본 발명의 목적은, 면역 혈청학적 검사에 있어서 넓은 농도 범위의 생체 시료를 측정할 수가 있고, 장기간 안정적으로 보존할 수 있는 측정 시약용 담체 입자 라텍스 및 그것을 사용한 측정 시약을 제공하는 것이다.
제1의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체와의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 상기 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 O.O05 내지 O.7 μmol/㎡, 평균 입경이 O.01 내지 1.5 ㎛인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다.
제2의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 상기 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 상이한 2종류 이상의 입자를 포함하는 것인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다. 제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서, 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 O.O05 내지 0.7 μmol/㎡인 것이 바람직하다. 제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서는, 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 O.OO5 μmol/㎡ 이상 O.12 μmol/㎡ 미만인 담체 입자 (A)와, 표면의 술폰산기량이 0.12 μmol/㎡ 이상 0.7 μmol/㎡ 이하인 담체 입자 (B)를 포함하는 것이 바람직하고, 담체 입자 (A)와 담체 입자 (B)의 함유 비율은, 중량비로 담체 입자 (A)/담체 입자 (B)=1/10 내지10/1인 것이 바람직하다.
제3의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 상기 담체 입자는 평균 입경이 0.04 내지 0.1 ㎛, 입경의 CV값이 8 내지 20 %인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다. 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서는, 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 0.OO5 내지 O.7 μmol/㎡인 것이 바람직하다.
제1, 제2 또는 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는 유화제를 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 제1, 제2 또는 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서는, 페닐기를 갖는 중합성 단량체가 스티렌이고, 또한 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체가 스티렌 술폰산염인 것이 바람직하다.
제4의 본 발명은, 제1, 제2 또는 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 담체 입자에 피측정 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지되어 이루어지는 측정 시약이다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명하지만 본 발명은 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
[담체 입자의 제조]
교반기, 환류용 냉각기, 온도 검출기, 질소 도입관 및 쟈켓을 구비한 유리제 반응 용기 (용량 2 L)에, 증류수 150O g, 스티렌 280 g, 스티렌 술폰산나트륨 0.9 g 및 증류수 10 g에 과황산칼륨 0.5 g을 용해시킨 수용액을 넣고, 용기 내를 질소 가스로 치환한 후, 70 ℃에서 교반하면서 24 시간 중합하였다.
중합 종료 후, 상기 용액을 페이퍼 여과지로 여과 처리하여, 담체 입자를 추출하였다. 얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 하기의 방법에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.
(담체 입자의 입경의 측정 방법)
투과형 전자 현미경 장치를 사용하여 담체 입자를 촬영하고 이것을 화상 해석함으로써 입경을 측정하였다.
(담체 입자 표면의 술폰산기량의 측정 방법)
담체 입자를 셀로판 튜브 투석막을 사용하여 48 시간, 정제수로 투석하여 잔존 단량체를 제거하였다. 이 입자를 건조 중량으로 10 g이 되도록 4구 유리 용기에 채취 후, 증류수로 150 mL가 되도록 희석하여 교반기칩을 사용하여 교반하였다. 이것을 용액 A라 하였다.
이어서, 전위차 전기 전도도 적정 처리 장치 (AT-310, 교도 덴시 고교사 제조)의 부속 장치 ATB-310 전동 뷰렛에, N/100-수산화 나트륨 (와꼬 쥰야꾸사 제조)을 셋트하고, 또한 도전율 전극을 용액 A에 침지하여, 질소 도입관, 탈기관 및 pH 전극을 설정하였다. 그리고, N/100-수산화나트륨을 적하 (적하량 0.05 ㎖/150 내지 500 초: 측정하는 술폰산량에 의해 조정)하여, 전위차 전기 전도도 적정 처리 장치 (AT-310)를 사용한 전도도의 변화량으로부터 당량점을 측정하고 목적으로 하는 술폰산량을 산출하였다.
