CN102641246B - 一种抗肿瘤的双药纳米载药微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗肿瘤药物，特别是一种抗肿瘤的双药纳米载药微球及其制备方法。本发明的双药纳米载药微球是由紫杉醇（Ptx）、协同药和载药材料混合组成，其中，协同药为汉防己甲素（Tet）或姜黄素（Cum）或白藜芦醇（Res），载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇（mPEG-PCL）或聚乳酸-聚乙二醇（mPEG-PLA）或聚羟基乙酸-聚乙二醇（mPEG-PLGA）。本发明的制法为配药、溶药、稀释、纯化、过滤和干燥或冻干等步骤，即可制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品或冻干成品。本发明充分发挥协同药具有增强紫杉醇抑瘤的协同作用，以提高双药协同抗肿瘤的药效。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤药物，特别是一种抗肿瘤的双药纳米载药微球及其制备方法。
背景技术
当今抗肿瘤药物层出不穷，但是降低抗肿瘤药物的毒副作用是迫切需要解决的难题。以下为正确表述各抗肿瘤药物名称，即在其中文名称后加(英文缩写)。紫杉醇(Ptx)是目前临床上常用的抗肿瘤药物，但其毒性反应对肿瘤患者产生的毒副作用以及肿瘤细胞日益增长的耐药性均使该药在临床使用中受到较大的限制。针对紫杉醇单药所存在的问题，医药界进一步开展对紫杉醇单药的纳米化研究。如将紫杉醇在水相中载入二亲嵌段共聚物制成纳米载药微球，既可降低紫杉醇的毒副作用，同时又可增加其用于体外治疗的药效。但难以解决的问题是，由于紫杉醇自身的强疏水性极易聚集在一起，从而使整个载药系统不能稳定的存在于水相中。为克服这一不足，在Zhang Y等人发表的“A novel paclitaxel-loadedpoly(epsilon-caprolactone)/Poloxamer 188blend nanoparticle overcoming multidrug resistance forcancer treatment”，Acta Biomater.2010；6(6)：2045-2052、Pan J，Feng SS.Targeted delivery ofpaclitaxel using folate-decorated poly(lactide)-vitamin E TPGS nanoparticles.Biomaterials.2008；29(17)：2663-2672以及代昭等人发表的“烷基壳聚糖纳米微球的制备及其紫杉醇负载研究”，高分子通报、2006年第6期64-74页等国内外文献中，报道了采用乳化法、共价法等方法来达到稳定紫杉醇纳米载药微球的目的，但均因制备工艺或条件过于复杂、体系稳定性欠佳和制备成本高等原因而无法进入实用化。同时，研究发现尽管将紫杉醇单药纳米化并作用于患者体外治疗可增加药效，但将其作用于患者体内治疗的药效却不尽如人意。为了克服现有技术的不足，近年来医药界又进一步开展抗肿瘤的双药研究。
2009年《第三届中国肿瘤内科大会教育集暨论文集》中报道了采用双乳剂法将顺铂与汉防己甲素(Tet)载入聚己内酯-聚乙二醇的纳米微球中，虽然在体外证实了该载药微球良好的抗肿瘤活性，但是顺铂纳米化以后其肝肾毒性及血液学毒性等毒副作用仍然严重，影响了其进一步应用。且该药必须采用二氯甲烷作为有机溶剂，在后续的制备过程中难以去除，给将来的用药和生产的安全性带来隐患。同时，该种方法所制备的载药微球粒径大于200nm，静脉注射后容易形成栓塞，也将限制其在临床上的进一步应用。再则，因顺铂的水溶性较大使其极易从纳米微球中露出，难以达到理想的载药量及包封率，从而影响载药纳米微球的稳定性和疗效。
中国专利公开号CN101474164A公开了一种口服复方紫杉醇胶囊剂及其制备方法。该方法为提高紫杉醇口服生物利用度，将紫杉醇、汉防己甲素(Tet)及环糊精共同灌装成胶囊，但紫杉醇与汉防己甲素仅为两种裸药的联合，患者口服后存在首关消除、生物利用度差，不能在体内达到长时间的有效血药浓度等难以解决的问题，此外，两药灌装成胶囊口服后在上述因素的影响下难以发挥协同作用，进而影响其在患者体内抗肿瘤活性。
如何克服现有技术的不足已成为当今抗肿瘤药物技术领域中亟待解决的重大难题。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种抗肿瘤的双药纳米载药微球及其制备方法，本发明制得的抗肿瘤的双药纳米载药微球不仅具有显著的抗肿瘤效果，而且其毒性反应对肿瘤患者产生的毒副作用显著降低；本发明的制备方法简便可靠，能够保证本发明产品的质量。
根据本发明提出的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球，其特征是由紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料混合组成，其中，协同药为汉防己甲素(Tet)或姜黄素(Cum)或白藜芦醇(Res)，载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)。本发明进一步的优选方案，其特征是按重量配比的组份为：由3-18％紫杉醇(Ptx)、3-18％协同药和64-94％载药材料混合组成；或者按重量配比的组份为：5-15％紫杉醇(Ptx)、5-15％协同药和70-90％载体材料混合组成。
