CN104662426B - 粒子凝集测定用胶乳粒子 - Google Patents
粒子凝集测定用胶乳粒子 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104662426B CN104662426B CN201380050058.0A CN201380050058A CN104662426B CN 104662426 B CN104662426 B CN 104662426B CN 201380050058 A CN201380050058 A CN 201380050058A CN 104662426 B CN104662426 B CN 104662426B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- particles aggregate
- latex particle
- polymerizable monomer
- particle
- phenyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/545—Synthetic resin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F290/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers modified by introduction of aliphatic unsaturated end or side groups
- C08F290/02—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers modified by introduction of aliphatic unsaturated end or side groups on to polymers modified by introduction of unsaturated end groups
- C08F290/06—Polymers provided for in subclass C08G
- C08F290/061—Polyesters; Polycarbonates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L33/00—Compositions of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides or nitriles thereof; Compositions of derivatives of such polymers
- C08L33/04—Homopolymers or copolymers of esters
- C08L33/14—Homopolymers or copolymers of esters of esters containing halogen, nitrogen, sulfur, or oxygen atoms in addition to the carboxy oxygen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Abstract
本发明提供一种粒子凝集测定用胶乳以及使用了该粒子的粒子凝集测定试剂。所述粒子凝集测定用胶乳粒子能够高度抑制非特异性反应,并且能够进行高灵敏度测定,且能够简便地制作出诊断剂。一种粒子凝集测定用胶乳粒子,作为成分而含有具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体、以及具有式(1)的聚合性单体,其中,具有式(1)的聚合性单体在粒子表面所占的密度(官能团密度)为0.003~0.05μmol/m2。CH2=CR1‑COOCH2CH2O(PO2)OCH2CH2‑N(CH3)3…(1)(式中,R1表示氢原子或甲基)。
Description
技术领域
本发明涉及一种粒子凝集测定用胶乳粒子、和使用了该粒子的粒子凝集测定试剂,所述粒子凝集测定用胶乳粒子能够高度抑制非特异性反应,并且能够进行高灵敏度测定。
背景技术
作为在临床检验领域中对被检体中的微量物质进行定量的方法,广泛进行着利用了抗原抗体反应的免疫测定法。其中,使用了担载有抗体等的胶乳粒子(以下有时称作敏化胶乳粒子)的胶乳免疫比浊法简便且测定时间短,因此被检验室等广泛使用。基于胶乳免疫比浊法而进行的被检体中的抗原或抗体的定量,通过对与免疫复合体形成相伴的敏化胶乳粒子的凝集所致的吸光度变化进行光学检测来进行。该吸光度的变化基于敏化胶乳粒子的凝集所致的表观的粒径变化。
一直以来,如专利文献1所记,胶乳免疫比浊法中,由于与检测对象物质特异性地进行反应的抗原或抗体的固定化(敏化)容易实施、比较廉价、并且聚合反应也容易控制,因此,一直使用的是以聚苯乙烯为主成分的聚苯乙烯系胶乳粒子。但是,聚苯乙烯系胶乳粒子虽然具有能够物理性地吸附(敏化)抗原、抗体的优点,但另一方面,由于也吸附被检体中的非检测对象蛋白质等,因此有时引起不基于抗原抗体反应这种特异性反应的敏化胶乳粒子的凝集反应、所谓的非特异性反应,该非特异性反应的抑制一直以来都是问题。
