CN110845445A - 一种连接体及制备方法和应用、基于沙利度胺的PROTACs的中间体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机化合物合成技术领域，尤其涉及一种连接体及制备方法和应用、基于沙利度胺的PROTACs的中间体及应用。本发明提供的双功能小分子PROTACs的连接体用于制备基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体，所得中间体包括基于沙利度胺分子的结构和连接体基团结构，能够成功实现将沙利度胺与多种靶蛋白识别配体相连，为基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs新药下一步的合成提供了便利。本发明提供的基于沙利度胺的PROTACs的中间体的制备方法，反应条件温和、合成简便高效。
Description
技术领域
本发明涉及有机化合物合成技术领域，尤其涉及一种连接体及制备方法和应用、基于沙利度胺的PROTACs的中间体及应用。
背景技术
蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimerias，PROTACs)是近些年的一种新型抗肿瘤技术，能够选择性诱导蛋白降解。PROTACs是一种杂合双功能小分子化合物,其分子结构由靶蛋白识别配体(A)、连接体(L)和E3连接酶配体(B)三部分组成。PROTACs通过将靶蛋白和E3泛素连接酶拉近，利用泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasomepathway，UPP)特异性的降解靶蛋白。UPP由泛素分子(Ubiquitin,Ub)、26S蛋白酶体、泛素激活酶E1、泛素转移酶E2和泛素连接酶E3组成(Li W.；Ye Y.Polyubiquitin chains:functions,structures,and mechanisms.Cell Mol.Life Sci.2008,65(15):2397-2406.)，具体的PROTACs降解蛋白机制如图1所示。
沙利度胺(Thalidomide)为谷氨酸衍生物，具有镇静止痛、免疫调节及抗炎、抑制血管生成及抗肿瘤作用。一些细胞因子如血管内皮生长因子和成纤维细胞因子，均是血管生成的刺激剂，它们和特异性受体结合刺激信号转导，引起内皮细胞的增殖。沙利度胺能够减少这些因子的分泌，从而抑制血管。肿瘤的转移和细胞的恶变与肿瘤细胞和血管内皮细胞的粘连、血管的生成有关。沙利度胺不仅能够抑制血管生成，而且能减少整合素亚基的合成，这也是其抗肿瘤的机制之一。此外，沙利度胺还能通过COX-2途径而非抑制血管生成的途径来降低瘤内微血管密度，从而抗肿瘤增生。
目前，将沙利度胺与多种靶蛋白识别配体通过连接体(L)相连合成基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs仍然困难重重，而且，主要是由于PROTACs中间体的合成条件不够温和、合成方法不简便、收率一般(Li Y,Yang J,Aguilar A,et al.Discovery of MD-224as a first-in-class,highly potent,and efficacious proteolysis targetingchimera murine double minute 2degrader capable of achieving complete anddurable tumor regression[J].Journal of medicinal chemistry,2018,62(2):448-466.Qiu X,Sun N,Kong Y,et al.Chemoselective Synthesis of Lenalidomide-BasedPROTAC Library Using Alkylation Reaction[J].Organic letters,2019,21(10):3838-3841.)，导致新药PROTAC的合成发展缓慢。基于此，开发一种基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体(B-L)的合成方法刻不容缓。
发明内容
本发明的目的在于提供一种连接体及制备方法和应用、基于沙利度胺的PROTACs的中间体及应用，该中间体能够成功实现将沙利度胺与多种靶蛋白识别配体通过其连接体相连。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种双功能小分子PROTACs的连接体，具有式I或式II所示结构；
式I所示结构连接体为Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮，式II所示结构连接体为叠氮基类哌嗪-1-烷基酮，式I和式II中，n为碳链长度，n＝1～12。
优选的，所述连接体包括
本发明提供了上述技术方案所述双功能小分子PROTACs的连接体的制备方法，包括以下步骤：
当所述连接体为式I所示结构的Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮时，所述连接体的制备方法包括以下步骤：
将Boc保护的氨基酸、DMF、苄基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体；
