WO2015178454A1 - 皮膚外用剤及び皮膚刺激低減剤 - Google Patents

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skin
drug
external preparation
block chain
molecular assembly
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PCT/JP2015/064622
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鈴木　健一
陽貴 中川
佳央 山北
英一 小関
隆志 川辺
恵利 松谷
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株式会社島津製作所
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    • C08G2230/00—Compositions for preparing biodegradable polymers

Definitions

  • the present invention relates to an external preparation for skin. Furthermore, this invention relates to the skin irritation reducing agent which can reduce skin irritation
  • Patent Document 1 discloses that a hydrophilic polypeptide chain having 10 or more sarcosine units and 5 or more amino acid units or hydroxyl acid units are essential as a drug delivery system and a molecular imaging probe directly administered intravenously.
  • An amphiphilic block polymer having a hydrophobic molecular chain contained as a unit is described.
  • Patent Document 2 discloses a parent having a hydrophilic block chain having 20 or more sarcosine units and a hydrophobic block chain having 10 or more lactic acid units as a molecular imaging probe directly administered intravenously. There is described a molecular assembly composed of two types of polymers, namely a medium block polymer and a labeled polymer having at least 10 lactic acid units and a labeling group.
  • Patent Document 3 for the purpose of enhancing the activity of the physiologically active ingredient in the skin, a percutaneous absorption external preparation (Patent Document 3) in which the physiologically active ingredient is encapsulated in nanoparticles of polymethyl methacrylate (PMMA) has been proposed.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • the external preparation described in Patent Document 3 is not a biodegradable polymer material
  • PMMA is not a biodegradable polymer material.
  • PMMA may be adversely affected by residue in the skin when used repeatedly for a long period of time as a pharmaceutical or cosmetic. Also, it may be difficult to encapsulate the drug when the particle size is reduced. Since the external preparation described in Patent Document 4 contains a very small amount of tranexamic acid that can be encapsulated in PLGA nanoparticles, administration of a large amount of preparation is necessary for delivery deeper than the skin layer (dermis). In addition, when the drug to be used is accompanied by skin irritation, there is a concern that a drug that could not be encapsulated in the drug carrier may adversely affect the skin.
  • JP 2008-024816 A International Publication No. 2009/148121 JP 2002-308728 A JP 2010-180145 A
  • the problem to be solved by the present invention is that even if a drug that has a strong skin irritation is difficult to administer transdermally, the irritation of the drug to the skin is reduced, and the safety is high and excellent. It is providing the skin external preparation which has a pharmacological effect.
  • the combination of a nanometer-sized molecular assembly containing a specific amphiphilic block copolymer and a drug can cause transdermal administration with strong irritation to the skin.
  • the present inventors have found that an external preparation for skin having a high safety and an excellent pharmacological effect can be obtained even if a difficult drug is contained, the irritation to the skin of the drug is reduced, and the present invention has been completed.
  • the present invention comprises a drug and a nanometer-sized molecular assembly, wherein the molecular assembly has a hydrophilic block chain having a structural unit derived from sarcosine and a hydrophobic block having a structural unit derived from a hydroxy acid
  • An external preparation for skin comprising an amphiphilic block copolymer having a chain (hereinafter also simply referred to as an amphiphilic block copolymer) is provided.
  • the present invention is a skin irritation reducing agent used for reducing skin irritation caused by a drug in a skin-containing external preparation containing a drug, and is used for forming a nanometer-sized molecular assembly.
  • a skin irritation reducing agent comprising an amphiphilic block copolymer having a hydrophilic block chain having a structural unit derived from sarcosine and a hydrophobic block chain having a structural unit derived from hydroxy acid is provided.
  • the skin external preparation of the present invention contains a drug that is highly irritating to the skin and difficult to be transdermally administered, the irritation to the skin of the drug is reduced, and the safety is high, and an excellent pharmacological effect.
  • the skin external preparation of this invention has high skin permeability.
  • the skin external preparation of the present invention contains a drug and a nanometer-sized molecular assembly, and the molecular assembly has a hydrophilic block chain having a structural unit derived from sarcosine and a hydrophobic unit having a structural unit derived from a hydroxy acid. And an amphiphilic block copolymer having a functional block chain.
  • the hydrophilic block chain contained in the amphiphilic block copolymer has a structural unit derived from sarcosine.
  • the structural unit improves the hydrophilicity and flexibility of the hydrophilic block chain.
  • all the structural units derived from sarcosine in the hydrophilic block chain may be continuous or discontinuous.
  • the “hydrophilic block chain” is relatively more hydrophilic than the hydrophobic block chain contained in the amphiphilic block copolymer, and the amphiphilic block copolymer is self-reacting in a solvent. It has a hydrophilic property that enables it to form a self-assembly (preferably a particulate self-assembly).
  • the hydrophilic block chain is derived from sarcosine from the viewpoint of reducing skin irritation, skin permeability and pharmacological effects, and making it easy to control the molecular assembly to the shape and appropriate size of micelles and vesicles. Those having 20 or more structural units are preferred.
  • the number of such sarcosine-derived structural units is more preferably 30 or more, further preferably 40 or more, preferably 500 or less, more preferably 200 or less, still more preferably 150 or less, particularly Preferably it is 100 or less.
  • the structural unit derived from sarcosine is specifically represented by the following formula (1).
  • the content of the structural unit derived from sarcosine is preferably 50 to 100 mol%, more preferably 65 to 100 mol%, still more preferably 80 to 100 mol%, and more preferably 90 to 100 mol% in the hydrophilic block chain. Particularly preferred.
  • the hydrophilic block chain may contain a sugar chain or a polyether chain, but is preferably a polypeptide chain.
  • the structural unit other than the sarcosine-derived structural unit contained in the hydrophilic block chain include structural units derived from amino acids other than sarcosine (including hydrophilic amino acids and other amino acids).
  • the “amino acid” may be any of L-form, D-form, and DL-form, and includes natural amino acids, unnatural amino acids, and derivatives thereof by modification and / or chemical change, and ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -amino acids are also included.
  • hydrophilic amino acids are preferable. Specific examples include serine, threonine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.
  • the hydrophobic block chain contained in the amphiphilic block copolymer has a structural unit derived from a hydroxy acid. All of the structural units derived from the hydroxy acid in the hydrophobic block chain may be continuous or discontinuous.
  • the “hydrophobic block chain” is relatively more hydrophobic than the hydrophilic block chain contained in the amphiphilic block copolymer, and the amphiphilic block polymer is self-reacting in a solvent. It has a hydrophobic property that enables it to form a self-assembly (preferably a particulate self-assembly).
  • Hydrophobic block chains include hydroxy acid from the viewpoints of reducing skin irritation, skin permeability and pharmacological effects, and making it easy to control molecular aggregates in the shape and appropriate size of micelles and vesicles. Those having 10 or more structural units derived from are preferred. The number of structural units derived from such a hydroxy acid is more preferably 15 or more, still more preferably 20 or more, preferably 100 or less, more preferably 80 or less, still more preferably 60 or less, Particularly preferred is 50 or less.
  • an aliphatic hydroxy acid is preferable.
  • the aliphatic hydroxy acid include lactic acid, glycolic acid, hydroxyisobutyric acid and the like, and one of these may be used alone or in combination of two or more.
  • lactic acid is particularly preferable from the viewpoint of improving solubility in a low-boiling solvent, biocompatibility, and stability.
  • the lactic acid may be any of L-lactic acid, D-lactic acid, and DL-lactic acid, and the hydrophobic block chain may be composed of one or more of them.
  • R1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R2 represents a single bond or a methylene group.
  • the combination of R1 and R2 is preferably a combination in which R1 is a hydrogen atom or a methyl group, R2 is a single bond, R1 is a methyl group, and R2 is a methylene group. From the viewpoint of improving solubility in a boiling solvent, biocompatibility and stability, a combination in which R1 is a methyl group and R2 is a single bond is particularly preferable.
  • the content of the structural unit derived from the hydroxy acid is preferably 50 to 100 mol%, more preferably 65 to 100 mol%, still more preferably 80 to 100 mol%, and more preferably 90 to 100 mol% in the hydrophobic block chain. Is particularly preferred.
  • Examples of the structural unit other than the structural unit derived from hydroxy acid contained in the hydrophobic block chain include structural units derived from amino acids (including hydrophobic amino acids and other amino acids). Many of the hydrophobic amino acids have an aliphatic side chain, an aromatic side chain, and the like. Examples of natural hydrophobic amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, and tryptophan. Non-natural hydrophobic amino acid derivatives include glutamic acid methyl ester, glutamic acid benzyl ester, aspartic acid methyl ester, aspartic acid ethyl ester, aspartic acid benzyl ester and the like.
  • the content ratio of the hydrophilic block chain and the hydrophobic block chain includes reduced skin irritation, skin permeability, and pharmacology.
  • the ratio of the number of structural units is preferably 10: 1 to 1: 1, more preferably 6: 1 to 1.5: 1, and particularly preferably 5: 1 to 1.6: 1.
  • amphiphilic block copolymer used in the present invention includes one represented by the following formula (3).
  • R 3 represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • m represents an integer of 20 to 200
  • n represents an integer of 10 to 100
  • R 1 and R 2 represent It is synonymous with the above.
  • the divalent hydrocarbon group represented by R3 is preferably an alkylene group.
  • the alkylene group may be linear or branched. Specific examples of the alkylene group include methylene group, ethylene group, trimethylene group, propylene group (propane-1,2-diyl group), tetramethylene group, pentamethylene group, hexamethylene group and the like.
  • the divalent hydrocarbon group preferably has 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 or 3, and still more preferably 2.
  • n represents an integer of 20 to 200, preferably an integer of 30 to 150, and more preferably an integer of 40 to 100.
  • n represents an integer of 10 to 100, preferably an integer of 15 to 80, more preferably an integer of 20 to 60, and particularly preferably an integer of 20 to 50.
  • the n R1s may be the same or different, and the n R2s may be the same or different.
  • the number average molecular weight (Mn) of the amphiphilic block copolymer used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 3,000 to 14,000, and more preferably 3,000 to 9,000.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the amphiphilic block copolymer is not particularly limited, but is preferably 3,000 to 14,000, more preferably 3,000 to 9,000.
  • the molecular weight distribution (Mw / Mn) of the amphiphilic block copolymer is preferably 1.5 or less.
  • the content of each structural unit may be measured by 13 C-NMR, 1 H-NMR, or the like.
  • the molecular assembly used in the present invention may contain a hydrophobic polymer in addition to the amphiphilic block copolymer.
  • hydrophobic polymer (hereinafter also simply referred to as hydrophobic polymer), from the viewpoint of biocompatibility, stability, biodegradability, and solubility in a low-boiling solvent, a structural unit derived from a hydroxy acid is used. Hydrophobic polymers having are preferred.
  • the number of structural units derived from the hydroxy acid includes the viewpoint of affinity with the amphiphilic block polymer and the shape of the molecular assembly as a micelle or vesicle, From the viewpoint of facilitating control to an appropriate size, preferably 10 or more, more preferably 15 or more, further preferably 20 or more, preferably 200 or less, more preferably 160 or less, Preferably it is 100 or less.
  • the number is preferably not more than twice the number of structural units contained in the hydrophobic block chain in the amphiphilic block polymer.
  • an aliphatic hydroxy acid is preferable.
  • the aliphatic hydroxy acid include lactic acid, glycolic acid, hydroxyisobutyric acid and the like, and one of these may be used alone or in combination of two or more.
  • lactic acid is particularly preferable from the viewpoint of improving solubility in a low-boiling solvent, biocompatibility, and stability.
  • the lactic acid may be any of L-lactic acid, D-lactic acid, and DL-lactic acid, and the hydrophobic polymer may be composed of one or more of them.
  • lactic acids from the viewpoint of facilitating control of the average particle diameter and stability, when the hydrophobic block chain in the amphiphilic block polymer contains a structural unit derived from L-lactic acid, L-lactic acid is used.
  • D-lactic acid is preferred when the hydrophobic block chain in the amphiphilic block polymer contains a structural unit derived from D-lactic acid.
  • the content of the structural unit is preferably 50 to 100 mol%, more preferably 65 to 100 mol%, more preferably 80 to 100 mol% in the hydrophobic polymer. More preferred is mol%, and particularly preferred is 90 to 100 mol%.
  • the hydrophobic polymer may contain a structural unit derived from the hydrophobic amino acid.
  • the number average molecular weight (Mn) of the hydrophobic polymer is not particularly limited, but is preferably 700 to 6,000, more preferably 1,000 to 4,000.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the hydrophobic polymer is not particularly limited, but is preferably 700 to 6,000, more preferably 1,000 to 4,000.
  • the molecular weight distribution (Mw / Mn) of the hydrophobic polymer is preferably 1.5 or less.
  • the molar ratio of the content of the amphiphilic block copolymer and the hydrophobic polymer [(A-1) :( A-2)] indicates the volume of the hydrophobic core part of the molecular assembly and the molecular assembly. From the viewpoint of easily controlling the size of the body, the ratio is preferably 10: 1 to 1:10.
  • the drug contained in the external preparation for skin of the present invention is not particularly limited.