[측정 시약의 제조]
얻어진 담체 입자를 사용하여 농도를 5 % (w/v)에 조정한 수용액 250 μL를 8 mL 유리관에 넣었다. 여기에 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도: 12 mg/mL) 550 μL를 한번에 첨가하여 37 ℃에서 완만하게 1 시간 교반하여 흡착시켰다. 이어서 1.0 중량%의 소혈청 알부민 (이하, BSA라고도 함)을 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 450 μL를 한번에 첨가하고, 또한 37 ℃에서 1 시간 교반하여 블로킹 처리를 행하였다.
블로킹 처리 후의 현탁액을 8 mL의 원심관에 분취하여, 1500O rpm, 4 ℃에서 30 분간 원심 분리하여, 상청액을 제거하고, 1.0 중량% BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2 회 행하였다.
이어서, 잉여 항체 처리를 끝낸 입자에 1.0 중량 % BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5) 2.5 mL를 첨가하고, 초음파 처리 후, 또한 1.0 중량% BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종액량이 30 mL가 되도록 하여 측정 시약을 제조하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
1) 측정 감도의 평가
얻어진 측정 시약을 사용하여 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다. 측정에는 1 검체 측정에 대하여 측정 시약을 132 μL, 검체 희석액으로서 1 % BSA 함유 글리신 완충액 132 μL, 측정 검체로서 CRP 농도가 0.08 내지 20 mg/dL의 것을 2 μL를 사용하여 각 검체의 흡광도 변화량을 측정하였다. 측정 기기에는, 생화학 자동 분석기 (히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7170형 자동 분석 장치)를 사용하고, 측정 파장은 800 nm, 측광 포인트 2 포인트-엔드(point-end) 21-34 p로 행하였다. 이 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1에서 얻어진 측정 시약은 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하였다.
2) 시약 안정성의 평가
얻어진 측정 시약을, 온도 4 ℃에서 6 개월 동안 보관하여 상기 방법과 동일하게 하고 CRP 농도가 0.08 내지 20 mg/dL 범위의 검체의 측정 감도의 평가를 행하였다.
결과를 도 2에 나타냈다.
도 2로부터 장기간 보관 후의 측정 시약에서도 제조 직후와 마찬가지로 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하고, 장기간에 걸쳐 성능이 안정적으로 유지된다는 것을 알았다.
<실시예 2 내지 3, 비교예 1 내지 4>
증류수, 스티렌 및 스티렌술폰산나트륨을 표 1에 나타낸 바와 같이 넣는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 담체 입자를 제조하였다.
얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하여 그 결과를 표 1에 나타냈다.
다음으로 실시예 1과 표면적당의 감작량이 동일하게 되도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하고 각 실시예 및 비교예의 측정 시약을 제조하였다.
얻어진 측정 시약의 측정 감도의 평가를 실시예 1과 동일한 방법에 의해 행하였다. 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 2, 3에서 제조한 측정 시약으로는실시예 1과 동일하게 양호한 측정 결과를 나타냈다. 이에 대하여, 비교예 1 내지 4에서 제조한 측정 시약으로는 측정 감도가 낮았다.
또한, 제조한 측정 시약을, 온도 4 ℃에서 6 개월 동안 보관하여 실시예 1과 동일한 방법에 의해 시약 안정성의 평가를 행하였다. 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2로부터, 실시예 2, 3에서 제조한 측정 시약은 실시예 1과 동일하게 장기간 보관 후에도 제조 직후와 같이, 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하고, 장기간에 걸쳐 성능이 안정적으로 유지되는 것을 알았다. 이에 대하여, 비교예 1 내지 4에서 제조한 측정 시약은 장기간 보관 후는 제조 직후와 비교하여 측정 감도가 저하되고 시약 성능이 나빠진다는 것을 알았다.
<실시예 4, 비교예 5>
실시예 3 및 비교예 3에서 제조한 담체 입자로의 항체 감작량을, 표면적당의 감작량이 실시예 3 및 비교예 3의 각각 80 %가 되도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하여 측정 시약을 제조하고, 이것을 실시예 4 및 비교예 5로 하였다.
얻어진 측정 시약의 측정 감도 평가를 실시예 1과 동일한 방법에 의해 행하여 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 4에서 제조한 측정 시약은, 실시예 1과 동일하게 양호한 측정 결과를 나타냈다. 이에 대하여, 비교예 5에서 제조한 측정 시약은 측정 감도가 낮았다.
