WO2023190003A1

WO2023190003A1 - シアリルルイス抗原の測定方法、測定用試薬及び測定用キット

Info

Publication number: WO2023190003A1
Application number: PCT/JP2023/011434
Authority: WO
Inventors: 明清水; 仁小野
Original assignee: ミナリスメディカル株式会社
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2023-03-23
Publication date: 2023-10-05

Abstract

水性媒体中で、試料中のシアリルルイス抗原を、前記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と反応させる、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法であって、前記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである方法を開示する。

Description

シアリルルイス抗原の測定方法、測定用試薬及び測定用キット

　本発明は、シアリルルイス抗原の測定方法、測定用試薬及び測定用キットに関する。

　近年、癌マーカーとして使用される糖鎖抗原である、シアリルルイス抗原に対する抗体が多数報告されている。その中でもモノクローナル抗体ＤＵＰＡＮ－２は、ヒト膵癌培養細胞ＨＰＡＦを免疫原として用いて作製されたモノクローナル抗体であり、膵癌細胞から高率に産生されるムチン様タンパク質（抗原）に反応することが報告されている（非特許文献１、２）。この抗原は、ＤＵＰＡＮ－２抗原と呼ばれており、膵癌及び胆道系癌などの癌マーカーとして用いられている。

　ＤＵＰＡＮ－２抗原の測定方法としては、ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（非特許文献１）及びＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（特許文献１）が報告されている。

　前述の測定方法は、試料中のＤＵＰＡＮ－２抗原と、ＤＵＰＡＮ－２抗原に結合する抗体と、を抗原抗体反応させ免疫複合体を形成させたのち、免疫複合体中の標識の量を測定することにより、ＤＵＰＡＮ－２抗原を測定することを原理とする標識法が用いられている。しかしながら、これらの標識法は、一般的に、免疫複合体中の標識の量を測定する前に、試料中に含まれるＤＵＰＡＮ－２抗原以外の物質を取り除くために、洗浄液を用いて洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行う必要があり、測定に時間を要する。

　一方、標識を使用しない免疫測定法の１つにラテックス凝集免疫測定方法がある（特許文献２、３）。ラテックス凝集免疫測定方法は、測定対象成分に結合する抗体、又は抗原を結合したラテックス粒子を用いて、試料中の測定対象成分と抗原抗体反応を起こさせ、ラテックス粒子の凝集による濁度変化を吸光度として測定する方法であり、Ｂ／Ｆ分離が不要な方法であるため、生化学検査用の汎用自動分析機での測定にも適用されている。しかしながら、ラテックス凝集免疫測定方法は測定感度が悪いという問題があり、高感度が必要とされる測定対象成分の測定には適用が難しい。また、ラテックス凝集免疫測定方法にはＢ／Ｆ分離工程が含まれないため、試料に含まれる夾雑物に起因する非特異反応の影響を受けやすく、正確な測定が難しいという課題もある。

国際公開第２０１９／１８９８７４号特開２００６－０１７７４５号公報特開２０１４－１５３１０２号公報

Metzgarら、"Detection of a pancreatic cancer-associated antigen (DU-PAN-2antigen) in serum and ascites of patients with adenocarcinoma"、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、1984年、81巻、5242-5246頁櫻林ら、「膵癌関連糖蛋白抗原，ＤＵ－ＰＡＮ－２に関する研究Ｉ．酵素免疫測定法における基礎的検討および健常人の測定値の分布」、臨床病理、1986年、34巻、705-710頁

　シアリルルイス抗原は、癌マーカーとして用いられているため、より高感度な測定ができる測定用試薬及び測定用キットが必要とされていた。本発明の課題は、高感度な、試料中のシアリルルイス抗原の測定方法、測定用試薬及び測定用キットを提供することにある。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍであるラテックス粒子を用いたラテックス凝集免疫測定方法は、シアリルルイス抗原を高感度に測定可能である、という知見を見出し、本開示内容の発明を完成するに至った。

　すなわち、本開示は一態様において以下を提供する。
［１］水性媒体中で、試料中のシアリルルイス抗原を、上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と反応させる、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法であって、上記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである方法。
［２］上記試料を超音波で処理することを含む、［１］に記載の方法。
［３］（１）シアリルルイス抗原を含む試料を、水性媒体と混合する工程；及び
　（２）工程（１）で得られた溶液中で、試料中のシアリルルイス抗原を、上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と反応させる工程、を含み、
　工程（２）における上記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法。
［４］上記工程（１）の後、及び／又は、上記工程（２）の後に、上記試料を超音波で処理することを含む、［３］に記載の方法。
［５］上記工程（１）及び／又は上記工程（２）が金属イオンの存在下で行われる、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］上記金属イオンが二価以上の金属イオンである、［５］に記載の方法。
［７］上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、上記ラテックス粒子との結合が化学結合である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記シアリルルイス抗原がＤＵＰＡＮ－２抗原である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。

［９］シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含み、上記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用試薬。
［１０］上記ラテックス凝集免疫測定が、試料を超音波で処理することを含む、［９］に記載の試薬。
［１１］試料を超音波で処理することが記載された説明書を含む、［９］に記載の試薬。
［１２］超音波処理機能を備える分析装置に用いるための、［９］に記載の試薬。
［１３］金属イオンを含む、［９］～［１２］のいずれかに記載の試薬。
［１４］上記金属イオンが二価以上の金属イオンである、［１３］に記載の試薬。
［１５］上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、上記ラテックス粒子との結合が化学結合である、［９］～［１４］のいずれかに記載の試薬。
［１６］上記シアリルルイス抗原がＤＵＰＡＮ－２抗原である、［９］～［１５］のいずれかに記載の試薬。

［１７］水性媒体を含む第１試薬と、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含む第２試薬と、を含み、上記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用キット。
［１８］上記ラテックス凝集免疫測定が、試料を超音波で処理することを含む、［１７］に記載のキット。
［１９］試料を超音波で処理することが記載された説明書を含む、［１７］に記載のキット。
［２０］超音波処理機能を備える分析装置に用いるための、［１７］に記載のキット。
［２１］上記第１試薬及び／又は上記第２試薬に金属イオンを含む、［１７］～［２０］のいずれかに記載のキット。
［２２］上記金属イオンが二価以上の金属イオンである、［２１］に記載のキット。
［２３］上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、上記ラテックス粒子との結合が化学結合である、［１７］～［２２］のいずれかに記載のキット。
［２４］上記シアリルルイス抗原がＤＵＰＡＮ－２抗原である、［１７］～［２３］のいずれかに記載のキット。

　本開示によれば、高感度な、試料中のシアリルルイス抗原の測定方法、測定用試薬及び測定用キットを提供することができる。

　以下、本開示を実施するための形態について詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより開示の範囲が狭く解釈されることはない。なお、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。また、溶液中の各成分の量は、溶液中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、反応中又は試薬中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。

　本開示において、「％（ｗ／ｖ）」とは、体積（１００ｍＬ）を基準とする質量（ｇ）の百分率を意味する。

　本開示において、抗体とシアリルルイス抗原とが「結合する」、「反応する」、あるいは抗体がシアリルルイス抗原を「認識する」と表現する場合、本開示の分野で通常使用される意味を含み、いずれも同義で用いる。抗体とシアリルルイス抗原とが「結合する」ことを確認する方法としては、当業者に周知の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法、免疫クロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法等の原理を利用した方法などにより行うことができる。

「試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法」
　本開示における試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法の一実施形態は、水性媒体中で、試料中のシアリルルイス抗原を、上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合した、平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍであるラテックス粒子と反応させる、方法である。

