CN107405378B - 用于治疗与非降解异常蛋白的积聚相关的病症或癌症的蛋白酶体抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白酶体抑制剂用于治疗和/或预防与非降解异常蛋白的积聚相关的病症，尤其是早衰症的用途。本发明还涉及蛋白酶体抑制剂用于减弱生理老化的用途。本发明还涉及蛋白酶体抑制剂用于治疗和/或预防年龄相关疾病及其代谢后果的用途。本发明还涉及蛋白酶体抑制剂用于预防和/或减弱皮肤老化的皮肤病学、皮肤美容或美容用途。本发明还涉及蛋白酶体抑制剂用于治疗癌症的用途。

Description

用于治疗与非降解异常蛋白的积聚相关的病症或癌症的蛋白 酶体抑制剂

技术领域

本发明涉及使用蛋白酶体抑制剂来治疗和/或预防与非降解异常蛋白(例如早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体)的积聚相关的病症，尤其是与上述这些异常蛋白相关的早衰症。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在预防和/或减弱与早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体相关的皮肤老化中的皮肤病学、皮肤美容或美容用途。本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在减弱与早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体相关的生理老化中的用途。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在治疗和/或预防与早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体的存在和/或积聚相关的年龄相关疾病及其代谢后果中的用途，特别是在组织(包括皮肤、脂肪组织、骨、血管)中，包括内皮和血管平滑肌细胞及其对皮肤、心脏、脑或肾的病理学后果。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在治疗在遗传性神经退行性和/或肌肉疾病中与毒性蛋白质的存在和/或积聚相关的病症中的用途。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在治疗与SRSF1过表达相关的病症，例如癌症中的用途。

背景技术

Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS；OMIM#176670)是罕见的遗传性疾病，其影响每4-8百万儿童中的一个，症状与正常的成年老龄化类似，包括生长障碍、非常薄的皮肤、皮下脂肪的丧失、脱发、骨质疏松症和心脏病，导致寿命缩短，死亡时间约为13.5年(1,2)。这种综合征是由编码核层蛋白A的LMNA基因的外显子11内的新生错义点突变c.1824C>T、p.G608G引起(3,4)。该突变激活外显子11中的隐蔽供体剪接位点，导致羧基端球状结构域50个氨基酸的缺失，产生截断的永久法尼基化的核层蛋白A前体，即早老蛋白。该蛋白缺少核层蛋白A前体的残基607-656，但保留C末端的CAAX盒(法尼基化的靶标)。由于在截断的核层蛋白/早老蛋白中缺少内切蛋白酶切割位点，它永远保持法尼基化。核层蛋白A/C和B型核层蛋白是核纤层的主要成分，所述核纤层是内核膜下的纤维网络。

在细胞水平，HGPS早衰症的特征在于核包膜结构的巨大缺陷、核形状的大规模改变、起泡、“形成疝(herniation)”、在核的一极的一些内核膜(INM)蛋白质的损失以及潜在的异染色质的破坏。由于核层蛋白A也是内核基质的成分，在HGPS患者细胞中它的改变可能影响核功能区域例如核仁、散斑和核体的分布和/或结构组织。核基质组成的异常还导致DNA和RNA代谢步骤(从引起基因组不稳定的DNA修复到RNA转录和剪接)的缺陷。核代谢缺陷及其对细胞周期、代谢途径和细胞室功能的影响导致细胞衰老(5)。

已经表明，早老蛋白在生理老化期间产生而没有LMNA基因突变(6)，并且被认为是人(7)和小鼠皮肤中老化的生物标志物，其中已经表明早老蛋白的合成主要通过NADPH氧化酶NOX1过度活化(9)由UV诱导的ROS产生(8)而触发。在人培养的来自患者的角质形成细胞和Xpc^–/–小鼠(9)中，在DNA修复遗传疾病C型着色性干皮病(XPC)中均观察到两种现象。类似的NOX1过度活化在其他DNA修复疾病中已经报道，也可以导致产生早老蛋白(10)。在培养细胞中，复制衰老期间端粒缩短诱导早老蛋白的合成(11)。来自间充质谱系的细胞，例如内皮和血管平滑肌细胞、骨和脂肪组织细胞、骨骼和心肌细胞尤其对早老蛋白更加敏感，这诱导引起这些组织更新的成体干细胞逐渐消失(12)，该现象也由法尼基化的核层蛋白A前体诱导且在成体表皮干细胞中观察到(13)。另一方面，氧化应激导致ZMPSTE24在mRNA和蛋白质水平的阻断，从而导致在血管平滑肌细胞老化过程中产生法尼基化的核层蛋白A前体(14)。从1个月到97岁的年龄，来自非HGPS受试者的冠状动脉中的早老蛋白染色增加(15)。此外，在内皮衰老期间，SRSF1从细胞核到细胞质的错位导致几个mRNA的异常剪接事件，其中包括核层蛋白A前体mRNA(16)。由于miR-9诱导的核层蛋白A前体mRNA的切割，脑神经元和星形胶质细胞均不产生早老蛋白或法尼基化的核层蛋白A前体(17,18)。然而，早老蛋白或法尼基化的核层蛋白A前体可以通过血管(19)和室管膜细胞(20)的合成来间接地促进脑老化，以响应氧化应激(21,22)以及神经细胞中核层蛋白B的积聚(23)。

治疗HGPS以及与核层蛋白A前体加工相关的其他早衰症的策略主要可以分为三种：i/降低法尼基化的核层蛋白A前体的毒性，特别是通过阻断异戊二烯的生物合成或通过阻断它的合成；ii/阻断导致成熟早老蛋白mRNA从而导致早老蛋白合成的LMNA外显子11的隐蔽剪接位点；iii/降解细胞内的早老蛋白或法尼基化的核层蛋白A前体。

目前，只有第一种策略能在人类患者中进行治疗(5)。

已经测试了一种法尼基转移酶抑制剂(FTI)洛那法尼，但它的益处是有争议的(25)。由于已经公认RAS是人类癌症中最常见的突变致癌基因，正常和致癌RAS都需要法尼基化，法尼基转移酶(Ftase)一直是抗癌药物发现最有吸引力的靶标之一。在超过70个的临床试验中，已经开发并测试了大量的Ftase抑制剂(FTI)(26)。结果大部分是令人失望的，然而，出乎意料地发现当Ftase被抑制时，H-RAS和K-RAS仍然能被香叶基香叶基化(geranylgeranyled)(27)。此外，已经表明一种FTI，即FTI-27抑制蛋白酶体活性(28)。然而，在FTI功效远低于培养细胞的几种小鼠模型中(29)和在早老症的临床试验(24)中，以前在来自早老症患者的培养细胞中使用的FTI都没有证实如本发明所述的对蛋白酶体的抑制活性或表现早老蛋白或核层蛋白A前体的含量减少。

在2008-2013之间测试的另一种治疗是唑来膦酸(法尼基焦磷酸合成酶的氨基二膦酸盐抑制剂，Zo)和普伐他汀(HMG-coA还原酶的他汀类抑制剂，Pra)的联合，即ZoPra。将ZoPra和洛那法尼组合的第三个临床试验正在进行中。

第二种策略已经在培养的HGPS细胞和早老症的小鼠模型中被证实。短寡核苷酸结合由LMNA突变激活的LMNA外显子11隐蔽剪接位点，并导致HGPS细胞中早老蛋白mRNA减少和蛋白质的生物合成(30)。静脉内施用两种吗啉-寡核苷酸拯救了KI小鼠模型G609G的寿命以及几个生物参数，重现早老症的病理生理机制、临床和生物学症状(31)。一种吗啉靶向LMNA外显子11隐蔽剪接位点并抑制早老蛋白mRNA的产生，而第二种靶向LMNA外显子10剪接位点，从而有利于产生核层蛋白C mRNA并降低核层蛋白A mRNA的产生。在相同的早老症KI小鼠模型中，已经表明剪接因子SRSF1结合LMNA外显子11隐蔽位点，且有利于产生早老蛋白mRNA(32)。

已经研究了第三种策略，即降解细胞内的早老蛋白或法尼基化的核层蛋白A前体。通过激活巨自噬，免疫抑制剂雷帕霉素降低了HGPS成纤维细胞中的早老蛋白并拯救它们的核形状的表型(33,34)和随后的错误2013。因此，已经提出雷帕霉素构成HGPS的合适治疗。已经表明，在致癌性损伤的培养细胞中，通过法尼基锚定到核纤层的核层蛋白B1被排出到细胞质，并通过自噬降解，例如通过激活的RAS(35)。

然而，仍然需要对HGPS和具有相关的、类似的或相同的病理生理机制的其他早老综合征的有效治疗。所述机制可能涉及截断的和/或法尼基化的核层蛋白A前体和/或B型核层蛋白的存在，和/或LMNA、LMNB1和/或LMNB2的重复。这种治疗对预防和/或治疗疾病伴随的核层蛋白相关的生理老化也是有利的。

发明简述

如实施例1所示，发明人出乎意料地发现，使用蛋白酶体抑制剂例如MG132诱导了HGPS细胞中早老蛋白的清除。实际上，MG132在HGPS细胞中有两个独立的功能：

–一方面，它诱导自噬从而诱导蛋白质降解；和

–另一方面，它降低称为SRSF1的转录因子的量，所述SRSF1参与产生早老蛋白mRNA的核层蛋白A前体mRNA的剪接(32)。

结果是，早老蛋白通过自噬被降解，同时由于SRSF1下调其产生较少。

发明人还出乎意料地表明，使用蛋白酶体抑制剂能有效治疗癌细胞(参见实施例2)和治疗眼咽肌营养不良症(OPMD)的动物模型(参见实施例3)。

因此，本发明涉及蛋白酶体抑制剂用于治疗和/或预防与非降解异常蛋白(例如尤其是导致早衰症的截断的和/或法尼基化的核层蛋白A前体)的积聚相关的病症。

优选地，蛋白酶体抑制剂通过下调SRSF1用于治疗和/或预防与非降解异常蛋白(例如导致早衰症的截断的和/或法尼基化的核层蛋白A前体)的积聚相关的病症。

本发明还涉及在需要其的受试者中治疗和/或预防与非降解异常蛋白(例如导致早衰症的截断的和/或法尼基化的核层蛋白A前体)的积聚相关的病症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的蛋白酶体抑制剂。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在预防和/或减弱皮肤老化，尤其是人皮肤老化中的皮肤病学、皮肤美容或美容用途。本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在减弱生理老化，例如与早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体相关的生理老化中的用途。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在治疗和/或预防年龄相关疾病及其代谢后果中的用途，尤其是包括表达早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体的组织的那些，例如皮肤、脂肪组织、骨、血管和它们的内皮和血管平滑肌细胞及其对皮肤、心脏、脑或肾的影响。