将所述第一中间体、乙醇和钯碳催化剂混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体；
所述Boc保护的氨基酸具有式III所示结构：
所述苄基哌嗪-1-羧酸酯具有式IV所示结构：
当所述连接体为式II所示结构的叠氮基类哌嗪-1-烷基酮时，所述连接体的制备方法包括以下步骤：
将叠氮基类有机酸、DMF、叔丁基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体；
将所述第一中间体和TFA-CH2Cl2溶液混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体；
所述叠氮基类有机酸具有式V所示结构：
所述叔丁基哌嗪-1-羧酸酯具有式VI所示结构：
本发明提供了上述技术方案所述双功能小分子PROTACs的连接体在制备基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体中的应用，所述制备的方法，包括以下步骤：
将2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮、连接体、铜催化剂、N,N-二异丙基乙胺和有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs类的中间体；所述连接体为上述技术方案所述双功能小分子PROTACs的连接体。
优选的，所述铜催化剂包括CuCl、CuCl2、CuI、CuOAc、[Cu(OH)TMED]2Cl2或Cu-Al2O3。
优选的，所述有机溶剂包括NMP、THF、甲苯、DMSO或DMF。
优选的，所述2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮、连接体、铜催化剂、N,N-二异丙基乙胺和有机溶剂的用量比为18～22mmol:20～25mmol:1～2.5mmol:1～2.5mmol:70～80mL。
优选的，所述亲核取代反应的温度为40～60℃，时间为8～24h。
一种基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体，具有式VII所示结构：
其中，所述R包括：
本发明提供了上述技术方案所述基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体在合成及药物化学领域中的应用。
本发明提供了一种双功能小分子PROTACs的连接体，将该连接体用于制备基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体，所得中间体包括基于沙利度胺分子的结构和连接体基团结构，所述连接体基团结构的尾端为叠氮基团和氨基基团，容易与多种靶蛋白配体连接，从而能够成功实现将沙利度胺与多种靶蛋白识别配体相连，为基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs新药下一步的合成提供了便利。
本发明在铜催化剂作用下制备所述基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体，所用铜催化剂廉价易得，反应条件温和、合成简便高效。
附图说明
图1为背景技术中PROTACs降解蛋白机制原理图。
具体实施方式
本发明提供了一种双功能小分子PROTACs的连接体，具有式I或式II所示结构；
式I所示结构连接体为Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮，式II所示结构连接体为叠氮基类哌嗪-1-烷基酮，式I和式II中，n为碳链长度，n＝1～12。
在本发明中，所述n更优选为2～7。
在本发明中，所述连接体优选包括
本发明提供了上述技术方案所述双功能小分子PROTACs的连接体的制备方法，包括以下步骤：
当所述连接体为式I所示结构的Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮时，所述连接体的制备方法包括以下步骤：
将Boc保护的氨基酸、DMF、苄基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体；
将所述第一中间体、乙醇和钯碳催化剂混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体；
所述Boc保护的氨基酸具有式III所示结构：
所述苄基哌嗪-1-羧酸酯具有式IV所示结构：
当所述连接体为式II所示结构的叠氮基类哌嗪-1-烷基酮时，所述连接体的制备方法包括以下步骤：
将叠氮基类有机酸、DMF、叔丁基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体；
将所述第一中间体和TFA-CH2Cl2溶液混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体；
所述叠氮基类有机酸具有式V所示结构：
所述叔丁基哌嗪-1-羧酸酯具有式VI所示结构：
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
当所述连接体为式I所示结构的Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮时，本发明将Boc保护的氨基酸、DMF、苄基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体。在本发明中，所述Boc保护的氨基酸、DMF、苄基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑(CDI)的用量比优选为40mmol:100mL:48mmol:40mmol。在本发明中，所述CDI作为碳酰化试剂。