「水性媒体」
　本開示の測定方法における水性媒体としては、脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、酢酸緩衝液、グッド緩衝剤等が挙げられる。緩衝剤は、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。

　水性媒体には、塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含まれていてもよい。塩類としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。金属イオンとしては、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。蛋白質としては、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す）等が挙げられる。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。

「試料」
　本開示の測定方法における試料としては、シアリルルイス抗原を含む可能性がある試料であれば特に制限はなく、全血、血漿、血清、尿、腹水、髄液、唾液、羊水、尿、汗及び膵液からなる群から選択されるいずれか１以上の生体試料等が挙げられ、好ましくは全血、血漿、血清、腹水等が挙げられる。

　本開示の測定方法における試料は、シアリルルイス抗原を産生する、遺伝子組換え微生物、遺伝子組換え動物細胞、又は培養癌細胞の細胞可溶化物（ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）であってもよいし、上記遺伝子組換え微生物、上記遺伝子組換え動物細胞又は上記培養癌細胞を培養した際に得られる培養上清であってもよい。

　微生物としては、例えば酵母が挙げられ、動物細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。培養癌細胞としては、例えば、培養膵癌細胞、培養大腸癌細胞、培養肝癌細胞、培養胆道癌細胞、培養乳癌細胞、培養卵巣癌細胞等が挙げられる。

　本開示の測定方法における試料は、シアリルルイス抗原を含む水性媒体であってもよく、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、以下、ＰＢＳと記す）等で希釈されたシアリルルイス抗原が挙げられる。水性媒体に含まれるシアリルルイス抗原は、上記生体試料、上記細胞可溶化物、又は上記培養上清から精製されたシアリルルイス抗原等を用いることができる。

「シアリルルイス抗原」
　本開示の測定方法におけるシアリルルイス抗原は、糖鎖抗原であり、細胞の癌化に伴って癌細胞にて発現が亢進する。それゆえシアリルルイス抗原は、癌マーカーとして用いられている。本開示におけるシアリルルイス抗原は、シアリルルイス抗原を認識する抗体が結合するムチン様タンパク質（糖タンパク質）、シアリルルイス糖鎖、又は当該糖鎖を有するペプチドをいう。シアリルルイス抗原としては、例えば、ＣＡ－１９－９（シアリルルイスＡ抗原）、ＤＵＰＡＮ－２抗原（シアリルルイスＣ抗原）、ＳＬＸ（シアリルルイスＸ－ｉ抗原）、ＣＳＬＥＸ（シアリルルイスＸ抗原）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原等が挙げられ、好ましくはＤＵＰＡＮ－２抗原が挙げられる。シアリルルイス抗原は、特に制限されないが、例えば、癌患者の血清、又は培養癌細胞の培養上清に含まれるシアリルルイス抗原等を使用することができる。

「ＤＵＰＡＮ－２抗原」
　本開示の測定方法におけるＤＵＰＡＮ－２抗原は、モノクローナル抗体「ＤＵＰＡＮ－２」（Metzgarら、“Antigens of Human Pancreatic Adenocarcinoma Cells Defined by Murine Monoclonal Antibodies”、CANCER RESEARCH(1982)、42:601-608）が結合するムチン様タンパク質（糖タンパク質）、モノクローナル抗体「ＤＵＰＡＮ－２」が結合する糖鎖、又は当該糖鎖を含むペプチドをいう。具体的には、ＤＵＰＡＮ－２抗原は、モノクローナル抗体「ＤＵＰＡＮ－２」が結合すると報告されているシアリルルイスＣ糖鎖（Kawaら、“Epitope Analysis of Span-1 andDUPAN-2 using Synthesized Glycoconjugates Sialyllact-N-Fucopentaose II and Sialyllact-N-Tetraose”、Pancreas (1994)、9(6):692-697）、当該糖鎖を有するタンパク質、又は当該糖鎖を有するペプチドをいう。ＤＵＰＡＮ－２抗原は、ヒト膵癌患者の腹水、又はヒト膵癌培養細胞ＨＰＡＦの培養上清に含まれるＤＵＰＡＮ－２抗原を使用することができる。ヒト膵癌培養細胞ＨＰＡＦは、「ＨＰＡＦ－ＩＩ」という名称でＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手することができる。

「シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片」
　本開示の測定方法において、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片とは、シアリルルイス抗原のシアリルルイス糖鎖を認識し、シアリルルイス抗原に結合することができる抗体をいう。シアリルルイス抗原はエピトープを複数有する高分子（多価抗原）であるため、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片は、１種類であってもよく、２種類（シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片、及び、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片）であってもよい。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が２種類である場合、第１抗体又はその抗原結合性断片と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片とは、それぞれの抗体が結合するシアリルルイス抗原の部位（エピトープ）は同じであっても、異なっていてもよい。また、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片とは同一の抗体であってもよいし、異なる抗体であってもよい。

　本開示の測定方法において、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片のうちＤＵＰＡＮ－２抗原に結合する抗体又はその抗原結合性断片は、国際公開第２０１９／１８９８７４号に開示される、下記糖鎖構造を有するＤＵＰＡＮ－２抗原
と反応し、かつ、
下記糖鎖構造を有するＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原
と反応しない抗体又はその抗原結合性断片であってよく、上記ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原に対する反応性が上記ＤＵＰＡＮ－２抗原に対する反応性の１０％未満である抗体又はその抗原結合性断片であってよく、上記ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原に対する反応性が上記ＤＵＰＡＮ－２抗原に対する反応性の１％未満である抗体又はその抗原結合性断片であってよい。また、ＤＵＰＡＮ－２抗原に結合するモノクローナル抗体としては、前述のモノクローナル抗体「ＤＵＰＡＮ－２」（Metzgarら、“Antigens of Human Pancreatic Adenocarcinoma Cells Defined by Murine Monoclonal Antibodies”、CANCER RESEARCH(1982),42:601-608）等が挙げられる。なお、本開示において、当該モノクローナル抗体ＤＵＰＡＮ－２を「ＤＵＰＡＮ－２抗体」とも記載する。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体は、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体であってよく、又は他の種由来抗体であってもよい。また、シアリルルイス抗原を認識する抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体等が挙げられ、均質性及び安定性の観点からはモノクローナル抗体が好ましい。

　本開示の測定方法において、抗原結合性断片とは、上記シアリルルイス抗原を認識する抗体の一部であって、抗体の可変ドメインを含むか、少なくとも抗原結合領域を含むものをいう。本開示における抗原結合性断片としては、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）_２、Ｆａｂ_３、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びミニボディが挙げられる。「Ｆｖ断片」は最小の抗原結合性断片であり、完全な抗原認識領域と抗原結合領域を含む。

　本開示の測定方法におけるシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片は、シアリルルイス抗原、又はシアリルルイス抗原を産生する癌細胞を免疫原として用いて、通常の抗体の作製方法により取得することができる。例えば、上記免疫原を動物に免疫することで得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合した細胞（ハイブリドーマ）を作製し、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を得ることにより取得することができる。

「ラテックス粒子」
　本開示における試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法は、平均粒径（Ｄ５０）が２００ｎｍ～４００ｎｍであるラテックス粒子（以下、単に「ラテックス粒子」とも記載する。）を使用することにより、シアリルルイス抗原を高感度に測定することができる。