本发明的另一种技术方案是在前述技术方案或者优选方案的基础上，由紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料组成的纳米载药微球与外加的冻干保护剂混合组成，其中，冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。本发明另一种技术方案的优选方案，其特征是按重量配比的组份为：由紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料组成的纳米载药微球混合药20-30％和外加的冻干保护剂70-80％混合组成。
根据本发明所述的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球的制备方法，其特征在于：
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取3-18％紫杉醇(Ptx)、3-18％协同药和64-94％载药材料，其中，协同药为汉防己甲素(Tet)或姜黄素(Cum)或白藜芦醇(Res)；载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料(二亲嵌段共聚物)三种原料组分溶于一定量的丙酮或乙醇有机溶剂中，其中，按组分的重量配比，原料组分50-80％、有机溶剂20-50％；
步骤三，稀释：将步骤二得到的有机溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中，其中：有机溶液与蒸馏水的体积比为，有机溶液∶蒸馏水＝1∶4-5；
步骤四，纯化：将步骤三得到的有机溶液稀释液，通过旋转蒸发法除去有机溶剂，或者用透析法除去有机溶剂；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去有机溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径为70-100nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥或冻干：将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40℃的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品；或者在步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，冷冻干燥后即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品，其中，按组分的重量配比，该溶液冻干成品中的双药纳米载药微球混合药20-30％、冻干保护剂70-80％。
本发明的作用原理是：第一，本发明选择汉防己甲素(Tet)、姜黄素(Cum)或白藜芦醇(Res)作为紫杉醇(Ptx)的协同药，不仅具有抗肿瘤细胞增生和诱导凋亡的抑瘤增效作用，而且还具有与紫杉醇同样的可作用于患者体内外治疗的药性。第二，利用具有可生物降解特性的医用聚己内酯与聚乙二醇等合成的二亲嵌段共聚物作为负载紫杉醇与协同药的双药载药材料，聚己内脂作为疏水端、聚乙二醇作为亲水端，两者在水相中能够自动合成二嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)的纳米载药微球，将紫杉醇与协同药同时投入该纳米载药微球，即可避免其双药的各自聚集并凸显其双药纳米载药微球的稳定性。第三，聚己内脂的疏水性能够使具有脂溶性的紫杉醇与协同药更容易被载入纳米载药微球，而聚乙二醇的亲水性则使纳米载药微球在患者体内循环的时间大大延长，更容易达到对肿瘤组织发挥药效，同时该双药纳米载药微球具有单药或单药纳米载药微球所不能比拟的低毒副作用，为在患者使用中增加药物的使用剂量而又不引起过高的毒性反应提供了保证。第四，该双药纳米载药微球能够通过肿瘤细胞的包吞作用被摄入细胞内，这种进入方式效率远大于小分子裸药逐渐渗入方式的效率，从而使紫杉醇与协同药能够迅速在细胞内达到较高的药物浓度，产生更好的协同抗肿瘤效果。
本发明与现有技术相比其显著优点是：第一，本发明通过纳米载药体系共同投递紫杉醇与协同药，充分发挥协同药具有增强紫杉醇抑瘤的协同作用，从而提高双药协同抗肿瘤的药效。第二，本发明的双药纳米载药微球的粒径小于100nm，不会形成给药栓塞，不仅可用于患者体外治疗，而且还可用于患者的静脉给药或者腹腔给药，能够在患者体内长时间的循环，从而达到更加优越的抗肿瘤药效。第三，本发明的双药纳米载药微球与现有任一抗肿瘤的单药、单药或双药的纳米载药微球或口服复方紫杉醇两药联合胶囊剂相比，其毒性反应对肿瘤患者的毒副作用显著降低。第四，本发明的双药纳米载药微球的制备方法简便易行，可以避免其双药的各自聚集，显著提高其双药纳米载药微球的稳定性，易实现工业化生产。
为进一步说明本发明与现有技术对比的显著效果，现以紫杉醇(Ptx)、汉防己甲素(Tet)和聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)混合制得的双药纳米载药微球为例，对比实验数据如表1、表2和表3所示。
表1、本发明与现有各组药物对人胃癌与鼠肝癌细胞的抑制率
表1数据说明：表1中Ptx：为紫杉醇；Ptx np：为紫杉醇单药微球；Tet+Ptx：为汉防己甲素与紫杉醇裸药联合；Tet-Ptx capsule：为汉防己甲素与紫杉醇胶囊；Ptx-Tet np：为紫杉醇与汉防己甲素双药纳米载药微球。人胃癌BGC-823以及鼠肝癌H22细胞株均在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养，采用MTT法测定各组药物的细胞抑制率结果，其中Ptx等效剂量为10nM，Tet等效剂量为8uM，微球中Ptx与Tet剂量等同于裸药，细胞抑制率越大表示抗肿瘤效果越强。