또한, 얻어진 측정 시약을 온도 4 ℃에서 6 개월간 보관하여, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 시약 안정성의 평가를 행하였다. 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4로부터, 실시예 4에서 제조한 측정 시약은 제조 직후와 동일하게 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하고, 장기간 에 걸쳐 성능이 안정적으로 유지된다는 것을 알았다. 이에 대하여, 비교예 5에서 제조한 측정 시약은 장기간 보관 후에는 제조 직후와 비교하여, 측정 감도가 저하되고 시약 성능이 나빠진다는 것을 알았다.
<실시예 5 내지 7, 비교예 6 내지 8>
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2 L)에 표 2에 나타낸 조성의 원료를 넣고, 질소 치환한 후 교반하면서 반응 온도를 70 ℃ 내지 71 ℃로 제어하면서 48 시간 공중합하였다. 또한 중합시에 사용하는 촉매로서는 증류수 10 g에 과황산칼륨 0.5 g을 용해시킨 수용액을 사용하였다. 또한 실시예 5, 6 및 비교예 6에서는 비이온계 유화제 (에멀젠(EMULGEN) 804 S, 가오사 제조)를, 실시예 7 및 비교예 7에서는 음이온계 유화제 (네오페렉스(NEOPELEX) F-25, 가오사 제조)를 사용하였다.
얻어진 담체 입자를 취하고 실시예 1과 동일한 방법에 의해 입경 및 표면의 술폰산기량을 측정하였다.
결과를 표 2에 나타냈다.
[측정 시약의 제조]
실시예 5에서 얻어진 담체 입자를 사용하여 5 % 농도 수용액을 제조한 후 8 mL 유리관에 250 μL 넣고, 여기에 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도 12 mg/mL: 이하, 항체 용액이라고 함) 55O μL를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 교반 흡착 후, BSA(소혈청 알부민)를 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 450 μL 가하고, 블로킹 처리로서 37 ℃에서 60 분 교반 처리를 행하였다.
이어서, 블로킹 처리품을, 8 ㎖ 원심관에 분취하여 15000 rpm에서 50 분간 원심 분리 처리 후, 상청을 폐기하고 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여재분산시켜 잉여 항체 처리를 2 회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 2.5 mL 첨가하고, 초음파 처리 후 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 30 mL로 하여 측정 시약을 제조하였다.
실시예 6, 7 및 비교예 6 내지 8에서 제조한 담체 입자에 대해서는 항체 감작량이 담체 입자 표면적당 동일하도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정한 것 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로 측정 시약을 제조하였다.
또한 원심 분리 조건에 대해서는 실시예 5 및 비교예 6에서는 15000 rpm에서 50 분간, 실시예 6 및 비교예 7에서는 15000 rpm에서 45 분간, 실시예 7 및 비교예 8에서는 15000 rpm에서 38 분간으로 하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
얻어진 각 측정 시약을 사용하고, 이하의 측정 조건으로써, CRP 농도 0.08 내지 20 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 5 및 도 6에 나타냈다.
측정기종: 히타치 세이사꾸쇼 제조, 7170형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 2 μL
희석액 (R1) 132 μL (희석액 조성 1 % BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 132 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트-엔드 21-34 p
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2L)에, 표 3에 나타낸 소정량의 증류수, 스티렌 및 스티렌술폰산나트륨을 넣고, 또한 증류수 10 g에 과황산칼륨 (중합 개시제) 0.5 g을 용해시킨 수용액을 첨가하여, 질소치환한 후, 교반 상태로 반응 온도를 71 내지 73 ℃로 제어하면서 48 시간 공중합하여, 6 종류의 담체 입자 (a) 내지 담체 입자 (f)를 얻었다. 얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하였다. 결과를 표 3에 나타냈다.