　本開示の測定方法において、ラテックス粒子としては平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍであれば特に制限はなく、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とし、又は後述の本開示の測定用試薬若しくは測定用キットに使用可能なラテックス粒子であればよい。ラテックス粒子の平均粒径としては、例えば、２００ｎｍ～２５０ｎｍ、２５０ｎｍ～３００ｎｍ、３００ｎｍ～３５０ｎｍ、３５０ｎｍ～４００ｎｍ、２００ｎｍ～３００ｎｍ、２５０ｎｍ～３５０ｎｍ、３００ｎｍ～４００ｎｍ、２００ｎｍ～３５０ｎｍ、２５０ｎｍ～４００ｎｍであってもよい。平均粒径（Ｄ５０）は、例えば、レーザー回折式粒度分布計にて測定することができる。平均粒径（Ｄ５０）は、粒度分布における積算値５０％（体積基準）での粒径を平均粒径とする。ラテックス粒子の形状としては、特に制限はなく、例えば、球状、楕円上、凹凸形状等が挙げられる。

　上記ラテックス粒子としては、例えば、有機高分子物質の微粒子、無機酸化物の微粒子、核となる上記微粒子の表面を有機物等で表面処理した微粒子等が挙げられる。具体的には、例えば、ポリスチレン、スチレンを主成分とする共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、（メタ）アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂等が挙げられる。上記ラテックス粒子は、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。これらの中でも、特にポリスチレン系の合成高分子、電荷を与える為に成分としてアクリル酸系のモノマー、スルホン酸を有するモノマー等を共重合したポリスチレン系の合成高分子が好ましい。

　上記ラテックス粒子は、ポリスチレンラテックス粒子が特に好ましく用いられる。ポリスチレンラテックス粒子等の表面の疎水性が強いラテックスを用いると、タンパク質及びペプチドの吸着をスムーズにすることができる。また、乳化剤として界面活性剤を用いないソープフリー重合によって得られるポリスチレンラテックス粒子は、表面の負電荷同士の反発に基づき、界面活性剤なしでも安定に存在できるので特に好ましい。その他、種々の変性ラテックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）、磁性ラテックス（磁性粒子を内包させたラテックス）等を必要に応じて用いることもできる。

「シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子」
　本開示の測定方法において、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子とは、上記ラテックス粒子に、上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片（シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗体断片、及び、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗体断片を含む）が結合しているラテックス粒子をいう。言い換えると、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が、ラテックス粒子に担持されているということもできる。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、ラテックス粒子との結合方法としては、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とし、又は、後述の本開示の測定用試薬若しくは測定用キットに使用可能な結合方法であれば特に制限はなく、物理吸着による結合、化学結合による結合等が挙げられる。物理吸着としては、静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、共有結合、配位結合等が挙げられる。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、ラテックス粒子に結合させてもよいし、間接的にラテックス粒子に結合させてもよい。間接的な結合方法としては、ビオチンとアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）等の一組の親和性物質の特異的結合を利用して、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片をラテックス粒子に結合する方法、リンカーを介した共有結合によりラテックス粒子に結合する方法等が挙げられる。

　一組の親和性物質を用いる場合、一組の親和性物質の一方（Ａ）が結合したシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、一組の親和性物質の他方（ａ）が結合したラテックス粒子とを、結合させることにより、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を生成させることができる。

　Ａ－ａの組み合わせとしては、以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）との組み合わせ；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）とビオチンとの組み合わせ；
・シアリルルイス抗原を認識する抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ領域と結合する抗体との組み合わせ。

　リンカーとしては、ラテックス粒子表面の官能基と、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が有する官能基との両者を共有結合できる分子等が挙げられ、例えば、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、ラテックス粒子表面の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同時に持つ分子であって、第１の反応活性基と第２の反応活性基とが異なる基である分子が好ましく用いられる。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が有する官能基、及びラテックス粒子がその表面に保持している官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ－ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。

「ラテックス凝集免疫測定方法」
　本開示の測定方法において、ラテックス凝集免疫測定方法は、水性媒体中で、試料中のシアリルルイス抗原と、上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を反応させ、上記シアリルルイス抗原と、上記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を含む複合体を形成させ、ラテックス粒子を選択的に凝集させる方法であり得る。当該凝集は、吸光度又は散乱光等を測定することにより検出することができる。

　シアリルルイス抗原を上記ラテックス粒子と「反応させる」には、例えば、水性媒体にシアリルルイス抗原、及び上記ラテックス粒子を添加すればよい。また、水性媒体中でシアリルルイス抗原、及び上記ラテックス粒子を混合してもよい。

　上記ラテックス凝集免疫測定方法は、ホールピペット等の溶液分注用の器具、ラテックス凝集免疫反応のための加温用の恒温槽、吸光度又は散乱光の測定機器などを組み合わせて使用する、いわゆる用手法で実施してもよく、機器上で一連の溶液分注、加温、吸光度又は散乱光の測定を行う、いわゆる自動分析装置を使用して実施してもよい。上記自動分析装置は、特に制限はないが、例えば、試料、測定用試薬又はそれらの混合液の攪拌のため、上記混合液等が入った反応セルへ棒又はヘラ状の攪拌用部材を差し込み、その後に、上記攪拌用部材を前後若しくは左右に移動させる機構、又は、上記攪拌用部材を回転させる機構（以下、ヘラ攪拌機構と記載する）を備えた自動分析装置であってもよく、試料、測定用試薬又はそれらの混合液の攪拌のため、上記混合液等が入った反応セルの外側から超音波をあてる機構（以下、超音波攪拌機構と記載する）を備えた自動分析器であってもよい。

　上記ヘラ攪拌機構を備えた自動分析装置としては、特に制限はないが、例えば、自動分析装置３５００、自動分析装置７１８０（以上、日立ハイテク社製）、ＪＣＡ－ＺＳ０５０自動分析装置クリナライザ　ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ（登録商標）ＺＥＲＯ、ＪＣＡ－ＢＭ９１３０自動分析装置クリナライザ　ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ（以上、日本電子社製）、ＴＢＡ（登録商標）－ｃ１６０００、ＴＢＡ－１２０ＦＲ（以上、キヤノンメディカルシステムズ社製）、自動分析装置ＡＵ５８００、及び自動分析装置ＡＵ６８０（以上、ベックマンコールター社製）が挙げられる。上記超音波攪拌機構を備えた自動分析装置としては、特に制限はないが、例えば、自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ（登録商標）００３、自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ（登録商標）　００６、及び自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ（登録商標）　００８α（以上、日立ハイテク社製）が挙げられる。

「超音波で処理する」
　本開示におけるラテックス凝集免疫測定方法は、感度が高くなるという観点から、試料を超音波で処理すること（超音波処理）を含んでいてもよい。「超音波で処理する」とは、上記のとおり超音波で攪拌することであってもよい。また、「試料を超音波で処理する」とは、試料そのものを超音波で処理することのほか、例えば、試料と水性媒体とを混合した溶液を超音波処理すること、試料と後述の試料希釈試薬とを混合した溶液を超音波処理すること、試料と後述の「試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用試薬」とを混合した溶液を超音波処理すること、試料と後述の「試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用キット」に含まれる各試薬とを混合した溶液を超音波処理すること等を含んでいてもよい。超音波処理は、超音波処理することのできる任意の装置によって行うことができ、例えば、上記の装置が挙げられる。超音波処理の時間は、本開示の測定方法が可能な限り制限されないが、例えば、３０秒間以下、２０秒間以下、又は１０秒間以下であってよい。超音波処理の時間は、例えば、５秒間以上、３秒間以上、１秒間以上、又は０．５秒間以上であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　試料中のシアリルルイス抗原を、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と反応させる時間は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば、１０秒間以上、２０秒間以上、３０秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、又は５分間以上であってよい。また、上記の反応時間は、例えば、１時間以下、５０分間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、９分間以下、７分間以下、又は６分間以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　試料中のシアリルルイス抗原を、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と反応させる温度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、０℃以上、４℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上又は３７℃以上であってよく、５０℃以下、４５℃以下又は４０℃以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　上記反応におけるシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、０．００３％（ｗ／ｖ）以上、０．００５％（ｗ／ｖ）以上、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１２％（ｗ／ｖ）以上、又は０．０１３％（ｗ／ｖ）以上であってよい。また、上記反応におけるシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０８％（ｗ／ｖ）以下、０．０６％（ｗ／ｖ）以下、０．０５％（ｗ／ｖ）以下、０．０４％（ｗ／ｖ）以下、０．０３％（ｗ／ｖ）以下、０．０２５％（ｗ／ｖ）以下、０．０２％（ｗ／ｖ）以下、又は０．０１５％（ｗ／ｖ）以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　本開示における試料中のシアリルルイス抗原の測定方法の一実施形態は、
（１）シアリルルイス抗原を含む試料を、水性媒体と混合する工程；及び
（２）工程（１）で得られた溶液中で、試料中のシアリルルイス抗原を、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合した、平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍであるラテックス粒子と反応させる工程、を含む。