发明详述

定义

如本文所用，术语“蛋白酶体抑制剂”是阻断蛋白酶体的酶学活性的化合物。哺乳动物26S细胞质和细胞核的蛋白酶体由一个20S蛋白水解核和两个19S调节帽亚单元组成(36)。20S核提供其中降解蛋白质的桶形腔。

20S核由四个环(两个α和两个β)组成。每个α环包含由7个基因编码的7个不同的α亚单元，每个β环包含由7个基因编码的7个不同的β亚单元。

19S调节帽亚单元由基底和盖组成，基底包含6个ATPase和2个非ATPase亚单元，盖包含多达10个非ATPase亚单元。

如本文所用，术语“治疗”是指逆转、减轻、抑制这种术语适用的疾病或病症，或这种疾病或病症的一种或多种症状的进展，或预防这种术语适用的疾病或病症，或这种疾病或病症的一种或多种症状。

如本文所用，术语“预防”是指减轻疾病或病症使其不在尚未被诊断患有该疾病的受试者中发生。

“治疗有效量”意欲是指为受试者赋予治疗益处所必需的活性剂的最少量。例如，“治疗有效量”是诱导、缓解或导致病理症状、疾病进展或与疾病相关生理病症的改进，或提高对疾病的抗性的量。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选地，根据本发明的受试者是人。本发明的所有治疗和方法可以向哺乳动物，尤其是非人哺乳动物和人施用。优选地，它们可以向人施用。

治疗与根据本发明的非降解异常蛋白的积聚相关的病症

本发明涉及蛋白酶体抑制剂用于治疗和/或预防与非降解异常蛋白(例如截断的和/或法尼基化的核层蛋白A前体和/或B型核层蛋白，或由LMNB1和/或LMNB2的重复产生的蛋白)的积聚相关的病症。

如本文所用，“与非降解异常蛋白的积聚相关的病症”是涉及异常蛋白存在的病症，所述蛋白由于不被降解而在细胞中积聚。所述异常蛋白可以是错误折叠的蛋白或突变蛋白。非降解异常蛋白的积聚可以是在细胞核中和/或细胞质中。优选地，非降解异常蛋白是截断的和/或法尼基化的核层蛋白A前体、截断的和/或法尼基化的B型核层蛋白，或由LMNB1和/或LMNB2的重复产生的蛋白。截断的和/或法尼基化的核层蛋白A前体的优选实例是早老蛋白。

优选地，与非降解异常蛋白的积聚相关的病症是与非降解异常蛋白的细胞核积聚相关的病症。优选地，所述病症选自早衰症、横纹肌和神经退行性疾病。在所述疾病中，非降解异常蛋白在细胞核中积聚。

优选地，与非降解异常蛋白的积聚相关的病症是与非降解异常蛋白的细胞质积聚相关的病症。优选地，所述病症选自横纹肌和神经退行性疾病。在横纹肌和神经退行性疾病中，可以优选提及眼咽肌营养不良症(OPMD)。实施例3示出了对OPMD模型使用蛋白酶体抑制剂。

更优选地，根据本发明，所述疾病选自早衰症。早衰症的特征在于加速老化，影响多数或所有组织并导致受影响的个体显示仅与老化相关的一些特征(称为“分段的”)，或仅影响一个组织(称为“单峰的”)。例如，早衰症可以选自涉及加速老化的疾病，其中存在至少一个以下突变：

–核层蛋白A前体和/或核层蛋白B被截断，和/或

–早老蛋白和/或核层蛋白A前体和/或核层蛋白B被法尼基化，和/或

–LMNA、LMNB1和/或LMNB2被重复。

例如，如果LMNB1被重复，则该遗传缺陷导致成人发作的常染色体显性遗传性脑白质营养不良(37)。

早衰症可以选自早老综合征。

早老综合征是遗传性人类疾病，其包括提示老化但过早出现的临床症状，且其进化急剧加快。大多数加快老化的人综合征由两种主要机制之一引起：核纤层和基质蛋白质的缺陷或参与DNA修复的蛋白质的改变(5)。

在早老综合征中，可以提及分别由LMNA、ZMPSTE24或BANF1中的突变引起的Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)、非典型性早老综合征(APS)、限制性皮肤病、Nestor-Guillermo早老综合征，和由其产物参与DNA修复的基因的突变引起的Werner、Bloom、Rothmund-Thomson或Cockayne综合征、着色性干皮病和毛滴虫病。

优选地，蛋白酶体抑制剂通过下调SRSF1用于治疗和/或预防与非降解异常蛋白的积聚相关的病症。

SRSF1是富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1，其属于富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子家族。“下调SRSF1”是指与未处理对照相比，蛋白酶体抑制剂将SRSF1蛋白下调至少10％，优选至少50％，优选至少60％。SRSF1的下调可以如实施例1和图3B所述来测量。不希望受限于理论，根据本发明的蛋白酶体抑制剂可以通过诱导半胱天冬酶介导的SRSF1水平的降低(其导致SRSF1下调)来发挥其作用。然后，这种下调降低早老蛋白转录水平，从而降低早老蛋白的产生。

优选地，根据本发明的用于治疗和/或预防与非降解异常蛋白的积聚相关的病症的蛋白酶体抑制剂是化学化合物。优选地，它不包含MG132。更优选地，它选自任选修饰的肽。更优选地，它选自除MG132之外的任选修饰的肽。

肽优选任选修饰的三肽。优选地，这些肽是任选修饰的包含至少两个亮氨酸的三肽。修饰可以是增加醛功能，或增加化学化合物，例如–B(OH)2。优选地，这些肽包括Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)2、Z-Leu-Leu-Nva-H、Z-Leu-Leu-Phe-al和Z-Leu-Leu-Leu-al。

修饰的三肽Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)2也称为MG262。

修饰的三肽Z-Leu-Leu-Nva-H也称为MG115。

修饰的三肽Z-Leu-Leu-Leu-al也称为MG132。

修饰的三肽Z-Leu-Leu-Phe-al也称为MG110。

更优选地，蛋白酶体抑制剂选自MG115、MG262、MG110和MG132。更优选地，蛋白酶体抑制剂选自MG115、MG110和MG262。

本发明还涉及含有本发明的尤其是选自MG115、MG262、MG110和MG132的蛋白酶体抑制剂的药物组合物。

当本发明的蛋白酶体抑制剂是肽时，它可以与增加所述肽在细胞中的积聚的试剂偶联或连接。

与合适试剂的这种偶联可以使所述肽更加膜可渗透，例如细胞膜渗透性载体。这种试剂可以是细胞膜渗透性载体，例如富含带正电的氨基酸的肽，优选富含精氨酸的肽。优选地，富含精氨酸的肽是序列为RRRRRRRRR(SEQ ID NO:12)的聚精氨酸标签。其他细胞穿透性肽可以选自衍生自氨基肽酶(CD13)N配体的NGR肽(CNGRCG)、触足前导肽(KKWKMRRNQFWVKVQRG SEQ ID NO:13)、Bcl-2结合肽(癸酰基-KNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGL SEQ ID NO:14)、tat序列(RKKRRQRRR SEQ ID NO:15)、buforin(TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK SEQ ID NO:16)、人T细胞淋巴瘤病毒(HTLV)-11Rex的肽片段(TRRQRTRRARRNR SEQ ID NO:17)、脂质膜转位肽(KKAAAVLLPVLLAAP SEQ ID NO:18)和穿膜肽(RQIKIWFQNRRMKWKKGG SEQ ID NO:19)。

当本发明的蛋白酶体抑制剂是肽时，它可以其药用活性盐之一的形式施用。合适的药用活性盐包括酸加成盐和碱或碱土金属盐。例如，可以获得钠盐、钾盐、锂盐、镁盐或钙盐。肽与有机和无机酸形成药学上可接受的盐。用于形成这种酸加成盐的合适的酸的实例有：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、对氨基水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、磺酸、膦酸、高氯酸、硝酸、甲酸、丙酸、葡萄糖酸、乳酸、酒石酸、羟基马来酸、丙酮酸、苯乙酸、苯甲酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、亚硝酸、羟基乙磺酸、乙烯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、磺胺酸、樟脑磺酸、扁桃酸、邻甲基扁桃酸、氢-苯磺酸、苦味酸、己二酸、D-邻甲苯基酒石酸、丙醇酸、a-甲苯酸、(邻、间、对)-甲苯酸、萘胺磺酸，和本领域技术人员熟知的其他无机酸或羧酸。通过以下方法来制备盐：使游离碱形式与足量的所需酸接触以常规方法制备盐。

本发明的肽也可以与非肽部分偶联。待与肽偶联的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，例如天然或合成的均聚物或杂聚物，其分子量一般为约300-100,000Da,例如约500-20,000Da。合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)、支链PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，或适于降低免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期的任何其他生物聚合物。聚合物分子的另一个实例是人白蛋白或另一种丰富的血浆蛋白。通常，衍生自聚亚烷基二醇的聚合物是生物相容的、无毒、无抗原性、无免疫原性、具有各种水溶性特征，且容易从活的生物体排出。