表2、本发明与现有各组药物对肝癌的体内抑瘤效果评价
表2数据说明：表2中Ptx：为紫杉醇；Ptx np：为紫杉醇单药微球；Tet+Ptx：为汉防己甲素与紫杉醇裸药联合；Tet-Ptx capsule：为汉防己甲素与紫杉醇胶囊；Ptx-Tet np：为紫杉醇与汉防己甲素双药纳米载药微球。鼠源性H22肝癌细胞系保种于ICR小鼠腹腔内，待7-9日腹水生成后取腹水，显微镜下计数并调整细胞数至4～6×106个/ml，分别接种于ICR小鼠(左侧腋下，每只0.2m1)。细胞种植后7-8天，选择肿瘤体积100mm3左右的小鼠为实验模型，将符合条件的小鼠随机分为6组，每组8只。表2中Ptx剂量为7.5mg/kg、Tet剂量为15mg/kg、Ptx np、Tet-Ptx capsule及Ptx-Tet np中的Ptx与Tet剂量等同于裸药。除Tet-Ptx capsule灌胃，其余各组均静脉给药，隔天测一次肿瘤长径a和垂直于a的最大横径b，计算瘤体积并且绘制肿瘤体积生长曲线。瘤体积＝1/2*a*b2。每日观察各组动物的饮食、活动、皮色等方面的变化，每2天测量一次小鼠体重，观察体重变化情况。表2中肝癌肿瘤体积抑制率与肝癌肿瘤重量抑制率越大表示该药抗肿瘤效果越强。
表3、本发明与现有各组药物的体内毒性评价
表3数据说明：当表2实验结束时对每组小鼠抽血查血常规及肝肾功能。表3中Con：为对照组；Ptx：为紫杉醇；Ptx np：为紫杉醇单药微球；Tet+Ptx：为汉防己甲素与紫杉醇裸药联合；Tet-Ptx capsule：为汉防己甲素与紫杉醇胶囊；Ptx-Tet np：为紫杉醇与汉防己甲素双药纳米载药微球。WBC：为白细胞；Hb：为血红蛋白；PLT：为血小板；ALT：为谷丙转氨酶；BUN：为尿素氮；CRE：为肌酐。表3中的数据可看出紫杉醇裸药、紫杉醇单药微球、紫杉醇-汉防己甲素胶囊均有不同程度的血液系统毒性及肝脏毒性，而紫杉醇与汉防己甲素双药纳米载药微球相较于其他各组(包括紫杉醇裸药、紫杉醇单药微球等)则基本无骨髓、肝脏或肾脏毒性。
附图说明
图1是本发明提出的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球成品制备方法的流程示意图。
图2是本发明提出的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品制备方法的流程示意图。
图3是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球在冻干前的原子力显微镜影像照片。
图4是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球在室温条件下的体外释放曲线。
图5是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球对小鼠肝癌H22细胞的体外协同抑瘤效果评价。
图6是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球在小鼠肝癌H22细胞的体内协同抑瘤效果评价。
图7是本发明的姜黄素与紫杉醇双药纳米载药微球在小鼠肝癌H22细胞的体内协同抑瘤效果评价。
图8是本发明的白藜芦醇与紫杉醇双药纳米载药微球在小鼠肝癌H22细胞的体内协同抑瘤效果评价。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
结合附图1和图2，制备本发明提出的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球成品或者一种抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品，所采用的紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料以及溶剂、冻干保护剂等全部原料均为市售医药原料，符合中华人民共和国药典标准。其中：协同药为汉防己甲素(Tet)或者姜黄素(Cum)或者白藜芦醇(Res)，不论采用所述的何种协同药都能够达到本发明所述的协同药效；载药材料为聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)合成的二亲嵌段共聚物，不论采用所述的何种载药材料都能够达到本发明所述的载药效果。本发明的原料规格如下：
1、紫杉醇(Ptx)：分子式C47H51NO14；分子量853.906；纯度：HPLC＞99％。
2、协同药：
①汉防己甲素(Tet)：分子式C38H42N2O6；分子量622.73；纯度HPLC＞99％。
②姜黄素(Cum)：分子式C21H20O6；分子量：368.4；纯度HPLC＞99％。
③白藜芦醇(Res)：分子式：C14H12O3；分子量：228.24；纯度HPLC＞99％。
3、载药材料：
①聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物为聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)；经过核磁(NMR)和凝胶滤过色谱(GPC)验证。
②聚乳酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物为聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)；经过核磁(NMR)和凝胶滤过色谱(GPC)验证。
③聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物为聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；经过核磁(NMR)和凝胶滤过色谱(GPC)验证。
4、溶剂：
①丙酮为色谱纯；
②乙醇为色谱纯；
③蒸馏水为色谱纯。
5、冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，又名Lutrol F68(泊洛沙姆188)，分子式(C3H6OC2H4O)x；分子量：8350；级别：医用级。
结合附图1，以制备1000g抗肿瘤的双药纳米载药微球成品为例，本发明的具体实施方式如下。
实施例1：
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取30g紫杉醇(Ptx)、30g汉防己甲素(Tet)以及940g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中：mPEG分子量4000、PCL分子量20000；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的30g紫杉醇(Ptx)、30g汉防己甲素(Tet)和940g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分80％、丙酮溶剂20％)；
步骤三，稀释：将步骤二得到的丙酮溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中(丙酮溶液与蒸馏水的体积比为1∶4)，即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化：将步骤三得到的丙酮溶液稀释液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去丙酮溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、汉防己甲素(Tet)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径77.2nm的含紫杉醇(Ptx)与汉防己甲素(Tet)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥：将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40℃的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品。
实施例2：
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取100g紫杉醇(Ptx)、100g姜黄素(Cum)以及800g载药材料，其中，载药材料为聚乳酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，其中：mPEG分子量4000、PLA分子量40000；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的100g紫杉醇(Ptx)、100g姜黄素(Cum)和800g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分65％、丙酮溶剂35％)；
步骤三，稀释：将步骤二得到的丙酮溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中(丙酮溶液与蒸馏水的体积比为1∶4.5)，即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化：将步骤三得到的丙酮溶液稀释液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去丙酮溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、姜黄素(Cum)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径79.6nm的含紫杉醇(Ptx)与姜黄素(Cum)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥：将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40℃的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品。
实施例3
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取180g紫杉醇(Ptx)、180g白藜芦醇(Res)以及640g载药材料，其中，载药材料为聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)，其中：mPEG分子量4000、PLGA分子量36000；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的180g紫杉醇(Ptx)、180g白藜芦醇(Res)和640g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分50％、丙酮溶剂50％)；
