CN107459563B - 一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以3～5℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以1～4mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1000～2000r/min的速度搅拌2～3min，接着以搅拌速度为500～800r/min的速度搅拌4～6min，再以搅拌速度为100～200r/min的速度搅拌4～6min，搅拌结束停止通气，降温至‑27～‑17℃，在超声波的声能密度为15～25W/mL的辅助处理条件下放置3～5h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白。本发明能够在保证硒蛋白品质的情况下高效沉淀硒蛋白，具有广大的市场推广价值。
Description
【技术领域】
本发明涉及硒蛋白的沉淀领域，特别涉及一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺。
【背景技术】
硒是人和动物的必需微量元素之一,硒可以提高免疫力，能加速免疫球蛋白及抗体产生。保护心血管与心肌，降低心血管病与心绞痛的发生率。在抗氧化抗衰老与抗癌防癌等方面有多种作用，并具有降低重金属毒害等特殊生理功能。被国内外科学家们誉为人类“抗癌之王、长寿元素、生命的火种、天然解毒剂、心脏守护神”。
硒可分为有机硒和无机硒，无机硒主要以硒酸盐、亚硒酸盐为主，占硒总量的8％，一般具有较强的毒性。有机硒可分为大分子硒和小分子硒化物，占硒总量的80％以上，一般以硒代氨基酸和硒蛋白的形式存在，在生物体内发挥作用的主要是有机硒化物。在植物体内，硒积聚能力较强的植物硒结合蛋白较少，所以硒可能作为含硫氨基酸代谢中间产物类似物存在。在非积聚植物中，硒与蛋白质往往比较多，而且主要以硒代蛋氨酸存在，也有硒代半胱氨酸存在。研究发现在水稻硒蛋白中存在着两种硒结合态：硒代氨基酸和硒代半胱氨酸。
硒蛋白中的硒主要以硒代甲硫氨酸存在，要准确检测其中硒含量，必须找到合适的硒蛋白提取和沉淀方法，制备出硒蛋白。但是目前对于硒蛋白的研究方向主要集中在提取方面，对于硒蛋白沉淀方面的研究较少，目前市场上常用的沉淀剂主要为醇类和酮类沉淀剂，其中酮类沉淀剂的使用较广，但是醇类沉淀剂存在着沉淀效率低的问题。因此，研究一种具有高效沉淀硒蛋白的沉淀工艺，具有广大的市场推广价值。
【发明内容】
本发明目的在于提供一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，本发明先将硒蛋白萃取液放入低温环境中，然后采用冰丙酮作为沉淀剂对硒蛋白进行沉淀，与此同时采用三级搅拌程序，结合超声波的辅助处理，能够使硒蛋白充分沉淀。本发明能够在保证硒蛋白品质的情况下高效沉淀硒蛋白，具有广大的市场推广价值。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以3～5℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以1～4mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1000～2000r/min的速度搅拌2～3min，接着以搅拌速度为500～800r/min的速度搅拌4～6min，再以搅拌速度为100～200r/min的速度搅拌4～6min，搅拌结束停止通气，降温至-27～-17℃，在超声波的声能密度为15～25W/mL的辅助处理条件下放置3～5h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白。
在本发明中，作为进一步说明，所述的硒蛋白萃取液由下述方法制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份60～80℃的去离子水中浸泡3～5h后，研磨成浆，加入1～3份淀粉酶，在25～35℃下酶解10～15h，接着加入1000～3000份浸提液，在温度为45～65℃的条件下浸提10～18h，然后放入离心机中，以3000～5000r/min的转速离心10～20min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
在本发明中，作为进一步说明，所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管。
在本发明中，作为进一步说明，所述的微孔曝气管的曝气流量为0.2～0.5m3/s。
在本发明中，作为进一步说明，所述的保护性气体为按体积比为10：3～7的氮气和惰性气体混合而成。
在本发明中，作为进一步说明，所述的超声波的频率为30000～40000Hz。
部分原料的功能介绍如下：
丙酮，在本发明中用作沉淀硒蛋白的溶剂。
富硒大米，在本发明中用作制备硒蛋白萃取液的原料。
淀粉酶，催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖、麦芽糖及含有α1，6-糖苷键支链的糊精。在本发明中淀粉酶用于促进富硒大米浆液中的淀粉酶解。