因此，本发明的蛋白酶体抑制剂可以与药学上可接受的赋形剂，和任选的缓释基质，例如生物可降解的聚合物组合以形成治疗组合物。

“药学上的”或“药学上可接受的”是指当酌情向哺乳动物尤其是人施用时，不会产生有害的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒的固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、包封材料或配制辅剂。

药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然地取决于待治疗的病症、疾病严重度、患者的年龄、体重和性别等。

本发明的药物组合物可以配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、胃内、静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、阴道内、直肠、舌下、经皮或眼内施用等。施用形式包括例如丸剂、片剂、膜片、包衣片、胶囊、脂质体制剂、微米和纳米制剂、粉末和沉积物。优选地，药物组合物包含药学上可接受的能够用于注射制剂的介质。这些尤其可以是等渗的无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或根据情况当加入无菌水或生理盐水时，能够构成可注射溶液的干燥的尤其是冷冻干燥的组合物。

用于施用的剂量可以根据各种参数调节，尤其是以下参数：所用的施用方式、相关的病理或所需的治疗持续时间。为制备药物组合物，可以将有效量的蛋白酶体抑制剂溶于或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。适于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须无菌，且必须是易于注射的程度的流体。它在制备和存储条件下必须是稳定的，且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在一般的存储和使用条件下，这些制剂包括防腐剂以防止微生物生长。

载体也可以是包含例如水、乙醇、多醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。

可以通过例如使用包衣(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在很多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。

无菌注射溶液通过以下来制备：根据需要在合适的溶剂中包括所需量的活性化合物和以上列举的各种其他成分，然后过滤灭菌。

通常，通过以下制备分散体：在包含基础分散介质和来自以上列举那些的所需其他成分的无菌介质中包括各种无菌活性成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从无菌过滤的溶液产生活性成分和任何额外的所需成分的粉末。

配制完成后，以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的这种量施用溶液。制剂容易以各种剂型施用，例如上述的注射溶液的类型，但也可以使用药物释放胶囊等。

对于水性溶液的肠胃外施用，例如，如果需要应当适当地使溶液缓冲，且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。

这些特定的水性溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用的无菌水性介质将是本领域技术人员基于本公开已知的。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液，并且加至1000ml皮下注射液或在建议的输注位点注射(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"15th Edition,第1035-1038和1570-1580页)。取决于被治疗的受试者的病症，剂量可以有一些改变。在任何情况下，负责施用的人将确定单个受试者的合适剂量。

除了化合物配制用于肠胃外施用，例如静脉内或肌肉内注射，其他药学上可接受的形式包括例如片剂或用于口服施用的其他固体；定时释放胶囊；和目前使用的任何其他形式。

蛋白酶体抑制剂可以单独使用，或与至少一种其他药物联合使用。此类药物可以选自抗炎剂(38)；从(31)已知的反义寡核苷酸，如5′-GCTACCACTCACGTGGTGGTGATGG-3′(SEQID NO:1)和5′-GGGTCCACCCACCTGGGCTCCTGAG-3′(SEQ ID NO:2)；法尼基焦磷酸合成酶的氨基二膦酸盐抑制剂，如唑来膦酸；HMG-CoA还原酶的他汀类抑制剂，如普伐他汀；其他肽，例如NOX1抑制剂；伴侣蛋白或其ATPase活性的激活剂；自噬激活剂，例如海藻糖、锂盐、亚精胺；Rho激酶抑制剂，例如法舒地尔盐酸盐、Y-27632、HA1077或H89；Rho抑制剂，例如BioAxone Therapeutics的BA-210

和它们的混合物。

此类药物也可以是化疗或免疫疗法。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在预防和/或减弱皮肤老化，尤其是人皮肤老化中的皮肤病学、皮肤美容或美容用途。本发明还涉及蛋白酶体抑制剂在减弱生理老化中的用途。

蛋白酶体抑制剂如上所述。

它可以用于预防和/或减弱皮肤老化，尤其是用于减少皱纹、细纹，和/或用于防止皮肤变薄和/或柔软干瘪的皮肤面貌。

本发明还涉及蛋白酶体抑制剂用于治疗和/或预防年龄相关疾病及其代谢后果，尤其是包括表达早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体的组织的那些，例如皮肤、脂肪组织、骨、血管和它们的内皮和血管平滑肌细胞及其对皮肤、心脏、脑或肾的影响。特别是，年龄相关疾病可以选自骨质疏松症、2型糖尿病和动脉粥样硬化。因此，优选的，本发明涉及蛋白酶体抑制剂用于治疗和/或预防年龄相关疾病及其代谢后果，尤其是包括表达早老蛋白和/或法尼基化的核层蛋白A前体的组织的那些，例如皮肤、脂肪组织、骨、血管和它们的内皮和血管平滑肌细胞及其对皮肤、心脏、脑或肾的影响。优选的，所述年龄相关疾病可以选自骨质疏松症、2型糖尿病和动脉粥样硬化。

蛋白酶体抑制剂的施用可以是如上所述的任何合适的方法。可以根据经验确定蛋白酶体抑制剂的合适量，但通常在以下给出的范围内。蛋白酶体抑制剂的单次施用足以对患者产生有益效果，但将理解，如果施用超过一次(这种情况下可能是典型的施用方案)可能是有益的，例如每周一次或两次，每六个月2-4周，或每天一次，每4-6个月1周。

施用剂量将取决于各种因子，包括组合物的性质、施用途径以及施用方案的安排和时机。

本发明的分子或分子组合的合适剂量为每次施用约1μg至10μg、至15μg、至20μg、至25μg、至30μg、至35μg、至50μg、至100μg、至500μg或更多。合适的量可以小于15μg但至少1ng、或至少2ng、或至少5ng、或至少50ng、或至少100ng、或至少500ng、或至少1μg或至少10μg。对于本发明的某些分子，所用量可以更高，例如，高达1mg、高达2mg、高达3mg、高达4mg、高达5mg或更高。这种量可以在液体制剂中，以适于允许通过所选择的途径施用适当体积的浓度提供。

根据本发明的诊断方法

本发明还涉及用于诊断受试者的生物样品中与非降解异常蛋白的积聚相关的病症，尤其是早衰症的方法，包括i)检测细胞核中的线样PML-NB；和ii)检测次要参数。所述次要参数选自受试者老化的临床症状，和/或检测所述生物样品中的DNA断裂。

实际上，如实施例所示，发明人已经发现，线样PML-NB是HGPS细胞的标志物，因此可以用于与非降解异常蛋白的积聚相关的病症，尤其是早衰症的诊断方法。

PML-NB(早幼粒细胞性白血病核体)是核体，且已经被描述为与细胞核基质紧密相关的离散的核斑点(39)。PML基因最初被鉴定为急性早幼粒细胞白血病T(15；17)染色体易位中视黄酸受体α基因的融合配偶体。PML-NB的直径大小为0.2μm-1.2μm，且它们是动态结构，其响应于诸如热休克、重金属暴露和DNA损伤的应力改变大小、位置和数量。

借助于本领域已知的经典方法，如免疫荧光、蛋白质印迹或流式细胞仪，可以检测PML-NB。

因此，根据本发明，用于诊断受试者的生物样品中与非降解异常蛋白的积聚相关的病症，尤其是早衰症(更具体的，HGPS和其他早老综合征)的方法包括i)检测所述生物样品中的线样PML-NB；和ii)检测次要参数。如果检测到线样PML-NB，且如果检测到次要参数，则可以得出结论，所述受试者患有与非降解异常蛋白的积聚相关的病症。

生物样品可以是来自皮肤活检的细胞、外周血细胞、来自水肿粘膜的上皮细胞或尿液。

根据本发明的癌症治疗

最后，本发明还涉及如上所述的下调SRSF1的蛋白酶体抑制剂用于治疗和/或预防癌症。所述应用出乎意料地示于以下实施例2。

所述蛋白酶体抑制剂可以是如上所述。优选地，所述蛋白酶体抑制剂选自MG132、MG115、MG262和MG110。

已经在人癌症中观察到SRSF1原癌基因的过表达(40)。因此，通过下调SRSF1，本发明的蛋白酶体抑制剂能够治疗癌症。

癌症可以是任何类型。优选的，癌症选自乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、结肠直肠癌和皮肤癌。

本发明将通过以下附图和实施例进一步阐述。

附图说明

图1.蛋白酶体抑制剂MG132降低HGPS成纤维细胞中的早老蛋白水平。

(A)相对于对照成纤维细胞(对照1:8471和对照2:8498)，在HGPS成纤维细胞(AG01972)中观察到蛋白酶体活性的显著增加(胰蛋白酶：Z-LRR-氨基荧光素，糜蛋白酶：Suc-LLVY氨基荧光素和半胱天冬酶样：Z-nLPnLD-氨基荧光素)(平均值±SEM,n＝3)。各实验在相同传代水平的细胞上进行。发光测定为相对光单位(RLU)。

(B)上图：未处理(对照)或用10μM MG132或DMSO处理3、6、24和48h的HGPS成纤维细胞的全裂解物中早老蛋白和微管蛋白的蛋白质印迹评估。下图：用ImageJ软件定量上图所述的早老蛋白条带，并将早老蛋白表达水平归一化至对照细胞值。(n＝6±SEM)。*p<.05,**p<.01,***p<.001,实验vs.对照(DMSO处理的细胞)。

(C)用DMSO(对照)或10μM MG132、MG115、MG262、硼替佐米(BTZ)或卡非佐米(CFZ)处理48h的HGPS成纤维细胞的全裂解物中早老蛋白、肌动蛋白和GAPDH的蛋白质印迹评估。倒置图。

(D)MG132处理24h后HGPS成纤维细胞(AG01972、AG11498和5968)中的蛋白酶体活性(胰蛋白酶：Z-LRR-氨基荧光素，糜蛋白酶：Suc-LLVY氨基荧光素和半胱天冬酶样：Z-nLPnLD-氨基荧光素)(平均值±SEM,n＝3)。发光测定为相对光单位(RLU)。C＝用DMSO处理24h的对照细胞。

