KR20220044040A - Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220044040A
KR20220044040A KR1020200126989A KR20200126989A KR20220044040A KR 20220044040 A KR20220044040 A KR 20220044040A KR 1020200126989 A KR1020200126989 A KR 1020200126989A KR 20200126989 A KR20200126989 A KR 20200126989A KR 20220044040 A KR20220044040 A KR 20220044040A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lrp5
heart disease
ischemic heart
protein
expression
Prior art date
Application number
KR1020200126989A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102536092B1 (ko
Inventor
송희상
Original Assignee
조선대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 조선대학교산학협력단 filed Critical 조선대학교산학협력단
Priority to KR1020200126989A priority Critical patent/KR102536092B1/ko
Publication of KR20220044040A publication Critical patent/KR20220044040A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102536092B1 publication Critical patent/KR102536092B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/13—Nucleic acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/326—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having effect on cardiovascular health
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

LRP5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 의하면, HIF-1α를 안정화시킴으로써 허혈성 심장질환 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

LRP5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic heart disease containing an inhibitor of LRP5 expression or activity}
LRP5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
허혈(ischemia)은 혈관의 수축 또는 폐색에 의해 유발되는 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈액공급의 감소 상태를 말한다. 허혈 후에는 혈액의 재관류(repurfusion)가 일어나더라도 신경세포가 손상되어 여러 가지 후유증이 야기된다. 이러한 허혈은 종종 관상동맥 질환, 심장혈관 질환, 협심증, 두통 또는 기타의 혈관 증상들과 관련되며, 궁극적으로 비가역적인 손상, 즉 세포 및 조직의 괴사로 이어지게 된다.
이러한 허혈/재관류시의 세포 손상과 기능 저하에 의해 발생하는 심근 경색, 부정맥, 부전증 등의 허혈성 질환은 유병률 및 사망률이 높고 완치가 어려워 지난 50년 동안 집중적인 기초 연구 및 임상 연구가 진행되어 왔다 (Wang, Q. D. et al., Cardiovasc. Res. 55:25-37, 2002). 허혈/재관류 손상은 대사, 면역반응 및 이온항상성의 변화, 산소유리기 등 다양한 생리학적 기전이 관여되므로 면역조절 물질, 세포사멸 관련물질, 이온통로 조절 물질 등 다양한 분야에서 연구가 이루어지고 있다(Hearse, D. J. et al., Mol. Cell. Biochem. 186:177-184,1998). 현재까지 기전연구와 함께 새로운 작용점에 의한 치료제의 개발 및 외과적 시술의 개발 등이 활발히 이루어졌으나, 허혈/재관류로부터 심근세포를 보호할 수 있는 기술이 아직 임상적으로 상용화되지 못하였다.
따라서 허혈에 의한 심근세포 손상의 진행을 늦추고 재관류 손상을 완화시킬 수 있는 허혈성 심장질환의 예방 및 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
많은 저산소 반응들은 저산소증 유도인자 1(hypoxia inducible factor 1, HIF-1)에 의해 매개된다. HIF-1은 산소에 의해 조절되는(oxygen-regulated) 알파 서브유닛(HIF-1α 또는 HIF-2α)과 일정하게(constitutively) 발현되는 베타 서브유닛(HIF-1β)으로 이루어진 이종이합(heterodimeric) 전사조절인자(transcription factor)이다. 저농도 산소 환경에서 HIF-1α는 안정화되어 핵으로 이동하며, 이에 따라 HIF-1이 표적 유전자의 cis 조절인자인 HRE (hypoxia response element) 에 결합함으로써 특정한 표적 유전자의 발현을 유도한다.
LRP5 (저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질5: Low-density lipoprotein receptor-related protein 5)는 Wnt/β-catenin 신호 전달 활성화를 위한 필수 공동-수용체 역할을 하는 저밀도 지질 단백질 수용체 (LDLR) 계열에 속하는 단일-통과 막 관통 단백질이다. Wnt 공동-수용체로서, 기능 상실 돌연변이 또는 LRP5의 변경된 발현은 Wnt 신호 전달 이상을 통한 골다공증, 종양 발생 및 고 콜레스테롤 혈증을 포함한 많은 복잡한 인간 질병과 관련이 있다. 그러나 허혈성 심장질환과 관련하여서 LRP5의 역할에 대해서는 알려져 있지 않다.
한국등록특허 10-1939401
일 양상은 LRP5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 LRP5 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈성 심장질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 LRP5 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈성 심장질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 허혈성 심장질환이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 LRP5 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 심장질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 허혈성 심장질환의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 LRP5 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 LRP5 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 심장질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 LRP5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
일 양상은 LRP5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 LRP5 유전자는 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있고, 그 활성을 저하시키지 않는 하나 또는 그 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 LRP5 유전자 서열(서열번호 1)과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 LRP5 유전자의 발현 억제제는 LRP5 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA를 억제하는 것이면 당업계에 알려진 어떠한 물질도 포함할 수 있고, 화학적으로 합성하거나, 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 등 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 상기 발현 억제제는 LRP5 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것을 의미한다. 또한, 상기 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다.
상기 siRNA는 특정 mRNA의 절단을 통하여 RNA의 간섭을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 의미한다. 또한, 상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중가닥 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분도 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNA 간섭 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 말단 또는 돌출 말단 모두 가능하며, 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출 구조와 5' 말단 돌출 구조 모두 가능하다.
상기 shRNA는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 의미하며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵 (silence)시키는 데 이용될 수 있다. 또한, 상기 shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하여 세포로 전달될 수 있으며, 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 침묵이 유전될 수 있다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작에 의해 siRNA로 분해되어 RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합되고, 상기 복합체가 siRNA에 상응하는 mRNA에 결합하여 이를 분해시킬 수 있다.
상기 리보자임은 특이적 RNA 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자를 의미한다. 리보자임의 분자 서열과 상보적인 표적 RNA의 특이적 혼성화에 의해 핵산내부용해성 절단이 유도될 수 있고, 리보자임은 표적 RNA에 상보적인 하나 이상의 서열 또는 기능적 등가 서열의 절단을 담당하는 공지된 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 리보자임은 햄머-헤드(hammer-head) 리보자임 또는 리보핵산내부분해효소(endoribonuclease) RNA인 체크형(Cech type)리보자임일 수 있고, 변경된 올리고뉴클레오티드에 의해 형성되어 안전성, 표적화 등이 개선될 수 있다. 한편, 상기 리보자임은 생체내에서 표적 유전자를 발현하는 세포에 분포될 수 있고, 형질감염된 세포가 내생성 표적 메신저를 파괴하고 번역을 억제하기에 충분한 양의 리보자임을 생성하도록 강한 항시성 중합효소 III 또는 중합효소 II 프로모터의 조절 하에서 리보자임을 코딩하는 DNA 구축물이 사용될 수 있다. 리보자임은 촉매활성을 갖기 때문에, 다른 안티센스 분자와 달리 세포내에서 낮은 농도로 유지되어야 할 수 있다.
또한, 상기 LRP5 단백질은 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 이러한 변이체는 LRP5 단백질 서열과 80％, 90％, 95％, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 LRP5 단백질의 활성 억제제는 LRP5 단백질을 구성하는 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(mimetics), 기질유사체, 앱타머(aptamer) 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 펩티드 및 펩티드 미메틱스는 LRP5 단백질이 다른 단백질과 결합하는 것을 억제함으로써 LRP5 단백질의 활성을 억제하는 것일 수 있다. 상기 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 비가수분해성 펩티드 미메틱스는 주요 잔기로서 β-턴 디펩티드 코어, 케토-메틸렌 슈도펩티드류, 아제핀, 벤조디아제핀, β-아미노알콜 또는 치환 감마락탐환을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 앱타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하고, 분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질등에 결합하여 그 기능을 차단할 수 있으므로 단일 항체를 대체하는 일종의 화학 항체로 볼 수 있다. 또한, 상기 앱타머는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용하여, 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리함으로써 수득할 수 있다.
상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합항체일 수 있다. 특정 단백질에 대한 항체는 단백질의 서열이 공지되어 있다면 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 구체적으로, 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같이 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 분리된 면역 세포와 암 세포주를 융합하여 만들 수 있다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜 등을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킬 수 있다. 한계 희석법을 이용하여 서브 클로닝을 실시하고, 균일한 세포 집단을 수득한 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양하여 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.
상기 다클론항체는 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 상기 면역원이 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수득하고 이로부터 항체를 분리 및 정제하여 제조될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LRP5의 억제제는 BI905677, BI905681, DKK1(dickkopf) 또는 SOST(sclerostin)을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서의 용어 "허혈성 심장질환”은, 심장세포에 공급이 불충분하여 발생하는 질환으로서, 심근세포 등의 세포사가 유발되어 조직이 영구적 또는 비영구적으로 손상되는 질환을 의미할 수 있다. 상기 허혈성 심장질환의 예시는 관상동맥 질환,　협심증(예를 들면, 안정형 협심증, 불안정형 협심증, 이형 협심증), 심근경색증, 급사, 심장돌연사, 심장마비, 심장발작, 동맥경화증, 허혈성 심부전증, 심근비대증 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제는 LRP5와 PHDs(HIF prolyl-hydroxylase)와의 상호작용 억제제인 것일 수 있다. 상기 PHDs는 PHD1, PHD2, 또는 PHD3를 포함할 수 있고, 구체적인 실시예에 있어서, 상기 PHDs는 PHD2 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제는 심근세포에 LRP5와 PHDs의 상호작용을 억제하여 HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α)를 안정화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, LRP5가 저산소증 조건에서 HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1-alpha)를 히드록실화 시킴으로써 허헐/재관류 손상을 일으킴을 확인하였고, 이에 따라 LRP5를 침묵시킴으로써 HIF-1α가 발현되도록 하여 허혈/재관류 손상의 치료 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
용어 "약학적 조성물"은, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭할 수 있다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 임상투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 활성 성분을 개체 내로 전달할 수 있는 약학적 활성 성분의 종류는 항암제, 조영제(염료), 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 클로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 저분자 화합물, 핵산, 앱타머, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, siRNA 및 마이크로 RNA 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 약학적 조성물의 투여량은 1일 1 ug/kg/일 내지 1,OOO mg/kg/일일 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 허혈성 심장질환의 치유를 필요로 하는 개체일 수 있다.
다른 양상은 LRP5 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈성 심장질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자로부터 전사 또는 번역된 전사체(transcript) 및 이로부터 번역된 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준일 수 있다. 상기 전사체는 mRNA, 비-암호화 RNA(non-coding RNA), 또는 이들의 상보적 DNA(complementary DNA: cDNA)을 포함할 수 있다. 상기 단편(fragment)은 상기 단백질의 일부로서, 면역원성 폴리펩티드일 수 있다.
용어 "발현 수준(expression level)"은 단백질의 양 또는 전사체의 양을 의미한다. 상기 발현 수준은 단백질 또는 전사체의 상대적인 비율일 수 있다. 예를 들어, 발현 수준의 증가는 음성 대조군에 비해 단백질 또는 전사체의 양이 증가한 것일 수 있다.
상기 제제는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다.
상기 제제는 상기 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.
용어 "진단(diagnosis)"은 병명을 판정하는 일을 말하고, 허혈성 심장질환의 병명, 병의 상태, 병기, 병인, 합병증의 유무, 예후, 및 재발 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 LRP5 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈성 심장질환 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 허혈성 심장질환의 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.
또 다른 양상은 허혈성 심장질환이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 LRP5 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 심장질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 허혈성 심장질환을 앓고 있거나 허혈성 심장질환에 걸린 것으로 의심되는 개체일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 상기 개체로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던 블롯팅, 폴리머라아제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사-PCR(reverse transcription-PCR: RT-PCT) 폴리머라아제 증폭 반응, 실시간 PCR, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "정상 대조군(normal control)"은 용어 "음성 대조군(negative control)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 정상 대조군은 허혈성 심장질환에 걸린 적이 없는 개체 또는 건강한 개체일 수 있다.
상기 방법은 상기 LRP5 유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 증가한 경우, 상기 개체는 허혈성 심장질환에 걸리거나 허혈성 심장질환에 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 LRP5(예를 들면, LRP5 유전자, 또는 단백질)에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질 처리된 LRP5 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 LRP5 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 무처리 대조군에 비해 감소한 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 심장질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 유전자의 발현 수준은 LRP5의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 mRNA의 발현 수준은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
또한, 상기 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 측정하는 단계는, LRP5와 PHDs(HIF prolyl-hydroxylase)와의 상호작용 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상기 상호작용 수준을 무처리 대조군에 비해 감소시킨 후보 물질을 추가적으로 선별하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 후보 물질은 허혈성 심장질환의 치료에 효과적인 것으로 예상되는 임의의 물질일 수 있다.