在本发明中，所述混合的过程优选为先将Boc保护的氨基酸溶于DMF，再加入CDI，室温搅拌2h，然后向所得混合物中加入苄基哌嗪-1-羧酸酯。在本发明中，所述第一反应的温度优选为室温，所述第一反应的时间优选为17h。本发明优选在搅拌条件下进行所述第一反应，本发明对所述搅拌的过程没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程能够保证反应顺利进行即可。
完成所述第一反应后，本发明优选将所得物料用饱和NaHCO3溶液、HCl溶液和盐水将有机层分离清洗，然后EA萃取，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1～10/1)洗脱，得到第一中间体。
得到第一中间体后，本发明将所述第一中间体、乙醇和钯碳催化剂混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体。在本发明中，所述乙醇优选为无水乙醇，所述钯碳催化剂(Pd/C)的质量浓度优选为10％；所述第一中间体、乙醇溶液和钯碳催化剂的用量比优选为20mmol:170mL:1.0g。在本发明中，所述去保护优选在N2气氛保护下及H2存在条件下进行，所述H2的压强优选为1atm，所述去保护的温度优选为室温，时间优选为5h，所述去保护优选在搅拌条件下进行，本发明对所述搅拌的过程没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程能够保证反应顺利进行即可。
完成所述去保护后，本发明优选将所得反应液进行过滤浓缩，得到双功能小分子PROTACs的连接体。本发明对所述过滤浓缩的过程没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程即可。
当所述连接体为式II所示结构的叠氮基类哌嗪-1-烷基酮时，本发明将叠氮基类有机酸、DMF、叔丁基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体。在本发明中，所述叠氮基类有机酸、DMF、叔丁基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑(CDI)的用量比优选为40mmol:100mL:48mmol:40mmol。在本发明中，所述CDI作为碳酰化试剂。
在本发明中，所述混合的过程优选为先将叠氮基类有机酸溶于DMF，再加入CDI，室温搅拌2h，然后向所得混合物中加入叔丁基哌嗪-1-羧酸酯。在本发明中，所述第一反应的温度优选为室温，所述第一反应的时间优选为17h。本发明优选在搅拌条件下进行所述第一反应，本发明对所述搅拌的过程没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程能够保证反应顺利进行即可。
完成所述第一反应后，本发明优选将所得物料用饱和NaHCO3溶液、HCl溶液和盐水将有机层分离清洗，然后EA萃取，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1～10/1)洗脱，得到第一中间体。
得到第一中间体后，本发明将所述第一中间体和TFA-CH2Cl2溶液混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体。在本发明中，所述TFA/CH2Cl2的体积分数优选为20％(V/V)。在本发明中，所述去保护的温度优选为室温，时间优选为1h。
完成所述去保护后，本发明优选将所得物料冷却至室温，水相由二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1～10/1)洗脱，得到双功能小分子PROTACs的连接体。
本发明提供了上述技术方案所述双功能小分子PROTACs的连接体在制备基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体中的应用，所述制备的方法，包括以下步骤：
将2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮、连接体、铜催化剂、N,N-二异丙基乙胺和有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs类的中间体；所述连接体为上述技术方案所述双功能小分子PROTACs的连接体。
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮、连接体、铜催化剂、N,N-二异丙基乙胺和有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs类的中间体。在本发明中，所述铜催化剂优选包括CuCl、CuCl2、CuI、CuOAc、[Cu(OH)TMED]2Cl2或Cu-Al2O3，更优选为CuI。在本发明中，所述有机溶剂优选包括NMP、THF、甲苯、DMSO或DMF，更优选为NMP。在本发明中，所述N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)能够促进亲核取代反应顺利进行。在本发明中，所述2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮、连接体、铜催化剂、N,N-二异丙基乙胺和有机溶剂的用量比优选为20mmol:22mmol:2mmol:2mmol:72mL。本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程即可。