氮气和惰性气体，在本发明中用作硒蛋白沉淀过程中保护性气体，不仅能够保护硒蛋白的氧化，还能促进硒蛋白沉淀物和气体的充分接触。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用在超声波辅助处理的条件下，使用冰丙酮在低温环境中对硒蛋白进行沉淀，不仅能高效的沉淀硒蛋白，还可以提高硒蛋白的纯度，进而有利于人体吸收。首先，本发明采用冰丙酮沉淀硒蛋白的技术手段，避免了常温下丙酮会使蛋白质变质现象的发生，保障了所提取的硒蛋白品质的稳定，提高了硒蛋白的纯度。其次，本发明还采用三级搅拌程序，使用不同的搅拌速度对硒蛋白进行沉淀。先进行搅拌的时候，沉淀物较少，通过快速的搅拌速度，可以使沉淀物达到快速沉淀的效果；当沉淀物较多时，如果采用快速搅拌，反而容易产生絮状沉淀，不利于后续的搅拌和加工成型，因此后期采用慢速搅拌。使用了快-中-慢速三级搅拌程序的技术手段，契合了沉淀物沉淀的规律，实现了最大程度的沉淀效率。最后，本发明还采用了在保护性气体的环境中，使用超声波辅助处理的技术手段，在超声条件下，硒蛋白与丙酮的接触面积增加，在超声波的振动下，硒蛋白也随之不断振动，避免了硒蛋白团聚现象的发生，进而提升了硒蛋白的沉淀率；而且保护性气体的使用，可以保护硒蛋白不容易氧化变质，提高了硒蛋白的纯度。本发明所采用的各个技术手段从不同角度、不同原理实现了硒蛋白的沉淀，并且做到了相互作用、相互配合、层层递进，能够共同促进硒蛋白的沉淀和纯度的提高，所产生的总体效果远远高于单个技术手段所产生的效果。
2.本发明能够高效制备硒蛋白萃取液。本发明以富硒大米为原料，通过浸泡的技术手段，使富硒大米的组织结构由于吸收大量的水分而变得松散，有利于后续硒蛋白的提取步骤的进行；然后通过研磨成浆的技术手段，使富硒大米的外部结构能够初步被打破，硒蛋白的保护层被打破，促进硒蛋白溶出；最后采用淀粉酶酶解的技术手段，使浆液中的物质进行酶解，酶解了浆液中的淀粉，提高了硒蛋白在浆液中的含量，有利于后续的步骤的进行。本发明所采用的各个技术手段相互作用、相互配合，能够共同促进后续的提取步骤的进行，提高了提取效率，所产生的总体效果远远高于单个技术手段所产生的效果的简单加和。
【具体实施方式】
实施例1：
1.前期准备：
硒蛋白萃取液的制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份60℃的去离子水中浸泡3h后，研磨成浆，加入1份淀粉酶，在25℃下酶解10h，接着加入1000份浸提液，在温度为45℃的条件下浸提10h，然后放入离心机中，以3000r/min的转速离心10min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
保护性气体的制备：将按体积比为10：3的氮气和惰性气体混合，得到保护性气体。
将上述前期制备而得的物质用于下述提取硒蛋白过程中的沉淀工艺上。
2.一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以3℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以1mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1000r/min的速度搅拌2min，接着以搅拌速度为500r/min的速度搅拌4min，再以搅拌速度为100r/min的速度搅拌4min，搅拌结束停止通气，降温至-27℃，在超声波的声能密度为15W/mL、频率为30000Hz的辅助处理条件下放置3h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白；
所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管，微孔曝气管的曝气流量为0.2m3/s。
实施例2：
1.前期准备：
硒蛋白萃取液的制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份65℃的去离子水中浸泡3.5h后，研磨成浆，加入2份淀粉酶，在28℃下酶解12h，接着加入1500份浸提液，在温度为50℃的条件下浸提15h，然后放入离心机中，以3500r/min的转速离心13min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
保护性气体的制备：将按体积比为5：2的氮气和惰性气体混合，得到保护性气体。
将上述前期制备而得的物质用于下述提取硒蛋白过程中的沉淀工艺上。
2.一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以4℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以2mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1700r/min的速度搅拌2.5min，接着以搅拌速度为600r/min的速度搅拌4.5min，再以搅拌速度为130r/min的速度搅拌5min，搅拌结束停止通气，降温至-20℃，在超声波的声能密度为19W/mL、频率为38000Hz的辅助处理条件下放置4h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白；
所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管，微孔曝气管的曝气流量为0.3m3/s。
实施例3：
1.前期准备：