상기 방법은, 상기 측정된 LRP5의 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 LRP5의 발현 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 개체의 허혈성 심장질환의 치료에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 LRP5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (이하, '기능성 원료')을 사용하여 제조한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 겔, 젤리, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 또는 건강 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 건강기능식품에 함유된 유효성분 (즉, LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제)의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.0001 내지 99 중량%, 0.0001 내지 95 중량%, 0.0001 내지 90 중량%, 0.0001 내지 80 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 0.001 내지 99 중량%, 0.001 내지 95 중량%, 0.001 내지 90 중량%, 0.001 내지 80 중량%, 0.001 내지 50 중량%, 0.01 내지 99 중량%, 0.01 내지 95 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 80 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 0.1 내지 95 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 80 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 0.1 내지 30 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 1 내지 99 중량%, 1 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 50 중량%, 1 내지 30 중량%, 1 내지 10 중량%, 10 내지 99 중량%, 10 내지 95 중량%, 10 내지 90 중량%, 10 내지 80 중량%, 10 내지 50 중량%, 10 내지 30 중량%, 25 내지 99 중량%, 25 내지 95 중량%, 25 내지 90 중량%, 25 내지 80 중량%, 25 내지 50 중량%, 25 내지 30 중량%, 40 내지 99 중량%, 40 내지 95 중량%, 40 내지 90 중량%, 40 내지 80 중량%, 40 내지 50 중량%, 50 내지 99 중량%, 50 내지 95 중량%, 50 내지 90 중량%, 50 내지 80 중량%, 60 내지 99 중량%, 60 내지 95 중량%, 60 내지 90 중량%, 또는 60 내지 80 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제 (치즈, 초콜릿등), 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 전체 건강 기능성 식품 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발명에 대해 기술한 용어 및 방법 등은 각 발명들 간에 동일하게 적용된다.
일 양상에 따른 LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 의하면, HIF-1α를 안정화시킴으로써 허혈성 심장질환 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 저산소증으로 인한 심근 세포 사멸에서의 LRP5 및 LRP6의 구별되는 역할을 나타낸다:
도 1A는 8 시간 동안 저산소 상태 (O2 1.2 %)에 노출된 심근 세포에서 LRP5 및 LRP6 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이고, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 1B는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 Ad-LRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 트리판 블루 배제 분석을 이용하여 세포 생존율의 상대적 백분율을 평가한 사진 및 그래프이며; 도 1C는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 Ad-LRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율의 상대적 백분율을 평가한 사진 및 그래프이고, 상기 도 1B 및 도 1C에서 세포 생존율은 정상 산소 Ad-lacZ 대조군으로 표준화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 1D는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 Ad-LRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 카스파아제-3 활성을 측정한 그래프이며, 데이터는 ml 단위의 샘플 부피당 분당 pNA (p-니트로아닐린)의 pmol로 나타내었다. 카스파아제-3은 양성 대조군으로 사용되었다 (5 μg/ml의 5 μl). 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 1E는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 아넥신 V-Cy3.18 염색 (빨간색)의 형광 이미지이고, 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었으며, 스케일 바는 200 μm이다. 아폽토시스 비율은 SIBIA 소프트웨어로 정량화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 1F는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 Bcl-2 및 Bax 발현을 보여주는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 결과는 비율로 표시되고 %로 변환되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3).
도 2는 저산소증으로 인한 심근 세포 사멸에서의 LRP5 및 LRP6의 구별되는 역할을 나타낸다:
도 2A는 shLamin-, shLRP5- 및 shLRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 평가된 세포 생존율의 상대적 백분율을 나타낸 사진 및 그래프이고; 도 2B는 shLamin-, shLRP5- 및 shLRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 MTT 분석을 사용하여 평가된 세포 생존율의 상대적 백분율을 나타낸 사진 및 그래프이며, 상기 도 2A 및 도 2B에서 세포 생존율은 정상 산소 shLamin 대조군으로 표준화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (도 2A, n=4; 도 2B, n=3); 도 2C는 shLamin-, shLRP5- 및 shLRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 카스파아제-3 활성을 측정한 결과 그래프이고, 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 2D는 shLamin 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 아넥신 V-Cy3.18 염색 (빨간색)의 형광 이미지이며, 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 스케일 바는 200 μm이고, 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 2E는 shLamin 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 Bcl-2 및 Bax 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 결과는 비율로 표시되고 %로 변환되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이고, 정상 산소증은 "N"으로 표시되고 저산소증은 "H"로 표시되었다.
도 3은 저산소 상태에서 유전자 발현 프로파일에 대한 LRP5의 효과를 나타낸다:
도 3A는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 심근 세포에서 저산소증에 대한 반응으로 상향 조절된 각 유전자 (정상 산소증 Ad-lacZ 대 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5 저산소증, 배수 변화 ≥2.0, p≤0.05)에 대한 "생물학적 과정" 범주의 유전자 온톨로지 (GO) 농축 분석이고, 도 3B는 KEGG 농축 분석을 나타낸 그래프이며, p-값은 Benjamini 수정된 Fisher의 정확 검정을 사용하여 계산되었다.
도 4는 저산소 상태에서 유전자 발현 프로파일에 대한 LRP5의 효과를 나타낸다:
도 4A는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포 사이의 HIF-1α 전사 표적 유전자를 나타낸 히트맵이고, 각 배수 변화는 정상 산소 Ad-lacZ 대조군과 비교하여 계산되었다. p<0.05; 도 4B는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포 사이에서 8 개의 가장 유의하게 변화된 유전자를 나타낸 그래프이며, 각 배수 변화는 정상 산소 Ad-lacZ 대조군과 비교하여 계산되었다. 그래프는 평균±SD을 나타낸다; 도 4C는 저산소증 4 시간 하에 선택된 유전자의 mRNA 발현을 qPCR로 확인한 그래프이고, 유전자 발현은 GAPDH로 정규화되었다. 배수 변화는 각각 정상 산소 Ad-lacZ 대조군 또는 shLamin 대조군과 비교하여 계산되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다.
도 5는 LRP5가 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α 안정성을 악화시키는 것을 나타낸다:
도 5A는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5-에 감염된 심근 세포를 정상 산소증 또는 저산소증에 30 분 및 60 분 동안 노출시키고 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이고; 도 5B는 shLamin- 및 shLRP5에 감염된 심근 세포를 정상 산소증 또는 저산소증에 30 분 및 60 분 동안 노출시키고 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 상기 도 5A 및 5B는 저산소증 하에서 증가하는 시간 동안 인큐베이션된 심근 세포에서 HIF-1α 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 5C는 qPCR 분석을 사용하여 정량화된 HIF-1α 전사체 수준을 나타낸 그래프이고, 유전자 발현은 GAPDH로 정규화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다(n=3); 도 5D는 심근 세포에서 HIF-1α 단백질의 반감기를 나타낸 그래프이며, 웨스턴 블롯팅을 위해 Ad-lacZ-, Ad-LRP5-, shLamin- 및 shLRP5-감염된 심근 세포를 Ad-HIF-1α로 공동 감염시키고 표시된 시간 동안 시클로헥시미드 (CHX, 50 μg/ml)로 처리한 다음 다양한 시점에서 수집한 것이다. 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 5E는 60 분 동안 저산소 조건에 노출된 후 세포질 및 핵 분획 용해물에서 HIF-1α 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이고, α-tubulin 및 lamin B는 각각 세포질 및 핵 단백질 대조군으로 사용되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다. N.S: 유의하지 않음.
도 6은 LRP5가 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α 전사활성을 악화시키는 것을 나타낸다:
도 6A는 HRE-루시퍼라아제 활성의 전사활성을 나타낸 그래프이며, 심근 세포는 Ad-lacZ- 또는 Ad-LRP5-감염과 함께 HRE 루시퍼라아제 리포터 및 pRL-TK 벡터 (형질 감염 효율에 대한 레닐라 대조군)와 함께 공동 형질 감염되었다; 도 6B는 HRE-루시퍼라아제 활성의 전사활성을 나타낸 그래프이고, 심근 세포는 shLamin- 또는 shLRP5- 감염과 함께 HRE 루시퍼라아제 리포터 및 pRL-TK 벡터 (형질 감염 효율에 대한 대조군)와 함께 공동 형질 감염되었다. 상기 도 6A 및 3B에서 pGL3 프로모터 벡터는 양성 대조군으로 사용되었으며, 상대적인 루시퍼라아제 활성은 레닐라 활성에 대한 루시퍼라아제의 비율이다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다.
도 7은 LRP5가 PHD2에 의해 매개되는 HIF-1α의 히드록실화를 조절하는 것을 나타낸다:
도 7A는 도 7A는 Ad-lacZ- 또는 Ad-LRP5에 감염된 심근 세포에서 HIF-1α의 발현에 대한 MG132 (10 μM)의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이고, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 7B는 Pro564-HIF-1α를 인식하는 특정 항체를 사용하여 히드록실화된 HIF-1α 수준을 나타낸 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 심근 세포를 상기 아데노 바이러스로 48 시간 동안 감염시키고 저산소 상태에 노출되기 전에 6 시간 동안 10 μM MG132로 처리한 것이다. 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 7C는 HIF-1α 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이고, 여기서 심근 세포는 음성 siRNA (Nesi) 또는 PHD1-3-특이적 siRNA로 일시적으로 형질 감염된 것이다. 형질 감염 24 시간 후, 세포를 Ad-lacZ 또는 Ad-LRP5로 48 시간 동안 감염시킨 다음 90 분 동안 저산소증에 노출시켰다 (n=4).
도 8은 LRP5가 PHD2에 의해 매개되는 HIF-1α의 히드록실화를 조절하는 것을 나타낸다:
도 8A는 비오틴화된 HIF-1α 산소 의존적 분해 도메인 및 히드록실화된 대조군 펩티드 (P.C)를 650nm에서 TMB 기질을 사용하여 검출된 것을 나타낸 그래프이며, 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3) ; 도 8B는 저산소 상태 (30 분) 하에서 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 심근 세포에서 히드록실화된 HIF-1α의 발현에 대한 PHD2 발현의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 8C는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α의 발현에 대한 DMOG의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 8D는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 세포 생존율에 대한 DMOG의 효과를 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율의 상대적 백분율을 평가한 그래프이며, 세포 생존율은 정상 산소 Ad-lacZ 대조군으로 표준화하였다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 8E는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 DMOG 처리에 의한 카스파아제-3 활성을 측정한 그래프이며, 데이터는 ml 단위의 샘플 부피당 분당 pNA (p-니트로아닐린)의 pmol로 나타내었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다.
도 9는 LRP5가 PHD2와 상호 작용함을 나타낸다:
도 9A는 심근세포를 Ad-LRP5로 감염시키고 표시된 대로 저산소증에 노출시켜, 전체 세포 용해물을 항-Myc 항체를 사용하여 면역 침강시킨 다음 블롯 오른쪽에 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이고 (n=4); 도 9B는 Myc-태그된 Ad-LRP5 및 Ad-PHD2를 심근 세포에 공동 감염시키고 60 분 동안 저산소증에 노출시켜, 전체 세포 용해물을 항-PHD2 항체를 사용하여 면역 침강시킨 다음 항-Myc 및 항-PHD2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이며 (n=4); 도 9C는 심근세포를 도 5B와 같이 준비하고, 용해물은 항-Myc 항체를 사용하여 면역 침강을 한 다음 항-Myc 및 항-PHD2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이다 (n=4).
도 10은 LRP5가 PHD2와 상호 작용함을 나타낸다:
도 10A는 심근세포에서 항-PHD2 및 항-Myc 항체를 사용하여 근접 결찰 분석 (PLA)을 한 결과 사진이며, 앰플리콘 검출은 적색 형광 신호로 생성하였고, 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 스케일 바는 200 μm이다; 도 10B는 심근세포를 Ad-lacZ 또는 Ad-LRP5로 감염시키고 저산소증에 노출시키거나 노출시키지 않고 90 분 후, 전체 세포 용해물을 항-PHD2 항체를 사용하여 면역 침강시킨 다음 항-LRP5 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이고; 도 10C는 심근세포를 표시된 대로 아데노 바이러스와 공동 형질 감염시키고 저산소증에 노출시켜 90 분 후, 세포 용해물을 항-PHD2 항체 또는 IgG를 사용하여 면역 침강시킨 다음 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이며 (n=3); 도 10D는 심근세포를 표시된 대로 아데노 바이러스로 감염시키고 전체 세포 용해물을 항-PHD2 항체 또는 IgG를 사용하여 면역 침강시킨 다음 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이다 (n=3).