步骤三，稀释：将步骤二得到的丙酮溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中(丙酮溶液与蒸馏水的体积比为1∶5)，即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化：将步骤三得到的丙酮溶液稀释液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去丙酮溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、白藜芦醇(Res)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径74.6nm的含紫杉醇(Ptx)与白藜芦醇(Res)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥：将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40℃的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品。
结合附图2，以制备7000g抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品为例，本发明的具体实施例如下。
实施例4
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取100g紫杉醇(Ptx)、300g汉防己甲素(Tet)以及1600g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中：mPEG分子量4000、PCL分子量20000；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的100g紫杉醇(Ptx)、300g汉防己甲素(Tet)以及1600g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分80％、丙酮溶剂20％)；
步骤三，稀释：将步骤二得到的丙酮溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中(丙酮溶液与蒸馏水的体积比为1∶4)，即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化：将步骤三得到的丙酮溶液稀释液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去丙酮溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、汉防己甲素(Tet)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径78.4nm的含紫杉醇(Ptx)与汉防己甲素(Tet)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，冻干：将步骤五得到的纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚(Pluronic F-68)5000g，冷冻干燥后即制得含紫杉醇(Ptx)与汉防己甲素(Tet)双药的纳米载药微球溶液冻干成品。
实施例5
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取100g紫杉醇(Ptx)、100g姜黄素(Cum)以及800g载药材料，其中，载药材料为聚乳酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，其中：mPEG分子量4000、PLA分子量40000；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的100g紫杉醇(Ptx)、100g姜黄素(Cum)和800g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分65％、丙酮溶剂35％)；
步骤三，稀释：将步骤二得到的丙酮溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中(丙酮溶液与蒸馏水的体积比为1∶4.5)，即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化：将步骤三得到的丙酮溶液稀释液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去丙酮溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、姜黄素(Cum)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径77.2nm的含紫杉醇(Ptx)与姜黄素(Cum)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，冻干：将步骤五得到的纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚(Pluronic F-68)6000g，冷冻干燥后即制得含紫杉醇(Ptx)与姜黄素(Cum)双药的纳米载药微球溶液冻干成品。
实施例6