图2.早老蛋白清除部分是由自噬的诱导引起。

(A)用ImageJ软件定量蛋白质印迹中的早老蛋白和GAPDH特异性的条带，并将早老蛋白表达水平归一化至GAPDH值。(n＝6±SEM).*p<.05,**p<.01,***p<.001,实验vs.对照(DMSO处理的细胞)。全裂解物中的早老蛋白水平分别来自未处理(对照)或用DMSO(48h)、10μM MG132(36h和48h)、氯喹(48h)(1μM、10μM、25μM或50μM)或同时加入10μM MG132和氯喹两者(1μM、10μM、25μM或50μM)(48h)处理的HGPS成纤维细胞。

(B)用ImageJ软件定量蛋白质印迹中的早老蛋白和GAPDH特异性的条带，并将早老蛋白表达水平归一化至GAPDH值。(n＝4±SEM).*p<.05,**p<.01,***p<.001,实验vs.对照(未处理细胞)。全裂解物中的早老蛋白水平来自用MG132(10μM)、氯喹(50μM)、洛霉素A1(100nM)、半胱天冬酶-6抑制剂Z-VEID-FMK(50μM)或细霉素B(20ng/ml)处理(+)48h的HGPS成纤维细胞。

图3.MG132降低早老蛋白转录物和剪接因子SRSF-1蛋白表达。

(A)响应于MG132的早老蛋白转录物的下调。相对于DMSO处理的细胞(对照)，用10μM MG132处理的HGPS成纤维细胞中的早老蛋白mRNA水平的定量实时PCR分析(平均值±SEM,n＝3)。***P<.001。

(B)上图：MG132降低剪接因子SRSF-1的表达。用DMSO(-)(对照)、MG132(10μM)、氯喹(50μM)、洛霉素A1(100nM)或泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK处理的HGPS成纤维细胞的全裂解物中核层蛋白A/C、早老蛋白、肌动蛋白、SRSF-1、LC3B-I和LC3B-II的蛋白质印迹评估。如所示的，也进行组合处理。下图：用ImageJ软件定量上图所述的早老蛋白、SRSF-1和肌动蛋白特异性条带。将早老蛋白和SRSF-1的表达水平归一化至肌动蛋白的值(平均值±SEM,n＝5)。

图4.MG132诱导核层蛋白A/C mRNA水平但不是蛋白质水平的降低。

(A)MG132降低核层蛋白A和核层蛋白C的转录物水平。用10μM MG132处理的HGPS成纤维细胞中的核层蛋白A和核层蛋白C mRNA水平的定量实时PCR分析(平均值±SEM,n＝3)。

(B)用MG132(10μM)处理HGPS成纤维细胞后，核层蛋白A和C的蛋白质水平均增加。示出了代表性蛋白质印迹和3个不同实验的平均值。*p<.05,**p<.01,***p<.001,实验vs.对照(DMSO处理的细胞)。

图5.MG132改进HGPS细胞系中的核形状异常。

通过手动盲计数计算正常核(核具有光滑的椭圆形状)和异常核(核具有小泡、不规则形状或多个折叠)的百分比。示出了代表性图像和3个不同实验的平均值。*p<.05。

图6.MG132降低衍生自患者iPS的MSC和VSMC中的早老蛋白水平。

用所示浓度的MG132处理24h后，用CellTiter-Glo发光细胞活力试验测量HGPS成纤维细胞、HGPS衍生的iPS-MSC或iPS-VSMC的活力。结果表示为相对于未处理细胞的MG132处理细胞的活力百分比。

图7.MG132降低Lmna^G609G/G609G小鼠骨骼肌中的早老蛋白水平。

(A)用ImageJ软件定量对应于DMSO处理的左肌肉(-)和1μg/Kg MG132处理的右肌肉(+)的核层蛋白A、早老蛋白、核层蛋白C和SRSF-1特异性条带，并将它们的表达水平归一化至GAPDH值。

(B)用10μg/Kg处理的如(A)中的相同定量。*p<.05,**p<.01,MG132-处理的vs.对照未处理细胞。

图8.蛋白酶体抑制剂降低两个培养的人腺癌细胞系中的SRSF1水平。

用在DMSO中稀释的3个浓度的蛋白酶体抑制剂孵育两个细胞系24h。

在各泳道上样20μg总蛋白提取物。

将用蛋白酶体抑制剂孵育24h后的SRSF1的量表示为仅用DMSO媒介孵育的对照细胞中的SRSF1的量的百分比，以及相对于肌动蛋白(黑色柱)或GAPDH(灰色柱)。

(A)HTC116，结肠腺癌，

(B)PANC-1，胰腺腺癌。

图9.果蝇OPMD模型中MG132的有益效果。

(A)通过将80只野生型第一龄幼虫转移到含有5毫升即时果蝇培养基的小瓶中来测定喂饲幼虫的MG132的毒性，该培养基用DMSO中的增加浓度的药物或仅用DMSO重构。该图显示了在25℃达到成年的果蝇的百分比。

(B)在25℃，仅用DMSO或用三个不同浓度的MG132喂饲的显示翅膀位置缺陷的表达PABPN1-17ala的果蝇的定量(Act88F-PABPN1-17ala/+)。所有浓度导致具有异常翅膀姿态的果蝇数量减少。示出了评分果蝇的数量。使用卡方检验，***p-值<0.001和**p-值<0.01。

具体实施方式

实施例1：Hutchinson-Gilford早老综合征中通过MG132处理的自噬诱导和SRSF-1 下调有效清除早老蛋白

材料和方法

细胞培养

根据马赛Timone医院的医学遗传部的生物资源中心(CRB TAC)的规定，制备并储存来自对照受试者(8498:1岁男性,8471:60岁男性,731C:96岁男性)和携带HGPSp.Gly608Gly突变的患者(5968:5岁女性)的人真皮成纤维细胞(从皮肤活检建立成纤维细胞)。从Coriell细胞储存库获得HGPS成纤维细胞((AG01972:14岁女性,AG11498:14岁男性)。在含有5％CO2的潮湿气氛中，在37℃，在补充有15％胎牛血清(Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)和1X青霉素-链霉素(Life Technologies)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Life Technologies)中培养细胞。在MG132(474790.MerckChemical LTD)、MG115(SCP0005.Sigma)、MG262(I-120-200.R&D Systems)、硼替佐米(S1013.Euromedex)、卡非佐米(S2853.Euromedex)、二磷酸氯喹晶体(C6628.Sigma)、洛霉素A1(B1793.Sigma)、半胱天冬酶-6抑制剂Z-VEID-FMK(FMK006.R&D Systems)、泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK(FMK001.R&D Systems)和细霉素B(L2913.Sigma)的存在或不存在下培养成纤维细胞。

siRNA转染

为敲低SRSF-1，用INTERFERin(Polyplus Transfection)用10nM siRNA转染HGPS细胞。在转染前一天，在6孔培养管中以100000-200000个细胞接种HGPS细胞。将22pmol的siRNA稀释于200μl不含血清的DMEM培养基，与8μl INTERFERin试剂混合。将试管振荡10s，并在室温下孵育10分钟。将转染混合物加入含有DMED培养基的血清中的细胞。4小时后更换培养基，并在37℃,5％CO2下孵育细胞48小时。SRSF-1siRNA(AM16708)从Thermo FisherScientific购买。

抗体

本研究中使用的抗体包括：兔抗核层蛋白A/C多克隆抗体(SC-20681,蛋白质印迹分析中以1:1000稀释度使用，免疫荧光标记中以1:200使用。Santa Cruz Biotechnology,Inc.)；小鼠抗早老蛋白单克隆抗体(sc-81611，蛋白质印迹分析中以1:1000稀释度使用，免疫荧光标记中以1:200使用。Santa Cruz Biotechnology,Inc.)；兔抗-PML多克隆抗体(sc-9863-R免疫荧光标记中以1:200使用。Santa Cruz Biotechnology,Inc.)；小鼠抗-PML单克隆抗体(sc-966免疫荧光标记中以1:100使用。Santa Cruz Biotechnology,Inc.)；山羊抗-SP100多克隆抗体(sc-16328免疫荧光标记中以1:50使用。Santa Cruz Biotechnology,Inc.)；小鼠抗-HP1单克隆抗体(2HP-1H5-AS免疫荧光标记中以1:100使用。Euromedex)；兔抗-ATRX多克隆抗体(sc-15408免疫荧光标记中以1:50使用。Santa Cruz Biotechnology,Inc.)；抗-DAXX(ab32140免疫荧光标记中以1:50使用。Abcam)；兔多克隆抗-CBP抗体(06-297免疫荧光标记中以1:200使用。Upstate)；小鼠抗泛素抗(PW8805免疫荧光标记中以1:10使用。Enzo)；小鼠抗单-和聚泛素化偶联物单克隆抗体(FK2,蛋白质印迹分析中以1:1000使用。Enzo)；兔抗-纤维蛋白多克隆抗体(ab5821免疫荧光标记中以1:100使用。Abcam)；山羊多克隆抗核层蛋白B1/B2抗体(sc6217免疫荧光标记中以1:100使用。Santa CruzBiotechnology,Inc.)；山羊抗-Emerin多克隆抗体(sc-8086免疫荧光标记中以1:100使用。Santa Cruz Biotechnology,Inc.)；小鼠抗-26S单克隆抗体(65144免疫荧光标记中以1:1使用。Progen Biotechnic.)；小鼠抗-Nup153单克隆抗体(ab93310,免疫荧光标记中以1:10使用。Abcam)；小鼠抗-p53单克隆抗体(ab26,免疫荧光标记中以1:200使用。Abcam)；兔抗-p62多克隆抗体(ab37024,蛋白质印迹分析中以1:1000使用，免疫荧光标记中以1:100使用。Abcam)；兔抗-LC3B多克隆抗体(#2775,蛋白质印迹分析中以1:1000使用，免疫荧光标记中以1:400使用。Cell Signaling)；兔抗-SQSTM1/p62多克隆抗体(#5114,蛋白质印迹分析中以1:1000使用，免疫荧光标记中以1:100使用。Cell Signaling)；兔抗-核层蛋白C多克隆抗体(BP4505,免疫荧光标记中以1:200使用。Acris Antibodies.GmbH)；兔抗SRSF1单克隆抗体(ab129108,蛋白质印迹分析中以1:1000使用。Abcam)；小鼠抗-甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体(MAB374,蛋白质印迹分析中以1:10000使用。Merck Millipore)；小鼠抗–α-微管蛋白单克隆抗体(T6074,蛋白质印迹分析中以1:10,000使用。Sigma)或小鼠抗–β-肌动蛋白单克隆抗体(AC-40,蛋白质印迹分析中以1:10,000使用。Sigma)；兔抗-Sumo2/3多克隆抗体(ab-3742,蛋白质印迹分析中以1:1000使用。Abcam)。