在本发明中，所述亲核取代反应的温度优选为40～60℃，更优选为45～55℃，时间优选为8～24h，更优选为12～18。
当所述连接体为式I所示结构的Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮时，完成所述亲核取代反应后，本发明优选将所得反应体系冷却至室温，水相采用乙酸乙酯提取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，由乙酸乙酯正己烷重结晶，得到中间体化合物，将所述中间体化合物溶解于TFA/CH2Cl2(20％(V/V))中，将反应所得混合物室温搅拌1h，反应结束后，所得反应液用饱和Na2CO3溶液处理至pH值为9，然后二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1-10/1)洗脱，得到目标产物--基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs类的中间体(如I-1所示结构)。
本发明采用Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮作为原料进行中间体的合成，能够避免生成副产物。本发明利用TFA/CH2Cl2去除氨基保护的Boc，得到目标产物。
当所述连接体为式I所示结构的Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮时，所述亲核取代反应的过程为：
当所述连接体为式II所示结构的叠氮基类哌嗪-1-烷基酮时，完成所述亲核取代反应后，本发明优选将所得反应液降至室温，水相由乙酸乙酯提取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，由乙酸乙酯正己烷重结晶，得到目标产物--基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs类的中间体(如I-2所示结构)。
当所述连接体为式II所示结构的叠氮基类哌嗪-1-烷基酮时，所述亲核取代反应的过程为：
本发明提供了一种基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体，具有式VII所示结构：
其中，所述R包括：
本发明提供了上述技术方案所述基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体在合成及药物化学领域中的应用。本发明对将所述基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体用于合成及药物化学领域的方法没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的方法即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，NMR测定采用ACF-400BRUK型核磁共振仪，测定溶剂为氘代氯仿(CDCl3)或氘代二甲亚砜(DMSO-D6)，TMS为内标。柱层析采用200～300目硅胶(青岛海洋化工厂生产)。
实施例1
1)叔丁基(3-氧-3-(哌嗪-1-基)丙基)氨基甲酸酯的合成：
将3-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸(Boc保护的氨基酸，7.6g，40mmol,1.0eq)溶于DMF(100mL)中,再加入CDI(6.5g，40mmol,1.0eq)，室温搅拌2h，然后加入苄基哌嗪-1-羧酸酯(10.6g，48mmol，1.2eq)继续搅拌反应17h，用饱和NaHCO3溶液(2×150mL)、1N HCl溶液(150mL)和盐水(150mL)将有机层分离清洗，EA萃取，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1)洗脱，得到第一中间体(9.4g)，收率：60％。
所述第一中间体的核磁数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44-7.07(m,5H),5.53-5.31(m,2H),3.81-3.58(m,4H),3.54-3.14(m,7H),2.68-2.40(m,2H),1.71-1.33(m,9H).
将所述第一中间体(7.8g，20mmol)溶于170mL乙醇溶液中，在N2气氛保护下，加入1.0g 10％的Pd/C，所得反应混合物在H2(1atm)下室温搅拌5h，反应液过滤浓缩，得到叔丁基(3-氧-3-(哌嗪-1-基)丙基)氨基甲酸酯(4.6g)。收率：90％。
所述叔丁基(3-氧-3-(哌嗪-1-基)丙基)氨基甲酸酯的核磁数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.81-3.65(m,2H),3.45(d,J＝25.3Hz,2H),3.35-3.16(m,3H),3.00-2.73(m,4H),2.63-2.36(m,2H),1.65-1.46(m,9H),1.28(s,1H).
