 부위일 수 있다. 따라서 검출라인(203)에서 신호를 관측한 결과 양자점-압타머 복합체(10)에서 발생한 신호가 관측이 될 경우 상기 시료(100)에 검출 대상인 분석물(20)이 존재한다고 판단할 수 있고, 그렇지 않을 경우 상기 시료(100)에 검출 대상인 분석물(20)이 존재하지 않는다 또는 일정 농도 이하의 분석물(20)이 존재한다고 판단할 수 있다.
검출라인(203) 후단에는 대조라인(204)이 존재하여 진단시스템이 정상적으로 작동하는지 검증할 수 있으며, 대조라인(204)에는 제 1 결합부재(40)과 제 2 결합부재(50)를 통해 지지체(60)에 고정되어 있는 제 2 포획자(31)가 존재하며, 제 2 포획자(31)는 압타머와 특이적 결합하는 항체, 압타머, 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 제 2 포획자는 양자점-압타머 복합체(10)의 압타머와 결합이 가능한 물질이어서 분석물(20)의 유무와 관계없이 양자점-압타머 복합체(10)가 대조라인(204)에 포획되므로 대조라인(204)에서 발생하는 신호 관측을 통해 양자점-압타머 복합체(10)의 유동이 올바르게 일어났다고 판단할 수 있고, 반대로 대조라인(204)에서 신호가 발생하지 않는 경우 진단시스템이 정상적으로 작동하지 않는다는 사실을 알 수 있다.
상기 제 1 결합부재(40)와 제 2 결합부재(50)는 공지의 결합쌍일 수 있고, 상기 검출라인(203)의 제 1 결합부재(40) 및 제 2 결합부재(50)와 상기 대조라인(204)의 제 1 결합부재(40) 및 제 2 결합부재(50)는 서로 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 상기 제 1 결합부재(40)와 제 2 결합부재(50)로 이루어진 결합쌍은 비오틴-스트렙트아비딘 결합쌍일 수 있다.
한편, 본 발명의 진단키트는, 상기 본 발명에 따른 양자점-압타머 복합체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 진단키트는 측면유동검사스트립일 수 있다.
[실시예]
실시예 1: 단백질 코팅된 양자점-압타머 복합체를 이용한 측방유동분석스트립의 제조
스트렙타비딘(50)과 결합한 바이오틴(40)-압타머(30)를 혼합하여 검출라인(203)에 분주 후 건조시켰다. 단백질을 코팅한 양자점-압타머 복합체(10)를 접합패드(202)에 주입 후 건조시켰다. 위 검출라인(203)과 접합패드(202)를 조립하여 측방유동분석스트립(200)을 제조하였다.
비교예 1: 양자점-압타머 복합체를 이용한 측방유동분석스트립의 제조
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 측방유동분석스트립 제조하되, 단백질을 코팅하지 않은 양자점-압타머 복합체를 사용하였다.
시험예 1: 비특이적 반응 평가
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 측방유동분석스트립 각각에 대하여, 시료주입패드에 전개용액을 주입하여 접합패드에 건조되어 있는 양자점-압타머 복합체를 전개시키고, 약 15 분 후 검출라인에 양자점-압타머 복합체가 부착되는지 확인하였다.
도 3은 그 결과를 촬영한 사진이며, 좌측은 상기 비교예 1(단백질 코팅 전)을, 우측은 상기 실시예 1(단백질 코팅 후)의 결과를 나타낸다. 또한, 각각에 대하여 형광신호를 측정하였으며 그 결과는 도 4 및 도 5와 같았다. 비교예 1의 경우 도 3 내지 도 5와 같이 높은 형광신호를 보였으나, 실시예 1의 경우 그렇지 않았다.
이를 통해, 타겟물질이 첨가되지 않은 전개용액을 측방유동분석스트립에 주입하여 양자점-압타머 복합체와 검출라인 구성물질간의 비특이적 반응을 확인해 보았을 때, 단백질을 코팅하지 않은 양자점-압타머 복합체는 검출라인에 분주되어 있는 스트렙타비딘-바이오틴 압타머와 비특이적으로 반응하여 형광신호를 보이고 단백질을 코팅한 양자점-압타머 복합체는 스트렙타비딘-바이오틴 압타머와 반응하지 않아 형광신호를 보이지 않는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 압타머-양자점 복합체는 양자점-압타머 복합체 형성시 단백질을 코팅하여 검출라인 및 대조라인의 결합부재에 의한 비특이적 반응을 제거함에 따라 비특이반응에 의한 검출 결과 오류를 감소시킬 수 있고 진단시스템의 정확도를 향상시킬 수 있다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 청구범위뿐만 아니라 이 청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.
10: 양자점-압타머 복합체 11: 비드 12: 양자점 13: 단백질 14: 앱타머 20: 분석물 30: 제 1 포획자 31: 제 2 포획자 40: 제 1 결합부재 50: 제 2 결합부재 60: 지지체 100: 시료 200: 진단키트 201: 시료주입패드 202: 접합패드 203: 검출라인 204: 대조라인 205: 흡수패드
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Claims (16)
- 표면에 양자점이 결합된 비드;
상기 양자점과 결합하는 단백질; 및
상기 단백질과 결합하는 압타머;를 포함하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 비드는 실리카 비드인 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 비드는 상기 양자점과 정전기적 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 표면에 양자점이 결합된 비드는 평균입경이 1 내지 2000 nm, 10 내지 1800 nm, 또는 50 내지 1000 nm인 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 양자점은 비드를 감싸는 양자점층을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 양자점은 단층을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 단백질은 상기 양자점을 감싸는 단백질층을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 7에 있어서,
상기 단백질층은 두께가 0.1 내지 100 nm, 0.5 내지 50 nm, 또는 1 내지 20 nm인 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)인 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 단백질과 양자점은 정전기적 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 압타머는 티올기를 갖는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 압타머와 상기 단백질은 디설파이드 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - 청구항 1에 있어서,
상기 압타머는 검출 대상 분석물과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 양자점-압타머 복합체. - A) 표면에 양자점이 결합된 비드와 단백질을 혼합하여 단백질 코팅된 양자점 비드를 형성하는 단계; 및
B) 상기 단백질 코팅된 양자점 비드와 압타머를 혼합하여 단백질에 압타머를 결합시키는 단계;를 포함하는, 양자점-압타머 복합체의 제조방법. - 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 양자점-압타머 복합체를 분석물 검출 시 분석물 결합 및 신호발생물질로 사용하는, 분석물 검출방법.
- 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 양자점-압타머 복합체를 포함하는, 진단키트.
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