荧光显微镜

通过用细胞离心涂片器(Shandon)离心(300rpm，5分钟)，将离心收集的细胞铺板到聚赖氨酸涂覆的玻片上。然后，在室温下，在pH7.2的PBS中的2％(w/v)多聚甲醛中固定细胞10分钟。在室温下，用100μL透化缓冲液(0.5％Triton X-100、50mM NaCl、300mM蔗糖、20mM HEPES pH 7.5、3mM MgCl2)使细胞透化。用PBS中的3％牛血清白蛋白(w/v)(PBS-BSA)阻断非特异性抗体结合30分钟。在37℃用一级抗体孵育透化细胞3h。洗涤后，然后在37℃用二级抗体(A11001,A11058,Life Technologies；1/400)孵育细胞20分钟。在室温下，用在Vectashield(Abcys)中稀释的DAPI(50ng/ml)染色细胞核10分钟。在4％多聚甲醛中固定样品5分钟。染色细胞在Axioplan 2成像显微镜(Carl Zeiss)上观察或通过与激光共聚焦扫描系统(Leica)连接的Nikon倒置显微镜检查。在单独的染色反应中测试所有抗体的特异性和性能。不含一级抗体的对照均为阴性。

异常核形态的定量

用含有10μM MG132或相同体积媒介(DMSO,0.025％v/v)的DMEM培养基培养来自三位HGPS患者(AG01972、AG11498、5968)和两位正常个体(8471、8498)的成纤维细胞48h。通过具有Axioplan 2成像显微镜(Carl Zeiss)的荧光显微镜检查核层蛋白A/C或DAPI染色的细胞。对于异常核形态的定量，通过手动盲计数计算正常核(核具有光滑的椭圆形状)和异常核(核具有小泡、不规则形状或多个折叠)的百分比。各细胞系随机选择至少200个成纤维细胞核，并在两个独立实验中检查。结果用图表表示为计数的总核的平均百分比。

RNA分离、逆转录和实时PCR

用RNeasy plus提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离总RNA。用High CapacitycDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)将1μg RNA逆转录。在LightCycler 480(Roche,Germany)上，用

Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)进行实时PCR扩增，所用预先设计的引物为：GAPDH(Hs00266705_g1)、Progerin(F:ACTGCAGCAGCTCGGGG(SEQ ID NO:3)R:TCTGGGGGCTCTGGGC(SEQ ID NO:4)和探针:CGCTGAGTACAACCT(SEQ ID NO:5))、核层蛋白A(F:TCTTCTGCCTCCAGTGTCACG(SEQ ID NO:6)R:AGTTCTGGGGGCTCTGGGT(SEQ ID NO:7)和探针:ACTCGCAGCTACCG(SEQ ID NO:8))和核层蛋白C(F:CAACTCCACTGGGGAAGAAGTG (SEQ ID NO:9)R:CGGCGGCTACCACTCAC (SEQ ID NO:10)和探针:ATGCGCAAGCTGGTG(SEQ ID NO:11))(Applied Biosystems)，所用程序如下：50℃UNG孵育2分钟，95℃初始变性10分钟，40个扩增循环：95℃变性15秒和60℃退火1分钟。所有PCR反应进行三次重复。通过归一化至GAPDH表达的2-ΔΔ^CT相对方法，用阈值循环(Ct)值来计算相对mRNA表达。

蛋白质印迹

在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific)的200μL NP40细胞裂解缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中提取成纤维细胞总蛋白。或者，用尿素(8M尿素、5mM二硫苏糖醇、150mM NaCl、50mM Tris-Cl pH7.5、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(ThermoScientific))裂解细胞。将细胞超声两次(每次30秒)，于4℃孵育30分钟，然后以10,000g离心10分钟。用二辛可宁酸技术(Pierce BCA Protein Assay Kit)评估蛋白浓度，用nanodrop 1000(Thermo Fisher Scientific Inc.)测量562nm处的吸光度。将等量的蛋白质(40μg)上样至10％Tis-甘氨酸凝胶(Criterion^TM XT precast gel)，使用XT Tricine运行缓冲液(Biorad,USA)。电泳后，将凝胶点转移至硝基纤维素膜或Immobilon-FL聚偏二氟乙烯膜(Millipore)，室温下在以1：1稀释于PBS中的Odyssey阻断缓冲液中阻断，并用各种一级抗体在4℃孵育过夜或在室温孵育2小时。用TBS-T缓冲液[20mM tris(pH 7.4)、150mMNaCl和0.05％Tween 20]洗涤印迹，并在Odyssey阻断缓冲液(LI-COR Biosciences)中用1:10,000IR-Dye 800–偶联的二级驴抗山羊或IR-Dye700–偶联的二级抗小鼠抗体(LI-CORBiosciences)孵育。对于IR-Dye800和IR-Dye 700检测,使用Odyssey红外成像系统(LI-CORBiosciences)。GAPDH、α-微管蛋白或β-肌动蛋白用作细胞内总蛋白的上样对照。

免疫沉淀

用Dynabead Protein G免疫沉淀试剂盒(Invitrogen)进行免疫沉淀。向50μl(1.5mg)Dynabeads加入5μg小鼠单克隆抗-早老蛋白抗体(Abcam)，在室温下旋转10分钟。除去上清液，在200μL具有含有5mM N-乙基马来酰亚胺(NEM,Thermoscientific)的Tween-20的PBS中洗涤珠-抗体复合物。除去上清液，将Dynabead与用含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific)和5mM NEM的NP40细胞裂解缓冲液(Invitrogen)提取的200μl细胞裂解物(200μg蛋白质)一起孵育，在室温下旋转试管30分钟。根据制造商的方案洗涤珠3次。用含有5mM NEM的20μl洗脱缓冲液洗脱蛋白质。如上所述进行SDS/PAGE和免疫印迹。

蛋白酶体活性试验

用Proteasome-Glo^TM 3-Substrate Cell-Based试验系统(Promega)测定HGPS和对照细胞中的蛋白酶体活性，所述系统允许测量培养细胞中与蛋白酶体复合物相关的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样或半胱天冬酶样的蛋白酶活性。每个Proteasome-Glo^TM Cell-BasedReagent包含特异性的发光蛋白酶体底物。这些肽底物是分别用于糜蛋白酶样、胰蛋白酶样或半胱天冬酶样活性的Suc-LLVY氨基荧光素(琥珀酰-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-氨基荧光素)、Z-LRR-氨基荧光素(Z-亮氨酸-精氨酸-将氨酸-氨基荧光素)和Z-nLPnLD-氨基荧光素(Z-正亮氨酸-脯氨酸-正亮氨酸-天冬氨酸-氨基荧光素)。在37℃,5％CO2下，在96孔板中以100μl/孔培养细胞(10,000个细胞/孔)。在加入100μl底物/孔和荧光素检测试剂之前，允许将板平衡至22℃。用平板振动器以700rpm将孔的内容物混合2分钟，并在室温下孵育10分钟。被蛋白酶体切割后，释放荧光素酶的底物(氨基荧光素)，允许发生荧光素酶反应并产生光。用GloMax-Multi检测系统:光度计(Promega,USA)测定发光为相对光单位(RLU)。

衰老的测量

根据制造商的说明，用Beta-Glo试验试剂盒(Promega)测量衰老。用GloMax-Multi检测系统:光度计(Promega,USA)测定发光强度为相对光单位(RLU)。

活力和细胞毒性试验

根据制造商的说明，用MultiTox-Fluor Multiplex细胞毒性试验(Promega)测量活力和细胞毒性。MultiTox-Fluor试验同时测量两种蛋白酶的活性：一种是使用荧光细胞渗透肽底物的细胞活力标志物(甘氨酰-苯丙氨酰氨基氟香豆素；GF-AFC)，另一种是细胞毒性标志物(双丙氨酰-丙氨酰-苯基丙氨酰-罗丹明110；bis-AAF-R110)。活细胞和死细胞的蛋白酶产生不同的产物，AFC和R110，其具有不同的激发和发射谱，允许其被同时检测。用GloMax-Multi检测系统:光度计(Promega,USA)测量，结果以相关荧光单位(RFU)提供。数据代表重复三次的至少三个独立实验。

增殖试验

根据制造商的说明，用CellTiter 96一水溶液细胞增殖试验(Promega)测量细胞增殖率。用GloMax-Multi检测系统:光度计(Promega,USA)监测吸光度。

成纤维细胞的重编程

用从HGPS患者活检分离的成纤维细胞(在Assistance Publique

deMarseille进行，13-8243)或由Coriell Institute(Camden,USA)提供的成纤维细胞(AG01972)，通过重编程产生诱导的多能干细胞(iPS)。用基于逆转录病毒介导的四种转录因子(即Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)的转染的Yamanaka初始方法将细胞系重编程为iPSC(41)。分化前将iPSC系扩增至15次传代。