专利文献1中,为了抑制非特异性反应,尝试了利用牛血清白蛋白(BSA)等将对抗原、抗体进行了敏化后的胶乳粒子封闭,但大多无法取得充分的效果,给出了高背景值,因此,在制作能够进行高灵敏度测定的试剂的方面存在重大课题。
专利文献2中,使用苯乙烯、下述通式所示的化合物、苯乙烯磺酸的盐和水溶性自由基聚合引发剂并在水中使它们进行共聚,制成聚合物粒子,并制作了诊断剂用载体粒子。认为由此可抑制非特异性反应,但是按照以高浓度含有负责抑制非特异性反应的下述通式的化合物的方式制作的聚合物粒子,难以使抗原、抗体物理吸附于粒子表面,无法实现作为诊断剂用载体的目的。另外,专利文献2中没有示出在制作载体粒子时使用苯乙烯、下述通式所示的化合物、苯乙烯磺酸的盐和水溶性自由基聚合引发剂以外的化合物。
CH2=CR3-COO(CH2CH2O)X(CH(CH3)CH2O)y(CH2CH2O)ZR4
(式中,R3表示H或CH3,R4表示H或CH3,x、y和z分别为0或100以下的整数,x、y、z满足1≤x+y+z≤100)
专利文献3和专利文献4中公开了一种免疫学的测定用试剂,该免疫学的测定用试剂使用以下述通式所示的化合物为主成分单体而构成的聚合物类作为凝集促进剂。记载了:此时,聚合物虽然可以为共聚物,但下述通式的构成单元优选在聚合物中含有20%以上,另外,作为共聚物中的下述通式以外的构成单元,可以使用苯乙烯衍生物。但是,共聚物以链状聚合物的形式在反应液中以游离状态存在,完全没有示出以胶乳粒子的形态加以使用的情况。另外,专利文献4中记载了,在反应液中添加了聚乙二醇等凝集促进剂的情况下,由于盐析而产生非特异性浑浊,空白值上升,但在使用由下述通式所示的化合物作为主成分单体而构成的聚合物类作为凝集促进剂的情况下,不易产生盐析所致的非特异性浑浊。但是,专利文献4中完全没有示出这些聚合物类能够抑制非特异性地引起凝集反应的偏离被检体等的过剩凝集。
CH2=CR6-CO-X-R5-O(PO2)OR4-N-(R1)(R2)(R3)
(式中,R1至R3分别独立地表示氢原子或可以具有羟基的烷基,R4表示亚烷基,R5表示可以具有取代基并且链中可以具有氧原子的亚烷基,R6表示氢原子或甲基,X表示氧原子或-NH-基)
现有技术文献
专利文献
专利文献1:专利第3708942号公报
专利文献2:日本特公昭58-34486号公报
专利文献3:日本特开2005-106609号公报
专利文献4:日本特开2002-365296号公报
发明内容
发明要解决的课题
本发明是为了解决上述现有的胶乳免疫比浊法中的问题而完成的发明,本发明的目的在于,提供一种粒子凝集测定用胶乳粒子、和使用了该粒子的粒子凝集测定试剂,所述粒子凝集测定用胶乳粒子能够高度抑制非特异性反应,并且能够进行高灵敏度测定,且能够简便地制作出诊断剂。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现,通过在胶乳粒子聚合时使其组成成为特定的组成,从而能够制作出本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子,至此完成了本发明。即,本发明如下所述。
[1]一种粒子凝集测定用胶乳粒子,其特征在于,作为成分,含有具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体、和具有式(1)的聚合性单体,具有式(1)的聚合性单体在粒子表面所占的密度(官能团密度)为0.003~0.05μmol/m2。
CH2=CR1-COOCH2CH2O(PO2)OCH2CH2-N(CH3)3... (1)
(式中,R1表示氢原子或甲基)
[2]如上述[1]所述的粒子凝集测定用胶乳粒子,其中,上述具有苯基的聚合性单体为选自苯乙烯、邻甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、4-乙烯基苯甲酸中的至少1种。
[3]如上述[1]或[2]所述的粒子凝集测定用胶乳粒子,其中,上述具有苯基和磺酸盐的聚合性单体为选自苯乙烯磺酸盐、二乙烯基苯磺酸盐、邻甲基苯乙烯磺酸盐、对甲基苯乙烯磺酸盐中的至少1种。
[4]如上述[1]所述的粒子凝集测定用胶乳粒子,其特征在于,上述具有苯基的聚合性单体为苯乙烯,具有苯基和磺酸盐的聚合性单体为苯乙烯磺酸钠。
[5]如上述[1]~[4]中任一项所述的粒子凝集测定用胶乳粒子,其特征在于,通过物理吸附来担载抗原或抗体。
[6]一种粒子凝集测定试剂,其是使用了上述[1]~[5]中任一项所述的粒子凝集测定用胶乳粒子的粒子凝集测定试剂。
发明效果
通过使用本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子和粒子凝集测定试剂,从而能够抑制蛋白质等来源于生物体的物质、检验试剂中特定的构成成分干预免疫反应,抑制目标特异性反应(例如抗原抗体反应)以外的不适于测定目的的反应(例如由偏离被检体所引起的过剩凝集反应),因此可以制造出能够以比以往更高灵敏度地仅测定目标特异性凝集反应的诊断剂。另外,本发明的胶乳粒子通过一步聚合反应来制作,并且设计为抗原、抗体在胶乳粒子上的敏化通过物理吸附来进行。可见,能够以非常简便的工序得到高灵敏度的粒子凝集测定用胶乳粒子。
附图说明
图1为使用使抗D二聚体抗体敏化后的实施例和比较例的粒子凝集测定用胶乳粒子来测定D二聚体标准抗原而得的标准曲线。