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取150g紫杉醇(Ptx)、50g白藜芦醇(Res)以及800g载药材料，其中，载药材料为聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)，其中：mPEG分子量4000、PLGA分子量36000；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的150g紫杉醇(Ptx)、50g白藜芦醇(Res)和800g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分50％、丙酮溶剂50％)；
步骤三，稀释：将步骤二得到的丙酮溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中(丙酮溶液与蒸馏水的体积比为1∶5)，即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化：将步骤三得到的丙酮溶液稀释液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去丙酮溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、白藜芦醇(Res)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径80.3nm的含紫杉醇(Ptx)与白藜芦醇(Res)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，冻干：将步骤五得到的纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚(Pluronic F-68)6000g，冷冻干燥后即制得含紫杉醇(Ptx)与白藜芦醇(Res)双药的纳米载药微球溶液冻干成品。
本发明经反复实验验证，取得了满意的应用效果。现以紫杉醇(Ptx)、汉防己甲素(Tet)和聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)混合制得的双药纳米载药微球为例，其应用效果图示如下：
图3是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球成品的原子力显微镜影像照片。图3中可见双药纳米载药微球为较为规则的圆形，表面光滑，其粒径较为均匀，均小于100nm。
图4是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球在室温条件下的体外释放曲线。图4中可见汉防己甲素与紫杉醇分别表现为缓慢释放的特征，这样使得该双药纳米载药微球在患者体内发挥疗效时可以通过最初的突释来达到一个较高的血药浓度，而随后的长时释放则为保持一定的有效浓度提供了保证，从而达到了长效缓释的抗肿瘤效果。
图5是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球对小鼠肝癌H22细胞的体外协同抗肿瘤效果评价，采用MTT方法测定。实验分三组，分别为Ptx裸药，Tet-Ptx裸药联合，以及Tet-Ptx双药纳米载药微球。其中，Ptx-Tet裸药联合以及Ptx-Tet双药纳米微球中Tet的浓度均设为0.8μM来观察Tet对于Ptx的细胞抑制作用的影响(在预试验中该浓度对细胞无明显抑制作用)。图5中可见当小剂量的汉防己甲素联合紫杉醇时，细胞抑制率较之紫杉醇裸药有了一个明显的升高，紫杉醇与汉防己甲素双药纳米载药微球显示了比紫杉醇裸药更强的细胞杀伤作用。
图6是本发明的汉防己甲素与紫杉醇双药纳米载药微球在小鼠肝癌H22细胞的体内协同抑瘤效果评价。将鼠源性H22肝癌细胞系保种于ICR小鼠腹腔内，待7-9日腹水生成后取腹水，显微镜下计数并调整细胞数至4～6×106个/ml，分别接种于ICR小鼠(左侧腋下，每只0.2ml)。细胞种植后7-8天，选择肿瘤体积100mm3左右的小鼠为实验模型。将符合条件的小鼠随机分为6组，每组8只。各组药物如图6所示，其中，Ptx剂量为10mg/kg，Tet剂量为10mg/kg。Ptx np、Ptx-Tet np中的Ptx与Tet剂量等同于裸药。各组均静脉给药，隔天测一次肿瘤长径a和垂直于a的最大横径b，计算瘤体积并且绘制肿瘤体积生长曲线。瘤体积＝1/2*a*b2。每日观察各组动物的饮食、活动、皮色等方面的变化，每2天测量一次小鼠体重，观察体重变化情况。图6中可见体内实验结果显示紫杉醇与汉防己甲素双药纳米载药微球产生了显著优于紫杉醇裸药、紫杉醇单药微球以及紫杉醇与汉防己甲素两药联合的抑瘤效果。
图7是本发明的姜黄素与紫杉醇双药纳米载药微球在小鼠肝癌H22细胞的体内协同抑瘤效果评价。测定方法同图6。其中，Ptx剂量为10mg/kg，姜黄素剂量为10mg/kg。Ptx np，Ptx-Cumnp中的Ptx与Cum剂量等同于裸药。图7中的体内实验结果显示紫杉醇与姜黄素双药纳米载药微球产生了显著优于紫杉醇裸药、紫杉醇单药微球以及紫杉醇与姜黄素两药联合的抑瘤效果。
图8是本发明的白藜芦醇与紫杉醇双药纳米载药微球在小鼠肝癌H22细胞的体内协同抑瘤效果评价。测定方法同图6。其中，Ptx剂量为10mg/kg，Res剂量为15mg/kg。Ptx np、Ptx-Resnp中的Ptx及Res剂量等同于裸药。图8中的体内实验结果显示紫杉醇与白藜芦醇双药纳米载药微球产生了显著优于紫杉醇裸药、紫杉醇单药微球以及紫杉醇与白藜芦醇两药联合的抑瘤效果。
Claims (5)