도 11은 LRP5가 Wnt β-카테닌 신호 전달 경로와 독립적으로 HIF-1α 안정성을 조절하는 것을 나타낸다:
도 11A는 shLRP5 또는 shLRP6에 감염된 심근 세포에서 β-카테닌의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 11B는 표시된 저산소 시간 동안, 세포질 및 핵 분획 용해물에서의 β-카테닌 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이며, α-tubulin 및 lamin B는 각각 세포질 및 핵 단백질 대조군으로 사용하였다 (n=4); 도 11C는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 Wnt/β-카테닌 신호 전달 관련 유전자를 나타낸 히트맵이고 (Ad-lacZ 및 Ad-LRP5; n=3, shLRP5; n=2), 각 배수 변화는 정상 산소 Ad-lacZ 대조군과 비교하여 계산하였다; 도 11D는 표시된 바와 같이 아데노 바이러스 감염 후 세포질 및 핵 분획 용해물에서 β-카테닌 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이고, α-tubulin 및 lamin B는 각각 세포질 및 핵 단백질 대조군으로 사용되었다 (n=3).
도 12는 LRP5가 Wnt β-카테닌 신호 전달 경로와 독립적으로 HIF-1α 안정성을 조절하는 것을 나타낸다:
도 12A는 심근 세포가 표시된 시간 동안 저산소 상태에 노출된 후, p-LRP5 (S1503) 및 p-LRP5 (T1492)의 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 총 LRP5 수준으로 정규화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 12B는 LRP5 인산화 부위 및 부위 지정 돌연변이 유발의 개략도이며; 도 12C는 HIF-1α 발현에 대한 LRP5 돌연변이의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이다. 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); N.D: 검출되지 않음. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다. N.S: 유의하지 않음.
도 13은 LRP5 침묵이 인 비보에서 I/R 손상을 보호하는 것을 나타낸다:
도 13A는 압력-부피 루프 분석을 나타낸 그래프이고; 도 13B는 각 군의 박출률 (EF), 심박수, dp/dt max 및 dp/dt min을 포함하는 혈류 역학 분석 결과를 통계 분석한 결과 그래프이며, 그래프는 실험 그룹당 평균±SD를 나타낸다 (n=5-8 랫트).
도 14는 LRP5 침묵이 인 비보에서 I/R 손상을 보호하는 것을 나타낸다:
도 14A는 각 실험군에서 TTC 염색된 심근 절편의 이미지 및 그래프이고, LV 경색 크기 (흰색 영역)는 전체 심실 영역의 백분율로 표시되었다. 그래프는 실험 그룹당 평균±SD를 나타낸다 (n=5-8 랫트); 도 14B는 I/R 수술 2 주 후의 Masson 트리크롬 염색 이미지 및 그래프이며, 전체 면적에서 섬유증의 백분율로 정량화하였다. 스케일 바는 200 μm이다. 그래프는 실험 그룹당 평균±SD를 나타낸다 (n=5-8 랫트); 도 14C는 각 실험군에서 HIF-1α 면역 조직 화학 염색의 이미지이고; 도 14D는 비오틴화된 HIF-1α 산소 의존적 분해 도메인 및 히드록실화된 대조군 펩티드를 650 nm에서 TMB 기질을 사용하여 검출한 그래프이다. 그래프는 실험 그룹당 평균±SD를 나타낸다 (n=5-8 랫트). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 N.S: 유의하지 않음.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 실험 준비
1-1. 랫트 심근 세포의 1 차 배양
신생아 랫트 심근 세포를 2-4 일령 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 랫트의 심장에서 분리하였다. 분리된 심장을 Dulbecco 인산염 완충 식염수 용액 (pH 7.4, WELGENE)으로 세척하고, 약 0.5 mm3 크기의 조각으로 다진 다음 5 mL 콜라게나아제 II (1.4 mg/mL, 270 units/mg, Gibco BRL) 용액으로 5 분간 처리하였다. 그 다음, 상층액을 제거하고 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린/스트렙토 마이신 용액 (Carpricorn Scientific GmbH)이 포함된 알파 변형 최소 필수 배지 (α-MEM)로 세척하였다. 펠렛을 콜라게나아제 II에 재현탁시키고 5 % CO2를 포함하는 37 °C 가습 대기 챔버에서 7 분 동안 인큐베이션했다. 이 과정은 조직이 완전히 소화될 때까지 반복되었다. 생성된 세포 펠렛을 α-MEM에 재현탁시키고 세포를 37 °C에서 30 분 동안 100mm 배양 접시에 부착시켰다. 10 % FBS, 1 % 페니실린/스트렙토마이신 용액 및 0.1 mM 브로모데옥시우리딘 (Bromodeoxyuridine) (BrdU, Sigma-Aldrich)을 포함하는 α-MEM에서 실험을 위해 비-부착성 심근 세포를 배양하여 섬유 아세포 확장을 제거했다.
1-2. 아데노 바이러스의 생성, 정제 및 투여
C-말단에 Myc 태그가 있는 전장 인간 LRP5 (Ad-LRP5로 명명) 및 C-말단 VSVG 태그가 있는 전장 인간 LRP6 (Ad-LRP6으로 명명됨)을 발현하는 재조합 아데노 바이러스는 ViraPower™ 아데노 바이러스 발현 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 구축하였다. lacZ-β-갈락토시다아제를 발현하는 아데노 바이러스 벡터 (Ad-lacZ로 명명됨)를 감염 대조군으로 사용했다. 그 다음, 상기 구조체를 pAd/CMV/V5/DEST 게이트웨이 벡터와의 LR 재조합 반응에 사용하여 아데노 바이러스 발현 클론을 생성하였다. 그 다음, 제작된 아데노 바이러스 벡터를 Pac I 제한 효소로 절단한 후 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen life Technologies)을 사용하여 293A 세포에 형질 감염시켰다. 아네노 바이러스 농도는 Adeno-X™ qPCR 적정 키트 (Takara, Clontech)를 사용하여 적정했다. 분리된 심근 세포는 저산소 상태에 노출되기 전에 48 시간 동안 Ad-LRP5 (감염 다중도 (MOI 10) 또는 Ad-LRP6 (MOI 10)으로 감염시켰다. 랫트 LRP5 (shLRP5로 명명) 및 랫트 LRP6 (shLRP6으로 명명)을 표적으로 하는 shRNA는 BLOCK-iT™ 아데노 바이러스 RNAi 발현 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 생성하였다. 랫트 LRP5를 표적으로 하는 RNAi 뉴클레오티드 서열은 5'-GCUGUUCAGCCAGAAAUUU(서열번호 2)-3'이고 랫트 LRP6을 표적으로 하는 RNAi 뉴클레오티드 서열은 5'-GGUUGUUCCCAUUGUGUU(서열번호 3)-3'이다. BLOCK-iT™ U6 진입 벡터에서 클로닝된 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 pAd/BLOCK-iT™-DEST 벡터와의 LR 재조합 반응에 사용하여 아데노 바이러스 발현 클론을 생성했다. pAd-GW/U6-laminshRNA 아데노 바이러스 벡터 (shLamin으로 명명됨)를 감염 대조군으로 사용했다. 아네노 바이러스 농도는 Adeno-X™ qPCR 적정 키트 (Takara, Clontech)를 사용하여 적정했다. 분리된 심근 세포는 저산소 상태에 노출되기 전에 72 시간 동안 shLRP5 (MOI 40) 또는 shLRP6 (MOI 40)로 감염시켰다. LRP5 인산화 부위의 점 돌연변이 유발은 제조업체의 지침에 따라 QuikChange 부위-지정 돌연변이 유발 키트 (stratagene)를 사용하여 수행하였다.
1-3. siRNA 형질 감염
PHD1-3의 siRNA-매개 녹다운 (knockdown)의 경우, 제조업체의 지침에 따라 72 시간 동안 siLentFect (Bio-Rad)를 사용하여 60 nM의 표적 또는 음성 siRNA로 세포를 형질 감염시켰다. PHD1-3 및 음성 대조군을 표적으로 하는 siRNA의 서열은 다음과 같다: PHD1, GCUAGCAUCGGGACAGAAAGG(서열번호 4); PHD2, GCGGAGGUAUUCUUCGAAUUU(서열번호 5); PHD3, GGCUGGAUCUGGAGAAGAUCG(서열번호 6); 음성 대조군, UUCUCCGAACGUGUCACGU(서열번호 7).
1-4. 저산소증 처리
저산소증을 유도하기 위해, 심근 세포를 저산소 배지 (무혈청 및 30 분 동안 N2 가스로 대체됨)로 두 번 조심스럽게 세척하고, 심근 허혈의 인 비보 조건을 모방하기 위해 저산소 상태를 적용했다. 세포를 37 °C의 인큐베이터에 두었다. N2 (95 %) 및 CO2 (5 %)를 인큐베이터에 플러시하여 산소 함량을 1.2 %로 낮추었으며, 이는 산소 프로브 (Vision Scientific)를 사용하여 모니터링했다. 정상 산소군 심근 세포는 정상 산소 대기의 별도 인큐베이터에서 37 °C로 유지하였다.
1-5. 세포 생존률
세포 생존률 분석을 위해, 실험 세포를 MTT 및 트리판 블루 (Trypan blue) 분석 모두에서 평가하였다. MTT 분석은 제조업체의 지침에 따라 CellTiter 96 Aqueous One Solution 세포 증식 분석 (Promega)을 사용하여 수행하였다. 흡광도는 ELISA 판독기 (TECAN, infinite M200 PRO)를 사용하여 490 nm에서 측정하였다. 트리판 블루 분석의 경우, 세포를 트립신 처리로 분리하고 0.4 % 트리판 블루 염료로 염색했다. 혈구계 계수기 (hemocytometer counter)를 사용하여 현미경으로 생존 세포를 계수하였다. 대조군의 생존률은 100 %로 간주되었다.
1-6. 루시퍼라아제 리포터 분석 (Luciferase Reporter Assay)
3 개의 HRE를 포함하는 루시퍼라아제 리포터 구성은 Addgene (26731)에서 구입하였다. HRE-루시퍼라아제 리포터 플라스미드 및 레닐라 (Renilla) 루시퍼라아제 벡터 (pRL-TK; Promega)를 24 시간 동안 대조군, LRP5-과발현 심근 세포 또는 LRP5-침묵 심근 세포로 일시적으로 형질 감염시켰다. 그 다음, 세포를 정상 산소 또는 저산소 상태에 노출하였다. 제조업체의 프로토콜에 설명된 대로, 듀얼-루시퍼라아제 리포터 분석 시스템 (Promega)을 사용하여 firefly 및 Renilla 루시퍼라아제 분석을 위해 세포 용해물을 수집했다. HRE-루시퍼라아제 활성은 Micro-Lumat Plus LB96V 루미노미터 (EG & G Berthold)를 사용하여 측정하였다. 형질 감염 활성의 차이를 설명하기 위해 데이터를 Renilla 루시퍼아라제 활성으로 정규화시켰다.
1-7. 핵 추출물 준비
세포를 얼음 상에서 10 분 동안 세포질 추출 버퍼 (10mM HEPES; pH 7.5, 3mM MgCl2, 14mM KCl, 5 % 글리세롤 및 1mM DTT)로 용해시켰다. 그 다음, 0.4 % 최종 농도로 NP-40을 첨가하고 10 초 동안 볼텍싱했다. 세포 현탁액을 4 °C에서 5000 rpm에서 2 분 동안 원심 분리하고 세포질 분획을 포함하는 상층액을 제거하였다. 펠렛을 동일한 용해 완충액에서 3 회 세척한 다음, 핵 추출 완충액 (10mM HEPES; pH 7.5, 3mM MgCl2, 400mM NaCl, 5 % 글리세롤 및 1mM DTT)으로 용해시키고 초음파 처리했다. 30 분 동안 인큐베이션 후, 펠렛 현탁액을 4 °C에서 14000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하였다. 핵 분획을 포함하는 상층액을 웨스턴 블롯팅에 사용했다. 항-lamin B (sc-374015; Santa Cruz Biotechnology) 및 항-α-tubulin (sc-5286; Santa Cruz Biotechnology)을 각각 핵 및 세포질 로딩 대조군으로 사용했다.