图2为使用使抗D二聚体抗体敏化后的实施例和比较例的粒子凝集测定用胶乳粒子来测定D二聚体偏离被检体1和D二聚体偏离被检体2,并基于图1的标准曲线进行浓度换算而得的图表。
具体实施方式
本发明提供一种粒子凝集测定用胶乳粒子,其含有具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体、和式(1)所示的单体(以下称为“MPC单体”)作为单体成分,且MPC单体在粒子表面所占的密度(官能团密度)为0.003~0.05μmol/m2。
以下,进一步详细说明本发明。作为本发明中使用的具有苯基的聚合性单体,没有特别限制,可举出例如苯乙烯、邻甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、4-乙烯基苯甲酸等。它们可以单独使用,也可以混合使用2种以上。其中,优选使用苯乙烯。
作为具有苯基和磺酸盐的聚合性单体,只要是能够使聚合后的粒子表面含有磺酸基的单体,则没有特别限制,可举出例如苯乙烯磺酸盐、二乙烯基苯磺酸盐、邻甲基苯乙烯磺酸盐、对甲基苯乙烯磺酸盐等。另外,作为这种情况下的盐,也没有特别限制,可举出钠盐、钾盐、锂盐、铵盐等。它们可以单独使用,也可以并用2种以上。其中,优选使用苯乙烯磺酸盐,进一步优选使用苯乙烯磺酸钠。
MPC单体为下述通式(1)所示的单体。
CH2=CR1-COOCH2CH2O(PO2)OCH2CH2-N(CH3)3... (1)
(式中,R1表示氢原子或甲基)
具体地,可举出:R1为氢原子的磷酸2-(丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯、R1为甲基的磷酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯(东京化成制)。
本发明的MPC单体的极性基团部分与构成细胞膜的磷脂的极性基团结构相同,将该MPC单体作为主成分聚合而成的聚合物一般具有与生物体的细胞膜成分同样的性质。若使该聚合物人工地溶解于水中,则形成双分子膜微囊(bilayer membrane vesicle),从而能够以W/O/W乳液的形式稳定地存在于水中。正在积极地利用该性质来研究药物投递系统等。另外,已知该聚合物的生物体适合性高,而且若涂布于塑料机材等,则几乎不吸附血液中的蛋白质,显示出抑制非特异吸附的性质,因而人们正在研究其在医疗器材等中的应用。作为在诊断剂中的应用,如专利文献3和专利文献4所示,已知作为凝集促进剂的效果。但是,尚且没有如本发明所述的用于抑制非特异性反应的应用例,所示非特异性反应是由蛋白质等来源于生物体的物质、检验试剂中的特定的构成成分干预免疫反应而引起目标特异性反应(例如抗原抗体反应)以外的不适于测定目的的反应所导致的。
本发明的胶乳粒子通过在含有上述具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体和MPC单体的水性介质中进行无皂乳液聚合而得到。作为上述聚合的方法,可以使用以往公知的无皂乳液聚合法。可举出例如:在注满作为介质的水的反应容器内添加上述具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体、MPC单体、聚合引发剂,在氮气氛下边搅拌边进行加热的方法等。
聚合温度优选为50~100℃,更优选为60~85℃。另外,聚合时间虽然取决于聚合性单体的组成、浓度和聚合引发剂等条件,但通常为5~50小时。
作为上述水性介质,优选单独使用水(脱离子水),或者使用水与水溶性溶剂的混合溶剂,例如为水与乙醇等醇的混合溶剂。其中,优选单独使用水。
作为上述聚合引发剂,可以使用公知的自由基引发剂。可举出例如过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵等过硫酸盐,2,2′-偶氮二异丁腈,2,2′-偶氮二(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)、2,2′-偶氮二-2,4-二甲基戊腈等偶氮化合物,过氧化苯甲酰、二叔丁基过氧化物、过氧化月桂酰、过氧化2-乙基己酸叔丁酯等有机过氧化物。其中,优选使用过硫酸盐,更优选使用过硫酸钾。上述聚合引发剂的使用量没有特别限定,优选相对于聚合性单体量以0.01~5重量%的范围来使用。
另外,根据本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子的用途,在上述聚合时可以进一步添加能够与上述单体共聚的聚合性不饱和单体。作为聚合性不饱和单体,只要是通常能够在自由基聚合中使用的单体,就没有特别限制,可举出例如(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯衍生物、(甲基)丙烯腈、(甲基)丙烯酰胺、乙烯基卤化物(ハロゲン化ビニル)、乙烯酯、(甲基)丙烯醛、马来酸衍生物、富马酸衍生物等。需要说明的是,本发明中,(甲基)丙烯酸是指丙烯酸或甲基丙烯酸。另外,上述苯乙烯衍生物为本发明中使用的具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体以外的苯乙烯衍生物。