「工程（１）」
　工程（１）は、シアリルルイス抗原を含む試料を、水性媒体と混合する工程である。工程（１）において、水性媒体にシアリルルイス抗原を含む試料を添加して混合させてもよいし、シアリルルイス抗原を含む試料に水性媒体を添加して混合させてもよい。上記工程（１）における水性媒体としては、特に制限はなく、例えば前述の水性媒体が挙げられる。シアリルルイス抗原としては、例えば前述のシアリルルイス抗原が挙げられ、好ましくはＤＵＰＡＮ－２抗原が挙げられる。

　工程（１）において、シアリルルイス抗原を含む試料を、水性媒体と混合した後、一定時間、一定温度で保持してもよい。上記混合液を保持する時間は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば、１０秒間以上、２０秒間以上、３０秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、又は５分間以上であってよく、１時間以下、５０分間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、９分間以下、７分間以下、又は６分間以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　上記混合液を保持する温度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、０℃以上、４℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５度以上、３０℃以上、又は３７℃以上であってよく、５０℃以下、４５℃以下又は４０℃以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

「工程（２）」
　工程（２）は、工程（１）で得られた溶液中で、試料中のシアリルルイス抗原を、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と反応させる工程である。

　工程（２）において、シアリルルイス抗原に、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が反応し、シアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を含む複合体が生じる。なお、生体試料中のシアリルルイス抗原は、前述したとおり、多価抗原であるため、１種類の抗体を使用した場合であっても、シアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子とを含む複合体が生じ得る。

　工程（２）において、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子に、工程（１）で得られた溶液を添加して反応させてもよいし、工程（１）で得られた溶液に、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を添加して反応させてもよい。なお、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子としては例えば、前述のシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を用いることができる。

　工程（２）において、２種類以上のシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片を使用してもよい。２種類のシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片を用いる場合、工程（２）を以下のように行うことができる。また、本開示における測定方法は、工程（２Ａ）の後に後述の工程（３）を含むこともできる。
（２Ａ）工程（１）で得られた溶液中で、試料中のシアリルルイス抗原を、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子、及び、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と反応させる工程。

　工程（２Ａ）において、シアリルルイス抗原に、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片とが反応し、シアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子とを含む複合体が生成する。

　工程（２Ａ）において、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子におけるラテックス粒子と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子におけるラテックス粒子とは、同じであっても異なっていてもよい。

　工程（２Ａ）における反応は、上記複合体が生成する反応であれば特に制限はなく、例えば、シアリルルイス抗原に、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を反応させ、シアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子とを含む複合体を生成させた後に、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を添加して反応させてもよい。又はシアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を混合して反応させてもよい。

　シアリルルイス抗原に、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を混合して反応させる場合、これらを添加する順番に制限はなく、例えば、シアリルルイス抗原に、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子、及びシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を添加してもよい。又はシアリルルイス抗原に、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を混合した後に、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を添加してもよい。又はシアリルルイス抗原を認識する第１抗体若しくはその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体若しくはその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を混合した後に、シアリルルイス抗原を添加してもよい。

　工程（２Ａ）は、前述のとおり以下の工程（２Ａ－１）と工程（２Ａ－２）に分けて行ってもよい。また、本開示における測定方法は、工程（２Ａ－２）の後に後述の工程（３）を含むこともできる。
（２Ａ－１）工程（１）で得られた溶液中で、試料中のシアリルルイス抗原に、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を反応させ、シアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を含む複合体１を生成させる工程；及び
（２Ａ－２）水性媒体中で、工程（２Ａ－１）で生成した複合体１に、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を反応させ、シアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と、を含む複合体２を生成させる工程。

　工程（２）又は、工程（２Ａ）の反応時間は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば、１０秒間以上、２０秒間以上、３０秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、又は５分間以上であってよく、１時間以下、５０分間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、９分間以下、７分間以下、又は６分間以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。なお、工程（２Ａ）を工程（２Ａ－１）及び工程（２Ａ－２）に分けて行う場合、上記反応時間はそれぞれの工程の反応時間であってもよいし、それぞれの工程の反応時間の合計であってもよい。

　工程（２）又は、工程（２Ａ）の反応温度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、０℃以上、４℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上又は３７℃以上であってよく、５０℃以下、４５℃以下又は４０℃以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。なお、工程（２Ａ）を工程（２Ａ－１）及び工程（２Ａ－２）に分けて行う場合、上記反応温度はそれぞれの工程で同じであってもよいし、異なっていてもよい。

　工程（２）又は、工程（２Ａ）における、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、０．００３％（ｗ／ｖ）以上、０．００５％（ｗ／ｖ）以上、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１２％（ｗ／ｖ）以上、又は０．０１３％（ｗ／ｖ）以上であってよい。また、上記工程（２）又は、工程（２Ａ）における、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０８％（ｗ／ｖ）以下、０．０６％（ｗ／ｖ）以下、０．０５％（ｗ／ｖ）以下、０．０４％（ｗ／ｖ）以下、０．０３％（ｗ／ｖ）以下、０．０２５％（ｗ／ｖ）以下、０．０２％（ｗ／ｖ）以下、又は０．０１５％（ｗ／ｖ）以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。なお、工程（２Ａ）において、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒の濃度の合計を意味する。

　工程（２）は水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。また、上記工程（２）は、前述の塩類、糖類、蛋白質等の存在下で行われてもよい。

　上記工程（１）の後及び／又は工程（２）若しくは工程（２Ａ）の後に、超音波で処理することを含んでいてもよい。超音波処理は、前述の超音波処理と同様とすることができる。工程（２Ａ）を工程（２Ａ－１）及び工程（２Ａ－２）に分けて行う場合、工程（２Ａ－１）の後及び／又は工程（２Ａ－２）の後に、超音波で処理することを含んでいてもよい。

「金属イオン」
　上記工程（１）及び／又は工程（２）若しくは工程（２Ａ）は、金属イオンの存在下で行われてもよい。工程（２Ａ）を工程（２Ａ－１）及び工程（２Ａ－２）に分けて行う場合、工程（２Ａ－１）及び／又は工程（２Ａ－２）は、金属イオンの存在下で行われてもよい。

　本開示において、金属イオンは、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とし、又は後述の本開示の測定用試薬若しくは測定用キットに使用可能な金属イオンであれば特に制限はなく、例えば、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。本開示の測定方法において、金属イオンの価数は特に制限はないが、例えば、一価、二価、三価、四価等が挙げられ、感度が高くなるという観点から、二価以上が好ましい。