<실시예 8>
[측정 시약의 제조]
담체 입자 (a)와 담체 입자 (b)를 고형분 환산의 중량비로 (a)/(b)=1/10이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용하고, 증류수를 첨가하여 고형분을 10 중량%로 조정한 후, 8 ㎖ 유리관에 250 μL 채취하여, 항 인간 CRP 염소 혈청 (단백질 농도: 18 mg/mL, DAKO사 제조: 이하, 항체 용액라고도 함) 170 μL를 첨가하여 37 ℃에서1 시간 교반하여 흡착시킨 후, BSA (소혈청 알부민)를 포함하는 글리신 완충액 (pH: 8.5) 2080 μL를 첨가하고, 블로킹 처리로서 37 ℃에서 60 분간 교반 처리를 행하였다. 이어서, 블로킹 처리품을 8 ㎖ 원심관에 분취하여, 15000 rpm에서 50 분간 원심 분리 처리한 후, 상청액을 폐기하고, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2 회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5) 2.5 mL를 첨가하여 초음파 처리한 후, 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 5 mL로 측정 시약을 제조하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
얻어진 각 측정 시약을 사용하여, 이하의 측정 조건으로써 CRP 농도 0.08로부터 20 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정한였다.
결과를 도 7에 나타냈다.
측정 기종: 히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7150형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 3 μL
희석액 (R1) 270 μL (조성: 1 중량% BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 90 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트 30-50 p
<실시예 9>
담체 입자 (a)와 담체 입자 (b)를 고형분 환산의 중량비로 (a)/(b)= 10/1이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여측정 시약을 제조하였다.
<실시예 10>
담체 입자 (c)와 담체 입자 (d)를 고형분 환산의 중량비로 (c)/(d)=1/10이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<실시예 11>
담체 입자 (c)와 담체 입자 (d)를 고형분 환산의 중량비로 (c)/(d)=10/1이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
실시예 9 내지 실시예 11에서 얻어진 측정 시약의 성능 (감도)을 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 평가하였다. 그 결과를 도 7에 나타냈다.
<비교예 9>
담체 입자 (a) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<비교예 10>
담체 입자 (d) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하고, 또한 원심 분리 처리의 조건을 15000 rpm에서 38 분간으로 한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<비교예 11>
담체 입자 (e) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<비교예 12>
담체 입자 (f) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하고, 또한 원심 분리 처리의 조건을 15000 rpm에서 38 분간으로 한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
비교예 9 내지 비교예 12에서 얻어진 측정 시약의 성능 (감도)을 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 평가하였다. 그 결과를 도 8에 나타냈다.
도 7로부터 분명한 것과 같이, 실시예 8 내지 11에서 제조한 측정 시약은 모두 CRP 농도 0.08 내지 20 mg/dL의 넓은 농도 범위에서 흡광도 변화량이 크고, 우수한 감도를 나타냈다.
이에 대하여, 도 8로부터 분명한 것과 같이, 담체 입자로서 담체 입자 (a), 담체 입자 (e) 및 담체 입자 (f)를 각각 단독으로 사용하여 제조한 비교예 9, 11, 12의 측정 시약은, 모두 CRP 농도 0.08 내지 20 mg/dL의 넓은 농도 범위의 전부에 있어서 흡광도 변화량이 작고, 감도가 떨어져 있었다. 또한, 담체 입자로서 담체 입자 (d)를 단독으로 사용하여 제조한 비교예 10의 측정 시약은, CRP 농도 5 내지 20 mg/dL의 고농도 영역에서의 흡광도 변화량이 작고, 고농도 영역에서의 감도가떨어졌다.
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2L)에 표 4에 나타낸 조성의 원료를 넣고, 질소 치환한 후 교반하면서 반응 온도를 71 ℃ 내지 73 ℃로 제어하고 48 시간 공중합하여 5 종류의 담체 입자 (g) 내지 담체 입자 (k)를 얻었다. 얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하였다. 결과를 표 4에 나타냈다. 또한 중합시에 사용하는 촉매는 증류수 10 g에 과황산칼륨 0.5 g을 용해시킨 수용액을 사용하였다.
[측정 시약의 제조]
담체 입자 (g) 10 % (w/v) 농도로 조정한 수용액을 8 mL 유리관에 250 μL넣고, 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도 18 mg/mL: 이하, 항체 용액이라고 함) 170 μL를 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간 교반 흡착 후, BSA (소혈청 알부민)을 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 2080 μL를 가하여, 37 ℃에서 60 분교반하여 블로킹 처리를 행하였다. 다음으로 블로킹 처리품을 8 mL 원심관에 분취하고 18000 rpm에서 60 분간 원심 분리 처리 후, 상청액을 폐기하고 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 2.5 mL 첨가하고, 초음파 처리 후, 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 5 mL로 하여 측정 시약을 제조하였다.