作为聚合中使用的本发明的MPC单体的量,只要以MPC单体在粒子表面所占的密度(官能团密度)为0.003~0.05μmol/m2的量来使用,就没有特别限定。在粒子表面所占的官能团密度增高时,抑制非特异性反应的效果增高,但灵敏度的下降也变得显著,因而不优选。另外,在粒子表面所占的官能团密度变得过低时,MPC单体所具有的抑制非特异性反应的效果减少,变得与不使用MPC单体的粒子没有任何区别,因而不优选。为了在不使灵敏度下降的情况下抑制非特异性反应,重要的是使MPC单体的官能团密度为0.003~0.05μmol/m2,优选为0.004~0.02μmol/m2。
需要说明的是,MPC单体的官能团密度通过以下的计算式算出。
官能团密度(μmol/m2)=(胶乳粒子的制造中使用的MPC单体的摩尔数)/(生成的胶乳的总表面积)
具体而言,官能团密度可以通过下述方法计算。
设定:
r:生成的胶乳粒子的平均粒径(nm)
Y:胶乳粒子的制造中使用的MPC单体的摩尔数(μmol)
即,
Y=(制造中使用的MPC单体的重量(g))/(制造中使用的MPC单体的平均分子量)
V:胶乳粒子的总体积(cm3)
S:胶乳粒子的总表面积(cm2)
x:胶乳的总数(个)
Z:官能团密度(μmol/m2)
K:聚合反应中使用的具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体、聚合引发剂、MPC单体的重量的总和(g),
此时,
V=4/3π(r/2×10-7)3×x
S=4π(r/2×10-7)2×x
进而,S=6V/(r×10-7)
因此,
Z=Y/(S×10-4)
=Y×r×10-3/6V
在此,根据聚合而成的聚苯乙烯的比重为1.06g/cm3,
V=K/1.06
Z=1.766×10-4×Y×r/K
本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子的平均粒径期望为0.05~1.0μm。若小于0.05μm,则凝集所致的光学变化量过小,无法得到测定所需的灵敏度,另外,制备试剂时在离心分离时需要耗费大量时间,试剂成本增高。若超过1.0μm,则在检测对象物质为高浓度时,粒子的凝集所致的光学变化量超过能够测定的范围,无法得到与检测对象物质的量对应的光学变化量。本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子的平均粒径根据使用粒子凝集测定用胶乳粒子的测定方法、测定设备而不同,但优选为0.05~0.7μm,更优选为0.05~0.4μm。
上述粒子的粒径的变异系数(CV值)优选为20%以下。若超过20%,则有时试剂制备时的批次重现性差,测定试剂的重现性下降。更优选为15%以下。需要说明的是,上述粒径的变异系数由下式算出。
粒径的变异系数(CV值)=粒径的标准偏差/平均粒径
本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子的表面中MPC单体所占的密度、即官能团密度,可以通过胶乳粒子的制造中使用的MPC单体的摩尔量来进行控制。即,通过利用胶乳粒子的制造中使用的MPC单体的摩尔量而不是胶乳粒子的制造中使用的MPC单体的重量来规定官能团在每单位面积的胶乳粒子表面的量,从而即使是分子量不同的MPC单体,只要满足下述通式(1),就能够不问种类地以简便的操作来确定官能团密度,能够得到本发明的效果。
CH2=CR1-COOCH2CH2O(PO2)OCH2CH2-N(CH3)3... (1)
(式中,R1表示氢原子或甲基)
本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子以悬浊于水或水系溶剂的状态得到。粒子浓度没有特别限定,通常优选为1~20重量%。若小于1重量%,则制备试剂时需要进行浓缩,若超过20重量%,则有时发生凝集。
物理地吸附担载有与检测对象物质特异性结合的物质的粒子凝集测定用胶乳粒子(粒子凝集测定试剂)也属于本发明之一。作为上述与检测对象物质特异性结合的物质,只要是免疫血清学检验试剂(免疫学凝集反应和凝集阻止反应中使用的检验试剂)、生物化学测定法中通常使用的生理活性物质,就没有特别限定,其中,优选能够在抗原抗体反应中利用的物质。
作为上述能够在抗原抗体反应中利用的物质,可举出例如蛋白质、核酸、核蛋白质、雌激素、脂质等抗原或抗体。作为抗原,可举出例如各种抗原、受体、酶等,可举出β2微球蛋白、C-反应性蛋白质(CRP)、胰岛素、人血纤蛋白原、铁蛋白、类风湿因子(RA)、α-胎蛋白(AFP)、支原体抗原、HBs抗原等。另外,作为抗体,可举出例如针对各种毒素、病原菌等的抗体,可举出抗链球菌溶血素O抗体、抗雌激素抗体、抗β2微球蛋白抗体、抗梅毒螺旋体抗体、针对梅毒脂质抗原的抗体、抗HBs抗体、抗HBc抗体、抗HBe抗体、抗PSA抗体、抗CRP抗体、抗胰岛素抗体、抗D二聚体抗体等。此外,作为抗体,除免疫免疫球蛋白分子本身外,例如可以为F(ab’)2等片段。另外,作为抗体,也可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种。
作为使上述胶乳粒子担载(敏化)与检测对象物质特异性结合的物质的方法,只要是物理性吸附方法,就没有特别限制,利用以往公知的方法进行担载即可。