　二価以上の金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン等のアルカリ土類金属イオン；チタンイオン、クロムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン等の第一遷移元素イオン等が挙げられる。

　上記工程における金属イオンの濃度としては、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．９ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、又は９ｍｍｏｌ／Ｌ以上であってよい。また、上記工程における金属イオンの濃度は、例えば、１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、９００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、８００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、６００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、６０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、又は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。

　上記の数値は自由に組み合わせることができる。なお、上記工程において、１種類の金属イオンが存在していてもよいし、２種類以上の金属イオンが存在していてもよい。２種類以上の金属イオンが存在する場合、上記濃度は、当該２種類以上の金属イオンの濃度の合計を意味する。上記金属イオン濃度は、それぞれの工程において同じ濃度でもよく、異なる濃度であってもよい。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片（シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片、又はシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片を含む）は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、ラテックス粒子に結合させてもよいし、間接的にラテックス粒子に結合させてもよい。間接的な結合方法としては、前述の一組の親和性物質の特異的結合を利用して、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片、又はシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片をラテックス粒子に結合する方法、リンカーを介した共有結合によりラテックス粒子に結合する方法等が挙げられる。

　一組の親和性物質を用いる場合、一組の親和性物質の一方（Ａ）が結合したシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、一組の親和性物質の他方（ａ）が結合したラテックス粒子とを、結合させることにより、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片を結合したラテックス粒子、を生成させることができる。Ａ－ａの組み合わせとしては、前述の組み合わせ等が挙げられる。リンカーとしては、前述の分子等が挙げられる。

　工程（２）又は、工程（２Ａ）において、水性媒体中で、ラテックス粒子に、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片を結合させてもよい。この場合、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片の、ラテックス粒子への結合方法としては、例えば前述の結合方法が挙げられる。

「工程（３）」
　本開示における測定方法は、上記工程（２）の後に、以下の工程（３）を含むこともできる。
（３）シアリルルイス抗原と、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子との反応により生じる、ラテックス粒子の凝集を測定し、測定値を得る工程。

　工程（３）は、上記工程（２）の複合体、上記工程（２Ａ）の複合体、又は上記工程（２Ａ－２）の複合体２の生成に伴うラテックス粒子の凝集を光学的手段により測定する工程である。凝集を光学的に測定する方法としては、吸光度、散乱光強度又は透過光強度を光学機器で測定する方法等が挙げられる。

　吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ～９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。反応温度は１０～５０℃であることが好ましく、２０～４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では５～１５分間の反応時間で測定することができる。

　上記工程（１）から（３）に加え、以下の工程（４）及び工程（５）を行うことにより、試料中のシアリルルイス抗原の濃度を決定することもできる。
（４）試料として既知濃度のシアリルルイス抗原を用いて、上記工程（１）から（３）を行い、シアリルルイス抗原濃度と測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）の測定により得られた測定値とから、試料中のシアリルルイス抗原の濃度を決定する工程。

　既知濃度のシアリルルイス抗原としては、癌患者の血清由来のシアリルルイス抗原又は培養癌細胞由来のシアリルルイス抗原をＰＢＳで希釈したシアリルルイス抗原溶液等が挙げられる。既知濃度のシアリルルイス抗原について、複数の濃度を用意してもよい。

　既知濃度のシアリルルイス抗原におけるシアリルルイス抗原の濃度としては、シアリルルイス抗原の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、例えば、１Ｕ／ｍＬ以上、５Ｕ／ｍＬ以上、６Ｕ／ｍＬ以上、７Ｕ／ｍＬ以上、８Ｕ／ｍＬ以上、９Ｕ／ｍＬ以上、１０Ｕ／ｍＬ以上、２０Ｕ／ｍＬ以上、２５Ｕ／ｍＬ以上、３０Ｕ／ｍＬ以上、４０Ｕ／ｍＬ以上、５０Ｕ／ｍＬ以上、６０Ｕ／ｍＬ以上、７０Ｕ／ｍＬ以上、８０Ｕ／ｍＬ以上、９０Ｕ／ｍＬ以上、１００Ｕ／ｍＬ以上、２００Ｕ／ｍＬ以上、３００Ｕ／ｍＬ以上、４００Ｕ／ｍＬ以上、５００Ｕ／ｍＬ以上、６００Ｕ／ｍＬ以上、７００Ｕ／ｍＬ以上、８００Ｕ／ｍＬ以上、９００Ｕ／ｍＬ以上、１０００Ｕ／ｍＬ以上、１１００Ｕ／ｍＬ以上、１２００Ｕ／ｍＬ以上、１３００Ｕ／ｍＬ以上、１４００Ｕ／ｍＬ以上、１５００Ｕ／ｍＬ以上、１６００Ｕ／ｍＬ以上、１７００Ｕ／ｍＬ以上、又は１８００Ｕ／ｍＬ以上であってよい。また、既知濃度のシアリルルイス抗原におけるシアリルルイス抗原の濃度は、例えば、１５０００Ｕ／ｍＬ以下、１４０００Ｕ／ｍＬ以下、１３０００Ｕ／ｍＬ以下、１２０００Ｕ／ｍＬ以下、１１０００Ｕ／ｍＬ以下、１００００Ｕ／ｍＬ以下、９０００Ｕ／ｍＬ以下、８０００Ｕ／ｍＬ以下、７０００Ｕ／ｍＬ以下、６０００Ｕ／ｍＬ以下、５０００Ｕ／ｍＬ以下、４０００Ｕ／ｍＬ以下、３７００Ｕ／ｍＬ以下、３６００Ｕ／ｍＬ以下、３５００Ｕ／ｍＬ以下、３０００Ｕ／ｍＬ以下、２０００Ｕ／ｍＬ以下、１８００Ｕ／ｍＬ以下、１６００Ｕ／ｍＬ以下、１４００Ｕ／ｍＬ以下、１２００Ｕ／ｍＬ以下、１１００Ｕ／ｍＬ以下、１０００Ｕ／ｍＬ以下、９００Ｕ／ｍＬ以下、８００Ｕ／ｍＬ以下、７００Ｕ／ｍＬ以下、６００Ｕ／ｍＬ以下、５００Ｕ／ｍＬ以下、４００Ｕ／ｍＬ以下、３５０Ｕ／ｍＬ以下、３００Ｕ／ｍＬ以下、又は２００Ｕ／ｍＬ以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　なお、シアリルルイス抗原の濃度単位「Ｕ／ｍＬ」は、前述のシアリルルイス抗原について、それぞれ定義される。例えば、ＤＵＰＡＮ－２抗原の濃度単位「Ｕ／ｍＬ」は、「特定の膵癌患者の血清を競合ラジオイムノアッセイ法により測定した場合の、当該血清に含まれるＤＵＰＡＮ－２抗原の濃度を１０００Ｕ／ｍＬする」と定義される（Metzgarら、“Detection of a pancreatic cancer-associated antigen (DU-PAN-2 antigen) in serum and ascites of patients with adenocarcinoma”、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、1984年,Vol.81,pp.5242-5246）。

「試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用試薬」
　本開示の試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用試薬は、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合した、平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍであるラテックス粒子を含む。また、本開示の測定用試薬は、前述の測定方法に用いられる試薬である。

　本開示の測定用試薬の一態様（態様１）としては、ラテックス粒子、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片を含む、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用試薬である。

　態様１において、ラテックス粒子と、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片とは、２つの親和性物質を介して結合することができる。シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片の、ラテックス粒子への結合方法としては、例えば前述の結合方法等が挙げられる。