1-8. 아폽토시스 분석
저산소증-유도된 심근 세포 아폽토시스 비율은 Annexin V-Cy3 아폽토시스 검출 키트 (Sigma-Aldrich) 또는 비색 Caspase 3 분석 키트 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 각각 제조업체의 지침에 따라 결정하였다. Annexin V-Cy3 표지된 세포는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (Fluoview FV1000, Olympus)을 사용하여 시각화하였다. Caspase-3 활성 검출을 위해, 세포 용해물을 caspase-3 비색 기질이 포함된 동일한 양의 기질 반응 완충액과 결합시켰다 (Ac-DEVD-pNA). 그 다음, ELISA 판독기 (TECAN, infinite M200 PRO)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정했다.
1-9. PHD2 활성 분석
비오틴화된 HIF-1α 산소-의존 분해 도메인 (Biotin-DLDLEALAPYIPADDDFQL; HIF-1α의 아미노산 556에서 575까지) 및 히드록실화된 대조군 (Biotin-DLDLEALAP[OH]YIPADDDFQL) 펩티드를 스트렙타비딘 및 소 혈청 알부민 (BSA)-코팅된 96 웰 플레이트에 고정하였다. 저산소에 노출된 후, 심근 세포를 수집하고 저장성 완충액 (20mM HEPES; pH 7.4, 5mM NaF, 10μM Na3VO4, 0.1mM EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일 및 2mM DTT)으로 20 분 동안 용해시켰다. 그 다음, 0.5 % 최종 농도의 NP-40을 첨가했다. 동일한 양의 단백질 (50μg/웰)을 반응 완충액 (Tris-Cl; pH 7.5, 5mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2mM DTT, 0.5mM 2-OG 및 1mM 아스코르베이트)과 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 샘플을 히드록실화된 HIF-1α 1 차 항체 (3434P; Cell Signaling Technology)와 함께 인큐베이션 한 다음, 염소 항-토끼 HRP-접합 2 차 항체를 첨가했다. 펩티드 히드록실화는 TMB 기질을 사용하여 650nm에서 검출하였다.
1-10. 근접 결찰 분석 (Proximity Ligation Assay: PLA)
Duolink Red 스타터 키트 (DUO92101; Sigma-Aldrich)를 사용하여 인 시투 (in situ) PLA를 수행했다. 면역 형광법에 기재된 바와 같이 세포를 고정하고 투과시켰다. 제조업체의 지침에 따라 항체 배양 및 프로브 증폭을 수행했다. 하나의 1 차 항체만 PLA 프로브와 함께 인큐베이션된 음성 대조군 실험을 수행하였다. 세포의 형광 신호는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (Fluoview FV1000, Olympus)을 사용하여 시각화하였다.
1-11. 면역 침강 분석 및 웨스턴 블롯팅
세포를 PBS에서 1 회 세척하고 프로테아제 억제제 칵테일 및 1mM 페닐메틸술포닐 플루오리드 (PMSF)를 포함하는 RIPA 완충액에서 용해시켰다. 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석 키트 (Bio-Rad)를 사용하여 결정하였다. 동일한 양의 단백질을 6-12 % SDS-PAGE에서 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오리드 막 (Bio-Rad)으로 트랜스퍼 시켰다. 5 % 탈지유를 포함한 Tris-완충 식염수-Tween 30 (TBS-T, 0.1 % Tween 20)으로 RT에서 1 시간 동안 막 블로킹한 후, 막을 하기 항체를 사용하여 4 °C에서 밤새 1 차 항체와 함께 배양했다: Novus Biologicals로부터 구입한 토끼 항-HIF-1α (NB100-479), 토끼 항-PHD2 (NB100-2219), 토끼 항-PHD3 (NB100-139); Cell Signaling Technology로부터 구입한 토끼 항-LRP5 (5731), 토끼 항-LRP6 (2560), 토끼 항-Hydroxy-HIF (Pro564) (3434P), 토끼 항-Bax (2772), 마우스 항-Myc 태그 (2276) 및 토끼-항 LRP6 (phospho S1490) (2568); Abcam으로부터 구입한 토끼 항-β-카테닌 (ab32572), 토끼 항-PHD1 (ab113077) 및 토끼 항-LRP5 (phospho T1492) (ab203306); BD Biosciences로부터 구입한 마우스 항-Bcl-2 (610538); Enzo Life Sciences로부터 구입한 토끼 항-VSVG 태그 (ADI-MSA-115). 블롯을 TBS-T (0.1 % Tween 20)로 25 분 동안 5 회 세척한 다음, 겨자무 과산화 효소 (horseradish peroxidase)-접합된 2 차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 면역-반응성 단백질은 ECL 시스템 (iNtRON Biotechnology)을 사용하여 검출하였다. 정량화에는 Image J 소프트웨어를 사용하였다. 면역 침전 분석을 위해, 항체를 첨가하기 전에 단백질 A/G-아가로오스 비드 (Santa Cruz Biotechnology)로 용해물을 미리 제거했다. 그 다음, 원심 분리로 단백질 비드를 제거한 후 상층액을 4 °C에서 밤새 하기 1 차 항체로 인큐베이션했다: Cell Signaling Technology로부터 구입한 마우스 항-myc 태그 (2276), Origene Technologies로부터 구입한 마우스 항-PHD2 (AM09354PU) 또는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입한 이소형 대조군 면역 글로불린 G (IgG) (sc-2025). 다음으로, A/G-아가로오스 비드를 첨가하고 4 °C에서 회전시키면서 4 시간 동안 배양한 후, 비드-항체 복합체를 EBC 세척 완충액 (20mM Tris, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5 % NP-40)으로 4 회 세척하였다. 면역 침전된 단백질을 SDS 샘플 버퍼에서 변성시키고 5 분 동안 끓였다. 샘플을 웨스턴 블롯팅을 사용하여 분석하였다.
1-12. 유전자 발현 분석
Ad-lacZ에 감염된 정상 산소 세포 및 Ad-lacZ- 또는 Ad-LRP5에 감염된 저산소증 세포로부터의 전체 RNA 분리는 제조업체가 제공한 지침에 따라 Trizol 시약 (GIQGEN)을 사용하여 수행하였다. mRNA 시퀀싱 및 분석은 e-biogen 회사에서 수행하였다. <0.05의 p-값을 사용하여 차별적으로 발현된 유전자 목록을 생성했다. 유전자 온톨로지 농축 분석 및 KEGG 농축 분석은 DAVID 도구 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)를 사용하여 수행하였다.
1-13. 정량적 실시간 PCR (qPCR) 분석
제조업체가 제공한 지침에 따라 Trizol 시약 (GIAGEN)을 사용하여 세포에서 총 RNA를 분리했다. 전체 RNA는 1st-가닥 cDNA 합성 키트 (Takara)를 사용하여 역전사하였다. RealHelixTM qPCR 키트 (NanoHelix)를 사용한 실시간 정량 PCR은 Applied Rotor-Gene 3000TM (Corbett Research)을 사용하여 SYBR Green 방법으로 수행하였다. 유전자 발현은 GAPDH로 정규화하였다. 상대적 mRNA 발현 수준을 정량화하고 △△Ct 방법으로 Rotor-Gene 6 소프트웨어 (Corbett-research)를 사용하여 분석했다.
1-14. 면역 형광 염색
심근 세포는 커버글라스가 있는 24 웰 플레이트에서 배양하였다. 세포를 4 % 파라포름 알데히드로 15 분 동안 고정하고 0.2 % Triton X-100으로 10 분 동안 실온에서 투과시켰다. 세척 후, PBS에서 2 % BSA로 1 시간 동안 세포를 블로킹하고, 블로킹 용액을 제거하여 토끼 항-HIF-1α (NB100-479; Novus biologicals), 마우스 항-LRP5 (sc-390267; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양했다. 세포를 세척하고 암실에서 1 시간 동안 실온에서 마우스 항-토끼 IgG-TR (sc-3917; Santa Cruz Biotechnology) 및 염소 항-마우스 IgG-FITC (ab6785; Abcam)와 함께 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 PBS로 부드럽게 세척하고 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (Fluoview FV1000, Olympus)을 사용하여 시각화했다.
1-15. 조직의 X-Gal 염색
β-갈락토시다아제 활성의 시각화를 위해, lacZ 아데노 바이러스가 주입된 신선한 랫트 심장 조직을 절제하고 4 °C에서 4 시간 동안 4 % 파라포름 알데히드로 후-고정한 다음 4 °C에서 밤새 30 % 수크로오스로 인큐베이션했다. 심장 조직은 OCT 화합물과 함께 표준 cryomold에 고정시키고 저온 유지 장치 (cryostat) (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 20μm 연속-절편으로 절단하였다. 그런 다음, 연속 절편을 노화 β-갈락토시다아제 조직 화학 염색 키트 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 X-gal로 37 °C에서 밤새 염색하였다. 염색된 절편은 현미경 (Olympus)을 사용하여 캡처하였다.
1-16. 조직학적 분석 및 면역 조직 화학
조직학적 분석과 면역 조직 화학을 위해 심장을 절제하고 4 % 포름 알데히드로 고정시켰다. 탈수 후 심장 조직을 파라핀 왁스에 묻혀 4 μm 두께로 절편했다. 콜라겐 퇴적 수준은 Masson 트리크롬 염색 (American MasterTech)으로 측정하였다. SABIA (Solution for Automatic Bio-Image Analysis) 프로그램 (e-Biogen)을 사용하여 각 분야의 섬유증 조직 면적 및 전체 조직을 측정하고 전체 조직 면적에 대한 섬유증 조직 면적의 백분율로 평가했다. 또한, Vectastain ABC 키트 (Vector Laboratories)를 사용하여 아비딘 비오티닐화 된 겨자무 과산화 효소 (HRP) 복합체 (ABC)-기반 방법에 따라 면역 조직 화학을 수행하였다. 간단히 말해서, 파라핀에 내장된 심장 절편은 항원 회수 전에 자일렌과 계열 에탄올 시리즈 (graded ethanol series)를 통해 파라핀을 제거하고 다시 수화시켰다. 그런 다음 절편을 60 % 메탄올에서 30 분 동안 0.3 % 과산화수소와 함께 인큐베이션하고 4 °C에서 1 시간 동안 일반 염소 혈청으로 블로킹했다. 그 다음 일차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 3'-디아미노벤지딘 (DAB, Sigma-Aldrich)을 사용하여 면역 반응성을 달성했다. 절편은 Mayer 헤마톡실린 용액 (Sigma-Aldrich)으로 대조 염색하고 탈수, 탈지하여 말리놀 (malinol) (Muto Pure Chemicals)로 고정시켰다. 염색된 구조는 현미경 (BX41, Olympus)으로 관찰하였다. 정량화에는 Image J 소프트웨어를 사용하였다. 현미경 (Olympus)을 사용하여 동물 당 각 절편에서 겹치지 않는 영역의 염색된 절편의 5 개 이미지를 캡처하고 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 이미지에서 양성 염색 영역 (%)을 정량 분석했다.
1-17. 동물 모델
Sprague Dawley 랫트 (7 주령)와 Sprague Dawley 백그라운드의 신생아 랫트는 특정 병원균이 없는 (SPF) 조건에서 Samtako Bio Korea 회사로부터 구입했다. 동물은 표준 실험실 식이와 물이 공급되었고 온도 조절실에서 12 시간 빛/12 시간 어두운 주기로 유지하였다. 모든 동물 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국제 가이드에 따라 수행하였다. 이 프로토콜은 조선 대학교 의과 대학 동물 연구위원회 (프로토콜 번호 CIACUC2018-S0004)의 승인을 받았다.
1-18. 허혈/재관류 손상의 동물 모델
7 주령 Sprague-Dawley 수컷 쥐 (250g)에서 허혈/재관류 (I/R) 모델을 좌전 하행 (LAD) 관상 동맥의 외과적 폐색에 의해 확립하였다. 먼저, 랫트를 마취하고 Harvard 벤틸레이터에 연결된 기관 삽관을 통해 실내 공기로 인공 호흡하였다. 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이에 위치한 왼쪽 측면 개흉술 후, 심막을 절개하고 좌전 하행 관상 동맥을 멸균 6-0 실크 봉합사로 결찰시켰다. 심근 경색 모델에 대한 적절한 결찰은 창백하게 변하는 좌심실 벽의 육안 관찰로 확인하였다. 60 분의 국소 심근 허혈 후, 재관류를 허용하기 위해 6-0 실크 봉합사를 제거한 후 결찰을 해제시켰다. 상기 가짜 수술 (Sham operated)을 받은 동물은 좌전 하행 관상 동맥의 폐색없이 동일한 절차를 거쳤다. 인 비보 심근 경색 모델에서 LRP5의 효과를 확인하기 위해, 수술을 수행하기 전에 lacZ, LRP5, shLamin 또는 shLRP5 (2X1011 입자)를 발현하는 아데노 바이러스 구조체를 동물에 주입했다. 아데노 바이러스 구조체는 32G 바늘을 사용하여 전방 좌심실 유리 벽의 3 개의 다른 부위에 주입하였다. 상기 가짜 수술을 받은 동물에게 식염수를 주입했다. 3 일 후 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 아데노 바이러스 감염 효율을 평가했다. Sham, Ad-lacZ, Ad-LRP5, shLamin 및 shLRP5가 주입된 실험 동물을 3 일 후 재마취시키고 좌전 하강 관상 동맥 결찰을 수행하였다.