另外,可以在担载后根据需要而利用牛血清白蛋白等实施封闭处理,并分散于适当的缓冲液中,从而制作敏化胶乳分散液。可以在该敏化胶乳分散液中添加测定中使用的缓冲液和标准物质等,以粒子凝集测定试剂的试剂盒的形式使用。
作为上述与检测对象物质特异性反应的物质在胶乳粒子上担载的量,根据所使用的与检测对象物质特异性反应的物质的种类而不同,没有特别限定。
在使用包含担载抗原、抗体等的上述粒子凝集测定用胶乳粒子的测定试剂时,为了提高测定灵敏度、促进抗原抗体反应,可以含有各种增敏剂。作为上述增敏剂,可举出甲基纤维素、乙基纤维素等烷基化多糖类,支链淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮等。
通过使用本发明的胶乳粒子,可高度抑制非特异性反应,但为了进一步抑制由被检体中存在的其他物质引起的非特异性反应、或为了提高试剂的稳定性,还可以含有白蛋白(牛血清白蛋白、卵白蛋白)、酪蛋白、明胶等蛋白质、其分解物、氨基酸或表面活性剂等。
另外,检测对象物质可以由适当的稀释液进行稀释。作为上述稀释液,只要是pH5.0~9.0的缓冲液,则可以任意使用,可举出例如磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。
使用包含本发明的担载抗原、抗体等的上述粒子凝集测定用胶乳粒子的测定试剂,对由被检体中的检测对象物质与担载在胶乳粒子上的与检测对象物质特异性反应的物质的反应而生成的胶乳粒子的凝集程度进行光学测定,由此能够测定出被检体中的检测对象物质的反应量。上述光学测定中,只要是能够检测散射光强度、透射光强度、吸光度等的光学设备、或具备多种上述检测方法的光学设备等所代表的一般的生物化学自动分析仪,就都能使用。
作为光学测定上述凝集程度的方法,可使用以往公知的方法,可举出例如,以浊度增加来捕捉凝集的形成的比浊法、以粒度分布或平均粒径的变化来捕捉凝集的形成的方法、使用积分球测定因凝集的形成所致的前方散射光的变化并比较与透射光强度的比的积分球浊度法等。
另外,作为凝集程度的变化量的测定法,可举出例如,在不同时刻得到至少2个测定值,基于这些时刻间的测定值的增加部分(增加速度)来求出凝集程度的速度试验(rateassay);在某时刻(通常在被认为是反应终点的时刻)得到1个测定值,基于该测定值求出凝集程度的终点试验(end-point assay)等。其中,从测定的简便性、迅速性的观点出发,优选基于比浊法的终点试验。
实施例
以下,通过实施例进一步详细地说明本发明。需要说明的是,所得到的粒子凝集测定用胶乳粒子的粒径如下所述地进行测定。
粒子凝集测定用胶乳粒子的粒径测定:
按照常规方法将粒子凝集测定用胶乳粒子载置为棉胶膜状,利用透射型电子显微镜拍摄粒子图像,测量图像上的粒径(100个以上),由此求出平均粒径和标准偏差。
[实施例1]
在具备搅拌器、回流用冷凝器、温度检测器、氮气导入管和夹套的玻璃制反应容器(容量2L)中,添加超纯水1000g、苯乙烯单体135g、磷酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯(东京化成制)0.021g、苯乙烯磺酸钠1.2g、过硫酸钾0.7g,将容器内用氮气进行置换后,在70℃下、以210rpm的速度边搅拌,边实施24小时聚合。聚合结束后,用滤纸对上述溶液实施过滤处理,取出胶乳粒子。然后,利用透析膜进行48小时透析处理,得到纯化后的胶乳粒子。所得到的胶乳粒子的粒径为0.108μm(CV9.7%),MPC密度为0.010μmol/m2。
[实施例2]
将磷酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯(东京化成制)0.021g变更为0.009g,除此以外,与实施例1同样地得到胶乳粒子。所得到的胶乳粒子的粒径为0.102μm(CV10.4%),MPC密度为0.004μmol/m2。
[实施例3]
将磷酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯(东京化成制)0.021g变更为0.042g,除此以外,与实施例1同样地得到胶乳粒子。所得到的胶乳粒子的粒径为0.105μm(CV10.1%),MPC密度为0.019μmol/m2。
[比较例1]
不使用磷酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯(东京化成制)0.021g,除此以外,与实施例1同样地得到胶乳粒子。所得到的胶乳粒子的粒径为0.107μm(CV10.3%)。需要说明的是,由于未使用MPC单体,因此MPC密度为0。
[比较例2]
将磷酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯(东京化成制)0.021g变更为0.005g,除此以外,与实施例1同样地得到胶乳粒子。所得到的胶乳粒子的粒径为0.105μm(CV 9.8%),MPC密度为0.002μmol/m2。
[比较例3]
将磷酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯-2-(三甲基铵)乙酯(东京化成制)0.021g变更为0.120g,除此以外,与实施例1同样地得到胶乳粒子。所得到的胶乳粒子的粒径为0.110μm(CV9.1%),MPC密度为0.058μmol/m2。