또한 담체 입자 (h), (i), (j), (k)에 대해서는 담체 입자 표면적당의 항체 감작량이 동일하게 되도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하여 담체 입자 (g)와 동일 방법으로써 측정 시약을 제조하였다. 원심 분리 조건에 대해서는 담체 입자 (h)는 18000 rpm에서 45 분간, 담체 입자 (i) (j)는 15000 rpm에서 30 분간, 담체 입자 (k)는 18000 rpm에서 60 분간으로 하였다.
<실시예 12>
얻어진 담체 입자 (i), (j)를 포함하는 측정 시약을 사용하고 이하의 측정 조건으로 CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 9 및 도 10에 나타냈다.
측정기종: 히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7150형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 3 μL
희석액 (R1) 270 μL (조성: 1 중량% BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 90 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트 30-50 p
<비교예 13>
얻어진 담체 입자 (k)를 포함하는 측정 시약을 사용하여 실시예 12와 동일한 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 9 및 도 10에 나타냈다.
<실시예 13>
얻어진 담체 입자 (g)를 포함하는 측정 시약과 담체 입자 (i)를 포함하는 측정 시약을 1:10으로 혼합한 혼합 측정 시약을 사용하고, 실시예 12와 동일한 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 9에 나타냈다.
<실시예 14>
얻어진 담체 입자 (h)를 포함하는 측정 시약과 담체 입자 (j)를 포함하는 측정 시약을 1:10으로 혼합한 혼합 측정 시약을 사용하고, 실시예 12와 동일한 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 10에 나타냈다.
<실시예 15 내지 18, 비교예 14 내지 18>
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2L)에, 표 5에 나타낸 조성의 원료를 넣고, 또한 증류수 10 g에 과황산칼륨 (개시제) 0.5 g을 용해시킨 수용액을 가하여 질소 치환한 후, 교반 상태로 반응 온도를 71 내지 73 ℃로 제어하면서 48 시간 공중합하여, 담체 입자를 얻었다.
얻어진 담체 입자를 페이퍼 여과지로 여과 처리 후, 담체 입자의 입경을 측정하여 평균 입경 및 CV값을 구하였다. 또한, 입경은 투과형 전자 현미경으로 촬영한 화상을 바탕으로, 화상 해석 장치로 측정하였다. 또한, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 표면의 술폰산기량을 측정하였다.
결과를 표 5에 나타냈다.
[측정 시약의 제조]
실시예 15에서 얻어진 담체 입자를 사용하여 10 % (w/v) 농도로 조정한 수용액을 8 mL 유리관에 250 ㎛L 넣고, 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도 18 mg/mL: 이하, 항체 용액라고도 함) 170 μL를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 교반 흡착 후, BSA (소혈청 알부민)를 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 2080 μL를 가하여, 37 ℃에서 60 분 교반하여 블로킹 처리를 행하였다. 이어서, 블로킹 처리품을 8 mL 원심관에 분취하여 1800O rpm에서 60 분간 원심 분리 처리 후, 상청액을 폐기하고 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하고 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 2.5 mL 첨가하고, 초음파 처리 후, 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 5 mL로 하여, 측정 시약을 제조하였다.
실시예 16 내지 18 및 비교예 14 내지 18에 대해서는 담체 입자의 표면적당의 항체감작량이 동일하도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하여, 실시예 15와 동일한 방법으로 측정 시약을 제조하였다.
또한 원심 분리 조건에 대해서는 실시예 15 및 비교예 18은 18000 rpm에서 60 분간, 실시예 16, 17 및 비교예 16, 17은 18000 rpm에서 70 분간으로 하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
얻어진 측정 시약을 사용하고 이하의 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 11 및 도 12에 나타냈다.
측정 기종: 히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7150형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 3 μL
희석액 (R1) 270 μL (조성: 1 중량% BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 90 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트 30-50 p