1-19. 경색 크기 결정
가짜 (Sham) 및 허혈성/재관류 (I/R)-손상된 동물을 수술 2 주 후 안락사시키고 그들의 심장을 절제하여 PBS로 세척하였다. 심장을 액체 질소에서 급속 냉동하고 가로로 절편하여 1 % 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC) 용액 (37 °C에서 pH 7.4 완충액)에서 20 분 동안 인큐베이션했다. 조직을 4 ℃에서 밤새 10 % PBS 완충 포르말린에 담갔다. 심근 경색의 크기는 좌심실의 경색 조직 단면적과 전체 심실 영역의 단면적에 대한 백분율로 평가하였다. 전체 경색 크기는 Image J 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
1-20. 혈류 역학 분석
혈류 역학 평가는 Mikro-Tip 연구 압력 시스템 (Millar Instruments)을 사용하여 수행하였다. 랫트를 마취시키고 2F 압력-부피 (P-V) 카테터 (SPR-838, Millar Instruments)를 오른쪽 경동맥에 삽입하고 상행 대동맥으로 전진했다. 그 다음, 안정된 P-V 루프가 얻어질 때까지 카테터를 좌심실 강으로 전진시켰다. EF, 심박수, dP/dt max 및 dP/dt min은 PV 분석 프로그램 (PVAN, Millar Instruments)을 사용하여 산출 및 계산하였다. 좌심실 수축기말 (end-systolic) P-V 관계 (ESPVR)의 기울기 (Ees)는 좌심실 수축의 부하-독립적 지표로 계산하였다. 각 실험이 끝날 때, 100μl의 고장 식염수를 정맥 내로 주입시키고 P-V 관계의 변화에서 병렬 전도 부피를 소프트웨어로 계산하여 심장 질량 부피의 보정에 사용했다. 마지막으로, LabChart 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
1-21. 통계 분석
적어도 세 개의 샘플에서 얻은 모든 정량화된 데이터는 SPSS 13.0 소프트웨어로 분석하였다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. 두 그룹 간의 통계적 비교는 Student's t-test를 사용하여 수행하였다. 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 여러 그룹 간의 통계적 비교를 수행하였다. 양측 P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예 1. LRP5 또는 LRP6가 저산소증으로 인한 심근 세포 사멸에 미치는 차별적인 효과 확인
LRP5와 LRP6은 구조적으로 유사하고 Wnt 신호 전달에 대한 공동 수용체 역할을 하지만, 여러 보고서에서 조직 분포 및 병태 생리학적 조건에 따라 명확하게 구별되는 기능을 나타낸다. 허혈성 심근에서 LRP5 및 LRP6의 역할을 더 잘 정의하기 위해, 먼저 저산소증으로 유도된 심근 세포에서 LRP5 및 LRP6의 발현 수준을 조사했다.
그 결과, LRP5의 발현이 저산소 상태에서 유의하게 상향 조절되는 반면, LRP6는 저산소 상태에서 하향 조절되었음을 확인하였다 (도 1A). 다음으로, 저산소 상태에서 심근 세포에서 LRP5 및 LRP6의 역할을 조사하기 위해, myc 태그된-LRP5 (Ad-LRP5) 또는 VSVG 태그된-LRP6 (Ad-LRP6)을 발현하는 아데노 바이러스 벡터를 구축하거나, 내인성 발현을 침묵시키기 위해 shRNA 를 표적으로 하는 LRP5 또는 LRP6 (shLRP5 또는 shLRP6)를 발현시켰다. 저산소 상태에서 LRP5의 과발현은 Ad-lacZ 대조군과 비교하여 약 47.72 % (트리판 블루 분석의 경우) 또는 21.32 % (MTT 분석의 경우)의 세포 생존율을 감소시켰지만, LRP6의 과발현은 Ad-lacZ 처리된 대조군 세포와 비교하여 세포 생존력의 차이가 유의미하지 않았다 (도 1B 및 1C). 도 1D 내지 1F에서 나타낸 바와 같이, LRP5 과발현은 저산소성 심근 세포에서 프로-아폽토시스 카스파아제-3 (pro-apoptotic caspase-3) 활성, 아넥신-V 검출 및 Bax/Bcl-2 비율을 크게 증가시켰다. 대조적으로, LRP5 침묵은 저산소증으로 인한 세포 사멸을 현저히 예방하고 (도 2A 및 2B) shLamin 대조군 세포와 비교하여 아넥신-V 및 Bax/Bcl-2 비율과 같은 아폽토시스 마커의 발현 수준을 약화시켰다 (도 2C 내지 2E). 반면에 LRP6 침묵은 shLamin 대조군 세포와 비교하여 세포 생존력을 약 37.53 % (트리판 블루 분석의 경우) 또는 28.62 % (MTT 분석의 경우) (도 2A 및 2B) 및 카스파아제-3 활성 (도 2C)까지 감소시켰다.
이러한 결과는, LRP5와 LRP6이 저산소성 심근 세포에서 다른 역할을 하며, 저산소증에 의한 LRP5 발현이 심근 사망에 기여할 수 있음을 나타낸다. 따라서 이하에서 허혈성 심근에서의 LRP5의 역할에 대해 실험하였다.
도 1은 저산소증으로 인한 심근 세포 사멸에서의 LRP5 및 LRP6의 구별되는 역할을 나타낸다:
도 1A는 8 시간 동안 저산소 상태 (O2 1.2 %)에 노출된 심근 세포에서 LRP5 및 LRP6 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이고, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 1B는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 Ad-LRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 트리판 블루 배제 분석을 이용하여 세포 생존율의 상대적 백분율을 평가한 사진 및 그래프이며; 도 1C는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 Ad-LRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율의 상대적 백분율을 평가한 사진 및 그래프이고, 상기 도 1B 및 도 1C에서 세포 생존율은 정상 산소 Ad-lacZ 대조군으로 표준화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 1D는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 Ad-LRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 카스파아제-3 활성을 측정한 그래프이며, 데이터는 ml 단위의 샘플 부피당 분당 pNA (p-니트로아닐린)의 pmol로 나타내었다. 카스파아제-3은 양성 대조군으로 사용되었다 (5 μg/ml의 5 μl). 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 1E는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 아넥신 V-Cy3.18 염색 (빨간색)의 형광 이미지이고, 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었으며, 스케일 바는 200 μm이다. 아폽토시스 비율은 SIBIA 소프트웨어로 정량화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 1F는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 Bcl-2 및 Bax 발현을 보여주는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 결과는 비율로 표시되고 %로 변환되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3).
도 2는 저산소증으로 인한 심근 세포 사멸에서의 LRP5 및 LRP6의 구별되는 역할을 나타낸다:
도 2A는 shLamin-, shLRP5- 및 shLRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 평가된 세포 생존율의 상대적 백분율을 나타낸 사진 및 그래프이고; 도 2B는 shLamin-, shLRP5- 및 shLRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에서 MTT 분석을 사용하여 평가된 세포 생존율의 상대적 백분율을 나타낸 사진 및 그래프이며, 상기 도 2A 및 도 2B에서 세포 생존율은 정상 산소 shLamin 대조군으로 표준화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (도 2A, n=4; 도 2B, n=3); 도 2C는 shLamin-, shLRP5- 및 shLRP6에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 카스파아제-3 활성을 측정한 결과 그래프이고, 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 2D는 shLamin- 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 아넥신 V-Cy3.18 염색 (빨간색)의 형광 이미지이며, 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 스케일 바는 200 μm이고, 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 2E는 shLamin- 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에 대한 Bcl-2 및 Bax 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 결과는 비율로 표시되고 %로 변환되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이고, 정상 산소증은 "N"으로 표시되고 저산소증은 "H"로 표시되었다.
실험예 2. LRP5의 HIF-1α 전사 표적 유전자 발현 조절 확인
LRP5가 어떻게 저산소증으로 인한 심근 세포 사멸을 촉진하는지 및 이와 관련된 메커니즘을 조사하기 위해 mRNA-seq 분석을 사용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행했다.
그 결과, 저산소 상태에서 상향 조절된 유전자 (≥ 2.0 배 변화)의 유전자 온톨로지 (GO) 용어 분석에서 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포는 높은 유의성으로 저산소증, 아폽토시스 및 세포사멸에 대한 반응의 조절에 관여함을 확인했다 (도 3A). 또한, KEGG 경로는 HIF-1α 신호 전달 경로가 다른 연구에서 보고된 것처럼 정상 산소 세포와 비교하여 상당히 풍부하고 상향 조절되었음을 나타냈고, LRP5 발현 조절에 의해 HIF-1α 신호 전달 관련 유전자의 발현이 조절되는 것을 히트맵으로 나타냈다 (도 3B).
다음으로, LRP5가 저산소 조건에서 HIF-1α 신호 전달에 영향을 미치는지 확인하기 위해, Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 정상 산소성 및 저산소성 심근 세포를 mRNA-seq 분석을 통해 분석했다. LRP5 과발현 및 침묵에 의한 HIF-1α 전사 표적 유전자 세트 (약 39 개 유전자)의 유의한 변화를 도 4A에 히트맵으로 나타냈다. 대부분의 HIF-1α 전사 표적 유전자의 발현은 저산소 상태에서 Ad-lacZ 감염된 세포에 비해 LRP5 과발현에 의해 하향 조절되었고, LRP5 침묵에 의해 상향 조절되었다 (도 4B). mRNA-seq 데이터를 추가로 검증하기 위해, 5 개의 대표적인 HIF-1α 표적 유전자 (Bnip3, Pfkfb3, Glut-1, EPO 및 VEGF)의 mRNA 발현을 qRT-PCR을 사용하여 분석했다. mRNA-seq 데이터와 일치하게, VEGF을 제외한 Bnip3, Pfkfb3, Glut-1, 및 EPO의 mRNA 발현 수준은 LRP5 과발현에 의해 현저히 하향 조절된 반면, LRP5 침묵에 의해 현저하게 상향 조절되었다 (도 4C).
이러한 결과는, LRP5가 HIF-1α의 전사 활성을 조절하여 심근 세포에서 표적 유전자의 발현을 변경시킬 수 있음을 나타낸다.
도 3은 저산소 상태에서 유전자 발현 프로파일에 대한 LRP5의 효과를 나타낸다:
도 3A는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 심근 세포에서 저산소증에 대한 반응으로 상향 조절된 각 유전자 (정상 산소증 Ad-lacZ 대 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5 저산소증, 배수 변화 ≥2.0, p≤0.05)에 대한 "생물학적 과정" 범주의 유전자 온톨로지 (GO) 농축 분석이고, 도 3B는 KEGG 농축 분석을 나타낸 그래프이며, p-값은 Benjamini 수정된 Fisher의 정확 검정을 사용하여 계산되었다.
도 4는 저산소 상태에서 유전자 발현 프로파일에 대한 LRP5의 효과를 나타낸다:
도 4A는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포 사이의 HIF-1α 전사 표적 유전자를 나타낸 히트맵이고, 각 배수 변화는 정상 산소 Ad-lacZ 대조군과 비교하여 계산되었다. p<0.05; 도 4B는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포 사이에서 8 개의 가장 유의하게 변화된 유전자를 나타낸 그래프이며, 각 배수 변화는 정상 산소 Ad-lacZ 대조군과 비교하여 계산되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다; 도 4C는 저산소증 4 시간 하에 선택된 유전자의 mRNA 발현을 qPCR로 확인한 그래프이고, 유전자 발현은 GAPDH로 정규화되었다. 배수 변화는 각각 정상 산소 Ad-lacZ 대조군 또는 shLamin 대조군과 비교하여 계산되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다.
실시예 3. LRP5의 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α 안정성을 악화시키는지 여부 확인
LRP5가 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α의 안정성을 악화시키는지 확인하기 위해, LRP5가 HIF-1α 발현 수준에 영향을 미치는지 테스트하였다.
그 결과, HIF-1α 수준은 Ad-lacZ 처리된 대조군 세포와 비교하여 저산소 상태에서 LRP5-과발현된 심근 세포에서 현저하게 감소했다 (도 5A). 대조적으로, HIF-1α의 발현 수준은 LRP5-침묵 세포에서 오히려 향상되었다 (도 5B). LRP5에 의한 발현 조절이 전사 수준에서 발생하는지 알아보기 위해, 심근 세포에서 HIF-1α mRNA 수준을 조사하였다. HIF-1α mRNA는 정상 산소 상태에서 구성적으로 발현되며 저산소 상태와 LRP5 과발현 모두에 의해 변경되지 않았다 (도 5C).
이러한 결과는, LRP5가 단백질 수준에서 HIF-1α를 음성적으로 조절한다는 것을 나타낸다.
다음으로, LRP5가 HIF-1α 안정성을 조절하는지 여부를 평가하기 위해, HIF-1α가 과발현된 심근 세포를 단백질 합성의 글로벌 억제제인 시클로헥시미드 (CHX, 50 μg/ml)로 시간 의존적인 방식으로 처리했다.
그 결과, 도 5D에 나타낸 바와 같이, LRP5-과발현 세포에서 HIF-1α의 반감기는 약 1.8 분으로, 4 분인 Ad-lacZ 대조군 세포에서보다 상당히 짧았으며, LRP5 침묵은 HIF-1α의 반감기를 10 분 이상 연장시키는 것으로 나타났다. 또한, LRP5 침묵은 HIF-1α의 저산소증-유도 핵 전이를 강화한 반면, LRP5의 과발현은 대조군 세포에 비해 HIF-1α의 핵 전이를 극적으로 약화시켰다 (도 5E). 또한, HRE-의존적 루시퍼라제 활성은 Ad-lacZ 처리된 세포에 비해 LRP5-과발현된 심근 세포에서 현저하게 감소한 반면, shLamin 처리된 대조군에 비해 shLRP5-처리된 심근 세포에서는 증가했다 (도 6A 및 6B).
이러한 결과는, LRP5가 HIF-1α 안정성을 음성적으로 조절하여 HIF-1α에 의한 표적 유전자 전사의 후속적인 감소를 초래함을 나타낸다.
도 5는 LRP5가 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α 안정성을 악화시키는 것을 나타낸다:
도 5A는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5-에 감염된 심근 세포를 정상 산소증 또는 저산소증에 30 분 및 60 분 동안 노출시키고 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이고; 도 5B는 shLamin- 및 shLRP5에 감염된 심근 세포를 정상 산소증 또는 저산소증에 30 분 및 60 분 동안 노출시키고 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 상기 도 5A 및 5B는 저산소증 하에서 증가하는 시간 동안 인큐베이션된 심근 세포에서 HIF-1α 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 5C는 qPCR 분석을 사용하여 정량화된 HIF-1α 전사체 수준을 나타낸 그래프이고, 유전자 발현은 GAPDH로 정규화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 5D는 심근 세포에서 HIF-1α 단백질의 반감기를 나타낸 그래프이며, 웨스턴 블롯팅을 위해 Ad-lacZ-, Ad-LRP5-, shLamin- 및 shLRP5-감염된 심근 세포를 Ad-HIF-1α로 공동 감염시키고 표시된 시간 동안 시클로헥시미드 (CHX, 50 μg/ml)로 처리한 다음 다양한 시점에서 수집한 것이다. 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 5E는 60 분 동안 저산소 조건에 노출된 후 세포질 및 핵 분획 용해물에서 HIF-1α 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이고, α-tubulin 및 lamin B는 각각 세포질 및 핵 단백질 대조군으로 사용되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다. N.S: 유의하지 않음.
도 6은 LRP5가 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α 전사활성을 악화시키는 것을 나타낸다:
도 6A는 HRE-루시퍼라아제 활성의 전사활성을 나타낸 그래프이며, 심근 세포는 Ad-lacZ- 또는 Ad-LRP5-감염과 함께 HRE 루시퍼라아제 리포터 및 pRL-TK 벡터 (형질 감염 효율에 대한 레닐라 대조군)와 함께 공동 형질 감염되었다; 도 6B는 HRE-루시퍼라아제 활성의 전사활성을 나타낸 그래프이고, 심근 세포는 shLamin- 또는 shLRP5- 감염과 함께 HRE 루시퍼라아제 리포터 및 pRL-TK 벡터 (형질 감염 효율에 대한 대조군)와 함께 공동 형질 감염되었다. 상기 도 6A 및 3B에서 pGL3 프로모터 벡터는 양성 대조군으로 사용되었으며, 상대적인 루시퍼라아제 활성은 레닐라 활성에 대한 루시퍼라아제의 비율이다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다.
실시예 4. LRP5의 HIF-1α 히드록실화 촉진 여부 확인
LRP5가 HIF-1α 분해를 촉진하는지 여부를 조사하기 위해, 프로테아좀 억제제인 MG132를 심근 세포에 처리하여 HIF-1α를 안정화시켰다.
그 결과, 저산소 상태에서 MG132를 처리하여 Ad-LRP5-처리된 심근 세포에서 HIF-1α의 수준이 감소하지 않음을 나타냈다 (도 7A).
이러한 결과는, LRP5가 저산소 상태에서 HIF-1α의 유비퀴틴 매개 프로테아좀 분해를 조절할 수 있음을 나타낸다.
다음으로, PHD (PHD1-3)가 프롤릴-히드록실화(prolyl-hydroxylation) (Pro402 및 Pro564에서)을 제어하여 HIF-1α 안정화를 조절하는 세포 산소 센서 역할을 하기 때문에, PHD 조절을 통해 HIF-1α의 LRP5-매개 불안정화가 발생하는지 테스트했다.
그 결과, 도 7B에 나타낸 바와 같이, Ad-lacZ-감염된 심근 세포의 HIF-1α (Pro564) 히드록실화 수준은 저산소증 유도 후 30 분 이내에 현저하게 억제 (> 80 %)된 반면, LRP5의 과발현은 HIF-1α 히드록실화 수준을 정상 산소성 심근 세포와 유사한 수준을 유지하였다. 또한, 저산소 상태에서 LRP5-과발현된 심근 세포에서의 HIF-1α의 감소된 수준은 PHD2-침묵 세포에서 유의하게 회복되었지만, PHD1- 또는 PHD3-침묵 세포에서는 그렇지 않았다 (도 7C). 또한, PHD2 활성은 저산소 상태에서 유의하게 감소했지만, LRP5-과발현된 심근 세포에서는 변경되지 않았으며 LRP5-침묵 세포는 Ad-lacZ 대조군 세포에 비해 PHD2 활성이 더 크게 감소했다 (도 8A). 또한, HIF-1α의 히드록실화 수준은 Ad-lacZ 대조군 세포와 비교하여 LRP5-과발현된 심근 세포에서 PHD2 과발현시 유의하게 향상되었지만, LRP5-침묵 세포에서는 그렇지 않았다 (도 8B). 또한, 저산소 상태에서 PHD 억제제인 디메틸옥살릴글리신 (DMOG)을 처리하면 Ad-LRP5-처리된 심근 세포에서 HIF-1α의 수준이 감소하지 않고 (도 8C), 세포 생존력의 손실이 크게 회복되었다 (도 8D). 또한, 도 8E에서 나타낸 바와 같이, DMOG 처리는 LRP5-과발현된 심근 세포에서 카스파아제-3 활성을 억제시켰다.
이러한 결과는, LRP5가 PHD2-매개 HIF-1α 히드록실화의 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
도 7은 LRP5가 PHD2에 의해 매개되는 HIF-1α의 히드록실화를 조절하는 것을 나타낸다:
도 7A는 Ad-lacZ- 또는 Ad-LRP5에 감염된 심근 세포에서 HIF-1α의 발현에 대한 MG132 (10 μM)의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이고, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 7B는 Pro564-HIF-1α를 인식하는 특정 항체를 사용하여 히드록실화된 HIF-1α 수준을 나타낸 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 심근 세포를 상기 아데노 바이러스로 48 시간 동안 감염시키고 저산소 상태에 노출되기 전에 6 시간 동안 10 μM MG132로 처리한 것이다. 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 7C는 HIF-1α 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이고, 여기서 심근 세포는 음성 siRNA (Nesi) 또는 PHD1-3-특이적 siRNA로 일시적으로 형질 감염된 것이다. 형질 감염 24 시간 후, 세포를 Ad-lacZ 또는 Ad-LRP5로 48 시간 동안 감염시킨 다음 90 분 동안 저산소증에 노출시켰다 (n=4).
도 8은 LRP5가 PHD2에 의해 매개되는 HIF-1α의 히드록실화를 조절하는 것을 나타낸다:
도 8A는 비오틴화된 HIF-1α 산소 의존적 분해 도메인 및 히드록실화된 대조군 펩티드 (P.C)를 650nm에서 TMB 기질을 사용하여 검출된 것을 나타낸 그래프이며, 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 8B는 저산소 상태 (30 분) 하에서 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 심근 세포에서 히드록실화된 HIF-1α의 발현에 대한 PHD2 발현의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 8C는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α의 발현에 대한 DMOG의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 8D는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 세포 생존율에 대한 DMOG의 효과를 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율의 상대적 백분율을 평가한 그래프이며, 세포 생존율은 정상 산소 Ad-lacZ 대조군으로 표준화하였다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 8E는 Ad-lacZ- 및 Ad-LRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 DMOG 처리에 의한 카스파아제-3 활성을 측정한 그래프이며, 데이터는 ml 단위의 샘플 부피당 분당 pNA (p-니트로아닐린)의 pmol로 나타내었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다.
실시예 5. 심근세포에서 LRP5와 PHD2의 상호 작용 여부 확인
LRP5가 PHD2 기능을 통해 HIF-1α 히드록실화에 기여한다는 점을 감안할 때, LRP5와 PHD2 사이에 기능적 상호 작용이 있음을 테스트하기 위해 Ad-Myc-LRP5를 Ad-PHD2와 함께 심근 세포에서 이소성으로 발현시키고 항-Myc 항체를 사용하여 면역 침전된 LRP5를 발현시켰다.
그 결과, 도 9A에서 나타낸 바와 같이, PHD1 및 PHD3이 아닌 내인성 PHD2가 항-Myc 면역 침전물에서 관찰되었다.
다음으로, Myc-LRP5와 Ad-PHD2를 외인적으로 공동 발현시켜 면역 침전 분석을 수행하였다.
그 결과, 세포 용해물이 항-PHD2 항체로 면역 침전되었을 때, Myc-LRP5는 성공적으로 공동 면역 침전되었다 (도 9B). 상호적으로, PHD2는 세포 용해물이 항-Myc 항체로 면역 침전되었을 때 공동 면역 침전되었다 (도 9C). 또한 LRP5와 PHD2 사이의 풍부한 PLA 신호를 관찰할 수 있었다 (도 10A). LRP5와 PHD2 사이의 상호 작용은 LRP5-과발현된 심근 세포에서 현저하게 증가되었고 Ad-lacZ 대조군 세포에 비해 저산소증이 뒤따랐다 (도 10B).
그 다음, HIF-1α와 PHD2 간의 상호 작용에 대한 LRP5 발현 효과를 테스트했다.
그 결과, 항-PHD2 항체를 사용한 공동 면역 침강 HIF-1α의 수준은 예상대로 저산소 상태에서 LRP5-과발현 세포에서 지속적으로 증가했다. 대조적으로, LRP5-침묵 세포에서는 HIF-1a와 PHD2 사이의 상호 작용이 크게 감소했다 (도 10C). 주목할 점은 LRP5와 LRP6이 매우 상동성이긴 하지만 LRP6은 PHD2와 상호 작용하지 않았다 (도 10D).
이러한 결과는, LRP5가 PHD2 활성 조절을 통해 HIF-1α의 단백질 안정성을 조절함을 나타낸다.
도 9는 LRP5가 PHD2와 상호 작용함을 나타낸다:
도 9A는 심근세포를 Ad-LRP5로 감염시키고 표시된 대로 저산소증에 노출시켜, 전체 세포 용해물을 항-Myc 항체를 사용하여 면역 침강시킨 다음 블롯 오른쪽에 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이고 (n=4); 도 9B는 Myc-태그된 Ad-LRP5 및 Ad-PHD2를 심근 세포에 공동 감염시키고 60 분 동안 저산소증에 노출시켜, 전체 세포 용해물을 항-PHD2 항체를 사용하여 면역 침강시킨 다음 항-Myc 및 항-PHD2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이며 (n=4); 도 9C는 심근세포를 도 5B와 같이 준비하고, 용해물은 항-Myc 항체를 사용하여 면역 침강을 한 다음 항-Myc 및 항-PHD2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이다 (n=4).
도 10은 LRP5가 PHD2와 상호 작용함을 나타낸다:
도 10A는 심근세포에서 항-PHD2 및 항-Myc 항체를 사용하여 근접 결찰 분석 (PLA)을 한 결과 사진이며, 앰플리콘 검출은 적색 형광 신호로 생성하였고, 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 스케일 바는 200 μm이다; 도 10B는 심근세포를 Ad-lacZ 또는 Ad-LRP5로 감염시키고 저산소증에 노출시키거나 노출시키지 않고 90 분 후, 전체 세포 용해물을 항-PHD2 항체를 사용하여 면역 침강시킨 다음 항-LRP5 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이고; 도 10C는 심근세포를 표시된 대로 아데노 바이러스와 공동 형질 감염시키고 저산소증에 노출시켜 90 분 후, 세포 용해물을 항-PHD2 항체 또는 IgG를 사용하여 면역 침강시킨 다음 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이며 (n=3); 도 10D는 심근세포를 표시된 대로 아데노 바이러스로 감염시키고 전체 세포 용해물을 항-PHD2 항체 또는 IgG를 사용하여 면역 침강시킨 다음 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 한 결과 사진이다 (n=3).
실시예 6. LRP5에 의한 HIF-1α 안정성의 조절은 Wnt/β-카테닌 신호와 무관한지 여부 확인
Wnt/β-카테닌 신호 전달이 HIF-1α 안정성의 LRP5-매개 조절에 관여하는지 평가하기 위해, 먼저 LRP5- 또는 LRP6-침묵 심근 세포에서 β-카테닌의 발현을 테스트했다.
그 결과, 도 11A에 나타낸 바와 같이, LRP5 침묵은 β-카테닌 수준을 변경하지 않은 반면, LRP6 침묵은 β-카테닌 수준을 하향 조절시켰다. β-카테닌 발현은 세포질 또는 핵 분획에서 저산소증의 어느 시점에서도 크게 변화하지 않았다 (도 11B). 또한, Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5-감염된 저산소성 심근 세포에서 β-카테닌 (Ctnnb1), Axin2, GSK3β, Tcf4 및 Lef1와 같은 Wnt/β-카테닌 표적 유전자의 mRNA 수준이 큰 변화를 나타내지 않는 것을 히트맵으로 나타냈다 (도 11C). 또한, LRP5의 과발현 또는 침묵은 세포질 또는 핵에서 β-카테닌 발현 및 핵 전이에 영향을 미치지 않았다 (도 11D).
이러한 결과는, 급성 저산소증이 Wnt/β-카테닌 신호 전달을 활성화시키지 않고 LRP5가 저산소성 심근 세포에서 Wnt/β-카테닌 신호 전달에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 따라서 LRP5에 의한 HIF-1α 안정성의 조절은 Wnt/β-카테닌 신호 전달과 무관함을 나타낸다.
또한, 저산소증에 노출되면 세포 내 도메인 (ICD)의 첫 번째 PPP[S/T]P 모티프에서 유래된 Ser1503에서의 LRP5의 인산화 수준이 시간 의존적으로 크게 감소했지만, Thr1492 (ICD의 S/T 클러스터)에서의 LRP5의 인산화 수준은 변경되지 않았다 (도 12A). Ser1503에서 인산화된 수준은 저산소증 30 분 이내에 현저하게 감소되었다.
다음으로, phospho-Ser1503이 저산소증 후 30 분 이내에 감소하고 LRP5에 의한 HIF-1α 안정성의 감소가 60 분 이내에 발생했다는 점을 감안할 때 (도 5A), 변경된 인산화된 LRP5가 심근 세포의 저산소 상태에서 HIF-1α 안정성의 조절 뒤에 신호 유발 요인이 될 수 있음을 확인하고자 테스트하였다. 이에 따라, LRP5 ICD에서의 6 개의 PPP(S/T)P 인산화 모티프 (T1492D, S1503A, T1541D, T1578D, S1598A 및 S1609A) 각각이 돌연변이된 구조체를 만들고 (도 12B) HIF-1α 발현에 대한 각 구조체의 효과를 확인했다.
그 결과, T1492D (△1), S1503A (△2), T1541D (△3) 돌연변이체에서는 HIF-1α 수준의 감소가 방지되었지만, T1578D (△4), S1598A (△5), S1609A (△6) 돌연변이체에서는 그렇지 않았다 (도 12B). △1과 △2는 LRP5 과발현 세포에서 HIF-1α 발현을 거의 완전히 회복시켰고, △3은 한계 효과를 보였다.
이러한 결과는, LRP5의 인산화가 저산소성 심근 세포에서 HIF-1α 안정성을 조절함을 나타낸다.
도 11은 LRP5가 Wnt β-카테닌 신호 전달 경로와 독립적으로 HIF-1α 안정성을 조절하는 것을 나타낸다:
도 11A는 shLRP5 또는 shLRP6에 감염된 심근 세포에서 β-카테닌의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); 도 11B는 표시된 저산소 시간 동안, 세포질 및 핵 분획 용해물에서의 β-카테닌 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이며, α-tubulin 및 lamin B는 각각 세포질 및 핵 단백질 대조군으로 사용하였다 (n=4); 도 11C는 Ad-lacZ-, Ad-LRP5- 및 shLRP5에 감염된 저산소성 심근 세포에서 Wnt/β-카테닌 신호 전달 관련 유전자를 나타낸 히트맵이고 (Ad-lacZ 및 Ad-LRP5; n=3, shLRP5; n=2), 각 배수 변화는 정상 산소 Ad-lacZ 대조군과 비교하여 계산하였다; 도 11D는 표시된 바와 같이 아데노 바이러스 감염 후 세포질 및 핵 분획 용해물에서 β-카테닌 발현을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진이고, α-tubulin 및 lamin B는 각각 세포질 및 핵 단백질 대조군으로 사용되었다 (n=3).
도 12는 LRP5가 Wnt β-카테닌 신호 전달 경로와 독립적으로 HIF-1α 안정성을 조절하는 것을 나타낸다:
도 12A는 심근 세포가 표시된 시간 동안 저산소 상태에 노출된 후, p-LRP5 (S1503) 및 p-LRP5 (T1492)의 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이며, 단백질 수준은 총 LRP5 수준으로 정규화되었다. 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=4); 도 12B는 LRP5 인산화 부위 및 부위 지정 돌연변이 유발의 개략도이며; 도 12C는 HIF-1α 발현에 대한 LRP5 돌연변이의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯팅한 결과 사진 및 그래프이다. 단백질 수준은 β-액틴 수준으로 정규화되었으며 그래프는 평균±SD를 나타낸다 (n=3); N.D: 검출되지 않음. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001는 페어링되지 않은 t-검정을 사용하는 각 대조군과 비교한 것이다. N.S: 유의하지 않음.
실시예 7. LRP5 침묵이 인 비보 허혈/재관류 손상을 보호하는지 여부 확인
상기 결과를 고려하여, 인 비보에서 심근 손상에 대한 LRP5의 기능적 효과를 테스트했다.
먼저, lacZ, LRP5, lamin, shLRP5를 발현하는 아데노 바이러스를 랫트의 좌심실 유리 벽 (ventricular free wall)에 주입한 후 주입 3 일 후 랫트에게 허혈/재관류 손상 (I/R 손상)을 가했다.
혈류역학 분석 결과, LRP5 과발현이 더 높은 확장기말 압력-부피 관계 (end-diastolic pressure-volume relationship: EDPVR) 기울기를 나타냈다 (도 13A). 또한, Ad-LRP5 MI 모델에서는 심장 기능이 현저하게 저하되었는데, 이는 Ad-lacZ MI 모델와 비교하여 박출률 (EF) 감소, 혈압 증가 및 좌심실 압력 (-dp/dt)의 최대 감소율 감소로 입증되었다 (도 13B). 반대로, LRP5-침묵 모델은 shLamin MI 모델에 비해 I/R-유발 심장 손상의 예방을 보여주었다 (도 13A 및 13B).
또한, shLRP5-MI 심장에서 더 작은 경색 크기와 섬유증이 관찰된 반면, Ad-LRP5 MI는 Ad-lacZ MI 모델에 비해 증가된 경색 크기 및 섬유증을 나타냈다 (도 14A 및 14B). 또한 HIF-1α의 발현 수준은 I/R-손상된 심근에서 LRP5 수준과 음의 상관 관계를 나타냈다 (도 14C). 또한, Ad-lacZ 심장과 비교하여 Ad-LRP5 주입된 심장 조직에서 PHD2 활성이 크게 증가했으며, shLRP5 주입된 심장에서 수준이 회복되었음을 관찰했다 (도 14D).
이러한 결과는, LRP5를 억제시키면 허혈/재관류 손상을 막을 수 있음을 나타낸다.
도 13은 LRP5 침묵이 인 비보에서 I/R 손상을 보호하는 것을 나타낸다:
도 13A는 압력-부피 루프 분석을 나타낸 그래프이고; 도 13B는 각 군의 박출률 (EF), 심박수, dp/dt max 및 dp/dt min을 포함하는 혈류 역학 분석 결과를 통계 분석한 결과 그래프이며, 그래프는 실험 그룹당 평균±SD를 나타낸다 (n=5-8 랫트).
도 14는 LRP5 침묵이 인 비보에서 I/R 손상을 보호하는 것을 나타낸다:
도 14A는 각 실험군에서 TTC 염색된 심근 절편의 이미지 및 그래프이고, LV 경색 크기 (흰색 영역)는 전체 심실 영역의 백분율로 표시되었다. 그래프는 실험군당 평균±SD를 나타낸다 (n=4 랫트); 도 14B는 I/R 수술 2 주 후의 Masson 트리크롬 염색 이미지 및 그래프이며, 전체 면적에서 섬유증의 백분율로 정량화하였다. 스케일 바는 200 μm이다. 그래프는 실험군당 평균±SD를 나타낸다 (n=4 랫트); 도 14C는 각 실험군에서 HIF-1α 면역 조직 화학 염색의 이미지이고; 도 14D는 비오틴화된 HIF-1α 산소 의존적 분해 도메인 및 히드록실화된 대조군 펩티드를 650 nm에서 TMB 기질을 사용하여 검출한 그래프이다. 그래프는 실험군당 평균±SD를 나타낸다 (n=4 랫트). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. N.S: 유의하지 않음.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic heart disease containing an inhibitor of LRP5 expression or activity <130> PN201077KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4878 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP5 gene sequence <400> 1 atggaggcag cgccgcccgg gccgccgtgg ccgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 60 gcgctgtgcg gctgcccggc ccccgccgcg gcctcgccgc tcctgctatt tgccaaccgc 120 cgggacgtac ggctggtgga cgccggcgga gtcaagctgg agtccaccat cgtggtcagc 180 ggcctggagg atgcggccgc agtggacttc cagttttcca agggagccgt gtactggaca 240 gacgtgagcg aggaggccat caagcagacc tacctgaacc agacgggggc cgccgtgcag 300 aacgtggtca tctccggcct ggtctctccc gacggcctcg cctgcgactg ggtgggcaag 360 aagctgtact ggacggactc agagaccaac cgcatcgagg tggccaacct caatggcaca 420 tcccggaagg tgctcttctg gcaggacctt gaccagccga gggccatcgc cttggacccc 480 gctcacgggt acatgtactg gacagactgg ggtgagacgc cccggattga gcgggcaggg 540 atggatggca gcacccggaa gatcattgtg gactcggaca tttactggcc caatggactg 600 accatcgacc tggaggagca gaagctctac tgggctgacg ccaagctcag cttcatccac 660 cgtgccaacc tggacggctc gttccggcag aaggtggtgg agggcagcct gacgcacccc 720 ttcgccctga cgctctccgg ggacactctg tactggacag actggcagac ccgctccatc 780 catgcctgca acaagcgcac tggggggaag aggaaggaga tcctgagtgc cctctactca 840 cccatggaca tccaggtgct gagccaggag cggcagcctt tcttccacac tcgctgtgag 900 gaggacaatg gcggctgctc ccacctgtgc ctgctgtccc caagcgagcc tttctacaca 960 tgcgcctgcc ccacgggtgt gcagctgcag gacaacggca ggacgtgtaa ggcaggagcc 1020 gaggaggtgc tgctgctggc ccggcggacg gacctacgga ggatctcgct ggacacgccg 1080 gactttaccg acatcgtgct gcaggtggac gacatccggc acgccattgc catcgactac 1140 gacccgctag agggctatgt ctactggaca gatgacgagg tgcgggccat ccgcagggcg 1200 tacctggacg ggtctggggc gcagacgctg gtcaacaccg agatcaacga ccccgatggc 1260 atcgcggtcg actgggtggc ccgaaacctc tactggaccg acacgggcac ggaccgcatc 1320 gaggtgacgc gcctcaacgg cacctcccgc aagatcctgg tgtcggagga cctggacgag 1380 ccccgagcca tcgcactgca ccccgtgatg ggcctcatgt actggacaga ctggggagag 1440 aaccctaaaa tcgagtgtgc caacttggat gggcaggagc ggcgtgtgct ggtcaatgcc 1500 tccctcgggt ggcccaacgg cctggccctg gacctgcagg aggggaagct ctactgggga 1560 gacgccaaga cagacaagat cgaggtgatc aatgttgatg ggacgaagag gcggaccctc 1620 ctggaggaca agctcccgca cattttcggg ttcacgctgc tgggggactt catctactgg 1680 actgactggc agcgccgcag catcgagcgg gtgcacaagg tcaaggccag ccgggacgtc 1740 atcattgacc agctgcccga cctgatgggg ctcaaagctg tgaatgtggc caaggtcgtc 1800 ggaaccaacc cgtgtgcgga caggaacggg gggtgcagcc acctgtgctt cttcacaccc 1860 cacgcaaccc ggtgtggctg ccccatcggc ctggagctgc tgagtgacat gaagacctgc 1920 atcgtgcctg aggccttctt ggtcttcacc agcagagccg ccatccacag gatctccctc 1980 gagaccaata acaacgacgt ggccatcccg ctcacgggcg tcaaggaggc ctcagccctg 2040 gactttgatg tgtccaacaa ccacatctac tggacagacg tcagcctgaa gaccatcagc 2100 cgcgccttca tgaacgggag ctcggtggag cacgtggtgg agtttggcct tgactacccc 2160 gagggcatgg ccgttgactg gatgggcaag aacctctact gggccgacac tgggaccaac 2220 agaatcgaag tggcgcggct ggacgggcag ttccggcaag tcctcgtgtg gagggacttg 2280 gacaacccga ggtcgctggc cctggatccc accaagggct acatctactg gaccgagtgg 2340 ggcggcaagc cgaggatcgt gcgggccttc atggacggga ccaactgcat gacgctggtg 2400 gacaaggtgg gccgggccaa cgacctcacc attgactacg ctgaccagcg cctctactgg 2460 accgacctgg acaccaacat gatcgagtcg tccaacatgc tgggtcagga gcgggtcgtg 2520 attgccgacg atctcccgca cccgttcggt ctgacgcagt acagcgatta tatctactgg 2580 acagactgga atctgcacag cattgagcgg gccgacaaga ctagcggccg gaaccgcacc 2640 ctcatccagg gccacctgga cttcgtgatg gacatcctgg tgttccactc ctcccgccag 2700 gatggcctca atgactgtat gcacaacaac gggcagtgtg ggcagctgtg ccttgccatc 2760 cccggcggcc accgctgcgg ctgcgcctca cactacaccc tggaccccag cagccgcaac 2820 tgcagcccgc ccaccacctt cttgctgttc agccagaaat ctgccatcag tcggatgatc 2880 ccggacgacc agcacagccc ggatctcatc ctgcccctgc atggactgag gaacgtcaaa 2940 gccatcgact atgacccact ggacaagttc atctactggg tggatgggcg ccagaacatc 3000 aagcgagcca aggacgacgg gacccagccc tttgttttga cctctctgag ccaaggccaa 3060 aacccagaca ggcagcccca cgacctcagc atcgacatct acagccggac actgttctgg 3120 acgtgcgagg ccaccaatac catcaacgtc cacaggctga gcggggaagc catgggggtg 3180 gtgctgcgtg gggaccgcga caagcccagg gccatcgtcg tcaacgcgga gcgagggtac 3240 ctgtacttca ccaacatgca ggaccgggca gccaagatcg aacgcgcagc cctggacggc 3300 accgagcgcg aggtcctctt caccaccggc ctcatccgcc ctgtggccct ggtggtagac 3360 aacacactgg gcaagctgtt ctgggtggac gcggacctga agcgcattga gagctgtgac 3420 ctgtcagggg ccaaccgcct gaccctggag gacgccaaca tcgtgcagcc tctgggcctg 3480 accatccttg gcaagcatct ctactggatc gaccgccagc agcagatgat cgagcgtgtg 3540 gagaagacca ccggggacaa gcggactcgc atccagggcc gtgtcgccca cctcactggc 3600 atccatgcag tggaggaagt cagcctggag gagttctcag cccacccatg tgcccgtgac 3660 aatggtggct gctcccacat ctgtattgcc aagggtgatg ggacaccacg gtgctcatgc 3720 ccagtccacc tcgtgctcct gcagaacctg ctgacctgtg gagagccgcc cacctgctcc 3780 ccggaccagt ttgcatgtgc cacaggggag atcgactgta tccccggggc ctggcgctgt 3840 gacggctttc ccgagtgcga tgaccagagc gacgaggagg gctgccccgt gtgctccgcc 3900 gcccagttcc cctgcgcgcg gggtcagtgt gtggacctgc gcctgcgctg cgacggcgag 3960 gcagactgtc aggaccgctc agacgaggcg gactgtgacg ccatctgcct gcccaaccag 4020 ttccggtgtg cgagcggcca gtgtgtcctc atcaaacagc agtgcgactc cttccccgac 4080 tgtatcgacg gctccgacga gctcatgtgt gaaatcacca agccgccctc agacgacagc 4140 ccggcccaca gcagtgccat cgggcccgtc attggcatca tcctctctct cttcgtcatg 4200 ggtggtgtct attttgtgtg ccagcgcgtg gtgtgccagc gctatgcggg ggccaacggg 4260 cccttcccgc acgagtatgt cagcgggacc ccgcacgtgc ccctcaattt catagccccg 4320 ggcggttccc agcatggccc cttcacaggc atcgcatgcg gaaagtccat gatgagctcc 4380 gtgagcctga tggggggccg gggcggggtg cccctctacg accggaacca cgtcacaggg 4440 gcctcgtcca gcagctcgtc cagcacgaag gccacgctgt acccgccgat cctgaacccg 4500 ccgccctccc cggccacgga cccctccctg tacaacatgg acatgttcta ctcttcaaac 4560 attccggcca ctgtgagacc gtacaggccc tacatcattc gaggaatggc gcccccgacg 4620 acgccctgca gcaccgacgt gtgtgacagc gactacagcg ccagccgctg gaaggccagc 4680 aagtactacc tggatttgaa ctcggactca gacccctatc cacccccacc cacgccccac 4740 agccagtacc tgtcggcgga ggacagctgc ccgccctcgc ccgccaccga gaggagctac 4800 ttccatctct tcccgccccc tccgtccccc tgcacggact catccgaaca aaaactcatc 4860 tcagaagagg atctgtga 4878

Claims (17)

  1. LRP5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 LRP5 유전자의 발현 억제제는 LRP5 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임 (ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 LRP5 단백질의 활성 억제제는 LRP5 단백질을 구성하는 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(mimetics), 기질유사체, 앱타머(aptamer), 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제는 LRP5와 PHDs(HIF prolyl-hydroxylase)와의 상호작용 억제제인 것인 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 LRP5 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제는 심근세포에 LRP5와 PHDs의 상호작용을 억제하여 HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α)를 안정화시키는 것인, 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 허혈성 심장질환은 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 허혈성 심부전증, 및 심근비대증로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. LRP5 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈성 심장질환 진단용 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편; 또는
    상기 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 허혈성 심장질환 진단용 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 허혈성 심장질환 진단용 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 핵산은 프라이머 또는 프로브인 허혈성 심장질환 진단용 조성물.
  11. LRP5 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허혈성 심장질환 진단용 키트.
  12. 허혈성 심장질환이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 LRP5 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 심장질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던 블롯팅, 폴리머라아제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사-PCR(reverse transcription-PCR: RT-PCT) 폴리머라아제 증폭 반응, 실시간 PCR, 또는 이들의 조합으로 수행되는 허혈성 심장질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 LRP5 유전자 또는 단백질의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 증가한 경우, 상기 개체는 허혈성 심장질환에 걸리거나 허혈성 심장질환에 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 허혈성 심장질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  15. LRP5 유전자 또는 단백질에 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보 물질 처리된 LRP5 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 LRP5 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 무처리 대조군에 비해 감소시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 심장질환 치료제를 스크리닝하는 방법
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 측정하는 단계는, LRP5와 PHDs(HIF prolyl-hydroxylase)와의 상호작용 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 상호작용 수준을 무처리 대조군에 비해 감소시킨 후보 물질을 추가적으로 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 허혈성 심장질환 치료제를 스크리닝하는 방법.
  17. LRP5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) 유전자의 발현 억제제 또는 LRP5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
KR1020200126989A 2020-09-29 2020-09-29 Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR102536092B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200126989A KR102536092B1 (ko) 2020-09-29 2020-09-29 Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200126989A KR102536092B1 (ko) 2020-09-29 2020-09-29 Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220044040A true KR20220044040A (ko) 2022-04-06
KR102536092B1 KR102536092B1 (ko) 2023-05-24

Family

ID=81211713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200126989A KR102536092B1 (ko) 2020-09-29 2020-09-29 Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102536092B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140116490A (ko) * 2012-01-18 2014-10-02 제넨테크, 인크. 항-lrp5 항체 및 사용 방법
KR101939401B1 (ko) 2011-11-10 2019-01-16 가천대학교 산학협력단 단핵식세포계 세포의 ａｇｅ-알부민 합성 또는 분비 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101939401B1 (ko) 2011-11-10 2019-01-16 가천대학교 산학협력단 단핵식세포계 세포의 ａｇｅ-알부민 합성 또는 분비 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20140116490A (ko) * 2012-01-18 2014-10-02 제넨테크, 인크. 항-lrp5 항체 및 사용 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Basic Research in Cardiology. 2016. Vol.111, Article 67. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102536092B1 (ko) 2023-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marchi et al. Akt‐mediated phosphorylation of MICU 1 regulates mitochondrial Ca2+ levels and tumor growth
Burman et al. Localized hypoxia links ER stress to lung fibrosis through induction of C/EBP homologous protein
Mahul-Mellier et al. c-Abl phosphorylates α-synuclein and regulates its degradation: implication for α-synuclein clearance and contribution to the pathogenesis of Parkinson's disease
Yaddanapudi et al. CD2AP in mouse and human podocytes controls a proteolytic program that regulates cytoskeletal structure and cellular survival
US20130288981A1 (en) Targeting senescent cells and cancer cells by interference with jnk and/or foxo4
Du et al. A novel role of kallikrein-related peptidase 8 in the pathogenesis of diabetic cardiac fibrosis
US20160333343A1 (en) Method of Treatment of Vascular Complications
JP2023081919A (ja) チューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患を処置するための方法及び医薬組成物
WO2017208174A2 (en) Methods of treating disease with pfkfb3 inhibitors
CN113209303B (zh) Wwp1通过溶酶体途径降解癌蛋白muc1抑制肿瘤及其应用
Zhao et al. Caveolin-1 negatively regulates TRAIL-induced apoptosis in human hepatocarcinoma cells
Yang et al. KCTD11 inhibits progression of lung cancer by binding to β‐catenin to regulate the activity of the Wnt and Hippo pathways
Zhao et al. Intrabody against prolyl hydroxylase 2 ameliorates acetaminophen-induced acute liver injury in mice via concomitant promotion of angiogenesis and redox homeostasis
US10626397B2 (en) Therapeutic compositions for breast cancer containing protein kinase D1 inhibitor
Li et al. Endocytosis of peptidase inhibitor SerpinE2 promotes myocardial fibrosis through activating ERK1/2 and β-catenin signaling pathways
KR102536092B1 (ko) Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR100809890B1 (ko) 암 억제 방법
Liu et al. High glucose induces apoptosis in embryonic neural progenitor cells by a pathway involving protein PKCδ
KR102181813B1 (ko) 단백질 카이네이즈 d1 저해제를 포함하는 유방암 치료제 조성물
KR101367832B1 (ko) 종양 억제 타겟으로서 Ｈａｄｅｓ의 용도
Xia et al. A protein complex of LCN2, LOXL2 and MMP9 facilitates tumour metastasis in oesophageal cancer
JP2019534316A (ja) がんを処置するための組成物および方法
RU2812207C2 (ru) Способы и фармацевтические композиции для лечения заболеваний, связанных с тубулин карбоксипептидазами (tcp)
Madroñal et al. Role of the Scavenger Receptor CD36 in Accelerated Diabetic Atherosclerosis
Moore The Effects of Chromatin Remodeling and Pseudokinase Activity on Liver Pathophysiology

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right