KR101952599B1 - 고분자 컨쥬게이트화된 단백질 마이셀 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이셀 조립체 (micelle assemblies), 마이셀 조립체를 포함하는 조성물, 및 마이셀 조립체 및 그것의 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 체인과 같은 고분자에 대해 컨쥬게이트되는 프롤아민 단백질을 포함하며, 그것은 마이셀 조립체를 제조하는데 있어서 사용될 수 있다. 본 발명은 나아가 본 발명의 컨쥬게이트체 (conjugates)를 사용하여 분자를 캡슐화하는 방법을 포함한다. 상기 마이셀 조립체는 암을 처치하는 것, 종양을 타겟팅하는 것, 생체 내에서 약물의 독성을 감소시키는 것, 생체 내에서 캡슐화된 물질의 효능을 증가시키는 것, 분해에 대항하여 캡슐화된 물질을 보호하는 것, 및 약물 또는 다른 물질의 수 용해도를 향상시키는 것과 같은 다양한 적용을 위하여 사용될 수 있다.

Description

고분자 컨쥬게이트화된 단백질 마이셀{POLYMER CONJUGATED PROTEIN MICELLES}
본 발명은 일반적으로 약물 전달 기술, 및 더욱 구체적으로 나노 마이셀(nanomicelle) 약물 전달 시스템으로서, 소수성 수 불용성 단백질 및 수 용해성 고분자를 이용하는 시스템을 제조하기 위한 방법을 포함하는 것에 대한 것으로, 이러한 마이셀들은 프롤아민(prolamines)과 같은 소수성 수 불용성 단백질에 대하여 공유결합적으로 부착되어 있을 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol (PEG)) 또는 다른 친수성 모이어티들(moieties)을 포함하여, 나노 마이셀 약물 전달 시스템을 제조하기 위한 친양쪽성(amphiphilic) 컨쥬게이트를 형성한다.
대략적으로 40%의 약제학적 화합물은 열악한 수성 용해성을 가지고 있고, 이는 임상적인 시도들을 성공적으로 통과하기 위한 새로운 약물에 대하여 제한적인 요인이다(리핀스키(Lipinski) (2002), Am Pharm Rev 5:82-85). 수많은 시도들이 환자들에 대한 그들의 전달을 향상시키기 위하여 소수성 약물들을 용해시키는 데에 있어서 사용되어 왔다. 그러한 시도들 중의 몇 가지는 밀링(milling), 사이클로덱스트린과의 복합체화(complexing), 염의 형성, 및 계면활성제 또는 고분자적인 마이셀들(polymeric micelles)을 사용하는 것이다. 이러한 시도들의 각각은 어떤 장점 및 단점들을 가지고 있으며 따라서 약물을 용해시키기 위한 향상된 접근 방법들이 매우 요구되고 있는 실정이다.
고분자적인 마이셀들은 자기-조립된 친양쪽성(self-assembled amphiphilic) 블록 또는 그래프트 코폴리머들이다. 고분자적인 마이셀들은 콜로이드성 약물 전달 시스템을 보장하는 것으로서 주목을 끌어왔다(토르칠린(Torchilin), 저널 오브 컨트롤드 릴리스(J Controlled Release) 2001, 73, 137; 알렌 외(Allen et al.), 콜로이드 & 서피스 B(Colloids and Surfaces B): 바이오인터페이스(Biointerfaces) 1999, 16, 3; 및 오츠카 외(Otsuka et al.), 커런트 오피니언 인 콜로이드 및 인터페이스 사이언스(Current Opinion in Colloid & Interface Science) 2001, 6, 3). 이러한 콜로이드적인 시스템들 내에서, 상기 소수성 블록은 전형적으로 필수적으로 친유성 카고 분자(lipophilic cargo molecules)를 위한 "마이크로 컨테이너(microcontainer)"를 형성하는 코어를 형성한다(카타오카 외(Kataoka et al.), 어드밴스드 드럭 딜리버리 리뷰(Adv. Drug Delivery Rev.) 2001, 47, 113). 상기 마이셀들의 친수성 부분은 상기 코어 및 외부의 수성 환경 사이에서의 인터페이스를 안정화시키는 바깥 쉘(outer shell)을 형성한다.
계면활성제-기반의 마이셀적 시스템들과 비교할 때에, 고분자-기반의 마이셀들은 낮은 임계적 마이셀 농도(critical micelle concentration (CMC)) 및 감소된 독성 (reduced toxicity)과 같은 분명한 장점들을 나타낼 수 있다. 이러한 장점들에도 불구하고, 알려져있는 마이셀적 시스템의 용도는 적합하지 않은 생분해성, 생체적합성(biocompatibility), 캡슐화 효율(encapsulation efficiency), 안정성, 그 제형들의 임상적 부작용, 및 알려진 마이셀적 제형의 제조와 관련된 곤란함 및 비용으로 인하여 다소 제한되어 있다. 따라서, 마이셀적인 약물 전달 시스템과 관련되어 알려져 있는 장점들의 몇몇을 포함하며, 그러나 향상된 생체적합성을 가지고 또한 제조가 보다 용이하고 비용이 덜 드는 추가적인 마이셀적 시스템들에 대한 요구가 존재한다.
US6168804, US6506410, US20100159019, US5324351, US6020008, US20100003336
본 발명은 수 불용성 화합물들의 전달을 위한 신규한 나노 마이셀 플랫폼 기술(nanomicelle platform technology)을 제공한다. 또한 소수성 수 불용성 단백질 및 수 용해성 고분자를 사용하여 마이셀을 제조하기 위한 방법, 및 마이셀 조성물을 사용하는 방법으로서, 예를들면, 생체 내에서의(in vivo) 약물 전달을 위한 것이 제공된다. 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 친수성 모이어티들은 자인(zein)과 같은 소수성 수 불용성 단백질에 대하여 공유결합적으로 부착되어 있을 수 있으며, 상기 나노 마이셀 약물 전달 시스템을 제조하기 위하여 매우 유용한 친양쪽성 컨쥬게이트를 형성한다.
이에 따라, 본 발명은 생체 적합성 및 생분해성 코폴리머들을 포함하는 마이셀을 제공하고, 여기서 상기 코폴리머는 소수성 블록 및 친수성 블록을 포함하며; 상기 소수성 블록은 상기 친수성 블록에 대하여 공유결합적으로 컨쥬게이트되어 있는 소수성 프롤아민 단백질을 포함하고 또한 상기 친수성 블록은 적어도 약 3kDa의 분자량을 갖는 친수성 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하며; 상기 친양쪽성 코폴리머들의 프롤아민 단백질 체인들은 상기 마이셀의 내부를 향하여 방향지어져 있고, 또한 친양쪽성 코폴리머들의 폴리프로필렌 글리콜 모이어티는 상기 마이셀의 외부를 향하여 방향지어져 있으며; 또한 상기 마이셀의 직경은 약 10 nm 내지 약 300 nm이다.
생체 적합성이며 또한 생분해성의 코폴리머들은 그래프트 코폴리머 및/또는 블록 코폴리머를 포함할 수 있다. 물 속에서 상기 마이셀의 임계적 마이셀 농도(critical micelle concentration)는 예를들면 약 27 ℃에서 약 0.015 g/L 내지 약 0.035 g/L, 약 0.02 g/L 내지 약 0.03 g/L, 또는 약 0.25 g/L일 수 있다. 상기 소수성 약물은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 1 내지 약 7, 또는 1 부터 7 까지의 어떤 정수의 범위를 갖는 Log P 값을 갖는다.
상기 소수성 프롤아민 단백질은 자인(zein), 글리아딘(gliadin), 호르데인(hordein), 카피린(kafirin), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 친수성 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 약 4 kDa 내지 약 220 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 상기 친수성 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 약 4 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
상기 마이셀은 추가적으로 마이셀의 코어 내에 복수 개의 카고 분자들(cargo molecules)을 포함할 수 있다. 상기 카고 분자들은 예를들면, 하나 또는 초과의 약물, 단백질, 핵산, 호르몬, 수용체, 진단용 물질들, 이미징 물질들, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 약물은 항산화제(antioxidant), 소염제(anti-inflammatory drug) 또는 항암제(anticancer drug)일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 약물은 커큐민(curcumin) 또는 독소루비신(doxorubicin)이다. 또 다른 실시예에서, 상기 이미징 물질은 닐 레드(Nile red)이다.
다른 실시예에서, 상기 약물은 레티노이드(retinoid)이다. 적합한 레티노이드의 예는 레티놀(retinol), 13-트랜스-레티노산(트레티노인)(13-trans-retinoic acid (tretinoin)), 13-시스-레티노산(이소트레티노인)(13-cis-retinoic acid (isotretinoin)), 9-시스-레티노산(알리트레티노인)(9-cis-retinoic acid (alitretinoin)), 레틴알데히드(retinaldehyde), 에트레트네이트(etretnate), 애시트레틴(acitretin), 알파-카로틴(α-carotene), 베타-카로틴(β-carotene), 감마-카로틴(γ-carotene), 베타-크립토산틴(β-cryptozanthin), 루테인(lutein), 제아크산틴(zeaxanthin), 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 여기 기재된 복수 개의 마이셀들 및 약제학적으로 또는 화장용으로(cosmetically) 허용 가능한 희석제, 부형제, 또는 운반체를 포함하는 약제학적 또는 화장용의 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 또는 화장용의 조성물은 예를 들면, 분산물, 타블렛, 캡슐, 주사용 제형, 에어로졸 제형, 젤, 연고, 크림, 로션, 또는 샴푸의 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 마이셀을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하이드로알콜성 용매로부터 PEG화된 프롤아민을 침전시키기 위하여 수성의 현탁물에 대하여 버퍼를 추가함으로써 PEG화된 프롤아민의 수성 분산물을 형성하는 것 및 탈이온수에 대한 투석에 의하여 상기 분산물 내에서 알콜 및 비 반응된 PEG 및 글리신을 제거하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가적으로 마이셀을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 PEG화된 프롤아민의 수성 현탁물로부터 알콜을 제거하여 PEG화된 프롤아민의 건조 필름을 형성하고; 및 예를 들면, 비캡슐화된 소수성 분자들을 제거하기 위하여, 예를 들면, 물 및 현탁물과 같은 버퍼 조성물 내에 복수 개의 마이셀 들을 제공하기 위하여, 탈이온수에 대한 투석에 의해 후속되는 물 또는 버퍼 내에서 상기 PEG-자인 필름(PEG-zein film)을 재현탁 시키는 것을 포함한다. 이러한 방법에서, 자인의 PEG화 후에 상기 에탄올은 예를 들면, 로터리 증발기 내에서의 증발에 의하여 제거될 수 있으며 건조 필름을 형성한다. 상기 건조 필름은 다음으로 예를 들면, 비캡슐화된 소수성 화합물들을 제거하기 위하여, 수성 상 내에서 마이셀들을 형성하기 위하여 물에서 재구성될 수 있고 또한 탈이온수에 대해서 투석될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 제 1 혼합물을 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 화합물 및 프롤아민 단백질을 하이드로알콜성 용매 내에 용해시키는 것에 의하여 여기 기재된 마이셀들을 제조하는 방법을 제공하며; 여기서 상기 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 하나의 말단은 모노알킬레이트화되어 있고, 및 제 2 말단은 반응성 그룹을 포함하며 또한 상기 폴리에틸렌 글리콜 화합물은 적어도 약 3 kDa의 분자량을 갖는 것이며, 상기 제 1 혼합물을 가열하여 수성의 현탁물 내에서 PEG화된 프롤아민을 형성하고, 및 선택적으로 상기 수성의 현탁물 내의 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 과량의 반응성 그룹들을 소화시키고 (quenching), 및 동결건조 (lyophilization) 에 의해 후속되는 탈이온수에 대한 투석에 의하여 상기 디스퍼션 내의 알콜 및 비반응된 PEG 및 글리신을 제거한다.
본 발명의 나머지는 두 경로 중의 하나를 따를 수 있다. 일 실시 예에서, 상기 방법은 (a) 하이드로알콜성 용매 내에 PEG-자인을 부가하고 및 탈이온수에 대한 투석에 의하여 알콜을 제거하고 버퍼 및 물 조성물 내에서 복수 개의 마이셀들을 형성하는 것을 포함한다. 다른 실시 예에서, 상기 방법은 (b) 수성의 현탁물의 알콜을 제거하여 PEG화된 프롤아민의 건조 필름을 형성하고; 및 예를 들면, 비캡슐화된 소수성 화합물을 제거하고 수성 상 내에서 마이셀을 형성하기 위하여 투석에 의해 후속되는 물 또는 버퍼 내에서 건조 필름의 PEG화된 프롤아민을 재현탁시키는 것을 포함한다.
따라서, 일단 제조된 상기 PEG 프롤아민은 특정 농도로 하이드로알콜성 용액 내에 용해될 수 있다. 제조의 필름 방법에 따를 때에, 상기 알콜은 제거되어 PEG-자인 필름을 형성한다. 상기 필름은 다음으로 탈이온수로 재건조되어 (recocstituted) PEG-자인 마이셀을 형성한다. 이러한 조성물은 다음으로 비캡슐화된 화합물을 제거하기 위하여 물에 대해 투석될 수 있다. 수성의 분산물의 형성은 다음으로 PEG-자인 마이셀 파우더를 획득하기 위하여 동결 건조에 의해 후속될 수 있다.
제조의 투석 방법에 따를 때에, 알콜은 탈이온수에 대해 투석됨으로써 제거되어 마이셀을 형성한다. 수성의 분산물은 다음으로 동결 건조될 수 있고 PEG-자인 마이셀 파우더를 형성한다. 따라서, 본 발명은 파우더 형태의 분리된 복수 개의 마이셀을 제공하기 위하여 분산물과 같은 조성물 내에서 복수 개의 마이셀을 동결 건조시키는 것을 포함할 수 있다.
제조를 위한 방법의 어느 것에서, 유용한 카고 분자들, 예를들면, 치료학적 물질 또는 이미징 물질이 용매 시스템 내에 용해될 수 있고 또한 상기 제 1 혼합물에 대해 추가될 수 있으며, 결과적으로 카고 로드된 마이셀들의 형성, 즉 약물 로드된 마이셀들이 형성된다. 상기 마이셀들의 캡슐화 효율은 약 60% 내지 약 95%일 수 있다. 상기 방법은 약물 로드된 마이셀들의 치료학적 조성물을 제공하기 위하여 버퍼 용액 내에 복수 개의 마이셀들을 분산시키는 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 복수 개의 마이셀들과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 세포 내에서 세포적 P-글리코단백질 (P-gp) 유출 펌프 (efflux pump)을 저해하고, 이에 따라 세포 내에서 세포적 P-gp 유출 펌프(efflux pump)를 저해하는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 세포를 여기 기재된 복수 개의 마이셀과 접촉시키는 것을 포함하는 약물-저항성 암세포 내에 치료학적 물질의 흡수를 향상시켜, 이에 따라 약물-저항성 암 세포 내에서 상기 치료학적 물질의 섭취를 향상시키는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 마이셀 내에 친유성 화합물을 캡슐화하는 것을 포함하는 친유성 화합물의 수 용해성을 향상시켜, 이에 따라 친유성 화합물의 수 용해성을 향상시키는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 마이셀 내에 화합물을 캡슐화 시키는 것을 포함하는 화합물의 화학적 안정성을 향상시켜, 이에 따라 상기 화합물의 화학적 안정성을 향상시키는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 마이셀 내에 화합물을 캡슐화 시키는 것 및 상기 캡슐화된 화합물과 생물학적 매개를 접촉시키는 것을 포함하는 조성물로부터 화합물의 지속적인 방출을 제공하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 화합물은 약 1 시간 내지 약 14 일의 기간에 걸쳐 마이셀로부터 방출된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 대상 또는 샘플과 여기 기재된 마이셀 또는 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는 비-면역성 및 생체 적합성 제형으로 대상 및 샘플에 대해 화합물을 제공하여, 이에 따라 상기 대상 또는 상기 샘플에 대하여 비-면역성 및 생체적합성 제형을 제공하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 그러한 제형은 캡슐화된 화합물의 시스템적인 순환을 향상시킬 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 마이셀 내에 활성 물질 또는 이미징 물질을 캡슐화시키는 것 및 마이셀을 포함하는 조성물과 피부를 접촉시키는 것을 포함하는 활성 물질 또는 이미징 물질의 피부 침투성 및 보유성을 향상시켜, 상기 마이셀의 부재 하에 활성 물질 또는 이미징 물질의 피부 침투성에 비하여 활성 물질 또는 이미징 물질의 피부 침투성을 향상시키는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 마이셀 내에 약물을 캡슐화시키는 것, 및 종양을 가지고 있는 대상에 대하여 복수 개의 마이셀을 투여하는 것을 포함하는 약물의 종양 축적을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 캡슐화된 약물은 마이셀의 부재 하에 대상에 대하여 투여된 약물에 비하여 훨씬 큰 정도로 종양에 축적된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 마이셀 내에 약물을 캡슐화시키고, 및 상기 복수의 마이셀을 종양을 가지고 있는 대상에 대해 투여하는 것을 포함하는 포유류 내에서의 비 종양 함유 (nontumor-bearing) 조직 내의 약물 축적을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 비캡슐화된 약물은 마이셀의 부재하에 대상에 대해 투여된 약물에 비하여 훨씬 적은 정도로 비 종양 함유 (nontumor-bearing) 조직 내에 축적된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 복수 개의 로드된 마이셀을 대상에 대하여 투여하는 것을 포함하는 약물의 효율성을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 약물의 효율성은 마이셀의 부재 하에서의 약물의 투여에 비하여 증가된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 여기 기재된 복수 개의 로드된 마이셀을 대상에 대하여 투여하는 것을 포함하는 약물의 독성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 약물의 독성은 마이셀의 부재 하에서의 약물의 투여에 비하여 감소된다.
본 발명은 또한 화학식 I의 코폴리머를 제공한다:
Z-(PEG)n (I)
여기서 Z는 프롤아민 단백질이고, "PEG"는 적어도 약 3 kDa의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가고, 및 n은 약 1 내지 약 100, 또는 약 5 내지 약 50이다. 프롤아민 단백질은, 예를 들면, 백색 자인, 노란 색 자인, 글리아딘, 호르데인, 또는 카피린일 수 있다. 다양한 분자량을 갖는 다양한 PEG 모이어티들이 상기 프롤아민에 대해 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들면, PEG 모이어티의 분자량은 1 kDa 내지 약 220 kDa, 약 2kDa 내지 약 20 kDa, 약 3 kDa 내지 약 20 kDa, 약 4 kDa 내지 약 20 kDa, 약 4 kDa 내지 약 10 kDa, 또는 약 5 kDa일 수 있다.
화학식 I는 프롤아민 및 PEG의 그래프트 코폴리머; 및 프롤아민 및 PEG의 블록 코폴리머 (디블록 또는 트라이블록과 같은 멀티블록 코폴리머) 를 포함할 수 있다.
예들은 화학실 II-V를 포함한다:
Z-g-PEG (그래프트 코폴리머) (II)
Z-b-PEG (디블록 코폴리머) (III)
Z-b-PEG-b-Z (트라이블록 코폴리머) (IV)
PEG-b-Z-b-PEG (트라이블록 코폴리머) (V)
화학식 I의 코폴리머들은 소수성 치료학적 물질들의 전달을 위한 것과 같은, 약물 전달 적용에 있어서 유용할 수 있는 응집물을 제조하기 위해 유용한 중간체이다.
본 발명은 추가적으로 액상의 현탁물, 분산물 또는 용액, 예를 들면 I.V. 제형 내에 여기 기재된 복수 개의 코폴리머 또는 마이셀을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 용매 또는 용매 시스템 내에 복수 개의 화학식 I 및 분자 (즉, 치료학적 물질) 를 혼합하는 것, 및 상기 분자 주위에 화학식 I의 코폴리머를 응집시키는 것을 포함하여 상기 캡슐 (즉, 복수의 화학식 I의 코폴리머에 의해 캡슐화되고 둘러싸여진 분자) 을 제공하는 본 발명의 캡슐을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 희석제 및 분자 (즉, 치료학적 물질) 를 둘러싸는 복수 개의 화학식 I의 코폴리머로부터 형성된 마이셀을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 캡슐 (즉, 복수의 화학식 I에 의하여 예를 들면 마이셀 내에 캡슐화되거나 둘러싸여진 치료학적 물질); 및 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 대안적으로, 상기 치료학적 물질은 소수성 코어 내의 프롤아민 및/또는 친수성 고분자성 쉘에 대하여 컨쥬게이트되거나 복합체화될 수 있다. 상기 마이셀은 또한 다중성의 (multiple) 치료학적 물질에 대하여 사용될 수 있고, 및/또는 다중성의 치료학적 물질들은 상기 코어 및/또는 쉘에 대하여 복합체화/컨쥬게이트될 수 있다. 치료학적 물질에 추가적으로 또는 대신하여, 상기 마이셀들은 진단용 및/또는 이미징 물질들 등과 같은 것을 운반하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 동물에 대하여 본 발명의 캡슐을 투여하는 것을 포함하는 물질에 의한 치료가 필요한 동물에 대해 치료학적 물질을 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 캡슐은 화학식 I의 코폴리머의 마이셀 적인 어셈블리 내에 치료학적 물질을 포함한다.
본 발명은 또한 의학적 치료에서의 사용을 위한 여기 기재된 마이셀적 조성물의 용도를 제공한다. 상기 의학적 치료는 암, 예를 들면 유방암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 또는 결장암을 치료하는 것이 될 수 있다. 본 발명은 또한 그러한 암들을 치료하기 위한 제약의 제조를 위한 여기 기재된 마이셀 적 조성물의 용도를 제공한다. 상기 제약은 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제, 또는 캐리어를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 여드름과 같은 피부 및 모낭성 (follicular) 장애들의 치료를 위하여 제공되고, 또한 탈모, 지루성 습진 (seborrhetic eczema), 모낭염(follicullitis), 피부 악성 종양(cutaneous malignancies), 건선(psoriasis), 각질화(keratinization disorders), 피부 변색(skin discoloration), 상처(wounds), 및 광노화(photoaging)의 치료에서 사용될 수 있다.
후속되는 도면들은 명세서의 일부를 형성하며 또한 나아가 어떤 실시예들 또는 본 발명의 다양성을 개시하기 위하여 포함된 것이다. 어떤 면에서, 본 발명의 실시예들은 여기 개시된 구체적인 상세한 설명과 결합하는 후속하는 도면들을 참조하는 것에 의해 가장 잘 이해될 수 있다. 상세한 설명 및 후속하는 도면들은 어떤 구체적인 실시예, 또는 본 발명의 어떤 관점을 강조할 수 있지만, 단, 본 기술 분야에서 숙련된 기술자는 상기 실시예 또는 관점의 일부가 본 발명의 다른 실시예 또는 관점과 결합 되는데에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
도 1은 일 실시예에 따른 약물 로드된 PEG-자인 나노 마이셀의 형성을 도시한 것이다.
도 2는 일 실시예에 따른 친양쪽성 PEG-자인의 제조를 위한 일반적인 과정들을 기술하는 플로우 차트를 도시한 것이다.
도 3은 일 실시예에 따른 친양쪽성 PEG-자인의 제조를 위한 구체적인 과정들을 기술하는 플로우 차트를 도시한 것이다. 이러한 및 다른 도면들에 언급된 구체적인 양은 특정한 실시예의 예시를 위한 것이며, 또한 본 기술 분야에서 숙련된 기술자에 의해 이미 인정되는 바와 같이 많은 다양한 것들이 여기 기재된 과정들에 대해 적용될 수 있다.
도 4는 (a) FTIR 및 (b) 크기 익스클루시브 크로마토그래피(size exclusivw chromatography)에 의해 PFG-자인 컨쥬게이트의 특성을 도시한 것이다. 자인, PFG-에스테르, 및 PEG-자인 (각각 5 mg)의 FTIR 스펙트럼은 NICOLET 380 ATR-FTIR 분광 광도계(spectrophotometer) (써모 일렉트론 코포레이션(THERMO ELECTRON Corporation), 메디슨(Madison), 와이오밍(WI))의 2cm-1 해상도에서 ZnSe 크리스탈에 대해 기록되었다. 각각의 스펙트럼은 100 번 스캔의 평균이다. 기능성 그룹들의 피크 포지션은 OMNIC 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. SEC는 HPLC (베크맨 쿨터(BECKMAN COULTER), 브레아(Brea), 캘리포니아(CA)) 시스템 내에서 페노메넥스 비셉 에스이씨-에스 2000(PHENOMENEX BISEP SEC-S 2000) 4.6 mm x 3000 컬럼 (페노메넥스®(PHENOMENEX®) 토렌스(Torrance), 캘리포니아(CA))을 사용하여 수행되었다. 샘플들은 0.5 mL/분 의 플로우 레이트를 사용하여 모바일 상으로서 70 % (v/v) 에탄올을 사용하여 분리되었다. 상기 컬럼 전개는 280 nm 에서 모니터링되었다.
도 5는 (a) DMSO 및 (b) D2O 내에서의 PEG-자인의 1H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 5a에서, PEG의 에틸렌 그룹들은 3.56 ppm 에서 관찰되었고 또한 단백질/아미드 피크는 3.36 ppm 에서 관찰되었다. 도 5b에서, PEG의 에틸렌 결합은 3.56 ppm 에서 관찰되었고, 반면 3.36 ppm 에서의 단백질/아미드 피크는 소수성 자인 코어가 D2O 에 용해되지 않기 때문에 존재하지 않는다.
도 6은 희석에 따른 PEG-자인 마이셀들의 안정성을 보여준다; 10 mM 시트레이트 버퍼 pH 7.4 내에서 PEG- 자인 마이셀들의 2 mg/mL 스톡 분산물은 20, 100, 200, 500, 및 1000 배로 희석되었고, 또한 마이셀들의 크기는 입자 크기 분석기(particle size analyzer) (NICOMP 380 ZLS 제타 포텐셜 애널라이저(Zeta Potential Analyzer), 입자 사이징 시스템(Particle Sizing Systems), 산타바바라(Santa Barbara), 캘리포니아(CA))로 결정되었다. 상기 데이터는 마이셀들의 크기가 현저하게 변화하지 않았기 때문에 마이셀들이 희석에 대해 안정하다는 것을 보여주었다. 각각의 데이터 포인트는 세 번의 실험의 평균± SD이다.
도 7은 PEG화된 자인의 로그화된 농도(g/L)에 대하여 339 nm 및 334 nm (방출 파장은 390 nm이다)의 여기 파장(excitation wavelength)에서의 파이렌(pyrene) (0.6 μM) 흡광도(absorbance) 비율의 플롯을 나타낸 것이다. PEG화된 자인의 농도가 증가함에 따라 임계적 마이셀성 농도(critical micellar concentration (CMC))에서의 파이렌 흡광도의 강도는 현저하게 이동한다. PEG화된 자인의 CMC는 27℃에서 0.025 (g/L)이다.
도 8은 쥐 에서 PEG-자인 마이셀들의 생체 내로의 투여 후에 면역 반응성을 도시한 것이다. 혈청 내에서 항-자인 항체들 (y 축에서의 광학 밀도)이 제 1 투여량의 제 3 주 후에 및 증강된 투여량 (booster dose) 후의 제 5 주 째에 측정되었다. 식염수 또는 PEG-자인 마이셀들(100 ㎍/50 μL)이 쥐에서 피하에 대하여(subcutaneously) 투여되었다. 결과들은 평균± 평균의 표준 에러 (n=4)로서 기재되었다. PEG-자인 마이셀은 어떤 항-자인 항체들을 생산하지 않았으며 또한 그 값들은 식염수 대조군과 유사하였다.
도 9는 일 실시예에 따른, 필름 방법을 사용하여 커큐민-로드된 PEG화된 자인 마이셀들을 제조하는 과정들을 도시한 것이다.
도 10은 일 실시예에 따른, 투석 방법을 사용하여 커큐민-로드된 PEG화된 자인 마이셀들을 제조하는 과정들을 도시한 것이다.
도 11은 1% w/v 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 포지티브하게 염색된 커큐민-로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 투과 전자 현미경 사진(transmission electron microphotograph (TEM))을 도시한 것이다. 스케일 1 mm = 0.05 gm.
도 12는 비-탭핑 모드(non-tapping mode)에서 2 ㎛의 스캔 속도에서의 커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀들의 원자력 현미경(atomic force microscopy (AFM)) 이미지들을 도시한 것이다. 왼쪽부터 오른쪽으로 각각 88 nm의 z-스케일, 0.39 V, 및 61°에서의 대표적인 샘플의 2D 토포그래피(topography), 진폭(amplitude), 및 상(phase) 이미지들이다. AFM 에서 측정된 100 입자들의 평균 입자 크기는 90 ±10 nm였다.
도 13은 메탄올, PBS pH 7.4 (10% 메탄올을 포함하는) 내에서의 커큐민 (10 ㎍/mL), 및 PBS pH 7.4 내에서의 커큐민-로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 UV-비져블 스펙트럼(UV-Visible spectrum )을 도시한 것이다. 커큐민-로드된 PEG화된 자인의 흡광도는 메탄올 내에 용해된 커큐민의 흡광도와 유사하며, 이는 커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀들의 향상된 수 용해도를 보여준다.
도 14는 메탄올, PBS pH 7.4 (10% 메탄올을 포함하는) 내에서의 커큐민 (10㎍/mL), 및 PBS pH 7.4 내에서의 커큐민-로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 형광 스펙트럼들(fluorescence spectra )을 도시한 것이다. 540 nm 으로부터 525 nm 로의 커큐민의 방출 스펙트럼들의 λmax의 이동은 상기 커큐민이 마이셀 내에 트랩된 것을 보여준다. 또한 현저하게 증가된 커큐민의 수성 용해도로 인하여 PEG화된 자인 마이셀들 내로의 트랩화 이후에 물에서의 커큐민 형광도에서 현저한 증가 (대략적으로 4 배)가 존재한다.
도 15는 자인, 커큐민, 블랭크 PEG-자인, mPEG-에스테르, 및 커큐민-로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 시차 주사 열량 측정법(calorimetry (DSC))의 온도 기록도(thermograms)를 차동적으로(differential) 스캔닝한 것을 도시한 것이다.
도 16은 생체 외에서의 시트레이트 버퍼 pH 7.4 내의 PEG-자인 마이셀들로부터 커큐민의 방출 프로파일을 도시한 것이다 (평균 ± SE; n=3). 커큐민 로드된 PEG-자인 마이셀들 (1 mg/mL)은 여기 기재된 바와 같은 투석 방법에 의해 제조되었고, 원심분리 튜브 내에서 1 mL의 시트레이트 버퍼 pH 7.4 내에서 인큐베이트 되었으며, 또한 그 현탁물은 50 rpm 에서 수평의 쉐이커 워터 배쓰(horizontal shaker water bath) 내에서 37℃로 유지되었다. 상기 샘플은 12,000 rpm으로 12분 동안 원심 분리되었다. 상청액은 다음으로 HPLC를 사용하여 PEG-자인 마이셀들로부터 방출된 커큐민에 대하여 분석되었다. A C18 컬럼(워터스TM 코포레이션(WATERSTM Corporation), 마이애미, 미국(MA, USA))이 사용되었으며 또한 그 모바일 상은 60 % 아세토니트릴 및 40 % 시트릭 버퍼 (50% (w/w) 소듐 하이드록사이드 용액을 사용하여 pH 3.0으로 조정된 1 %(w/v)) 시트르산 용액) 로 이루어졌다. 플로우 속도는 1.0 mL/분 이었고 또한 검출 파장은 420 nm이었다. 방출 스터디는 24 시간 동안 진행되었다. 각각의 데이터 포인트는 세 번의 실험의 평균 ± SD 값이다.
도 17은 생체 외에서의 커큐민 (10%의 DMSO에 용해 되어있는) 의 독성 프로파일을 도시한 것이다. 약물 저항성을 갖는 NCl/ADR-RES 약물 저항성의 인간 난소암 세포들 (웰 당 2000 세포 수)가 7.8 nM 내지 500 nM의 농도 범위를 갖는 커큐민 용액 또는 커큐민 마이셀로 4 일 동안 처치되었다. 제 5일 째에 MTT를 사용하여 독성 분석이 수행되었다. 데이터 포인트는 평균 ± SD 값 (n=4)이다. 커큐민 용액(Curcu-soln) 및 커큐민 마이셀들(Curcu-M)에 대한 IC50 값은 각각 104 nM 및 34 nM 이었다.
도 18은 수직의 디퓨젼 셀 내에서 다른 기간 동안의 처치 후에 잘라진(excised) 돼지 피부를 사용하여 자유 커큐민 (PBS 내의 10% 트윈 80, pH 7.4; 도면에서는 "C"로 표현되어 있는) 및 캡슐화된 커큐민 (PBS, pH 7.4 내; 도면에서는 "CM"으로 표현되어 있는) 의 생체 내 피부 침투성을 도시한 것이다. 잘라진 돼지 피부는 수직의 디퓨젼 셀 두 개 구획 사이에 샌드위치되었다. 수용체 매개는 포스페이트 버퍼 (20% 에탄올을 포함하는 pH 7.4) 로 이루어졌고, 37℃에서 유지되었으며 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 상기 피부는 세척되었고 또한 각질층(stratum corneum)을 제거하기 위하여 스카치 테이프(SCOTCH TAPE)를 사용하여 15-20 회 테이프-스트립핑되었다. 커큐민은 90 % 에탄올을 사용하여 테이프 스트립 및 남아있는 피부(눈으로 보이는 표피(epidermis) + 피부(dermis))로부터 분리되었다. 피부 내 및 수용체 상 내의 커큐민의 양은 HPLC 방법을 사용하여 결정되었다.
도 19는 자유 커큐민 (a) 및 PEG-자인 마이셀 내에 캡슐화된 커큐민 (b)으로 의 6 시간의 처치 후에 돼지 피부의 공초점 형광(confocal fluorescence) XZ 광학적 스캔 이미지들(0-100 ㎛ 깊이) 및 커큐민 마이셀의 모낭을 통한 침투성(penetration) (c) 헤어 모낭을 통한 (xy 표면도) 및 (d) 각질층(stratum corneum (SC)) 및 눈으로 보이는 표피(epidermis) 내에 정량화된 커큐민 형광 픽셀들(fluorescence pixels )을 도시한 것이다. SC 0-20 ㎛ 에 대하여 및 표피 20-100 ㎛ 에 대하여 형광 픽셀들을 정량화 하는데 있어 XZ 광학적 섹션이 사용되었다.
도 20은 일 실시예에 따른, 필름 방법을 사용하여 독소루비신-로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 제조를 위한 과정들을 도시한 것이다.
도 21은 일 실시예에 따른, 투석 방법을 사용하여 독소루비신-로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 제조를 위한 과정들을 도시한 것이다.
도 22는 1% w/v 우라닐 아세테이트로 포지티브하게 염색된 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀들의 전자 투과 현미경 사진(transmission electron microphotograph (TEM))을 도시한 것이다. 스케일 1 mm = 0.11 ㎛
도 23은 비-탭핑 모드(non-tapping mode)에서 2 ㎛의 스캔 속도에서의 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀들의 원자력 현미경(atomic force microscopy (AFM)) 이미지들을 도시한 것이다. 왼쪽부터 오른쪽으로 각각 228 nm의 z-스케일, 0.64 V, 및 71°에서의 대표적인 샘플의 2D 토포그래피(topography), 진폭(amplitude), 및 상 이미지들(phase images)이다. 100 입자들의 평균 입자 크기는 125 ±15 nm였다.
도 24는 각각 포스페이트 버퍼 pH 7.4 내에서의 독소루비신 (10㎍/mL), 90% 에탄올 내에서의 독소루비신, 및 PBS pH 7.4 내에서의 독소루비신 로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 UV-비져블 스펙트럼들(UV-Visible spectra)을 도시한 것이다. 독소루비신-로드된 PEG화된 자인의 흡광도는 90% v/v 에탄올 내에 용해된 독소루비신의 흡광도보다 높으며, 이는 PEG 자인 마이셀 내에서의 독소루비신의 증가된 수성 용해도에 기인한다.
도 25는 각각 포스페이트 버퍼 pH 7.4, 90% 에탄올 내에서의 독소루비신 (10㎍/mL), 및 PBS pH 7.4 내에서의 독소루비신 로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 형광 스펙트럼들(fluorescence spectra)을 도시한 것이다. 독소루비신의 현저하게 증가된 수성 용해도로 인하여 PEG화된 자인 마이셀들 내에 트랩화 후에 pH 7.4 내에서의 독소루비신 형광도에서의 현저한 증가 (대략적으로 50 배)가 존재한다.
도 26은 자인, 독소루비신, 블랭크 PEG-자인, mPEG-에스테르, 및 독소루비신-로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 시차 주사 열량 측정법(calorimetry (DSC))의 온도 기록도(thermograms)를 차동적으로(differential) 스캔닝한 것을 도시한 것이다.
도 27은 생체 외에서 시트레이트 버퍼 pH 7.4 내의 PEG-자인 마이셀들로부터 독소루비신의 방출 프로파일을 도시한 것이다 (n=3, ±SEM). 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀들(1 mg/mL)은 원심분리 튜브 내에서 1 mL의 시트레이트 버퍼 pH 7.4 내에서 인큐베이트 되었으며, 또한 그 현탁물은 50 rpm 에서 수평의 쉐이커 워터 배쓰(horizontal shaker water bath) 내에서 37℃로 유지되었다. 상기 샘플은 12,000 rpm으로 12분 동안 원심 분리되었다. 상청액은 HPLC 분석을 사용하여 PEG-자인 마이셀들로부터 방출된 독소루비신에 대하여 분석되었다. A C18 컬럼(워터스TM 코포레이션(WATERSTM Corporation), 마이애미, 미국(MA, USA))이 사용되었으며 또한 그 모바일 상은 1 mL/분의 플로우 속도에서 트리플루오로아세트산 (0.1 % v/v) 및 아세토니트릴 5 % v/v (~ 3 분, 80 % v/v ~11 분 및 5 % v/v ~22 분)로 이루어졌다. 형광도 검출기가 사용되었다 (각각 여기(excitation) 로서 505 nm 및 방출 파장으로서 550 nm). 방출 스터디는 24 시간 동안 진행되었다. 각각의 데이터 포인트는 세 번의 실험의 평균 ± SD 값이다.
도 28은 생체 외에서의 독소루비신 염기 (90 % v/v 에탄올에 용해 되어있는) 및 PEG-자인 마이셀의 독성 프로파일을 도시한 것이다. MCF- 7 인간 유방암 세포들 (웰 당 2000 세포 수)이 15.62 nM 내지 1000 nM의 농도 범위를 갖는 독소루비신 용액 (Dox-soln) 또는 독소루비신 로드된 마이셀 (Dox M)로 4 일 동안 처치되었다. 제 5 일 째에 MTT를 사용하여 독성 분석이 수행되었다. 데이터 포인트는 평균 ± SE 값 (n=4)을 나타낸다. 독소루비신 용액 및 독소루비신 마이셀들에 대한 IC50 값은 각각 148 nM 및 30 nM 이었다.
도 29는 생체 외에서의 독소루비신 염기 (90 % v/v 에탄올에 용해 되어있는) 및 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 독성 프로파일을 도시한 것이다. 약물 저항성을 갖는 NCl/ADR-RES 약물 저항성의 인간 난소암 세포들 (웰 당 2000 세포 수)가 31.25 nM 내지 1000 nM의 농도 범위를 갖는 독소루비신 용액(Dox-soln) 또는 독소루비신 마이셀(Dox-M)로 4 일 동안 처치되었다. 제 5 일 째에 MTT를 사용하여 독성 분석이 수행되었다. 데이터 포인트는 평균 ± SE 값 (n=4)을 나타낸다. 독소루비신 용액 및 독소루비신 마이셀들에 대한 IC50 값은 각각 126 nM 및 29 nM 이었다.
도 30은 NCl/ADR-RES 세포 라인 내에서의 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 세포적 섭취에 대한 온도의 영향을 도시한 것이다. 세포들은 4 ℃에서 2 시간 동안 예비-인큐베이트되었다. 2 시간 후에 세포들은 PBS pH 7.4 로 두 번 세척되었고, 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀 (5 ㎍/mL의 독소루비신에 대응하는) 로 처치되었다. 두 시간 후에, 상기 처치가 제거되었고 또한 세포들은 아이스 콜드 PBS pH 7.4 로 두 번 세척되었으며, 세포 여과물(lysate) 내에서의 독소루비신 함유의 양이 HPLC 분석을 사용하여 측정되었다. 대조 그룹 내에서, 세포들은 37 ℃에서 인큐베이트되었다. 각각의 값은 평균 ±SE (n=3)이다. 4 ℃에서의 세포 섭취는 37 ℃에서의 세포 섭취와 비교할 때에 현저히 낮았다 (p<0.05; 스튜던트 t-테스트).
도 31은 NCl/ADR-RES 세포 라인 내 (50000 세포 수/플레이트) 에서의 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀 및 독소루비신 용액 (51 Lig/mL) 의 세포적 섭취의 동력학을 도시한 것이다. 데이터 포인트는 세 번의 실험의 평균 ± SE 값이다.
도 32는 저항성의 인간 암 세포들 내에서의 PEG-자인 마이셀들의 세포 섭취의 메카니즘을 도시한 것이다. NCl/ADR-RES 세포들 (50000 세포 수/웰)은 PLURONIC F68 (1 mg/mL; 포지티브 대조군; P-글리코단백질 (P-gp)을 저해하는 것으로 알려져 있는 블록-코폴리머), 및 블랭크 PEG-자인 마이셀 (0.050 mg/mL)로 처치 되었다. 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션 후에 50 μL의 칼세인 AM(clcein AM)의 0.25 μM/L 가 부가되었다. 형광도는 실온에서 마이크로 플레이트 리더 (485/589 여기/방출 파장) 를 사용하여 1 시간 동안 매 5 분 측정되었다. P-gp 저해는 하기와 같이 계산되었다: % 상대적인 형광도 = 100 x (FLtreatment -FlNon-treatment)/ FLNon-treatment). 데이터 포인트는 평균 ±SE (n=8) 을 나타낸다. 더 높은 P-gp 저해가 블랭크 PEG-자인 마이셀에 대해 관찰되었다.
도 33은 쥐 이형이식(allograft) 종양 마우스 모델에서의 독소루비신 용액 및 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀(식염수 내)의 생체 내 생물 분포 (biodistribution)를 도시한 것이다. 상기 종양 모델은 JC 마우스 유방 암 세포의 피하로의 주사에 의해 야기되었다. 독소루비신 용액 또는 마이셀은 테일 정맥 주사(tail vein injection)에 의해 주어졌다 (4.5 mg/kg). 동물들은 처치 투여 후 3 시간에 희생되었다. 종양 및 기관들이 수집되었다. 종양 및 기관들 내의 독소루비신 농도는 형광 기반의 이동상(isocratic) HPLC 방법을 사용하여 측정되었다. 독소루비신 함량은 기관 무게에 대하여 정규화되었다 (n=3-4, ±SEM). 마이셀들은 종양에 대하여 더 높은 분포 및 다른 기관들 내에서 현저하게 더 낮은 분포의 결과를 가져왔다. 독소루비신은 심장 독성(cardiotoxicity) 및 신장 독성( renal toxicity)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 결과들은 마이셀들이 독소루비신의 증가된 효율성 및 감소된 독성을 유도한다는 것을 보여준다.
도 34는 약물 저항성의 종양 이형이식(allograft) 마우스 종양 모델에서의 독소루비신 용액 및 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 생체 내 항암 효율성 (anticancer efficacy) 을 도시한 것이다. 피하의(subcutaneous) JC 마우스 유방 암 세포들을 포함하는 암컷 BALB/C가 연구를 위하여 사용되었다. 쥐는 i.v. 주사에 의하여 0 일 째 및 7 일째에 독소루비신 용액 또는 마이셀로 주사되었다 (3mg/kg). 종양 부피가 격일로 측정되었다. 종양 부피에서의 퍼센트 감소가 식을 사용하여 계산되었다 (처치 후의 종양 부피/ 처치 전의 종양 부피)x 100. 데이터는 평균 ± SEM, 그룹 당 n= 4-5로서 나타내어졌고; * 값은 다른 처치들과 비교할 때에 p<0.05에서 현저하다는 것을 보여준다. 독소루비신 마이셀 그룹을 제외하고, 쥐는 모든 다른 처치 그룹들에서 7 일 후에 생존하지 못하였다. 종양들은 독소루비신 마이셀들이 투여되었을 때 서서히 성장하였고, 이는 마이셀 형성의 더 큰 효율성을 의미한다. BM은 블랭크 마이셀들을 의미한다; Dox-Soln은 독소루비신 용액을 의미한다; 또한 Dox-M은 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀을 의미한다.
도 35는 이형이식 (allograft) 유방 종양을 포함하는 BALB/C 쥐의 카플란-마이어 생존 플롯 (Kaplan-Meier survival plot)을 도시한 것이다. 피하의 JC 종양을 포함하는 암컷 BALB/C는 i.v. 주사 (6 mg/kg)에 의하여 0 일 째 및 7 일 째에 나누어진 용량으로 독소루비신 용액 또는 독소루비신 마이셀로 주사되었다. 동물들의 퍼센트 생존이 그래프 패드 5 소프트웨어 (Graph Pad 5 software)를 사용하여 플롯팅되었다. 데이터는 그룹 당 4-5 동물들의 평균이다. 쥐의 사망률은 Dox 마이셀 (Dox-M) < Dox-용액 (Dox-Soln) < 식염수 < 블랭크 마이셀 (blank micelles (BM))의 순서로 증가되는 것이었다. 데이터는 독소루비신 마이셀들이 그 제형의 향상된 효율성으로 인하여 더 큰 생존의 결과를 가져오는 것임을 보여준다.
도 36은 일 실시예에 따른, 투석 방법을 사용하여 닐 레드(Niel-red) 로드된 PEG화된 자인 마이셀들의 제조를 위한 과정들을 도시한 것이다.
도 37은 표피 및 각질층에서의 닐 레드의 양을 도시한 것이다 (n=3). 생체 내연구는 수직의 디퓨젼 셀 (PERMEGEARTM, 헬러타운(Hellertown), PA)의 두 구획 사이에 샌드위치된 피부 분절된(dermatomed) 돼지 피부를 사용하여 수행되었다. 5 % v/v 트윈-80 용액 내의 100 μL의 닐 레드 (250 ng) 또는 물 속의 닐 레드-로드된 PEG-자인 마이셀 (250 ng)이 도너 구획에 대하여 부가되었다. 수용체 구획은 37 ℃로 유지되는 PBS pH 7.4로 이루어졌고 마그네틱 스터 바에 의해 교반되었다. 6 시간 후에 피부는 제거되었고 또한 형광 픽셀들이 공초점 레이저 스캔닝 마이크로그래피(confocal laser scanning microscopy) (플로우뷰 FV300TM(FLUOVIEW FV300TM), Olympus ix70, 올림푸스(Olympus), 센터 밸리(Center Valley), PA)를 사용하여 측정되었다. 광학적 섹션들 (xyz)이 플로우뷰TM(FLUOVIEWTM) 소프트웨어(올림푸스(Olympus), 센터 밸리(Center Valley), PA)를 사용하여 각질층(0-15 ㎛) 및 눈으로 보이는 표피 (20-100㎛) 내에서의 형광 강도에 대하여 분석되었다.
도 38은 일 실시예에 따른, 투석 방법을 사용하여 레티놀 로드된 PEG화된 자인 마이셀들을 제조하기 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다. 도 38-39 및 도 43-46에서, BHT는 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxyltoluene)(2,6-디-터트-부틸-4-메틸페놀 (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol))을 의미한다.
도 39는 일 실시예에 따른, 필름 방법을 사용하여 레티놀 로드된 PEG화된 자인 마이셀들을 제조하기 위한 일반적인 과정들을 플로우 차트의 수단에 의해 도시한 것이다.
도 40은 왼쪽에서 부터 오른쪽까지, 자유 레티놀 및 레티놀 로드된 나노 마이셀들의 수 분산성(water dispersibility)을 도시한 것이다.
도 41은 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서 PEG-자인 나노 마이셀들로부터 레티놀의 생체 외에서의 방출을 도시한 것이다. 그 레티놀 농도는 320 nm 에서 UV-비져블 분광법 (UV-visible spectrophotometry)에 의해 측정되었다. 각각의 데이터 포인트는 평균 ± SD (n=3) (평균 ± SEM; n=3)이다.
도 42는 왼쪽에서 부터 오른쪽까지, 자유 레티놀, 동결 건조된 및 레티놀 마이셀들을 도시한 것이다. 도면은 순수한 레티놀의 흡습 특성(hygroscopic nature)을 보여주며 또한 레티놀 마이셀들이 비-흡습성 자유 흐름 파우더(non-hygroscopic free flowing powders)임을 보여준다.
도 43은 보통의 실내 빛 하에 저장되었을 때 레티놀 로드된 나노 마이셀들의 고체 상태 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 마이셀들은 깨끗한 글래스 바이엘들에 보존되었고 또한 일주일 동안 실내 빛에 대해 노출되었다. 다른 시간 포인트들에서의 잔존 레티놀은 320 nm 에서 UV-비져블 분광법 (UV-visible spectrophotometry) 에 의해 측정되었다 (평균 ± SD; n=3).
도 44는 빛의 부재 하에 저장되었을 때 레티놀 로드된 나노 마이셀들의 고체 상태 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 마이셀들은 깨끗한 글래스 바이엘들에 보존되었고 또한 일주일 동안 어두운 캐비넷 내부에 저장되었다. 다른 시간 포인트들에서의 잔존 레티놀은 320 nm 에서 UV-비져블 분광법 (UV-visible spectrophotometry)에 의해 측정되었다(평균 ± SD; n=3).
도 45는 보통의 빛 하에 저장되었을 때 레티놀 로드된 나노 마이셀들의 액체 상태 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 마이셀들은 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에 분산되었고 또한 일주일 동안 실내 빛에서 깨끗한 글래스 바이엘들 내에 저장되었다. 다른 시간 포인트들에서의 잔존 레티놀은 320 nm 에서 UV-비져블 분광법 (UV-visible spectrophotometry)에 의해 측정되었다(평균 ± SD; n=3).
도 46은 어두운 캐비넷 내부에서 빛으로부터 차단되어 저장되었을 때 레티놀 로드된 나노 마이셀들의 액체 상태 안정성을 도시한 것이다. 자유 레티놀 및 레티놀 마이셀들은 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에 분산되었고 또한 일주일 동안 어두운 캐비넷 내에서 깨끗한 글래스 바이엘들에 저장되었다. 다른 시간 포인트들에서의 잔존 레티놀은 320 nm 에서 UV-비져블 분광법 (UV-visible spectrophotometry)에 의해 측정되었다(평균 ± SD; n=3).
도 47은 자유 레티놀 및 PEG-자인 마이셀들 내에 캡슐화된 레티놀로의 처치 후 돼지 피부 내 및 수용체 매개 내에서의 48 시간 종결시 적용된 레티놀의 퍼센트를 도시한 것이다. 잘라진 돼지 피부는 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 보존된 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌으며 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내 자유 또는 캡슐화된 레티놀 분산액은 도너 챔버 내에 로딩되었다. 연구의 종결 시점에서, 3H 표지화된 레티놀을 사용하는 방사화학적 방법(radiochemical method )을 사용하여 피부 및 수용체 구획 내의 레티놀 농도가 측정되었다. 레티놀 농도를 측정하기 위하여 피부는 0.1M 소듐 하이드록사이드를 사용하여 분해되었다(평균 ±SD; n=6).
도 48은 자유 레티놀 및 레티놀 캡슐화된 마이셀로의 처치 후 돼지 피부 내 및 수용체 매개 내에서의 48 시간 종결시 적용된 레티놀의 퍼센트를 도시한 것이다. 잘라진 돼지 표피(epidermis (Epi))는 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 놓여졌다. 실험의 제 2 세트에서, 각질층은 돼지 표피로부터 제거되었고 또한 다음으로 돼지 표피 위로 물리적으로 놓여졌으며(샌드위치되었으며) (샌드 (Sand)) 또한 연구에서 사용되었다. 자유 레티놀 및 레티놀 마이셀들이 피부에 대하여 적용되었고 또한 연구가 48 시간 동안 수행되었다. 수용체 매개는 37 ℃로 보존된 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌으며 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 포스페이트 버퍼(pH 7.4) 내 자유 또는 캡슐화된 레티놀 분산액은 도너 챔버 내에 로딩되었다. 연구의 종결 시점에서, 3H 표지화된 레티놀을 사용하는 방사화학적 방법(radiochemical method)에 의하여 피부 및 수용체 구획 내의 레티놀 농도가 측정되었다. 레티놀 농도를 측정하기 위하여 피부는 0.1M 소듐 하이드록사이드를 사용하여 분해되었다 (평균 ±SD; n=6).
도 49는 알루미늄 포일로 커버된 글래스 바이엘 내에 한 달의 기간 동안 실온 및 49℃ 에서 저장된 레티놀 마이셀 크림 제형의 안정성을 도시한 것이다. 규칙적인 간격으로 제형의 알리쿼트(aliquot)가 제거되었으며 또한 레티놀 함량이 HPLC를 사용하여 분석되었다. 제형은 안정적으로 남아있고 또한 실온에서 어떤 현저한 감소도 보이지 않았다. 각각의 바이엘은 평균 ±SD; n=3이다.
도 50은 pH 7.4에서의 크림 제형으로부터 자유 레티놀(채워진 원) 및 레티놀 마이셀(채워진 삼각형)의 생체 외에서의 방출을 도시한 것이다.
도 51은 인간 피부에서의 레티놀 크림 제형의 생체 외에서의 피부 침투성을 도시한 것이다.
도 52는 자유 및 마이셀 캡슐화된 크림 레티놀 제형의 적용 후에 쥐에서의 피부 수분 증발 측정(transepidermal water loss (TEWL)) 값들을 도시한 것이다. 소듐 라우릴 설페이트(Sodium lauryl sulfate (SLS)), 알려져 있는 피부 자극물(irritant)이 포지티브 대조군으로서 사용되었고, 또한 네거티브 대조 그룹은 어떠한 처치 하에도 놓여지지 않았다.
도 53은 SKH-1 헤어리스 쥐에서의 6 시간 동안 처치 후 자유 및 나노입자 캡슐화된 레티놀의 생체 내 국소적 생물학적 가용능(topical bioavailability)을 도시한 것이다.
도 54는 닐 레드 로드된 카제인(casein) 마이셀을 제조하기 위한 과정들을 도시한 것이다.
도 55는 자유 닐 레드 및 카제인 마이셀 내에 캡슐화된 닐 레드로의 처치 6 시간 후에 피부의 다른 층들에서의 형광 픽셀을 도시한 것이다. 0-20 ㎛, 각질층 (stratum corneum (SC)) 및 표피 20-100 ㎛에 대하여 형광 픽셀을 정량화하기 위하여 XZ 광학적 섹션들이 사용되었다.
자인(zein), 소수성 플랜트 단백질은 프롤아민의 계 (family)에 속하며 또한 수 불용성이다. 자인은 약제학적인 다양한 물질들, 식품, 및 화장용 물품들의 지속적인 방출을 위한 고분자로서 연구되어 왔다 (슐카 및 체리안(Shukla and Cheryan) (2001), Ind Crops Prod 13:171-192). 자인은 또한 코팅 물질을 필름화 하는데에 있어서 및 마이크로 입자 또는 나노 입자과 같은 입자 시스템을 형성하는데에 있어서 사용되어 왔다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 수 용해성이고, 에테르 결합에 의해 링크된 다중 에틸렌 글리콜 유닛으로 이루어진 생체 적합성 FDA 승인된 고분자이다.
출원인들은 다양한 친양쪽성 단백질 컨쥬게이트가 대략적으로 도 1에 도시된 바와 같이 안정된, 생체 적합성의, 및 생분해성의 마이셀적인 어셈블리를 형성하기 위하여 자기-조립할 수 있음을 발견하였다. 마이셀들은 마이셀 코어 내에서의 카고 분자(cargo molecules)의 존재 또는 부재를 포함하여 형성될 수 있다. 또한 자인은 도 2 및 3에 도시된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 대해 공유결합적으로 부착될 수 있음을 발견하였다. 블랭크 (비-약물 로드된) 또는 약물 로드된 PEG화된 자인은 수성의 환경에서 자기-조립하여 소수성 코어 및 친수성 쉘을 갖는 나노 마이셀 (~100nm)을 형성한다.
다른 소수성 단백질, 예를들면, 식물, 동물 및 합성의 소스를 포함하는 다양한 수크로스로부터 유도된 것들이 자인을 대신하여 사용될 수 있다. 유사하게, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리글리코산(polyglycolic acid), 및 여기 기재된 다른 것들과 같은 다른 수 용해성 고분자들이 상기 나노 마이셀을 제조하기 위하여 소수성 단백질과 컨쥬게이트될 수 있다. 다양한 수 불용성 소수성 분자들 (즉, 치료학적 물질들 또는 "약물들")은 나노 마이셀의 코어 내부에 캡슐화될 수 있고, 또한 상기 마이셀의 코로나에 있는 친수성 고분자 체인들이 인간 신체와 같은 수성의 환경에서의 약물을 용해시키는 것을 돕는다. 부가적으로, 카운터 이온들로 중화된 하전된 분자들이 여기 기재된 마이셀의 소수성 코어 내부에 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 하전된 기능성 그룹들이 소수성 코어 또는 친수성 쉘 내로 도입될 때에, 상기 하전된 분자들은 정역학적 상호 작용(hydrostatic interactions)을 통하여 코어에 대하여 및/또는 쉘에 대하여 복합체화될 수 있다. 예를 들면, 양이온성 고분자, 폴리에틸렌 이민(polyethylene imine), 폴리라이신(polylysine) 등과 같은, 의 마이셀 코어 및/또는 쉘에 대한 부착성은 음전하적으로 하전된 DNA 또는 올리고뉴클레오티드를 복합체화하는데에 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 친수성 분자들은 화학적으로 마이셀의 코어 내부로의 캡슐화를 위한 소수성 부분(entity)을 제공하기 위하여 변형될 수 있다(즉, 프로드러그(prodrug) 또는 염의 형태로서). 실시예들에서, 단백질 상의 전반적인 전하는 프롤아민의 pI 위로 또는 아래로(즉, 자인의 pI는 약 5 및 9 사이이다; 글리아딘의 pI는 약 6.8이다) pH를 조정하는 것에 의해 변화시킬 수 있다.
정의:
여기 사용된 바와 같이, 언급된 용어들은 하기의 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 모든 다른 용어들 및 구절들은 본 기술 분야의 숙련된 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이 그들의 통상적인 의미를 갖는다. 그러한 통상적인 의미는 기술적 사전, 홀리스 컨덴스드 케미컬 딕셔너리 14th 에디션(Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition), R.J. 루이스에 의함(R.J. Lewis), 존 윌리 & 손스(John Wiley & Sons), 뉴욕(New York), N.Y., 2001과 같은, 을 참조함으로써 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 "하나의 실시예(one embodiment)", "일 실시예(an embodiment)", 등의 의미는 기재된 실시예가 특정한 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성을 포함할 수 있음을 의미하고, 그러나 모든 실시예가 반드시 그 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성을 포함하는 것은 아니라는 것을 나타낸다. 더우기, 그러한 구절들은, 반드시 그러한 것은 아니나, 본 명세서의 다른 부분에서 언급된 동일한 실시예를 의미할 수 있다. 나아가, 특정한 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성이 실시예와 연관되어 기재되었을 때에, 분명하게 기재되어 있든 아니든 간에, 그러한 관점, 구성, 구조, 부분, 또는 특성이 다른 실시예들에 영향을 끼치거나 또는 그들과 연관시키는 것은 본 기술 분야에서 숙련된 자의 지식 범위 내이다.
용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "가지는(having)", "함유하는(containing)", "에 의해 특징지어지는(by characterized)", 및 문법적으로 이들과 동등한 것들은, 부가적인, 비언급된 요소들 또는 방법 과정들을 배제하지 않는 포함적인 또는 개방형-종결 용어이며, 한편 또한 더욱 제한적인 용어들 "구성되는(consisting of) 및 "필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 을 포함한다.
단수의 형태 "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"는 본문에서 분명하게 다르게 기재하기 않는 한 복수의 의미를 포함한다. 따라서, 예를들면, "하나의 화합물(a compound)" (예를 들면, 약물)에 대한 의미는 복수 개의 그러한 화합물들을 포함하고, 따라서 화합물 X는 복수 개의 화합물 X를 포함한다. 부가적인 예들로서, "하나의 마이셀 (a micelle)"에 대한 의미는 복수 개의 그러한 마이셀들을 포함할 수 있고, 또한 하나의 "분자 (molecule)"에 대한 의미는 복수 개의 분자들 및 그의 등가물들에 대한 의미일 수 있다. 나아가 청구항들은 어떠한 선택적인 요소를 배제하기 위하여 드래프트될 수 있음에 주목한다. 이에 따라, 이러한 기재는 청구항 요소들의 언급 및 "네거티브적인" 제한의 사용과 연관되는, "단지(solely)", "단지(only)", 및 이와 같은 것과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행적 기반으로서 기여하게 하는 것이 의도된다.
용어 "및/또는 (and/or)"은 그 아이템들의 어떤 하나, 그 아이템들의 어떤 조합, 또는 이러한 용어가 연관되어 있는 아이템들의 모두를 의미한다. 구절 "하나 또는 초과의(one or more)"는 본 기술 분야에서 숙련된 기술자에 의해, 특히 그것이 사용되는 본문에서 읽힐 때에 충분히 이해된다. 예를들면, 페닐 링에 대한 하나 또는 초과의 치환체는, 예를들면 페닐 링이 이중 치환된다면 하나 내지 다섯 개의, 또는 하나 내지 네 개를 의미한다.
용어 "약 (about)"은 구체적인 값의 ±5%, ±10%, ±20%, 또는 ±25% 의 다양한 것들을 의미할 수 있다. 예를들면, "약 50 (about 50)" 퍼센트는 어떤 실시예들에서 45 부터 55 퍼센트까지의 다양성을 의미할 수 있다. 정수의 범위에 대하여, 용어 "약 (about)"은 언급된 정수보다 크거나 및/또는 작은 하나 또는 두 개의 정수들을 포함할 수 있다. 여기에서 다르게 기재되지 않는 한, 용어 "약 (about)"은 개별적인 구성, 조성, 또는 실시예의 기능성에서의 관점에서 등가적인, 언급된 범위에 근접하는 값들, 예를 들면 무게 퍼센트들을 포함하도록 의도될 수 있다. 부가적으로, 여기에서 다르게 기재되지 않는 한, 언급된 범위 (예컨데, 무게 퍼센트들 또는 탄소 그룹들)는 그 범위 내의 각각의 구체적인 값 또는 성분을 포함한다.
숙련된 기술자들에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건들, 및 이와 같은 것을 표현하는 것들을 포함하는, 모든 숫자들은 근접한 것이고 또한 용어 "약 (about)"에 의해 모든 예들 내에서 선택적으로 변형될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 값들은 여기에서의 기재들의 가르침을 이용하여 본 기술 분야의 숙련된 자들에 의해 획득되는 것이 요구되는 바람직한 특성들에 따라 변화할 수 있다. 또한 그러한 값들은 고유하게 그들의 대표적인 테스팅 측정들에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 도출되는 가변성을 포함한다는 것 또한 이해된다.
본 기술 분야에서 숙련된 자에 의해 이해되는 바와 같이, 어떤 및 모든 목적을 위하여, 특히 기재된 기술을 제공한다는 점에 있어서, 여기 언급된 모든 범위들은 또한 어떤 및 모든 가능한 하위 범위들 및 그들의 하위 범위들의 조합들 및 그 범위를 구성하는 개별적인 값들, 특히 정수 값들을 포함한다. 언급된 범위 (예컨데, 무게 퍼센트들 또는 카본 그룹들) 은 그 범위 내에서의 각각의 구체적인 값, 정수, 소수 (decimal), 또는 성분을 포함한다. 리스트화된 어떤 범위는 적어도 동일한 이분의 일, 삼분의 일, 사분의 일, 오분의 일, 또는 십분의 일로 쪼개지는 동일한 범위를 충분히 기재하는 것 또는 가능하게 하는 것으로서 용이하게 이해될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 여기 기재된 각각의 범위는 하부의 삼분의 일, 중간의 삼분의 일, 상부의 삼분의 일 등으로 용이하게 나뉘어질 수 있다.
본 기술 분야에서 숙련된 자에 의해 또한 이해될 것과 같이, "최대(up to)", "적어도(at least)", "보다 큰(greater than)", "보다 적은(less than)", "보다 많은(more than)", "또는 초과의(or more)" 및 기타 등등과 같은 모든 언어는 언급된 숫자를 포함하며, 또한 그러한 용어들은 앞서 논의된 바와 같이 하위 범위들로 후속적으로 나누어질 수 있는 범위들을 의미한다. 동일한 방법으로, 여기에서 언급된 모든 비율들은 또한 더 넓은 비율 내로 떨어지는 모든 하위 비율들을 포함한다. 따라서, 래디컬들, 치환체들, 및 범위들에 대하여 언급된 구체적인 값들은 단지 예시를 위한 것이고; 그들은 래디컬들 및 치환체들에 대해 정의된 범위들 내에서의 다른 정의된 값들 또는 다른 값들을 배제하지 않는다.
본 기술 분야에서 숙련된 자는 또한 구성원들이 보통의 방법, 예를들면 마쿠쉬 그룹(Markush group), 으로 함께 그룹화되었을 때에, 발명이 전체적으로 리스트화된 모든 그룹 뿐만 아니라, 그 그룹의 각각의 구성원을 개별적으로 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹들을 포함하는 것이라는 것을 용이하게 이해할 것이다. 부가적으로, 모든 목적을 위하여, 본 발명은 주요 그룹 뿐만 아니라, 그 그룹 구성원들의 하나 또는 초과가 결여된 주요 그룹을 포함한다. 본 발명은 따라서 언급된 그룹의 어떤 하나 또는 초과의 구성원들의 명백한 배제를 예상한다. 따라서, 단서들이 개시된 카테고리들 또는 실시예들의 어떤 것에 대하여 적용될 수 있으며 그에 의해 언급된 요소들, 종류들, 또는 실시예들의 하나 또는 초과의 어떤 것이, 예를들면, 명백한 네거티브적인 제한에서 사용되는 바와 같이, 그러한 카테고리 또는 실시예로부터 배제될 수 있다.
용어 "자인(zein)"은 프롤아민 단백질의 강 (class)을 의미한다. 프롤아민은 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 및 수수와 같은 다양한 곡식들, 및 다른 식물들 및 동물들 내에서 발견된다. 프롤아민의 다른 예들은 글리아딘, 호르데인 및 카피린을 포함한다. 이러한 프롤아민은 여기 기재된 다양한 실시예에서 자인을 대신하여 교체될 수 있다. 자인은 높은 비율의 비-극성 아미노산, 예를들면 프롤린, 글루타민 및 아스파라긴, 을 포함하며, 또한 약 22-27 kDa의 분자량을 갖는다 (슐카(Shukla), 자인: 옥수수로부터의 산업적 단백질(Zein: the industrial protein from corn). Ind. Crops. Prod. 13, 171-92 ; 2001). 자인의 전형적인 샘플은 대략적으로 20 % 류신, 10 % 프롤린, 21-26 % 글루타민, 5 % 아스파라긴, 및 10 % 알라닌을 포함하며, 이에 따라 그것의 아미노산 조성에서의 적어도 약 61 %가 소수성 아미노산이다. 이러한 소수성 아미노산들은 단백질에 수 불용성을 부여한다. 자인은 생분해성 US-FDA 승인된 GRAS 고분자 (Fed. Register (1985) 50:8997-8999)이다.
자인은 옥수수 글루텐 밀 (corn gluten meal)로부터 파우더로서 제조될 수 있다. 순수한 자인은 그것을 가공되는 식품들 및 제약들을 위한 중요한 성분이 되도록하는 특성인, 무취의, 무미의, 수-불용성의, 또한 식용 가능한 것이다. 자인을 분리하고, 처리하고, 및 사용하는 방법들은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를들면 로톤(Lawton), 시리얼 켐(Cereal Chem) 2002, 79(1): 1-18, 및 WO 2009/137112 (퍼루말 외(Perumal et al.))를 참조하라, 이들은 참조로서 여기 포함된다. 자인의 "등급 (grade)"은, 그 내용이 참조로서 여기 포함되는 미국 특허 번호 5,254,673(쿡 외(Cook et al.))에 개시된 바와 같이, 다양한 수단들에 의해 유도되는, 백색 자인 및 노란 색 자인을 포함하는, 자인의 유형 및 형태의 다양성을 의미한다.
용어 "PEG" 또는 "폴리에틸렌 글리콜"은 수 용해성이고, 생체 적합성이며, 에테르 결합에 의해 링크되어 있는 다중 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하는 FDA 승인된 고분자이다. PEG 체인 또는 모이어티의 분자량은 약 1 kDa 부터 약 220 kDa 까지의 범위일 수 있고, 예를들면, 체인 내의 에틸렌 글리콜 유닛들의 숫자에 의존적으로, 약 1 kDa 내지 약 15 kDa이다. PEG 모이어티들은 -(OCH2CH2)nOH 또는 -(OCH2CH2)nOR 그룹으로 표현될 수 있으며, 여기서 n은 2 내지 약 1,000이며 R은 메틸, 에틸, t-부틸, 페닐 또는 벤질과 같은 알킬, 아릴, 또는 아릴알킬이다. PEG 모이어티들은 예를들면, 숙시네이트 에스테르에 의해 활성화되었을 때에, 말단의 하이드록시 그룹을 통하여 단백질에 대해 부착될 수 있다.
다양한 실시예들에서, PEG 체인의 분자량은 약 1 kDa 내지 약 220 kDa일 수 있다. 어떠한 실시예들에서, PEG 그룹은 약 1,000 내지 약 20,000, 약 4,500 내지 약 20,000; 약 5,000 내지 약 18,000; 약 5,000 내지 20 약 12,000; 또는 약 4,000 내지 약 9,000의 분자량을 가질 수 있다. 다른 실시예들에서, PEG 그룹들은 약 4,000, 5,000, 6,000 또는 약 7,000의 분자량을 가질 수 있다. 상기 PEG 그룹은 또한 그것의 종결의 말단에서 아세틸 그룹 또는 알킬 그룹, 예를들면 메틸 또는 에틸그룹, 과 같은 보호 그룹으로 캡핑될 수 있다.
비유사성의 종결 그룹들을 포함하는, 헤테로바이오 기능성 PEG 그룹들 (Heterobifunctional PEG groups) 이 또한 PEG화를 위하여 사용될 수 있다. 헤테로바이오 기능성 PEG 그룹들의 예들은 HO2C-PEG-OH; HC(=O)- PEG-SH, 및 기타 등등을 포함한다. 선형의 PEG 모이어티들에 부가적으로, PEG 체인들을 포함하는 분지된 모이어티들 또한 프롤아민의 PEG 화를 위하여 사용될 수 있다. 자인에 대하여 컨쥬게이트될 수 있는 다양한 PEG 모이어티들의 예들이 로버트 외(Roberts et al.)(어드밴스드 드럭 딜리버리, 리뷰(Adv. Drug Deliv. Rev.) 54:459-476, 2002)에 의하여 기재되었고 또한 하기와 같이 도시된다.
PEG2 트리아진을 기반으로 하는 분지된 PEG 그룹들:
Figure 112013087000250-pct00001
여기서 R-NH2의 아미노 그룹은 프롤아민 단백질의 사이드 체인 또는 종결 그룹 상의 아미노 그룹이다. 프롤아민 단백질에 대하여 컨쥬게이트될 수 있는 다른 PEG 모이어티들은 다음을 포함한다:
1) 분지된 PEG(PEG2);
2) 선형의 포크화된(forked) PEG; 및/또는
3) 분지된 포크화된(forked) PEG:
Figure 112013087000250-pct00002
여기서 Y는 파텬을 분지하는 카본을 갖는 그룹이고 또한 X는 프롤아민 단백질의 원소, 프롤아민 단백질에 대한 링커, 또는 프롤아민 단백질의 기능성 그룹이다.
폴리에틸렌 글리콜 모이어티들 또는 다른 폴리 (알킬렌 옥사이드)는 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 다양한 기술들에 의해 자인에 대하여 컨쥬게이트될 수 있다(예를들면, 프란세스코 외(Francesco et al.)(2005), 드럭 디스커버리 투데이(Drug Discov Today) 10, 1451-1458를 참조하라). 컨쥬게이트 형성의 하나의 예는, 아래의 스킴 A에 도시된 바와 같이, 에스테르 또는 아미드 연결을 형성하기 위하여, 메톡시 PEG-숙신이미딜 숙시네이트(PEG-succinimidyl succinate)와 같은, 활성화된 모노알콕실레이트화된 PEG 에스테르와 자인과 같은 프롤아민 단백질을 반응시키는 것을 포함한다.
스킴 A. 자인의 (글루타민 사이드 체인의) PEG화
Figure 112013087000250-pct00003

스킴 A에서 보여지는 바와 같이, m-PEG-N-하이드록시 숙신이미딜 에스테르는 자인과 같은 프롤아민 내의 글루타민 잔기들 (및/또는 아스파라긴 잔기들)의 하나 또는 초과의 종결의 아민 그룹들에 대한 아미드 결합의 형성을 통하여 컨쥬게이트될 수 있다(세사 외.(Sessa et al.), (2007) 저널 오브 어플리케이션 폴리 사이언스(J Appl Poly Sci) 105, 2877-2883). 다른 실시예들에서, 아르기닌 및 히스티딘 내의 아민 그룹들이 아미드 또는 카보네이트 연결을 통하여 PEG에 대하여 컨쥬게이트될 수 있다. 부가적으로, N-말단의 아미노산들이 PEG화될 수 있다. PEG 카르복실산, 에스테르, 카보네이트, 알데히드, 및 기타 등등을 포함하는, 본 기술 분야에서 알려져 있는 다양한 PEG 유도체들이 아민 그룹들의 PEG화를 위하여 사용될 수 있다. 아스파트산 (aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid) 내에서의 카르복실산 및 자인 내의 C-말단의 카르복실산은 또한 아민, 하이드록실, 또는 본 기술 분야에서 PEG 그룹들에 대한 카르복실 산을 연결시키기 위한 것으로 알려져 있는 다른 기능성 그룹들을 포함하는 PEG를 사용하여 PEG에 대해 컨쥬게이트될 수 있다. 자인 내의 시스테인 (cysteine)에서의 티올은 또한 예로서, 피드리일 설파이드(pydriyl sulfide), 비닐 설폰(vinyl sulfone), 말레이미드(maleimide), 또는 아이오도아세트아미드(iodoacetamide)로 기능화된 PEG를 사용하여 PEG 에 대하여 컨쥬게이트될 수 있다. 자인 내의 트레오닌 및 세린은 또한 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 PEG화될 수 있다.
자인 내에서 사이트 특정의 PEG 화 (Site specific PEGylation)는 효소들을 사용하여 달성될 수 있다. 예로서, 트랜스글루타미나제 (transglutaminase)가 하기의 스킴 B에서 보여지는 바와 같이 글루타민 내에서의 사이드 체인 아민 그룹을 선택적으로 PEG화하기 위하여 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 선택적인 PEG화는 시알일트랜스퍼라제(sialyltransferase) 를 사용하는 PEG-시알릭 산(sialic acid)의 컨쥬게이트에 의해 후속되는, 아세틸갈락토실아민 트랜스퍼라제(acetylgalactosylamine transferase)를 사용하여 세린 또는 트레오닌 내에서의 하이드록시 그룹의 선택적인 글리코실레이션에 의하여 달성될 수 있다(베로네스 외.(Veronese et al.) (2005), 드럭 딜리버리 투데이(Drug Discov Today) 10, 1451-1458).
스킴 B. 효소적인 PEG화.
Figure 112013087000250-pct00004

다양한 실시예들에서, 각각의 알킬렌 그룹 내에 2 부터 4 까지의 카본 원소들을 함유하고 있는 알킬렌 옥사이드 체인과 같은 다른 알킬렌 옥사이드들이 폴리에틸렌 글리콜을 대신하여 사용될 수 있다. 알콕시-종결된 폴리(알킬렌 옥사이드), 메톡시-종결된 폴리(알킬렌 옥사이드)와 같은, 가 적합한 예이며, 또한 자유 하이드록시 말단은 다음으로 숙신이미딜 숙시네이트와 같은 그룹들에 의해 활성화될 수 있다. 어떤 실시예들에서, 폴리(알킬렌 옥사이드) 체인들은 약 2 부터 약 110 까지의 반복 유닛들을 포함할 수 있으며, 또한 전형적으로 약 50 부터 약 110 까지의 반복 유닛들을 포함한다.
용어 "생체 적합성(biocompatible)"은 고분자 또는 언급된 컨쥬게이트가 대상에 대하여 생체 내로 투여되었을 때에 현저한 부정적인 영향을 유발하거나 또는 가져오지 않음을 의미한다. 가능한 부정적인 효과들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니나, 과도한 염증성 및/또는 과도한 또는 부정적인 면역 반응성, 및 독성을 포함한다. 자인 및 폴리에틸렌 글리콜은 생체 적합성 성분들이다.
용어 "하이드로알콜성 용매(hydroalcoholic solvent)"는 물 및 메탄올, 에탄올, n-프로판올, iso-프로판올, 또는 부탄올(1-부탄올, 2-부탄올 (sec-부탄올), iso-부탄올, 및 tert-부탄올을 포함하는)과 같은, 알콜성 용매 양자를 포함하는 용매 시스템을 의미한다. 통상의 하이드로알콜성 용매 시스템은 물에 50 %, 70 %, 90 %, 및 92 % 에탄올을 포함한다.
용어 "안정성(stable)"은 코어가 물과의 접촉을 가지고 있지 않을 때에 마이셀의 코어를 의미한다 (예를들면 코어-쉘 스트럭쳐 오브 PEG-자인(Core-Shell structure of PEG-Zein), 실시예 1(Example 1)을 참조하라).
용어 "접촉하는 (contacting)"은 세포적 또는 분자적 수준을 포함하여, 터치하는 것, 접촉을 이루는 것, 또는 즉각적인 또는 가깝게 근접함을 가져오는 동작을 의미하며, 예를들면, 생리학적 반응, 화학적 반응, 또는 물리적 변화, 예를 들면, 용액 내에서, 반응 혼합물 내에서, 생체 외에서 또는 생체 내에서, 를 가져오는 것이다.
용어 "투여된(administered)" 또는 "투여(administration)"는 나노 입자에 대하여 치료학적으로 및 진단상 용도로서의 문맥 내에서 사용될 때에, 예를들면 타겟화된 사이트에 대하여 치료학적인 물질을 전달하는 목적을 위해 선택된 양의 마이셀의 생체 내에서의 또는 생체 외에서의 환경으로의 도입을 의미하고 또한 포함한다.
"유효량 (effective amount)"은 질병, 장애 및/또는 질환을 치료하기 위해, 또는 언급된 효과를 가져오기 위한 유효량을 의미한다. 예로서, 유효량은 처치되는 질환 또는 증상의 전개 또는 심각성을 감소시키기 위한 유효량일 수 있다. 치료학적 유효량의 정의는 본 기술 분야에서 숙련된 자들의 능력 범위 내에서 잘 알려져 있다. 용어 "유효량(effective amount)"은 예를 들면 호스트 내에서, 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 또는 질병 또는 장애의 증상을 치료하기 위해 효과적인, 블랭크 또는 여기 기재된 약물 로드된 마이셀의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "유효량"은 일반적으로 바람직한 효과를 제공하는 양을 의미한다.
용어 "처치하는(treating)", "처치하다(treat)" 및 "처치(treatment)"는 (i) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환이 발생하는 것을 예방하는 것(예를들면, 질병예방(prophylaxis)); (ii) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환을 저해시키는 것 또는 그것의 발전을 억누르는 것; (iii) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환을 완화시키는 것; 및/또는 (iv) 질병, 병리학적 또는 의학적 질환과 관련된 증상들을 없애는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "처치하다(treat)", "처치(treatment)", 및 "처치하는(treating)"은 질병예방(prophylaxis)에 대하여 확대될 수 있고 또한 처치되는 질환 또는 증상들의 발전 또는 심각성을 예방하는 것, 예방, 예방하는, 낮추는, 중지시키는 또는 역전시키는 것을 포함할 수 있다. 이에 따라, 용어 "처치(treatment)"는 의학적, 치료학적인 투여 양자를, 및/또는 적합하다면 예방적인(prophylactic) 투여를 포함할 수 있다.
용어 "저해하다(inhibit)", "저해하는(inhibiting)", 및 "저해(inhibition)"는 질병, 감염, 질환, 또는 세포 그룹의 성장 또는 발전을 늦추는 것, 중단시키는 것, 또는 역전시키는 것을 의미한다. 저해는 예를들면, 처치 또는 접촉의 부재 하에서 발생하는 성장 또는 발전과 비교할 때 약 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%보다 클 수 있다.
용어 "생체 내(in vivo)" 는 대상의 몸, 예를들면 환자의 그것과 같은, 에 대하여 또는 내부에서를 의미하며 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 투여에 있어 구강으로의(oral), 구강으로의(buccal), 정맥으로의(intravenous), 근육 내로의(intramuscular), 복강 내로의 (intraperitoneal), 비경구적으로의(parenteral), 피하로의(subcutaneous), 국소적으로의(topical), 눈으로의(ocular), 폐로의(pulmonary) 및 코로의(nasal) 경로들을 포함하는 다양한 수단에 의한 마이셀의 투여를 의미한다.
용어 "생체 외(in vitro)" 는 대상 또는 환자의 몸의 외부의 환경을 의미한다. 용어 "대상(subject)" 또는 "환자(patient)"는 양자 모두 개별적인 복합체적 유기체, 예를들면, 인간 또는 비인간적 동물을 의미한다.
용어 "치료학적 물질(therapeutic agent)", 및 치료학적 또는 의학적인 기능을 의미하는 유사한 용어들은, 언급된 작은 분자, 거대분자, 단백질, 핵산, 성장 인자, 호르몬, 약물, 다른 물질, 세포, 또는 이들의 조합이 질병 또는 질환의 개시, 경로 및/또는 하나 또는 초과의 증상들에 대하여 긍정적으로 영향을 끼칠 수 있는 것 또는 질병 또는 다른 질환을 처치하기 위한 의약 (medicaments)의 제조에서 마이셀과의 컨쥬게이션에서 사용될 수 있는 것을 의미한다. 여기 기재된 마이셀 내에 캡슐화를 위한 적합한 치료학적 물질은 소수성 치료학적 물질, 예를들면, 이에 제한되는 것은 아니나, 커큐민, 독소루비신, 및 닐 레드와 같은 이미징 물질들을 포함한다.
소수성 물질들:
실질적으로 어떠한 소수성 물질은 그렇지 않다면 본 발명의 실시를 위해 적합한 것은 다양한 적용들을 위해 사용될 수 있다. 여기 기재된 친양쪽성 고분자는 증점제(thickening agents), 윤활제(lubricants), 분해제(detergents), 계면활성제(surfactants), 및 항 오염제(anti-fouling agents)로서 또한 사용될 수 있다. 친양쪽성 고분자들은 염색제 (dyes), 화장품, 피그먼트 (pigment) 및 약제학적인 생산품을 위하여 현탁시키는, 분산시키는 또는 안정화시키는 물질로서 사용될 수 있다. 친양쪽성 고분자들은 특히 직물을 염색하는데 있어서 및 화장품을 위한 염색제를 캡슐화시키기 위하여 현탁시키는, 분산시키는 또는 안정화시키는 물질로서 유용할 수 있다. 친양쪽성 고분자는 화장품(cosmetics), 제약(pharmaceuticals), 약효 식품(nutraceuticals), 살충제(pesticides), 직물(textiles), 및 향수(perfumes)를 위한 윤활제 (lubricants) 또는 캡슐화제 (encapsulants)로서 유용한 것일 수 있다.
따라서, 생물학적으로 또는 약제학적으로 활성인 소수성 물질들에 부가적으로, 여기 기재된 친양쪽성 고분자에 의해 캡슐화될 수 있는 다른 소수성 분자들은 진단용 물질들(diagnostic agents), 살충제(insecticides), 살충제(pesticides), 제초제(herbicides), 소독제(antiseptics), 식품 첨가제(food additives), 방향제(fragrances), 염색제(dyes), 진단적 보조물(diagnostic aids), 및 기타 등등을 포함한다. 여기 기재된 친양쪽성 고분자에 의해 캡슐화될 수 있는 소수성 분자의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나: 아비트산(abietic acid), 아세글라톤(aceglatone), 아세나프텐(acenaphthene), 이세노코우라롤(acenocoumarol), 아세토헥사미드(acetohexamide), 아세토메록톨(acetomeroctol), 아세톡솔론(acetoxolone), 아세틸디기톡신(acetyldigitoxins), 아세틸렌 디브로마이드(acetylene dibromide), 아세틸렌 디클로라이드(acetylene dichloride), 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 알란토락톤(alantolactone), 알드린(aldrin), 알렉시톨 소듐(alexitol sodium), 알레트린(allethrin), 알릴에스트레놀(allylestrenol), 알릴 설파이드(allyl sulfide), 알프라졸람(alprazolam), 알루미늄 비스(아세틸살리실레이트(aluminum bis(acetylsalicylate)), 암부세타미드(ambucetamide), 아미노클로테녹산진(aminochlothenoxazin), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 아밀 클로라이드(amyl chloride), 앤드로스테네디올(androstenediol), 애네톨 트리톤(anethole trithone), 아닐라진(anilazine), 안트랄린(anthralin), 안티마이신 A(Antimycin A), 아플라스모마이신(aplasmomycin), 아르세노아세트산(arsenoacetic acid), 아시아티코사이드(asiaticoside), 아스테미졸(astemizole), 아우록독스(aurodox), 아우로티오글리카나이드(aurothioglycanide), 8-아자구아닌(8-azaguanine), 아조벤젠(pazobenzene); 바이칼레인(baicalein), 발삼 페루(Balsam Peru), 발삼 톨루(Balsam Tolu), 바르반(barban), 박스트로빈(baxtrobin), 벤드아작(bendazac), 벤다졸(bendazol), 벤드로플루메티아자이드(bendroflumethiazide), 베노밀(benomyl), 벤자틴(benzathine), 벤제에스톨(benzestrol), 벤조데파(benzodepa), 벤족시퀴논(benzoxiquinone), 벤즈페타민(benzphetamine), 벤즈티아지드(benzthiazide), 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate), 벤질 시나메이트(benzyl cinnamate), 바이브로카톨(bibrocathol), 바이페녹스(bifenox), 바이나파크릴(binapacryl), 바이오레스메트린(bioresmethrin), 바이사보롤(bisabolol), 바이사코디일(bisacodyl), 비스(클로로페녹시)메탄(bis(chlorophenoxy)methane), 비스무스 아이오도서브갈레이트(bismuth iodosubgallate), 비스무스 서브갈레이트(bismuth subgallate), 비스무스 탄네이트(bismuth tannate), 비스페놀 A(Bisphenol A), 바이티오놀(bithionol), 보르닐(bornyl), 브로모이소발레레이트(bromoisovalerate), 보르닐 클로라이드(bornyl chloride), 보르닐 이소발레레이트(bornyl isovalerate), 보르닐 살리실레이트(bornyl salicylate), 브로디파코움(brodifacoum), 브로메탈린(bromethalin), 브록시퀴놀린(broxyquinoline), 부펙사막(bufexamac), 부타미레이트(butamirate), 부테탈(butethal), 부티오베이트(buthiobate), 부틸레이트 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 부틸레이트 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene); 칼슘 아이오도스테아레이트(calcium iodostearate), 칼슘 사카레이트(calcium saccharate), 칼슘 스테아레이트(calcium stearate), 카포벤산(capobenic acid), 카프탄(captan), 카바마제파인(carbamazepine), 카르보클로랄(carbocloral), 카르보페노틴(carbophenothin), 카르보쿠온(carboquone), 카로텐(carotene), 카르바크롤(carvacrol), 세파에린(cephaeline), 세파린(cephalin), 슐모오그르산(chaulmoogric acid), 케노디올(chenodiol), 키틴(chitin), 클로르단(chlordane), 클로르페낙(chlorfenac), 클로르페네톨(chlorfenethol), 클로로탈로닐(chlorothalonil), 클로로트리아니센(chlorotrianisene), 클로로프로틱센(chlorprothixene), 클로르퀴날돌(chlorquinaldol), 크로모나르(chromonar), 실로스타졸(cilostazol), 신코니딘(cinchonidine), 시트랄(citral), 클리노피브레이트(clinofibrate), 클로파지민(clofazimine), 클로피브레이트(clofibrate), 클로플루카르반(cloflucarban), 클로니트레이트(clonitrate), 클로피돌(clopidol), 클로린디온(clorindione), 클록사졸람(cloxazolam), 코록손(coroxon), 코르티코스테론(corticosterone), 코우마클로르(coumachlor), 코우마포스(coumaphos), 코우미토에이트 크레실 아세테이트(coumithoate cresyl acetate), 크리미딘(crimidine), 크루포메이트(crufomate), 쿠프로밤(cuprobam), 시아메마진(cyamemazine), 시클란델레이트(cyclandelate), 시클라르바메이트 시마린(cyclarbamate cymarin), 사이페르네트릴(cypernethril); 다프손(dapsone), 데포스파미드(defosfamide), 델타메트린(deltamethrin), 데옥시코르티코코스테론 아세테이트(deoxycorticocosterone acetate), 데속시메타손(desoximetasone), 덱스트로모르아미드(dextromoramide), 디아세타조토(diacetazoto), 디알리포르(dialifor), 디아티모술폰(diathymosulfone), 데카프톤(decapthon), 디클로플루아니(dichlofluani), 디클로로펜(dichlorophen), 디클로르펜아미드(dichlorphenamide), 디코폴(dicofol), 디크릴(dicryl), 디큐마롤(dicumarol), 디에네스트롤(dienestrol), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 디펜아미졸(difenamizole), 디하이드로코데이논 에놀 아세테이트(dihydrocodeinone enol acetate), 디하이드로에르고타민(dihydroergotamine), 디하이드로모르핀(dihydromorphine), 디하이드로타키스테롤(dihydrotachysterol), 디메스트롤(dimestrol), 디메티스테론(dimethisterone), 디옥사티온(dioxathion), 디페난(diphenane), N-(1,2-디페닐에틸)니코틴아미드(N-(1,2-diphenylethyl)nicotinamide), 디피로세틸(dipyrocetyl), 디설파미드(disulfamide), 디티아논(dithianone), 독세니토인(doxenitoin), 드라족솔론(drazoxolon), 두라파타이트(durapatite), 에디펜포스(edifenphos), 에모딘(emodin), 엔펜아민산(enfenamic acid), 에르본(erbon), 에르고코르니닌(ergocorninine), 에리쓰리틸 테트라니트레이트(erythrityl tetranitrate), 에리쓰로마이신 스테아레이트(erythromycin stearate), 에스트리올(estriol), 에타베린(ethaverine), 에티스테론(ethisterone), 에틸 비스코움아세테이트(ethyl biscoumacetate), 에틸하이드로큐프레인(ethylhydrocupreine), 에틸 멘탄 카르복사나이드(ethyl menthane carboxarnide), 에우게놀(eugenol), 에우프로신(euprocin), 엑살아미드(exalamide); 페바르바메이트(febarbamate), 페날아미드(fenalamide), 펜벤다졸(fenbendazole), 페니펜톨(fenipentol), 페니트로티온(fenitrothion), 페노피브레이트(fenofibrate), 펜퀴존(fenquizone), 펜티온(fenthion), 페프라존(feprazone), 플릴핀(flilpin), 필릭스산(filixic acid), 플록타페닌(floctafenine), 플루아니손(fluanisone), 플루메퀸(flumequine), 플루코르틴 부틸(fluocortin butyl), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 플루로틸(flurothyl), 플루타졸암(flutazolamn), 퓨마길린(fumagillin), 5-퍼퓨릴-5-이소프로필바르비튜르산(5-furfury1-5-isopropylbarbituric acid), 퓨사펀긴(fusafungine), 갈라페닌(glafenine), 글루카곤(glucagon), 글루테티미드(glutethimide), 글리부티아졸(glybuthiazole), 그리세오풀빈(griseofulvin), 구아이아콜 카보네이트(guaiacol carbonate), 구아이아콜 포스페이트(guaiacol phosphate), 할시노나이드(halcinonide), 헤마토프로피린(hematoprophyrin), 헥사클로로펜(hexachlorophene), 헥세스트롤(hexestrol), 헥세티딘(hexetidine), 헥소바르비탈(hexobarbital), 하이드로클로로티아지드(hydrochlorothiazide), 하이드로코돈(hydrocodone), 이부프록삼(ibuproxam), 이데베논(idebenone), 인도메타신(indomethacin), 이노시톨 니아시네이트(inositol niacinate), 이오벤자민산(iobenzamic acid), 이오세타민산(iocetamic acid), 이오디파미드(iodipamide), 이오메갈민산(iomeglamic acid), 이포데이트(ipodate), 이소메테프텐(isometheptene), 이소녹신(isonoxin), 2-이소발레릴인데인-1,3-디온( 2-isovalerylindane-1,3-dione); 조사마이신(josamycin),11-케토프로게스테론(11-ketoprogesterone), 라우로카프람(laurocapram), 3-0-라우로일피리독솔 디아세테이트(3-O-lauroylpyridoxol diacetate), 리도카인(lidocaine), 린데인(lindane), 리놀렌산(linolenic acid), 리오티로닌(liothyronine), 루센소마이신(lucensomycin), 만코젭(mancozeb), 만데르산(mandelic acid), 이소아밀 에스테르(isoamyl ester), 마진돌(mazindol), 메벤다졸(mebendazole), 멥하이드롤린(mebhydroline), 메비퀸(mebiquine), 멜라르소프롤(melarsoprol), 멜팔란(melphalan), 메나디온(menadione), 멘틸 발레레이트(menthyl valerate), 메페녹살론(mephenoxalone), 메펜테르민(mephentermine), 메페닐토인(mephenytoin), 메프릴카인(meprylcaine), 메스타놀론(mestanolone), 메스트라놀(mestranol), 메술펜(mesulfen), 메테르골린(metergoline), 메탈라탈(methallatal), 메탄드리올(methandriol), 메타쿠알론(methaqualone), 3-메틸콜안트렌(3-methylcholanthrene), 메틸페니데이트(methylphenidate), 17-메틸테스토스테론(17-methyltestosterone), 메티프라놀올(metipranolol), 미나프린(minaprine), 마이오랄(myoral), 나프탈로포스(naftalofos), 나프토피딜(naftopidil), 나트탈렌(naphthalene), 2-나프틸 락테이트(2-naphthyl lactate), 2-(2-나프틸옥시)에탄올(2-(2-naphthyloxy)ethanol), 나프틸 살리실레이트(naphthyl salicylate), 나프록센(naproxen), 닐바르비탈(nealbarbital), 네마덱틴(nemadectin), 니클로사미드(niclosamide), 니코클로네이트(nicoclonate), 니코모르핀(nicomorphine), 니푸로퀸(nifuroquine), 니푸록사지드(nifuroxazide), 니트라크린(nitracrine), 니트로메르솔(nitromersol), 노갈라마이신(nogalamycin), 노르다제팜(nordazepamn), 노르에탄드롤론(norethandrolone), 노르게스트리에논(norgestrienone); 옥타베린(octaverine), 올레안드린(oleandrin), 올레산(oleic acid), 옥사제팜(oxazepam), 옥사졸람(oxazolam), 옥셀라딘(oxeladin), 옥스차자인(oxwthazaine), 옥시코돈(oxycodone), 옥시메스테론(oxymesterone), 옥시페니스탄 아세테이트(oxyphenistan acetate), 파라헤르쿠아미드(paraherquamide), 파라티온( parathion), 페모린(pemoline), 펜타에리쓰리톨 테트라니트레이트(pentaerythritol tetranitrate), 펜틸페놀(pentylphenol), 페르펜아진(perphenazine), 펜카바마이드(phencarbamide), 페니라민(pheniramine), 2-페닐-6-클로로페놀(2-phenyl 6-chlorophenol), 펜틀메틸바비투르산(phentlmethylbarbituric acid), 페니토인(phenytoin), 포살론(phosalone), 프탈일술파티아졸(phthalylsulfathiazole), 필로퀴논(phylloquinone), 피카덱스(picadex), 피파닌(pifarnine), 피케토프펜(piketopfen), 피프로졸린(piprozolin), 피로자딜(pirozadil), 플라피브라이드(plafibride), 플라우노톨(plaunotol), 폴아프레진크(polaprezinc), 폴리티아지드(polythiazide), 프로베네시드(probenecid), 프로게스테론(progesterone), 프로메게스톤(promegestone), 프로파니디드(propanidid), 프로파기트(propargite), 프로팜(propham), 프로쿠아존(proquazone), 프르티온아미드(protionamide), 피리메타민(pyrimethamine), 피리미테이트(pyrimithate), 피르비늄 파모에이트(pyrvinium pamoate); 퀘르세틴(quercetin), 퀸볼론(quinbolone), 퀴잘로포-에틸(quizalofo-ethyl), 라폭사나이드(rafoxanide), 레스신아민(rescinnamine), 로시베린(rociverine), 루넬(runnel), 살렌(salen), 스칼렛 레드(scarlet red), 시카닌(siccanin), 시마진(simazine), 시메트라이드(simetride), 소부족산(sobuzoxane), 솔란(solan), 스피로놀아세톤(spironolactone), 스쿠알렌(squalene), 스타놀론(stanolone), 수크랄페이트(sucralfate), 술파벤즈(sulfabenz), 술파구아놀(sulfaguanole), 술파살라진(sulfasalazine), 술폭사이드(sulfoxide), 술피라이드(sulpiride), 숙시부존(suxibuzone), 탈부탈(talbutal), 테르귀드(terguide), 테스토스테론(testosterone), 테트라브로모크레졸(tetrabromocresol), 테트란드린(tetrandrine), 티아세타존(thiacetazone), 티오콜키신(thiocolchicine), 티옥트산(thioctic acid), 티오퀴녹스(thioquinox), 티오리다진(thioridazine), 티람(thiram), 티밀 N-이소아밀카바메이트(thymyl N-isoamylcarbamate), 티옥시다졸(tioxidazole), 티옥솔론(tioxolone), 토코페롤(tocopherol), 톨시크레이트(tolciclate), 톨나프테이트(tolnaftate), 트리클로산(triclosan), 트리플루살(triflusal), 트리파라놀(triparanol); 우르솔산(ursolic acid), 발리노마이신(valinomycin), 베라파닐(veraparnil), 빈블라스틴(vinblastine), 비타민 A(vitamin A), 비타민 D(vitamin D), 비타민 E(vitamin E), 크센부신(xenbucin), 자일라진(xylazine), 잘토프로펜(zaltoprofen), 및 제아라레논(zearalenone)을 포함한다.
본 발명과 함께 사용을 위해 적합한 생물적 활성을 갖는 소수성 분자의 특정한 클래스는 세포 사이의 조절자 (inter-cellular regulators) 및 인터페론, 성장 인자, 호르몬, 및 기타 등등, 인지체 수용체(cognate receptors)를 포함하는, 과 같은 중재자 (mediator)이다. 여기 기재된 친양쪽성 컨쥬게이트는 인터페론의 수 불용성 때문에 문제성인 것으로 여겨져 온, 인터페론의 효과적인 투여를 위해 특별히 효과적인 것으로 간주된다. 여기 기재된 마이셀성 제형의 국소용으로서의 용량 형태는 친양쪽성 고분자 마이셀에 의한 소수성 물질의 캡슐화에 의한 것일 수 있는 경피 전달(transdermal delivery)의 예상치 않게 가속된 속도를 나타낼 수 있다. 따라서, 생물적 또는 약제학적 활성을 갖는 고분자-캡슐화된 소수성 물질은 로션, 젤, 연고(salves), 크림(creams), 밤(balms), 연고(ointments ) 및 기타 등등과 같은 국소적 용량 형태로서 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 수성의 용액 형태 또는 오일-인-워터 (oil-in-water) 또는 워터-인-오일 에멀젼 (water-in-oil emulsions)의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 다양한 경로들, 주사에 의한 투여, 폐로의 투여, 및 구강을 통한 또는 코의 경로에 의한 투여를 포함하는, 에 의해 환자에 대한 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 여기 기재된 마이셀을 포함하는 이러한 제형들은 다른 언급이 없다면 통상적인 제형일 수 있으며, 선택적으로 잘-알려진 첨가제들을 함유하고, 또한 본 기술 분야에서 인식되어 있는 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
가용화 기술(Solubilization Technologies):
환자에 대한 그들의 전달을 향상시키기 위하여 소수성 약물을 가용성으로 하기(solubilize) 위하여 수많은 접근들이 사용되어져 왔다. 존재하는 가용화 기술들의 전반적인 것은 하기 표 A에 나타내어져 있다. 이 테이블은 단지 마켓팅된 제품들에서 및 임상적인 개발에서 사용되는 대표적인 가용화 기술들의 리스트를 보여준다.
표 A. 다양한 가용화 기술들
Figure 112013087000250-pct00005

a. 리핀스키(Lipinski) (2002), 암. 팜. 리뷰(Am. Pharm. Rev.) 5:82-85; 네르바난(Neervannan) (2006), 엑스퍼트 오피니온 드럭 메타브. 톡시콜(Expert Opin Drug Metab Toxicol) 2:715-731.
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c. 얄코브스키 외(Yalkowsky et al.) (1998), 저널 오브 팜 사이언스(J Pharm Sci) 87:787-796; 포트만 및 시몬(Portmann and Simmons) (1995), 저널 오브 팜 바이오메드 애널리시스(J Pharm Biomed Analysis) 13, 1189-1193; 존슨 외(Johnson et al.) (2003), 저널 오브 팜 사이언스(J Pharm Sci) 92:1574-1581
d. 토르실린(Torchillin) (2007), 팜 레스(Pharm Res) 24:1-16; 브리스 외(Vries et al. )(1996), 드럭 딜리버리 인드 팜( Drug Dev Ind Pharm), 22:475-494; 티제 외(Tije et al.) (2003), 클린 파마코키넷(Clin Pharmacokinet) 42:665-685.
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항암 물질로서의 임상적 개발 또는 사용에서의 PEG 컨쥬게이트에 대한 오버뷰:
활성화 물질(약물)을 밀링(miiling)하는 것은 몇 가지 장점들을 제공하며, 이는 많은 양의 약물을 다루는 데에 있어서 확장성(scalability), 낮은 배치-가변성(low batch variability), 및 높은 유연성(flexibility)을 포함한다. 활성화 물질(약물)을 밀링(miiling)하는 것의 단점은 상기 프로세스가 단지 결정성 약물들에 대해 적용 가능할 것이며, 그라스(GRAS) 목록화된 스테릭(steric)/이온성(ionic) 안정제가 요구될 수 있고, 오츠왈드(Ostwald) 숙성(ripening)이 일어날 수 있으며, 또한 연장된 밀링이, 불안정성을 가져오는 비결정성 조성물의 형성을 유도할 수 있다는 점이다.
베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)과 같은 변형된 사이클로덱스트린은 그라스(GRAS) 및 FDA 승인된 부형제이다. 그러나, 상기 사이클로덱스트린은 게스트 분자(guest molecule)와 캐비피 크기(cavity size) 간의 엄격한 상관 관계를 요구한다. 사이클로덱스트린은 또한 만약 상응하는 결합 상수가 너무 높을 경우 ADME 변수들을 현저하게 변형시킬 수 있다. 활성 물질의 염이 향상된 수성의 용해도를 제공하기 위하여 사용될 수 있으며 또한 어떤 경우들에 있어서 약동학(pharmacokinetics) 프로파일을 유리하게 변형시키기 위하여 사용될 수 있다. 염은 또한 가공을 위한 약물의 융점을 증가시킬 수 있다. 그러나, 염의 형성은 적합한 이온화 그룹들을 요구하며, 또한 활성 물질의 염은 FDA에 의해 새로운 약물로서 여겨질 수 있고, 또한 별도의 승인을 요구할 수 있다. 염은 또한 하이드로클로라이드 염과 함께 공통 이온 효과를 가져올 수 있고, 또한 수화물(hydrates) 및 동소체(polymorphs)의 형성을 위한 특정한 경향(propensity)을 가질 수 있으며, 및/또는 약동학(pharmacokinetics)을 변형시킬 수 있다.
계면활성제 및/또는 고분자성 마이셀은 희석상에서의 낮은 침전 경향을 가지고, 바람직하지 않은 부작용이 최소화되며, 또한 유용한 약물 전달 시스템으로 알려져 왔다. 그러나, 많은 마이셀 시스템은 그들의 성분적 계면활성제와 관련된 다양한 양의 독성을 가지며, 로딩 용량이 불충분할 수 있고, 또한 가용화 용량이 너무 낮다. 그들의 표면 활성 때문에, 계면활성제 분자들은 또한 생물적 멤브레인을 침투하거나 손상시킬 가능성이 있으며 또한 용혈성(hemolytic)일 수 있다.
마이셀의 임계적 마이셀성 농도(critical micellar concentration (CMC)) 는 생체 내로의 투여 후에 그들의 구조적 안정성을 나타내며, 또한 고분자성 마이셀은 계면활성제 마이셀보다 높은 구조적 안정성을 갖는다. 그러나, 문헌에 보고된 대부분의 고분자성 마이셀은 합성의 블록 코폴리머이며 이들은 지루하며 복잡한 합성의 과정을 통하여 개별적인 모노머 유닛으로부터 제조된다.
작은 분자 약물의 PEG화는 약물 내의 기능성 그룹들의 수에 의해 제한될 수 있다. 작은 약물 분자의 PEG화는 또한 입체적 제약(conformational constraint)을 유발할 수 있고 또한 그 약물의 결합 및 치료학적 활성에 영향을 끼칠 수 있다. 더우기, PEG의 제한된 컨쥬게이션(즉, 약물 분자 하나 당 하나의 PEG) 및 고분자 약물-컨쥬게이트로의 제한된 약물 로딩 때문에, 높은 소수성 약물의 수 용해성에서의 증가는 최대한으로 하더라도 그리 대단하지 않다. 따라서, 현재 사용되는 약물 전달 기술의 많은 단점들을 극복하기 위하여 향상된 약물 전달 시스템이 요구된다.
마이셀 및 그들의 적용:
본 발명은 소수성 수 불용성 단백질 및 수 용해성 단백질을 사용하여 마이셀을 제조하는 방법에 관한 것이다. 예로서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 합성의 고분자가 자인, 소수성 수 불용성 식물 단백질, 에 대하여 공유결합적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 친양쪽성 PEG화된 자인은 약 0.025 g/L의 CMC에서 물 속에서 분산될 때에 자발적으로 소수성 코어 및 친수성 쉘을 가지는 자기-조립된 마이셀을 형성할 수 있다. 상기 마이셀의 직경은 예를 들면, 약 10 nm 내지 약 450 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 75 nm 내지 약 450 nm, 약 75 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, or 약 80 nm 내지 약 200 nm일 수 있다.
나노 마이셀은 약 3 kDa 또는 이보다 큰 폴리에틸렌 글리콜로의 자인의 공유결합적인 변형 후에만 형성된다는 것이 알려져 있다. 약 5 kDa의 PEG 모이어티들이 자인에 대하여 컨쥬게이트될 때에 마이셀 형성을 위해 특히 적합하다는 것이 알려져 있다.
자인이 높은 분자량의 단백질 (대략적으로 22-27 kDa)이기 때문에, PEG화된 자인은 대부분의 다른 알려진 고분자성 마이셀보다 더욱 안정된 마이셀을 형성한다. 마이셀의 형성을 위해 요구되는 농도는 임계적 마이셀성 농도(critical micellar concentration (CMC))로서 알려져 있다. 상기 CMC 는 물 또는 혈청으로의 희석에 있어서 마이셀의 안정성을 결정한다. 이러한 관점에서, CMC가 낮을 수록, 마이셀의 안정성은 높아진다. 예를 들면, 소듐 도데실 설페이트는 약 2.304 g/L의 CMC를 갖는다. PEG화된 자인의 CMC는, 어떤 실시예에 있어서, 0.025 ±0.0095 g/L이며, 이는 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리프로필렌 옥사이드로부터 제조되는 상업적으로 허용 가능한 블록-코폴리머성 마이셀 (플루로닉®(Pluronic®)) 고분자의 CMC 값, 이는 플루로닉®(Pluronic®) 고분자의 분자량에 의존적으로 0.3 및 190 g/L 사이에서 변하는데, 보다 낮은 것이다.
PEG-자인 마이셀은 예를 들면 캡슐화 또는 안정성을 향상시키기 위하여 또는 부가적인 또는 다양한 기능성을 제공하기 위하여, 혼합된 마이셀성 시스템을 형성하는 다른 계면활성제 또는 고분자들과 결합될 수 있다. 혼합된 마이셀을 형성하기 위하여 사용될 수 있는 계면활성제는 BRIJ 35, BRIJ 58P, 트리톤 X-100(TRITON X-100), 트리톤 X-114(TRITON X-114), 트윈 20(TWEEN 20), 트윈 40(TWEEN 40), 트윈 80(TWEEN 80), 스판 80(SPAN 80), 및 기타 등등과 같은 비온성 계면활성제, 담즙산염(bile salts), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate)와 같은 음이온성 계면활성제, 또는 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)), 트리메틸테트라데실 암모늄 브로마이드(trimethyltetradecyl ammonium bromide (TTAB)), 및 기타 등등과 같은 양이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
PEG-프롤아민 그래프트 코폴리머 또는 블록-코-폴리머는 다른 고분자들과 함께 혼합된 마이셀을 형성하는데 있어서 사용될 수 있으며, 이들은 플루로닉(PLURONICS) (폴리프로필렌 옥사이드-b-폴리에틸렌 옥사이드(polypropylene oxide-b-polyethylene oxide)), 폴리액트산-b-PEG(polylactic acid-b-PEG), 폴리카프로락톤-b-PEG(polycaprolactone-b-PEG), PEG-b-폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PEG-b-poly(N-isopropylacrylamide)), PEG-b-폴리(2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트-b-폴리(-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트((PEG-b-poly(2-(diethylamino)ethyl methacrylate)-b-poly(-(diethylamino)ethyl methacrylate)), PEG-b-폴리아미노산(PEG-b-polyaminoacids), 폴리아스파트산-b-PEG(polyaspartic acid-b-PEG), PEG-b-폴리프로필렌 옥사이드-b-폴리에틸렌 옥사이드(PEG-b-polypropylene oxide-b-polyethylene oxide), 폴리액트산-b-폴리에틸렌 옥사이드-b-폴리프로필렌 옥사이드(polylactic acid-b-polyethylene oxide-b-polypropylene oxide), 폴리비닐피롤리돈-b-폴리액트산-b-폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone-b-polylactic acid-b-polyvinylpyrrolidone), 폴리((3-벤질 아스파테이트)-g-PEG(poly((3-benzyl aspartate)-g-PEG), 키토산-g-폴리카프로락톤-g-PEG(chitosan-g-polycaprolactone-g-PEG), 및 기타 등등을 포함한다.
이와 유사하게, 인지질 (phospholipids), 포스파티딜에탄올 아민(phosphatidylethanol amine), PEG-디아실리피드(PEG-diacyllipids) 및 기타 등등과 같은 지질이 또한 상기 자인-PEG 컨쥬게이트와 함께 혼합된 마이셀을 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 카세인(casein)과 같은 천연의 고분자가 또한 PEG-자인과 함께 혼합된 마이셀을 형성하기 위하여 결합될 수 있다. 상기 기재된 계면활성제, 지질, 천연의 및 합성의 고분자는 단지 대표적인 예들이며 및 마이셀 내에서의 계면활성제, 고분자 또는 지질의 조성물은 PEG-자인과 함께 혼합된 다양한 마이셀을 형성하기 위하여 변형될 수 있다.
PEG화된 자인 마이셀로의 열악한 용해성 화합물의 캡슐화는 하이드로알콜성 용매, 예를들면 90 % v/v 에탄올, 내에서 양 성분을 함께 용해시키는 것 및 후속적으로 소수성 화합물 ("카고 분자(cargo molecle)")의 소수성 자인 코어 내부로의 분할 (partitionaing)을 허용 하기에 충분한 얼마간의 시간 (예를 들면, 하룻밤) 동안의 인큐베이션에 의해 달성될 수 있다. 인큐베이션 후에, 상기 하이드로알콜성 용매는 증발에 의해 제거될 수 있고 박막(thin fim)을 형성한다. 상기 필름은 버퍼 내에서 재건조될(reconstituted) 수 있고 약물 로드된 마이셀을 회수한다.
친양쪽성 PEG-자인으로의 열악한 용해성 화합물의 캡슐화는 또한 하이드로알콜성 용매 (예를 들면 90 % v/v 에탄올) 내에서 양 성분을 함께 용해시키는 것 및 후속적으로 소수성 화합물의 소수성 자인 코어 내부로의 분할(partitionaing)을 허용하기 위한 인큐베이션에 의해 달성될 수 있다. 인큐베이션 후에, 상기 하이드로알콜성 용매는, 예를들면 물에 대한 광범위한 투석에 의하여 제거될 수 있다. 알콜의 완벽한 제거는 약물 로드된 마이셀 형성의 결과를 가져온다.
대안적으로, PEG-자인 마이셀을 제조하기 위하여 동결 건조 방법이 또한 사용될 수 있다. 열악한 용해성 화합물 및 PEG-자인은 물/터트-부탄올 용매 혼합물 내에 용해될 수 있고, 동결 건조에 의한 상기 용매의 제거에 의해 후속된다. 수성의 운반체 또는 버퍼에서의 동결-건조된 생성물의 재건조(reconstitutuin)에 의해 마이셀은 자발적으로 형성된다.
PEG화된 프롤아민 마이셀은 수많은 중요한 적용성을 갖는다. 예로서, 그들은 약제학적 및 관련된 산업에 대하여 관심있는 소수성 화합물, 예로서 이러한 소수성 화합물은 약 1 부터 6.5 까지의 범위 또는 이보다 큰 Log P (옥탄올/물)를 갖는다, 의 용해도를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 어떤 실시예들에서, 약 60 % 내지약 95 %의 캡슐화 효율이 여기 기재된 마이셀을 사용하여 달성될 수 있다. 여기 기재된 마이셀은 최대한 약 일 주일, 또는 약 이 주일 동안, 생체 외 또는 생체 내 환경에서 캡슐화된 카고 분자의 지속적인 방출을 제공할 수 있다.
마이셀의 CMC, 크기 및 캡슐화 효율은 또한 PEG화의 정도(dgree), 사용되는 PEG 모이어티의 분자량(m. w.), 및 마이셀을 제조하는데 있어서 사용되는 고분자에 대한 약물의 비율을 변화시키는 것에 의해 달라질 수 있다. 예를 들면, CMC는 더 높은 분자량의 PEG를 사용하는 것에 의해 낮아질 수 있다. 이와 유사하게, CMC는 PEG-자인 컨쥬게이트 내에서의 PEG 체인들의 수를 최적화하는 것에 의하여 감소될 수 있다. PEG-자인 비율에 대한 더 낮은 약물의 비율은 또한 더 작은 크기의 마이셀을 유도할 수 있다. 다른 면에 있어서, 약물/PEG-자인 비율에서의 증가는 캡슐화 효율 및 마이셀에 있어서 로딩 효율을 증가시킬 수 있다. 교차 결합하는 자인 소수성 코어 또는 PEG 쉘은 또한 로딩 효율을 증가시킬 수 있다. 교차 결합은 또한 마이셀로부터 카고 분자의 방출을 더욱 더 지속시키기 위하여 사용될 수 있다. 부가적으로, 타겟팅 리간드(targeting ligands)의 표면 컨쥬게이트가 특정적으로 마이셀을 신체 내 특정한 조직, 예를 들면 암 조직, 에 대하여 타겟팅 시키기 위하여 사용될 수 있다.
항암 약물이 로드된 PEG화된 자인 마이셀은 마이셀을 제조할 때에 관심의 항암 물질을 용해되어 있는 PEG화된 자인과 함께 용해시키는 것에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 약물 로드된 마이셀은 항암 약물의 세포성 섭취를 현저하게 향상시킬 수 있으며 또한 자유 약물보다 훨씬 효과적이다. 항암 약물의 세포성 섭취는 HPLC 분석을 사용하여 세포 내 약물 농도를 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 도 30 및 31, 및 그들에 대한 설명을 참조하라. 자유 약물과 비교할 때 약물 로드된 마이셀의 효용성은 약물 저항성의 인간 암 세포의 세포 생존 능력을 측정하는 것 및 세포의 50 %를 죽이기 위하여 요구되는 농도를 결정하는 것(즉, IC50 값을 결정하는 것)에 의하여 평가될 수 있다. 약물 로드된 마이셀은 자유 약물보다 현저하게 더 낮은 IC50 을 갖는다. 예를 들면, 도 17, 28, 및 29, 및 그들에 대한 설명을 참조하라.
PEG화된 자인 마이셀 내에 캡슐화된 항암 약물이 약물 저항성 암에 대하여 효과적이라는 것 또한 놀랍게도 발견되었다. 이러한 발견은 칼세인 아세톡시 메틸 에스테르 (Calcein acetoxy methyl ester (Calcein AM)), P-글리코프로테인 유출 펌프(efflux pump)를 위한 기질인 형광성 마커를 사용하는 약물 저항성의 인간 암세포의 분석에 의하여 발견되었다. 어떤 암에서의 P-gp 유출 펌프의 과발현은 약물 저항성을 유도한다. 마이셀은 P-gp 유출 펌프를 저해하고 또한 형광 분광법(spectrofluorimetry)에 의하여 측정되는 바와 같은 칼세인의 세포 내 농도를 증가시킬 수 있다. 도 32 및 그것에 대한 설명을 참조하라. 따라서, PEG-자인 마이셀은 P-gp 유출 펌프를 저해할 수 있고 또한 약물 저항성의 암, 예를들면 유방 암, 난소 암, 결장 암, 폐암 및 악성 뇌교종(glioblastoma)의 약물 저항성 스트레인, 에서의 항암 약물의 세포 섭취를 향상시킬 수 있다. 마이셀의 코어 내에서의 소수성 화합물의 캡슐화는 또한, 빛이 있는 곳에서 실온에서 저장된 자유 약물 용액 또는 약물 로드된 마이셀 분산액의 다른 시간 주기(예를 들면, 최대 12 시간)에서의 약물 농도를 측정하는 것에 의하여 결정되는 바와 같이, 환경 물질로부터의 분해에 대항하여 불안정한 화합물을 안정화시킨다. 약물 농도는 UV-비져블(visible) 분광법에 의하여 측정되었다.
추가적으로, PEG화된 자인 마이셀은 소수성 약물의 수 용해성/수 분산성의 제형화를 개발하는데 있어서 사용될 수 있다. 상기 마이셀이 크기에 있어서 작기 때문에 (예를 들면, 직경에 있어서 약 100 nm 내지 약 300 nm), 그들은 예를 들면, 소수성 약물의 IV 투여를 위하여 사용될 수 있다. 그들은 또한 비경구의(perenteral), 구강으로의(oral), 코로의(nasal), 피부 통과로의(transdermal), 눈으로의(ocular) 및 약물 투여의 다른 경로에 의한 수 불용성 약물의 생물학적 가용능(bioavailability)을 향상시키는데 있어 사용될 수 있다. 동결 건조된 약물 (수 불용성 약물) 로드된 마이셀은 주사에 앞서 물로 용이하게 희석될 수 있다. 상기 동결 건조된 약물 로드된 마이셀은 다음으로 캡슐 또는 다른 적당한 제형화 매트릭스 내로 혼입될 수 있다. 투여 후에 상기 마이셀은 위장의 장의 플루이드 (gastrointestinal intestinal fluids) 내에서 형성될 수 있고, 그 결과 수 불용성 약물의 향상된 용해도 및 흡수성을 가져온다. 나아가, 상기 PEG화된-자인 마이셀은 생체 적합성이고 또한 생분해성이며, 이에 따라 인간에 대하여 그들의 안전성 프로파일을 향상시킨다.
본 발명의 일 관점에서, 마이셀은 치료학적인 및/또는 진단용의 마이셀 제형, 예를 들면, 항암 물질을-함유하는 마이셀, 로서 사용될 수 있다. 그러한 마이셀은 종종 작은 분자 약물, 핵산, 단백질, 백신, 수용체, 호르몬, 세포, 항체, 화학 물질 또는 다른 물질(agent) 또는 물질(substance)과 같은 치료학적 물질인 활성 물질의 타겟화된 전달 및 방출에 대한 시간의 (temporal) 조절을 제공할 수 있다. 기재된 치료학적 방법에 더하여, 본 발명은 진단용 물질, 예를 들면 염색제, 이미징 물질, 프로브, 및 기타 등등, 을 포함하는 마이셀을 생산하기 위한 수단을 제공한다.
나아가 상기 프롤아민-고분자 컨쥬게이트에 대한 변형이 특정한 적용, 예를들면 종양에 대한 타겟화된 전달을 위하여 타겟팅 리간드를 친수성 쉘에 대하여 부착시키는 것, 을 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, 엽산(folic acid), 항체, 및 기타 등등은 특정한 타겟팅 리간드에 대한 수용체를 과발현시키는 암 세포를 타겟팅하기 위하여 PEG 쉘에 대하여 부착될 수 있다.
여기 기재된 방법을 사용하여 형성된 자인 마이셀은 다른 용도, 특히 신체의 외부에서, 를 가질 수 있다. 예를 들면, 약물-로드된 PEG화된 자인 마이셀은 심장 혈관의(cardiovascular) 및 다른 생의학적 장치를 위한 코팅 물질로서 사용될 수 있다. 약물 전달에 관하여 여기 기재된 것에도 불구하고, 마이셀은 또한 식품, 유제품 및 화장품 산업에서의 관심의 분자를 캡슐화하고 또한 방출을 지속시키는데 있어 사용될 수 있다. 인간에 대한 약물에 부가적으로, 수의과적인 약물 또한 상기 마이셀 내로 캡슐화될 수 있다. PEG화된 자인 마이셀은 분해, 예를 들면 가수분해, 산화, 광-분해, 및 다른 분해 반응으로부터 분자를 보호하는데 있어 사용될 수 있다. 이러한 활용은 제약, 식품, 유제품, 농업에서의, 기능 식품(nutraceutical) 및 화장품 산업에서의 관심의 분자를 포함할 수 있다.
화학식 I의 다양성:
화학식 I-V는 추가적으로 변형될 수 있어 추가적인 실시예들을 제공한다. 예로서 자인을 언급하는 어떤 실시예에서, 프롤아민의 다른 형태가 자인을 대신할 수 있으며 별도의 실시예를 제공한다. 예를들면, 자인(Z) 및 PEG에 더하여, 다른 소수성(X) 또는 친수성 고분자(Y)가 또한 화학식 I-V의 어떤 것에 대하여 컨쥬게이트될 수 있으며 그래프트 코폴리머 또는 ABC 타입의 다중 코폴리머를 형성한다, 여기서 A, B, 및 C는 다른 모노머 유닛의 폴리머 블록 모이어티들이다. 이러한 다양성의 예들은 화학식 VI-IX 를 포함한다:
Z-b-PEG-b-X (VI)
Z-b-PEG-b-Y (VII)
PEG-b-Z-b-Y (VIII)
PEG-b-Z-b-X (IX)
여기서 X는 소수성 고분자 모이어티가고, Y는 친수성 고분자 모이어티가며, 또한 Z 및 PEG는 화학식 I에 대하여 정의된 바와 같다.
일반적 화학식 I의 친수성 고분자 PEG는 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone (PVP)), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol (PVA)), 키토산(chitosan), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine (PEI)), 폴리아크릴산(polyacrylic acid (PAA)), 폴리살리실산(polysialic acid (PSA)), 덱스트란(dextran)과 같은 폴리사카라이드(polysaccharides), 및 기타 등등과 같은 다른 친수성 고분자(Y)로 대체될 수 있다. 이와 유사하게, 소수성 고분자(X)는 프롤아민 (예를 들면, 자인)에 대하여 컨쥬게이트될 수 있다. 그러한 소수성 고분자(X)는 예를 들면, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리 락트산-코-글리코산(poly lactic acid-co-glycolic acid), 폴리프로필렌 옥사이드(polypropylene oxide), 폴리아스파르테이트(polyaspartate), 폴리굴타메이트(polygultamate), 스페르민(spermine), 폴리라이신(polylysine), 또는 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 폴리디메틸아미노 에틸 아크릴레이트(polydimethylamino ethyl acrylate)와 같은 폴리아크릴레이트(polyacrylates) 및 기타 등등을 포함할 수 있다. 지방산이 또한 프롤아민에 대하여 컨쥬게이트될 수 있어 소수성 코어를 형성한다. 그러한 지방산의 예들은 예를 들면, 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 포스파디틸에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 및 올레산(oleic acid)을 포함한다.
다른 및/또는 부가적인 변형들이 프롤아민 소수성 코어 및/또는 친수성 PEG 쉘에 대하여 수행될 수 있다. 이러한 변형들은 pH 민감성 마이셀을 제조하기 위하여 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(polyhydroxyethylmethacrylate), 또는 열 민감성의 마이셀을 제조하기 위하여 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly (N-isopropylacrylamide))와 같은 자극 반응성 성분(stimuli responsive elements)을 코어에 대하여 컨쥬게이트시키는 것을 포함할 수 있다. 부가적으로, 상기 프롤아민 소수성 코어 또는 친수성 쉘은 약물 방출을 조절하기 위하여 및 약물 캡슐화 및 로딩 효율을 향상시키기 위하여 교차 결합될 수 있다 (예를 들면, 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 게니핀(genipin), 또는 시트르산(citric acid), 및 기타 등등과 같은 교차-결합제(cross-linkers)를 사용하여).
마이셀의 약제학적 제형:
여기 기재된 마이셀은 치료학적인 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 마이셀들은 수성의 분산액의 형태로서 또는 동결 건조된 마이셀의 건조 파우더로서의 조성물에 대하여 부가될 수 있다. 여기 기재된 마이셀은 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있고 또한 다양한 형태의 인간 환자와 같은 포유류의 호스트에 대하여 투여될 수 있다. 상기 형태들은 투여의 선택되어진 경로, 예를 들면 정맥으로의, 근육 내로의, 국소적으로의 또는 피하로의 경로에 의한, 구강으로의 또는 비경구적인 투여, 에 대하여 특정하게 적합화될 수 있다.
여기 기재된 마이셀은 불활성의 희석제 또는 소화 흡수되는 (assimilable) 식용 가능한 캐리어와 같은 약제학적으로 허용 가능한 운반체와 함께 조합하여 시스템적으로 투여될 수 있다. 구강으로의 투여에 대하여, 마이셀 분산물은 하드한 또는 소프트한 쉘 젤라틴 캡슐 내로 봉지될 수 있고, 또는 동결 건조된 마이셀은 타블렛 내로 압축될 수 있거나, 또는 환자의/대상의 식단 상의 식품 내로 직접적으로 혼입될 수 있다. 마이셀 분산물 또는 동결 건조된 마이셀은 또한 하나 또는 초과의 부형제와 함께 결합될 수 있고 또한 소화 가능한 타블렛, 구강의 타블렛(buccal tablets), 트로키(troches), 캡슐, 엘릭시르제(elixirs), 현탁물, 시럽, 웨이퍼(wafers), 및 기타 등등의 형태로서 사용될 수 있다. 그러한 조성물 및 제조물들은 전형적으로 적어도 0.1 중량%의 활성의 치료학적 또는 진단용 약물을 함유한다. 조성물 및 제조물 내에서 물질의 중량 퍼센트는 달라질 수 있으며 또한 통상적으로 약 2 % 부터 약 60 % 까지의 주어진 단위 용량 형태의 중량일 수 있다. 마이셀을 함유하는 그러한 치료학적으로 유용한 조성물 내에서의 활성 화합물의 양은 효과적인 용량 수준이 획득될 수 있을 정도의 그것이다.
타블렛, 트로키, 필(pills), 캡슐, 및 기타 등등은 또한 하나 또는 초과의 하기의 것을 포함할 수 있다: 검 트라가칸쓰(gum tragacanth), 아카시아(acacia), 콘 스타치(corn starch) 또는 젤라틴(gelatin)과 같은 바인더; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate)와 같은 부형제; 콘 스타치(corn starch), 포테이토 스타치(potato starch), 알긴산(alginic acid) 및 기타 등등과 같은 붕해제(disintegrating agent); 및 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)와 같은 윤활제(lubricant). 수크로스(sucrose), 프락토스(fructose), 락토스(lactose) 또는 아스파탐(aspartame)과 같은 감미료(Sweeting agent); 또는 페파민트(peppermint), 윈터그린의 오일(oil of wintergreen), 또는 체리 플레버링(cherry flavoring) 과 같은 착향제(flavoring agent)가 부가될 수 있다. 단위 용량 형태가 캡슐일 때에, 그것은 상기 타입의 물질들에 부가적으로, 액상의 캐리어, 예를 들면 식물성 오일 또는 폴리에틸렌글리콜, 를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서 또는 그렇지 않다면 고체 단위 용량 형태의 물질적 형태를 변형시키기 위하여 존재할 수 있다. 예로서, 타블렛, 필(pills), 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락(shellac) 또는 슈거 및 기타 등등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘리시르제(elixir)는, 감미료로서의 수크로스 또는 프락토스, 보존제로서의 메틸 및 프로필 파라벤(methyl and propyl parabens), 체리 또는 오렌지 향과 같은 염색제 또는 착향제에 대하여 부가적으로 마이셀을 함유할 수 있다. 단위 용량 형태를 제조하는데 있어서 사용되는 어떤 물질은 약제학적으로 허용 가능하며 사용되는 양에 있어서 및 실질적으로 비-독성이어야 한다. 부가적으로, 마이셀 분산물 또는 동결 건조된 마이셀은 부가적인 지속되는-방출 제조물 또는 장치 내로 혼입될 수 있다.
마이셀 분산물은 정맥 내로, 피하로, 근육 내로, 종양 내부로(intratumorally), 종양 근처로(peritumorally), 또는 인퓨전(infusion) 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 상기 마이셀의 분산물은 물 내에서, 선택적으로 버퍼와 함께 혼합된, 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 용매, 또는 이들의 혼합물 내에서 제조될 수 있다. 저장 또는 사용에 있어서의 통상의 조건 하에서, 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위하여 보존제를 함유할 수 있다.
주사 또는 인퓨젼(infusion)을 위하여 적합한 약제학적 용량 형태들은 살균된 주사가 가능한 또는 인퓨젼 가능한 용액 또는 분산물의 즉석의 (extemporaneous) 제조를 위해 적합화된 마이셀을 포함하는 살균한 수성 용액(sterile aqueous solution), 분산물, 또는 살균한 파우더를 포함할 수 있다. 궁극적인 용량의 형태는 살균한 것이어야 하고, 제조 및 저장의 환경에서 유동성이며 안정적이어야 한다. 액상의 캐리어 또는 운반체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올 (예를들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 리퀴드 폴리에틸렌 글리콜, 및 기타 등등), 식물성 오일, 비독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적합한 혼합물를 포함하는 액상의 분산 매개일 수 있다. 미생물의 활동을 방지하는 것은 다양한 항박테리아성 및 항곰팡이성 물질, 예를 들면 파라벤(parabens), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀(phenol), 소르브산(sorbic acid), 티오메르살(thiomersal), 및 기타 등등, 에 의하여 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장성 물질(isotonic agents), 예를 들면 슈거, 버퍼, 또는 소듐 클로라이드, 을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 (prolonged) 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및/또는 젤라틴에 의해 달성될 수 있다.
살균된 주사가 가능한 용액은 앞서 언급되었던 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 내로의 요구되는 양의 마이셀을 혼입시키는 것, 필요하다면 후속하는 여과 살균에 의해 제조될 수 있다. 살균된 주사가 가능한 용액의 제조를 위한 살균 파우더의 경우에서, 제조의 방법은 진공 건조시키는 및 동결 건조시키는 기술을 포함할 수 있으며, 이는 마이셀 파우더에 더하여 미리 살균-여과된 용액 내에 존재하게 되는 어떤 부가적인 바람직한 성분을 생산하는 것이다.
국소적인 투여 (topical administration) 를 위하여, 고체상, 액상, 젤, 크림, 연고 또는 페이스트일 수 있는, 예를 들면 피부 과학적으로(dermatologically) 허용 가능한 캐리어와 함께 결합된 조성물 또는 제형으로서, 마이셀을 피부에 대하여 투여하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 유용한 고체상 캐리어들은 미세하게 나뉘어진 고체, 예를 들면 탈크(talc), 클레이(clay), 미세결정성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 실리카(silica), 알루미나(alumina), 및 기타 등등을 포함한다. 유용한 액상의 캐리어들은 물, 또는 물-알콜/글리콜/디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide (DMSO)) 혼합물을 포함하며, 그 안에서 마이셀은 선택적으로 비-독성의 계면활성제의 보조에 의해 효과적인 수준으로 분산될 수 있다. 향수(fragrances)와 같은 아쥬반트(adjuvants) 및 부가적인 항균성 물질이 주어진 용도를 위한 특성을 최적화하기 위하여 첨가될 수 있다. 유동성 조성물은 밴드를 스며들게 하기 위해(impregnate) 사용되는 흡수성 패드(absorbent pads)에 의해 적용될 수 있거나, 또는 펌프-타입 또는 에어로졸 스프레이를 사용하여 효과가 미치는 부위에 대하여 분무될 수 있다.
합성의 고분자, 지방산, 지방산염 및 에스테르, 지방 알콜, 변형된 셀룰로오스, 또는 변형된 미네랄 물질과 같은 증점제 (thickeners)가 또한 사용자의 피부에 대해 직접적인 적용을 위하여 잘 퍼지는(spreadable) 페이스트, 젤, 연고, 비누, 및 기타 등등을 형성하기 위해 액상의 캐리어와 함께 사용될 수 있다.
피부에 대하여 활성인 물질들(예를들면, 물질 로드된 마이셀)을 전달하기 위한 피부 과학적인 조성물의 예들은 본 기술 분야에서 알려져 있다; 예를들면, 그들의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 4,608,392 (자크퀘트 외(Jacquet et al.)), 4,992,478 (게리아(Geria)), 4,559,157 (스미스 외(Smith et al.)), 및 4,820,508 (워츠만(Wortzman))를 참조하라. 그러한 피부 과학적인 조성물들은 여기 기재된 마이셀 제형들과 함께 조합하여 사용될 수 있다.
여기 기재된 약물 로드된 마이셀의 유용한 용량은 그들의 생체 외에서의 활성도 및 동물 모델에서의 생체 내에서의 활성도를 비교하는 것에 의하여 결정될 수 있다. 쥐, 및 다른 동물들에서의 효과적인 용량에 대한 인간으로의 외삽을 위한 방법이 본 기술 분야에서 알려져 있다; 예를 들면, 그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 4,938,949 (보치 외(Borch et al.))를 참조하라. 처치에서의 용도를 위하여 요구되는 마이셀 내로 로드되는; 화합물, 또는 활성 염, 프로드러그, 또는 그들의 유도체의 양은 특정 화합물 또는 선택된 염에 의해서 뿐만 아니라, 투여의 경로, 처치되는 질환의 성질, 및 환자의 나이 및 상태에 의해서도 달라질 것이고, 또한 궁극적으로 참여하는 의사 또는 임상 의사의 재량에 의할 것이다.
치료용 물질 로드된 마이셀은 바람직하게 단위 용량 형태로서, 예를들면, 5 내지 1000 mg/m2, 바람직하게 10 내지 750 mg/m2, 가장 바람직하게 50 내지 500 mg/m2 의 단위 용량 형태 당 활성 성분을 함유하는 것으로서 투여될 수 있다. 바람직한 용량은 바람직하게 단독 용량으로서 또는 적당한 간격으로 투여되는 나뉘어진 용량으로서, 예를 들면 하루에 두 번, 세 번, 네 번 또는 초과의 하위-용량들로서, 표현될 수 있다. 하위-용량 그 자체는, 예를 들면 별개의 여유롭게 간격이 나뉘어진 투여의 수로, 더욱 나뉘어질 수 있다.
여기 기재된 약물 로드된 마이셀은 효과적인 항-종양 물질일 수 있으며 또한 더 높은 효능(potency) 및/또는 비-마이셀 캡슐화된 항-종양 물질과 비교할 때에 감소된 독성을 갖는 것일 수 있다. 본 발명은 포유류에서 암을 처치하는 치료학적 방법을 제공하며, 이는 암을 포함하고 있는 포유류에 대하여 유효량의 여기 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 포유류는 영장류(primate), 인간, 설치류(rodent), 개(canine), 고양이(feline), 소(bovine), 양(ovine), 말(equine), 돼지(swine), 염소(caprine), 소(bovine) 및 기타 등등을 포함한다. 암은 어떤 다양한 타입의 악성 신생물(malignant neoplasm), 예를 들면 결장 암, 유방 암, 악성 흑색종(melanoma) 및 백혈병을 의미하며, 또한 일반적으로 바람직하지 않은 세포성 증식에 의하여 특징지어지며, 예를 들면 비조절성 성장(unregulated growth), 분화의 결핍(lack of diifferentiation), 국지적 조직 침입(local tissue invasion), 및 전이(metastasis)이다.
본 발명의 화합물의 암을 처치하는 능력은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 처치 프로토콜의 디자인(design of treatment protocols), 독성 평가(toxicity evaluation), 데이터 분석(data analysis), 종양 세포 킬링의 정량화(quantification of tumor cell kill), 및 이식될 수 있는 종양 스크린 사용의 생물학적 의미(biological significance of the use of transplantable tumor screens)가 알려져 있다.
하기의 예들은 상기 방법을 도시하기 위한 것으로 의도되며 또한 그것의 범위를 좁히는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 기술 분야에서 숙련된 자는 그 실시예들이 본 발명이 실행될 수 있는 많은 다른 방법을 제시한다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 수많은 다양성 및 변형이 이루어질 수 있으며 한편 본 발명의 범위 내에 잔존한다.
실시예
실시예 1. PEG화된 자인의 제조 및 마이셀의 형성
대략적으로 80 nm 및 대략적으로 200 nm 사이의 크기 범위를 갖는 PEG화된 자인 나노 마이셀이 여기 기재되는 바와 같이 제조되었다. 도 2 및 3은 다양한 실시예들에 따른 PEG-자인의 단계화된 제조를 도시한 것이다. PEG화된 자인이 0.1 g의 메톡시 PEG-숙신이미딜 숙시네이트 (methoxy PEG-succinimidyl succinate)(m. w. 1000, 2000, 또는 5000 kDa)를 90 % 에탄올 5 mL 내의 1 g의 백색 자인에 대해 첨가하는 것에 의해 제조되었다. 특정 비율 (1:1, w/w) 를 갖는 상기 혼합물은 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이트되었다. 3 시간 후에, 1 mL의 수성 글리신 (1 M) 용액이 어떤 과도한 PEG 에스테르를 퀸치 (quench)하기 위하여 부가되었다. 5 mL의 시트레이트 버퍼, pH 7.4, 가 다음으로 첨가되었으며 PEG화된 자인을 침전시켰다. 침전된 PEG화된 자인의 분산물은 다음으로 자유 PEG, 글리신, 및 에탄올을 제거하기 위하여, 실온 (-23 ℃) 에서 24 시간 동안 마그네틱 스터러 (100 rpm) 하에서 탈이온수에 대하여 직접적으로 투석되었다 (m .w. 컷 오프 = ~10,000 Da). 결과로서 얻어진 생성물은 -80 ℃ 로 동결되었으며 -47 ℃에서 60 m Torr 진공 하에서의 12 내지 14 시간 동안의 동결 건조에 의해 후속되었다.
m-PEG-N-하이드록시 숙신이미딜 에스테르(m-PEG-N-hydroxy succinimidyl ester)(5 kDa) 가 자인 내의 아미노 그룹과의 아미드 결합을 형성하기 위하여 사용되었다. 컨쥬게이트는 FTIR을 사용하여 확인되었다. 자인의 아미드 I 및 II 단백질 (Amide I and II protein) 피크가 1650 및 1500-1540 cm-1에서 각각 관찰된다. 자인과의 컨쥬게이션 후에 사라지는 PEG에 대한 NHS 에스테르 피크가 1740 cm-1에서 관찰된다 (도 4). 나아가, 컨쥬게이트는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 특징지어진다. 도 4에서 보여지는 바와 같이, PEG- 자인 컨쥬게이트는 7 분에 분리되었고 또한 자인은 23 분에 분리되었다. 다른 한편, PEG 는 29 분에 분리되었다.
다양한 분자량의 PEG 컨쥬게이트화된 자인에 대해서 관찰되는 PEG화의 효율이 하기 표 1에서 보여지며, 여기서 효율 퍼센트는 트리니트로벤젠 술폰산(trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) 분석법을 사용하여 결정되었다. 자인 내의 표면 아미노 그룹들이 PEG화에 관여되는 것으로 발견되었다. TNBS 분석법은 PEG화 이전 및 이후에 자인 내에서의 자유 아미노 그룹들을 측정하기 위하여 사용되었다. 표준화된 커브가 순수한 자인 및 PEG화된 자인의 농도를 증가시키는 것 대 (versus) 440 nm 파장에서의 흡광도에 의해 만들어졌다. PEG화 효율은 하기의 식을 사용하여 계산되었다:
% PEG 화 효율 = [a-b/a] x 100
여기서 a = 비-PEG화된 자인의 농도 대 (versus) 흡광도의 기울기, 및 b = PEG화된 자인의 농도 대 (versus) 흡광도의 기울기. 표준화된 커브를 생성하기 위하여 사용되는 자인의 농도 범위는 0.357 mg/mL 내지 12 mg/mL이며, 또한 상관 계수(correlation coefficient)는 0.9994 이었다.
자인 PEG 화 효율
샘플 PEG 분자량 ( Da ) PEG 화 효율 (%)
1 1000 74±7
2 2000 60±4
3 5000 52±6
결과들은 세 개 샘플들의 대표값이다 (평균 ± SD).
더 작은 크기의 PEG-자인 마이셀이 표 2에서 보여지는 데이터에 의해 도시되는 바와 같이, PEG> 3000 Da을 사용하여 형성되었다. 도 1에 대략적으로 도시된 바와 같이 소수성 코어 및 친수성 쉘을 포함하는 나노 마이셀 (~100 nm) 을 형성하기 위하여 수성의 환경에서 PEG화된 자인은 자기-조립한다.
마이셀 형성을 위해 요구되는 PEG 분자량
샘플 PEG 분자량 ( Da ) 입자 크기
( nm ) 		PDI
1 1000 970±125 0.69±0.12
2 2000 902±107 0.65±0.08
3 5000 95±1.7 0.21±0.02
결과들은 세 개 샘플들의 대표값이다 (평균 ± SD).
코어-쉘 구조의 PEG-자인: 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide (DMSO)내에서, 자인 및 PEG 5000 Da 양자의 소수성 및 친수성 부분에 대응하는 1H NMR 공명 피크가 NMR 스펙트럼에서 분명하게 관찰되었다 (도 5): PEG 메틸렌 공명에 대하여 3.56 ppm 및 단백질/아미드 공명에 대하여 3.36 ppm. 이와 대조적으로, 단지 PEG 공명 피크들만 D2O 에서 검출되었고 또한 자인 피크들은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 코어-쉘 구조의 PEG-자인 마이셀을 확인하는 것이다. 중수소 치환된 물 (D2O) 에서, 자인에 대한 단백질 피크들은 관찰되지 않았는데 이것은 자인이 물에 불용성이기 때문이다. 그러나, PEG 피크는 D2O 에서 발견되며 이는 PEG 가 수 용해성이기 때문이다. PEG-자인 마이셀에 대하여, PEG 블록을 구성하는 쉘은 D2O 내에 잘 용해되며 또한 이에 따라 분명한 NMR 스펙트럼 상의 피크들을 보여주는 반면, 마이셀의 코어를 형성하는 자인의 공명 피크들은 용매의 결핍 및 마이셀 코어 내에서의 용매화로 인하여 관찰되지 않았다. DMSO는 그러나 마이셀들을 용해시키고 또한 분해되게 하며 이에 따라 PEG 및 단백질 양자를 용매화할 수 있어서, 분자의 양자 모든 부분에 대응하는 피크들이 기록되도록 한다 (도 5).
마이셀의 형성을 위하여 요구되는 농도는 임계적 마이셀성 농도 (critical micellar concentration (CMC))로서 알려져 있다. 상기 CMC 값은 물로의 희석에 따른 마이셀의 안정성을 결정한다. PEG화된 자인의 CMC 는 0.025 ±0.0095 g/L이며, 이것은 프로브 (probe)로서 파이렌(pyrene)을 사용하여 결정되었다 (도 7). 자인의 분자량이 상대적으로 높기 때문에, 자인 마이셀의 더 낮은 CMC 값에 의해 나타내어지는 바와 같이, 그들은 다른 고분자성 마이셀보다 더욱 안정된 마이셀을 형성한다 (예를들면, 도 6을 참조하라). 도 6은 PEG화된 자인의 로그화된 농도 (g/L)에 대해 339 nm 및 334 nm 의 여기 파장 (방출 파장은 390 nm이다)에서의 파이렌 (0.6 ILIM) 의 흡광도 비율의 플롯을 도시한 것이다. PEG화된 자인의 농도가 증가될 수록, 그 CMC (즉, 마이셀이 형성되는 농도)에서의 파이렌 흡광도의 강도에서의 현저한 이동이 존재한다.
마이셀의 입자 크기는 버퍼로의 희석에 의해 현저하게 변화하지 않았으며, 이는 마이셀의 안정성을 나타내는 것이다 (도 6). 제조된 PEG-자인 마이셀은 쥐에서의 피하로의 투여 후에 어떠한 자인 특정화된 항체의 부재에 의해 결정되는 바와 같은 비 면역성이었다 (도 8). PEG-자인 마이셀 내로 로드된 다양한 소수성 화합물에 대한 입자 크기 및 캡슐화 효율에 대한 요약이 하기 표 3에서 보여진다.
다양한 화합물에 대한 PEG -자인 마이셀 캡슐화 데이터
샘플 화합물 Log P M.W.
( Da ) 		입자 크기
( nm ) 		PDI 캡슐화 효율(%)
1 커큐민 2.5 368.3 124±4.1 0.25±0.03 95±4
2 독소루비신 1.20 543.5 153±3 0.18±0.06 92±6
3 닐 레드 5 318.3 165±7 0.21±0.08 77±11
결과들은 세 개 샘플들의 대표값이다 (평균 ± SD); PDI = 다분산 지수 (polydispersity index).
실시예 2. 독소루비신을 캡슐화하는 PEG화된 자인 마이셀
독소루비신은 다른 것들 중에서도 유방 암 및 난소 암의 처치를 위해 폭넓게 사용되는 항암 약물이다. 그러나, 독소루비신의 임상적 사용은, 울혈성 심부전증(to congestive heart failure)을 유도할 수 있는 미엘로서프레션 (myelosupression) 및 만성적인 심장 독성과 같은 심각한 부작용에 의해 제한되고 있다 (호르토바기(Hortobagyi) (1997), 드럭(Drugs) 54 Suppl 4:1-7). 독소루비신에 있어서 다른 제한은 화학적 치료법에 대한 저항성의 발전이다 (코트만 외(Gottesman et al.) (2002), 내츄럴 리뷰 캔서(Nat Rev Cancer) 2:48-58). 독소루비신은 543.5의 분자량(m. w.), 1.2의 Log P를 가지며, 특히 물에 대해 불용성이고, 또한 메탄올, 에탄올 및 DMSO 내에서는 용해성이다.
Figure 112013087000250-pct00006
독소루비신
낮은 분자량의 계면활성제 마이셀과 비교할 때에, 고분자 마이셀은 일반적으로 낮은 임계적 마이셀성 농도(CMC) 및 보다 느린 해리에 의해 보다 안정적이며, 이는 보다 긴 시간의 기간 동안 로드된 독소루비신의 보유성을 허용하며, 또한 궁극적으로 타겟 사이트에서의 약물의 보다 높은 축적을 달성하게 한다. 그러한 선택적인 수동적인 타겟팅 능력은 누수성 맥관 구조(vasculature) 및 종양 조직에서의 림프 도수(lymphatic drainage) 의 결핍으로부터 도출되는, 향상된 투과성(permeability) 및 보유 효과(retention effect)에 기인한다 (매다 외(Maeda et al.) (2000), 저널 오브 컨트롤 릴리즈(J Control Release) 65:271-284).
수 불용성 독소루비신 염기는 그것의 하이드로클로라이드 염으로부터 추출되었다. 독소루비신 하이드로클로라이드(Doxorubicin hydrochloride) (0.012 g)가 100 mL의 탈이온수에 용해되었고 (0.22 ㎛ 여과되었으며), 또한 독소루비신의 완전한 용해를 허용하기 위해 10 분 동안 마그네틱으로 교반되었다. 용액의 pH는 7.2 였다. 트리에틸아민(Triethylamine) (0.2 mL)이 첨가되었으며 30 분 동안의 마그네틱으로의 교반에 의해 후속되어 균일한 혼합을 가능하게 하였다. 얻어지는 용액의 pH는 12 였다. 이 수성의 용액에 100 mL의 클로로포름을 첨가하였고 또한 15 분 동안 마그네틱으로 교반하였다. 결과로 얻어지는 에멀젼을 분별 깔때기에서 격렬하게 쉐이킹하여 주었고, 또한 상기 클로로포름 층을 회수하였다. 이 과정을 세 번 반복하였으며 염기를 완벽하게 회수하였다. 분획들을 혼합하였고 감소된 압력 하(로터리 증발기 상에서) 에서 건조될 때까지 농축하였다. 건조된 잔여물을 클로로포름에 재용해시켰고 또한 소듐 클로라이드의 포화된 수성 용액으로 세척하였다. 상기 클로로포름 층을 둥근 바닥 플라스크로 분리해 내었으며 또한 로터리 증발기 상에서 건조될 때까지 완벽하게 농축시켰다. 둥근 바닥 플라스크 내의 독소루비신 염기는 오븐 안에서 37 ℃에서 48 시간 동안 유지되었고 (어두운 환경 하에서), 완벽한 건조가 가능하도록 하였다. 생성물은 4 ℃에서 사용될 때까지 저장되었다.
도 20 및 21은 각각 필름 및 투석 방법을 사용하는 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀의 단계화된 제조를 도시한 것이다. 양 필름 및 투석 방법에서, 0.1 g의 PEG-자인 및 0.001 g의 독소루비신이 20 mL의 90 % 에탄올 내에 용해되었다. 상기 혼합물은 하룻 밤에 걸쳐 37 ℃에서 인큐베이트되었으며 (마그네틱 스터바. 50 rpm 에서 교반됨), 독소루비신의 소수성 자인 코어로의 분리가 가능하도록 하였다. 하룻 밤 동안의 인큐베이션 후에, 하이드로알콜성 용매가 로터리 증발에 의해 감소된 압력 하에서 완벽하게 제거되었고 박막을 형성하였다. 건조된 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀의 필름은 시트레이트 버퍼 pH 7.4 에서 재건조되었으며 또한 균일한 현탁물을 형성하기 위하여 5 분 동안 초음파 처리되었다. 상기 혼합물은 다음으로 마그네틱 스터러 안에서 물에 대하여 투석되었다 (m.w. 컷 오프 = ~10,000 Da).
투석 방법을 위하여, 하룻 밤 동안의 인큐베이션 후에, 혼합물은 마그네틱 스터러 안에서 (100 rpm) 실온에서 24 시간 동안 물에 대하여 투석되었고 (m.w. 컷 오프 = ~10,000 Da), 어떠한 잔여 물질을 제거하였다. 결과로서 얻어지는 생성물은 다음으로 -80 ℃ 까지 동결되었으며 이어서 -47 ℃에서 60 mTorr의 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조되었다 (도 21). 동결 건조된 생성물은 데시케이터 안에서 4 ℃ 로 냉장된 조건 하에서 저장되었다. 표 4, 하기의, 는 각각 필름 방법 및 투석 방법을 사용하여 제조된 독소루비신-로드된 PEG화된 자인 마이셀의 여러가지 특성들을 나타낸 것이다.
샘플 독소루비신
(% w/w) 		입자 크기
(nm) 		PDI 캡슐화 효율 (%)
필름 방법
1 0.025 170±10 0.47±0.1 72±2.8
2 0.1 327±19 0.29±0.02 26±4.7
3 0.2 427±43 0.27±0.06 12±1.3
투석 방법
4 0.01 145±2 0.16±0.01 92±6
5 0.025 153±3 0.18±0.06 89±3.5
6 0.05 185±10 0.5±0.12 59±8.3
결과들은 세 개 샘플들의 대표값이다 (평균 ± SD); PDI = 다분산 지수 (polydispersity index).
자유 독소루비신, 캡슐화된 독소루비신의 양, 생체 외에서의 방출 연구 동안 방출된 양, 및 세포 섭취량이 1 mL/분의 플로우 속도에서, 트리플루오아세트산 (trifluoroacetic acid) (0.1 %v/v) 및 아세토니트릴 (acetonitrile) 5 % v/v ~ 3 분, 80 % v/v ~ 11 분 및 5 % v/v ~22 분으로 이루어진 모바일 상을 사용하는 그래디언트 HPLC (gradient HPLC)를 사용하고, 형광 검출기 (여기 파장으로서 505 nm 및 방출 파장으로서 550 nm) 를 사용하여 정량화되었다.
Figure 112013087000250-pct00007
도 22 및 23은 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀에 대한 전자투과 현미경(transmission electron microscopic (TEM)) 및 원자력 현미경(atomic force microscopy (AFM))의 이미지를 각각 보여준다.
독소루비신은 실질적으로 물 속에서 불용성이다 (15 ng/mL). 그러나 PEG화된 자인 마이셀 내로 혼입되었을 때에, 그 용해도는 대략적으로 1000 배 (10 ㎍/mL) 로 증가된다. 도 24는 90 % 에탄올, 포스페이트 버퍼 pH 7.4 에서의 독소루비신 및 PBS pH 7.4 에서의 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀의 UV-비져블 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다. 90 % 에탄올 (v/v) 내에서 독소루비신-로드된 PEG-자인의 흡광도는 독소루비신의 흡광도보다 높으며, 이는 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀의 향상된 수성 용해도를 보여준다 (1000 배 증가).
도 25는 90 % 에탄올, 포스페이트 버퍼 pH 7.4 에서의 독소루비신 및 PBS pH 7.4 에서의 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀의 형광 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다. PEG화된 자인 마이셀 내에 트랩된 후에(entrapment) PBS pH 7.4에서 독소루비신 형광도에서의 현저한 증가 (대략적으로 50 배)가 존재하며 이는 독소루비신의 증가된 용해도에 기인한다. 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀의 시차 주사 열량 측정법 (Differential scanning calorimetry (DSC)) 온도 기록도가 도 26에 보여진다. 독소루비신의 융해 피크의 부재는 마이셀의 코어 내부에서의 독소루비신의 캡슐화를 나타낸다. PEG-자인 마이셀로부터 독소루비신의 생체 외에서의 방출은 도 27 에 도시되었다. 독소루비신의 방출은 약 24 시간 동안 지속되었다. PEG화된 자인 마이셀은 따라서 독소루비신에 대하여 유망한 캐리어이다.
여기 기재된 바와 같이 제조된 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀의 치료학적 활성이 독소루비신에 민감한 인간 유방 암 세포 (MCF-7) 및 독소루비신 저항성의 인간 난소 암 세포 (NCl/ADR/RES), 및 독소루비신에 민감한 인간 유방 암 세포 (MCF-7)에 대하여 생체 외에서 테스트되었다. 도 28은 생체 외에서 독소루비신 (90 % 에탄올에 용해된) 및 MCF-7 세포 내에서의 PEG-자인 마이셀의 세포 독성 (cytotoxicity) 프로파일을 나타낸 것이다. 웰 당 2000의 시드 밀도에서의 세포가 7.8 nM 내지 500 nM의 농도에서의 독소루비신 용액 및 독소루비신 마이셀에 대하여 노출되었다. 24 시간 경과 후에, 각각의 약물 처치가 제거되었다. 세포는 아이스 콜드 포스페이트 버퍼로 두 번 세척되었고 신선한 매개로 대체되었다. 매개는 매 48 시간 마다 교체되었다. 5 일 째에, MTT 분석법을 사용하여 세포 독성 분석이 이루어졌다.
독소루비신 마이셀의 IC50 값은 순수한 독소루비신 처치의 그것의 절반이었다. 도 29는 생체 외에서 독소루비신 염기 (90 % v/v 에탄올에 용해된) 및 NCl/ADR/RES 세포 라인에서의 PEG-자인 마이셀의 세포 독성 프로파일을 나타낸 것이다. 웰 당 2000 세포의 시드 밀도에서의 세포가 31.25 nM 내지 1000 nM의 농도에서의 독소루비신 염기 및 독소루비신 마이셀에 대하여 노출되었다. 24 시간 경과 후에, 각각의 약물 처치가 제거되었다. 세포는 아이스 콜드 포스페이트 버퍼로 두 번 세척되었고 신선한 매개로 대체되었다. 매개는 매 48 시간 마다 교체되었다. 5일 째에, MTT 분석법을 사용하여 세포 독성 분석이 이루어졌다. 독소루비신 마이셀에 대한 IC50 값은 자유 독소루비신 처치의 그것보다 4 배 낮았다. 인간 암 세포 라인에서의 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀에 대한 생체 외에서의 독성 분석법 결과는 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀이 자유 독소루비신 용액보다 현저하게 높은 효능을 가진다는 것을 보여주었다. 효능에서의 차이는 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀과 비교할 때에 자유 약물의 세포 섭취 동력학에서의 차이에 기인하는 것일 수 있다.
자유 독소루비신은 농도 변화에 의해 나타내어지는 수동적인 확산에 의해 섭취되는 반면, 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀은 능동적인 세포내 섭취 (endocytosis) 과정으로 섭취된다. 도 30은 NCl/ADR/RES 세포 라인에서의 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀 세포성 섭취에 대한 온도의 영향을 나타낸 것이다. 세포들은 4 ℃ 에서 2 시간 동안 예비-인큐베이트되었다. 2 시간 경과 후에 세포는 PBS pH 7.4로 두 번 세척되었고 또한 마이셀 (5 ㎍/mL 의 독소루비신에 대응하는 양) 로 처치되었다. 두 시간 후에 처치가 제거되었고, 세포는 아이스 콜드 PBS pH 7.4로 두 번 세척되었으며, 다른 시간적 간격에서의 세포 여과물 (lysate) 에서의 독소루비신 함유량이 HPLC 분석법을 사용하여 측정되었다.
세포 섭취는 낮은 온도에서 현저하게 감소되었으며 이는 PEG-자인 마이셀의 세포 섭취가 능동적인 세포내 섭취 (endocytosis) 과정이라는 것을 의미한다. 도 31은 NCl/ADR/RES 세포 라인에서의 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀 및 용액 (5 ㎍/mL 의 독소루비신 및 독소루비신-로드된 PEG-자인 마이셀 (5000 세포 수/웰) )의 세포성 섭취에 대한 동력학을 나타낸다. 독소루비신 마이셀의 더 높은 세포 섭취가 플레인 독소루비신 용액과 비교할 때에 모든 시간 포인트에서 관찰되었다. 나아가, 독소루비신 마이셀의 세포 이물 흡수적(endocytotic) 섭취는 저항성 암 세포에서의 약물 유출 펌프를 압도했으며, 따라서 약물 효능을 증가시키는 것이다.
도 32는 NCl/ADR/RES 세포에서 P-gp 활성도 (칼세인 AM 분석법 (Calcein AM assay))에 대한 PLURONIC F68 처치 (1 mg/mL), 및 블랭크 PEG 자인 마이셀 (0.050 mg/mL)의 영향을 나타낸 것이다. 칼세인 AM (Calcein AM)은 비-형광성이며 또한 세포 내부로 용이하게 확산된다. 칼세인 AM (Calcein AM)은, 칼세인은 아닌, P-gp 에 대한 기질이다. P-gp 저해제의 존재 하에서, 칼세인 AM (Calcein AM)은 세포로 들어가며 또한 세포 내 에스테라제(esterase)에 의해 칼세인으로 전환된다. 형광도는 세포 내에서의 칼세인 농도의 증가와 함께 증가하였다. 도 32 에서 보여지는 데이터로부터, 현저한 P-gp 저해가 블랭크 PEG-자인 마이셀에 있어서 관찰되는 것이 분명하다. 타겟팅 리간드가 또한 생체 내에서 타겟 사이트에 대하여 약물 로드된 PEG-자인 나노 마이셀의 전달을 촉진시키기 위해 부착될 수 있다.
도 33은 이형 이식(allograft) 종양 마우스 모델에서의 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 생체 내 생물 분포 (biodistribution)를 도시한 것이다. 암컷의 누드 마우스 (찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories), 윌밍톤(Wilmington), 마이애미(MA)) 가 연구에서 사용되었다. JC 마우스 유방 암 세포 (1 x 107 세포수) 가 PBS 내에 현탁되었고 또한 피하 내로 주사되었다. 종양 부피가 ~150 내지 200 mm3 에 도달하였을 때에, 동물은 독소루비신 용액 또는 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 정맥 내로의 주사를 맞았다 (3 mg/kg). 3 시간 경과 후에 마우스는 희생되었고 또한 기관들 (간, 심장, 폐, 비장, 뇌 및 종양) 이 수집되었으며 2 mL의 탈이온수 내에서 조직 균질화제 (tissue homogenizer)를 사용하여 균질화되었다. 100 ng의 다우노루비신 (내부 표준(internal standard))의 첨가 후에, 조직 균질화물은 동결 건조되었다.
건조 조직의 무게가 재어졌으며 5 mL의 메탄올/클로로포름 혼합물 (65:35)로 실온에서 어두운 곳에서 5 시간 동안 쉐이커를 사용하여 추출되었다. 추출물은 4℃에서 13,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리되었다. 상청액은 질소 가스 하에서 증발되었고 또한 메탄올/아세토니트릴 (50:50) 내에서 재건조되었다. 기관에서의 독소루비신의 양은 역상의 HPLC 방법(reverse phase HPLC method) (27 (아세토니트릴): 73 (20 mM 포타슘 하이드로전 포스페이트(potassium hydrogen phosphate) (단일 염기성) 버퍼 (pH: 2.5))를 사용하고 형광 검출기 (여기 파장으로서 505 nm 및 방출 파장으로서 550 nm) 를 사용하여 정량화되었다. 기관 내부에서의 독소루비신의 양은 건조 기관의 mg 당 양 (ng)으로서 표시되었다.
도 30에서 보여지는 바와 같이, 더 높은 약물 축적이 종양에서 발견되었던 반면 종양에서 자유 독소루비신 용액의 약물 축적은 없었다. 심장 및 신장 조직 내에서의 약물 농도는 자유 독소루비신 용액 샘플과 비교할 때에 독소루비신 PEG-자인 마이셀에서 현저하게 더 낮았다. 독소루비신 화학 요법은 심장 및 신장 독성에 의해 제한된다. 이러한 결과들은 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 향상된 종양 축적 및 감소된 독성을 나타내는 것이다.
독소루비신 PEG-자인 마이셀의 효능은 이형 이식 유방 종양 마우스 모델에서의 종양 부피에서의 변화를 측정하는 것에 의해 연구되었다. 암컷 BALB/c 마우스 (찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories), 윌밍톤(Wilmington), 마이애미(MA)) 가 연구에서 사용되었다. JC 마우스 유방 종양 세포 (1x107 세포수) 가 PBS 내에 현탁되었고 또한 피하 내로 주사되었다. 종양 부피가 ~150 내지 200 mm3에 도달하였을 때에, 동물은 정맥 내로의 독소루비신 용액 또는 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 두 번의 용량을 투여받았다 (3 mg/kg, 0 및 7일 째에). 종양 부피는 버니어 칼립퍼(Vernier Caliper)를 사용하여 측정되었다.
도 34는 다른 처치들 후에 종양 부피에서의 증가를 보여준다. 도 34 에서 보여지는 바와 같이, 종양 부피에서의 증가는 독소루비신 PEG-자인 마이셀에서 현저하게 낮았다. 독소루비신 PEG-자인 마이셀로 처치된 마우스는 또한 다른 처치 그룹들보다 더 오래 생존하였다 (도 35). 이러한 결과는 독소루비신 로드된 PEG-자인 마이셀의 향상된 효능을 나타내는 것이다.
실시예3. 커큐민을 캡슐화하는 PEG화된 자인 마이셀
커큐민은 인디안 스파이스 강황(turmeric)의 주요 커큐미노이드(curcuminoid)이며, 진저 과(진지베라세아(Zingiberaceae))의 멤버이다. 두 개의 다른 커큐미노이드(curcuminoid)는 데스메톡시커큐민(desmethoxycurcumin) 및 비스- 데스메톡시커큐민(bis-desmethoxycurcumin)이다. 커큐민은 적어도 두 개의 토토머변이(tautomeric)로 존재할 수 있으며, 그것의 에놀(enol) 형태가 고체 상에서 및 용액 내에서 에너지적으로 더욱 안정하다. 커큐민은 368.4의 분자량 (m. w.), 2.5의 Log P를 가지며, 실질적으로 물 속에서 불용성이고 메탄올에서 용해성이다.
Figure 112013087000250-pct00008
커큐민
임상적 연구는 다발성 골수종(multiple myeloma), 췌장암(pancreatic cancer), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes), 결장암(colon cancer), 건선(psoriasis), 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease)을 포함하는 다양한 질병에 대한 커큐민의 효과를 연구하고 있다. 생체 외에서의 및 동물 실험은 커큐민이 항종양, 항산화, 항관절염의(antiarthritic), 항-아밀로이드(anti-amyloid), 항-허열성(anti-ischemic), 및 항-염증성(anti-inflammatory)의 특성, 및 다른 생물학적 활성을 가지고 있음을 보여준다(애가왈 외(Aggarwal et al.), 어드밴스드 익스페리먼트 메디컬 바이올로지(Adv Exp Med Biol) 2007, 595:1-75). 도 9 및 10은 각각 필름 수화 및 투석 방법을 사용하는 커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀의 단계화된 제조를 도시한 것이다. 양 필름 수화 및 투석 방법에서, 0.1 g 의 PEG-자인 및 0.002 g 의 커큐민이 20 mL 의 90 % 에탄올 내에 용해되었다. 상기 혼합물은 하룻 밤에 걸쳐 37 ℃에서 인큐베이트되었으며 (50 rpm 에서 교반됨), 독소루비신 자인 코어 내부로의 커큐민의 분리가 가능하도록 하였다. 다음으로 하이드로알콜성 용매가 로터리 증발 장치를 사용하여 완벽하게 제거되었고 필름을 형성하였다. 건조된 독소루커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀의 필름은 시트레이트 버퍼 pH 7.4 에서 재건조되었으며, 또한 균일한 현탁물을 형성하기 위하여 5 분 동안 초음파 처리되었다. 상기 혼합물은 다음으로 자유 커큐민을 제거하기 위하여 실온에서 24 시간 동안 교반하는 것과 동시에 (100 rpm) 물에 대하여 투석되었다 (m.w. 컷 오프 = ~10,000 Da).
투석 방법에서, 하룻 밤 동안의 인큐베이션 후에, 혼합물은 마그네틱 교반 하 (100 rpm) 에 실온에서 24 시간 동안 물에 대하여 투석되었고 (m.w. 컷 오프 = ~10,000 Da), 자유 커큐민을 제거하였다. 결과로서 얻어지는 생성물은 다음으로 -80 ℃ 까지 동결되었으며 이어서 -47 ℃에서 60 mTorr의 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조되었다. 동결 건조된 생성물은 데시케이터 안에서 4 ℃로 저장되었다.
하기의 표 5 및 6은 각각 필름 방법 및 투석 방법을 사용하여 제조된 커큐민-로드된 PEG화된 자인 마이셀의 여러가지 특성들을 나타낸 것이다.
샘플 커큐민 (% w/w) 입자 크기 (nm) PDI 캡슐화 효율 (%)
1 0.25 166±10 0.4±0.1 92±3.5
2 0.5 139±2 0.43±0.05 76±11
3 1 176±9 0.4±0.12 47±17
4 2 185±13 0.52±0.06 38±4
결과들은 세 개 샘플들의 대표값이다 (평균 ± SD); PDI = 다분산 지수 (polydispersity index).
샘플 커큐민 (% w/w) 입자 크기 (nm) PDI 캡슐화 효율(%)
1 1 124±4.1 0.25±0.03 95±4
2 1.25 127±2.6 0.31±0.01 94±7
3 1.66 148±7 0.34±0.09 87±15
4 2.5 152±2.5 0.35±0.03 74±09
5 5 154±1 0.45±0.04 60±13
6 4 175±1.7 0.38±0.03 63±11
결과들은 세 개 샘플들의 대표값이다 (평균 ± SD); PDI = 다분산 지수 (polydispersity index).
자유 커큐민 및 캡슐화된 커큐민의 농도가 C-18 컬럼을 사용하는 RP-HPLC에 의해 분석되었다. 모바일 상은 60% 아세토니트릴 및 40% 시트릭 버퍼 (50 % (w/w) 소듐 하이드록사이드 용액을 사용하여 pH 3.0 으로 조정되어진 1 % (w/v) 시트르산 용액) 로 이루어졌다. 플로우 속도는 1.0 mL/분 이었고 및 검출 파장은 420 nm 였다.
Figure 112013087000250-pct00009
도 11 및 12는 커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀에 대한 전자투과 현미경(transmission electron microscopic (TEM)) 및 원자력 현미경(atomic force microscopy (AFM))의 이미지를 각각 보여준다. 커큐민은 실질적으로 물에 불용성이다 (11 ng/mL) (B. 애가왈 외(B. Aggarwal et al.) (2007), 어드밴스드 익스페러먼트 메디컬 바이올로지(Adv Exp Med Biol) 595:1-75). 그러나 PEG화된 자인 마이셀 내로 혼입되었을 때에, 그 용해도는 대략적으로 2000 배 (20 ㎍/mL) 로 증가된다. 도 13은 10 % 메탄올 내에서의 커큐민 및 PBS pH 7.4 에서의 커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀의 UV-비져블 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다. 상기 스펙트럼으로부터 커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀의 흡광도는 10 % 메탄올 (v/v) 내에 용해된 커큐민의 흡광도와 유사하다는 것이 분명하다. 따라서 PEG-자인은 대략적으로 2000 배 만큼 커큐민의 수성 용해도를 현저하게 향상시켰다. 도 14는 10 % 메탄올 내의 커큐민 및 PBS pH 7.4 내의 커큐민 로드된 PEG-자인 마이셀의 형광 스펙트럼이다. 540 nm 으로부터 525 nm으로 까지의 방출 스펙트럼의 Xmax의 이동은 커큐민이 마이셀 내에 트랩되었음을 보여준다. 나아가, PEG화된 자인 마이셀 내로의 트랩화 후에 물에서의 커큐민 형광도에서의 현저한 증가 (대략적으로 4 배)가 존재하며 이는 커큐민의 향상된 수성 용해도에 기인하다. 코어 내부로의 캡슐화는 환경 물질로부터의 분해, 예를들면, 가수분해 및 광분해, 에 대항하여 커큐민을 안정화시켰다.
표 7, 하기의, 은 빛의 존재 하에서 및 다양한 pH 에서 커큐민 로드된 PEG화된 자인 마이셀의 안정성을 보여준다. 커큐민의 안정성은 플레인 용액 (반감기 4 분)과 비교할 때에, PEG-자인 마이셀 내에 캡슐화되었을 때에 향상된다 (반감기 31.8 분) (포스페이트 버퍼 pH 7.4). 안정성은 포스페이트 버퍼 pH 5 내에서 더욱 분명하게 향상되었다 (반감기 = 6.9 분, 마이셀, t1/2 = 366 분과 비교할 때).
샘플 제형 조건 t 1/2 (분)
1 커큐민* pH 7.4 4
2 커큐민 로드된 PEG-자인 마이셀 pH 7.4 31.8
3 커큐민* pH 5 6.9
4 커큐민 로드된 PEG-자인 마이셀 pH 5 366
* 10 % v/v 메탄올이 커큐민을 용해시키기 위하여 사용되었다.
커큐민-로드된 PEG-자인 마이셀의 시차 주사 열량 측정법 (Differential scanning calorimetry (DSC)) 온도 기록도가 도 15에 보여진다. 커큐민의 융해 피크의 부재는 마이셀의 코어 내부로의 커큐민의 캡슐화를 나타낸다. PEG-자인 마이셀로부터 커큐민의 생체 외에서의 방출은 도 16 에 도시되었다. 커큐민의 방출은 약 24 시간 동안 지속되었다. 커큐민은 항암 및 항염증의 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있으나, 그러나 커큐민의 전달은 그것의 열악한 수 용해도에 의해 제한된다. PEG화된 자인 마이셀은 커큐민에 대한 적합한 캐리어일 수 있다. 도 17은 생체 외에서의 커큐민 (10 % DMSO에 용해된) 및 약물 저항성 인간 난소 암 세포 (NCl/ADR-RES 세포) 내에서의 커큐민 마이셀 (PBS 7.4 내에서) 의 세포 독성 (cytotoxicity) 프로파일을 나타낸 것이다. 세포 (2000 세포 수/웰)가 7.8 nM 내지 500 nM의 커큐민으로 4일 동안 처치되었다. 5일 째에 MTT 분석법을 사용하여 세포 독성 분석이 이루어졌다. 커큐민-로드된 마이셀은 순수한 커큐민보다 더 큰 효능 (3 배 초과)을 나타내었다.
자유 커큐민 및 캡슐화된 커큐민의 생체 외에서의 피부 침투.
도 18에서 보여지는 바와 같이, 커큐민의 피부 침투는 5-20 배 향상되었다. 자유 커큐민과 다르게, 커큐민 마이셀의 피부 침투는 처치 시간에 따라 증가하였다. 적용된 용량의 현저항 양 (5-20 %)이 피부를 침투하였고 및 커큐민은 더 긴 처치 시간에 의해 수용체 상(receptor phase)을 관통하고 도달하는 것으로 또한 밝혀졌다.
도 19에서 보여지는 바와 같이, 커큐민 마이셀은 주로 모낭 (hair follicles) (c) 에 대하여 국지화 (localization)되었다. 이것은 또한 형광성이 표면으로부터 100 ㎛ 깊이의 피부 내부에 이르기까지 연속된 부분(streaks)에서 관찰되는 "b" 로부터 명백하다. PEG-자인 마이셀의 국지화는 특히 여드름, 탈모, 지루성 습진(seborrhetic eczema), 모낭염 (follicullitis) 및 어떤 피부 암과 같은 여포성의 (follicular) 질병을 처치하기 위하여 유용하다. 도 19 (d) 는 각질층 (stratum corneum) (0-15 ㎛) 및 눈으로 보이는 표피 (20-100 ㎛) 에서의 형광 픽셀들을 보여준다. 마이셀 내로의 커큐민의 캡슐화는 커큐민의 피부 침투를 현저하게 증가시켰고, 각 값은 평균 ±SD (n =4 )이다. 잘라진 돼지 피부는 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획들 사이에 샌드위치되었다. 포스페이트 버퍼 (20 % 에탄올을 포함하며 pH 7.4)로 이루어진 수용체 매개는 37 ℃에서 유지되었으며 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 자유 또는 캡슐화된 커큐민은 6 시간 동안 피부에 대하여 적용되었다. 실험의 종결 시점에서, 피부는 세척되었고 또한 공초점 형광 현미경 (confocal fluorescence microscope) 하에서 관찰되었다. 형광 픽셀은 IMAGEJ 소프트웨어를 사용하여 정량화 되었다.
실시예 4. 닐 레드를 캡술화하는 PEG화된 자인 마이셀
닐 레드가 피부 전달 운반체로서의 PEG-자인 나노 마이셀의 적용을 연구하기 위하여 모델 소수성 염색제 (사이헤트 외(Sheihet et al.) (2008), 인터내셔널 저널 오브 팜( Int. J. Pharm.) 350: 312-319) 로서 사용되었다.
Figure 112013087000250-pct00010
닐 레드
닐 레드는 318.4의 분자량, Log P : 5를 가지며, 또한 녹는 점이 203-205 ℃이다. 실질적으로 물 속에서 불용성이고 메탄올, 에탄올, 및 DMSO 에서 용해성이다.
도 36은 일 실시예에 따른 투석 방법을 사용하는 닐 레드-로드된 PEG-자인 마이셀의 단계화된 제조를 도시한 것이다. PEG-자인 (0.1 g) 및 0.5 mg의 닐 레드가 20 mL의 90 % 에탄올 내에 용해되었다. 상기 혼합물은 하룻 밤에 걸쳐 37 ℃에서 인큐베이트되었으며 (50 rpm 에서 교반됨), 닐 레드의 소수성 자인 코어 내부로의 분리가 가능하도록 하였다. 혼합물은 다음으로 실온에서 24 시간 동안 물 (100 rpm 에서 교반되는)에 대하여 투석되었고 (m.w. 컷 오프 = ~10,000 Da), 어떠한 잔여 물질들을 제거하였다. 결과로서 얻어지는 생성물은 다음으로 -80 ℃ 까지 동결되었으며 이어서 -47 ℃에서 60 mTorr의 진공 하에 12 내지 14 시간 동안 동결 건조되었다. 동결 건조된 생성물은 데시케이터 안에서 4 ℃로 저장되었다. 닐 레드-로드된 PEG화된 자인 마이셀의 여러 가지 특성들이 하기의 표 9에서 보여진다.
모델 화합물 입자 크기 (nm) PDI 캡슐화 효율 (%)
닐 레드 165 ±7 0.21 ±0.08 77 ±11
결과들은 세 개 샘플들의 대표값이다 (평균 ± SD); PDI = 다분산 지수 (polydispersity index).
닐 레드는 피부 침투를 연구하는 데 있어 사용되는 모델 친유성 염색제이다. 제조된 닐 레드 로드된 PEG-자인 마이셀은 평균 입자 크기 165 nm 및 낮은 다분산 지수 (polydispersity index) (0.21)를 갖는다. PEG-자인 마이셀은 우수한 캡슐화 효율 (77%) 을 보여준다. 도 37은 소수성 화합물에 대한 피부 침투성 및 피부 보유성을 증가시키는 PEG-자인 마이셀의 능력을 나타낸다. 상기 데이터는 또한 PEG-자인 마이셀의 치료용 및 화장용 물질을 위한 피부 전달 운반체로서의 적용을 나타낸다.
피부 및 각질층에서 발견되는 닐 레드의 양 (n=3)은 피부 분절된 (dermatomed) 돼지 피부를 사용하여 조사되었다. 돼지 귀가 사우스 다코타 스테이트 유니버시티의 동물 및 레인지 사이언스 분과(Department of Animal and Range Sciences at South Dakota State University) 내 도살장으로부터 수득되었다. 상기 귀는 도살 후에 즉시 수집되었고 또한 수도물로 세척되었다. 등 부위의 털이 헤어 클립퍼로 제거되었다. 피부가 메스 (scalpel) 및 집게 (forceps)를 사용하여 하층의 연골 뼈로부터 절개되었다. 진피에 붙어있는 지방은 블런트 메스를 사용하여 조심스럽게 제거되었으며 또한 피부는 어떤 눈으로 보이는 손상에 대하여 관찰되었다.
피부는 모델 B 전자 피부 분절기 (model B electric dermatome) (파젯TM(PadgettTM ) 인스트루먼트(Instruments), 세이트 루이스(St. Louis), MO)를 사용하여 300 ㎛의 두께로 피부 분절되었다. 피부 분절된 돼지 피부는 프란츠 디퓨젼 셀 (Franz diffusion cell) (퍼미기어TM(PermeGearTM), 헬러타운(Hellertown), PA) 내에서 도너 및 리셉터 챔버 사이에 샌드위치 되었다. 리셉터 챔버는 6 mL의 포스페이트 버퍼 (PB, pH 7.4) 로 채워졌고 또한 마그네틱 스터바를 사용하여 교반되었다. 리셉터 매개는 37 ℃에서 유지되었다. 도너 챔버는 5 % v/v 트윈-80 용액 내의 닐 레드 (250 ㎍) 100 μL 및 물 속에서의 닐 레드 마이셀 (250 ㎍의 닐 레드에 상당하는) 로 로딩되었다. 6 시간 경과 후에, 피부 샘플이 PBS로 세척되었고 또한 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy (CLSM))에 의한 분석을 위하여 현미경 슬라이드 상에 놓여졌다.
각질층 (SC) 을 위면에 포함하는 피부가 CLSM (플루오뷰 FV300TM(Fluoview FV300TM), 올림푸스(Olympus) ix70, 올림푸스(Olympus), 센터 밸리(Center Valley), PA)을 사용하여 관찰되었다. 닐 레드는 488 nm의 여기 파장에서 아르곤 레이저를 사용하여 여기되었다. 이미지가 플란-네오프루어(Plan-neofluar) 40/0.85 오브젝티브(objective) 를 사용하여 관찰되었다. 피부의 xyz 공초점 이미지가 표면 (z=0 ㎛) 로부터 100 ㎛에 이르기까지 5 ㎛/스캔의 스텝 크기로 스캔되었다. 모든 이미지는 동일한 광학적 기기, 렌즈 및 스캔 스피드를 사용하여 얻어졌다.
블랭크 스킨은 어떠한 자가-형광성(auto-fluorescence)을 보이지 않았다. 각각의 대표적인 이미지가 세 개 내지 네 개의 피부 샘플들로부터 수집되었으며 또한 각 피부의 세 개 내지 네 개의 다른 영역들에서 스캔되었다. 광학적 섹션 (xyz) 이 플루오뷰TM (FluoviewTM) 소프트웨어 (올림푸스(Olympus), 센터 밸리(Center Valley), PA)를 사용하여 분석되었다. 공초점 이미지에서의 형광성 강도 분포 (fluorescence intensity distribution)가 총 픽셀을 집산(intergrating) 하는 것에 의해 정량화되었다. 각 피부에 대해 적어도 세 개 내지 네 개 영역에서 분석되었다. SC (0-15㎛) 및 눈으로 보이는 표피 (VE, 20-100 ㎛) 에서의 픽셀이 각각 계산되었다. 피부의 닐 레드로의 처치는 자유 닐 레드 용액과 비교할 때에 각질층 및 눈으로 보이는 표피 양자에 대한 피부 침투에서의 현저한 증가를 보여주었다 (도 37). 이러한 데이터는 PEG-자인 마이셀이 다양한 피부 질환을 효과적으로 처치하기 위하여 각질층 또는 눈으로 보이는 표피에 대한 치료용 또는 화장용 물질의 전달을 위해 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 5. 부가적인 컨쥬게이트 및 마이셀 실시예.
여기 기재된 PEG화된 자인 마이셀의 다양한 것이 또한 제조될 수 있다. 예를들면, 자인을 대신하여, 다른 소수성 프롤아민 단백질, 예를 들면 글리아딘, 호르데인 및 카피린이 마이셀 형성을 위하여 PEG화된 단백질로서 사용될 수 있다. 따라서, PEG화된 글리아딘 마이셀, PEG화된 호르데인 마이셀, 및 PEG화된 카피린 마이셀이 제조될 수 있고 또한 여기 기재된 PEG화된 자인 마이셀과 유사하게 사용될 수 있다.
부가적으로, 다른 친양쪽성 단백질 컨쥬게이트들은 PEG화된 프롤아민 코폴리머의 PEG 모이어티를 다른 수 용해성 고분자, 예를 들면 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone (PVP)), 폴리글리코산(polyglycolic acid (PGA)), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol (PVA)), 키토산(chitosan), 폴리살리실산(polysialic acid (PSA)), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine (PEI)), 폴리아크릴산(polyacrylic acid (PAA)), 덱스트란(dextran)과 같은 폴리사카라이드(polysaccharides), 및 기타 등등으로 대체하는 것에 의해 제조될 수 있다. 이러한 수 용해성 고분자들은 소수성 프롤아민 단백질, 예를 들면 자인, 글리아딘, 호르데인 및 카피린의 어느 것에 대하여 컨쥬게이트될 수 있으며, 마이셀 내부로 자기-조립되는 친양쪽성 단백질 컨쥬게이트를 형성한다. 마이셀이 용해되어 있는 치료용 물질의 존재하에 형성될 때에, 약물 로드된 마이셀은 이러한 다양한 친양쪽성 단백질 컨쥬게이트로부터 제조될 수 있고 또한 PEG화된 자인 마이셀에 대하여 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
이와 유사하게, 소수성 고분자는 프롤아민에 대하여 컨쥬게이트될 수 있다. 그러한 고분자는, 예를 들면 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리 락트산-코-글리코산(poly lactic acid-co-glycolic acid), 폴리프로필렌 옥사이드(polypropylene oxide), 폴리아스파르테이트(polyaspartate), 폴리굴타메이트(polygultamate), 스페르민(spermine), 폴리라이신(polylysine), 또는 폴리아크릴레이트(polyacrylates) (예를 들면, 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 폴리디메틸아미노 에틸 아크릴레이트(polydimethylamino ethyl acrylate) 및 기타 등등)을 포함할 수 있다. 지방산은 또한 프롤아민에 대하여 컨쥬게이트될 수 있어 소수성 코어를 형성한다. 그러한 지방산의 예들은 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 포스파디틸에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 또는 올레산(oleic acid)을 포함할 수 있다. 이러한 폴리머 및/또는 지방산은 소수성 프롤아민 단백질의 어떤 것, 예를 들면 자인, 글리아딘, 호르데인 및 카피린에 대하여 컨쥬게이트될 수 있고, 마이셀 내부로 자기-조립되는 단백질 컨쥬게이트를 형성한다. 마이셀이 용해되어 있는 치료학적 물질의 존재하에 형성될 때에, 약물 로드된 마이셀은 이러한 다양한 단백질 컨쥬게이트로부터 제조될 수 있고 또한 PEG화된 자인 마이셀에 대하여 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
다른 또는 추가적인 변형들이 프롤아민 소수성 코어에 대하여 또는 PEG 쉘과 같은 친수성 쉘에 대하여 이루어질 수 있다. 이러한 변형들은 pH 민감성 마이셀을 제조하기 위하여 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(polyhydroxyethylmethacrylate), 또는 열 민감성의 마이셀을 제조하기 위하여 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly (N-isopropylacrylamide))와 같은 자극 반응성 성분(stimuli responsive elements)을 코어에 대하여 컨쥬게이트시키는 것을 포함할 수 있다. 부가적으로, 상기 프롤아민 소수성 코어 또는 친수성 쉘은 약물 방출을 조절하기 위하여 및 약물 캡슐화 수율 및 효율을 향상시키기 위하여 교차 결합될 수 있다, 예를들면, 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 게니핀(genipin), 또는 시트르산(citric acid), 및 기타 등등과 같은 교차-결합제(cross-linkers)를 사용하여.
실시예 6. 레티노이드의 국소적 전달을 위한 프롤아민 마이셀
여러 가지 피부 과학적 질환들을 처치하기 위하여 피부를 통과하는 레티놀의 국소적 전달을 위한 신규한 나노 캐리어들이 개발되어 왔다. 레티놀 (비타민 A) 및 그것의 유도체들 (레티노이드)은 표피 세포의 성장 및 분화, 시력 (vision), 면역조절(immumomodulatory) 및 항-염증 효과(anti-inflammatory effects) 를 포함하는 신체 내에서의 다양한 생물학적 기능에 관여된다(서머(Summer), J Nutr 138:1835-1839, 2008). 특히, 레티놀 및 그것의 유도체들은 여드름, 건선, 액취증 (keratinization disorders), 피부 변색 (skin discoloration), 및 피부 악성 종양 (cutaneous malignancies ) (피부 암 및 악성 흑색종(melanoma))을 포함하는 다양한 피부 과학적 질환을 처치하기 위하여, 및 상처 치료 및 광노화(photoaging)에 대해 광범위하게 사용된다 (오파노스 외(Orfanos et al.), 드럭(Drug) 53:358-388, 1997). 레티놀은 또한 주름을 감소시키고 및 셀룰라이트를 처치하기 위하여 화장용 제형으로 사용된다 (오파노스 외(Orfanos et al.), 드럭(Drug) 53:358-388, 1997). 그러나 화장용 및 피부 과학적인 적용을 위한 레티놀의 사용은 그것의 열악한 물리화학적 특성들 및 피부 자극(irritation) 가능성에 의하여 심각하게 제한된다 (멜로 외(Melo et al.), 저널 오브 컨트롤 릴리즈(J Control Release) 138:32-39, 2009; 김 외(Kim et al.), 톡시콜 레터 (Toxicol Lett) 146:65-73, 2003).
Figure 112013087000250-pct00011
레티놀
레티놀은 친유성 분자 (Log P 6.20)이며, 열악한 수 용해도 및 제한된 피부 침투성을 갖는다. 나아가, 그것은 빛 및 습기의 존재 하에 매우 불안정하다 (그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 5,851,538 (프로익스 외(Froix et al.))를 참조하라). 레티놀의 국소적 적용은 마일드 홍반(erythema) 및 각질층 벗겨짐 (stratum corneum peeling) 으로 나타나는 심각한 국지적 자극(irritation)을 유발하고, 사용자들 사이에서 비-컴플라이언스(non-compliance )를 유도한다 (김 외(Kim et al.), 톡시콜 레터 (Toxicol Lett) 146:65-73, 2003). 출원인들은 국소적 적용을 위하여 레티놀을 신규한 단백질 기반의 마이셀 내로 캡슐화하는 것에 의해 레티놀의 상기 전달 문제를 성공적으로 해결하였다.
신규한 나노 캐리어가 여기 기재된 바와 같이 옥수수 단백질 자인으로부터 개발되었다. 하나의 나노 캐리어는 자인에 대하여 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 컨쥬게이트시키는 것을 포함한다. PEG화된 자인은 소수성 코어 및 친수성 쉘을 포함하는 자기-조립된 나노 마이셀을 형성한다. 자인은 피부 케라틴에 대하여 소수성을 나타내며 (데오 외 (Deo et al.), 랑뮈어 (Langmuir) 19:5083-5088, 2003) 또한 따라서 피부 적용에 대하여 유망한 캐리어이다. 자인이 소수성이기 때문에, 그것은 나노 입자 내부에 소수성의 레티노이드를 캡슐화하는데 있어서 사용될 수 있거나 (예를 들면, 그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 WO 2009/137112를 참조하라), 또는 여기 기재된 마이셀은 레티노이드에 대해 물 제거 가능한 제형을 제공하기 위하여 소수성 레티노이드를 캡슐화하는데 있어 사용될 수 있다.
출원인들은 79-91 %의 캡슐화 효율을 가지고 180-220 nm 의 크기 범위를 갖는 레티놀 로드된 나노 마이셀을 제조하였다. 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 수 용해성 제형의 결과를 가져왔다.
PEG-자인 나노 마이셀은 습기 및 빛이 유발하는 분해에 대하여 레티놀의 고체 상태 및 액체 상태 안정성을 현저하게 향상시켰다. 레티놀 방출은 PEG-자인 나노 마이셀로부터 최대 2 일 동안 지속되었다.
PEG-자인 나노 마이셀은 자유 레티놀 수성 분산물과 비교할 때 레티놀의 피부 침투를 향상시켰다. 나아가, PEG-자인 나노 마이셀은 화장용 및 피부 과학적 적용을 위한 피부 층에서의 레티놀을 보유시키기 위해 사용될 수 있다. 나노 캐리어의 독특한 점은 레티놀의 국소적 전달을 위한 복합적인 시장의(market) 도전을 해소하는 나노 마이셀의 능력이다. 이러한 도전은 1) 레티놀의 수 용해성 및 수 분산이 가능한 제형, 2) 빛 및 습기가 유발하는 분해에 대항하는 레티놀의 향상된 안정성, 3) 레티놀의 자유롭게 흐르는, 무색 및 비-흡습성(non-hygroscopic) 파우더, 4) 레티놀의 지속적인 방출 제형, 5) 레티놀의 더 높은 피부 침투성 및 더 높은 피부 보유성, 및 6) 레티놀의 비-자극성 제형을 제공하는 것을 포함한다.
자인은 피부 케라틴과 유사한 특성을 갖는 생분해 가능한 US-FDA 승인된 단백질 고분자로서 또한 따라서 이것은 피부 적합성 나노 캐리어이다. PEG는 US-FDA 승인된 수 용해성 고분자이다. PEG-자인 나노 마이셀은 따라서 레티놀에 대하여 수 세척 가능한 국소적 제형을 제공한다. 친양쪽성 PEG-자인 마이셀은 피부에서 소수성 및 친수성 환경을 번갈아 통하여 레티놀과 같은 소수성 약물을 이동시키기 위한 캐리어로서 작용한다.
레티놀 수 용해도는 나노 마이셀 내에서의 캡슐화 후에 현저하게 증가된다. 상기 레티놀 방출은 자인 나노 마이셀로부터 지속될 수 있으며 이는 더 낮은 용량 및 적용에 있어서 감소된 주기를 유도한다. 자인 나노 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀 제형의 품질 수명(shelf-life)을 현저하게 증가시킨다. PEG-자인 나노 마이셀은 고체 및 세미-고체 제형에서의 레티놀의 흐름성 및 분산성을 증가시킨다. 레티놀이 흡습성의 스티키(sticky)한 파우더이기 때문에, 나노 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀과 관련된 어려운 핸들링 및 프로세싱 문제점들을 해소할 수 있다.
PEG-자인 나노 마이셀은 화장용 및 피부 과학적 적용에 대하여 피부의 층에서의 레티놀의 피부 침투성 및 보유성을 향상시킬 수 있다. 자인 나노 마이셀은 화장용 및 피부 과학적 적용에 대하여 피부의 층에서의 레티놀의 피부 침투성 및 보유성을 향상시킬 수 있다. 나노 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀의 노란 색을 덮는다. 이것은 레티놀 제형의 심미적 어필(appeal)을 향상시키고 또한 노란 색의 스테이닝(staining)을 방지한다. 동결 건조된 PEG-자인 나노 마이셀은 젤, 크림, 로션 및 연고와 같은 다양한 국소적 제형 매트릭스 내에 용이하게 혼입될 수 있다.
피부 침투에 대한 연구는 많은 중요한 관점에서 인간의 피부와 유사한 절개된 돼지 피부에 의해 수행되었다 (시몬 및 마이바흐 (Simon and Maibach), 스킨 파마콜 어플라이 피지올 (Skin Pharmacol Appl Physiol) 13:229-234, 2000). 쥐에서의 생체 내 연구는 나아가 나노 마이셀의 레티놀 피부 자극을 해소하는 능력을 보여준다. 현재의 상업적인 제형을 대신하여 나노 마이셀을 사용하는 것의 장점들은 하기를 포함한다:
1. 용해성
레티놀은 수 불용성 소수성 화합물이다. PEG-자인 나노 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 수 용해성/분산성이다. 따라서 나노 마이셀은 국소적 적용을 위한 수 세척 가능한 레티놀 제형을 개발하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로 수 세척 가능한 제형은 화장용 및 피부 과학적 적용을 위하여 선호된다.
2. 안정성
레티놀은 습기 및 빛의 존재 하에 매우 불안정하다. 이것은 레티놀 제형의 품질 수명 및 적용의 기간 동안 제형의 효능을 제한한다. PEG-자인 나노 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀 제형의 안정성 및 품질 수명을 현저하게 향상시킨다.
3. 서방성
레티놀 방출은 PEG-자인 나노 마이셀로부터 지속될 수 있다. 방출은 2 일 부터 일주일에 이르기까지 지속될 수 있다. 이것은 레티놀의 적용의 용량 및 주기를 감소시킨다.
4. 피부 침투 및 보유력
레티놀은 열악한 피부 침투 특성을 갖는다. 나노 마이셀은 향상된 레티놀의 피부 침투성을 유도한다. 레티놀은 적용에 따라, 레티놀은 다양한 피부 과학적/화장용 적용을 위하여 나노 마이셀을 사용하여 피부의 층들에 보유될 수 있다.
5. 화장용으로서의 적용
레티놀 로드된 마이셀은 항-노화, 항-주름, 및 셀룰라이트의 처치와 같은 화장용으로서의 적용을 위해 사용될 수 있다.
6. 피부 과학적인 적용
레티놀 로드된 마이셀은 건선, 여드름, 상처 치료 및 피부 악성 종양 (cutaneous malignancies), 예를 들면 피부 암 및 악성 흑색종(melanoma)와 같은 다양한 피부 과학적 질환에 대하여 사용될 수 있다.
7. 효과적이고 안전한 제형
레티놀 로드된 나노 마이셀의 사용은 더욱 효과적인 처치의 결과를 가져온다. 나아가, 나노 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 레티놀에 의해 유발되는 피부 자극을 감소시킨다. 레티놀의 피부 자극은 레티놀의 화장용 및 피부 과학적 적용에 대한 비-컴플라이언스(non-compliance)에서의 주요한 문제점이다.
8. 다른 레티노이드의 캡슐화를 위한 플랫폼 기술
레티놀, 레티노산(retinoic acid), 및 그들의 유도체를 포함하는 다양한 레티노이드가 화장용 및 피부 과학적인 적용을 위하여 프롤아민 나노 마이셀 내로 캡슐화될 수 있다. 캡슐화를 위해 적합한 다양한 레티노이드의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 레티놀, 레티노산 (예를들면 13-트랜스-레티노산(13-trans-retinoic acid (트레티노인(tretinoin)), 13-시스-레티노산(13-cis-retinoic acid (이소트레티노인 (isotretinoin)), 9-시스-레티노산(9-cis-retinoic acid (알리트레티노인(alitretinoin)), 레틴알데히드(retinaldehyde), 에트레네이트(etretnate), 애시트레틴(acitretin), 레티놀 팔미테니트(retinol palmitate), 및 카로틴(carotene), β-카로틴(β-carotene), γ-카로틴(γ-carotene), β-크립토잔틴(β-cryptozanthin), 루테인(lutein), 및 제아크산틴(zeaxanthin)과 같은 카로테노이드(carotenoids)를 포함한다.
9. 조합 치료법
레티놀 나노 마이셀은 다른 약물과 함께 다른 제품, 예를들면 항-건선(anti-psoriatic), 항-여드름 및 피부-암 제품 내로 혼입될 수 있다. 레티놀은 캡슐화되기 때문에 그것은 다른 약물과의 상호 작용을 방지할 수 있다. 다른 약물, 예를 들면 항-산화, 자유-래디컬 스캐빈져(free-radical scavengers), 항-염증 약물이 또한 나노 마이셀 내로 레티놀과 함께 캡슐화될 수 있다.
레티놀 로드된 PEG-자인 나노 마이셀.
레티놀 (C20I-1300; 286.45 g/몰)은 61-63 ℃의 녹는 점, 3100 유닛/mg의 활성, 및 6.2의 Log P를 갖는다. 레티놀은 실질적으로 물 속에서 불용성이고, 에탄올에서 용해성 또는 부분적으로 용해성이며, 또한 클로로포름, 에테르 및 석유 스피릿(petroleum spirits)과 함께 혼합된다(miscible).
레티놀은 광노화, 여드름, 상처 치료, 기미 건선(melasma psoriasis), 피부 암, 악색 흑색종 (melanoma) 및 다른 피부 질환들을 포함하는 다양한 피부 질환들에 대하여 사용되는 화장품용(cosmecutical)/치료용 약물이다 (오파노스 외(Orfanos et al.), 드럭(Drug) 53:358-388, 1997). 레티놀은 열악한 수 용해성 및 열악한 광 안정성을 갖는다 (멜로 외(Melo et al.), 저널 오브 컨트롤 릴리즈(J Control Release) 138:32-39, 2009 ; 그것의 전체로서 참조에 의해 여기 포함되어 있는 미국 특허 번호 5,851,538 (프로익스 외(Froix et al.)). 이에 더하여, 그것은 또한 피부 자극을 유발한다 (김 외(Kim et al.), 톡시콜 레터 (Toxicol Lett) 146:65-73, 2003). 출원인들은 레티놀의 새로운 자인 기반의 나노 입자화된 국소적 제형을 개발하였다. 자인은 피부 케라틴과 유사한 특성을 가지기 때문에, 그것은 국소적 제형에서 사용되는 부형제들의 피부 자극을 테스트하기 위한 모델 단백질로서 사용된다 (자인 테스트). 그것의 피부 케라틴과의 유사성 때문에, 자인 나노 캐리어는 레티놀에 대한 우수한 전달 운반체이다. 이에 더하여, PEG는 피부 제형들에서 광범위하게 사용되는 물질이다. 따라서, PEG-자인 마이셀 내에서의 소수성 자인 및 친수성 PEG의 조합은 피부에서의 소수성 및 친수성 영역을 번갈아 통하면서 피부를 관통하는 분자의 이동을 가능하게 하는 친양쪽성 캐리어이다.
본 예는 레티놀 로드된 자인 나노 마이셀의 제조 및 특성, PEG-자인 나노 마이셀을 사용하는 향상된 레티놀의 용해도, PEG-자인 나노 마이셀 내로의 캡슐화에 의한 레티놀의 향상된 안정성, 자인 마이셀로부터의 레티놀의 지속되는 방출, 레티놀의 피부 침투성 및 피부 보유성을 향상시키기 위한 자인 나노 마이셀의 능력, 및 레티놀 자체와 비교할 때 레티놀 마이셀 제형의 결핍된 또는 감소된 피부 자극을 보여준다.
1. 레티놀 로드된 나노 마이셀의 제조.
PEG-자인, 레티놀 및 BHT는 90 % 에탄올에 용해되었고 37 ℃에서 하루 밤 동안 인큐베이트되었다. 그 후에 분산물이 탈이온수에 대해 투석되었으며 자유 레티놀을 제거하였다. 레티놀 로드된 마이셀은 그런 다음 동결 건조되었다. "콜드(cold)" 레티놀과 함께 방사선 표지된 (3H) 레티놀이 본 연구에서 사용되었다. 나노 마이셀의 크기는 PEG-자인/약물 비율 및 BHT 농도에 의존적으로 약 180-220 nm 였고 캡슐화 효율은 79 내지 91 %였다. BHT의 부재 하에, 캡슐화 효율은 <35% 였다. 표 6 (10)-1 은 각각 투석 방법 (예로서 도 38을 참조하라) 및 필름 방법 (예로서 도 39을 참조하라)을 사용하여 제조되는 레티놀-로드된 PEG화된 자인 마이셀의 특성에 대한 데이터를 제공한다.
[표 10-1]
Figure 112013087000250-pct00012

2. 수성 용액 내에서의 레티놀의 증가된 용해도/분산성.
자유 레티놀은 물 속에서 분산성이 아니며 물질의 의도된 분산 후에 바이엘의 바닥에 가라앉는다 (도 40). 다른 한편, 레티놀 로드된 PEG-자인 나노 마이셀은 물 속에서 용이하게 분산된다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 레티놀의 용해도는 나노 마이셀 내로의 캡슐화 후에 현저하게 향상되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 10 ㎍/mL 의 샘플 레티놀 (레티놀 상당) 레티놀 마이셀은 10 ㎍/mL 의 20 % 메탄올 내에서의 자유 레티놀에 대해 비교할 만한 UV 흡광도 (320 nm) 를 보여주었다. 매우 적은 흡광도가 10 ㎍/mL 의 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내 레티놀의 분산물에서 관찰되었다.
3. PEG-자인 나노 마이셀로부터의 레티놀의 방출.
나노 마이셀로부터의 레티놀의 방출에 대한 연구가 포스페이트 버퍼 식염수 (PBS, pH 7.4) 내에서 수행되었다. 레티놀의 농도는 320 nm에서의 UV 분광 광도계를 사용하여 분석되었고, 방출 연구는 세 번에 걸쳐 수행되었다. 레티놀 방출은 도 41에서 보여지는 바와 같이 나노 마이셀로부터 최대 48 시간 동안 지속되었다.
4. 레티놀 로드된 자인 나노 마이셀의 안정성
레티놀은 노란 색의 파우더이다. 그것은 주변의 환경에서 흡습성이며 또한 빨리 스티기(sticky)해 진다. 캡슐화된 레티놀은 무색이며 자유롭게 흐르고, 또한 훨씬 적은 흡습성을 갖는다 (도 42). 도 42 에서 보여지는 레티놀 샘플은 밝은 노란색이고 나노 마이셀 제형은 백색이며, 이는 캡슐화가 레티놀의 밝은 노란 색을 커버한다는 것을 나타낸다. 나노 마이셀 제형은 또한 순수한 레티놀보다 훨씬 자유로운 흐름성의 결과를 가져온다.
주변의 환경 및 어두운 곳에서 레티놀 나노 마이셀 제형의 안정성이 일 주일의 기간에 걸쳐 연구되었다. 레티놀 및 레티놀 로드된 나노 마이셀 (동결 건조된 파우더) 의 고체상 안정성이 또한 일 주일에 걸쳐 연구되었다. 액체 상테에서의 안정성에 대하여, 자유 레티놀 또는 레티놀 로드된 나노 마이셀은 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 내에서의 분산되었고 또한 레티놀 농도는 UV 분광법 (320 nm)을 사용하여 일 주일 동안 측정되었다. 레티놀은 제 1차 동력학을 따르는 것으로 밝혀졌으며 반감기가 측정되었다. 하기의 결과들이 표 10-3 및 10-4 및 도 43, 44, 45, 및 46 에서 보여지는 바와 같이 얻어졌다.
PEG-자인 나노 마이셀은 광분해 및 습기가 유발하는 분해에 대하여 레티놀을 보호하였다. 고체 상태 및 액체 상태에서 캡슐화된 레티놀은 자유 레티놀과 비교할 때 향상된 안정성을 보였다. 산화 방지제로서의 BHT의 포함은 캡슐화된 레티놀의 안정성을 추가적으로 향상시켰다. 최종적으로, 레티놀의 품질-수명은 나노 마이셀 내에서의 캡슐화에 의해 현저하게 향상되었다.
[표 10-3]
Figure 112013087000250-pct00013
[표 10-4]
Figure 112013087000250-pct00014

5. 레티놀 및 캡슐화된 레티놀의 피부 침투성
레티놀 및 캡슐화된 레티놀의 피부 침투성은 프란츠 디퓨젼 셀(Franz diffusion cell)을 사용하여 절개된 돼지 귀 피부를 사용하여 연구되었다. '콜드(cold)' 레티놀과 함께 방사선 표지된 (3H) 레티놀이 본 연구에서 사용되었다. 48 시간의 종결 시점에서 피부 균질체 및 수용체 매개 내에서의 레티놀의 양은 방사 화학적 분석법을 사용하여 측정되었다. 이 실험은 6 회 반복되었다 (±SD). 도 47 에서 보여지는 바와 같이, 캡슐화된 레티놀은 피부에서의 레티놀의 더 큰 보유성의 결과를 가져왔다. 마이셀은 레티놀의 피부 보유성을 대략적으로 5 배 증가시키는 결과를 가져왔다. 자유 레티놀 및 레티놀 마이셀에 대해서 "수용체에 대한 피부 내에서의 레티놀"의 비는 각각 3 및 6.5였다. 상기 결과들은 마이셀이 레티놀의 피부 침투성 및 보유성을 전체적으로 증가시켰다는 것을 보여준다.
레티놀의 모낭 타겟팅 (follicular targeting)을 보여주기 위하여 피부 샌드위치 모델이 사용되었다. 상기 샌드위치 피부에서 (도 48을 참조하라), 모낭으로의 경로가 표피 위로 샌드위치되어 있는 각질층에 의해 블록킹되어 있다. 샌드위치 피부 모델에서 수용체 부분으로 이동된 레티놀의 양은 통상적인 피부 표피 침투 연구와 비교할 때 자유 및 마이셀 캡슐화된 레티놀 양자에 있어서 감소되었다. 그러나 마이셀로부터 레티놀의 이동에서는 현저한 감소가 존재하였고 이는 레티놀 마이셀의 상당한 분획이 헤어 모낭을 관통하여 이동된 것을 나타낸다. 여드름 (여드름은 주로 헤어 모낭으로부터 기인한다) 을 치료하기 위한 레티놀의 사용을 가정할 때에, 레티놀 마이셀은 헤어 모낭 내에서의 질병 사이트에 대하여 레티놀을 타겟팅한다는 장점을 가질 것이다.
요약하면, PEG-자인 나노 마이셀은 레티놀의 수성 용해성 및 분산성을 현저하게 증가시켰다. 나노 마이셀 내로의 레티놀의 캡슐화는 노란 색의, 스티키하며, 또한 흡습성 파우더인 자유 레티놀과 다르게 자유롭게 흐르는 무색의 파우더의 결과를 가져왔다. 자인 나노 마이셀은 효과적으로 레티놀의 방출을 지속시켰다. 레티놀의 광 안정성 및 가수 분해에 대한 안정성이 자인 나노 마이셀 내로 캡슐화시키는 것에 의해 현저하게 향상되었고, 이는 산화 방지제로서의 BHT의 첨가에 의해 더욱 향상되었으며, 또한 PEG-자인 나노 마이셀은 레티놀의 더 높은 피부 보유성의 결과를 가져왔다. 나노 마이셀은 또한 레티놀의 피부 자극을 감소시킬 수 있다.
레티놀 마이셀에 대한 크림 제형의 제조.
상업적인 개발을 위한 전달용으로서 피부 제형화의 구현 가능성을 보여주기 위하여, 상업적인 크림 베이스 (MEDCO Labs) 가 자유 레티놀 또는 자인 마이셀 내로 캡슐화된 레티놀을 혼입하는데에 사용되었다. 크림 베이스는 스테아릴 알콜 (stearyl alcohol) (14 %), 세틸 에스테르 (cetyl esters) 가 (3.5 %) 였으며, 글리세릴 모노스테아레이트 (glyceryl monostearate) (2 %), 폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르 (polyoxyethylene stearyl ether) (3 %), 소르비톨 (sorbitol) (10 %), 이소프로필 팔미테이트 (isopropyl palmitate) (2 %), 메틸 파라벤 (methyl paraben) (0.16 %), 프로필 파라벤 (propyl paraben) (0.4 %) 및 순수한 물 (65 %)을 포함한다. 0.1 % 상당의 레티놀이 무게 재어졌으며 또한 시계 접시로 이동되었고 기하학적인 희석 (geometric dilution)에 의한 유리 막대를 사용하여 균일하게 혼합되었다. 이에 제한되는 것은 아니나, 오일-워터 크림, 오일 크림 내 워터, 연고, 젤, 및 기타 등등을 포함하는 다른 제형이 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 3H-레티놀의 0.05 μCi로 스파이크 되었고 (spiked) 또한 크림 내에서 격렬하게 혼합되었다. 최종적으로, 제조된 크림 제형은 유리 바이엘로 이동되었고 또한 사용 시까지 저장되었다.
레티놀 크림 제형들
레티놀 (0.1% w/w) 크림 -1g
레티놀 0.001 g
크림 베이스 0.800g
레티놀 마이셀 크림 (0.1% w/w) -1g
레티놀 마이셀 0.0625 g
크림 베이스 0.9375g
레티놀 마이셀 크림 제형의 안정성은 한 달 동안 측정되었다 (도 49를 참조하라). 상기 도면에서 보여지는 바와 같이, 제형은 안정되게 유지되었고 또한 실온에서 어떠한 열화(degradation)도 관찰되지 않았다.
생체 외에서의 크림 제형으로부터의 레티놀의 방출.
방출 실험을 위하여 약 40 mg의 크림 베이스 및 마이셀 크림이 수직의 디퓨젼 셀 투석 멤브레인 (vertical diffusion cell dialysis membrane) (MWCO ~ 8,000-10,000 Da) 에 놓여졌으며, 수용체 매개는 pH 7.4 버퍼로 이루어졌다. 샘플은 수용체 매개로부터 수집되었고 또한 3H를 사용하는 방사 화학적 방법에 의해 분석되었다. 각 데이터 포인트는 평균 ±SD (n =3)을 나타낸다. 도 50에서 보여지는 바와 같이, 마이셀 크림과 비교할 때 더 많은 레티놀이 플레인 크림으로부터 방출된다.
생체 외에서의 피부 침투성.
절개된 인간의 피부가 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치되었다. 수용체 매개는 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)로 이루어졌고 37 ℃로 유지되었으며 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 자유 또는 레티놀 캡슐화된 마이셀 크림 제형이 도너 챔버에 로딩되었다. 제형은 6 시간 동안 적용되었고 또한 다음으로 상기 제형은 제거되었으며 침투성 연구가 48 시간 동안 계속되었다. 연구의 종결 시점에서, 피부 및 수용체 부분 내의 레티놀 농도가 3H 표지된 레티놀을 사용하는 방사 화학적 방법에 의하여 측정되었다. 상기 피부는 0.1 M의 소듐 하이드록사이드를 사용하여 용해되었으며 레티놀의 농도를 측정하였다. 도 51에서 보여지는 바와 같이, 플레인 크림에 대하여 더 많은 레티놀이 피부 내에서보다 수용체 부분 내에서 존재하였다. 이와는 대조적으로, 마이셀 크림은 반대의 경우를 보여주었는데, 더 많은 레티놀이 수용체 부분에서보다 피부 내에서 발견되었다.
레티놀 및 캡슐화된 레티놀 크림 제형의 피부 자극.
표준 대 캡슐화된 제형의 피부 자극이 표 12에 리스트화되어 있는 바와 같은 처치 그룹들을 사용하여 SKH-1 헤어리스 마우스에서 생체 내에서의 테스트될 수 있다.
피부 자극 연구를 위한 처치 그룹들
그룹 처치
그룹 1 대조군 (처치 없음)
그룹 2 레티놀 크림
그룹 3 블랭크 PEG-자인 마이셀 크림
그룹 4 레티놀 나노 마이셀 크림
그룹 5 소듐 라우릴 설페이트(Sodium lauryl sulfate) 크림 (포지티브 대조군)
레티놀 크림 제형들 (0.1 % w/v 레티놀 상당의 0.5 g) 이 5 일 동안 매일 SKH-1 헤어리스 마우스의 등에 대해 적용되었다. 경표피 수분손실(Transepidermal Water Loss (TEWL)) 값이 TEWA 미터 (Delfin)을 사용하여 매일 제형의 적용 전에 측정되었다. TEWA에서의 증가는 피부 자극의 척도이며 또한 도 52에서 보여지는 바와 같이, 마이셀 내에 캡슐화된 레티놀은 어떠한 피부 자극도 보이지 않았고 네거티브 대조군 (즉, 처치 없음)에 비교될 만 하였다. 다른 한편 자유 레티놀 크림은 피부 자극을 보인다. 소듐 라우릴 설페이트(Sodium lauryl sulfate) (SLS), 피부 자극제로서 알려져 있는, 는 포지티브 대조군으로서 사용되었다.
생체 내에서의 국소적 생물학적 가용능.
크림 제형들이 이소플루란 마취(isoflurane anesthesia) 하에 마우스의 등 피부에 대해 적용되었다. 동물을 안락사시킨 후에, 피부가 스카치 테이프 (SCOTCH TAPE)를 사용하여 테이프-스트립핑되었고 각질층을 제거하였다. 피부 (각질층 및 표피/진피) 및 혈액에서의 레티놀의 양이 방사 화학적 분석법에 의한 3H 레티놀을 사용하여 측정되었다. 도 53에서 보여지는 바와 같이, 마이셀 캡슐화된 레티놀은 혈액 내로 어떠한 시스템적인 흡수 없이 피부 내에 보유되었다. 값들은 평균 ± SD이다 (n =3).
실시예 7. 카세인 마이셀
카세인은 적당한 조건 하에서 마이셀을 형성할 수 있는 우유 단백질이다. 어떤 연구에서 카세인 마이셀의 전달 운반체로서의 용도를 기재하고 있기는 하나, 카세인 마이셀이 피부 적용을 위한 전달 물질로서 사용되고 있지는 않다. 카세인은 PEG-자인과 결합하여 신규한 혼합된 마이셀을 형성할 수 있다.
레티놀 로드된 β-카세인 마이셀을 제조하기 위한 일반적인 과정들은 하기와 같다. β-카세인 (20 mg) 및 레티놀 (600 μL의 에탄올 내 0.1 mg) 이 10 mL의 0.1 M PBS pH 7.0 에 용해되었다. 상기 혼합물은 약 37 ℃에서 하룻 밤 동안 인큐베이트 될 수 있고, 이어서 ~100 ℃에서 100 mTorr 진공 하에 동결 건조 (예를 들면, 약 24 시간 동안) 될 수 있다. 결과로서 얻어지는 마이셀 파우더는 약 2-8 ℃에서 연장된 시간의 기간 동안 데시케이터 내에 저장된다. 하기의 표 13은 레티놀 로드된 β-카세인 마이셀의 여러가지 특성들을 나타낸 것이다. 레티놀 로드된 β-카세인 마이셀의 제조를 위해서, 레티놀 농도는 약 0.005 부터 약 0.05 % w/w의 범위에 이를 수 있다. β-카세인 농도는 약 0.15-0.25 % w/v 로 부터의 범위였다.
레티놀 로드된 β- 카세인 마이셀의 여러 가지 특성들
셈플 번호 레티놀
(% w/w) 		BHT (% w/w) 입자 크기 ( nm ) PDI 캡슐화 효율 (%)
1 0.005 -- 207.4 0.656 9.74
2 0.015 -- 109.1 0.616 10.28
3 0.005 0.005 76.9 0.626 10.25
4 0.015 0.015 68.9 0.510 11.06
카세인은 또한 마이셀을 포함하는 닐 레드 (도 54를 참조하라) 를 제조하는데 있어서 사용될 수 있다. 표 14는 그러한 마이셀의 특성들을 제공한다.
샘플 이름 입자 크기
(nm) 		PI 캡슐화 효율 (%)
닐 레드-카세인 마이셀 245 ±15 nm 0.38 ±0.41 78 ±5%
도 55에서 보여지는 바와 같이, 카세인 마이셀 내로의 닐 레드의 캡슐화는 닐 레드의 피부 침투성을 현저하게 증가시켰다. 절개된 돼지 피부는 수직의 디퓨젼 셀의 두 구획 사이에 샌드위치 되었다. 포스페이트 버퍼 (pH 7.4) 로 이루어진 수용체 매개가 37 ℃로 유지되었으며 또한 마그네틱 비드를 사용하여 교반되었다. 자유 또는 캡슐화된 닐 레드는 6 시간 동안 피부 상에 적용되었다. 실험의 종결 시점에서, 상기 피부는 세척되었으며 또한 공초점 형광 현미경 (confocal fluorescence microscope) 하에서 관찰되었다. SC (0-15 ㎛) 및 눈으로 보이는 표피 (20-100 ㎛) 에서의 형광도가 IMAGEJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 각 값은 평균 ± SD 였다 (n=4). p < 0.05 에서의 현저한 차이.
실시예 8 약제학적 용량 형태
하기의 제형들은 여기 기재된 마이셀 제형의 치료용으로서 또는 화장용으로서 투여를 위해 사용될 수 있는 대표적인 약제학적 용량 형태들을 보여주며, 그것은 수성의 분산물 또는 동결 건조된 파우더일 수 있다 (이후로 "조성물 X" 로 표시되는).
Figure 112013087000250-pct00015

이러한 제형들은 약제학 기술 분야에서 잘 알려져있는 통상적인 과정을 통하여 제조될 수 있다. 상기 약제학적 조성물들은 활성 성분 '조성물 X'의 양 및 유형을 다르게 제공하기 위하여 잘 알려져 있는 약제학적 기술에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 에어로졸 제형 (vi)는 표준의, 미터화된 용량의 에어로졸 디스펜서와 함께 사용될 수 있을 것이다. 부가적으로, 구체적인 성분들 및 조성들은 예시적인 목적을 위한 것이다. 관심의 용량 형태에 대한 바람직한 특성에 따라, 성분들은 적합한 등가물로 대체될 수 있고 및 조성이 달라질 수 있다.
구체적인 실시예들이 위에서 개시된 실시예 및 예들을 참조로 하여 기재되었지만, 한편 그러한 실시예들은 단지 본 발명에 대한 예시적인 것이며 또한 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 변화 및 변형이 본 기술 분야에서 통상적인 기술에 따라 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 그것의 더욱 넓은 관점에서 하기의 청구항들에서 정의된 바에 따라 이루어질 수 있다.
모든 공개물들, 특허들, 및 특허 문서들은 개별적으로 참조로서 포함되는 것처럼 여기에 참조로서 포함된다. 본 발명은 다양한 구체적인 및 바람직한 실시예들 및 기술들을 참조로 하여 기재되었다. 그러나, 많은 변형 및 수정이 본 발명의 스피릿 및 범위 내에서 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명이 상기 예들을 참조로 하여 기재되었음에도 불구하고 수정 및 변형이 본 발명의 스피릿 및 범위 내에 포함된다는 것이 이해될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 하기의 청구항들에 의해서만 제한된다.

Claims (35)

  1. 적어도 하나의 친수성 모이어티 (hydrophilic moiety)에 대하여 공유 결합적으로 컨쥬게이트 되어 있는 적어도 하나의 소수성 모이어티 (hydrophobic moiety) 을 함유하는 친양쪽성 (amphiphilic) 코폴리머를 포함하는 안정한 마이셀로서,
    상기 친수성 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol (PEG))이며,
    상기 소수성 모이어티는 자인(zein) 단백질이고,
    상기 친양쪽성 코폴리머의 물에서의 임계적 마이셀 농도 (critical micelle concentration (CMC))는 0.015 g/L 내지 0.035 g/L이며,
    상기 안정한 마이셀은 생분해성 친수성 쉘-소수성 코어 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  2. 제 1 항에서,
    상기 안정한 마이셀은 상기 친양쪽성 코폴리머를 포함하는 필름의 수화 (hydration)로부터 형성되거나 또는 상기 안정한 마이셀은 친양쪽성 코폴리머를 포함하는 투석물 (dialysate)로부터 형성되며, 그리고 상기 친양쪽성 코폴리머는 블록 코폴리머 또는 그래프트 코폴리머인 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  3. 제 1 항에서,
    상기 자인 단백질의 표면 아미노 그룹 중 적어도 50%는 PEG화 되어 있는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  4. 제 3 항에서,
    상기 PEG는 적어도 3,000 Da의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  5. 제 4 항에서,
    상기 안정한 마이셀의 다분산 지수 (polydispersity index (PDI))는, PEG의 분자량이 2000 Da을 초과할 때에, 0.5 보다 작은 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  6. 제 3 항에서,
    PEG의 분자량은 1 kDa 내지 220 kDa인 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  7. 제 3 항에서,
    상기 마이셀의 입자 크기는 10 nm 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  8. 제 1 항에서,
    하나 이상의 카고 분자 (cargo molecules)를 더 포함하고, 상기 하나 이상의 카고 분자는 소수성 코어 내에 캡슐화되거나 (encapsulated), 소수성 모이어티에 대해 공유 결합적으로 또는 비-공유 결합적으로 복합체화되거나 (complexed), 상기 친수성 모이어티에 대해 공유 결합적으로 또는 비-공유 결합적으로 복합체화되거나 (complexed), 또는 이들의 조합이며,
    상기 하나 이상의 카고 분자는 약물 (drug), 이미징 물질 (imaging agent) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고,
    상기 약물은 커큐민(curcumin), 독소루비신(doxorubicin) 또는 레티노이드 (retinoid)이며, 상기 레티노이드는 레티놀(retinol)이고,
    상기 이미징 물질은 닐 레드(Nile red)인 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  9. 삭제
  10. 제 8 항에서,
    상기 약물은 1 내지 7의 Log P를 가지는 소수성 약물인 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  11. 제 8 항에서,
    상기 안정한 마이셀을 통하여 전달되는 약물은 상기 안정한 마이셀의 부재 하에서 전달되는 약물과 비교할 때 낮은 독성 및 향상된 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 8 항에서,
    부틸레이트 하이드록시톨루엔 (butylated hydroxyltoluene (BHT)), 카세인 (casein), 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 프롤아민 단백질 (prolamine protein) 및 모노알킬레이트화된 폴리에틸렌 글리콜 (monoalkylated polyethylene glycol (mPEG))을 하이드로알콜성 용매 (hydroalcoholic solvent)에 용해하여 제 1 혼합물을 형성하는 단계;
    제 1 혼합물을 가열하여 수성의 현탁물 내에 공유 결합적으로 컨쥬게이트되어 있는 PEG화된 프롤아민을 형성하는 단계 및 선택적으로 상기 수성의 현탁물 내의 PEG의 과량의 반응성 그룹을 소화시키는 (quenching) 단계;
    제 1 혼합물에 버퍼를 첨가하여 하이드로알콜성 용매로부터 PEG화된 프롤아민을 침전시키고, 수용액에 대하여 상기 PEG화된 프롤아민을 투석하는 단계;
    결과물로 얻은 투석물 (dialysate)을 동결 건조하는 단계;
    상기 동결 건조된 PEG화된-프롤아민을 하이드로알콜성 용매에 용해하여 제 2 혼합물을 형성하는 단계; 및
    하기의 단계 중 어느 하나를 수행하는 단계:
    (a) 수성의 버퍼에 대하여 제 2 혼합물을 투석하여 안정한 마이셀을 형성하는 단계, 또는
    (b) 제 2 혼합물을 증발시켜 건조 필름을 형성하고, 상기 필름을 수성의 버퍼로 수화시키고, 상기 수화된 필름을 초음파 처리하여 안정한 마이셀을 형성하는 단계
    를 포함하는 안정한 마이셀을 제조하는 방법으로서,
    상기 프롤아민 단백질은 자인(zein) 단백질이고,
    상기 PEG화된 프롤아민의 물 중의 임계적 마이셀 농도 (CMC)는 0.015 g/L 내지 0.035 g/L인 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀을 제조하는 방법.
  20. 제 19 항에서,
    건조된 파우더를 형성하기 위하여 상기 안정한 마이셀을 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀을 제조하는 방법.
  21. 제 19 항에서,
    하나 이상의 카고 분자로 로드된 복수의 안정한 마이셀 형성의 결과를 가져오도록, 용매 시스템에 용해되어 있는 하나 이상의 카고 분자를 상기 제 1 혼합물에 첨가하는 단계를 더 포함하고,
    상기 하나 이상의 카고 분자는 소수성 코어 내에 캡슐화되거나 (encapsulated), 소수성 모이어티에 대해 공유 결합적으로 또는 비-공유 결합적으로 복합체화되거나 (complexed), 친수성 모이어티에 대해 공유 결합적으로 또는 비-공유 결합적으로 복합체화되거나 (complexed), 또는 이들의 조합이며, 그리고 상기 복수의 안정한 마이셀은 거기에 함유되어 있는 하나 이상의 카고 분자의 특성을 향상시키는 것이고, 상기 특성은 상기 복수의 안정한 마이셀의 부재 하에서 상기 하나 이상의 카고 분자의 특성과 비교할 때, 하나 이상의 카고 분자의 수 용해도를 향상시키는 것, 하나 이상의 카고 분자의 화학적 안정성을 향상시키는 것, 하나 이상의 카고 분자의 약물 효능 (drug efficacy)을 향상시키는 것, 하나 이상의 카고 분자의 제품 수명 (shelf life)을 향상시키는 것, 하나 이상의 카고 분자의 종양 축적 (tumor accumulation)을 향상시키는 것, 하나 이상의 카고 분자의 피부 침투성 (skin penetration)을 향상시키는 것, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀을 제조하는 방법.
  22. 제 19 항에서,
    상기 안정한 마이셀의 캡슐화 효율 (encapsulation efficiency)은 60 % 내지 95 %인 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀을 제조하는 방법.
  23. 제 19 항에서,
    상기 PEG는 적어도 3,000 Da의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 안정한 마이셀을 제조하는 방법.
  24. 삭제
  25. 제 8 항, 제 10항, 제 11 항 및 제 16 항 중 어느 한 항의 안정한 마이셀을 포함하는, P-글리코단백질 (P-glycoprotein (P-gp))-의존적인 다중 약물 저항성 (multidrug resistant (MDR)) 유형의 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 암은 유방암 또는 난소암인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  26. 제 25 항에서,
    상기 안정한 마이셀은 그 소수성 코어 내에 치료용 물질을 더 포함하며, 상기 안정한 마이셀은 안정한 마이셀의 부재 하에서의 상기 치료용 물질의 섭취와 비교할 때 상기 치료용 물질의 MDR 유형의 암세포로의 섭취를 향상시키는 것을 특징으로 하는 MDR 유형의 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  27. 제 26 항에서,
    상기 치료용 물질은 1 시간 내지 14일의 기간에 걸쳐 상기 안정한 마이셀로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 MDR 유형의 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  28. 제 25 항에서,
    상기 약제학적 조성물은 비-면역성인 것을 특징으로 하는 MDR 유형의 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  29. 삭제
  30. 삭제
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  34. 삭제
  35. 삭제
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