多能干细胞的培养和分化

在STO小鼠成纤维细胞上生长HGPS iPSC，用10mg/ml丝裂霉素C灭活，以30,000/cm2接种，并如前所述生长(42)。对于分化，用之前公开的用于分化的指导方案(43-45)将iPSC分化为间充质干细胞(MSC-iPSC)。通过荧光激活细胞分选(FACS)分离CD31+细胞从iPSC获得VSMC(46)。

小鼠

之前已经描述了在内源Lmna基因携带c.1827C>T(p.Gly609Gly)突变(对应于人HGPS突变c.1824C>T(p.Gly609Gly))的敲入小鼠模型(Lmna^G609G/G609G)(31)。在异氟烷麻醉下，每周3次，向8月龄的纯合敲入小鼠(Lmna^G609G/G609G)的右腓肠肌中注射MG132(1或10μg/Kg体重)2周。对侧肌肉作为对照(DMSO)。将MG132溶于二甲基亚砜(DMSO)，然后在100μl无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释用于肌肉内注射。单独的媒介和MG132处理均没有在小鼠中产生任何明显的损伤或应力反应。动物实验是按照欧洲实验动物护理和使用指南(欧盟指令2010/63/EU)，按照法国国家卫生和医学研究所(INSERM)和艾克斯马赛大学伦理委员会的实验动物护理和使用指南提供的建议进行的。

统计分析

用GraphPad Prism软件进行统计分析。用GraphPad Prism，用双尾学生t检验分析组之间的差异。在所有情况下，假设实验数据符合t检测要求(正常分布和相似变量)；在其中t检测假设不成立的情况下，使用非参数统计方法(Mann-Whitney检测)。认为P值小于.05是显著的。误差条表示平均值的标准误差。

结果

鉴定线样PML-NB为HGPS细胞系中的新生物标志物

HGPS细胞的经典标志是早老蛋白的积聚，因此发明人研究了患有HGPS的三位患者的成纤维细胞(AG11498、AG01972、5968)中早老蛋白的亚细胞定位。免疫染色显示，在培养的后期传代中核质内早老蛋白标记点和纤维状聚集体的大量积聚(数据未显示)。

由于PML-NB已经被提出作为靶向蛋白酶体降解的错误折叠蛋白的封存位点(47)并且已经涉及细胞衰老的控制(48)，发明人假设这些细胞器可能涉及早老蛋白的积聚或降解。发明人探索了三位患有HGPS的患者的成纤维细胞(AG11498、AG01972、5968)和两位健康受试者的成纤维细胞(8471、8498)中PML蛋白的定位。在早期传代中(9-15代)，PML蛋白在患者和对照中的分布类似，PML-NB表现为经典的点状结构(10-30个小体/0.5μm直径的细胞)。在后期传代中(16-26代)，相对于培养物中的细胞倍增，在HGPS细胞核中异常球形和线样PML-NB的数量增加。与此相反，在正常对照成纤维细胞中检测到非常少的异常PML-NB，无论是在同样的或更年老的培养物(29-33代)中(数据未显示)。

发明人然后分析了PML-NB的组成。对后期传代的HGPS成纤维细胞上进行的用抗PML抗体和针对PML-NB的经典成分的抗体(SP100、HP1、DAXX、CBP和ATRX)的双免疫染色表明，这种结构的组成与常规PML-NB的组成类似，且可能具有相似的功能(数据未显示)。

因此，可以认为线样PML-NB是HGPS细胞系中的新生物标志物。

PML-NB是HGPS成纤维细胞细胞核中的早老蛋白积聚细胞器

为评估线样PML结构的存在和早老蛋白的存在之间的可能关系，发明人用抗PML和抗早老蛋白抗体对HGPS成纤维细胞进行了双免疫染色。有趣的是，早老蛋白与PML共定位。使用共焦显微镜，发明人发现PML-NB包含早老蛋白(数据未显示)。

为测定除早老蛋白之外的其他核纤层固有蛋白是否具有靶向至PML-NB的能力，发明人测试了核层蛋白A、C、B1、B2、Nup-153和emerin的亚细胞定位。在研究的蛋白中，仅B型核层蛋白(B1和B2)也包括于球形和线样的PML-NB结构中。核内共聚焦面和PML 3D可视化的预测表明，线样PML-NB位于核质内(数据未显示)。此外，在PML-NB中从未观察到定位于内质网内腔或核包膜的钙调蛋白(数据未显示)。这表明，PML-NB不对应于可以锚定早老蛋白、B型核层蛋白或emerin的核包膜的内陷。

蛋白酶体抑制剂MG132降低HGPS细胞中的早老蛋白水平

与细胞质不同，在真核细胞的细胞核中的三个主要的互补蛋白水解系统介导的蛋白质降解(即自噬、泛素蛋白酶体系统(UPS)和半胱天冬酶)中，只有UPS和半胱天冬酶有作用。据信细胞核蛋白酶体介导的蛋白质降解在不同的核质灶中发生(47)。这些蛋白水解核亚结构域代表代表其中泛素、蛋白酶体和SUMO偶联物浓缩的PML-NB的子集(49-52)。泛素和26S蛋白酶体与早老蛋白一起存在于线样PML结构中，强烈地支持它们可能参与蛋白质的降解，特别是通过UPS降解早老蛋白。

为分析蛋白酶体活性水平是否能够影响HGPS细胞中早老蛋白的积聚，发明人用特异性的荧光底物测量了三种不同蛋白酶体的催化活性：糜蛋白酶、胰蛋白酶和半胱天冬酶样的活性。与类似或更年老的健康受试者相比，HGPS细胞显示增加的三种蛋白酶体的酶活性(图1A)。这表明，UPS系统可能达到饱和点，在该饱和点上超出了降解早老蛋白聚集的能力。实际上，鉴于HGPS患者的成纤维细胞显示升高的ROS(53)，氧化应激可能导致蛋白酶体的饱和，这是由过量的错误折叠的、氧化损伤的和泛素化的蛋白质导致的。之前已经描述了HGPS成纤维细胞中蛋白酶体降解蛋白能力的显著降低；发生的损害部分是由于组装蛋白水解复合物所需的亚单位数量减少以及高水平的ROS和氧化蛋白质(54)。总之，这些结果表明，早老蛋白被捕获于PML-NB内，且不通过泛素蛋白酶体系统(UPS)自然降解。

为测定蛋白酶体抑制剂是否影响早老蛋白的水平，发明人在HGPS细胞系上用10μMG132进行时间过程处理，并用蛋白质印迹检测早老蛋白的水平。出乎意料地，从MG132处理6h至48h，MG132诱导早老蛋白水平的降低。当归一化至微管蛋白对照时，蛋白质印迹定量蛋白显示，与DMSO处理的HGPS细胞相比，MG132处理的HGPS细胞中早老蛋白的量在6h、24h和48h分别降低～31％、58％和65％(图1B)。

肽醛(MG132)和肽硼酸盐(MG262)蛋白酶体抑制剂而不是其他硼酸酯类似物(硼替佐米和卡非佐米)引起早老蛋白清除，同时它们在蛋白酶体酶活性中表现出不同的抑制

为确认或排除蛋白酶体抑制参与早老蛋白清除，发明人在相同条件下测试了几种蛋白酶体抑制剂。MG115(Z-Leu-Leu-nVal-al)，另一种醛类蛋白酶体抑制剂，最初被认为不如MG132有效，被发现具在抑制早老蛋白积聚方面有相同功效(图1C)。硼酸盐类似物MG262(Z-Leu-Leu-Leu-硼酸盐)尽管对蛋白酶体活性位点的亲和力较高，但效果较差。MG262比醛MG132更有效(55)，因此发明人预期MG262能在比MG132更低的浓度下有效达到相同的效果。然而，发明人发现，MG262仅在与MG132相等的剂量下诱导HGPS细胞中的早老蛋白清除(数据未显示)。这些发现与MG132和MG262对半胱天冬酶和蛋白酶体酶活性的已知差异作用一致。

然后，发明人测试了两种FDA批准(治疗多种骨髓瘤)的蛋白酶体抑制剂硼替佐米和卡非佐米对早老蛋白清除的效果。与醛MG132和MG115不同，这两种分子不诱导早老蛋白清除，因为早老蛋白的表达如在HGPS对照中一样被维持(图1C，进一步数据未显示)。这种无效可能与其对HGPS细胞系中蛋白酶体酶活性的不同作用有关(图1D)。然而，这些发现表明，MG132对早老蛋白清除的效果不是仅仅由其对蛋白酶体的已知作用介导。

早老蛋白清除部分由自噬诱导引起

除了泛素-蛋白酶体系统，细胞内蛋白质降解的另一个主要途径是自噬-溶酶体通路。观察到的蛋白酶体抑制时的早老蛋白降低引发了这种清除如何能发生这一问题，并进一步表明早老蛋白可能是自噬降解的底物，特别是因为已经显示蛋白酶体抑制导致自噬的补偿性增强(57-59)。为评估在MG132增强的早老蛋白清除中是否涉及巨自噬过程，发明人用氯喹或直接改变溶酶体酸性pH的向溶酶体剂，或溶酶体质子泵抑制剂洛霉素A1来抑制自噬。用高剂量氯喹或洛霉素A1处理暴露于MG132的HGPS成纤维细胞部分抑制了MG132的作用并诱导部分早老蛋白再表达(图2)，表明在MG132处理中观察到的增加的早老蛋白清除部分是由自噬-溶酶体通路介导的。引人注意的是，高剂量氯喹或洛霉素A1单独处理也导致早老蛋白的表达水平降低(图2)。实际上，已经报道了在培养的人结肠癌中，抑制自噬导致蛋白酶体活性增加和蛋白酶体亚单元的上调(60)。然而，用这两种抑制剂处理HGPS细胞没有改变三种蛋白酶体的活性。因此，这些发现表明，由氯喹或洛霉素A1诱导的早老蛋白水平降低中不涉及蛋白酶体的活化。用LC3B来评估自噬水平，因为通过脂质化将LC3-I转化为LC3-II为自噬活性提供了指标。如预期一样，MG132处理后LC3B-II水平增加，同时早老蛋白水平降低(图2A)。同时阻断UPS和自噬后不完全的早老蛋白再表达表明，除了自噬外，MG132对早老蛋白清除的功效还受另一种蛋白水解伴随活动的介导。