2)4-(4-(3-氨基丙酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-1-a)的合成：
在烧瓶中加入叔丁基(3-氧-3-(哌嗪-1-基)丙基)氨基甲酸酯(连接体，n＝2，5.7g，22mmol，1.1eq)、2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(5.6g，20mmol，1.0eq)和DIPEA(10.5mL，2.0mmol，2.0eq)，溶于NMP(72mL,0.2M)，加入铜催化剂CuI(0.38g，2mmol，0.1eq)，升温至50℃搅拌过夜反应(12h)，反应结束后，将所得体系冷却至室温，水相由乙酸乙酯提取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，由乙酸乙酯正己烷重结晶，得到中间体化合物(叔丁基(3-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)哌嗪-1-基)-3-丙酰)氨基甲酸酯)，将该中间体化合物(7.2g,14mmol)溶解于20％(V/V)TFA/CH2Cl2(50mL)中，所得混合物在室温搅拌1h，所得反应液用饱和Na2CO3溶液处理至pH值为9；然后将所得体系用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1)洗脱，得到化合物I-1-a(5.2g)，收率：90％。
对实施例1制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.42(s,1H),7.22(s,1H),7.00(s,1H),4.44(s,1H),3.97-3.67(m,4H),3.65-3.51(m,2H),3.48-3.36(m,2H),3.05-2.90(m,2H),2.78(s,1H),2.69-2.28(m,5H),1.27-1.02(m,2H)。
实施例2
1)叔丁基(4-氧-4-(哌嗪-1-基)丁基)氨基甲酸酯的合成：
按照实施例1所述方法和比例，区别仅在于所述Boc保护的氨基酸为4-(叔丁氧羰基)氨基)丁酸；
2)制备4-(4-(4-氨基丁酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-1-b)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例1，区别仅在于：反应原料中连接体为叔丁基(4-氧-4-(哌嗪-1-基)丁基)氨基甲酸酯，即连接体中n＝3。
对实施例2制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.54-6.88(m,3H),4.44(s,1H),3.92-3.54(m,6H),3.50-3.29(m,2H),2.89-2.27(m,8H),2.05-1.74(m,2H),1.31-0.98(m,2H)。
实施例3
1)叔丁基(5-氧-5-(哌嗪-1-基)戊基)氨基甲酸酯的合成：
按照实施例1所述方法和比例，区别仅在于所述Boc保护的氨基酸为5-(叔丁氧羰基)氨基)戊酸；
2)制备4-(4-(5-氨基戊酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-1-c)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例1，区别仅在于：反应原料中连接体为叔丁基(5-氧-5-(哌嗪-1-基)戊基)氨基甲酸酯，即连接体中n＝4。
对实施例3制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.59-6.90(m,3H),4.44(s,1H),3.97-3.29(m,8H),2.91-2.20(m,8H),1.78-1.41(m,4H),1.23-0.98(m,2H)。
实施例4
1)叔丁基(6-氧-6-(哌嗪-1-基)己基)氨基甲酸酯的合成：
按照实施例1所述方法和比例，区别仅在于所述Boc保护的氨基酸为6-(叔丁氧羰基)氨基)己酸；
2)制备4-(4-(6-氨基己酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-1-d)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例1，区别仅在于：反应原料中连接体为叔丁基(6-氧-6-(哌嗪-1-基)己基)氨基甲酸酯，即连接体中n＝5。
对实施例4制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.59-6.85(m,3H),4.44(s,1H),3.97-3.25(m,8H),2.91-2.23(m,8H),1.71-1.23(m,6H),1.18-0.95(m,2H)。
实施例5
1)叔丁基(7-氧-7-(哌嗪-1-基)庚基)氨基甲酸酯的合成：
按照实施例1所述方法和比例，区别仅在于所述Boc保护的氨基酸为7-(叔丁氧羰基)氨基)庚酸；
2)制备4-(4-(7-氨基庚酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-1-e)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例1，区别仅在于：反应原料中连接体为叔丁基(7-氧-7-(哌嗪-1-基)庚基)氨基甲酸酯，即连接体中n＝6。
对实施例5制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.56-6.85(m,3H),4.44(s,1H),3.92-3.32(m,8H),2.91-2.23(m,8H),1.74-1.22(m,8H),1.18-0.95(m,2H)。
实施例6
1)叔丁基(8-氧-8-(哌嗪-1-基)辛基)氨基甲酸酯的合成：
按照实施例1所述方法和比例，区别仅在于所述Boc保护的氨基酸为8-(叔丁氧羰基)氨基)辛酸；
2)制备4-(4-(8-氨基辛酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-1-f)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例1，区别仅在于：反应原料中连接体为叔丁基(8-氧-8-(哌嗪-1-基)辛基)氨基甲酸酯，即连接体中n＝7。
对实施例6制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.60-6.82(m,3H),4.44(s,1H),3.90-3.25(m,8H),2.95-2.24(m,8H),1.74-1.21(m,10H),1.15-0.98(m,2H)。