1.一种抗肿瘤的双药纳米载药微球，其特征是由按重量配比的：3-18％紫杉醇(Ptx)、3-18％协同药和64-94％载药材料混合组成，其中，协同药为汉防己甲素(Tet)或姜黄素(Cum)或白藜芦醇(Res)；载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇(mPEG-PCL)，或聚乳酸与聚乙二醇合成的聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的聚羟基乙酸-聚乙二醇mPEG-PLGA。
2.一种抗肿瘤的双药纳米载药微球，其特征是由按重量配比的：3-18％紫杉醇(Ptx)、3-18％协同药和64-94％载药材料组成的纳米载药微球混合药，再与外加的冻干保护剂混合组成，其中：该纳米载药微球混合药为20-30％，外加的冻干保护剂为70-80％；协同药为汉防己甲素(Tet)或姜黄素(Cum)或白藜芦醇(Res)；载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇(mPEG-PCL)，或聚乳酸与聚乙二醇合成的聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的聚羟基乙酸-聚乙二醇mPEG-PLGA；冻干保护剂为嵌段式聚醚PluronicF-68。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球，其特征是按重量配比的组份为：5-15％紫杉醇(Ptx)、5-15％协同药和70-90％载体材料混合组成。
4.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球的制备方法，其特征在于：
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取3-18％紫杉醇(Ptx)、3-18％协同药和64-94％载药材料，其中，协同药为汉防己甲素(Tet)或姜黄素(Cum)或白藜芦醇(Res)；载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇(mPEG-PCL)，或聚乳酸与聚乙二醇合成的聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料三种原料组分溶于一定量的丙酮或乙醇有机溶剂中，其中，按组分的重量配比，原料组分50-80％、有机溶剂20-50％；
步骤三，稀释：将步骤二得到的有机溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中，其中：有机溶液与蒸馏水的体积比为，有机溶液：蒸馏水＝1:4-5；
步骤四，纯化：将步骤三得到的有机溶液稀释液，通过旋转蒸发法除去有机溶剂，或者用透析法除去有机溶剂；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去有机溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径为70-100nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥：将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40℃的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品。
5.根据权利要求2所述的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球的制备方法，其特征在于：
步骤一，配药：按原料组分的重量配比分别称取3-18％紫杉醇(Ptx)、3-18％协同药和64-94％载药材料，其中，协同药为汉防己甲素(Tet)或姜黄素(Cum)或白藜芦醇(Res)；载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇(mPEG-PCL)，或聚乳酸与聚乙二醇合成的聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；
步骤二，溶药：在常温条件下，将步骤一中称取的紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料三种原料组分溶于一定量的丙酮或乙醇有机溶剂中，其中，按组分的重量配比，原料组分50-80％、有机溶剂20-50％；
步骤三，稀释：将步骤二得到的有机溶液在搅拌条件下缓慢滴加入一定量的蒸馏水中，其中：有机溶液与蒸馏水的体积比为，有机溶液：蒸馏水＝1:4-5；
步骤四，纯化：将步骤三得到的有机溶液稀释液，通过旋转蒸发法除去有机溶剂，或者用透析法除去有机溶剂；
步骤五，过滤：将步骤四得到的除去有机溶剂的稀释液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的紫杉醇(Ptx)、协同药和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径为70-100nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；
步骤六，冻干：在步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚PluronicF-68，冷冻干燥后即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品，其中，按组分的重量配比，该溶液的冻干成品中的双药纳米载药微球混合药为20-30％、冻干保护剂为70-80％。
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