半胱天冬酶-6被广泛认为是在细胞凋亡中对核层蛋白A和C的切割负责。核层蛋白A/C和早老蛋白显示位于227-230位的非螺旋连接区L12中的保守VEID半胱天冬酶6切割位点(61-64)。为研究MG132诱导的早老蛋白清除中半胱天冬酶-6的参与，发明人用MG132和半胱天冬酶-6抑制剂的组合处理HGPS细胞48h。再一次，在氯喹存在或不存在下，早老蛋白水平保持低于HGPS对照(图2B)。或者，因为早老蛋白具有富含亮氨酸的核输出信号(NES)，用普霉素B测试可能的CRM1介导的早老蛋白输出至细胞质，抑制含有富含亮氨酸的NES的蛋白质的CRM1依赖性核输出(65)。结果是，普霉素B不抑制MG132诱导的早老蛋白清除。由于当用MG132抑制时，早老蛋白在核质中不能通过蛋白酶体降解，它的清除因而被解释为通过另外的途径降解或通过下调新合成的蛋白或通过普霉素B不敏感的核质早老蛋白的流出。实际上，已经在层状病毒中显示了通过核大分子或含PML复合物的核包膜破裂到细胞质的出口(66)。

用MG132的蛋白酶体抑制后，早老蛋白在自噬泡中积聚

已经报道了MG132能够导致PML-NB成分蛋白被易位进入细胞核(35,36)。其他最新的发现表明了细胞核和PML-NB之间的动态关系(37-39)。为研究MG132处理后早老蛋白的亚细胞定位，发明人对用MG132(10μM)处理6h和24h的HGPS细胞系用早老蛋白和PML抗体进行了时间过程的间接免疫荧光。MG132处理24h诱导了大的早老蛋白和PML核内灶的形成(数据未显示)。无论是来自健康受试者的成纤维细胞还是HGPS患者的成纤维细胞，使用针对定位于核仁的致密纤维组分的纤维蛋白原的抗体进行分析，显示与PML和Emerin重叠(数据未显示)。已经报道了在用MG132处理细胞时，p53与灭活的蛋白酶体位于与核糖体生产室不同的核内区域(67)。这些观察与我们的结果一致，因为我们也观察到p53位于核仁。在相同条件下，发明人已经表明，核层蛋白B1/B2、26S蛋白酶体亚单元和泛素与PML共定位于核仁中。因此，当蛋白酶体依赖性降解被阻断时，核仁可能作为固定和暂时储存积聚的早老蛋白的替代封存位点，因为发明人在MG132处理24h后检测到PML和LC3B的细胞质共定位(数据未显示)。同时，在该处理期间，早老蛋白主要仍位于核仁内(数据未显示)，48h后，在细胞质中检测到早老蛋白聚集体，发明人在细胞质中发现其与LC3B共定位(数据未显示)。为进一步研究含有细胞质早老蛋白的聚集体的类型，发明人探索了自噬泡的其他标志物，例如p62(已知的自噬底物)和LAMP-2(溶酶体膜蛋白)。用早老蛋白和p62或LAMP-2抗体标记的双免疫荧光证实，HGPS细胞系暴露于MG132 48h后，细胞质早老蛋白在p62和LMAP-2阳性的小泡中积聚。总之，这些结果表明，用MG132处理后，早老蛋白在自噬泡中积聚，进而在细胞质中进行自噬降解。

MG132下调核层蛋白A前体异常mRNA剪接

因为与HGPS对照细胞相比，阻断所有主要降解通路不能恢复早老蛋白水平，发明人进一步评估了MG132是否在转录水平上对核层蛋白和早老蛋白有作用。因此，发明人进行了定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)试验来定量MG132处理的HGPS和对照细胞中的早老蛋白的转录水平。如图3A所示，MG132处理几乎以时间依赖的方式消除早老蛋白的mRNA表达，表明其在蛋白质和转录水平上对早老蛋白的双重作用。

之前已经表明，富含丝氨酸-精氨酸(SR)的蛋白质的子集(包括富含丝氨酸-精氨酸的剪接因子-1，SRSF-1)对LMNA外显子11的5'剪接位点(5'SS)的识别和对来自c.1824C>T突变的LMNA等位基因的核层蛋白A和早老蛋白的产生的调节作用(32)。此外，已经表明，MG132的T细胞刺激主动诱导SRSF-1的降解，并且半胱天冬酶-3有助于T细胞活化期间调节SRSF-1蛋白的表达(68)。鉴于在自噬性抑制剂存在下早老蛋白部分再表达且MG132处理后早老蛋白mRNA的表达水平降低，发明人假设MG132的作用也可以由SRSF-1表达的降低(从而剪接早老蛋白mRNA前体并产生早老蛋白)介导。有趣的是，发明人表明，用MG132处理HGPS成纤维细胞48h导致SRSF-1水平显著降低，同时早老蛋白水平降低(图3B)。为了排除添加MG132使早老蛋白可能变得不溶而不能完全从聚集体中提取，本发明人用尿素溶解细胞。该实验表明，早老蛋白在处理72h后重新出现。因此，对早老蛋白清除的长期作用可能需要48h后的再处理。为探索涉及半胱天冬酶的机制是否在SRSF-1表达中起作用，发明人在HGPS细胞处理期间添加了泛半胱天冬酶抑制剂(VAD)，并观察到SRSF-1蛋白表达的拯救，同时增加的早老蛋白稍微达到对照水平。还值得注意的是，通过使用MG132、泛半胱天冬酶抑制剂和氯喹的组合观察到更高的早老蛋白再表达。有趣的是，发明人观察到，自噬抑制剂(氯喹和洛霉素A1)也能够降低SRSF-1水平，这可以解释在其处理后观察到的早老蛋白水平的降低。实际上，已经在活化的T细胞中描述了洛霉素A1对降低SRSF-1水平的作用(68)。为更好地理解SRSF-1在调节早老蛋白表达中的参与，发明人用小干扰RNA(siRNA)处理HGPS细胞以瞬时耗尽SRSF-1细胞内容物。图5所示的结果表明，SRSF-1的siRNA敲低极大降低了早老蛋白的水平，证明了该剪接因子在MG132诱导的早老蛋白清除中的重要作用。

总之，结果表明，自噬诱导、半胱天冬酶和通过SRSF1灭活的剪接机制在MG132处理下发挥了促进早老蛋白清除的融合作用。

由于SRSF1参与控制核层蛋白A/早老蛋白的剪接交换，发明人假设MG132调控核层蛋白A的转录物水平。为测试该假设，发明人使用qRT-PCR来探索MG132处理后的HGPS细胞的mRNA水平。MG132时间过程的qRT-PCR分析表明，核层蛋白A转录物显著降低，同时观察到不太明显的核层蛋白C转录物水平的降低(图4A)。观察到的核层蛋白A/C mRNA的降低促使发明人评估蛋白酶体抑制后它们对应的蛋白质水平。如图4B所示，发明人发现，在用MG132处理48h期间，核层蛋白A和C的蛋白质水平均升高。

MG132降低患者iPS衍生的MSC和VSMC中的早老蛋白水平

为测定MG132是否也影响其他细胞谱系中的早老蛋白水平，发明人从HGPS患者的成纤维细胞制备了iPSC。衍生自HGPS iPSC的间充质干细胞(MSC)和血管平滑肌细胞(VSMC)呈现了通常描述的HGPS成纤维细胞异常，即增殖能力的丧失，早衰和核泡(69,70)。发明人用早老蛋白抗体对MG132处理的VSMC进行免疫染色。

MG132处理的VSMC导致早老蛋白从1.25μM开始的显著降低(数据未显示)。同时，发明人研究了MG132处理后的早老蛋白和SRSF-1水平，并比较了HGPS成纤维细胞、iPS-MSC和iPS-VSMC。这表明，在所有测试的细胞系中，MG132处理降低了早老蛋白和SRSF-1水平(数据未显示)。由于活力测试表明本研究中所用的剂量在HGPS成纤维细胞、iPS-MSC和iPS-VSMC中不诱导显著死亡，观察到的早老蛋白清除与增加的细胞凋亡或细胞死亡不相关，因为其他FDA批准的蛋白酶体抑制剂也一样(图6)，表明MG132作为早老蛋白的治疗剂具有非常低的毒性和强的潜力。

MG132降低Lmna^G609G/G609G小鼠肌肉中的早老蛋白水平

由于MG132在各种细胞系中诱导几乎完全的早老蛋白清除，调查其体内作用是令人感兴趣的。因此，发明人测试了肌肉内注射MG132是否也能够在我们的敲入小鼠模型(Lmna^G609G/G609G)中增强早老蛋白清除，所述模型在内源Lmna基因中携带c.1827C>T(p.Gly609Gly)突变，对应于人HGPS突变c.1824C>T(p.Gly608Gly)。如图7所示，与未处理络肌相比，用1μg/Kg MG132处理诱导了处理肌肉中早老蛋白水平的显著降低。在这些条件下，观察到核层蛋白A的小幅增加和核层蛋白C的降低，但这些变化不显著。在10μg/kg体重，注射MG132也导致早老蛋白水平显著降低，但这伴随着核层蛋白C的降低。然而，核层蛋白A的水平保持不变或稍微增加，这补偿了核层蛋白C的降低，如之前在健康的但核层蛋白C完全不存在的Lmna^LAO/LAO小鼠中所示(71)。