　本開示の測定用試薬の別の態様（態様２）としては、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含む、試料中のシアリルルイス抗原の測定用試薬である。

　本開示の測定用試薬の別の態様（態様３）としては、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子、及びシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含む、試料中のシアリルルイス抗原の測定用試薬である。

　態様１～３の測定用試薬において、ラテックス粒子、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子（シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子、及びシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含む）は、例えば前述のシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を用いることができる。また、本開示の測定用試薬において、測定対象成分であるシアリルルイス抗原は例えば、前述のシアリルルイス抗原が挙げられ、好ましくはＤＵＰＡＮ－２抗原が挙げられる。

　態様２～３の測定用試薬におけるシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、ラテックス粒子に結合させてもよいし、間接的にラテックス粒子に結合させてもよい。間接的な結合方法としては、前述の一組の親和性物質の特異的結合を利用して、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片をラテックス粒子に結合する方法、リンカーを介した共有結合によりラテックス粒子に結合する方法等が挙げられる。

　一組の親和性物質を用いる場合、一組の親和性物質の一方（Ａ）が結合したシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、一組の親和性物質の他方（ａ）が結合したラテックス粒子とを結合させることにより、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片を結合したラテックス粒子を生成させることができる。Ａ－ａの組み合わせとしては、前述の組み合わせ等が挙げられる。リンカーとしては、前述の分子等が挙げられる。

　態様１～３の測定用試薬におけるラテックス粒子の濃度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、０．００３％（ｗ／ｖ）以上、０．００５％（ｗ／ｖ）以上、０．００８％（ｗ／ｖ）以上、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１５％（ｗ／ｖ）以上、０．０２％（ｗ／ｖ）以上、０．０３％（ｗ／ｖ）以上０．０４％（ｗ／ｖ）以上、又は０．０５％（ｗ／ｖ）以上であってよい。また、態様１～３の測定用試薬におけるラテックス粒子の濃度は、例えば、１％（ｗ／ｖ）以下、０．８％（ｗ／ｖ）以下、０．５％（ｗ／ｖ）以下、０．３％（ｗ／ｖ）以下、０．２％（ｗ／ｖ）以下、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０９％（ｗ／ｖ）以下、０．０８％（ｗ／ｖ）以下、０．０７％（ｗ／ｖ）以下、又は０．０６％（ｗ／ｖ）以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　態様３の試薬において、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度の合計を意味する。

　本開示の測定用試薬は、ラテックス凝集免疫測定用であり、当該ラテックス凝集免疫測定は、試料を前述の超音波で処理することを含んでいてもよい。そのため、本開示の測定用試薬は、超音波処理機能を備える分析装置に用いるための試薬とすることもできる。また、本開示の測定用試薬は、試料を超音波で処理することが記載された説明書を含んでいてもよい。

　上記超音波処理機能を備える分析装置は、超音波処理機能を備えていれば特に制限されないが、例えば、前述の超音波攪拌機構を備えた自動分析装置が挙げられる。

　上記説明書は、試料を超音波で処理することが記載されていれば特に制限はないが、例えば、前述の超音波で処理することができる装置等が記載された説明書が挙げられる。

　本開示の測定用試薬は、前述の金属イオンを含んでいてもよく、好ましくは二価以上の金属イオンを含んでいてもよい。本開示の測定用試薬における金属イオンの濃度としては、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．９ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、又は９ｍｍｏｌ／Ｌ以上であってよい。また、本開示の測定用試薬における金属イオンの濃度は、例えば、１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、９００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、８００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、６００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７５ｍｍｏｌ／ｍL以下、７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、６０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、又は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。

　上記の数値は自由に組み合わせることができる。なお、本開示の測定用試薬において、１種類の金属イオンを含んでいてもよいし、２種類以上の、金属イオンを含んでいてもよい。２種類以上の、金属イオンを含む場合、上記濃度は、当該２種類以上の、金属イオンの濃度の合計を意味する。

　試料中のシアリルルイス抗原を、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と反応させる時間は、前述の反応時間と同様にすることができ、例えば、１０秒間以上、２０秒間以上、３０秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、又は５分間以上であってよい。また、上記の反応時間は、例えば、１時間以下、５０分間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、９分間以下、７分間以下、又は６分間以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　試料中のシアリルルイス抗原を、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と反応させる温度は、前述の反応温度と同様とすることができ、０℃以上、４℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上又は３７℃以上であってよく、５０℃以下、４５℃以下又は４０℃以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　本開示の測定用試薬は、凍結乾燥状態でも液状でもよい。凍結乾燥状態の測定用試薬を使用する場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。溶解に用いる水性媒体としては、特に制限はなく、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含まれていてもよい。

　液状の測定用試薬においては、ラテックス粒子、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片、及びシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片からなる群より選ばれる少なくとも１種は、水性媒体で混合された状態となっている。水性媒体としては、特に制限はなく、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含まれてもよい。

「試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用キット」
　本開示の試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態を取ることもできる。

　本開示の試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用キットは、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合した、平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍであるラテックス粒子を含む。また、本開示の測定用キットは、前述の試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法に用いられるキットである。

　以下、本開示の、試料中のシアリルルイス抗原の測定用キットの態様を例示する。なお、後述の測定用キットの態様において、水性媒体、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子（シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子、及びシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含む）は、例えば前述の水性媒体、シアリルルイス抗原、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を用いることができる。本開示の測定用キットにおいて、測定対象成分であるシアリルルイス抗原は例えば、前述のシアリルルイス抗原が挙げられ、好ましくはＤＵＰＡＮ－２抗原が挙げられる。

［測定用キット（１）］
　水性媒体を含む第１Ａ試薬；及び
　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合した、ラテックス粒子を含む第２Ａ試薬
を含む、測定用キット。

［測定用キット（２）］
　水性媒体を含む第１Ｂ試薬；及び
　シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合した、ラテックス粒子、並びに、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合した、ラテックス粒子を含む第２Ｂ試薬
を含む、測定用キット。

［測定用キット（３）］
　水性媒体を含む第１Ｃ試薬；
　シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合した、ラテックス粒子を含む第２Ｃ試薬；及び
　シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合した、ラテックス粒子を含む第３Ｃ試薬
を含む、測定用キット。

　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片（シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片、又はシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片を含む）は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、ラテックス粒子に結合させてもよいし、間接的にラテックス粒子に結合させてもよい。間接的な結合方法としては、前述の一組の親和性物質の特異的結合を利用して、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片をラテックス粒子に結合する方法、リンカーを介した共有結合によりラテックス粒子に結合する方法等が挙げられる。

　一組の親和性物質を用いる場合、一組の親和性物質の一方（Ａ）が結合したシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、一組の親和性物質の他方（ａ）が結合したラテックス粒子とを、結合させることにより、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片を結合したラテックス粒子を生成させることができる。Ａ－ａの組み合わせとしては、前述の組み合わせ等が挙げられる。リンカーとしては、前述の分子等が挙げられる。

　第２Ａ試薬又は第２Ｂ試薬おけるシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、０．００３％（ｗ／ｖ）以上、０．００５％（ｗ／ｖ）以上、０．００８％（ｗ／ｖ）以上、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１５％（ｗ／ｖ）以上、０．０２％（ｗ／ｖ）以上、０．０３％（ｗ／ｖ）以上０．０４％（ｗ／ｖ）以上、又は０．０５％（ｗ／ｖ）以上であってよい。また、第２Ａ試薬又は第２Ｂ試薬おけるシアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、例えば、１％（ｗ／ｖ）以下、０．８％（ｗ／ｖ）以下、０．５％（ｗ／ｖ）以下、０．３％（ｗ／ｖ）以下、０．２％（ｗ／ｖ）以下、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０９％（ｗ／ｖ）以下、０．０８％（ｗ／ｖ）以下、０．０７％（ｗ／ｖ）以下、又は０．０６％（ｗ／ｖ）以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　第２Ｂ試薬において、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度と、シアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒の濃度の合計を意味する。