  • the topical skin preparation of the present invention is a combination of a drug containing a molecular assembly containing the amphiphilic block copolymer and a drug that reduces irritation to the skin. Even if it exists, it can be safely administered transdermally. Therefore, specifically, a drug reported to cause contact dermatitis can be preferably used as the drug. These drugs can be used alone or in combination of two or more.
  • statins examples include mevastatin, simvastatin, fluvastatin, lovastatin, atorvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, pravastatin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • pharmaceutically acceptable salt examples include alkali metal salts such as sodium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts; ammonium salts; alkylammonium salts. Since the external preparation for skin of the present invention has high skin permeability and easily migrates to blood or the like, the pharmacological action provided by statins can be sufficiently exerted.
  • a fat-soluble statin and a pharmaceutically acceptable salt thereof are preferable.
  • the fat-soluble statins include mevastatin, simvastatin, fluvastatin, lovastatin, atorvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • drugs reported to cause contact dermatitis include, for example, fradiomycin sulfate, gentamicin, kanamycin, oxytetracycline hydrochloride, clindamycin phosphate, polymyxin B sulfate, bacitracin, erythromycin, chloramphenicol, fusidin Antibiotics such as sodium acid and silver sulfadiazine; Antifungal agents such as clotrimazole, neticonazole hydrochloride, luliconazole, sulconazole nitrate, bifonazole, ranoconazole, amorolfine hydrochloride, terbinafine hydrochloride, butenafine hydrochloride, tolnaftate; Non-steroidal anti-inflammatory drugs such as acetylsalicylic acid, bufexamac, ibuprofen, ibuprofen piconol, ufenamate, diclofenac sodium
  • Steroidal anti-inflammatory drugs Eye drops such as phenylephrine hydrochloride, pivalephrine hydrochloride, atropine sulfate, ketotifen fumarate, sodium cromoglycate, amlexanox, tobramycin, dibekacin sulfate, sisomycin sulfate, timolol maleate, nipradilol, befnolol hydrochloride, levocabastine hydrochloride; Antiulcer drugs such as lysozyme chloride and trafermin; Alzheimer's disease treatments such as donepezil hydrochloride, memantine hydrochloride, rivastigmine, rivastigmine tartrate, galantamine hydrobromide; Anticonvulsants such as chloramphenicol, carbamazepine, phenobarbital, phenytoin, etizolam, nitrazepam, idebenone, mians
  • Alzheimer type dementia treatment drugs and frequent urination drugs are preferable.
  • the skin external preparation of the present invention contains a nanometer-sized molecular assembly containing the amphiphilic block copolymer and the drug.
  • the dosage form of the external preparation for skin of the present invention is not particularly limited, but is an external solution, lotion, tonic, liniment, emulsion, gel, ointment, cream, plaster, plaster, poultice, pap. Agent, plaster agent, tape agent, reservoir patch, spray agent, aerosol agent, foam agent, lotion, pack agent and the like.
  • the topical skin preparation includes a drug and a molecular assembly means that the drug and the molecular assembly exist in the topical skin preparation, and includes the amphiphilic block copolymer and, if necessary, the hydrophobic polymer.
  • the drug may be contained in the polymer nanoparticles of the molecular assembly.
  • the “containing” is a concept including inclusion and support. When the molecular assembly contains a drug, the molecular assembly itself has both an action as a drug and an action as a skin irritation reducing agent.
  • the form in which the molecular assembly contains the drug is a molecular assembly.
  • region containing a drug is mentioned. In these forms, the molecular assembly acts as a skin irritation reducing agent.
  • the external preparation for skin includes a molecular assembly-containing region and a drug-containing region
  • the molecular assembly is provided on the skin application surface side on the drug-containing layer.
  • a thing provided with a body content layer is mentioned.
  • Such a skin patch external preparation comprises, on a base material, a drug-containing layer as a drug-containing region and a molecular assembly-containing layer as a molecular assembly-containing region for reducing skin irritation in this order. .
  • the molecular assembly When the molecular assembly is used as a skin irritation reducing agent, after the molecular assembly is brought into contact with the epidermis by application or the like, the drug is applied from above to obtain a skin irritation reducing effect.
  • the content of the drug is, for example, about 0.0001 to 50% by mass with respect to the total amount of the external preparation for skin.
  • the content of the drug is preferably 0.001 to 30% by mass, more preferably 0.01 to 15% by mass with respect to the total amount of the external preparation for skin.
  • 0.05 to 10% by mass is more preferable, and 0.1 to 5% by mass is more preferable.
  • the content is more preferably 0.15 to 2.5% by mass, further preferably 0.2 to 1.5% by mass, and particularly preferably 0.3 to 1% by mass.
  • the content of the amphiphilic block copolymer is, for example, about 0.0001 to 50% by mass, preferably 0.001 to 30% by mass, more preferably 0.01 to 20% by mass, based on the total amount of the external preparation for skin. Particularly preferred is 0.1 to 10% by mass.
  • the molar ratio [(A-1) :( B)] of the content of the amphiphilic block copolymer and the drug in the external preparation for skin is preferably 1: 1000 to 1000: 1, more preferably 1: 100 to 100: 1, more preferably 1: 100 to 1: 1, and particularly preferably 1:50 to 1: 1.
  • the molecular assembly used in the present invention is a structure formed by aggregation of the amphiphilic block copolymer or by self-assembled orientational association.
  • the shape of the molecular assembly may be any of particles (micelle, vesicle, etc.), rod, and other molecular aggregates. From the viewpoint of reducing skin irritation, skin permeability, and pharmacological effects, Particulate form is preferred, micelle form and vesicle form are more preferred, and micelle form is particularly preferred.
  • the molecular assembly used in the present invention preferably has an average particle size of 10 to 300 nm, and an average particle size of 10 to 200 nm, from the viewpoints of reducing skin irritation, skin permeability, and pharmacological effects.
  • the average particle size is more preferably 10 to 150 nm, the average particle size is more preferably 10 to 100 nm, the average particle size is further preferably 15 to 60 nm, and the average particle size is A thickness of 20 to 45 nm is particularly preferable.
  • an average particle diameter shall say the value measured by the method as described in the Example mentioned later.
  • the external preparation for skin and the skin irritation reducing agent of the present invention can be produced by blending a molecular assembly obtained as follows according to a conventional method.
  • a molecular assembly can be obtained by a film method or an injection method using an amphiphilic block copolymer that can be synthesized by a known method combining peptide synthesis method, polyester synthesis method, and depsipeptide synthesis method as appropriate, and a hydrophobic polymer as necessary. Can be made.
  • a drug is used to obtain a molecular assembly containing the drug.
  • the amphiphilic block copolymer before forming a molecular assembly, and the hydrophobic polymer used as needed can also be provided as a skin irritation reducing agent.
  • the molecular assembly which can be used as a skin external preparation is obtained by producing a molecular assembly using the amphiphilic block copolymer as a skin irritation reducing agent and a drug.
  • the film method is a method generally used for preparing liposomes, and includes the following steps (1) to (3).
  • Step (1) A step of dissolving an amphiphilic block copolymer, a drug, and optionally a hydrophobic polymer in an organic solvent in a container (eg, a glass container);
  • Step (2) removing the organic solvent from the solution to obtain a film containing an amphiphilic block copolymer and optionally a hydrophobic polymer and / or a drug on the inner wall of the container;
  • Step (3) A step of adding water or an aqueous solution to the container to convert the film into a particulate molecular aggregate to obtain a molecular aggregate dispersion.
  • the film method may include a step of subjecting the dispersion of the molecular assembly to a lyophilization treatment.
  • ultrasonic treatment and heat treatment of the aqueous solution may be performed as necessary.
  • a solution containing an amphiphilic block copolymer and, optionally, a hydrophobic polymer and / or a drug in an organic solvent is appropriately prepared by those skilled in the art.
  • it may be prepared by mixing all of the polymer and drug to be used at once, or a part of the polymer and drug to be used is previously prepared in a film state, and then, It may be prepared by adding a solution containing other components.
  • a method of forming a part of the polymer film prepared in advance can be performed according to the method described later.
  • the organic solvent used in the film method is not particularly limited as long as the amphiphilic block copolymer, drug and hydrophobic polymer to be used are dissolved, but it is preferable to use a low boiling point solvent because it is distilled off after dissolution.
  • the low boiling point solvent in the present invention means a solvent having a boiling point at 1 atm of 100 ° C. or less, preferably 90 ° C. or less. Specific examples include chloroform, diethyl ether, acetonitrile, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetone, dichloromethane, tetrahydrofuran, hexane, and ethyl acetate.
  • the use of such low boiling solvents for the dissolution of amphiphilic block copolymers and possibly hydrophobic polymers and / or drugs makes the removal of the solvent very simple.
  • the method for removing the solvent is not particularly limited, and may be appropriately determined by those skilled in the art according to the boiling point of the organic solvent to be used.
  • the solvent may be removed under reduced pressure, or the solvent may be removed by natural drying.
  • a film containing an amphiphilic block copolymer and, optionally, a hydrophobic polymer and / or a drug is formed on the inner wall of the container.
  • Water or an aqueous solution is added to the container to which the film is attached.
  • the water or aqueous solution is not particularly limited, and those skilled in the art may appropriately select a biochemically and pharmaceutically acceptable one. Examples thereof include distilled water for injection, physiological saline, and buffer solution.
  • the film After adding water or an aqueous solution, the film is peeled off from the inner wall of the container by performing heating treatment and / or ultrasonic treatment as necessary, and a molecular assembly is formed in the process.
  • the ultrasonic treatment can be performed, for example, under conditions of 1 to 60 minutes.
  • the heating treatment can be performed under conditions of 20 to 95 ° C., for example.
  • the ultrasonic process may be performed under conditions of 20 to 95 ° C. and 1 to 60 minutes, for example.
  • a dispersion liquid in which the molecular assembly is dispersed in the water or aqueous solution is prepared in the container.
  • the injection method is not limited to the molecular assembly of the present invention, and is a method used for preparing many other molecular assemblies.
  • an amphiphilic block copolymer, and optionally a hydrophobic polymer and / or drug are dissolved in an organic solvent such as trifluoroethanol, ethanol, hexafluoroisopropanol, dimethyl sulfoxide, etc., and the resulting solution is dissolved.
  • aqueous solvent such as distilled water for injection, physiological saline, buffer, etc.
  • purification treatment such as gel filtration chromatography, filtering, ultracentrifugation, etc.
  • a substance to be encapsulated is dissolved or suspended in an aqueous solvent such as distilled water for injection, physiological saline, or buffer solution.
  • an aqueous solvent such as distilled water for injection, physiological saline, or buffer solution.
  • a solution obtained by dissolving the amphiphilic block copolymer and, in some cases, the hydrophobic polymer and / or the drug in the organic solvent may be dispersed in the aqueous solution or suspension thus obtained.
  • a hydrophobic drug is preferably used from the viewpoint that the drug is easily contained or carried and the skin irritation is reduced.
  • the drug is likely to be encapsulated or carried in the hydrophobic core portion of the amphiphilic block copolymer, and skin irritation is further reduced.
  • the molar ratio of the content of the amphiphilic block copolymer and the drug [(A-1) :( B)] is preferably 1: 1000 from the viewpoint of appearance stability such as particle coarsening and leakage drug aggregation. ⁇ 1000: 1, more preferably 1: 100 to 100: 1, even more preferably 1: 100 to 1: 1, and particularly preferably 1:50 to 1: 1.
  • the external preparation for skin of the present invention includes a moisturizer, a softener, a transdermal absorption enhancer, a soothing agent, an antiseptic, an antioxidant, a colorant, a thickener, a fragrance, A pH adjusting agent or the like may be included. These may contain 1 type individually or in combination of 2 or more types.
  • humectant examples include, for example, agar, diglycerin, distearyldimonium hectorite, butylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, hexylene glycol, yokinein extract, petrolatum, urea, hyaluronic acid, tranexamic acid, ceramide, lipid, Isoflavone, amino acid, collagen, mucopolysaccharide, fucoidan, lactoferrin, sorbitol, chitin / chitosan, malic acid, glucuronic acid, placenta extract, seaweed extract, button pipi extract, amacha extract, hypericum extract, coleus extract, masaki extract, koka extract, maikai Flower extract, Chorei extract, Hawthorn extract, Rosemary extract, Duke extract, Chamomile extract, Odorikosou extract, Ganoderma essence Girisouekisu, aloe extract, horse chest
  • softener examples include glycerin, mineral oil, emollient components (for example, isopropyl isostearate, polyglyceryl isostearate, isotridecyl isononanoate, octyl isononanoate, oleic acid, glyceryl oleate, cocoa butter, cholesterol, mixed fatty acid triglyceride, Dioctyl succinate, sucrose acetate stearate, cyclopentasiloxane, sucrose distearate, octyl palmitate, octyl hydroxystearate, aralkyl behenate, sucrose polybehenate, polymethylsilsesquioxane, myristyl alcohol, cetyl myristate, myristic acid Myristyl, hexyl laurate, etc.).