这些数据提供证据表明，在来自HGPS患者的成纤维细胞中，早老蛋白被封存在蛋白酶体和泛素化蛋白质所在的PML-NB中。用MG132的蛋白酶体抑制诱导半胱天冬酶介导的SRSF-1表达水平的降低和在早老蛋白的核仁易位及其随后输出至细胞质之后发生的自噬诱导的早老蛋白降解。

根据MG132处理后的早老蛋白清除，本文报道的结果为治疗患有早老症的儿童提供了令人鼓舞的策略。观察到的对早老蛋白(少量(sparing)A型核层蛋白)的特异性进一步支持以下观点：除了典型的早老症，与核层蛋白A前体缺陷相关的疾病可能从同样的治疗受益。最后，考虑到MG醛家族(特别是MG132和MG115)的蛋白酶体抑制剂对SRSF-1下调的活性，该分子家族可能对以下具有有益效果：期间积聚早老蛋白的生理老化，以及涉及SRSF-1所用的隐蔽隐蔽剪接位点的活化的疾病或表现出SRSF1过表达的疾病如某些癌症。

实施例2：蛋白酶体抑制剂下调人腺癌细胞系中的SRSF-1

材料和方法

细胞培养

从ATCC获得六个腺癌人细胞系(肺:A549,HCC827；结肠:HCT116,HT-29；胰腺:PANC-1,Mis PaCa-2)，根据需要培养并增殖(50-60代)以获得含有5x 10⁵-10⁶个细胞/小瓶的小瓶，其冷冻于DMSO并储存于-80℃，直到进一步使用。如上所述检查细胞活力。

蛋白酶体抑制剂处理

在3个浓度(0.1、1和10μM，DMSO中)下孵育MG132(474790.Merck Chemical LTD)、MG262(I-120-200.R&D Systems)和硼替佐米(S1013.Euromedex)24h。对照细胞仅在DMSO媒介中孵育。

抗体

针对SRSF1、核层蛋白A/C、早老蛋白、肌动蛋白和GAPDH(用作上样对照)的抗体如实施例1所述。

蛋白质印迹和图像分析方法已经在以上实施例1中详细描述。

结果

所有研究的腺癌细胞系表达的SRSF-1，主要条带为～32kDa(对应于ASF2亚型，测量其强度)和两个次要条带，～28kDa的是SRSF-1的ASF1亚型，～60kDa的条带可能是二聚体。当沉积40μg蛋白质时，SRSF-1条带的强度是在含有20μg沉积蛋白质的泳道中测量的强度的两倍。

DMSO媒介增加SRSF-1的量(图8)。MG262、MG132和硼替佐米诱导SRSF-1的量降低，从-20％至-77％，呈现剂量依赖性效果，抑制剂功效从硼替佐米至MG132然后MG262增加。此外，即使在相同范围，根据所用的上样带电对照是肌动蛋白或GAPDH，数据也不同。

所有的细胞系研究证实了各种量的核层蛋白A/C，但从未表达早老蛋白。

这些结果证实了使用MG132和MG262的HGPS细胞获得的关于SRSF1的结果，而硼替佐米在HGPS细胞和癌细胞中表现出不同的作用。

实施例3：蛋白酶体抑制剂MG132对果蝇模型中的眼咽肌营养不良症(OPMD)具有积 极作用

引言

眼咽肌营养不良症(OPMD)是常染色体显性的发作迟缓的肌营养不良症，通常在第五或第六十年开始，其特征为进展性眼睑下垂(下垂)、吞咽困难(吞咽困难)和近端肢体虚弱。OPMD是一种罕见疾病(欧洲1/10 000)，全球分布；它是布哈拉犹太人(1/600)和魁北克省(1/1000)最常见的肌营养不良症(综述:(72,73))。目前没有对该疾病的药物治疗；可以进行手术以改进吞咽和提升下垂的眼睑。

引起OPMD的基因已被鉴定为编码聚(A)结合蛋白核1(PABPN1)的基因。在OPMD患者中，PABPN1扩增了编码位于蛋白N末端的聚丙氨酸道的GCG重复序列(74)。聚丙氨酸扩增是中度的，因为正常蛋白中存在10个丙氨酸，而在蛋白质的突变体形式中扩增为12-17个丙氨酸。

OPMD的病理学特征是肌肉纤维中的核包涵体，其由管状细丝组成且含有突变的不溶性PABPN1，以及Hsp70、泛素和蛋白酶体的亚单元(75-78)。几种RNA结合蛋白和I型精氨酸甲基转移酶、PRMT1和PRMT3(已知甲基化PABPN1)也被募集入核内含物(78-80)。PABPN1中的聚丙氨酸扩增引起错误折叠和聚集成由突变蛋白的较慢转换导致的内容物。

PABPN1具有核聚腺苷酸化的功能，即导致在mRNA的3'末端形成聚(A)尾的mRNA加工反应。PABPN1在该反应期间与新生的聚(A)尾结合，并具有两个作用：刺激聚(A)聚合酶(合成聚(A)尾的酶)，以及控制聚(A)尾长度(81-84)。PABPN1还参与控制早期胚胎(81)中的细胞质mRNA poly(A)尾、聚(A)RNA的衰变或从核中输出(85)、替代性聚(A)位点选择的调控(86，87)以及长非编码RNA(lncRNA)的转换(88)。

已经开发了OPMD的果蝇模型，其中丙氨酸扩增的哺乳动物PABPN1(PABPN1-17ala)在果蝇肌肉中特异性表达(89,90)。这些模型概括了疾病特征，即进展性肌无力和退化，以及PABPN1核聚集体的形成。通过以下事实已经证实了果蝇模型的相关性：鉴定为参与果蝇中的OPMD的分子机制已经在OPMD患者活检中证实(91,91)。果蝇模型已经用于鉴定OPMD的潜在活性药物，特别是抗聚集药物(92)。

材料和方法

如下制备药物补充食物。将即时果蝇介质(Carolina Biological SupplyCompany)在每个小瓶中用1％酵母的水溶液重新配制，补充增加浓度的溶于DMSO(二甲基亚砜)中的药物或单独的DMSO。MG132购自Santa Cruz Biotechnology(SC-201270)。每个小瓶含有5ml或2.5ml的重构介质，分别饲养幼虫或成虫。个体从幼虫阶段开始喂药。每只小瓶转移70至80只第一龄幼虫，并在同一小瓶中发育至成虫；将成虫转移到具有相同浓度药物的新小瓶中。为了确定药物毒性，将80只第一龄幼虫转移到含有药物或单独DMSO补充的介质的小瓶中。将达到成虫的个体评分。

通过以下定量异常翅膀姿态：在出生时收集雄性成虫，每个小瓶5只雄性，不经麻醉在情况下通过小瓶直接观察果蝇每天对异常翅膀姿态评分。

结果

转录组学分析表明，泛素-蛋白酶体系统在果蝇和OPMD的小鼠模型和患者活检中普遍下调(20)。此外，蛋白酶体活性在OPMD的小鼠模型的肌肉中上调，并且这与肌肉萎缩相关(93)。这些结果使得发明人提出，UPS下调可能通过导致肌肉萎缩的增加的蛋白质降解参与OPMD。因此，发明人测试了用MG132降低蛋白酶体活性是否对果蝇模型中的OPMD有益。本发明人使用果蝇模型来测定MG132在体内的作用，所述模型中PABPN1-17ala在成虫间接飞行肌肉中从Act88F-PABPN1-17ala转基因组成型表达(90)。从幼虫阶段开始在食物中经口施用MG132，浓度分别为400、500和600μM。生存测试显示，果蝇培养基中的600μM MG132(在0.2％DMSO中)对活力没有不利影响(图9A)。间接飞行肌肉中的PABPN1-17ala表达导致异常翅膀姿态，这是由受影响的肌肉功能和肌肉退化引起(89)。从成年期的第3天到第11天记录翅膀姿态缺陷。通过记录具有异常翅膀姿态的表达Act88F-PABPN1-17ala的果蝇数量来量化MG132的效果。所有三种MG132浓度显示出有益的效果，因为与单独的DMSO相比，它们导致具有异常翅膀姿态的果蝇数量显著减少(图9B)。

因此，蛋白酶体抑制剂MG132改进了其特征在于毒性蛋白聚集体的核积聚的遗传性肌病OPMD。

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Claims (8)

1.修饰的三肽或其药学上可接受的盐之一在制备用于治疗和/或预防选自以下的病症的药物中的用途：

早老综合征；和

横纹肌疾病；

其中所述修饰的三肽选自Z-Leu-Leu-Leu-al、Z-Leu-Leu-nVal-al、Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)₂或Z-Leu-Leu-Phe-al。

2.权利要求1所述的用途，其中所述横纹肌疾病是眼咽肌营养不良症。

3.权利要求1或2所述的用途，其中所述早老综合征选自Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)、非典型性早老综合征(APS)、限制性皮肤病、Nestor-Guillermo早老综合征、Werner综合征、Bloom综合征、Rothmund-Thomson综合征、Cockayne综合征、着色性干皮病和毛滴虫病。

4.权利要求1-3任一项所述的用途，其中将所述修饰的三肽或其药学上可接受的盐之一配制成可注射制剂。

5.修饰的三肽或其药学上可接受的盐之一在制备用于预防和/或减弱皮肤老化的药物中的用途，其中所述修饰的三肽选自Z-Leu-Leu-Leu-al、Z-Leu-Leu-nVal-al、Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)₂或Z-Leu-Leu-Phe-al。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述皮肤老化是人皮肤老化。

7.修饰的三肽或其药学上可接受的盐之一在制备用于减弱生理老化的药物中的用途，其中所述修饰的三肽选自Z-Leu-Leu-Leu-al、Z-Leu-Leu-nVal-al、Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)₂或Z-Leu-Leu-Phe-al。

8.根据权利要求7所述的用途，用于减少皱纹、细纹，和/或用于防止皮肤变薄和/或柔软干瘪的皮肤面貌。

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