[应用例]
使用实施例和比较例的胶乳粒子来实施D二聚体用粒子凝集测定试剂的评价。所使用的试剂和材料如下所述。
〈试剂和材料〉
·抗D二聚体抗体
·担载抗体的胶乳制备用缓冲液:使用20mM Tris-HCl(pH8.0)。
·封闭用缓冲液:使用2%(w/v)BSA、20mM Tris-HCl(pH8.0)。
·被检体稀释用缓冲液:使用0.15%(w/v)BSA、30mM Tris-HCl(pH8.5)。
〈D二聚体用粒子凝集测定试剂的制备〉
通过离心分离将实施例1~3、比较例1~3中得到的胶乳粒子纯化后,以达到5%(w/v)的方式利用担载抗体的胶乳制备用缓冲液进行稀释,制备稀释胶乳液。
另一方面,以使浓度达到1mg/mL的方式利用担载抗体的胶乳制备用缓冲液来稀释抗D二聚体抗体,制备稀释抗体溶液。
边搅拌上述稀释胶乳液1体积,边添加、混合上述稀释抗体溶液1体积,并进一步进行搅拌。然后,追加添加封闭用缓冲液2体积,继续进行搅拌。然后,使用缓冲液,将回收上述所得物而得到的D二聚体用粒子凝集测定试剂调整至0.5%(w/v),得到抗体敏化胶乳分散液。使用该抗体敏化胶乳分散液,利用D二聚体抗原标准液制作标准曲线。
装置:日立7170型自动分析装置
使用波长:570/800nm,测定温度:37℃
检测对象物质(0~58μg/mL的D二聚体标准液):12μL
第1试剂(被检体稀释用缓冲液:0.15%(w/v)BSA、30mM Tris-HCl(pH8.5):100μL
第2试剂(抗体敏化胶乳粒子的0.5%(w/v)分散液):100μL测光点:18-34
[测定例1]
使用将抗D二聚体抗体敏化后的实施例1~3和比较例1~3的抗体敏化胶乳粒子(0.5%(w/v)),按照上述测定方法进行测定,制作标准曲线(图1)。在使用了实施例1~3的抗体敏化胶乳粒子的情况下,能够以较高的灵敏度进行测定。另一方面,在使用了比较例1~3的抗体敏化胶乳粒子的情况下,只得到了低于实施例的灵敏度。
[测定例2]
使用将抗D二聚体抗体敏化后的实施例1~3和比较例1~3的抗体敏化胶乳粒子(0.5%(w/v))和D二聚体偏离被检体(2种),按照上述测定方法进行测定,对于其值,分别根据通过测定例1求出的标准曲线进行浓度换算。在此,D二聚体偏离被检体是指在以往的D二聚体免疫比浊测定体系中被观察到非特异性凝集反应的被检体。其结果如图2所示。可确认,在使用了实施例1~3的抗体敏化胶乳粒子的情况下,相对于未使用MPC单体的比较例1,高度地抑制了偏离被检体的非特异凝集反应。另外,在使用了比较例3的抗体敏化胶乳粒子的情况下,虽然确认到与实施例1~3同样地抑制了偏离被检体的非特异性凝集反应,但如测定例1所示,灵敏度大幅下降。可认为其理由是,由于MPC单体的密度过高,所以在胶乳粒子表面未充分吸附(敏化)抗体。
产业上的可利用性
通过使用本发明的粒子凝集测定用胶乳粒子、和粒子凝集测定用试剂,不会吸附引起非特异凝集反应的被检体中的非检测对象蛋白质,而仅引起目标特异凝集反应,因此能够得到灵敏度比以往更高的诊断剂。作为免疫血清学的检验试剂(免疫学的凝集反应和凝集阻止反应中使用的检验试剂)、生物化学测定法中通常使用的生理活性物质的检测试剂是有用的。
Claims (5)
1.一种粒子凝集测定用胶乳粒子,其中,
作为成分,含有具有苯基的聚合性单体、具有苯基和磺酸盐的聚合性单体、以及具有式(1)的聚合性单体,并且,所述粒子凝集测定用胶乳粒子通过在水性介质中进行无皂乳液聚合而得到,
所述具有苯基的聚合性单体为选自苯乙烯、邻甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、4-乙烯基苯甲酸中的至少1种,
具有式(1)的聚合性单体在粒子表面所占的密度、即官能团密度为0.003~0.05μmol/m2,
CH2=CR1-COOCH2CH2O(PO2)OCH2CH2-N(CH3)3…(1)
式中,R1表示氢原子或甲基。
2.如权利要求1所述的粒子凝集测定用胶乳粒子,其中,
所述具有苯基和磺酸盐的聚合性单体为选自苯乙烯磺酸盐、二乙烯基苯磺酸盐、邻甲基苯乙烯磺酸盐、对甲基苯乙烯磺酸盐中的至少1种。
3.如权利要求1所述的粒子凝集测定用胶乳粒子,其特征在于,
所述具有苯基的聚合性单体为苯乙烯,具有苯基和磺酸盐的聚合性单体为苯乙烯磺酸钠。
4.如权利要求1~3中任一项所述的粒子凝集测定用胶乳粒子,其中,
通过物理吸附来担载抗原或抗体。
5.一种粒子凝集测定试剂,其是使用所述权利要求1~4中任一项所述的粒子凝集测定用胶乳粒子的粒子凝集测定试剂。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012-213647 | 2012-09-27 | ||
JP2012213647 | 2012-09-27 | ||
PCT/JP2013/076389 WO2014051098A1 (ja) | 2012-09-27 | 2013-09-27 | 粒子凝集測定用ラテックス粒子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104662426A CN104662426A (zh) | 2015-05-27 |
CN104662426B true CN104662426B (zh) | 2017-06-13 |
Family