  • emollient components for example, isopropyl isostearate, polyglyceryl isost
  • transdermal absorption enhancer examples include ethanol, isopropyl myristate, citric acid, squalane, oleic acid, menthol, N-methyl-2-pyrrolidone, diethyl adipate, diisopropyl adipate, diethyl sebacate, diisopropyl sebacate.
  • Examples of the soothing agent include benzyl alcohol, procaine hydrochloride, xylocaine hydrochloride, chlorobutanol and the like.
  • preservatives examples include benzoic acid, sodium benzoate, paraben, ethyl paraben, methyl paraben, propyl paraben, butyl paraben, potassium sorbate, sodium sorbate, sorbic acid, sodium dehydroacetate, hydrogen peroxide, formic acid, formic acid.
  • examples include ethyl, sodium dichlorite, propionic acid, sodium propionate, calcium propionate, pectin degradation products, polylysine, phenol, isopropylmethylphenol, orthophenylphenol, phenoxyethanol, resorcin, thymol, thiram, and tea tree oil.
  • antioxidants examples include vitamin A, retinoic acid, retinol, retinol acetate, retinol palmitate, retinyl acetate, retinyl palmitate, tocopheryl retinoic acid, vitamin C and its derivatives, kinetin, ⁇ -carotene, astaxanthin , Lutein, lycopene, tretinoin, vitamin E, ⁇ -lipoic acid, coenzyme Q10, polyphenol, SOD, phytic acid and the like.
  • colorant examples include iron oxide, iron sesquioxide, yellow iron sesquioxide, titanium dioxide, kaolin, tar dye, and chlorophyll.
  • thickener examples include quince seed, carrageenan, gum arabic, caraya gum, xanthan gum, gellan gum, tamarind gum, locust bean gum, tragacanth gum, pectin, starch, cyclodextrin, methylcellulose, ethylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium alginate, polyvinyl Alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxy vinyl polymer, sodium polyacrylate, etc. are mentioned.
  • fragrance examples include musk, acacia oil, anise oil, ylang ylang oil, cinnamon oil, jasmine oil, sweet orange oil, spearmint oil, geranium oil, thyme oil, neroli oil, mint oil, hinoki oil, fennel oil, Peppermint oil, bergamot oil, lime oil, lavender oil, lemon oil, lemongrass oil, rose oil, rosewood oil, anisaldehyde, geraniol, citral, civeton, muscone, limonene, vanillin and the like.
  • Examples of the pH adjuster include citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, phosphoric acid, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, and succinate.
  • Examples include acids, sodium succinate, malic acid, sodium malate, hydrochloric acid and the like.
  • the external preparation for skin of the present invention is not limited as long as it is transdermally administered (including transmucosal administration), but it can be expected to have not only a local action but also a systemic action. It is useful as an external preparation for skin for preventing or treating systemic diseases such as systemic diseases and endocrine diseases. Moreover, the dosage and administration period of the external preparation for skin of the present invention can be appropriately set according to the type and amount of drug used, the weight of the patient, the state of the disease, and the like.
  • the skin external preparation of the present invention has reduced irritation to the skin of the drug, has high safety to the human body, easily penetrates the skin and moves to the body such as blood, and has excellent pharmacological effects.
  • it has excellent biodegradability and biocompatibility, and it can be expected that a medicinal effect is expressed in the body even in a small amount.
  • it can exert an excellent pharmacological effect, and it has a high risk of side effects such as skin irritation.
  • DMF Dimethylformamide
  • Example 1 Skin irritation reduction effect of pitavastatin calcium
  • pitavastatin calcium was used as a drug, and a test on an external preparation for skin containing a drug in an amphiphilic polymer micelle was performed.
  • Preparation Example 1-2 Preparation of polymer micelle containing pitavastatin calcium (60 nm)] 100 mg of PSar 65 -PLLA 30 obtained in Synthesis Example 1, 34 mg of poly-L-lactic acid (PLLA 30 -Z) Z-terminal (benzyloxycarbonylated) and 20 mg of pitavastatin calcium were dissolved in 10 mL of chloroform, and the rotary evaporator was used. The chloroform was distilled off under reduced pressure. After distillation under reduced pressure, 10 mL of purified water was added to the thin film formed in the container, and the container was immersed in an 85 ° C.
  • Test Example 1-1 Skin irritation test
  • a lint cloth cut into a 2.5 cm square was impregnated with 500 ⁇ L each of the following liquids ⁇ 1-A> to ⁇ 1-E> as test substances and protected with oil paper (hereinafter referred to as a preparation), and then applied to the back skin. Affixed.
  • the administration was closed, and after application of the preparation, it was covered with a medical adhesive sheet to prevent the lint cloth from slipping, and further wrapped with surgical tape and fixed, and the animal was equipped with an Elizabeth collar.
  • ⁇ 1-A> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension prepared such that the concentration of the pitavastatin calcium-containing polymer micelle obtained in Preparation Example 1-1 is 0.5% by mass in terms of pitavastatin calcium
  • ⁇ 1-B> Phosphate buffer solution (pH 7.4) solution containing pitavastatin calcium (0.5 mass%) and Macrogol 400 (9 mass%)
  • ⁇ 1-C> Pitavastatin calcium (0.5 mass) Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension containing 1%)
  • ⁇ 1-D> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension containing the polymer (2.5% by mass) obtained in Synthesis Example 1
  • Solution ⁇ 1-E> Phosphate buffer solution (pH 7.4)
  • Test Example 1-2 Skin permeation test (1)
  • the rat abdominal skin was removed after depilation and used as a permeable membrane.
  • the isolated skin was fixed to the horizontal transmission cell with the horny side of the extracted skin as the donor side.
  • the pitavastatin calcium-containing polymer micelles obtained in Preparation Examples 1-1 and 1-2, and pitavastatin calcium as a control were added to a phosphate buffer (pH 7.4) so that the concentration of pitavastatin calcium was 0.1% by mass. These were suspended and applied to the isolated rat skin as a donor solution.
  • the receptor solution was 2 mL of phosphate buffer (pH 7.4).
  • Test Example 1-4 Drug efficacy test
  • the day before the start of administration the back hair of the test animal (male guinea pig, Slc: Hartley, 7 weeks old) was shaved using an electric clipper and a shaver, and the hair was removed with a hair removal cream (Epirat, Kanebo).
  • the hair removal site of each test animal was covered with a sponge packing with tape (3.5 cm ⁇ 3.5 cm ⁇ 0.5 cm, manufactured by Ashiya Packing Mfg. Co., Ltd.) to prevent dripping, and 2.5 cm ⁇ 2.5 cm hollowed out inside 500 ⁇ L of the following liquids ⁇ 4-A> to ⁇ 4-E> were applied to each portion.
  • the administration liquid was made to conform to the application site, and then absorbed with a lint cloth cut into a 2.5 cm square (hereinafter referred to as a preparation).
  • the administration was a closed application, and three silicon sheets were stacked on a lint cloth soaked in water and fixed with a medical surgical tape and an elastic bandage. 24 hours after application, the preparation was removed (cleaned) with absorbent cotton soaked with physiological saline (Japanese Pharmacopoeia physiological saline, Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.). After the observation of the administration site, the following coating operation was performed and coating was continued for 10 days.
  • ⁇ 4-A> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension prepared so that the concentration of the pitavastatin calcium-containing polymer micelle obtained in Preparation Example 1-1 is 0.1% by mass in terms of pitavastatin calcium Solution
  • ⁇ 4-B> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspended so that the concentration of the pitavastatin calcium-containing polymer micelle obtained in Preparation Example 1-1 was 0.5% by mass in terms of pitavastatin calcium
  • ⁇ 4-C> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension containing pitavastatin calcium (0.1 mass%)
  • ⁇ 4-D> Phosphate containing pitavastatin calcium (0.5 mass%) Buffer solution (pH 7.4) suspension
  • ⁇ 4-E> Phosphate buffer solution (pH 7.4)
  • the pitavastatin calcium-containing polymer micelle suspension (liquids 4-A and 4-B) has a total cholesterol amount, an HDL cholesterol amount, an LDL cholesterol amount, and a phospholipid amount. It can be seen that both are reduced. Further, as shown in FIGS. 4-1 and 4-3, when a polymer micelle suspension (liquid 4-A) containing pitavastatin calcium (0.1 mass%) was used, 0.1 mass of pitavastatin calcium was used. The total cholesterol level and the LDL cholesterol level were reduced to the same extent as in the case of using a phosphate buffer containing 1% (solution 4-C). Further, as shown in FIGS.
  • Test Example 1-5 Irritation test using three-dimensional skin model
  • ⁇ 5-A> to ⁇ 5-G> as test substances, according to the OECD TG439 (In Vitro Skin Irritation Test) using the OECD approved skin irritation test kit (Kurabo product number: EPI-212SIT)
  • EPI-212SIT skin irritation test kit
  • test substance was exposed to the stratum corneum by adding 30 ⁇ L of the test substance to the stratum corneum side of the kit epidermis that had been pre-incubated overnight, and placing a nylon mesh with tweezers.
  • the test substance is solid ( ⁇ 5-E> below)
  • 25 ⁇ L of DPBS is added to the stratum corneum, and immediately after that 25 mg of the solid substance is added to the stratum corneum to expose the test substance to the stratum corneum. It was. Washing was performed after 60 minutes to completely remove the test substance, followed by 42 hours post-incubation. During the post-incubation, the medium was changed once after 24 hours.
  • the MTT assay kit manufactured by Kurabo Industries, product number: MTT-100-JP
  • MTT-100-JP the MTT assay kit
  • ⁇ 5-A> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension prepared so that the concentration of the pitavastatin calcium-containing polymer micelle obtained in Preparation Example 1-1 is 0.5% by mass in terms of pitavastatin calcium Solution
  • ⁇ 5-B> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspended so that the concentration of the pitavastatin calcium-containing polymer micelle obtained in Preparation Example 1-1 was 1.0% by mass in terms of pitavastatin calcium
  • ⁇ 5-C> Phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension containing pitavastatin calcium (0.5 mass%)
  • ⁇ 5-D> Phosphate containing pitavastatin calcium (1.0 mass%) Buffer solution (pH 7.4) suspension
  • ⁇ 5-E> Pitavastatin calcium drug substance (powder)
  • positive control ⁇ 5-G> Dulbecco phosphate buffered saline (DPBS); negative control
  • ⁇ 5-A Suspension of phosphate buffer (pH 7.4) of pitavastatin calcium-containing polymer micelle prepared to 0.5% by mass in terms of pitavastatin calcium>
  • ⁇ 5-C A phosphate buffer solution (pH 7.4) suspension> 1.5 mL containing pitavastatin calcium (0.5 mass%) was applied, and a phosphate buffer solution (pH 7.4) was used as the receptor solution.
  • 0.8 mL of the receptor solution was collected, and 0.8 mL of the receptor solution was newly replenished.
  • the drug content in the collected receptor solution was measured by the HPLC method.
  • FIG. 6 shows the results of plotting the relationship between the time from the start of the test until the receptor solution was collected and the cumulative amount of drug permeation.
  • Example 2 Skin irritation reduction effect of rivastigmine
  • rivastigmine which is a therapeutic agent for Alzheimer's dementia
  • Example 2 rivastigmine, which is a therapeutic agent for Alzheimer's dementia, was used as a drug, and a test on an external preparation for skin in which an amphiphilic polymer micelle and a drug were mixed was conducted.
  • Preparation Example 2-1 Preparation of polymer micelle containing no drug
  • 100 mg of PSar 65 -PLLA 30 obtained in Synthesis Example 1 was dissolved in 40 mL of chloroform, and chloroform was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator. After distillation under reduced pressure, 10 mL of purified water was added to the thin film formed in the container, and the container was immersed in an 85 ° C. hot water bath for 20 minutes to form micelles, filtered using a 0.2 ⁇ m PTFE filter, and the filtrate was filtered.
  • the polymer micelle was obtained by freeze-drying. Average particle size: 35 nm, drug content: 0, recovery rate: 90% or more
  • Preparation Example 2-2 Preparation of mixed solution of polymer micelle and drug (1)
  • Rivastigmine was added to isopropyl myristylate (IPM) to prepare a 20% by mass solution (1-A below).
  • IPM isopropyl myristylate
  • the polymer micelle obtained in Preparation Example 2-1 was added so that the concentration was 1% by mass (1-B below) or 3% by mass (1-C below).
  • a suspension in which polymer micelles were dispersed in a rivastigmine solution was prepared.
  • Preparation Example 2-3 Preparation of mixed solution of polymer micelle and drug (2)
  • the concentration of the polymer micelle obtained in Preparation Example 2-1 is 1% by mass (2-B below), 3% by mass (2-C below), or 10% by mass with respect to the rivastigmine stock solution.
  • (2-D below) was added to prepare a suspension in which polymer micelles were dispersed in a rivastigmine stock solution.
  • Test Example 2-1 Irritation test using three-dimensional skin model (1)
  • the following ⁇ 1-A> to ⁇ 1-E> are used as test substances, and the test substances are exposed to the epidermis and evaluated for irritation using the skin irritation test kit in the same manner as in Test Example 1-5 described above. Carried out. The relative survival rate relative to the negative control is shown in FIG.
  • Test Example 2-2 Irritation test using a three-dimensional skin model (2)
  • the following ⁇ 2-A> to ⁇ 2-F> are used as test substances, and the test substance is exposed to the epidermis and evaluated for irritation using the skin irritation test kit in the same manner as in Test Example 1-5 described above. Carried out. The relative survival rate relative to the negative control is shown in FIG. 7-2.
  • Test Example 2-3 Skin permeation test using three-dimensional skin model
  • a skin permeation test was carried out in the same manner as in Test Example 1-6 using 20% by mass rivastigmine IPM suspension and 20% by mass rivastigmine IMP suspension added with 2% by mass polymer micelle as a donor solution.
  • a commercially available external skin patch containing rivastigmine as a medicinal ingredient (Ixelon patch 18 mg; 1.3 cm ⁇ (area: 1.33 cm 2 ) manufactured by Novartis Pharma) was applied to the horny layer side of a cultured skin model, A permeation test was performed.
  • FIG. 8 shows the results of plotting the relationship between the time from the start of the test until the receptor solution was collected and the cumulative amount of drug permeation.
  • the polymer micelle-added rivastigmine solution tended to have a slightly lower skin permeability than the rivastigmine solution to which no polymer micelle was added. It showed high skin permeability and was useful as a skin external preparation.
  • Example 3 Skin irritation reduction effect of memantine
  • memantine hydrochloride which is a therapeutic agent for Alzheimer-type dementia, is used as a drug
  • an external preparation for skin containing a drug in an amphiphilic polymer micelle, and amphiphilic polymer micelle as a skin irritation reducing agent are used in the skin.
  • the test concerning the form of applying the drug after contact with was conducted.
  • Preparation Example 3-1 Preparation of memictine-containing polymer micelle (52 nm)] 100 mg of PSar 65 -PLLA 30 and 100 mg of memantine hydrochloride obtained in Synthesis Example 1 were dissolved in 50 mL of chloroform, and chloroform was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator. 100 mL of purified water is added to the thin film formed in the container after distillation under reduced pressure, and the container is immersed in a 85 ° C. water bath for 20 minutes to form micelles and freeze-dried to obtain memantine hydrochloride-containing polymer micelles It was. Average particle size: 52 nm, drug content: 100% by mass, recovery: 90% or more
  • Test Example 3-1 Skin irritation test using a three-dimensional skin model
  • OECD-200SIT skin irritation test kit
  • the following ⁇ A> to ⁇ E> levels were applied to the epidermis in the same manner as in Test Example 1-5 above.
  • the test substance was exposed and evaluated for irritation.
  • the relative survival rate relative to the negative control is shown in FIG.
  • ⁇ A> 25 ⁇ L of DPBS was added to the stratum corneum, and immediately after that 1 mg of memantine hydrochloride (solid) was added to the stratum corneum.
  • ⁇ C> 25 ⁇ L of DPBS was added to the stratum corneum, and immediately after that, 5 mg of polymer micelle containing no drug obtained in Preparation Example 2-1.
  • the relative survival rate of the drug-containing polymer micelle containing ⁇ B>: memantine was significantly increased compared to the case where ⁇ A>: memantine was used alone.
  • ⁇ C> and ⁇ D> Even when memantine is applied after application of polymer micelle, relative survival rate is significantly increased compared to the case where ⁇ A>: memantine is used alone, and skin irritation The reduction effect was confirmed. From these results, it is understood that the polymer micelle acts as a skin irritation reducing agent by applying the polymer micelle prior to the application of the drug.
  • Test Example 3-2 Determination of IL-1 ⁇ production by ELISA
  • levels A, B, D, E, and F of Test Example 3-1 a culture supernatant 24 hours after the start of post-incubation was collected, and a commercially available interleukin (IL) -1 ⁇ ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) kit was used to measure the IL-1 ⁇ content (production amount) in the culture supernatant.
  • IL-1 ⁇ is a kind of cytokine produced when the skin is stimulated. The measurement results are shown in FIG. 10 together with the relative survival rate.

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Abstract

　皮膚外用剤は、薬物とナノメートルサイズの分子集合体とを含有する。分子集合体は、サルコシンに由来する構造単位を有する親水性ブロック鎖とヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックコポリマーを含む。本発明の皮膚外用剤は、皮膚に対する刺激が強く一般には経皮投与することが困難である薬物を含んでいても、その薬物の皮膚に対する刺激が低減されるため、安全性が高く、且つ優れた薬理効果を有する。

Description

皮膚外用剤及び皮膚刺激低減剤
　本発明は、皮膚外用剤に関する。さらに、本発明は皮膚外用剤の併用により皮膚刺激を低減可能な皮膚刺激低減剤に関する。
　従来、ドラッグデリバリーシステムや、特定の生体組織を標識するための分子イメージング用プローブとして、薬物や蛍光色素を担持、内包又は結合させたポリマーナノ粒子が多数報告されている。
　例えば、特許文献１には、静脈内に直接投与される薬剤搬送システム及び分子イメージングプローブとして、サルコシン単位を１０個以上有する親水性ポリペプチド鎖と、アミノ酸単位又はヒドロキシル酸単位を５個以上必須構成単位として含有する疎水性分子鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーが記載されている。
　また、特許文献２には、静脈内に直接投与される分子イメージングプローブとして、２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマー、及び１０個以上の乳酸単位と標識基とを少なくとも有する標識ポリマーという２種のポリマーから構成される分子集合体が記載されている。
　一方、生理活性成分の皮膚中における活性を高めることなどを目的として、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のナノ粒子に生理活性成分を内包させた経皮吸収外用剤（特許文献３）が提案されている。また、当該経皮吸収外用剤と同様に皮膚中で作用させることを目的として、トラネキサム酸をＰＬＧＡナノ粒子に封入して経皮吸収外用剤とすることも提案されている（特許文献４）。
　しかしながら、特許文献３に記載の外用剤は、ＰＭＭＡが生分解性ポリマー材料ではないため、医薬品や化粧品等として長期間繰り返し使用した場合にはＰＭＭＡの皮膚中の残留による悪影響が懸念される。また、粒子サイズを小さくした場合に薬物を封入することが困難になる可能性がある。
　特許文献４に記載の外用剤は、ＰＬＧＡナノ粒子中に封入できるトラネキサム酸が微量であるため、皮膚層（真皮）より深部に送達させる場合には多量の製剤の投与が必要である。また、使用する薬物が皮膚刺激を伴うものであるような場合には、薬物担体に封入しきれなかった薬物が皮膚に悪影響を及ぼす怖れがあるなどの問題が懸念される。
特開２００８－０２４８１６号公報 国際公開第２００９／１４８１２１号 特開２００２－３０８７２８号公報 特開２０１０－１８０１４５号公報
　本発明が解決しようとする課題は、皮膚に対する刺激が強く経皮投与することが困難であった薬物を含んでいても、その薬物の皮膚に対する刺激が低減され、安全性が高く、且つ優れた薬理効果を有する皮膚外用剤を提供することにある。
　そこで、本発明者らが鋭意研究を行った結果、特定の両親媒性ブロックコポリマーを含むナノメートルサイズの分子集合体と薬物とを併用することによって、皮膚に対する刺激が強く経皮投与することが困難であった薬物を含んでいても、その薬物の皮膚に対する刺激が低減され、安全性が高く、且つ優れた薬理効果を有する皮膚外用剤が得られることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、薬物とナノメートルサイズの分子集合体を含有し、前記分子集合体が、サルコシンに由来する構造単位を有する親水性ブロック鎖とヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックコポリマー（以下、単に両親媒性ブロックコポリマーともいう）を含む、皮膚外用剤を提供するものである。
　また、本発明は、薬物を含有する皮膚外用剤中の前記薬物による皮膚刺激を低減するために使用される皮膚刺激低減剤であって、ナノメートルサイズの分子集合体を形成させるために使用される、サルコシンに由来する構造単位を有する親水性ブロック鎖とヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックコポリマーを含有する皮膚刺激低減剤を提供するものである。
　本発明の皮膚外用剤は、皮膚に対する刺激が強く経皮投与することが困難であった薬物を含んでいても、その薬物の皮膚に対する刺激が低減され、安全性が高く、且つ優れた薬理効果を有する。また、本発明の皮膚外用剤は、皮膚透過性も高い。
ピタバスタチンによる皮膚刺激性試験の結果を示す図である。 ピタバスタチンの皮膚透過試験の結果を示す図である。 ピタバスタチンの皮膚透過試験の結果を示す図である。 皮膚外用剤適用後の総コレステロール量を示す図である。 皮膚外用剤適用後のＨＤＬコレステロール量を示す図である。 皮膚外用剤適用後のＬＤＬコレステロール量を示す図である。 皮膚外用剤適用後のリン脂質量を示す図である。 三次元皮膚モデルでのピタバスタチンによる刺激性試験の結果を示す図である。 三次元皮膚モデルでのピタバスタチンの透過試験の結果を示す図である。 三次元皮膚モデルでのリバスチグミンによる刺激性試験の結果を示す図である。 三次元皮膚モデルでのリバスチグミンによる刺激性試験の結果を示す図である。 三次元皮膚モデルでのリバスチグミンの透過試験の結果を示す図である。 三次元皮膚モデルでのメマンチンによる刺激性試験の結果を示す図である。 三次元皮膚モデルでのメマンチンによる刺激性試験及びＩＬ－１α産生量の測定結果を示す図である。
　本発明の皮膚外用剤は、薬物とナノメートルサイズの分子集合体を含有し、当該分子集合体が、サルコシンに由来する構造単位を有する親水性ブロック鎖とヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックコポリマーを含むものである。
＜（Ａ－１）両親媒性ブロックコポリマー＞
　（親水性ブロック鎖）
　両親媒性ブロックコポリマーに含まれる親水性ブロック鎖は、サルコシンに由来する構造単位を有するものである。当該構造単位によって、親水性ブロック鎖の親水性と柔軟性が向上する。なお、親水性ブロック鎖中のサルコシン由来の構造単位は、すべてが連続していてもよいし、非連続であってもよい。
　ここで、本明細書において、「親水性ブロック鎖」とは、両親媒性ブロックコポリマーに含まれる疎水性ブロック鎖よりも相対的に親水性が高く、且つ両親媒性ブロックコポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体（好ましくは粒子状の自己集合体）を形成することが可能となる親水性を備えるものをいう。
　親水性ブロック鎖としては、皮膚刺激性の低減、皮膚透過性、及び薬理効果の観点や、分子集合体をミセルやベシクルといった形状や適度な大きさに制御しやすくする観点から、サルコシンに由来する構造単位を２０個以上有するものが好ましい。斯かるサルコシン由来の構造単位の個数は、より好ましくは３０個以上、さらに好ましくは４０個以上であり、また、好ましくは５００個以下、より好ましくは２００個以下、さらに好ましくは１５０個以下、特に好ましくは１００個以下である。
　上記サルコシンに由来する構造単位は、具体的には、下記式（１）で示されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　サルコシンに由来する構造単位の含有量としては、親水性ブロック鎖中、５０～１００モル％が好ましく、６５～１００モル％がより好ましく、８０～１００モル％がさらに好ましく、９０～１００モル％が特に好ましい。
　親水性ブロック鎖は、糖鎖やポリエーテル鎖などを含んでいてもよいが、好ましくはポリペプチド鎖である。親水性ブロック鎖に含まれるサルコシン由来の構造単位以外の構造単位としては、サルコシン以外のアミノ酸（親水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）に由来する構造単位が挙げられる。
　ここで、本明細書において「アミノ酸」は、Ｌ体、Ｄ体、ＤＬ体のいずれでもよく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの修飾及び／又は化学的変更による誘導体を含み、且つ、α－、β－、γ－アミノ酸も包含する。
　上記アミノ酸の中でも、親水性アミノ酸が好ましい。具体的には、セリン、スレオニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
　（疎水性ブロック鎖）
　両親媒性ブロックコポリマーに含まれる疎水性ブロック鎖は、ヒドロキシ酸に由来する構造単位を有するものである。疎水性ブロック鎖中のヒドロキシ酸由来の構造単位は、すべてが連続していてもよいし、非連続であってもよい。
　ここで、本明細書において、「疎水性ブロック鎖」とは、両親媒性ブロックコポリマーに含まれる親水性ブロック鎖よりも相対的に疎水性が高く、且つ両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体（好ましくは粒子状の自己集合体）を形成することが可能となる疎水性を備えるものをいう。
　また、疎水性ブロック鎖としては、皮膚刺激性の低減、皮膚透過性、及び薬理効果の観点や、分子集合体をミセルやベシクルといった形状や適度な大きさに制御しやすくする観点から、ヒドロキシ酸に由来する構造単位を１０個以上有するものが好ましい。斯かるヒドロキシ酸由来の構造単位の個数は、より好ましくは１５個以上、さらに好ましくは２０個以上であり、また、好ましくは１００個以下、より好ましくは８０個以下、さらに好ましくは６０個以下、特に好ましくは５０個以下である。
　上記ヒドロキシ酸としては、脂肪族ヒドロキシ酸が好ましい。脂肪族ヒドロキシ酸としては、乳酸、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてよい。
　これらの中でも、低沸点溶媒に対する溶解性や、生体適合性及び安定性が向上する観点から、乳酸が特に好ましい。該乳酸は、Ｌ－乳酸、Ｄ－乳酸、ＤＬ－乳酸のいずれでもよく、疎水性ブロック鎖はこれらのうち単独で構成されていても複数から構成されていてもよい。
　上記ヒドロキシ酸に由来する構造単位の好適な具体例としては、下記式（２）で示されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
〔式（２）中、Ｒ1は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ2は、単結合又はメチレン基を示す。〕
　式（２）中、Ｒ1とＲ2の組み合わせとしては、Ｒ1が水素原子又はメチル基であり、Ｒ2が単結合である組み合わせ、Ｒ1がメチル基であり、Ｒ2がメチレン基である組み合わせが好ましく、低沸点溶媒に対する溶解性や、生体適合性及び安定性が向上する観点から、Ｒ1がメチル基であり、Ｒ2が単結合である組み合わせが特に好ましい。
　ヒドロキシ酸に由来する構造単位の含有量としては、疎水性ブロック鎖中、５０～１００モル％が好ましく、６５～１００モル％がより好ましく、８０～１００モル％がさらに好ましく、９０～１００モル％が特に好ましい。
　疎水性ブロック鎖に含まれるヒドロキシ酸由来の構造単位以外の構造単位としては、アミノ酸（疎水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）に由来する構造単位が挙げられる。
　疎水性アミノ酸は、その多くが、脂肪族側鎖、芳香族側鎖などを有する。天然の疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン等が挙げられる。非天然の疎水性アミノ酸誘導体としては、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステルなどが挙げられる。
　本発明で用いる両親媒性ブロックコポリマー中、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖との含有割合〔親水性ブロック鎖：疎水性ブロック鎖〕としては、皮膚刺激性の低減、皮膚透過性、及び薬理効果の観点から、構造単位数の比で、１０：１～１：１が好ましく、６：１～１．５：１がより好ましく、５：１～１．６：１が特に好ましい。
　また、本発明で用いる両親媒性ブロックコポリマーの好適な具体例としては、下記式（３）で表されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
〔式（３）中、Ｒ3は、炭素数１～６の２価の炭化水素基を示し、ｍは２０～２００の整数を示し、ｎは１０～１００の整数を示し、Ｒ1及びＲ2は、前記と同義である。〕
　式（３）中、Ｒ3で示される２価の炭化水素基としては、アルキレン基が好ましい。アルキレン基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキレン基の具体例としては、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基（プロパン－１，２－ジイル基）、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。
　上記２価の炭化水素基の炭素数は、好ましくは２～５であり、より好ましくは２又は３であり、さらに好ましくは２である。
　ｍは２０～２００の整数を示すが、３０～１５０の整数が好ましく、４０～１００の整数がより好ましい。ｎは１０～１００の整数を示すが、１５～８０の整数が好ましく、２０～６０の整数がより好ましく、２０～５０の整数が特に好ましい。
　なお、ｎ個のＲ1は同一であっても異なっていてもよく、ｎ個のＲ2も同一であっても異なっていてもよい。
　本発明で用いる両親媒性ブロックコポリマーの数平均分子量（Ｍn）は特に限定されないが、好ましくは３，０００～１４，０００であり、より好ましくは３，０００～９，０００である。両親媒性ブロックコポリマーの重量平均分子量（Ｍw）は特に限定されないが、好ましくは３，０００～１４，０００であり、より好ましくは３，０００～９，０００である。
　両親媒性ブロックコポリマーの分子量分布（Ｍw／Ｍn）は、１．５以下が好ましい。
　なお、各構造単位の含有量は、13Ｃ－ＮＭＲ、1Ｈ－ＮＭＲ等により測定すればよい。
＜（Ａ－２）疎水性ポリマー＞
　本発明で使用する分子集合体は、両親媒性ブロックコポリマーの他に、疎水性ポリマーを含有していてもよい。
　上記疎水性ポリマー（以下、単に疎水性ポリマーとも呼ぶ。）としては、生体適合性、安定性、生分解性の観点や、低沸点溶媒に対する溶解性の観点から、ヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する疎水性ポリマーが好ましい。
　疎水性ポリマーがヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する場合、ヒドロキシ酸に由来する構造単位の個数としては、両親媒性ブロックポリマーとの親和性の観点、及び分子集合体をミセルやベシクルといった形状や適度な大きさに制御しやすくする観点から、好ましくは１０個以上、より好ましくは１５個以上、さらに好ましくは２０個以上であり、また、好ましくは２００個以下、より好ましくは１６０個以下、さらに好ましくは１００個以下である。
　上記個数は、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロック鎖に含まれる構造単位数の２倍を超えない個数であるのが好ましい。
　上記ヒドロキシ酸としては、脂肪族ヒドロキシ酸が好ましい。脂肪族ヒドロキシ酸としては、乳酸、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてよい。
　これらの中でも、低沸点溶媒に対する溶解性や、生体適合性及び安定性が向上する観点から、乳酸が特に好ましい。該乳酸は、Ｌ－乳酸、Ｄ－乳酸、ＤＬ－乳酸のいずれでもよく、疎水性ポリマーはこれらのうち単独で構成されていても複数から構成されていてもよい。斯かる乳酸の中でも、平均粒子径を制御しやすくする観点、及び安定性の観点から、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロック鎖がＬ－乳酸由来の構造単位を含む場合は、Ｌ－乳酸が好ましく、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロック鎖がＤ－乳酸由来の構造単位を含む場合は、Ｄ－乳酸が好ましい。
　疎水性ポリマーがヒドロキシ酸に由来する構造単位を含む場合、斯かる構造単位の含有量としては、疎水性ポリマー中、５０～１００モル％が好ましく、６５～１００モル％がより好ましく、８０～１００モル％がさらに好ましく、９０～１００モル％が特に好ましい。
　なお、疎水性ポリマーは、上記疎水性アミノ酸に由来する構造単位等を含んでいてもよい。
　上記疎水性ポリマーの数平均分子量（Ｍn）は特に限定されないが、好ましくは７００～６，０００であり、より好ましくは１，０００～４，０００である。
　上記疎水性ポリマーの重量平均分子量（Ｍw）は特に限定されないが、好ましくは７００～６，０００であり、より好ましくは１，０００～４，０００である。
　上記疎水性ポリマーの分子量分布（Ｍw／Ｍn）は、１．５以下が好ましい。
　疎水性ポリマーを用いる場合、両親媒性ブロックコポリマーと疎水性ポリマーとの含有量のモル比〔（Ａ－１）：（Ａ－２）〕は、分子集合体の疎水コア部の体積や分子集合体の大きさを制御しやすくする観点から、好ましくは１０：１～１：１０である。
＜（Ｂ）薬物＞
　本発明の皮膚外用剤に含まれる薬物は、特に限定されない。本発明の皮膚外用剤は、上記両親媒性ブロックコポリマーを含む分子集合体と薬物との併用により、薬物の皮膚に対する刺激が低減されており、薬物として皮膚刺激性の高いものを使用した場合であっても、安全に経皮投与することができる。
　そのため、薬物としては、具体的には、接触皮膚炎を起こすと報告されている薬物などが好適に使用できる。これら薬物は、単独で又は複数種の組み合わせで用いることができる。
　接触皮膚炎を起こすと報告されている薬物としては、例えばスタチンが挙げられる。スタチンとしては、メバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、これらの薬学的に許容される塩が挙げられる。ここで、当該薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；アルキルアンモニウム塩が挙げられる。本発明の皮膚外用剤は皮膚透過性が高く血中等にまで移行しやすいため、スタチンの備える薬理作用を十分に発揮させることができる。
　これらの中でも、スタチンとしては、脂溶性スタチン、これらの薬学的に許容される塩が好ましい。脂溶性スタチンとしては、メバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、これらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
　他の接触皮膚炎を起こすと報告されている薬物としては、例えば、硫酸フラジオマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、塩酸オキシテトラサイクリン、リン酸クリンダマイシン、硫酸ポリミキシンＢ、バシトラシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、フシジン酸ナトリウム、スルファジアジン銀等の抗生物質；
クロトリマゾール、塩酸ネチコナゾール、ルリコナゾール、硝酸スルコナゾール、ビホナゾール、ラノコナゾール、塩酸アモロルフィン、塩酸テルビナフィン、塩酸ブテナフィン、トルナフテート等の抗真菌薬；
アセチルサリチル酸、ブフェキサマク、イブプロフェン、イブプロフェンピコノール、ウフェナマート、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、ピロキシカム等の非ステロイド性抗炎症薬；
塩酸プロカイン、アミノ安息香酸エチル、塩酸ジブカイン、塩酸リドカイン、塩酸トルペリゾン等の局所麻酔薬；
塩酸ジフェンヒドラミン、クロタミトン、Ｌ－メントール、サリチル酸グリコール、サリチル酸メチル等の鎮痒薬；
酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、ハルシノニド、フルシノニド、アムシノニド、フルシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、プロピオン酸デプロドン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、プロピオン酸クロベタゾール、酢酸クロベタゾン、吉草酸ベタメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、吉草酸ジフルコルトン、ジプロピオン酸ベタメサゾン、酪酸プロピオン酸ベタメサゾン、プロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸デキサメタゾン、ピバル酸フルメタゾン、アルクロメタゾン、フランカルボン酸モメタゾン、ジフルプレドナート、酢酸ジフロラゾン等のステロイド性抗炎症薬；
塩酸フェニレフリン、塩酸ピバレフリン、硫酸アトロピン、フマル酸ケトチフェン、クロモグリク酸ナトリウム、アンレキサノックス、トブラマイシン、硫酸ジベカシン、硫酸シソマイシン、マレイン酸チモロール、ニプラジロール、塩酸ベフノロール、塩酸レボカバスチン等の点眼薬；
塩化リゾチーム、トラフェルミン等の潰瘍治療薬；
ドネペジル塩酸塩、メマンチン塩酸塩、リバスチグミン、リバスチグミン酒石酸塩、ガランタミン臭化水素酸塩等のアルツハイマー型認知症治療薬；
クロラムフェニコール、カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニトイン、エチゾラム、ニトラゼパム、イデベノン、塩酸ミアンセリン等の抗痙攣薬；
抱水クローラル、アセチルサリチル酸、トルフェナム酸、ブコローム等の解熱鎮痛薬；
塩酸メキシレチン、メシル酸ドキサゾシン、ジピリダモール、硝酸イソソルビド等の循環器治療薬；
リン酸ジヒドロコデイン、テオフィリン等の呼吸器薬；
塩酸チクロピジン、ベラプロストナトリウム、リマプロストアルファデクス等の血液・体液疾患治療薬；
オキシブチニン塩酸塩等の頻尿治療薬が挙げられる。
　これらの中でも、他の接触皮膚炎を起こすと報告されている薬物としては、アルツハイマー型認知症治療薬、頻尿治療薬が好ましい。
＜皮膚外用剤の形態＞
　本発明の皮膚外用剤は、上記両親媒性ブロックコポリマーを含むナノメートルサイズの分子集合体、及び上記薬物を含有する。本発明の皮膚外用剤の剤形は、特に限定されないが、外用液剤、ローション剤、トニック剤、リニメント剤、乳剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、泥膏剤、硬膏剤、湿布剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、リザーバー型貼付剤、スプレー剤、エアゾール剤、泡剤、化粧水、パック剤等が挙げられる。
　皮膚外用剤が薬物及び分子集合体を含むとは、皮膚外用剤中に、薬物と分子集合体とが存在することであり、上記両親媒性ブロックコポリマー、必要に応じて上記疎水性ポリマーを含む分子集合体のポリマーナノ粒子中に、上記薬物が含有されていてもよい。なお、当該「含有」は、内包及び担持を含む概念である。分子集合体が薬物を含有する場合、分子集合体自体が薬物としての作用と皮膚刺激低減剤としての作用の両方を有する。
　薬物と分子集合体とを含有する形態としては、分子集合体が薬物を含有する形態以外に、分子集合体と薬物とが混合状態で存在（併存）する形態や、皮膚外用剤が分子集合体を含有する領域と薬物を含有する領域とを含む形態が挙げられる。これらの形態では、分子集合体が皮膚刺激低減剤として作用する。
　皮膚外用剤が、分子集合体含有領域と薬物含有領域とを含む形態としては、例えば、基材上に薬物含有層を備える皮膚貼付剤において、薬物含有層上の皮膚貼付面側に、分子集合体含有層を備えるものが挙げられる。このような皮膚貼付外用剤は、基材上に、薬物含有領域としての薬物含有層と、皮膚刺激低減のための分子集合体含有領域としての分子集合体含有層とを、この順に備えている。
　分子集合体を皮膚刺激低減剤として使用する場合、塗布等により分子集合体を表皮に接触させた後、その上から薬物を適用することにより、皮膚への刺激低減効果が得られる。
　薬物の含有量は、皮膚外用剤全量に対して、例えば、０．０００１～５０質量％程度である。皮膚刺激性の低減、皮膚透過性、及び薬理効果の観点から、薬物の含有量は、皮膚外用剤全量に対して、０．００１～３０質量％が好ましく、０．０１～１５質量％がより好ましく、０．０５～１０質量％がさらに好ましく、０．１～５質量％が更に好ましい。特に、皮膚透過性、及び薬理効果の観点から、０．１５～２．５質量％が更に好ましく、０．２～１．５質量％が更に好ましく、０．３～１質量％が特に好ましい。
　両親媒性ブロックコポリマーの含有量は、皮膚外用剤全量に対し、例えば、０．０００１～５０質量％程度であり、好ましくは０．００１～３０質量％、より好ましくは０．０１～２０質量％、特に好ましくは０．１～１０質量％である。
　皮膚外用剤における両親媒性ブロックコポリマーと薬物との含有量のモル比〔（Ａ－１）：（Ｂ）〕は、好ましくは１：１０００～１０００：１、より好ましくは１：１００～１００：１であり、さらに好ましくは１：１００～１：１であり、特に好ましくは１：５０～１：１である。
＜分子集合体＞
　本発明で使用する分子集合体は、上記両親媒性ブロックコポリマーの凝集により、或いは自己集合的な配向会合により成り立つ構造体である。上記分子集合体の形状は、粒子状（ミセル状、ベシクル状等）、ロッド状、その他分子の凝集形態のいずれでもよいが、皮膚刺激性の低減、皮膚透過性、及び薬理効果の観点から、粒子状が好ましく、ミセル状、ベシクル状がより好ましく、ミセル状が特に好ましい。
　本発明で使用する分子集合体は、皮膚刺激性の低減、皮膚透過性、及び薬理効果の観点から、平均粒子径が１０～３００ｎｍであるのが好ましく、平均粒子径が１０～２００ｎｍであるのがより好ましく、平均粒子径が１０～１５０ｎｍであるのがさらに好ましく、平均粒子径が１０～１００ｎｍであるのがさらに好ましく、平均粒子径が１５～６０ｎｍであるのがさらに好ましく、平均粒子径が２０～４５ｎｍであるのが特に好ましい。
　なお、平均粒子径は、後述する実施例に記載の方法で測定した値をいうものとする。
　本発明の皮膚外用剤及び皮膚刺激低減剤は、以下のようにして得られる分子集合体を常法に従い配合することにより製造できる。
　ペプチド合成法、ポリエステル合成法、デプシペプチド合成法を適宜組み合わせる公知の方法により合成できる両親媒性ブロックコポリマーと、必要に応じて疎水性ポリマーとを用いて、フィルム法又はインジェクション法等により分子集合体を作製できる。分子集合体の作製時に、両親媒性ブロックコポリマー、及び必要に応じて用いられる疎水性ポリマーに加えて、薬物を用いることにより、薬物を含有する分子集合体が得られる。また、分子集合体を形成する前の両親媒性ブロックコポリマー、及び必要に応じて用いられる疎水性ポリマーを、皮膚刺激低減剤として提供することもできる。当該形態では、皮膚刺激低減剤としての両親媒性ブロックコポリマー及び薬物を用いて分子集合体を作製することにより、皮膚外用剤として使用可能な分子集合体が得られる。なお、得られた分子集合体に対して、公知の方法によって表面修飾を行ってもよい。
　（フィルム法）
　フィルム法は、一般にリポソームの調製に用いられる方法であり、次の工程（１）～（３）を含むものである。
　工程（１）容器（例えばガラス容器）内で、両親媒性ブロックコポリマー、薬物、及び場合によっては疎水性ポリマーを有機溶媒に溶解させる工程；
　工程（２）前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に両親媒性ブロックコポリマー、並びに場合によっては疎水性ポリマー及び／又は薬物を含むフィルムを得る工程；
　工程（３）前記容器中に水又は水溶液を加え、前記フィルムを粒子状の分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程。
　さらに、フィルム法は、前記の分子集合体の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでもよい。また、工程（３）では、必要に応じて超音波処理、及び水溶液の加熱処理を行ってもよい。
　また、両親媒性ブロックコポリマー、並びに場合によっては疎水性ポリマー及び／又は薬物を有機溶媒中に含む溶液は、当業者によって適宜調製される。例えば、用いるべきポリマー及び薬物の全てを一度に混合することによって調製されてもよいし、当該用いるべきポリマー及び薬物のうちの一部をあらかじめフィルムの状態で用意し、その後、当該用いるべき成分のうち他の成分を含む溶液を加えることによって調製されてもよい。あらかじめ用意される一部のポリマーのフィルムの形成法は、後述する方法に準じて行うことができる。
　フィルム法に用いる有機溶媒としては、使用する両親媒性ブロックコポリマー、薬物及び疎水性ポリマーが溶解するものであれば特に制限はないが、溶解後に留去することから低沸点溶媒を用いることが好ましい。本発明における低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、酢酸エチルなどが挙げられる。
　両親媒性ブロックコポリマー、並びに場合によっては疎水性ポリマー及び／又は薬物の溶解にこのような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
　有機溶媒が除去された後は、容器内壁に両親媒性ブロックコポリマー、並びに場合によっては疎水性ポリマー及び／又は薬物を含むフィルムが形成される。このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
　水又は水溶液が加えられた後、必要に応じて加温処理及び／又は超音波処理を行うことにより、フィルムが容器内壁から剥がれ、その過程で分子集合体が形成される。超音波処理は、例えば１～６０分の条件下で行うことができる。加温処理は、例えば２０～９５℃の条件下で行うことができる。超音波処理と同時に加温処理を行う場合は、例えば、２０～９５℃、１～６０分の条件下で、超音波処理を行えばよい。加温処理及び／又は超音波処理終了時には、分子集合体が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。
　（インジェクション法）
　インジェクション法は、本発明の分子集合体に限らず、他の多くの分子集合体の調製に用いられる方法である。この方法においては、有機溶媒、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシドなどに、両親媒性ブロックコポリマー、並びに場合によっては疎水性ポリマー及び／又は薬物を溶解し、得られた溶液を、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などの水系溶媒に分散させ、精製処理、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行った後、有機溶媒を除去することによって分子集合体を調製することができる。
　分子集合体をベシクルとして調製する場合において、内包型のものを調製する場合は、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などの水系溶媒に、内包すべき物質を溶解又は懸濁させ、このようにして得られた水溶液又は懸濁液に、両親媒性ブロックコポリマー、並びに場合によっては疎水性ポリマー及び／又は薬物を上記有機溶媒に溶解させて得られた溶液を分散させるとよい。
　分子集合体の作製時に薬物を用いることにより、薬物を含有する分子集合体を形成する場合、薬物が内包又は担持されやすくなり皮膚刺激性が低減される点から、疎水性の薬物が好ましく用いられる。例えば、薬物として脂溶性スタチンを用いた場合、薬物が両親媒性ブロックコポリマーの疎水コア部分に内包又は担持されやすくなり、皮膚刺激性が更に低減される。
　両親媒性ブロックコポリマーと薬物との含有量のモル比〔（Ａ－１）：（Ｂ）〕は、粒子の粗大化、漏出薬物の凝集等の外観安定性の観点から、好ましくは１：１０００～１０００：１、より好ましくは１：１００～１００：１であり、さらに好ましくは１：１００～１：１であり、特に好ましくは１：５０～１：１である。
＜皮膚外用剤の付加的成分＞
　本発明の皮膚外用剤は、上記分子集合体及び薬物の他に、保湿剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、無痛化剤、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、増粘剤、香料、ｐＨ調整剤等を含んでいてもよい。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて含んでいてよい。
　上記保湿剤としては、例えば、カンテン、ジグリセリン、ジステアリルジモニウムヘクトライト、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、へキシレングリコール、ヨクイニンエキス、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、トラネキサム酸、セラミド、リピジュア、イソフラボン、アミノ酸、コラーゲン、ムコ多糖、フコイダン、ラクトフェリン、ソルビトール、キチン・キトサン、リンゴ酸、グルクロン酸、プラセンタエキス、海藻エキス、ボタンピエキス、アマチャエキス、オトギリソウエキス、コレウスエキス、マサキ抽出物、コウカエキス、マイカイ花エキス、チョレイエキス、サンザシエキス、ローズマリーエキス、デュークエキス、カミツレエキス、オドリコソウエキス、レイシエキス、セイヨウノコギリソウエキス、アロエエキス、マロニエエキス、アスナロエキズ、ヒバマタエキス、オスモインエキス、オーツ麦エキス、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、大麦エキス、オレンジ抽出物、ジオウエキス、サンショウエキス、ヨクイニンエキスなどが挙げられる。
　上記柔軟剤としては、例えば、グリセリン、ミネラルオイル、エモリエント成分（例えば、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸ポリグリセリル、イソノナン酸イソトリデシル、イソノナン酸オクチル、オレイン酸、オレイン酸グリセリル、カカオ脂、コレステロール、混合脂肪酸トリグリセリド、コハク酸ジオクチル、酢酸ステアリン酸スクロース、シクロペンタシロキサン、ジステアリン酸スクロース、パルミチン酸オクチル、ヒドロキシステアリン酸オクチル、ベヘン酸アラキル、ポリベヘン酸スクロース、ポリメチルシルセスキオキサン、ミリスチルアルコール、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ラウリン酸ヘキシルなど）が挙げられる。
　上記経皮吸収促進剤としては、例えば、エタノール、ミリスチン酸イソプロピル、クエン酸、スクワラン、オレイン酸、メントール、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、アジピン酸ジエチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸イソプロピル、オレイン酸オクチルドデシル、イソステアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、尿素、植物油、動物油が挙げられる。
　上記無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、塩酸プロカイン、塩酸キシロカイン、クロロブタノールなどが挙げられる。
　上記防腐剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、過酸化水素、ギ酸、ギ酸エチル、ジ亜塩素酸ナトリウム、プロピオン酸、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、ペクチン分解物、ポリリジン、フェノール、イソプロピルメチルフェノール、オルトフェニルフェノール、フェノキシエタノール、レゾルシン、チモール、チラム、ティートリー油が挙げられる。
　上記酸化防止剤としては、例えば、ビタミンＡ、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、レチニルアセテート、レチニルパルミテート、レチノイン酸トコフェリル、ビタミンＣ及びその誘導体、カイネチン、β－カロテン、アスタキサンチン、ルテイン、リコピン、トレチノイン、ビタミンＥ、α－リポ酸、コエンザイムＱ１０、ポリフェノール、ＳＯＤ、フィチン酸などが挙げられる。
　上記着色剤としては、例えば、酸化鉄、三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、二酸化チタン、カオリン、タール系色素、クロロフィルなどが挙げられる。
　上記増粘剤としては、例えば、クインスシード、カラギーナン、アラビアガム、カラヤガム、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、トラガントガム、ペクチン、デンプン、シクロデキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムなどが挙げられる。
　上記香料としては、例えば、ジャコウ、アカシア油、アニス油、イランイラン油、シナモン油、ジャスミン油、スウィートオレンジ油、スペアミント油、ゼラニウム油、タイム油、ネロリ油、ハッカ油、ヒノキ油、フェンネル油、ペパーミント油、ベルガモット油、ライム油、ラベンダー油、レモン油、レモングラス油、ローズ油、ローズウッド油、アニスアルデヒド、ゲラニオール、シトラール、シベトン、ムスコン、リモネン、バニリンなどが挙げられる。
　上記ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸ナトリウム、塩酸等が挙げられる。
＜皮膚外用剤の用法＞
　本発明の皮膚外用剤は、経皮投与（経粘膜投与を含む）されるものであればよいが、局所作用だけでなく全身作用も期待できるため、循環器疾患、免疫疾患、精神疾患、神経系疾患、内分泌疾患等の全身性疾患の予防又は治療のための皮膚外用剤として有用である。
　また、本発明の皮膚外用剤の投与量及び投与期間は、薬物の種類及び使用量、患者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができる。
　本発明の皮膚外用剤は、薬物の皮膚に対する刺激が低減されており、人体に対する安全性が高く、皮膚を透過して血中等の体内にまで移行しやすく、薬理効果にも優れる。また、優れた生分解性及び生体適合性を備え、更に少量でも薬効を体内で発現させることが期待できる。
　特に、単に皮膚に適用するだけでは所望の薬効を発現させることが困難な薬物であっても、優れた薬理効果を発現させることができ、また、皮膚刺激等の副作用のリスクが高いため外用には適さなかった薬物であっても、優れた薬理効果の発現と副作用のリスクの低減を両立できる。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、実施例における平均粒子径は、評価溶液中の分子集合体濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に分散した試料を用いて、ゼータサイザーナノＳ（マルバーン製）により測定した。また、測定パラメータは、Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ　ＲＩが１．３３０、Ｍａｔｅｒｉａｌ　ＲＩが１．４５（ｐｒｏｔｅｉｎ）及び測定温度が２５．０℃とした。また、データ解析にはＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ．６．３２）を使用した。
［合成例１：ポリサルコシン－ポリ－Ｌ－乳酸（ＰＳａｒ－ＰＬＬＡ）の合成］
　以下の手順に従い、サルコシン－ＮＣＡ（Ｓａｒ－ＮＣＡ）とアミノ化ポリＬ－乳酸（ａ－ＰＬＡ）とから、ポリサルコシン－ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（ＰＳａｒ65－ＰＬＬＡ30）を合成した（スキーム１）。
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　アミノ化ポリＬ－乳酸（３８３ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）とサルコシン－ＮＣＡ（３．２１ｇ，２７．９ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１４０ｍＬ）を加え、室温にて１２時間攪拌した。次いで、反応溶液を０℃に冷却し、グリコール酸（７２ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾル－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（３５７ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（２４５μＬ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間反応させた。
　その後、ロータリーエバポレーターによりＤＭＦを減圧留去し、ＬＨ２０カラムにて精製を行った。ＵＶ２７０ｎｍにてピークが検出されたフラクションを回収・濃縮した。得られた濃縮溶液を０℃にてジエチルエーテル中に滴下し、再沈澱することにより、目的物であるＰＳａｒ65－ＰＬＬＡ30（１．７ｇ）を得た。
［実施例１：ピタバスタチンカルシウムの皮膚刺激性低減効果］
　実施例１では、薬物としてピタバスタチンカルシウムを用い、両親媒性ポリマーミセルに薬物を含有させた皮膚外用剤に関する試験を行った。
［調製例１－１：ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの調製（３５ｎｍ）］
　合成例１で得られたＰＳａｒ65－ＰＬＬＡ30 １００ｍｇ及びピタバスタチンカルシウム２０ｍｇをクロロホルム４０ｍＬに溶解させ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去した。減圧留去後に容器内に形成された薄膜に精製水１０ｍＬを添加し、容器を８５℃湯浴中に２０分間浸漬してミセルを形成させ、０．２μｍＰＴＦＥフィルターを用いてろ過し、ろ液を凍結乾燥させ、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルを得た。
　平均粒子径：３５ｎｍ、薬物含有率：２０質量％、回収率：９０％以上
［調製例１－２：ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの調製（６０ｎｍ）］
　合成例１で得られたＰＳａｒ65－ＰＬＬＡ30 １００ｍｇ、末端をＺ化（ベンジルオキシカルボニル化）したポリ－Ｌ－乳酸（ＰＬＬＡ30－Ｚ）３４ｍｇ及びピタバスタチンカルシウム２０ｍｇをクロロホルム１０ｍＬに溶解させ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去した。減圧留去後に容器内に形成された薄膜に精製水１０ｍＬを添加し、容器を８５℃湯浴中に２０分間浸漬してミセルを形成させ、０．２μｍＰＴＦＥフィルターを用いてろ過し、ろ液を凍結乾燥させ、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルを得た。
　平均粒子径：６０ｎｍ、薬物含有率：１５質量％、回収率：９０％以上
［調製例１－３：ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの調製（３５ｎｍ）］
　ピタバスタチンカルシウムの量を１０ｍｇとした以外は調製例１－１と同様の手順により、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルを得た。
　平均粒子径：３５ｎｍ、薬物含有率：１０質量％、回収率：９０％以上
［調製例１－４：ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの調製（３５ｎｍ）］
　ピタバスタチンカルシウムの量を４０ｍｇとした以外は調製例１－１と同様の手順により、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルを得た。
　平均粒子径：３５ｎｍ、薬物含有率：４０質量％、回収率：９０％以上
［試験例１－１：皮膚刺激性試験］
　投与開始日前日に、電気バリカン及びシェーバーを用いて背部被毛を刈り、皮膚状態を考慮して被験動物（ウサギ）を選択した。２．５ｃｍ四方に裁断したリント布に被検物質として以下の液＜１－Ａ＞～＜１－Ｅ＞を５００μＬずつ含浸させ、油紙で保護した（以下、製剤とする）後、背部皮膚に貼付した。投与は閉鎖塗布とし、製剤塗布後にリント布のずれを防ぐために医療用粘着シートにより覆い、更にサージカルテープを巻いて固定し、動物にはエリザベスカラーを装着した。
　塗布２４時間後にエリザベスカラーを取り外し、生理食塩水（日本薬局方生理食塩液、大塚生食注、株式会社大塚製薬工場製）を浸した脱脂綿で製剤を除去（清拭）し、投与部位の観察終了後、次の塗布操作を行い、連続して１４日間繰り返し投与と観察を実施した。
　上記観察は、紅斑及び痂皮並びに浮腫の所見について肉眼観察にて行い、Ｄｒａｉｚｅ法による皮膚刺激性判定基準に従って、紅斑及び痂皮の評点と浮腫の評点との合計値から皮膚刺激の程度を判定した。紅斑及び痂皮の評点基準と浮腫の評点基準を表１に示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ法により統計解析した試験結果を図１に示す。
　＜１－Ａ＞：調製例１－１で得られたピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの濃度が、ピタバスタチンカルシウム換算で０．５質量％になるように調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜１－Ｂ＞：ピタバスタチンカルシウム（０．５質量％）とマクロゴール４００（９質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液
　＜１－Ｃ＞：ピタバスタチンカルシウム（０．５質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜１－Ｄ＞：合成例１で得られたポリマー（２．５質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜１－Ｅ＞：リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
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　試験例１－１の結果、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセル懸濁液（液１－Ａ）を用いた場合は、ピタバスタチンカルシウム懸濁液（液１－Ｃ）を用いた場合と比較して有意に皮膚刺激スコアが低減していることが確認された。しかも、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセル懸濁液（液１－Ａ）の皮膚刺激スコアは１４日間を通じて１以下に推移しており、意外にも、ピタバスタチンを含まないポリマーミセル懸濁液（液１－Ｄ）とほぼ同程度の推移であった。
　また、マクロゴール４００溶液にピタバスタチンカルシウムを溶解させた溶液（液１－Ｂ）での皮膚刺激性評価の結果では、累積刺激スコアに極端な上昇傾向は認められなかったものの、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセル懸濁液（液１－Ａ）よりも高い皮膚刺激スコアであった。
［試験例１－２：皮膚透過試験（１）］
　ラット腹部皮膚を脱毛処理した後摘出し、これを透過膜とした。横型透過セルに、摘出皮膚の角質側をドナー側として摘出皮膚を固定した。調製例１－１及び１－２で得られたピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセル、並びにコントロールとしてピタバスタチンカルシウムを、ピタバスタチンカルシウムの濃度が０．１質量％になるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁し、これらをドナー溶液として固定したラット摘出皮膚に適用した。レセプター溶液は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍＬとし、実験開始後、経時的にサンプル採取口より０．５ｍＬを採取し、新しいレセプター溶液０．５ｍＬを補充した。採取したサンプル溶液中のピタバスタチン含量をＨＰＬＣ法で測定し、それぞれの製剤におけるピタバスタチンカルシウムのラット皮膚透過量を測定した。試験結果を図２に示す。
［試験例１－３：皮膚透過試験（２）］
　調製例１－１、１－３及び１－４で得られたピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルをそれぞれピタバスタチンカルシウムの濃度が０．１質量％、０．０５質量％及び０．２質量％となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して調製したサンプルを使用し、試験例１－２と同様の方法で皮膚透過性を測定した。結果を図３に示す。
　試験例１－２及び１－３の結果、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルは、皮膚透過性が高いことが確認された。
［試験例１－４：薬効試験］
　投与開始日前日に、電気バリカン及びシェーバーを用いて被験動物（雄性モルモット、Ｓｌｃ：Ｈａｒｔｌｅｙ、７週齢）の背部被毛を刈り、除毛クリーム（エピラット、カネボウ製）にて除毛した。各被験動物の除毛部位を液ダレ防止のためテープ付スポンジパッキング（３．５ｃｍ×３．５ｃｍ×０．５ｃｍ、アシヤパッキング製作所製）で覆い、内側にくり抜かれた２．５ｃｍ×２．５ｃｍ部分に以下の液＜４－Ａ＞～＜４－Ｅ＞を５００μＬずつ適用した。投与液は塗布部位に馴染ませた後、２．５ｃｍ四方に裁断したリント布で吸水させた（以下、製剤とする）。投与は閉鎖塗布とし、吸水させたリント布の上にシリコンシートを３枚重ねて医療用サージカルテープ及び伸縮性包帯で固定した。塗布２４時間後に生理食塩水（日本薬局方生理食塩液、大塚生食注、株式会社大塚製薬工場製）を浸した脱脂綿で製剤を除去（清拭）した。投与部位の観察終了後、次の塗布操作を行い１０日間連続塗布した。尚、開始５日目に塗布部位以外を、スポンジ枠型の接着性の維持のため除毛クリームによって除毛した。
　投与開始０日目と１０日目に約２．５ｍＬ採血し、３３００ｒｐｍ、４℃の条件で１５分遠心分離を行うことで血漿を得て、得られた血漿について日立自動分析装置（ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ００３）にて総コレステロール量（ＴＣ）、ＨＤＬコレステロール量（ＨＤＬ－Ｃ）、ＬＤＬコレステロール量（ＬＤＬ－Ｃ）及びリン脂質量（ＰＬ）を測定した。その結果を図４－１～４－４に示す。
　＜４－Ａ＞：調製例１－１で得られたピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの濃度が、ピタバスタチンカルシウム換算で０．１質量％になるように調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜４－Ｂ＞：調製例１－１で得られたピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの濃度が、ピタバスタチンカルシウム換算で０．５質量％になるように調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜４－Ｃ＞：ピタバスタチンカルシウム（０．１質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜４－Ｄ＞：ピタバスタチンカルシウム（０．５質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜４－Ｅ＞：リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　図４－１～４－４に示す試験結果から、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセル懸濁液（液４－Ａ及び４－Ｂ）は、総コレステロール量、ＨＤＬコレステロール量、ＬＤＬコレステロール量及びリン脂質量をいずれも低減させることがわかる。
　また、図４－１及び図４－３に示すとおり、ピタバスタチンカルシウム（０．１質量％）含有ポリマーミセル懸濁液（液４－Ａ）を用いた場合には、ピタバスタチンカルシウムを０．１質量％含むリン酸緩衝液（液４－Ｃ）を用いた場合と同程度にまで総コレステロール量及びＬＤＬコレステロール量が低減された。また、図４－１、図４－３及び図４－４に示すとおり、ピタバスタチンカルシウム（０．５質量％）含有ポリマーミセル（液４－Ｂ）を用いた場合には、ピタバスタチンカルシウムを０．５質量％含むリン酸緩衝液（液４－Ｄ）を用いた場合よりも、総コレステロール量、ＬＤＬコレステロール量及びリン脂質量が低減された。
［試験例１－５：三次元皮膚モデルを用いた刺激性試験］
　試験物質として以下の＜５－Ａ＞～＜５－Ｇ＞を用い、ＯＥＣＤ承認の皮膚刺激性試験専用キット（クラボウ製　品番：EPI-212SIT）により、ＯＥＣＤ ＴＧ４３９（In Vitro 皮膚刺激試験）に従って、以下の手順で表皮への試験物質の暴露及び刺激性評価を実施した。
　一晩プレインキュベーションしておいたキット表皮の角層側に試験物質を３０μＬ添加し、ピンセットでナイロンメッシュを置くことにより角層に試験物質を暴露した。試験物質が固体の場合（下記＜５－Ｅ＞）は、２５μＬのＤＰＢＳを角層に添加し，直後に固体物質２５ｍｇを角層に添加することにより、角層への試験物質の暴露を行った。６０分後に洗浄を行い、試験物質を完全に除去してから、４２時間のポストインキュベーションンを行った。ポストインキュベーションの途中、２４時間経過後に１回の培地交換を行った。ポストインキュベーション後、ＭＴＴアッセイキット（クラボウ製　品番：MTT-100-JP）を用い、ＭＴＴ溶液で３時間反応し、ミトコンドリア代謝により産生されたホルマザン色素を抽出し、ＯＤ値を測定した。測定結果に基づき、陰性対照（下記＜５－Ｇ＞）に対する相対生存率を算出した。試験結果を図５に示す。
　＜５－Ａ＞：調製例１－１で得られた、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの濃度がピタバスタチンカルシウム換算で０．５質量％になるように調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜５－Ｂ＞：調製例１－１で得られた、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルの濃度がピタバスタチンカルシウム換算で１．０質量％になるように調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜５－Ｃ＞：ピタバスタチンカルシウム（０．５質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜５－Ｄ＞：ピタバスタチンカルシウム（１．０質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液
　＜５－Ｅ＞：ピタバスタチンカルシウム原薬（粉体）
　＜５－Ｆ＞：５％ＳＤＳ溶液；陽性対照
　＜５－Ｇ＞：ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）；陰性対照
　図５に示す試験結果から、三次元皮膚モデルを用いた試験では、ピタバスタチンカルシウムの適用濃度依存的に相対生存率が低下し、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルを適用することにより、相対生存率が上昇することが確認された。これらの結果は、ウサギ累積刺激性評価（上記試験例１－１）の結果と同様であり、三次元皮膚モデルによる刺激性評価試験が、動物実験の結果を再現しており、ポリマーミセルに薬物を含有させることによる皮膚刺激性低減効果が、細胞系にて示唆された。
［試験例１－６：三次元皮膚モデルを用いた皮膚透過試験］
　自動サンプリング機能付き経皮吸収試験装置（コスメディ製薬製 TransView）の縦型透過セルに、培養皮膚モデル（クラボウ製　品番：EPI-606X；バリア能亢進 吸収試験推奨品）の角層側をドナー側として固定した。ドナー溶液として、上記＜５－Ａ：ピタバスタチンカルシウム換算で０．５質量％になるように調製したピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液＞及び＜５－Ｃ：ピタバスタチンカルシウム（０．５質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）懸濁液＞１．５ｍＬを適用し、レセプター液にはリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を使用した。２，４，６，８，１０，１２時間後に、レセプター溶液０．８ｍＬを採取し，新たにレセプター溶液０．８ｍＬを補充した。採取したレセプター溶液中の薬物含量をＨＰＬＣ法により測定した。試験開始後レセプター溶液採取までの時間と薬物の累積透過量との関係をプロットした結果を図６に示す。
　試験例１－６の結果、三次元皮膚モデルにおいても、ラット腹部皮膚を用いた試験（上記試験例１－２及び１－３）と同様に、ピタバスタチンカルシウム含有ポリマーミセルが高い皮膚透過性を示すことが確認された。また、図６に示す結果から、ピタバスタチン含有ポリマーミセルは、ピタバスタチンカルシウムを単独で適用した場合と、皮膚透過性に差異がないことが分かる。以上の結果から、モルモット薬効試験（上記試験例１－４）において、ピタバスタチン含有ポリマーミセルが、ピタバスタチンカルシウムを単独で用いた場合と同等あるいは同等以上の薬効を示したのは、両者が同等の皮膚透過性を有することに起因すると考えられる。
［実施例２：リバスチグミンの皮膚刺激性低減効果］
　実施例２では、薬物としてアルツハイマー型認知症治療薬であるリバスチグミンを用い、両親媒性ポリマーミセルと薬物とを混合した皮膚外用剤に関する試験を行った。
［調製例２－１：薬物を含まないポリマーミセルの調製］
　合成例１で得られたＰＳａｒ65－ＰＬＬＡ30 １００ｍｇをクロロホルム４０ｍＬに溶解させ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去した。減圧留去後に容器内に形成された薄膜に精製水１０ｍＬを添加し、容器を８５℃湯浴中に２０分間浸漬してミセルを形成させ、０．２μｍＰＴＦＥフィルターを用いてろ過し、ろ液を凍結乾燥させ、ポリマーミセルを得た。
　平均粒子径：３５ｎｍ、薬物含有率：０、回収率：９０％以上
［調製例２－２：ポリマーミセルと薬物との混合液の調製（１）］
　ミスチリン酸イソプロピル（ＩＰＭ）にリバスチグミンを添加して、２０質量％の溶液を調製した（下記１－Ａ）。この溶液に、上記調製例２－１で得られたで得られたポリマーミセルを、濃度が１質量％（下記１－Ｂ）又は３質量％（下記１－Ｃ）となるように添加して、リバスチグミン溶液中にポリマーミセルが分散した懸濁液を調製した。
［調製例２－３：ポリマーミセルと薬物との混合液の調製（２）］
　オイル状のリバスチグミン原液（下記２－Ａ）に、上記調製例２－１で得られたポリマーミセルを添加して、分散性を確認したところ、リバスチグミン原液に対するポリマーミセルの添加量が１０質量％以内の場合に、ポリマーミセルが均一に分散した懸濁液が得られた。本調製例では、リバスチグミン原液に対して、調製例２－１で得られたポリマーミセルを、濃度が１質量％（下記２－Ｂ）、３質量％（下記２－Ｃ）、又は１０質量％（下記２－Ｄ）となるように添加して、リバスチグミン原液中にポリマーミセルが分散した懸濁液を調製した。
［試験例２－１：三次元皮膚モデルを用いた刺激性試験（１）］
　試験物質として以下の＜１－Ａ＞～＜１－Ｅ＞を用い、前述の試験例１－５と同様の手法で、皮膚刺激性試験専用キットによる表皮への試験物質の暴露及び刺激性評価を実施した。陰性対照に対する相対生存率を図７－１に示す。
　＜１－Ａ＞：２０％リバスチグミンＩＰＭ溶液
　＜１－Ｂ＞：調製例２－２で得られた、２０％リバスチグミンＩＰＭ溶液 １％ポリマーミセル懸濁液
　＜１－Ｃ＞：調製例２－２で得られた、２０％リバスチグミンＩＰＭ溶液 ３％ポリマーミセル懸濁液
　＜１－Ｄ＞：５％ＳＤＳ溶液；陽性対照
　＜１－Ｅ＞：ＤＰＢＳ；陰性対照
［試験例２－２：三次元皮膚モデルを用いた刺激性試験（２）］
　試験物質として以下の＜２－Ａ＞～＜２－Ｆ＞を用い、前述の試験例１－５と同様の手法で、皮膚刺激性試験専用キットによる表皮への試験物質の暴露及び刺激性評価を実施した。陰性対照に対する相対生存率を図７－２に示す。
　＜２－Ａ＞：リバスチグミン原液
　＜２－Ｂ＞：調製例２－３で得られた、リバスチグミン １％ポリマーミセル懸濁液
　＜２－Ｃ＞：調製例２－３で得られた、リバスチグミン ３％ポリマーミセル懸濁液
　＜２－Ｄ＞：調製例２－４で得られた、リバスチグミン １０％ポリマーミセル懸濁液
　＜２－Ｅ＞：５％ＳＤＳ溶液；陽性対照
　＜２－Ｆ＞：ＤＰＢＳ；陰性対照
　試験例２－１及び２－２の結果、リバスチグミン溶液及びリバスチグミン原液のいずれにおいても、ポリマーミセルの添加量増大に伴って相対生存率が上昇していた。これらの結果からポリマーミセルに薬物を含有させた場合（上記実施例１）と同様に、ポリマーミセルと薬物との混合系においても、薬物による皮膚刺激性が低減することが確認された。すなわち、薬物を内包していないポリマーミセルは、薬物との併用により皮膚刺激低減剤として作用し、ポリマーミセルと薬物とを混合状態で併存させることにより、皮膚刺激性が低減された皮膚外用剤が得られることが分かる。
［試験例２－３：三次元皮膚モデルを用いた皮膚透過試験］
　２０質量％リバスチグミンＩＰＭ懸濁、及び２質量％のポリマーミセルを添加した２０質量％リバスチグミンＩＭＰ懸濁液をドナー溶液として、上記試験例１－６と同様の手法で、皮膚透過試験を実施した。コントロールとして、リバスチグミンを薬効成分とする市販の皮膚外用貼付剤（ノバルティスファーマ製　イクセロンパッチ１８ｍｇ；１．３ｃｍφ（面積：１．３３ｃｍ２））を、培養皮膚モデルの角層側に貼付し、皮膚透過試験を実施した。試験開始後レセプター溶液採取までの時間と薬物の累積透過量との関係をプロットした結果を図８に示す。
　図８に示す結果から、ポリマーミセル添加リバスチグミン溶液は、ポリマーミセルを添加していないリバスチグミン溶液に比べると皮膚透過性が若干低下する傾向が認められたが、市販の皮膚外用貼付剤に比べて十分に高い皮膚透過性を示し、皮膚外用剤として有用であることが確認された。
［実施例３：メマンチンの皮膚刺激性低減効果］
　実施例３では、薬物としてアルツハイマー型認知症治療薬であるメマンチン塩酸塩を用い、両親媒性ポリマーミセルに薬物を含有させた皮膚外用剤、及び皮膚刺激低減剤としての両親媒性ポリマーミセルを皮膚に接触後に薬物を適用する形態に関する試験を行った。
［調製例３－１：メマンチン含有ポリマーミセルの調製（５２ｎｍ）］
　合成例１で得られたＰＳａｒ65－ＰＬＬＡ30 １００ｍｇ及びメマンチン塩酸塩１００ｍｇをクロロホルム５０ｍＬに溶解させ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去した。減圧留去後に容器内に形成された薄膜に精製水１００ｍＬを添加し、容器を８５℃湯浴中に２０分間浸漬してミセルを形成させ、凍結乾燥させて、メマンチン塩酸塩含有ポリマーミセルを得た。
　平均粒子径：５２ｎｍ、薬物含有率：１００質量％、回収率：９０％以上
［試験例３－１：三次元皮膚モデルを用いた皮膚刺激性試験］
　ＯＥＣＤ承認の皮膚刺激性試験専用キット（クラボウ製　品番：EPI-200SIT）を用い、前述の試験例１－５と同様の手法で、表皮に対して、下記＜Ａ＞～＜Ｅ＞の水準で試験物質の暴露を行い、刺激性評価を実施した。陰性対照に対する相対生存率を図９に示す。
　＜Ａ＞：２５μＬのＤＰＢＳを角層に添加し，直後にメマンチン塩酸塩（固体）１ｍｇを角層に添加
　＜Ｂ＞：２５μＬのＤＰＢＳを角層に添加し，直後に調製例３－１で得られた薬物含有ポリマーミセル２ｍｇ（薬物１ｍｇ相当）を角層に添加
　＜Ｃ＞：２５μＬのＤＰＢＳを角層に添加し，直後に調製例２－１で得られた薬物を含まないポリマーミセル５ｍｇを角層に添加し、その後さらにメマンチン塩酸塩（固体）１ｍｇを角層に添加
　＜Ｄ＞：２５μＬのＤＰＢＳを角層に添加し，直後に調製例２－１で得られた薬物を含まないポリマーミセル２５ｍｇを角層に添加し、その後さらにメマンチン塩酸塩（固体）１ｍｇを角層に添加
　＜Ｅ＞：５％ＳＤＳ溶液を角層に添加；陽性対照
　＜Ｆ＞：ＤＰＢＳを角層に添加；陰性対照
　図９に示すように、＜Ｂ＞：メマンチンを含有させた薬物含有ポリマーミセルは、＜Ａ＞：メマンチンを単独で使用した場合に比べて、相対生存率が大幅に上昇していた。また、＜Ｃ＞及び＜Ｄ＞：ポリマーミセルを適用後にメマンチンを適用した場合も、＜Ａ＞：メマンチンを単独で使用した場合に比べて、相対生存率が大幅に上昇しており、皮膚刺激低減効果が確認された。これらの結果から、薬物の適用に先立ってポリマーミセルを適用することにより、ポリマーミセルが皮膚刺激低減剤として作用することが分かる。
［試験例３－２：ＥＬＩＳＡによるＩＬ－１α産生量の定量］
　上記試験例３－１の水準Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆにおいて、ポストインキュベーション開始から２４時間後の培地上清を採取し、市販のインターロイキン（ＩＬ）－１α　ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）キットにより、培地上清中のＩＬ－１α含有量（産生量）の測定を行った。なお、ＩＬ－１αは、皮膚が刺激を受けた際に産生されるサイトカインの１種である。測定結果を、相対生存率と共に、図１０に示す。
　図１０に示すように、刺激性試験における相対生存率が高い試料ほど、ＩＬ－１αの産生量が小さい結果が得られた。これらの結果から、皮膚刺激メカニズムの観点からも、ポリマーミセルを用いることによる、皮膚刺激性低減効果が確認された。

Claims (13)

  1. 　薬物とナノメートルサイズの分子集合体を含有し、
    　前記分子集合体が、サルコシンに由来する構造単位を有する親水性ブロック鎖とヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックコポリマーを含む、皮膚外用剤。
  2. 　前記親水性ブロック鎖が、サルコシンに由来する構造単位を２０個以上有する親水性ブロック鎖である請求項１に記載の皮膚外用剤。
  3. 　前記疎水性ブロック鎖が、ヒドロキシ酸に由来する構造単位を１０個以上有する疎水性ブロック鎖である請求項１又は２に記載の皮膚外用剤。
  4. 　前記ヒドロキシ酸が、脂肪族ヒドロキシ酸である請求項１～３のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  5. 　前記分子集合体が、平均粒子径１０～３００ｎｍの粒子である請求項１～４のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  6. 　前記薬物が、スタチンである請求項１～５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  7. 　前記薬物が、アルツハイマー型認知症治療薬である請求項１～５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  8. 　前記分子集合体が、疎水性ポリマーをさらに含有するものである請求項１～７のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  9. 　前記分子集合体が、前記薬物を含有する請求項１～８のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  10. 　前記分子集合体と前記薬物とが混合状態で併存している請求項１～８のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  11. 　前記分子集合体を含有する領域と、前記薬物を含有する領域とを含む請求項１～８のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
  12. 　薬物を含有する皮膚外用剤中の前記薬物による皮膚刺激を低減するために使用される皮膚刺激低減剤であって、
    　サルコシンに由来する構造単位を有する親水性ブロック鎖とヒドロキシ酸に由来する構造単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックコポリマーを含有する皮膚刺激低減剤。
  13. 　前記両親媒性ブロックコポリマーが、ナノメートルサイズの分子集合体を形成している請求項１２に記載の皮膚刺激低減剤。

     
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