实施例7
1)3-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)丙烷-1-酮的合成：
将叠氮基丙酸(4.6g，40mmol,1.0eq)溶于DMF(100mL)中,再加入CDI(6.5g，40mmol,1.0eq)，室温搅拌2h；然后再加入叔丁基哌嗪-1-羧酸酯(8.9g，48mmol，1.2eq)继续搅拌反应17h，用饱和NaHCO3溶液(2×150mL)、1N HCl溶液(150mL)和盐水(150mL)将有机层分离清洗，EA萃取，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1-10/1)洗脱，得到第一中间体(6.8g)，收率：60％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.91-3.61(m,6H),3.55-3.39(m,2H),3.38-3.16(m,2H),2.89-2.47(m,2H),1.59-1.36(m,9H)；
将所述第一中间体(4.0g,14mmol)溶解于20％(V/V)TFA/CH2Cl2(50mL)中，反应混合物室温搅拌1h。反应结束后，冷却至室温，水相由二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，通过硅胶柱色谱层析纯化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝20/1-10/1)洗脱，得到3-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(2.3g)。收率：90％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.89-3.46(m,4H),3.43-3.20(m,2H),2.96-2.72(m,4H),2.72-2.46(m,2H),1.21(s,1H)；
2)4-(4-(3-叠氮基丙酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-2-a)合成:
在烧瓶中加入3-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(连接体，n＝2，4.0g，22mmol,1.1eq)、2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(5.6g,20mmol,1.0eq)和DIPEA(10.5mL，2.0mmol,2.0eq)，溶于NMP(72mL,0.2M)，加入铜催化剂CuI(0.38g,2mmol,0.1eq)，升温至50℃，搅拌过夜，进行亲核取代反应(12h)；反应结束后，将所得反应液降至室温，水相由乙酸乙酯提取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋除大部分溶剂，由乙酸乙酯正己烷重结晶，得到化合物I-2-a(7.5g)，产率：85％。
对实施例7制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.42(s,1H),7.22(s,1H),7.00(s,1H),4.44(s,1H),3.95-3.54(m,8H),3.51-3.32(m,2H),2.77(s,1H),2.68-2.26(m,5H)。
实施例8
1)4-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)丁烷-1-酮的合成：
按照实施例7所述方法和比例，区别仅在于所述叠氮基类有机酸为4-叠氮基丁酸；
2)制备4-(4-(4-叠氮基丁酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-2-b)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例7，区别仅在于：反应原料中连接体为4-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)丁烷-1-酮，即连接体中n＝3。
对实施例8制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.46-6.91(m,3H),4.44(s,1H),3.92-3.68(m,4H),3.64-3.51(m,2H),3.48-3.25(m,4H),2.91-2.26(m,6H),1.98-1.74(m,2H)。
实施例9
1)5-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)戊烷-1-酮的合成：
按照实施例7所述方法和比例，区别仅在于所述叠氮基类有机酸为5-叠氮基戊酸；
2)制备4-(4-(5-叠氮基戊酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-2-c)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例7，区别仅在于：反应原料中连接体为5-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)戊烷-1-酮，即连接体中n＝4。
对实施例9制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.57-6.87(m,3H),4.44(s,1H),3.96-3.37(m,8H),3.29-3.11(m,2H),2.88-2.19(m,6H),1.80-1.32(m,4H)。
实施例10
1)6-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)己烷-1-酮的合成：
按照实施例7所述方法和比例，区别仅在于所述叠氮基类有机酸为6-叠氮基己酸；
2)制备4-(4-(6-叠氮基己酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-2-d)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例7，区别仅在于：反应原料中连接体为6-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)己烷-1-酮，即连接体中n＝5。
对实施例10制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.56-6.85(m,3H),4.44(s,1H),3.96-3.68(m,4H),3.64-3.35(m,4H),3.27-3.01(m,2H),2.88-2.19(m,6H),1.78-1.15(m,6H)。