　第２Ｃ試薬又は第３Ｃ試薬における、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．０００５％（ｗ／ｖ）以上、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、０．００２％（ｗ／ｖ）以上、０．００３％（ｗ／ｖ）以上、０．００５％（ｗ／ｖ）以上、０．００８％（ｗ／ｖ）以上、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１５％（ｗ／ｖ）以上、０．０２％（ｗ／ｖ）以上、又は０．０２５％（ｗ／ｖ）以上であってよい。また、第２Ｃ試薬又は第３Ｃ試薬における、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子の濃度は、例えば、１％（ｗ／ｖ）以下、０．８％（ｗ／ｖ）以下、０．５％（ｗ／ｖ）以下、０．３％（ｗ／ｖ）以下、０．２％（ｗ／ｖ）以下、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０９％（ｗ／ｖ）以下、０．０８％（ｗ／ｖ）以下、０．０７％（ｗ／ｖ）以下、０．０６％（ｗ／ｖ）以下、０．０５％（ｗ／ｖ）以下、０．０４％（ｗ／ｖ）以下、又は０．０３％（ｗ／ｖ）以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　本開示の測定用キットは、ラテックス凝集免疫測定用であり、当該ラテックス凝集免疫測定は、試料を前述の超音波で処理することを含んでいてもよい。そのため、超音波処理機能を備える分析装置に用いるためのキットとすることもできる。また、本開示の測定用キットは、試料を超音波で処理することが記載された説明書を含んでいてもよい。

　上記第１試薬、及び／又は第２試薬は、前述の金属イオンを含んでいてもよく、好ましくは二価以上の金属イオンを含んでいてもよい。第３試薬を含む測定用キットの場合、第１試薬、及び／又は第２試薬に加えて、第３試薬も前述の金属イオンを含んでいてもよい。

　本開示の測定用キットの構成試薬における金属イオンの濃度としては、本開示のシアリルルイス抗原の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．９ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、４ｍｍｏｌ／Ｌ以上、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、又は９ｍｍｏｌ／Ｌ以上であってよい。また、本開示の測定用キットの構成試薬における金属イオンの濃度は、例えば、１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、９００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、８００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、６００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、６０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、又は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。上記の数値は自由に組み合わせることができる。

　なお、本開示の測定用キットの構成試薬において、１種類の金属イオンを含んでいてもよいし、２種類以上の、金属イオンを含んでいてもよい。２種類以上の、金属イオンを含む場合、上記濃度は、当該２種類以上の、金属イオンの濃度の合計を意味する。上記金属イオン濃度は、それぞれの試薬において同じ濃度でもよく、異なる濃度であってもよい。

　本開示の測定用キットの構成試薬は、凍結乾燥状態でも液状でもよい。測定用キットの構成試薬が凍結乾燥状態である場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含まれていてもよい。

　測定用キットの構成試薬が液状である場合には、シアリルルイス抗原を認識する第１抗体又はその抗原結合性断片、及びシアリルルイス抗原を認識する第２抗体又はその抗原結合性断片からなる群より選ばれる少なくとも１種は、水性媒体で溶解又は混合された状態となっている。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含まれていてもよい。

　上記測定用キット（１）～（３）には、試料を希釈するための試薬として、水性媒体を含む試料希釈試薬を含んでいてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含まれてもよい。また、上記測定用キット（１）～（３）には、前述の洗浄液、標準物質としての既知濃度のシアリルルイス抗原を含む標準物質試薬、本開示の測定方法が記載された取扱説明書等が含まれていてもよい。

　標準物質としての既知濃度のシアリルルイス抗原としては、血液由来のシアリルルイス抗原又は培養癌細胞由来のシアリルルイス抗原をＰＢＳで希釈したシアリルルイス抗原溶液等が挙げられる。本開示のキットにおいて、複数の既知濃度のシアリルルイス抗原を含んでいてもよい。標準物質としての既知濃度のシアリルルイス抗原における、シアリルルイス抗原の濃度としては、例えば前述の濃度等が挙げられる。

　以下、本開示を実施例により、更に詳細に説明するが、これらは本開示の範囲を何ら制限するものではない。なお、以下の実施例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。

　カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（平均粒径１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ及び４００ｎｍ）（藤倉化成社製）、Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（同仁化学研究所社製）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）（同仁化学研究所社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｖｏｇｅｎ社製）、塩化ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）、硫酸マグネシウム（富士フイルム和光純薬社製）、ＤＵＰＡＮ－２抗原測定キット「デタミナー（登録商標）ＤＵＰＡＮ－２　Ｎ」（ミナリスメディカル社製）を使用した。

＜ＤＵＰＡＮ－２抗体が結合したラテックス粒子の調製＞
　カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（平均粒径１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ又は４００ｎｍ）、ＥＤＣ、Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ、及びＤＵＰＡＮ－２抗体を用いて、定法に従い、ラテックス粒子にＤＵＰＡＮ－２抗体を結合させた。

＜ＤＵＰＡＮ－２抗原溶液の調製＞
　ヒト膵癌培養細胞ＨＰＡＦ（ＨＰＡＦ－ＩＩ）の培養上清から精製したＤＵＰＡＮ－２抗原の溶液について、ＤＵＰＡＮ－２抗原測定キット「デタミナー（登録商標）ＤＵＰＡＮ－２　Ｎ」を用いてＤＵＰＡＮ－２抗原含有量を算出した。含有量を算出した上記ＤＵＰＡＮ－２抗原の溶液を、「デタミナー（登録商標）ＤＵＰＡＮ－２　Ｎ」に付属している検体希釈液で希釈し、ＤＵＰＡＮ－２抗原溶液を調製した。

［実験例１］　ラテックス粒子の平均粒径と測定感度との関係の評価
＜測定用キットの調製＞
　以下の組成の第１試薬及び第２試薬を含む測定用キット１～３（実施例１～３）を調製した。なお、測定用キット１～３は、第２試薬に含まれるＤＵＰＡＮ－２抗体結合ラテックス粒子の平均粒径が異なり、それぞれ２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍである。

（第１試薬）
　　　ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　　ＢＳＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１％（ｗ／ｖ）
　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
適量の水酸化ナトリウムによりｐＨを７．０に調整した。
（第２試薬）
　　　Ｂｉｃｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　　ＤＵＰＡＮ－２抗体結合ラテックス粒子（平均粒径２００、３００、４００ｎｍ）
適量の水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０に調整した。また、上記ＤＵＰＡＮ－２抗体結合ラテックス粒子は、上記第２試薬における５７０ｎｍでの吸光度が０．５となるように添加した。

　以下の組成の第１試薬及び第２試薬を含む測定用キットＡ（比較例１）を調製した。

（第１試薬）
　　　ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　　ＢＳＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１％（ｗ／ｖ）
　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
適量の水酸化ナトリウムによりｐＨを７．０に調整した。
（第２試薬）
　　　Ｂｉｃｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　　ＤＵＰＡＮ－２抗体結合ラテックス粒子（平均粒径１００ｎｍ）
適量の水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０に調整した。また、上記ＤＵＰＡＮ－２抗体結合ラテックス粒子は、上記第２試薬における５７０ｎｍでの吸光度が０．５となるように添加した。

＜ラテックス粒子の平均粒径と測定感度との関係の評価＞
　自動分析装置３５００（日立ハイテク社製）、測定用キット１～３（実施例１～３）又は測定キットＡ（比較例１）、調製したＤＵＰＡＮ－２抗原溶液を用いて、ＤＵＰＡＮ－２抗原を以下の手順で測定した。反応温度３７℃にて、ＤＵＰＡＮ－２抗原溶液（１３μＬ）と第１試薬（１３７μＬ）とをセルに加え、上記自動分析装置３５００に備わるヘラ攪拌機構を用いて約１秒間均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬（５０μＬ）を、上記セル中のＤＵＰＡＮ－２抗原溶液と第１試薬との混合液に加え、上記自動分析装置３５００に備わるヘラ攪拌機構を用いて約１秒間均一攪拌して反応液（ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度：０Ｕ／ｍＬ、１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬ）を調製した。なお、ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの反応液は、調製したＤＵＰＡＮ－２抗原溶液の代わりに、上記検体希釈液を用いて調製した。その後、３０秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３００秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定し、ΔＡｂｓを１００００倍した数値を測定値とした。ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬ、１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬの反応液のそれぞれについて３回測定した際の測定値の平均値を算出した。その結果を表１に示す。

　ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの反応液の測定値に対し、ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬの反応液の測定値が高いほど、測定の感度が高いと評価することができる。表１から明らかなとおり、測定用キットＡ（比較例１）を用いた場合と比較して、測定用キット１～３（実施例１～３）を用いた場合では、ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの反応液の測定値に対するＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬの反応液の測定値が高かった。したがって、使用したラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ、３００ｎｍ又は４００ｎｍである測定用キットを用いると、使用したラテックス粒子の平均粒径が１００ｎｍである測定用キットと比較して、ＤＵＰＡＮ－２抗原の測定の感度が高くなることが明らかとなった。

［実験例２］　攪拌方法と測定感度との関係の評価
　測定キット１～３と同様の組成の測定キット４～６（実施例４～６）、及び測定キットＡと同様の組成の測定キットＢ（比較例２）を調製した。実験例１のヘラ攪拌機構を備える自動分析装置３５００の代わりに、自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ　００６（日立ハイテク社製）を使用し、上記自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ　００６に備わる超音波攪拌機構を用いて各種溶液及び試薬の混合液を約１秒間均一攪拌した。それ以外は、実験例１と同様の方法により、測定キット４～６及び測定キットＢを用いてＤＵＰＡＮ－２抗原を測定した。ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬ、１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬの反応液のそれぞれについて３回測定した際の測定値の平均値を算出した。その結果を表２に示す。

　自動分析装置３５００（ヘラ攪拌）を用いた場合と比較して、自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ　００６（超音波攪拌）を用いた場合では、ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの反応液の測定値に対するＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬの反応液の測定値が高かった。また、ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの反応液を測定した際の測定値については、測定対象成分であるＤＵＰＡＮ－２抗原が存在しないことから、０に近い方が望ましい。表２から明らかなとおり、自動分析装置３５００（ヘラ攪拌）を用いた場合と比較して、自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ　００６（超音波攪拌）を用いた場合では、ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの反応液を測定した際の測定値がより０に近い結果となった。したがって、超音波攪拌機構を用いて各種溶液及び試薬の混合液を均一攪拌する、すなわち、試料を超音波で処理することにより、測定の感度が高くなることが明らかとなった。

［実験例３］　金属イオンと測定感度との関係の評価
＜測定用キットの調製＞
　測定用キット１～３（実施例１～３）の第１試薬に含まれる塩化ナトリウム（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）の代わりに、硫酸マグネシウム（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を含ませる以外は、測定用キット１～３（実施例１～３）と同様の組成の、測定用キット７～９（実施例７～９）を調製した。

　比較例１の測定用キットＡの第１試薬に含まれる塩化ナトリウム（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）の代わりに、硫酸マグネシウム（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を含ませる以外は、比較例１と同様の組成の、測定用キットＣ（比較例３）を調製した。

＜金属イオンと測定感度との関係の評価＞
　測定用キット１～３（実施例１～３）の代わりに、測定用キット７～９（実施例７～９）を、測定キットＡ（比較例１）の代わりに測定キットＣ（比較例３）を用いる以外は、実験例１と同様の方法により、ＤＵＰＡＮ－２抗原を測定した。ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬ、１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬの反応液のそれぞれについて３回測定した際の測定値の平均値を算出した。その結果を表３に示す。

　表１及び表３から明らかなとおり、測定用キット１～３を用いた場合と比較して、測定用キット７～９を用いた場合では、ＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの反応液の測定値に対するＤＵＰＡＮ－２抗原濃度が１８００Ｕ／ｍＬ及び３６００Ｕ／ｍＬの反応液の測定値が高かった。したがって、二価以上の金属イオンを含む測定用キットを用いると、一価の金属イオンを含む測定用キットを用いるよりも測定の感度が高くなることが明らかとなった。

Claims

　水性媒体中で、試料中のシアリルルイス抗原を、前記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と反応させる、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法であって、前記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである方法。
　前記試料を超音波で処理することを含む、請求項１に記載の方法。
　（１）シアリルルイス抗原を含む試料を、水性媒体と混合する工程；及び
　（２）工程（１）で得られた溶液中で、試料中のシアリルルイス抗原を、前記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子と反応させる工程、を含み、
　工程（２）における前記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定方法。
　前記工程（１）の後、及び／又は、前記工程（２）の後に、前記試料を超音波で処理することを含む、請求項３に記載の方法。
　前記工程（１）及び／又は前記工程（２）が金属イオンの存在下で行われる、請求項３又は４に記載の方法。
　前記金属イオンが二価以上の金属イオンである、請求項５に記載の方法。
　前記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、前記ラテックス粒子との結合が化学結合である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　前記シアリルルイス抗原がＤＵＰＡＮ－２抗原である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含み、前記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用試薬。
　前記ラテックス凝集免疫測定が、試料を超音波で処理することを含む、請求項９に記載の試薬。
　試料を超音波で処理することが記載された説明書を含む、請求項９に記載の試薬。
　超音波処理機能を備える分析装置に用いるための、請求項９に記載の試薬。
　金属イオンを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の試薬。
　前記金属イオンが二価以上の金属イオンである、請求項１３に記載の試薬。
　前記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、前記ラテックス粒子との結合が化学結合である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の試薬。
　前記シアリルルイス抗原がＤＵＰＡＮ－２抗原である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の試薬。
　水性媒体を含む第１試薬と、シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片が結合したラテックス粒子を含む第２試薬と、を含み、前記ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍである、試料中のシアリルルイス抗原のラテックス凝集免疫測定用キット。
　前記ラテックス凝集免疫測定が、試料を超音波で処理することを含む、請求項１７に記載のキット。
　試料を超音波で処理することが記載された説明書を含む、請求項１７に記載のキット。
　超音波処理機能を備える分析装置に用いるための、請求項１７に記載のキット。
　前記第１試薬及び／又は前記第２試薬に金属イオンを含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載のキット。
　前記金属イオンが二価以上の金属イオンである、請求項２１に記載のキット。
　前記シアリルルイス抗原を認識する抗体又はその抗原結合性断片と、前記ラテックス粒子との結合が化学結合である、請求項１７～２０のいずれか１項に記載のキット。
　前記シアリルルイス抗原がＤＵＰＡＮ－２抗原である、請求項１７～２０のいずれか１項に記載のキット。