硒蛋白萃取液的制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份68℃的去离子水中浸泡4h后，研磨成浆，加入1.5份淀粉酶，在30℃下酶解14h，接着加入2000份浸提液，在温度为60℃的条件下浸提15h，然后放入离心机中，以4000r/min的转速离心14min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
保护性气体的制备：将按体积比为5：3的氮气和惰性气体混合，得到保护性气体。
将上述前期制备而得的物质用于下述提取硒蛋白过程中的沉淀工艺上。
2.一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以4℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以3mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1700r/min的速度搅拌2min，接着以搅拌速度为700r/min的速度搅拌5min，再以搅拌速度为160r/min的速度搅拌4min，搅拌结束停止通气，降温至-25℃，在超声波的声能密度为23W/mL、频率为39000Hz的辅助处理条件下放置4.5h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白；
所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管，微孔曝气管的曝气流量为0.4m3/s。
实施例4：
1.前期准备：
硒蛋白萃取液的制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份70℃的去离子水中浸泡3.5h后，研磨成浆，加入2份淀粉酶，在30℃下酶解14h，接着加入2000份浸提液，在温度为55℃的条件下浸提13h，然后放入离心机中，以3800r/min的转速离心16min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
保护性气体的制备：将按体积比为2：1的氮气和惰性气体混合，得到保护性气体。
将上述前期制备而得的物质用于下述提取硒蛋白过程中的沉淀工艺上。
2.一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以4.5℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以2mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1700r/min的速度搅拌2.5min，接着以搅拌速度为650r/min的速度搅拌4min，再以搅拌速度为160r/min的速度搅拌5.5min，搅拌结束停止通气，降温至-22℃，在超声波的声能密度为21W/mL、频率为37000Hz的辅助处理条件下放置3.5h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白；
所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管，微孔曝气管的曝气流量为0.4m3/s。
实施例5：
1.前期准备：
硒蛋白萃取液的制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份72℃的去离子水中浸泡4.5h后，研磨成浆，加入2份淀粉酶，在33℃下酶解11h，接着加入2500份浸提液，在温度为62℃的条件下浸提16h，然后放入离心机中，以4400r/min的转速离心17min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
保护性气体的制备：将按体积比为10：7的氮气和惰性气体混合，得到保护性气体。
将上述前期制备而得的物质用于下述提取硒蛋白过程中的沉淀工艺上。
2.一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以4.5℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以3mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1300r/min的速度搅拌2.5min，接着以搅拌速度为700r/min的速度搅拌4.5min，再以搅拌速度为140r/min的速度搅拌5.5min，搅拌结束停止通气，降温至-20℃，在超声波的声能密度为24W/mL、频率为32000Hz的辅助处理条件下放置4.5h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白；
所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管，微孔曝气管的曝气流量为0.4m3/s。
实施例6：
1.前期准备：
硒蛋白萃取液的制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份80℃的去离子水中浸泡5h后，研磨成浆，加入3份淀粉酶，在35℃下酶解15h，接着加入3000份浸提液，在温度为65℃的条件下浸提18h，然后放入离心机中，以5000r/min的转速离心20min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
保护性气体的制备：将按体积比为10：7的氮气和惰性气体混合，得到保护性气体。
将上述前期制备而得的物质用于下述提取硒蛋白过程中的沉淀工艺上。
2.一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以5℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以4mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为2000r/min的速度搅拌3min，接着以搅拌速度为800r/min的速度搅拌6min，再以搅拌速度为200r/min的速度搅拌6min，搅拌结束停止通气，降温至-17℃，在超声波的声能密度为25W/mL、频率为40000Hz的辅助处理条件下放置5h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白；
所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管，微孔曝气管的曝气流量为0.5m3/s。
对比例1：提取硒蛋白过程中的沉淀工艺所采用的原料与实施例1基本相同，不同点在于：采用常温下的丙酮溶液作为沉淀剂，并在常温环境下进行沉淀处理。
对比例2：提取硒蛋白过程中的沉淀工艺所采用的原料与实施例1基本相同，不同点在于：以1000～2000r/min的速度快速搅拌10min。
对比例3：提取硒蛋白过程中的沉淀工艺所采用的原料与实施例1基本相同，不同点在于：没有采用超声波辅助处理。
对比例4：提取硒蛋白过程中的沉淀工艺所采用的原料与实施例1基本相同，不同点在于：没有通入保护性气体。
对比试验1：将对比例1-4与实施例1-6的方法沉淀硒蛋白，取5ml硒蛋白萃取液放入HPLC中，检测硒蛋白萃取液中硒蛋白的含量，记为W1；然后用HPLC检测沉淀后的硒蛋白的含量，记为W2，计算沉淀率为＝(W1-W2)/W1×100，检测结果见表1。
对比试验2：将对比例1-4与实施例1-6的方法提取硒蛋白，采用考马斯亮蓝G－250试剂比色法。AA800紫外原子荧光光度计595nm处测定吸光度值，用牛血清蛋白制作标准曲线，求曲线回归方程，算出硒蛋白质含量，计算纯度。检测结果见表1。
表1：
| 沉淀率％ | 纯度％ | |
| 对比例1 | 56.3 | 75.3 |
| 对比例2 | 75.4 | 89.1 |
| 对比例3 | 88.2 | 94.6 |
| 对比例4 | 89.3 | 95.6 |
| 实施例1 | 95.5 | 99.8 |
| 实施例2 | 96.1 | 99.9 |
| 实施例3 | 95.8 | 99.9 |
| 实施例4 | 97.7 | 99.8 |
| 实施例5 | 96.4 | 99.9 |
| 实施例6 | 96.8 | 99.9 |
表1的结果表明：沉淀率越高，说明该方法越有效。对比例1的沉淀率最低，实施例4的沉淀率最高，说明通过采用冰丙酮在低温下进行沉淀，能够达到高效沉淀硒蛋白的效果；
纯度越高，说明该方法效率越高。对比例1的纯度最低，实施例2、3、5、6的纯度最高，说明通过采用冰丙酮在低温下进行沉淀，能够达到提高硒蛋白纯度的效果。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (6)
1.一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，其特征在于：由下述方法制备：
将硒蛋白萃取液放入低温反应器中，以3～5℃的降温速度降至0℃以下，使硒蛋白萃取液处于冰浴环境中，以1～4mL/min的速度加入4倍于硒蛋白萃取液体积的冰丙酮，同时，在硒蛋白萃取液中通入保护性气体并启动三级搅拌程序，先以搅拌速度为1000～2000r/min的速度搅拌2～3min，接着以搅拌速度为500～800r/min的速度搅拌4～6min，再以搅拌速度为100～200r/min的速度搅拌4～6min，搅拌结束停止通气，降温至-27～-17℃，在超声波的声能密度为15～25W/mL的辅助处理条件下放置3～5h，将沉淀物进行干燥和粉碎后，得到硒蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，其特征在于：所述的硒蛋白萃取液由下述方法制备：按重量份数计，将200份富硒大米放在800份60～80℃的去离子水中浸泡3～5h后，研磨成浆，加入1～3份淀粉酶，在25～35℃下酶解10～15h，接着加入1000～3000份浸提液，在温度为45～65℃的条件下浸提10～18h，然后放入离心机中，以3000～5000r/min的转速离心10～20min，所得上清液即为硒蛋白萃取液。
3.根据权利要求1所述的一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，其特征在于：所述的通入保护性气体的设备为中间镂空且呈圆环形的微孔曝气管。
4.根据权利要求3所述的一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，其特征在于：所述的微孔曝气管的曝气流量为0.2～0.5m3/s。
5.根据权利要求1所述的一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，其特征在于：所述的保护性气体为按体积比为10：3～7的氮气和惰性气体混合而成。
6.根据权利要求1所述的一种提取硒蛋白过程中的沉淀工艺，其特征在于：所述的超声波的频率为30000～40000Hz。
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