实施例11
1)7-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)庚烷-1-酮的合成：
按照实施例7所述方法和比例，区别仅在于所述叠氮基类有机酸为7-叠氮基庚酸；
2)制备4-(4-(7-叠氮基庚酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-2-e)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例7，区别仅在于：反应原料中连接体为7-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)庚烷-1-酮，即连接体中n＝6。
对实施例11制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.53-6.85(m,3H),4.44(s,1H),3.92-3.15(m,10H),2.94-2.17(m,6H),1.91-1.49(m,4H),1.44-1.13(m,4H)。
实施例12
1)8-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)辛烷-1-酮的合成：
按照实施例7所述方法和比例，区别仅在于所述叠氮基类有机酸为8-叠氮基辛酸；
2)制备4-(4-(8-叠氮基辛酰基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(I-2-f)，其结构式如下：
该实施例的合成步骤同实施例7，区别仅在于：反应原料中连接体为8-叠氮基-1-(哌嗪-1-基)辛烷-1-酮，即连接体中n＝7。
对实施例12制备得到的化合物进行核磁表征，数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(s,1H),7.54-6.90(m,3H),4.44(s,1H),3.92-3.32(m,8H),3.28-3.03(m,2H),2.88-2.24(m,6H),1.77-1.15(m,10H)。
由以上实施例可知，本发明提供了一种基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体及其制备方法和应用。本发明提供的基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体能够成功实现将泊马度胺与多种靶蛋白识别配体通过连接体相连，为基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs新药下一步的合成提供了便利。本发明提供了所述基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体的制备方法，本发明所用铜催化剂廉价易得，反应条件温和、合成简便高效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种双功能小分子PROTACs的连接体，其特征在于，具有式I或式II所示结构；
式I所示结构连接体为Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮，式II所示结构连接体为叠氮基类哌嗪-1-烷基酮，式I和式II中，n为碳链长度，n＝1～12。
2.根据权利要求1所述的连接体，其特征在于，所述连接体包括
3.权利要求1或2所述双功能小分子PROTACs的连接体的制备方法，其特征在于，
当所述连接体为式I所示结构的Boc保护的氨基类哌嗪-1-烷基酮时，所述连接体的制备方法包括以下步骤：
将Boc保护的氨基酸、DMF、苄基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体；
将所述第一中间体、乙醇和钯碳催化剂混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体；
所述Boc保护的氨基酸具有式III所示结构；
所述苄基哌嗪-1-羧酸酯具有式IV所示结构：
当所述连接体为式II所示结构的叠氮基类哌嗪-1-烷基酮时，所述连接体的制备方法包括以下步骤：
将叠氮基类有机酸、DMF、叔丁基哌嗪-1-羧酸酯和N,N-碳酰二咪唑混合，进行第一反应，得到第一中间体；
将所述第一中间体和TFA-CH2Cl2溶液混合，进行去保护，得到双功能小分子PROTACs的连接体；
所述叠氮基类有机酸具有式V所示结构：
所述叔丁基哌嗪-1-羧酸酯具有式VI所示结构：
4.权利要求1或2所述双功能小分子PROTACs的连接体在制备基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体中的应用，其特征在于，所述制备的方法，包括以下步骤：
将2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮、连接体、铜催化剂、N,N-二异丙基乙胺和有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs类的中间体；所述连接体为权利要求1或2所述双功能小分子PROTACs的连接体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述铜催化剂包括CuCl、CuCl2、CuI、CuOAc、[Cu(OH)TMED]2Cl2或Cu-Al2O3。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂包括NMP、THF、甲苯、DMSO或DMF。
7.根据权利要求4～6任一项所述的应用，其特征在于，所述2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮、连接体、铜催化剂、N,N-二异丙基乙胺和有机溶剂的用量比为18～22mmol:20～25mmol:1～2.5mmol:1～2.5mmol:70～80mL。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述亲核取代反应的温度为40～60℃，时间为8～24h。
9.一种基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体，其特征在于，具有式VII所示结构：
其中，所述R包括：
10.权利要求9所述基于沙利度胺的双功能小分子PROTACs的中间体在合成及药物化学领域中的应用。
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