ID=50388489
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380050058.0A Active CN104662426B (zh) | 2012-09-27 | 2013-09-27 | 粒子凝集测定用胶乳粒子 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9383356B2 (zh) |
EP (1) | EP2902785B1 (zh) |
JP (1) | JP5566557B1 (zh) |
CN (1) | CN104662426B (zh) |
WO (1) | WO2014051098A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2831398C (en) * | 2011-03-28 | 2020-06-09 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Psa assay and reagent therefor |
JP6777459B2 (ja) * | 2016-08-22 | 2020-10-28 | 東ソー・ファインケム株式会社 | ポリマーエマルション及びその製造方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5714340A (en) * | 1992-12-22 | 1998-02-03 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Immunoassay elements having a receptor zone |
CN1449495A (zh) * | 2000-08-29 | 2003-10-15 | 协和梅迪克斯株式会社 | 重现性良好的凝聚免疫分析法及其试剂 |
CN1522370A (zh) * | 2001-07-02 | 2004-08-18 | ��Ԩ��ѧ��ҵ��ʽ���� | 用于分析试剂的载体颗粒胶乳和分析试剂 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5834486B2 (ja) * | 1980-08-19 | 1983-07-27 | 積水化学工業株式会社 | 診断試薬用ラテツクスの製造方法 |
JPS5876762A (ja) * | 1981-10-31 | 1983-05-09 | Sekisui Chem Co Ltd | 診断試薬用ラテツクスの製造方法 |
KR860001409B1 (ko) | 1983-06-10 | 1986-09-23 | 니혼엑스란 고오교오 가부시끼가이샤 | 비이드상 폴리머의 제조법 |
JPS59232104A (ja) * | 1983-06-15 | 1984-12-26 | Japan Exlan Co Ltd | ビーズ状ポリマーの製造法 |
JPH0682128B2 (ja) * | 1986-07-23 | 1994-10-19 | 株式会社トクヤマ | ラテツクス試薬 |
JPH0810224B2 (ja) * | 1987-04-30 | 1996-01-31 | 日東電工株式会社 | 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 |
US5166077A (en) | 1987-04-30 | 1992-11-24 | Nitto Denko Corporation | Latex for immobilization of physiologically active substances for immuno nephelometry |
ATE176821T1 (de) * | 1992-12-22 | 1999-03-15 | Johnson & Johnson Clin Diag | Immunoassay-elemente, die eine getrennte rezeptorschicht haben |
JP2002318233A (ja) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Shino Test Corp | 測定対象物質の比濁法測定試薬及び測定対象物質の比濁法測定方法 |
JP4577747B2 (ja) * | 2001-06-05 | 2010-11-10 | 和光純薬工業株式会社 | 免疫学的測定法用凝集促進剤 |
JP4210828B2 (ja) * | 2001-12-07 | 2009-01-21 | Jsr株式会社 | 生理活性物質担体用ポリマー粒子およびその製造方法 |
JP4241301B2 (ja) | 2003-09-30 | 2009-03-18 | 和光純薬工業株式会社 | 免疫学的測定用試薬 |
EP2693214B1 (en) * | 2011-03-31 | 2016-08-31 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Latex particle for measurement reagent, sensitized latex particle, and measurement reagent for immunonephelometry |
