TWI642685B - 新穎胜肽及其應用 - Google Patents
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Abstract
一種具有與負電官能基結合能力的新穎胜肽及其應用，所述胜肽包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列。所述胜肽的應用包括材料螢光標定、特用化妝品、組織工程、物質分離、酵素固定化或生物感測器。
Description
本發明是有關於一種具有與負電官能基結合能力的胜肽及其應用，且特別是有關於一種對帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性的胜肽及其應用。
近年來，具有功能性的胜肽已在生物檢測、食品添加、化妝品工業及醫學等領域的研究中呈現卓越成果，可應用於檢測靈敏度、健康、美容、抗菌及癌症治療，因此，具有功能性的胜肽已成為生醫化學領域的研究重點。
胜肽序列的改變與其應用性具有密不可分的關聯性，且其應用更須與材料做進一步結合，故許多研究著重於化學交聯方法的開發。然而，習知方法具有以下三種缺點：(1)需要進行多步驟的化學反應，導致產能大幅降低；(2)許多常用的疏水性材料，難與胜肽結合進行應用；(3)胜肽的生產成本昂貴，即使全自動胜肽合成儀可降低成本，但仍相當耗時，不易量產，無法達到市場需求，導致其應用廣度的限制。針對上述缺點，使用原核
表現系統技術，使大量生產具功能性胜肽成為可行的方法，而漸為學術及產業界所重視。
基於上述，如何利用簡便方式生產一種新穎胜肽，改善其與常用材料的結合特異性，除了降低生產成本之外，更增加複合材料功能性，以改善習知方法的缺失，為目前所需研究的重要課題。
本發明提供一種具有與負電官能基結合能力的胜肽，所述胜肽利用簡便方式即可對帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性，可應用於材料螢光標定、特用化妝品、組織工程、物質分離、酵素固定化或生物感測器。
本發明的胜肽對帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性，其包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
在本發明的一實施例中，胜肽與帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合，使胜肽與應用材料連接。
在本發明的一實施例中，應用材料包括螢光蛋白、特用化妝品成分、精甘天冬氨酸肽、生物素/鏈親和素、酵素或生物分子。
在本發明的一實施例中，化妝品成分包括無機氧化物如
無機二氧化矽及黏土。
在本發明的一實施例中，生物分子包括抗原、抗體、核酸、蛋白質、脂質、酶、胜肽、醣類或微生物。
在本發明的一實施例中，帶負電官能基的材料包括無機二氧化矽材料，負電官能基包含氫氧基、硫醇基或磺酸基。
在本發明的一實施例中，表面負電官能基化的疏水性材料包括經修飾含氫氧基的聚乙烯對苯二甲酸酯、聚氯乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯。
本發明的化妝品組成物包括上述胜肽、帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料以及化妝品成分，其中胜肽與帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合，使胜肽連結特用化妝品成分。
在本發明的一實施例中，特用化妝品成分包括無機二氧化矽或黏土。
本發明的生物感測器包括上述胜肽、帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料以及生物分子，其中胜肽與帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合，且胜肽可連接生物分子，以進行生物檢測。
基於上述，本發明提出一種具有帶負電官能基結合能力的胜肽，其利用簡便方式即可對帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性，因此，可降低生產成本並增加複合材料功能性，進而改善習知方法的缺失。本發明的胜
肽可應用於材料螢光標定、特用化妝品、組織工程、物質分離、酵素固定化或生物感測器，進行物質分離及生物分子的固定化，相較於習知技術中所使用的化學交聯方法，可改善產率問題並提升便利性。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，特舉實施例作詳細說明如下。
圖1是含本發明新穎胜肽的蛋白質的分離純化分析圖。
圖2為含本發明新穎胜肽的蛋白質與對帶負電官能基材料於紫外光波長365nm照射下結合能力的分析圖。
圖3為含本發明新穎胜肽的蛋白質與對表面負電官能基化的疏水性材料特異性結合能力的螢光顯微鏡分析圖。
圖4為FITC修飾的本發明新穎胜肽對帶負電官能基材料於紫外光波長365nm照射下結合能力的分析圖。
圖5為FITC修飾的本發明新穎胜肽對表面負電官能基化的疏水性材料特異性結合能力的螢光顯微鏡分析圖。
本發明提供一種具有對帶負電官能基材料結合能力的胜肽，其對帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料
具有結合特異性，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，其中具有12個胺基酸。在本實施例中，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的胜肽例如可藉由固相生成法製備，其中將載體轉化至不同的宿主細胞，通過適當多肽表達方式以獲得。然而，本發明並不以此為限。
藉由本發明的功能性胜肽的對帶負電官能基的結合能力，其可對帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性。更詳細而言，帶負電官能基的材料可包括無機二氧化矽材料或黏土等，負電官能基可包括氫氧基、硫醇基或磺酸基，表面負電官能基化的疏水性材料可包括經表面修飾含氫氧基的聚乙烯對苯二甲酸酯、聚氯乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯等)。然而，本發明並不以此為限，胜肽亦可對其他帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性。
本發明的新穎胜肽與帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合時，可同時與應用材料連接，以進行物質分離及生物分子的固定化，進而應用於材料螢光標定、特用化妝品、組織工程、物質分離、酵素固定化或生物感測器等領域。
在本實施例中，應用材料可包括螢光蛋白、化妝品成分、精甘天冬氨酸肽(RGD)、生物素/鏈親和素(Biotin/strepavidin)、酵素或生物分子。舉例而言，生物分子可包括藥物、抗原、抗體(例如是單克隆抗體或多克隆抗體)、核酸(例如是寡聚型核酸)、蛋白質、脂質、酶、胜肽、醣類或微生物(例如是病毒或菌株)。
蛋白質例如是對抗原或抗體具有結合特異性的蛋白質，因此，可進一步與抗體或抗原進行結合以進行生物檢測。化妝品成分可包括無機二氧化矽或黏土。然而，本發明並不以此為限，亦可視情況或實際需求，將本發明具有與帶負電官能基結合能力的功能性胜肽連接至其他應用材料，以應用於生物檢測、食品添加、化妝品工業及醫學等領域。
在本實施例中，本發明的胜肽可經例如化學修飾技術或生物分子修飾技術進行修飾，其中化學修飾技術可包括醯胺化、醯化、乙醯化、交聯、環化、醣基化、羫基化、磷酸化或共價連接。然而，修飾的形式及方法並不以此為限，亦可以依實際需求選擇其他形式及方法對本發明的胜肽進行修飾。此外，本發明的胜肽可在例如肽主鏈、胺基酸側鏈、胺基末端或梭基末端進行修飾，但本發明並不以此為限。當本發明的胜肽經修飾後，可在不同的應用領域達成不同的應用目的。
更詳細而言，當本發明的功能性胜肽與帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合時，基於功能性胜肽所連接的應用材料不同，而可應用於不同用途。當應用材料為螢光蛋白時，本發明的功能性胜肽可應用於材料螢光標定；當應用材料為化妝品成分時，本發明的功能性胜肽可應用於特用化妝品；當應用材料為精甘天冬氨酸肽時，本發明的功能性胜肽可應用於組織工程；當應用材料為生物素/鏈親和素時，本發明的功能性胜肽可應用於物質分離；當應用材料為酵素時，本發
明的功能性胜肽可應用於酵素固定化；當應用材料為對抗體具有結合特異性的蛋白質時，本發明的功能性胜肽可應用於生物感測器進行生物檢測。然而，本發明並不以此為限。
基於上述應用，本發明提出一種化妝品組成物，包括上述胜肽、帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料以及化妝品成分，其中胜肽與帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合，使胜肽可連結化妝品成分。舉例而言，特用化妝品成分可包含無機氧化物如無機二氧化矽或及黏土，但本發明並不以此為限。
另一方面，本發明提出一種生物感測器，包括上述胜肽、帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料以及生物分子，其中胜肽與帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合，且胜肽連接生物分子，以進行生物檢測。舉例而言，生物分子可包括藥物、抗原、抗體(例如是單克隆抗體或多克隆抗體)、核酸(例如是寡聚型核酸)、蛋白質、脂質、酶、胜肽、醣類或微生物(例如是病毒或菌株)。蛋白質例如是對抗原或抗體具有結合特異性的蛋白質，因此，可進一步與抗體或抗原進行結合以進行生物檢測。
以下，藉由實驗例來詳細說明上述胜肽的製備方法及其與帶負電官能基的結合能力。然而，下述實驗例並非用以限制本發明。
本發明功能性胜肽的製備方法，除由廠商以固態合成儀所合成出的序列及於N端進行FITC螢光劑的修飾外，主要是使用原核表現系統技術，將0.1μg的目標質體送入BL21勝任細胞中，先放置於37℃的培養箱培養16小時，再挑出單株菌株於液態LB培養液培養4小時，之後加入誘導劑IPTG進行表現。經破菌、離心後，通過管柱進行分離，得到含本發明功能性胜肽的蛋白質，純度約為95%，1ml的菌液可生產0.06mg的含本發明功能性胜肽的蛋白質。
結果如圖1及下方表1所示，圖1是含本發明功能性胜肽的蛋白質的分離純化分析圖。在圖1中，第一行(Lane 1)是蛋白分子量(24-170kDa)，第二行(Lane 2)是破菌上清液，第三行(Lane 3)是流出物(flow through)，第四行(Lane 4)是含本發明功能性胜肽的蛋白質。在表1中，收集了12ml的細菌LB培養液，並利用酸性染劑(Coomassie brilliant blue)對蛋白質進行染色以評估純度。
配製適當濃度改質劑，取5μl改質劑以化學反應方式對
材料進行帶負電官能基改質，反應1小時後，清洗並烘乾備用。
取適當體積的含本發明功能性胜肽的蛋白質及FITC修飾之本發明新穎胜肽與帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料反應20分鐘，清洗後置於紫外光波長365nm照射及螢光顯微鏡下觀察螢光劑FITC及綠螢光蛋白的螢光(放射波長510nm)發光情形，藉此分析新穎胜肽及新穎胜肽蛋白質與上述材料特異性結合的能力，並將結果呈現於圖2至圖5中。
圖2為含本發明新穎胜肽的蛋白質對帶負電官能基材料於紫外光波長365nm照射下之結合能力的分析圖，圖3為含本發明新穎胜肽的蛋白質對表面負電官能基化的疏水性材料之結合能力的螢光顯微鏡分析圖，圖4為FITC修飾的本發明新穎胜肽對帶負電官能基材料於紫外光波長365nm照射下之結合能力的分析圖，圖5為FITC修飾的本發明新穎胜肽對表面負電官能基化的疏水性材料之結合能力的螢光顯微鏡分析圖。
在圖2中，(a)二氧化矽材料，(b)含本發明功能性胜肽的蛋白質，(c)離心後的樣品(蛋白質與材料的結合)，(d)經離心後所取出的上清液(FT)，(e)為經PBS洗滌、離心後所取出的上清液(WO)，將上述樣品置於紫外光波長365nm照射下分析螢光(放射波長510nm)發光情形之結果圖。在圖3及圖5中，(a)為修飾前之疏水性聚乙烯對苯二甲酸酯的螢光顯微鏡分析結果。(b)為修飾後之疏水性聚乙烯對苯二甲酸酯的螢光顯微鏡分析圖。
在圖4中，(a)二氧化矽材料，(b)FITC修飾之本發明新
穎胜肽，(c)經離心後的樣品(蛋白質與材料的結合)，(d)經離心後所取出的上清液(FT)，(e)經PBS洗滌、離心後所取出的上清液(WO)，將上述樣品的置於紫外光波長365nm照射下分析螢光(放射波長510nm)發光情形之結果圖。
如圖2至圖5所示，結果證實含本發明功能性胜肽的蛋白質及FITC修飾之本發明新穎胜肽可成功地與帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料進行特異性結合。
綜上所述，本發明提供了一種具與帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料有良好結合能力的新穎胜肽，其利用簡便方式即可對帶負電官能基材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性，具有降低成本且改善產率的優點，並增進複合材料的功能性，因此，能夠廣泛地用於生物感測器、物質分離、組織工程、螢光標定以及酵素固定化等領域。相較於習知技術中所使用的化學交聯方法，本發明的功能性胜肽不需使用交聯劑，因此，可大大提升便利性以改善習知方法的缺失。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
＜110＞ 中原大學 ＜120＞ 新穎胜肽及其應用 ＜160＞ 1 ＜210＞ 1 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 1 Arg Lys Gly Pro Lys Lys Phe Gly Arg Ala Ser Asp 1 5 10
Claims (12)
- 一種胜肽，其對帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料具有結合特異性，且其係由SEQ ID NO：1的胺基酸序列所組成的合成胜肽。
- 如申請專利範圍第1項所述的胜肽，其中所述胜肽與所述帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的所述疏水性材料進行特異性結合，且所述胜肽與應用材料連接。
- 如申請專利範圍第2項所述的胜肽，其中所述應用材料包括螢光蛋白、特用化妝品成分、精甘天冬氨酸肽、生物素/鏈親和素、酵素或生物分子。
- 如申請專利範圍第3項所述的胜肽，其中所述特用化妝品成分包括無機氧化物。
- 如申請專利範圍第4項所述的胜肽，其中所述無機氧化物包括無機二氧化矽或黏土。
- 如申請專利範圍第3項所述的胜肽，其中所述生物分子包括抗原、抗體、核酸、酶、胜肽、蛋白質、脂質、醣類或微生物。
- 如申請專利範圍第1項所述的胜肽，其中所述帶負電官能基的材料包括無機二氧化矽材料或黏土，負電官能基包括氫氧基、硫醇基或磺酸基。
- 如申請專利範圍第1項所述的胜肽，其中表面負電官能基化的所述疏水性材料包括經修飾含氫氧基的聚乙烯對苯二甲酸酯、聚氯乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯。
- 一種特用化妝品組成物，包括：如申請專利範圍第1項所述的胜肽；帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料；以及特用化妝品成分，其中所述胜肽與所述帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的所述疏水性材料進行特異性結合，且所述胜肽連接所述特用化妝品成分。
- 如申請專利範圍第9項所述的特用化妝品組成物，其中所述特用化妝品成分包括無機二氧化矽或黏土。
- 一種生物感測器，包括：如申請專利範圍第1項所述的胜肽；帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的疏水性材料；以及生物分子，其中所述胜肽與所述帶負電官能基的材料或表面負電官能基化的所述疏水性材料進行特異性結合，且所述胜肽連接所述生物分子，以進行生物檢測。
- 如申請專利範圍第11項所述的生物感測器，其中所述生物分子包括抗原、抗體、核酸、酶、胜肽、蛋白質、脂質、醣類或微生物。
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