WO2013100146A1 (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 積水メディカル株式会社 | 粒子凝集測定用ラテックス粒子 |
CN104335048B (zh) * | 2012-03-30 | 2017-05-17 | 积水医疗株式会社 | 凝集测定用胶乳粒子 |
-
2013
- 2013-09-27 JP JP2014512197A patent/JP5566557B1/ja active Active
- 2013-09-27 CN CN201380050058.0A patent/CN104662426B/zh active Active
- 2013-09-27 EP EP13842499.9A patent/EP2902785B1/en active Active
- 2013-09-27 US US14/431,555 patent/US9383356B2/en active Active
- 2013-09-27 WO PCT/JP2013/076389 patent/WO2014051098A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5714340A (en) * | 1992-12-22 | 1998-02-03 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Immunoassay elements having a receptor zone |
CN1449495A (zh) * | 2000-08-29 | 2003-10-15 | 协和梅迪克斯株式会社 | 重现性良好的凝聚免疫分析法及其试剂 |
CN1522370A (zh) * | 2001-07-02 | 2004-08-18 | ��Ԩ��ѧ��ҵ��ʽ���� | 用于分析试剂的载体颗粒胶乳和分析试剂 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2902785B1 (en) | 2017-07-26 |
WO2014051098A1 (ja) | 2014-04-03 |
US20150233906A1 (en) | 2015-08-20 |
CN104662426A (zh) | 2015-05-27 |
EP2902785A1 (en) | 2015-08-05 |
US9383356B2 (en) | 2016-07-05 |
JP5566557B1 (ja) | 2014-08-06 |
EP2902785A4 (en) | 2016-05-04 |
JPWO2014051098A1 (ja) | 2016-08-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6188577B2 (ja) | 粒子凝集測定用ラテックス粒子 | |
CN104335048B (zh) | 凝集测定用胶乳粒子 | |
CN103460046B (zh) | 测定试剂用胶乳粒子、致敏胶乳粒子及免疫比浊法用测定试剂 | |
JPH07107537B2 (ja) | アビジン−及びビオチン−固定試薬,分析要素並びにその使用法 | |
CN104535761B (zh) | 超支化聚缩水甘油醚修饰胶乳微球增强免疫比浊法及其应用 | |
CN104662426B (zh) | 粒子凝集测定用胶乳粒子 | |
JPWO2018062557A1 (ja) | 測定試薬用ラテックス粒子、感作ラテックス粒子及び免疫比濁法用測定試薬 | |
CN102203612B (zh) | 用于抗磷脂抗体测定试剂的不溶性载体、抗磷脂抗体测定试剂及抗磷脂抗体的测定方法 | |
JPH01104621A (ja) | ポリマーラテックス組成物の製造方法 | |
JPS585658A (ja) | 免疫血清学的検査試薬用担体 | |
EP0280556B1 (en) | Water-insoluble particle and immunoreactive reagent, analytical elements and methods of use | |
JP3452218B2 (ja) | 診断試薬用ポリマーラテックスおよび診断薬 | |
JP2005241363A (ja) | 測定試薬用担体粒子及び測定試薬 | |
JP2006329959A (ja) | 測定試薬用担体粒子及び測定試薬 | |
JP2006329958A (ja) | 測定試薬用担体粒子及び測定試薬 | |
JPH03281510A (ja) | 診断薬用担体用ポリマー粒子の製造方法 | |
JP2004325416A (ja) | 測定試薬用担体粒子ラテックス及び測定試薬 | |
JPH11201970A (ja) | 免疫測定試薬の製造方法および免疫測定法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |