CN113747894A - 成纤维细胞生长因子受体2(fgfr2)的降解剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗由异常成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)活性表征或介导的疾病或病况的双特异性化合物、组合物和方法。

Description

成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的降解剂

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2019年4月10日提交的美国临时申请号：62/831,952和2019年8月8日提交的美国临时申请号：62/884,422的优先权益，这两项申请的全部内容通过引用并入本文。

政府许可权

本发明是在政府的支持下，由美国国立卫生研究院授予的P50 CA12)003号基金资助下完成的。政府对这项发明有一定的权利。

背景技术

胆道癌(BTC)约占所有胃肠道(GI)恶性肿瘤的3％，预后不良。所有患者的5年生存率不到15％，III期患者降至10％，IV期患者降至近0％，尽管采用了现有的最佳化疗。几十年来，BTC的发病率一直在增加，主要是由于肝内胆管癌(ICC)的增加。激活成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的遗传改变是ICC中最常见的基因组改变之一，存在于20％以上的肿瘤中，最常见的包括成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)外显子1-18与编码二聚化结构域的多种伴侣的融合，导致组成型FGFR2激酶活性。

FGFR在组织修复、造血、骨生长、血管生成和调节代谢过程等许多生物过程中发挥重要作用。FGFR2作为治疗靶点的出现为ICC患者提供了新的希望。ICC临床开发中最先进的FGFR选择性化合物BGJ398在具有FGFR改变(融合、扩增或点突变)的晚期难治性ICC患者的II期试验中显示了疗效。总有效率(ORR)为14.8％(仅为FGFR2融合时为18.8％)，疾病控制率(DCR；即部分反应+稳定疾病)为)5.4％(仅为FGFR2融合时为83.3％)。中位无进展生存期为5.8个月。虽然5.8个月的生存率仍然低得令人无法接受，但这些结果明显优于难治性晚期ICC患者的历史对照数据。

然而，要将这一令人鼓舞的临床信号转化为长期临床益处，还存在许多挑战。第一个挑战是对三磷酸腺苷(ATP)竞争性FGFR抑制剂的获得性抗性。第二个挑战是抑制FGFR家族不同成员的在靶毒性。鉴于这些挑战，需要全新的方法来实现FGFR靶向的变革性进展。

发明内容

一种双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，所述双特异性化合物具有由式(I)表示的结构:

其中靶向配体代表结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的部分，降解决定子代表结合E3泛素连接酶的部分，接头代表共价连接降解决定子和靶向配体的部分。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供了制备所述双特异性化合物的方法。

本发明的另一方面涉及一种治疗以异常FGFR2活性为特征或由异常FGFR2活性介导的疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。

不希望被任何特定的操作理论所束缚，式(I)的双特异性化合物(本文也称为降解剂)被认为促进了FGFR2的降解，同时保留了其他FGFR亚型。通过将低纳摩尔效力的pan-FGFR2配体与E3连接酶结合剂结合，这些双特异性化合物可以快速募集E3连接酶，并因此促进FGFR2的降解。所述降解剂可以获得比组成型结合配体预期的更高的靶选择性，从而大大降低脱靶效应。

因此，本发明的双特异性化合物可以作为一组新的化学工具来敲除FGFR2，举例说明了一种广泛适用的方法来获得对非选择性结合配体具有选择性的降解剂，并且可以为FGFR2介导的疾病和病症(如癌症)提供有效的治疗。

附图说明

图1A-图1C是显示FGFR2选择性敲除的免疫印迹。图1A是免疫印迹，显示了不同浓度的双特异性化合物6，16小时后在Kato III细胞中FGFR2的敲除。图1B是免疫印迹，显示了对于双特异性化合物6、BGJ398、对照-1、硼替佐米和MLN4924，4小时后在Kato III细胞中FGFR2的敲除。图1C是免疫印迹，显示了对于双特异性化合物6，在0.1μM和0.5μM的浓度下，在16小时的时间内在Kato III细胞中FGFR2的敲除。

图2A-图2C是显示FGFR1/3/4降解的免疫印迹。图2A是免疫印迹，显示了不同浓度的双特异性化合物6，16小时后胆管癌细胞(CCLP1)中FGFR1的敲除。图2B是免疫印迹，显示不同浓度的双特异性化合物6，16小时后肝癌细胞(JHH))中FGFR3/4的敲除。图2C是免疫印迹，显示了在16小时的时间内，对于在0.1μM和0.5μM的浓度下的双特异性化合物6，在CCLP1细胞中FGFR1的敲除。

图3A和图3B是显示FGFR2降解剂的细胞存活力的图。图3A是显示基于VHL的FGFR2降解剂的细胞存活力的图。图3B是显示基于CRBN的FGFR2降解剂的细胞存活力的图。

图4A是免疫印迹，显示了对于不同浓度的双特异性化合物6和7(阴性对照)，在4小时后，在Kato III细胞中FGFR2的降解。

图4B是显示具有相应IC₅₀值的双特异性化合物6和7(阴性对照)和BGJ398的细胞活力的图。

图5A和图5B是显示FGFR2降解的免疫印迹。图5A是免疫印迹，其显示了对于双特异性化合物6和14-22，在1μM浓度下6小时后在Kato III细胞中FGFR2的敲除。图5B是免疫印迹，显示了对于双特异性化合物20、FIIN2、对照-1、硼替佐米和MLN4924，在不同浓度下4小时后在Kato III细胞中FGFR2的降解。

图6A和图6B是分别显示FGFR1和FGFR4敲除的免疫印迹。图6A是免疫印迹，其显示对于双特异性化合物6和14-22，在1μM浓度下6小时后CCLP1细胞中FGFR1的敲除。图6B是免疫印迹，其显示了对于双特异性化合物6和14-22，在1μM浓度下6小时后在JHH)细胞中FGFR4的敲除。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非有相反的说明，否则下列术语具有所示的含义，以便于理解本发明。

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，“一种组合物”包括两种或多种这种组合物的混合物，“一种抑制剂”包括两种或多种这种抑制剂的混合物，等等。

除非另有说明，术语“大约”是指由术语“约”修饰的特定值的10％以内(例如，在5％、2％或1％之内)。

与“包括”、“包含”或“特征在于”同义的过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未记载的元素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤“以及那些实质上不影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤”。

关于本发明的双特异性化合物，在以下术语在本文用于进一步描述它们的程度上，适用以下定义。

如本文所用，术语“烷基”是指饱和的直链或支链单价烃基。在一个实施方案中，烷基是C₁-C₁₈基团。在其他实施方案中，烷基是C₀-C₆、C₀-C₅、C₀-C₃、C₁-C₁₂、C₁-C₈、C₁-C₆、C₁-C₅、C₁-C₄或C₁-C₃基团(其中C₀烷基是指键)。烷基的例子包括甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。在一些实施方案中，烷基是C₁-C₃烷基。

本文使用的术语“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”是指如上定义的烷基，其上连接有氧基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是由氧共价连接的两个烃类化合物。因此，使烷基成为醚的烷基的取代基是或类似于烷氧基，例如可以由-O-烷基、-O-烯基和-O-炔基之一表示。

如本文所用，术语“卤素”(或“卤代”或“卤化物”)指氟、氯、溴或碘。

如本文所用，术语“亚烷基”是指直链或支链二价烃链，其将分子的其余部分连接至基团，仅由碳和氢组成，不含不饱和键并且具有1至12个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基等。亚烷基链可以通过单键连接到分子的其余部分，并通过单键连接到基团。在一些实施方案中，亚烷基包含1至8个碳原子(C₁-C₈亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至5个碳原子(C₁-C₅亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至4个碳原子(C₁-C₄亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至3个碳原子(C₁-C₃亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至2个碳原子(C₁-C₂亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含一个碳原子(C₁亚烷基)。

如本文所用，术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的直链或支链单价烃基。在一个例子中，炔基是C₂-C₁₈基团。在其它例子中，炔基是C₂-C₁₂、C₂-C₁₀、C₂-C₈、C₂-C₆或C₂-C₃。例子包括乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基、丁-1-炔基、丁-2-炔基和丁-3-炔基。

如本文所用，术语“环状基团”广义上指单独使用或作为更大部分的一部分使用的任何基团，包含饱和、部分饱和或芳环体系，例如碳环(环烷基、环烯基)、杂环(杂环烷基、杂环烯基)、芳基和杂芳基。环状基团可具有一个或多个(例如稠合的)环体系。因此，例如，环状基团可以包含一个或多个碳环、杂环、芳基或杂芳基。

如本文所用，术语“碳环”(也称为“碳环基”)是指单独使用或作为较大部分的一部分使用的基团，其包含具有3至20个碳原子的饱和、部分不饱和或芳环体系，其单独或作为较大部分(例如，烷基碳环基团)的一部分。术语碳环基包括单环、双环、三环、稠环、桥环和螺环体系及其组合。在一个实施方案中，碳环基包括3至15个碳原子(C₃-C₁₅)。在一个实施方案中，碳环基包括3至12个碳原子(C₃-C₁₂)。在另一个实施方案中，碳环基包括C₃-C₈、C₃-C₁₀或C₅-C₁₀。在另一个实施方案中，碳环基作为单环，包括C₃-C₈、C₃-C₆或C₅-C₆。在一些实施方案中，碳环基作为双环，包括C₎-C₁₂。在另一个实施方案中，碳环基作为螺环体系，包括C₅-C₁₂。单环碳环基的代表性例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊基-1-烯基、1-环戊基-2-烯基、1-环戊基-3-烯基、环己基、全氘代环己基、1-环己基-1-烯基、1-环己基-2-烯基、1-环己基-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、苯基和环十二烷基；具有)至12个环原子的双环碳环基包括[4,3]、[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]环体系，例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、萘和双环[3.2.2]壬烷。螺环碳环基的代表性例子包括螺环[2.2]戊烷、螺环[2.3]己烷、螺环[2.4]庚烷、螺环[2.5]辛烷和螺环[4.5]癸烷。术语碳环基包括本文定义的芳基环体系。术语碳环基也包括环烷基环(例如，饱和或部分不饱和的单、双或螺碳环)。术语碳环基团还包括与一个或多个(例如1、2或3个)不同的环状基团(例如芳环或杂环)稠合的碳环，其中基团或连接点在碳环上。

因此，术语碳环也包括碳环基烷基基团，如本文所用，其是指式–R^c–碳环基的基团，其中R^c是亚烷基链。术语碳环也包括碳环基烷氧基基团，如本文所用，其指通过式–O–R^c–碳环基的氧原子键合的基团，其中R^c是亚烷基链。

如本文所用，术语“杂环基”是指“碳环基”，其单独使用或作为更大部分的一部分使用，包含饱和、部分不饱和或芳环体系，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子已经被杂原子(例如，O、N、N(O)、S、S(O)或S(O)₂)取代。术语杂环基包括单环、双环、三环、稠环、桥环和螺环体系及其组合。在一些实施方案中，杂环基是指3至15元杂环基环体系。在一些实施方案中，杂环基是指3至12元杂环基环体系。在一些实施方案中，杂环基是指饱和环体系，例如3至12元饱和杂环基环体系。在一些实施方案中，杂环基是指杂芳基环体系，例如5至14元杂芳基环体系。术语杂环基也包括C₃-C₈杂环烷基，它是含有3-8个碳和一个或多个(1、2、3或4个)杂原子的饱和或部分不饱和的单、双或螺环体系。

在一些实施方案中，杂环基包括3-12个环原子，并且包括单环、双环、三环和螺环体系，其中环原子是碳，1-5个环原子是杂原子，例如氮、硫或氧。在一些实施方案中，杂环基包括具有一个或多个选自氮、硫或氧的杂原子的3-至)-元单环。在一些实施方案中，杂环基包括具有一个或多个选自氮、硫或氧的杂原子的4-至6-元单环。在一些实施方案中，杂环基包括3元单环。在一些实施方案中，杂环基包括4元单环。在一些实施方案中，杂环基包括5-6元单环。在一些实施方案中，杂环基包括0至3个双键。在任一前述实施方案中，杂环基包括1、2、3或4个杂原子。任何氮或硫杂原子可以任选被氧化(例如，NO、SO、SO₂)，并且任何氮杂原子可以任选被季铵化(例如，[NR₄]⁺Cl^-、[NR₄]⁺OH^-)。杂环基的代表性例子包括环氧乙烷基、氮丙啶基、硫杂丙啶基、氮杂环丁啶基、氧杂环丁啶基、噻吩基、1,2-二噻吩基、1,3-二噻吩基、吡咯烷基、二氢-1H-吡咯基、二氢呋喃基、四氢吡喃基、二氢噻吩基、四氢噻吩基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、六氢噻喃基、六氢嘧啶基、噁嗪烷基(oxazinanyl)、噻嗪基(thiazinanyl)、噻吨基(thioxanyl)、高哌嗪基(homopiperazinyl)、高哌啶基(homopiperidinyl)、氮杂环庚烷基(azepanyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂基(oxazepinyl)、氧杂氮杂环庚烷基(oxazepanyl)、二氮杂环庚烷基(diazepanyl)、1,4-二氮杂环庚烷基、二氮杂基(diazepinyl)、硫氮杂基(thiazepinyl)、硫氮杂环庚烷基(thiazepanyl)、四氢硫代吡喃基、唑烷基、噻唑基、异噻唑基、1,1-二氧硫代噻唑啉基、唑烷基、咪唑烷基、4,5,6,)-四氢[2H]吲唑基、四氢苯并咪唑基、4,5,6,)-四氢苯并[d]咪唑基、1,6-二氢咪唑基[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶基、噻嗪基、噻吩基、噁嗪基、噻二嗪基、噁二嗪基、二噻嗪基、二噁嗪基、噁噻嗪基、噻三嗪基、噁三嗪基、二噻二嗪基、咪唑啉基、二氢嘧啶基、四氢嘧啶基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、吲哚基、噻吡喃基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂蒽基、1,3-二氧杂戊环基、吡唑啉基、吡唑烷基、二噻烷基、二硫杂蒽基、嘧啶壬基、嘧啶二壬基、嘧啶-2,4-二酮基、哌嗪壬基、哌嗪二壬基、吡唑烷基咪唑基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚基、6-氮杂双环[3.1.1]庚基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、氮杂双环[2.2.2]己基、2-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、2-氮杂双环[2.2.2]辛基、8-氮杂双环[2.2.2]辛基、)-氧杂双环[2.2.1]庚烷、氮杂螺环[3.5]壬基、氮杂螺环[2.5]辛基、氮杂螺环[4.5]癸基、1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基、氮杂螺[5.5]十一烷基、四氢吲哚基、八氢吲哚基、四氢异吲哚基、四氢吲唑基、1,1-二氧六环氢化吡喃基。含有硫或氧原子和1-3个氮原子的5元杂环的例子是噻唑基，包括噻唑-2-基和噻唑-2-基氮氧化物，噻二唑基，包括1,3,4-噻二唑-5-基和1,2,4-噻二唑-5-基，唑基，例如唑-2-基，和噁二唑基，例如1,3,4-噁二唑-5-基，和1,2,4-噁二唑-5-基。含有2-4个氮原子的5元环杂环的例子包括咪唑基，如咪唑-2-基；三唑基，例如1,3,4-三唑-5-基；1,2,3-三唑-5-基、1,2,4-三唑-5-基和四唑基，例如1H-四唑-5-基。苯并稠合5元杂环基的代表性例子是苯并噁唑-2-基、苯并噻唑-2-基和苯并咪唑-2-基。6-元杂环基的例子包括1-3个氮原子和任选的硫或氧原子，例如吡啶基，如吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；嘧啶基，例如嘧啶-2-基和嘧啶-4-基；三嗪基，例如1,3,4-三嗪-2-基和1,3,5-三嗪-4-基；哒嗪基，特别是哒嗪-3-基和吡嗪基。

吡啶N-氧化物和哒嗪N-氧化物以及吡啶基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、哒嗪基和1,3,4-三嗪-2-基是杂环基的其他例子。在一些实施方案中，杂环基团包括与一个或多个(例如，1、2或3个)不同的环状基团(例如，碳环或杂环)稠合的杂环，其中基团或连接点在杂环上，并且在一些实施方案中，其中连接点是杂环中包含的杂原子。

因此，术语杂环包括N-杂环基，如本文所用，其指含有至少一个氮的杂环基，其中杂环基与分子其余部分的连接点是通过杂环基中的氮原子。氮杂环基的代表性例子包括1-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、1-吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基和咪唑烷基。术语杂环也包括C-杂环基，如本文所用，它指含有至少一个杂原子的杂环基，其中杂环基与分子其余部分的连接点是通过杂环基中的碳原子。碳杂环基的代表性例子包括2-吗啉基、2-或3-或4-哌啶基、2-哌嗪基和2-或3-吡咯烷基。术语杂环也包括杂环基烷基基团，如上所述，它是指式-R^c-杂环基的基团，其中R^c是亚烷基链。术语杂环还包括杂环基烷氧基，如本文所用，其是指通过式-O-R^c-杂环基的氧原子键合的基团，其中R^c是亚烷基链。

如本文所用，术语“芳基”单独使用或作为更大部分的一部分使用(例如，“芳烷基”，其中烷基上的末端碳原子是连接点，例如，苄基)、“芳烷氧基”，其中氧原子是连接点，或“芳氧基烷基”，其中连接点在芳基上，是指包括单环、双环或三环碳环体系的基团，其包括稠环，其中该体系中至少一个环是芳族的。在一些实施方案中，芳烷氧基是苯氧基。术语“芳基”可以与术语“芳基环”互换使用。在一个实施方案中，芳基包括具有6-18个碳原子的基团。在另一个实施方案中，芳基包括具有6-10个碳原子的基团。芳基的例子包括苯基、萘基、蒽基、联苯基、菲基、并四苯基、1,2,3,4-四氢萘基、1H-茚基、2,3-二氢-1H-茚基、萘啶基等，它们可以被一个或多个本文所述的取代基取代或独立取代。一种特殊的芳基是苯基。在一些实施方案中，芳基包括与一个或多个(例如，1、2或3个)不同的环状基团(例如，碳环或杂环)稠合的芳基环，其中基团或连接点在芳基环上。

因此，术语芳基包括芳烷基基团(例如,苄基)，如上所述，它是指式-R^c-芳基的基团，其中R^c是亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。在一些实施方案中，芳烷基基团是任选取代的苄基。术语芳基也包括芳烷氧基基团，本文使用的芳烷氧基是指通过式–O–R^c–芳基的氧原子键合的基团，其中R^c是亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。

如本文所用，术语“杂芳基”单独使用或作为更大部分的一部分使用(例如,“杂芳基烷基”(也称为“杂芳烷基”)或“杂芳基烷氧基”(也称为“杂芳烷氧基”),是指具有5至14个环原子的单环、双环或三环环体系，其中至少一个环是芳族的并含有至少一个杂原子。在一个实施方案中，杂芳基包括5-6元单环芳族基团，其中一个或多个环原子是氮、硫或氧。杂芳基基团的代表性例子包括噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、四唑基[1,5-b]哒嗪基、嘌呤基、去氮杂嘌呤基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基、吲哚基、1,3-噻唑-2-基、1,3,4-三唑-5-基、1,3-唑-2-基、1,3,4-噁二唑-5-基、1,2,4-噁二唑-5-基、1,3,4-噻二唑-5-基、1H-四唑-5-基、1,2,3-三唑-5-基和吡啶-2-基氮氧化物。术语“杂芳基”还包括其中杂芳基稠合至一个或多个环状(例如碳环基或杂环基)环的基团,其中基团或连接点在杂芳基环上。非限制性的例子包括吲哚基、吲哚嗪基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并硫代苯基、亚甲二氧基苯基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并二氧杂唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹啉基、咔唑基、吖啶基、苯并嗪基、吩噻嗪基、苯并噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环、双环或三环的。在一些实施方案中，杂芳基包括与一个或多个(例如1、2或3个)不同的环状基团(例如碳环或杂环)稠合的杂芳基环，其中基团或连接点在杂芳基环上，并且在一些实施方案中，其中连接点是杂环中包含的杂原子。

因此，术语杂芳基包括N-杂芳基，如本文所用，其是指如上定义的含有至少一个氮的杂芳基基团，其中杂芳基基团与分子其余部分的连接点是通过杂芳基基团中的氮原子。术语杂芳基也包括C-杂芳基基团，如本文所用，指如上定义的杂芳基基团，并且其中杂芳基与分子其余部分的连接点是通过杂芳基基团中的碳原子。术语杂芳基也包括杂芳基烷基基团，如上文所公开的，其是指式-R^c-杂芳基的基团，其中R^c是如上所定义的亚烷基链。术语杂芳基也包括杂芳烷氧基(或杂芳基烷氧基)基团，如本文所用，其指通过式-O-R^c-杂芳基的氧原子键合的基团，其中R^c是如上定义的亚烷基。

本文所述的任何基团可以是取代的或未取代的。如本文所用，并且在它们没有为任何特定基团另行定义的程度上，术语“取代的”广义上指所有允许的取代基，隐含的条件是此类取代是根据取代原子和取代基的允许化合价确定的，并且该取代产生稳定的化合物，即，一种不会自发发生转化(如重排、环化、消除等)的化合物。代表性的取代基包括卤素、羟基和任何其它含有任意数量碳原子(例如，1-14个碳原子)的有机基团，并且其可以包括一个或多个(例如，1、2、3或4)杂原子(例如氧、硫和氮)，以线性、支化或环状结构形式分组。

取代基的代表性例子因此可以包括烷基、取代的烷基(例如，C₁-C₆、C₁-C₅、C₁-C₄、C₁-C₃、C₁-C₂、C₁)、烷氧基(例如，C₁-C₆、C₁-C₅、C₁-C₄、C₁-C₃、C₁-C₂、C₁)、取代的烷氧基(例如，C₁-C₆、C₁-C₅、C₁-C₄、C₁-C₃、C₁-C₂、C₁)、卤代烷基(例如，CF₃)、烯基(例如，C₂-C₆、C₂-C₅、C₂-C₄、C₂-C₃、C₂)、取代的烯基(例如，C₂-C₆、C₂-C₅、C₂-C₄、C₂-C₃、C₂)、炔基(例如，C₂-C₆、C₂-C₅、C₂-C₄、C₂-C₃、C₂)、取代的炔基(例如，C₂-C₆、C₂-C₅、C₂-C₄、C₂-C₃、C₂)、环(例如，C₃-C₁₂、C₅-C₆)、取代的环(例如，C₃-C₁₂、C₅-C₆)、碳环(例如，C₃-C₁₂、C₅-C₆)、取代的碳环(例如，C₃-C₁₂、C₅-C₆)、杂环(例如，C₃-C₁₂、C₅-C₆)、取代的杂环(例如，C₃-C₁₂、C₅-C₆)、芳基(例如，苄基和苯基)、取代的芳基(例如，取代的苄基或苯基)、杂芳基(例如，吡啶基或嘧啶基)、取代的杂芳基(例如，取代的吡啶基或嘧啶基)、芳烷基(例如，苄基)、取代的芳烷基(例如，取代的苄基)、卤素、羟基、芳氧基(例如，C₆-C₁₂、C₆)、取代的芳氧基(例如，C₆-C₁₂、C₆)、烷硫基(例如，C₁-C₆)、取代的烷硫基(例如，C₁-C₆)、芳硫基(例如，C₆-C₁₂、C₆)、取代的芳硫基(例如，C₆-C₁₂、C₆)、氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、硫代、取代的硫代、亚磺酰基、取代的亚磺酰基、磺酰基、取代的磺酰基、亚磺酰亚胺、取代的亚磺酰亚胺、磺酰胺、取代的磺酰胺、脲、取代的脲、氨基甲酸酯、取代的氨基甲酸酯、氨基酸和肽基。

术语“结合”涉及靶向配体和靶向蛋白质或蛋白(其在本发明中是FGFR2)之间的相互作用，通常指分子间的相互作用，其可以是优先的或基本上特异性的(在本文中也称为“选择性的”)，因为靶向配体与细胞中存在的其它蛋白质实体的结合在功能上是不重要的。本发明的双特异性化合物可以优先结合和募集FGFR2用于靶向降解。

术语“结合”在涉及降解决定子和E3泛素连接酶之间的相互作用时，通常是指分子间相互作用，该相互作用可以表现出或不表现出等于或超过靶向配体和靶蛋白之间亲和力的亲和力水平，但是尽管如此，其中亲和力足以实现将连接酶募集到靶标蛋白的靶向降解和选择性降解。

广义上，所述双特异性化合物具有由下式表示的结构：

其中靶向配体代表结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的部分，降解决定子代表结合E3泛素连接酶的部分，接头代表共价连接降解决定子和靶向配体的部分。

FGFR2靶向配体

在一些实施方案中，靶向配体具有由式(TL-1)表示的结构：

其中

R₃独立地是卤素、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的氨基、任选取代的酰氨基、羧基、丙烯酰胺、任选取代的碳环基或任选取代的杂环基；和m是0-4的整数。

在一些实施方案中，R₃独立地是甲基、氯或甲氧基。

在一些实施方案中，m是0。

在一些实施方案中，m是2。

在一些实施方案中，m是4。

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物具有由式(I-1)表示的结构:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施例中，靶向配体具有由式TL-1a、TL-1b、TL-1c、TL-1d或TL-1e表示的结构:

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物具有由式I-1a、I-1b、I-1c、I-1d或I-1e表示的结构:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，靶向配体具有由式(TL-2)表示的结构：

其中：

R¹是H或任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的氨基、任选取代的酰氨基、羧基、丙烯酰胺、任选取代的碳环基或任选取代的杂环基；和n是0-4的整数。

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物具有由式(I-2)表示的结构:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，式I-2的双特异性化合物由式(I-2a)表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，靶向配体具有由式(TL-3)表示的结构：

其中R²是不存在或代表

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物具有由式(I-3a)或(I-3b)表示的结构:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，靶向配体具有由式(TL-4)表示的结构：

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物具有由式(I-4)表示的结构:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

美国专利号8,865,)3)和9,95),236以及美国专利申请公开号:US2014/03)8481、US2018/0155340、US2016/0009)85和US2015/0366866中描述了可用作FGFR2靶向配体的其它部分。

接头

接头(“L”)提供靶向配体和降解决定子的共价连接。接头的结构可能不是关键的，只要它基本上不干扰靶向配体或降解决定子的活性。

在一些实施方案中，接头可以是亚烷基链或二价亚烷基链，它们中的任一个可以被–O–、–S–、–N(R')–、–C≡C–、–C(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–C(NOR')–、–C(O)N(R')–、–C(O)N(R')C(O)–、–C(O)N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)–、–N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)O–、–OC(O)N(R')–、–C(NR')–、–N(R')C(NR')–、–C(NR')N(R')–、–N(R')C(NR')N(R')–、–OB(Me)O–、–S(O)₂–、–OS(O)–、–S(O)O–、–S(O)–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–N(R')S(O)₂–、–S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)–、–S(O)N(R')–、–N(R')S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)N(R')–、C₃-C₁₂亚碳环基(carbocyclene)、3-至12-元亚杂环基(heterocyclene)、5-至12-元亚杂芳基(heteroarylene)或其任意组合中的至少一个中断和/或终止(在一个或两个末端)，其中R’是H或C₁-C₆烷基，其中中断基团和一个或两个端基可以相同或不同。

“亚碳环基”是指任选被取代的二价碳环基团。

“亚杂环基”是指可以任选被取代的二价杂环基。

“亚杂芳基”是指可以任选被取代的二价杂芳基。

适用于本发明的接头的代表性例子包括亚烷基链：

其中n是1-12的整数(端值包括在内)，例如，1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-)、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-)、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-)、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-)、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-)、5-6、6-10、6-9、6-8、6-)、)-10、)-9、)-8、8-10、8-9、9-10和1、2、3、4、5、6、)、8、9和10，其例子包括:

终止于各种官能团的亚烷基链(如上所述)，其例子如下:

被各种官能团中断的亚烷基链(如上所述)，其例子如下:

用杂环烯基团中断或终止的亚烷基链，例如，

其中m和n独立地是0-10的整数，其例子包括:

被酰胺、杂环烯和/或芳基中断的亚烷基链，其例子包括:

被杂环烯和芳基基团以及杂原子中断的亚烷基链，其例子包括:

和

被杂原子如氮、氧或硼中断和/终止的亚烷基链，例如，

其中每个n独立地是1-10的整数，例如，1-9、1-8、1-)、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-)、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-)、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-)、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-)、5-6、6-10、6-9、6-8、6-)、)-10、)-9、)-8、8-10、8-9、9-10和1、2、3、4、5、6、)、8、9和10，并且R是氢或C₁至C₄烷基，其例子是

在一些实施方案中，接头可以是聚乙二醇链，其可以在以下至少一个中终止(在一个或两个末端)：–S–、–N(R')–、–C≡C–、–C(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–C(NOR')–、–C(O)N(R')–、–C(O)N(R')C(O)–、–C(O)N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)–、–N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)O–、–OC(O)N(R')–、–C(NR')–、–N(R')C(NR')–、–C(NR')N(R')–、–N(R')C(NR')N(R')–、–OB(Me)O–、–S(O)₂–、–OS(O)–、–S(O)O–、–S(O)–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–N(R')S(O)₂–、–S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)–、–S(O)N(R')–、–N(R')S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)N(R')–、C_3-12亚碳环基、3-至12-元亚杂环基、5-至12-元亚杂芳基或其任意组合中的至少一个中断和/或终止(在一个或两个末端)，其中R’是H或C₁-C₆烷基，其中一个或两个端基可以相同或不同。

包括聚乙二醇链的接头的例子包括:

其中n是2-10的整数，其例子包括:

在一些实施方案中，聚乙二醇链可以终止于官能团，所述官能团的例子如下:

在一些实施方案中，接头由选自由如下组成的组的结构表示:

在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物可以包括通过终止于官能团的PEG接头连接到降解决定子的FGFR2 TL。双特异性化合物的代表性例子包括:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物可以包括通过亚烷基接头连接到降解决定子的TL，该亚烷基接头可以被环状或非环状基团(例如酰胺基团)或一个或多个杂原子中断和/或终止。双特异性化合物的代表性例子包括:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物由以下结构中的任何一种表示(其中降解决定子是通用显示的):

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

降解决定子

泛素-蛋白酶体途径(UPP)是调节关键调节蛋白和降解错误折叠或异常蛋白的关键细胞途径。UPP是多个细胞过程的中心。泛素与特定蛋白质底物的共价连接是通过E3泛素连接酶的作用实现的。这些连接酶包括500多种不同的蛋白质，并根据其E3功能活性的结构元素分为多个类别。

在一些实施方案中，降解决定子结合E3泛素连接酶，该连接酶是cereblon，并且由选自由如下组成的组的结构表示:

其中

Y是NH、NMe或O；并且

Z是NH、O或C≡。

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物由选自由如下组成的组的通式表示:

其中

Y是NH、NMe或O；并且

Z是NH、O或C≡；

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在美国专利9,))0,512和美国专利申请公开号2018/001508)、2018/0009))9、2016/024324)、2016/0235)31、2016/0235)30和2016/01)6916，以及国际专利公开WO 201)/19)055、WO 201)/19)051、WO 201)/19)036、WO 201)/19)056和WO 201)/19)046中公开了与cereblon结合并且可能适用于本发明的其他降解决定子。

在一些实施方案中，被降解决定子结合的E3泛素连接酶是von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制因子。参见，Iwai,et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 96:12436-41(1999)。

在一些实施方案中，结合VHL的降解决定子由以下结构中的任何一种表示:

其中Y’是键、N、O或C；

其中Z’是环状基团，其在一些实施方案中是C5-6碳环或杂环基团，和

其中Y”是键、CH₂、NH、NMe、O或S，或其立体异构体。在某些实施方案中，杂环基团是

在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物可以由以下任何一种结构表示：

其中Y’是键、NH、O或CH₂，

其中Z’是环状基团，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，Z’是苯基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、恶唑基、噻唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基。在某些实施方案中，Z’是

美国专利申请公开201)/0121321 A1公开了结合VHL并可适用于本发明的其他降解决定子。

在一些实施方案中，由降解决定子结合的E3泛素连接酶是凋亡蛋白(IAP)的抑制剂。结合IAP并可适用于本发明的降解决定子的代表性实例由以下结构中的任何一种表示:

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物由以下任何一种结构表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在国际专利申请公开WO 20081281)1、WO 2008/016893、WO 2014/060)68、WO2014/060)6)和WO 15092420中公开了结合IAP并可适用于本发明的其他降解决定子。

因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物由结构TL-1至TL-4、L1至L10和本文所述降解决定子的结构(包括D1至D3)的组合所产生的任何结构，或其药学上可接受的盐或立体异构体表示。

在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物具有以下结构:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

本发明的双特异性化合物可以是游离酸或游离碱或药学上可接受的盐的形式。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指一种材料，例如载体或稀释剂，其不会消除双特异性化合物的生物活性或性质，并且相对无毒，即，所述材料可以施用于受试者，而不会引起不希望的生物学效应(如头晕或胃部不适)或以有害的方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。术语“药学上可接受的盐”是指通过本发明的双特异性化合物与合适的酸或碱反应获得的产物。本发明双特异性化合物的药学上可接受的盐的例子包括那些衍生自合适的无机碱如锂、钠、钾、钙、镁、铁、铜、铝、锌和锰盐的盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的例子是与无机酸形成的氨基的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡聚糖盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、4-甲基苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐等。本发明的某些双特异性化合物可以与各种有机碱如赖氨酸、精氨酸、胍、二乙醇胺或二甲双胍形成药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述双特异性化合物是同位素衍生物，因为它具有至少一个原子的期望的同位素取代，其取代度高于同位素的自然丰度，即，被富集。在一个实施方案中，该双特异性化合物包括氘或多个氘原子。用较重的同位素(例如氘(即²H))替代，可提供由于更高的代谢稳定性而产生的某些治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求减少，因此在某些情况下可能是有利的。

本发明的双特异性化合物可以具有至少一个手性中心，并因此可以是立体异构体的形式，如本文所用，其包括单个化合物的所有异构体，这些异构体的不同之处仅在于其原子在空间中的取向不同。术语立体异构体包括镜像异构体(包括化合物的(R-)或(S-)构型的对映异构体)、化合物的镜像异构体的混合物(对映异构体的物理混合物和外消旋物或外消旋混合物)、化合物的几何(顺式/反式或E/Z，R/S)异构体和具有一个以上手性中心但彼此不是镜像的化合物的异构体(非对映异构体)。化合物的手性中心可能在体内发生差向异构化；因此，对于这些化合物来说，以(R-)形式施用的化合物被认为等同于以(S-)形式施用的化合物。因此，本发明的双特异性化合物可以以单独异构体的形式制备和使用，并且基本上不含其他异构体，或者以各种异构体的混合物的形式，例如，立体异构体的外消旋混合物。

合成方法

另一方面，本发明涉及制备式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的方法。广义而言，本发明的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体可以通过任何已知适用于制备化学相关化合物的方法来制备。结合在各种工作实施例中描述的合成方案，将更好地理解本发明的双特异性化合物，这些合成方案说明了可以制备本发明双特异性化合物的非限制性方法。

药物组合物

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体。如本领域已知的，术语“药学上可接受的载体”是指适于向哺乳动物施用本发明化合物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。合适的载体可以包括，例如，液体(水性和非水性的，及其组合)、固体、封装材料、气体及其组合(例如，半固体)，和气体，其功能是将化合物从一个器官或身体的一部分运送或输送到另一个器官或身体的另一部分。载体是“可接受的”，意思是对制剂的其它成分呈生理惰性并与之相容，且对受试者或患者无害。根据制剂的类型，组合物可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。

广义而言，式(I)的双特异性化合物可根据常规制药实践如常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨细、乳化、胶囊化、包埋和压缩方法(参见，例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick andJ.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)配制成给定类型的组合物。制剂的类型取决于施用方式，所述施用方式可以包括肠内(例如，口服、含服、舌下和直肠)、肠胃外(例如，皮下(s.c.)、静脉注射(i.v.)、肌内注射(i.m.)、和胸骨内注射、或输注技术、眼内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、真皮内、阴道内、腹膜内、粘膜、鼻腔、气管内滴注、支气管滴注和吸入)和局部(例如透皮)。一般来说，最合适的施用途径取决于多种因素，包括例如药剂的性质(例如，其在胃肠道环境中的稳定性)和/或受试者的状况(例如，受试者是否能够耐受口服给药)。例如，肠胃外的(例如，静脉内)施用也是有利的，因为例如在单剂量治疗和/或急性病症的情况下，化合物可以相对快速地施用。

在一些实施方案中，所述双特异性化合物被配制用于口服或静脉施用(例如，全身静脉注射)。

因此，本发明的双特异性化合物可以配制成固体组合物(例如，粉末、片剂、可分散颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂)、液体组合物(例如，化合物溶解于其中的溶液、化合物固体颗粒分散于其中的悬浮液、乳液和含有脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液、糖浆和酏剂)；半固体组合物(例如，凝胶、悬浮液和乳膏)；和气体(例如，气溶胶组合物的推进剂)。化合物也可以配制成用于快速、中间或延长释放。

口服固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性化合物与载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和另外的载体或赋形剂如a)填充剂或增量剂(如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)，b)粘合剂(如甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)，c)湿润剂(如甘油)，d)崩解剂(如交联聚合物(例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、淀粉乙醇酸钠、琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)，e)溶液阻滞剂(如石蜡)，f)吸收促进剂(如季铵化合物)，g)润湿剂(如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯)，h)吸收剂(如高岭土和膨润土)，和i)润滑剂(如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)及其混合物混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可以包括缓冲剂。类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用诸如乳糖或乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳(如肠溶衣和其它包衣)来制备。它们可以进一步包含遮光剂。

在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物可以配制在硬或软明胶胶囊中。可以使用的代表性赋形剂包括预胶化淀粉、硬脂酸镁、甘露醇、硬脂酰富马酸钠、无水乳糖、微晶纤维素和交联羧甲基纤维素钠。明胶壳可以包括明胶、二氧化钛、氧化铁和着色剂。

口服液体剂型包括溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、糖浆剂和酏剂。除了化合物之外，液体剂型可以包含本领域常用的水性或非水性载体(取决于化合物的溶解度)，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。口服组合物还可包括赋形剂，如润湿剂、悬浮剂、着色剂、甜味剂、调味剂和加香剂。

注射制剂可包括无菌水溶液或油质悬浮液。它们可以根据标准技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(如油酸)用于制备注射剂。可注射制剂可被灭菌，例如，通过细菌保留过滤器过滤，或通过以无菌固体组合物的形式掺入灭菌剂，其可在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌注射介质中。该化合物的效果可以通过减缓其吸收来延长，这可以通过使用水溶性差的液体悬浮液或结晶或无定形材料来实现。该化合物从肠胃外施用制剂中的延长吸收也可以通过将该化合物悬浮在油性载体中来实现。

在某些实施方案中，式(I)的双特异性化合物可以以局部而非全身的方式施用，例如，通过将缀合物直接注射到器官中，通常以贮库制剂或持续释放制剂的形式。在具体实施方案中，长效制剂通过植入(例如皮下或肌内)或肌内注射施用。可注射贮库形式是通过在可生物降解的聚合物中形成该化合物的微胶囊基质来制备的，所述可生物降解的聚合物例如，聚交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)。化合物的释放速率可以通过改变化合物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质来控制。可注射贮库制剂也是通过将化合物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备的。此外，在其他实施方案中，化合物在靶向药物递送系统中递送，例如在涂有器官特异性抗体的脂质体中。在这样的实施方案中，脂质体靶向器官并被器官选择性吸收。

所述本发明的双特异性化合物可以配制成用于颊内或舌下施用，其例子包括片剂、锭剂和凝胶。

所述双特异性化合物可以配制成用于吸入施用。适于吸入施用的各种形式包括气溶胶、薄雾或粉末。药物组合物可以通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，以气雾剂形式，从加压包装或喷雾器中递送。在一些实施方案中，加压气雾剂的剂量单位可以通过提供阀门以递送经计量的量来确定。在一些实施方案中，例如用于吸入器或吹入器的包含明胶的胶囊和药筒(cartridge)可以被配制成包含化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

式(I)的双特异性化合物可配制成用于局部施用，如本文所用，其是指通过将制剂施用于表皮的皮内施用。这些类型的组合物通常是软膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、溶液和喷雾剂的形式。

用于配制局部应用的组合物的载体的代表性例子包括溶剂(例如，醇、多元醇、水)、乳膏、洗液、软膏、油、膏药、脂质体、粉末、乳液、微乳液和缓冲溶液(例如，低渗或缓冲盐水)。乳膏，例如，可以使用饱和或不饱和脂肪酸(如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、鲸蜡醇或油醇)来配制。乳膏也可以含有非离子表面活性剂，如聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。

在一些实施方案中，局部制剂还可以包括赋形剂，其一个例子是渗透增强剂。这些药剂能够将药理活性化合物输送通过角质层并进入表皮或真皮，优选地，具有很少或没有全身吸收。已经评价了多种化合物在提高药物渗透过皮肤的速率方面的效力。参见，例如，Percutaneous Penetration Enhancers,Maibach H.I.and Smith H.E.(eds.),CRCPress,Inc.,Boca Raton,Fla.(1995)，其调查了各种皮肤渗透增强剂的使用和测试，以及Buyuktimkin et al.,Chemical Means of Transdermal Drug PermeationEnhancementi nTransdermal and Topical Drug Delivery Systems,Gosh T.K.,Pfister W.R.,YumS.I.(Eds.),Interpharm Press Inc.,Buffalo Grove,Ill.(199))。渗透增强剂的代表性例子包括甘油三酯(例如，大豆油)、芦荟组合物(例如，芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、十八烷基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、甘油单油酸酯和丙二醇单油酸酯)和N-甲基吡咯烷酮。

可以包含在局部制剂以及其他类型制剂中的其他赋形剂的代表性例子(在它们相容的程度上)包括防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、润肤剂、缓冲剂、增溶剂、皮肤保护剂和表面活性剂。合适的防腐剂包括醇、季胺、有机酸、对羟基苯甲酸酯和酚类。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚、生育酚和螯合剂如乙二胺四乙酸和柠檬酸。合适的保湿剂包括甘油、山梨醇、聚乙二醇、尿素和丙二醇。合适的缓冲剂包括柠檬酸、盐酸和乳酸缓冲剂。合适的增溶剂包括季铵氯化物、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂和聚山梨醇酯。合适的皮肤保护剂包括维生素E油、尿囊素(allatoin)、二甲基硅油、甘油、凡士林和氧化锌。

透皮制剂通常采用透皮施用装置和透皮施用贴片，其中化合物被配制成亲脂性乳液或缓冲水溶液，溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中。贴片可以构造成用于连续、脉动式(pulsatile)或按需递送药剂。化合物的透皮递送可以通过离子电渗贴片来完成。透皮贴片可以提供化合物的受控递送，其中通过使用速率控制膜或通过将化合物捕获在聚合物基质或凝胶中来减缓吸收速率。吸收增强剂可用于增加吸收，其例子包括可吸收的药学上可接受的溶剂，其有助于通过皮肤。

眼科制剂包括滴眼剂。

用于直肠施用的制剂包括灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂和滞留灌肠剂，其可包含常规栓剂基质(如可可脂或其他甘油酯)，以及合成聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇)等。用于直肠或阴道施用的组合物也可以配制成栓剂，其可以通过将化合物与合适的非刺激性载体和赋形剂(如可可脂、脂肪酸甘油酯的混合物、聚乙二醇、栓剂蜡及其组合)混合来制备，所有这些物质在环境温度下是固体，但在体温下是液体，因此在直肠或阴道腔中熔化并释放化合物。

剂量

如本文所用，术语“治疗有效量”是指式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体；或包含式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的组合物的量，该量能有效地在患有以异常FGFR2活性为特征或由异常FGFR2活性介导的疾病或病症的特定患者中产生所需的治疗反应。术语“治疗有效量”因此包括本发明化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的量，当施用时，该量能诱导待治疗的疾病或病症的积极改变(例如，以选择性地抑制/降解FGFR2)，或足以防止疾病或病症的发展或进展，或在某种程度上减轻受试者中正在治疗的疾病或病症的一种或多种症状，或仅杀死或抑制患病(例如神经母细胞瘤)细胞的生长，或减少患病细胞中FGFR2的量。

所述双特异性化合物的总日剂量及其用法可根据标准医学实践决定，例如，由主治医师运用合理的医学判断。任何特定受试者的具体的治疗有效剂量可取决于多种因素，包括所治疗的疾病或病症及其严重程度(例如，其现状)；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与双特异性化合物组合使用或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素(参见，例如，Goodman and Gilman's,The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th Edition,A.Gilman,J.Hardman and L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,155-1)3，2001)。

式(I)的双特异性化合物可在宽剂量范围内有效。在一些实施方案中，总日剂量(例如，对于成年人来说)可以在约0.001至约1600mg、0.01至约1600mg、0.01至约500mg、约0.01至约100mg、约0.5至约100mg、1至约100-400mg每天、约1至约50mg每天、约5至约40mg每天的范围内，并且在其他实施方案中，为约10至约30mg每天。根据化合物每天施用的次数，可以将单个剂量配制成包含所需的剂量。举例来说，胶囊可以用约1至约200mg的化合物(例如1、2、2.5、3、4、5、10、15、20、25、50、100、150和200mg)配制。在一些实施方案中，根据化合物每天施用的次数，可以将单个剂量配制成包含所需的剂量。

使用方法

在一些方面，本发明涉及治疗涉及异常(例如，功能异常或失调)的FGFR2活性的疾病或病症的方法，其需要向有此需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。

可以说这些疾病或病症以异常的(例如，功能丧失或失调)FGFR2活性为特征或由异常的FGFR2活性介导(例如，相对于非病理状态，蛋白质的水平升高或在功能上异常)。“疾病”通常被认为是受试者的健康状况，其中受试者不能保持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“病症”是指受试者能够保持体内平衡，但受试者的健康状况不如没有病症时的健康状况好的健康状况。如果不治疗，病症不一定会导致动物健康状况的进一步下降。在一些实施方案中，式(I)的双特异性化合物可用于治疗细胞增殖性疾病和病症(例如，癌症或良性肿瘤)。如本文所用，术语“细胞增殖性疾病或病症”是指以细胞生长失调或异常或两者兼有为特征的病况，包括非癌性病况(如瘤)、癌前病况、良性肿瘤和癌症。

本文使用的术语“受试者”(或“患者”)包括动物王国中易患或患有所述疾病或病症的所有成员。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如，人类或非人类哺乳动物。这些方法也适用于伴侣动物，如狗和猫，以及家畜，如牛、马、绵羊、山羊、猪和其他家养和野生动物。根据本发明“需要”治疗的受试者可能“患有或疑似患有”特定疾病或病症，受试者可能已被确诊或以其他方式呈现有足够数量的风险因素或足够数量或组合的体征或症状，使得医学专业人员可以诊断或怀疑该受试者患有该疾病或病症。因此，患有和疑似患有特定疾病或病症的受试者不一定是两个不同的群体。

可以用式(I)的双特异性化合物治疗的非癌性(例如，细胞增生性)疾病或病症的示例性类型包括炎性疾病和病况、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、心脏病、病毒性疾病、慢性和急性肾脏疾病或损伤、代谢性疾病以及过敏性和遗传性疾病。

特定非癌性疾病和病症的代表性例子包括类风湿性关节炎、斑秃、淋巴组织增生性病况、自身免疫性血液病症(例如，溶血性贫血、再生障碍性贫血、无汗性外胚层发育不良、纯红细胞性贫血和特发性血小板减少症)、胆囊炎、肢端肥大症、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风、硬皮病、脓毒症、脓毒性休克、泪腺炎、蛋白相关周期性综合征(CAPS)、内毒素休克、子宫内膜炎、革兰氏阴性脓毒症、干燥性角膜结膜炎、中毒性休克综合征、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、慢性肺部炎症、慢性移植排斥、化脓性汗腺炎、炎症性肠病、克罗恩病、白塞氏综合征、系统性红斑狼疮、肾小球性肾炎、多发性硬化症、幼年型糖尿病、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、自身免疫性血管炎、甲状腺炎、爱迪生氏病、扁平苔藓、阑尾炎、大疱性天疱疮、寻常型天疱疮、叶状天疱疮、副肿瘤性天疱疮、重症肌无力、免疫球蛋白A肾病、桥本氏病、干燥综合征、白癜风、韦格纳肉芽肿病、肉芽肿性睾丸炎、自身免疫性卵巢炎、结节病、风湿性心脏炎、强直性脊柱炎、格雷夫斯病、自身免疫性血小板减少性紫癜、银屑病、银屑病关节炎、湿疹、疱疹样皮炎、溃疡性结肠炎、胰腺纤维化、肝炎、肝纤维化、CD14介导的脓毒症、非CD14介导的脓毒症、急性和慢性肾病、肠易激综合征、发热、再狭窄、宫颈炎、中风和缺血性损伤、神经损伤、急性和慢性疼痛、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、急性冠状动脉综合征、恶病质、疟疾、急性和慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、急性冠状动脉综合征、恶病质、疟疾、麻风病、利什曼病、莱姆病、雷特氏综合征、急性滑膜炎、肌肉退化、滑囊炎、肌腱炎、腱鞘炎、椎间盘突出、破裂或脱垂综合征、骨硬化、鼻腔鼻窦炎、血栓形成、矽肺、肺肌病、骨吸收疾病(如骨质疏松症)、纤维肌痛、AIDS和其他病毒性疾病(如带状疱疹、单纯疱疹I或II、流感病毒和巨细胞病毒)、I型和II糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗和糖尿病性视网膜病变、22q11.2缺失综合征、Angelman综合征、Canavan病、腹腔疾病、Charcot-Marie-Tooth病、色盲、Cridu chat、唐氏综合征、囊性纤维化、Duchenne肌营养不良、血友病、Klinefleter综合征、神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、Prader-Willi综合征、镰状细胞病、Tay-Sachs病、Turner综合征、尿素循环障碍、地中海贫血、中耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、肺炎、葡萄膜炎、多发性肌炎、直肠炎、间质性肺纤维化、皮肌炎、动脉粥样硬化、动脉硬化、肌萎缩性侧索硬化、血管性痴呆、静脉曲张、阴道炎、抑郁症和婴儿猝死综合征。

在一些实施方案中，所述双特异性化合物可用于治疗非癌性神经退行性疾病和病症。如本文所用，术语“神经退行性疾病和病症”是指以神经细胞进行性退化或死亡或两者兼有为特征的病症，包括运动问题(共济失调)或精神功能问题(痴呆)。此类疾病和病症的代表性例子包括阿尔茨海默病(AD)和AD相关的痴呆、帕金森病(PD)和PD相关的痴呆、朊病毒病、运动神经元病(MND)、亨廷顿病(HD)、皮克氏综合征、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA)、原发性进行性失语(PPA)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、创伤性脑损伤(TBI)、多发性硬化(MS)、痴呆(例如，血管性痴呆(VaD)、路易体痴呆(LBD)、语义性痴呆和额颞叶痴呆(FTD)。

在其他实施方案中，该方法涉及治疗患有癌症的受试者。广义地说，本发明的双特异性化合物可有效治疗癌(实体瘤，包括原发性和转移性肿瘤)、肉瘤、黑素瘤和血液学癌症(影响血液(包括淋巴细胞、骨髓和/或淋巴结)的癌症))，如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。癌症可以是血管化的，或者还没有实质上血管化的，或者是非血管化的肿瘤。

癌症的代表性例子包括肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌症(例如，卡波西氏和AIDS相关的淋巴瘤)、阑尾癌、儿童癌(例如，儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤)、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、尿膀胱癌、脑癌(例如，胶质瘤和胶质母细胞瘤(如脑干胶质瘤、妊娠滋养细胞肿瘤胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、神经系统癌(例如，中枢神经系统癌症、中枢神经系统淋巴瘤)、宫颈癌、慢性骨髓增生性疾病、结肠直肠癌(例如，结肠癌、直肠癌)、淋巴肿瘤、蕈样真菌病、Sezary综合征、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃肠癌(例如，胃癌、小肠癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST))、胆管癌、生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤、头颈癌、神经内分泌肿瘤、霍奇金淋巴瘤、Ann Arbor III期和IV期儿童非霍奇金淋巴瘤、ROS1阳性难治性非霍奇金淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、眼癌、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、肾癌(例如，肾母细胞瘤、肾细胞癌)、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、细胞ALK阳性间变性大淋巴瘤、ALK阳性晚期恶性实体肿瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、伴隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、多发性内分泌瘤(MEN)、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌(例如，口腔癌、唇癌、口腔癌、舌癌、口咽癌、喉癌、咽癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤)、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、鼻咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤、转移性未分化甲状腺癌、未分化甲状腺癌、甲状腺乳头状癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌、子宫肉瘤、子宫体癌)、鳞状细胞癌、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、青少年黄色肉芽肿、肾盂和输尿管及其他泌尿器官的移行细胞癌、尿道癌、妊娠滋养细胞肿瘤、阴道癌、外阴癌、肝母细胞瘤、横纹肌样瘤和肾母细胞瘤。

可用本发明化合物治疗的肉瘤包括软组织癌和骨癌，其代表性例子包括骨肉瘤或成骨性肉瘤(骨)(例如，尤因氏肉瘤)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜性内层)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、神经胶质瘤或星形细胞瘤(发现于大脑中的神经源性结缔组织)、粘液肉瘤(原始胚胎结缔组织)、间叶或混合中胚叶肿瘤(混合结缔组织类型)和组织细胞肉瘤(免疫癌)。

在一些实施方案中，本发明的方法能够治疗患有血液系统、肝、脑、肺、结肠、胰腺、前列腺、卵巢、乳房、皮肤和子宫内膜的细胞增殖性疾病或病症的受试者。

如本文所用，“血液系统的细胞增殖性疾病或病症”包括淋巴瘤、白血病、髓样肿瘤、肥大细胞肿瘤、脊髓发育不良、良性单克隆丙种球蛋白病、真性红细胞增多症、慢性髓细胞白血病、特发性髓样化生、和原发性血小板增多症。因此，血液学癌症的代表性例子可以包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和ALK+间变性大细胞淋巴瘤(例如，选自弥漫性大B细胞淋巴瘤的B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如，生发中心B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤或活化的B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤)、伯基特淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤/Waldenstrom巨球蛋白血症、转移性胰腺癌、难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤、和复发的B细胞非霍奇金淋巴瘤、儿童淋巴瘤以及淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤，例如，小淋巴细胞淋巴瘤、白血病(包括儿童白血病)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、急性髓细胞白血病(例如，急性单核细胞白血病)、慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病和肥大细胞白血病、髓样肿瘤和肥大细胞肿瘤。

如本文所用，“肝脏的细胞增殖性疾病或病症”包括影响肝脏的所有形式的细胞增殖性病症。肝脏的细胞增殖性病症可以包括肝癌(例如，肝细胞癌、肝内胆管细胞癌和肝母细胞瘤)、肝脏的癌前或癌前期病况、肝脏的良性生长或病变、肝脏的恶性生长或病变以及除肝脏以外的体内组织和器官的转移性病变。肝脏的细胞增殖性病症可能包括肝脏的增生、化生和发育不良。

如本文所用，“脑的细胞增殖性疾病或病症”包括影响脑的所有形式的细胞增殖性病症。大脑的细胞增殖性病症可以包括脑癌(例如，胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤和原始神经外胚层肿瘤(髓母细胞瘤))、脑的癌前或癌前期病况、脑的良性生长或病况、脑的恶性生长或病变以及除脑以外的身体组织和器官的转移性病变。大脑的细胞增殖性病症可能包括大脑的增生、化生和发育不良。

如本文所用，“肺的细胞增殖性疾病或病症”包括影响肺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。肺的细胞增殖性病症包括肺癌、肺的癌前和癌前期病况、肺的良性生长或病变、肺的增生、化生和发育不良以及除肺以外的身体组织和器官的转移性病变。肺癌包括所有形式的肺的癌症，例如，恶性肺肿瘤、原位癌、典型类癌瘤和非典型类癌瘤。肺癌包括小细胞肺癌(“SLCL”)、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、腺癌、小细胞癌、大细胞癌、鳞状细胞癌和间皮瘤。肺癌可包括“疤痕癌”、细支气管癌、巨细胞癌、梭形细胞癌和大细胞神经内分泌癌。肺癌还包括具有组织学和超微结构异质性的肺肿瘤(例如，混合细胞类型)。在一些实施方案中，本发明的双特异性化合物可用于治疗非转移性或转移性肺癌(例如，NSCLC、ALK阳性NSCLC、含有ROS1重排的NSCLC、肺腺癌和鳞状细胞肺癌)。

如本文所用，“结肠的细胞增殖性疾病或病症”包括影响结肠细胞的所有形式的细胞增殖性病症，包括结肠癌、结肠癌前或癌前期病况、结肠腺瘤性息肉和结肠异时病变。结肠癌包括散发性和遗传性结肠癌、恶性结肠瘤、原位癌、典型类癌瘤和非典型类癌瘤、腺癌、鳞状细胞癌和鳞状细胞癌。结肠癌可能与遗传性综合征有关，如遗传性非息肉病性结肠直肠癌、常见的腺瘤性息肉病、MYH相关的息肉病、Gardner氏综合征、Peutz-Jeghers综合征、Turcot氏综合征和青少年息肉病。结肠的细胞增殖性病症也可以以结肠的增生、化生或发育不良为特征。

如本文所用，“胰腺的细胞增殖性疾病或病症”包括影响胰腺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。胰腺的细胞增殖性病症可包括胰腺癌、胰腺的癌前或癌前期病况、胰腺的增生、胰腺的发育不良、胰腺的良性生长或病变、胰腺的恶性生长或病变以及除胰腺之外的身体组织和器官的转移性病变。胰腺癌包括所有形式的胰腺癌，包括导管腺癌、腺鳞癌、多形性巨细胞癌、粘液腺癌、破骨细胞样巨细胞癌、粘液性囊腺癌、腺泡癌、未分类的大细胞癌、小细胞癌、胰腺母细胞瘤、乳头状肿瘤、粘液性囊腺瘤、乳头状囊性肿瘤和浆液性囊腺瘤，以及具有组织学和超微结构异质性的胰腺肿瘤(例如，混合细胞类型)。

如本文所用，“前列腺的细胞增殖性疾病或病症”包括影响前列腺的所有形式的细胞增殖性病症。前列腺的细胞增殖性病症可包括前列腺癌、前列腺的癌前或癌前期病况、前列腺的良性生长或病变、前列腺的恶性生长或病变，以及除前列腺之外的体内组织和器官的转移性病变。前列腺细胞增生性疾病可能包括前列腺增生、化生和发育不良。

如本文所用，“卵巢的细胞增殖性疾病或病症”包括影响卵巢细胞的所有形式的细胞增殖性病症。卵巢的细胞增殖性病症可包括卵巢的癌前或癌前期病况、卵巢的良性生长或病变、卵巢癌以及除卵巢之外的体内组织和器官的转移性病变。卵巢的细胞增殖性病症可能包括卵巢增生、化生和发育不良。

如本文所用，“乳腺的细胞增殖性疾病或病症”包括影响乳腺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。乳腺的细胞增殖性病症可以包括乳腺癌、乳腺的癌前或癌前期病况、乳腺的良性生长或病变以及除乳腺之外的身体组织和器官中的转移性病变。乳腺的细胞增殖性病症可能包括乳腺增生、化生和发育不良。

如本文所用，“皮肤的细胞增殖性疾病或病症”包括影响皮肤细胞的所有形式的细胞增殖性病症。皮肤的细胞增殖性病症可以包括皮肤的癌前或癌前期病况、皮肤的良性生长或病变、黑色素瘤、恶性黑色素瘤或皮肤的其他恶性生长或病变，以及除皮肤之外的身体组织和器官中的转移性病变。皮肤的细胞增殖性病症可能包括皮肤增生、化生和发育不良。

如本文所用，“子宫内膜的细胞增殖性疾病或病症”包括影响子宫内膜细胞的所有形式的细胞增殖性病症。子宫内膜的细胞增殖性病症可包括子宫内膜的癌前或癌前期病况、子宫内膜的良性生长或病变、子宫内膜癌以及除子宫内膜之外的体内组织和器官的转移性病变。子宫内膜的细胞增殖性病症可能包括子宫内膜的增生、化生和发育不良。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是肝癌。在其他实施方案中，所述疾病或病症是胆道癌(BTC)。在其他实施方案中，所述疾病或病症是肝内胆管癌(ICC)或肝外胆管癌(ECC)。

式(I)的双特异性化合物可施用于患者(例如，癌症患者)，作为单一疗法或通过联合疗法，以及作为一线疗法或对一线疗法无反应的患者的后续疗法。疗法可以是“一线的”，即，作为没有接受过先前抗癌治疗方案的患者的初始治疗，单独或与其他治疗组合；或“二线的”，作为对已经经历过先前抗癌治疗方案的患者的治疗，单独或与其它治疗组合；或作为“三线的”、“四线的”等治疗，单独治疗或与其他治疗联合治疗。也可以对以前接受过部分成功治疗但对特定治疗变得不耐受的患者进行治疗。也可以作为辅助治疗来给予疗法，即，以在当前未检测到疾病的患者中或在手术切除肿瘤之后防止癌症的再次发生。因此，在一些实施方案中，所述化合物可以施用于已经接受另一种疗法(例如化疗、放射免疫疗法、外科疗法、免疫疗法、放射疗法、靶向疗法或其任意组合)的患者。

本发明的方法可能需要以单剂量或多剂量(例如，1、2、3、4、5、6、)、8、10、15、20或更多剂量)向患者施用式(I)的双特异性化合物或其药物组合物。例如，施用频率可以从每天一次到大约每八周一次。在一些实施方案中，施用的频率范围约为每天一次，持续1、2、3、4、5或6周，在其他实施方案中需要28天的周期，其包括3周(21天)的每天施用。在其他实施方案中，双特异性化合物可以在两天半的过程中每天给药两次(BID)(总共5次剂量)，或者在两天的过程中每天施用一次(QD)(总共2次剂量)。在其他实施方案中，双特异性化合物可以在五天内每天施用一次(QD)。

组合疗法

式(I)的双特异性化合物可以与至少一种其它活性剂(例如，抗癌剂)或疗法组合或同时使用，用于治疗疾病和病症。术语“组合”和“同时”在本文中是指药剂共同施用，其包括基本上同时施用，通过相同或单独的剂型，和通过相同或不同的施用模式，或顺序施用，例如，作为相同治疗方案的一部分，或者通过连续治疗方案。因此，如果连续施用，在开始施用第二种化合物时，在某些情况下，两种化合物中的第一种仍可以在治疗部位以有效浓度检测到。可以确定顺序和时间间隔，使得它们可以一起起作用(例如，协同作用以提供比以其他方式施用时增加的益处)。例如，可以同时施用或在不同的时间点以任何顺序依次施用治疗剂；然而，如果不同时施用，它们可以在足够接近的时间内施用，以提供期望的治疗效果，这可以是协同方式。因此，这些术语不限于在完全相同的时间施用活性剂。

在一些实施方案中，治疗方案可包括将式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体与一种或多种已知用于治疗疾病或病症(例如癌症)的其他治疗剂组合施用。另外的抗癌治疗剂的剂量可以与已知或推荐的剂量相同或甚至更低。参见，Hardman et al.,eds.,Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis OfTherapeutics,第十版,McGraw-Hill,New York,2001；Physician's Desk Reference,第60版,2006。例如，可与双特异性化合物联合使用的抗癌剂是本领域已知的。参见，例如，美国专利9,101,622(其中第5.2节)和美国专利9,345,705 B2(其中第12-18栏)。另外的活性剂和治疗方案的代表性例子包括放射疗法、化学疗法(例如，有丝分裂抑制剂、血管生成抑制剂、抗激素、自噬抑制剂、烷化剂、嵌入抗生素(intercalating antibiotics)、生长因子抑制剂、抗雄激素、信号转导途径抑制剂、抗微管剂、铂配位络合物、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂)、免疫调节剂、治疗性抗体(例如，单特异性和双特异性抗体)和CAR-T疗法。

在一些实施方案中，式(I)的双特异性化合物可以与其他抗癌剂组合使用，所述其他抗癌剂的例子包括紫杉醇(例如，卵巢癌、乳腺癌、肺癌、卡波济肉瘤、宫颈癌和胰腺癌)、拓扑替康(例如，卵巢癌和肺癌)、伊立替康(例如，结肠癌和小细胞肺癌)、依托泊苷(例如，睾丸癌、肺癌、淋巴瘤和非淋巴细胞白血病)、长春新碱(例如，白血病)、亚叶酸(例如，结肠癌)、奥曲肽(例如，卵巢癌)、柔红霉素(例如，急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)和卡波西肉瘤)、曲妥珠单抗(例如，乳腺癌、胃癌和食道癌)、利妥昔单抗(例如，非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗(例如，结肠直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌)、帕妥株单抗(例如，转移性HER2阳性乳腺癌)，阿仑单抗(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和T细胞淋巴瘤)、帕尼单抗(例如，结肠癌和直肠癌)、他莫昔芬(例如，乳腺癌)、氟维司群(例如，乳腺癌)、来曲唑(例如，乳腺癌)、依西美坦(例如，乳腺癌)、氮杂胞苷(例如，骨髓增生异常综合征)、丝裂霉素C(例如，胃肠癌、肛门癌和乳腺癌)、更生霉素(例如，肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、滋养细胞肿瘤、睾丸癌和卵巢癌)、厄洛替尼(例如，非小细胞肺癌和胰腺癌)、索拉非尼(例如，肾癌和肝癌)、替西罗莫司(例如，肾癌)、硼替佐米(例如，多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤)、培门冬酶(例如，急性淋巴细胞白血病)、卡博替尼(例如，肝细胞癌，甲状腺髓样癌和肾细胞癌)、可瑞达(例如，宫颈癌、胃癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌和头颈部鳞状细胞癌)、纳武单抗(例如，结直肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌和尿路上皮癌)和瑞戈非尼(例如大肠癌、胃肠道间质瘤和肝细胞癌)。

在一些实施方案中，式(I)的双特异性化合物和另外的(例如抗癌)治疗剂可以间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔小于1小时、间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约)小时、间隔约)小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至)2小时、间隔)2小时至84小时、间隔84小时至96小时、或间隔96小时至120小时施用。两种或更多种(例如抗癌)治疗剂可以在同一次患者就诊中施用。

当组合的活性成分不在同一药物组合物中施用时，应理解它们可以以任何顺序施用于需要的受试者。例如，本发明的化合物可以在另外的抗癌治疗剂施用之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、)2小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、)2小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用于有此需要的受试者。在各个方面，抗癌治疗剂间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔不到1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至)小时、间隔)小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔不超过24小时或间隔不超过48小时施用。在一个例子中，所述(例如，抗癌)治疗剂是在同一次办公室访问中进行的。在另一个例子中，组合抗癌治疗剂可以间隔1分钟至24小时施用。

在一些涉及癌症治疗的实施方案中，式(I)的双特异性化合物和另外的抗癌剂或治疗剂被循环施用。循环疗法包括施用一种抗癌治疗剂一段时间，随后施用第二种抗癌治疗剂一段时间，并重复这种顺序施用(即，该循环)，以便减少对一种或两种抗癌疗法的耐药性的发展，避免或减少一种或两种抗癌疗法的副作用，和/或提高疗法的疗效。在一个实例中，循环疗法包括施用第一种抗癌治疗剂一段时间，随后施用第二种抗癌治疗剂一段时间，任选地，随后施用第三种抗癌治疗剂一段时间等，并重复这种顺序施用(即，该循环)，以便减少对所述抗癌剂之一的耐药性的发展，避免或减少所述抗癌剂之一的副作用，和/或提高所述抗癌剂的疗效。

医药试剂盒

本发明的双特异性化合物和/或包含它们的组合物可以组装成试剂盒或药物系统。根据本发明的这一方面的试剂盒或药物系统包括载体或包装，例如盒、纸箱、管等，在其中具有严密限制的一个或多个容器，例如小瓶、管、安瓿或瓶，其包含本发明式(I)的双特异性化合物或其药物组合物。本发明的试剂盒或药物系统还可以包括使用所述化合物和组合物的印刷说明书。

本发明的这些和其他方面将在考虑以下实施例后得到进一步理解，这些实施例旨在说明本发明的某些特定实施方案，但不旨在限制由权利要求限定的本发明的范围。

实施例

实施例1：基于沙利度胺的中间体的合成。

2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁基酯

在室温下，将溴乙酸叔丁酯(199mg，1.02mmol)加入到2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(200mg，0.)3mmol)和K₂CO₃(304mg，2.20mmol)在3mL DMF中的混合物中。将混合物搅拌过夜，然后用水淬灭。然后用3×5mL乙酸乙酯萃取含水混合物，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，并浓缩。通过硅胶色谱纯化提供了2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁基酯(245mg，0.63mmol，86％)，为白色结晶固体。LC/MSm/z计算为[M+2H–tBu]⁺333.1,实测333.1。

2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸

将2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁基酯(140mg，0.036mmol)溶解在1mL DCM和1mL TFA中，并在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂，得到2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(121mg，0.036mmol，101％)，为白色固体。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺333.1,实测332.)。

2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-5-羟基-1H-苯并[去]异喹啉-1,3(2H)-二酮

在室温下，将3-羟基-1，8-萘二甲酸酐(2.14g，10.0mmol)和3-氨基哌啶-2，6-二酮(1.65g，10.0mmol)溶解在THF(40mL)中，并加入三乙胺(2.)8mL，20.0mmol)。然后将悬浮液回流5天，在最初的24小时内形成绿色沉淀，并最终变成黑色。蒸发溶剂，加入水，酸化混合物，搅拌1小时。然后过滤悬浮液，得到绿色固体形式的标题化合物(3.44g，9.53mmol，95％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺325.1,实测325.1。

2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧-1H-苯并[去]异喹啉-5-基)氧基)乙酸叔丁基酯

将2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-5-羟基-1H-苯并[去]异喹啉-1，3(2H)-二酮(361mg，1.1mmol)悬浮在3mL DMF中，然后加入K₂CO₃(2)6mg，2.0mmol)和溴乙酸叔丁酯(234mg，1.2mmol)。将蓝色悬浮液在室温下搅拌4小时，此时再加入1.0mmol溴乙酸叔丁酯。继续搅拌过夜后，加入水，过滤悬浮液，得到浅灰色固体形式的叔丁基酯(464mg，1.06mmol，95％)。LC/MS m/z计算为[M+2H–tBu]⁺383.1,实测383.2。

然后将该酯溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(1mL)，溶液在室温下搅拌2小时。然后除去溶剂，干燥产物，得到标题化合物，无需进一步纯化。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺383.08,实测383.19。

基于沙利度胺的中间体(A–E)

将2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1，3-二酮或2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1，3-二酮(1当量)溶解在DMF中，用K₂CO₃(2当量)处理，加入适当的烷基溴接头(1.0当量)，并将混合物在50℃下搅拌过夜。用水淬灭反应并用EtOAc萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，然后通过硅胶色谱浓缩并纯化，以得到保护的胺或酯。然后将这些中间体溶于1∶1的DCM:TFA中，在室温下搅拌2小时，然后浓缩并干燥，以得到A–E型的化合物。

实施例2：2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基}嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)-N-{2-[2-(2-{[3-(2,6-二氧哌啶-3-基)-2,4-二氧-3-氮杂三环[).3.1.0⁵,¹³]十三-1(12),5,),9(13),10-五烯-)-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}乙酰胺(1)的合成

4-(4-((6-氯嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯

将4-(4-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(2.0g，).21mmol)加入到在DIEA(1.88mL，10.8mmol)和异丙醇(15mL)中的4，6-二氯嘧啶(1.61g，10.8mmol)中。然后将紫色溶液在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化以得到标题化合物，为褐红色固体(2.)5g，).05mmol，98％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺390.16,实测390.30。

4-(4-((6-(甲氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯

将4-(4-((6-氯嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1.0g，2.6mmol)悬浮在1-丁醇(20mL)中，并加入DIEA(910uL，5.2mmol)，然后加入甲胺(1.28mmol，2M在THF中)。然后密封反应容器，混合物在120℃加热过夜。蒸发溶剂以得到标题化合物，无需进一步纯化。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺385.23,实测385.0)。

4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1,3-二甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯

将2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯胺(444mg，2.0mmol)和三光气(23)mg，0.80mmol)溶解在THF中。在0℃下，缓慢加入DIEA，随着反应缓慢升温至室温，形成白色沉淀。1小时后，蒸发溶剂，将粗异氰酸酯重新悬浮在甲苯(10mL)中。加入DIEA(1.39mL，8.0mmol)和4-(4-((6-(甲氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯()68mg，2.0mmol)，并将混合物在80℃搅拌过夜。蒸发溶剂，粗产物通过硅胶色谱纯化以得到标题化合物(828mg，1.31mmol，66％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺631.22,实测631.90。

1-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1,3-二甲基-3-(6-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)脲

将4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1，3-二甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(828mg，1.31mmol)溶解在DCM(1mL)中，并加入TFA(1mL)。将溶液搅拌2小时，蒸发溶剂。然后将残留物溶解在THF中，并用饱和NaHCO₃水溶液搅拌30分钟。然后过滤棕色沉淀，用水洗涤并干燥，得到黄色固体形式的标题化合物(611mg，1.0)mmol)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺531.1),实测531.)8。

2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1,3-二甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸

将1-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1，3-二甲基-3-(6-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)脲(42mg，0.0)9)溶解在DMF(1mL)中，并用K₂CO₃(44mg，0.32mmol)处理。加入溴乙酸叔丁酯(15mg，0.0)9mmol)，混合物在室温下搅拌过夜，然后加入水，接着用EtOAc萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，并通过硅胶色谱纯化以提供叔丁基酯。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺646.22,实测646.30。

然后将2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1,3-二甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯溶解在DCM(1mL)中，并加入TFA(1mL)。将溶液搅拌2小时，蒸发溶剂以得到标题化合物(34.4mg，0.058mmol，两步)4％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺590.16,实测590.39。

将2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1,3-二甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸(10mg，0.01)mmol)加入到3-(5-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-1,3-二氧基-2,3-二氢-1H-非那烯-2-基)哌啶-2,6-二酮TFA(9.)mg,0.01)mmol)的DIEA(11mg,0.085mmol)和DMF(1mL)溶液中。加入HATU(13mg，0.034mmol)，搅拌反应30分钟，然后用HPLC纯化以得到标题化合物(6.)mg，0.0059mmol，35％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺102).32,实测102).44。

实施例3：2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基}嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)-N-(3-{[3-(2,6-二氧哌啶-3-基)-2,4-二氧-3-氮杂三环[).3.1.0⁵,¹³]十三-1(12),5,),9(13),10-五烯-)-基]氧基}丙基)乙酰胺(2)的合成

双特异性化合物2的合成方法与双特异性化合物1类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺953.28,实测953.53。

实施例4：2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基}嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)-N-(6-{[3-(2,6-二氧哌啶-3-基)-2,4-二氧-3-氮杂三环[).3.1.0⁵,¹³]十三-1(12),5,),9(13),10-五烯-)-基]氧基}己基)乙酰胺(3)的合成

双特异性化合物3的合成方法与双特异性化合物1类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺995.33,实测995.40。

实施例5：2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基}嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)-N-(2-{2-[2-(2-{[3-(2,6-二氧哌啶-3-基)-2,4-二氧-3-氮杂三环[).3.1.0⁵,¹³]十三-1(12),5,),9(13),10-五烯-)-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)乙酰胺(4)的合成

双特异性化合物4的合成方法与双特异性化合物1类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺10)1.35,实测10)1.40。

实施例6：2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基}嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)-N-(5-{[2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基]氧基}戊基)乙酰胺(5)的合成

双特异性化合物5的合成方法与双特异性化合物1类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺931.30,实测930.52。

实施例)：(2S,4R)-1-[(2S)-2-[2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基})嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)乙酰氨基]-3,3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1,3)-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(6)的合成

将2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1,3-二甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸(5.0mg，0.0085mmol)加入到(2S,4R)-1-(L-丙酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(4.1mg,0.0085mmol)在DIEA(5.5mg,0.043mmol)和DMF(1mL)的溶液中。加入HATU，反应搅拌30分钟，然后用HPLC纯化，得到标题化合物。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1016.3),实测1016.43。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.98(s,1H),10.05(s,1H),9.51(s,1H),8.99(d,J＝3.9Hz,1H),8.))(d,J＝).2Hz,1H),8.40(s,2H),).55–).35(m,5H),).00(dd,J＝11.1,8.8Hz,2H),6.91(s,1H),6.50–6.40(m,2H),5.14(s,1H),4.8)-4.99(m,1H),4.59(d,J＝9.1Hz,1H),4.44(t,J＝8.1Hz,2H),4.32(s,1H),4.26–4.02(m,2H),3.95(s,9H),3.)3(s,2H),3.69–3.64(m,2H),3.59(d,J＝10.8Hz,2H),3.12–3.04(m,3H),2.4)(s,3H),2.11–2.00(m,1H),1.89–1.))(m,1H),1.39(d,J＝).0Hz,3H),0.98(s,9H)。

实施例8：(2S,4S)-1-[(2S)-2-[2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基})嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)乙酰氨基]-3,3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1,3)-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(7)的合成

双特异性化合物7的合成方法与双特异性化合物6类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1016.3),实测1016.33。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.91(s,1H),10.06(s,1H),9.46(s,1H),8.92(s,1H),8.)3(d,J＝9.4Hz,1H),8.45–8.23(m,2H),8.02(s,1H),).45–).26(m,5H),6.84(dd,J＝6.6,2.5Hz,3H),6.39(s,1H),4.83(t,J＝).3Hz,1H),4.58(d,J＝10.4Hz,1H),4.38(dd,J＝8.1,6.4Hz,1H),4.35–4.2)(m,1H),4.20–4.10(m,1H),4.03(d,J＝16.3Hz,1H),3.8)(s,6H),3.)3–3.64(m,1H),3.60(s,1H),3.51(dd,J＝10.4,3.3Hz,1H),3.25(s,3H),3.14(s,1H),2.9)(s,3H),2.3)(d,J＝4.4Hz,3H),2.05–1.95(m,1H),1.93–1.)9(m,1H),1.29(d,J＝).0Hz,3H),0.91(s,9H),0.84(t,J＝).5Hz,1H),0.80(t,J＝).0Hz,1H),0.66(s,1H)。

实施例9：N-(4-{[3-(3,5-二甲氧基苯基)-)-{[4-(4-{[(3-{[3-(2,6-二氧哌啶-3-基)-2,4-二氧-3-氮杂三环[).3.1.0⁵,¹³]十三-1(12),5(13),6,8,10-五烯-)-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]甲基}哌嗪-1-基)苯基]氨基}-2-氧代-1H,2H,3H,4H-[1,3]二嗪基[4,5-d]嘧啶-1-基]甲基}苯基)丙烯酰胺(8)的合成

N-((2,4-二氯嘧啶-5-基)甲基)-3,5-二甲氧基苯胺

在室温下，将2,4-二氯-5-(碘甲基)嘧啶(200mg，0.69mmol)和3,5-二甲氧基苯胺(106mg，0.69mmol)在丙酮(3mL)中混合，并加入K₂CO₃(190mg，1.38mmol)。蒸发溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，得到标题化合物(180mg，0.5)mmol，83％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺313.04,实测313.9)。

2-氯-5-(((3,5-二甲氧基苯基)氨基)甲基)-N-(4-硝基苄基)嘧啶-4-胺

在室温下，将4-氨基甲基硝基苯(108mg，0.5)mmol)加入到N-((2,4-二氯嘧啶-5-基)甲基)-3,5-二甲氧基苯胺(180mg，0.05)mmol)的DIEA(14)mg，1.14mmol)和二恶烷(3mL)中，并在60℃下搅拌20小时。然后蒸发溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，得到标题化合物(1)6mg，0.41mmol，)2％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺430.12,实测430.1)。

7-氯-3-(3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-硝基苄基)-3,4-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2(1H)-酮

将2-氯-5-(((3,5-二甲氧基苯基)氨基)甲基)-N-(4-硝基苄基)嘧啶-4-胺(1)6mg，0.41mmol)和三光气(4)mg，0.16mmol)溶解在THF(2mL)中。在室温下缓慢加入三乙胺，并将反应搅拌1小时。然后通过硅胶色谱将混合物浓缩并纯化，得到标题化合物(1)0mg，0.3)mmol，90％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺456.10,实测456.18。

1-(4-氨基苄基)-7-氯-3-(3,5-二甲氧基苯基)-3,4-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2(1H)-酮

将4-(4-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(103mg，0.3)mmol)和TFA(84mg，0.)4mmol)加入到)-氯-3-(3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-硝基苄基)-3,4-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2(1H)-酮的s-BuOH中。然后将混合物回流16小时，蒸发溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，得到标题化合物(192mg，0.28mmol，)6％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺69).30,实测69).40。

3-(3,5-二甲氧基苯基)-1-(4-硝基苄基)-7-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-3,4-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2(1H)-酮

将1-(4-氨基苄基)-)-氯-3-(3,5-二甲氧基苯基)-3,4-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2(1H)-酮(192mg，0.28mmol)溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(1mL)，并将溶液在室温下搅拌1小时。然后除去溶剂，得到胺。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺59).25,实测59).32。

然后将该中间体溶解在DMF(1mL)中，用K₂CO₃(116mg，0.84mmol)处理，并加入溴乙酸叔丁酯(55mg，0.28mmol)。将混合物在50℃搅拌14小时，并用硅胶色谱法纯化，得到标题化合物(12)mg，0.18mmol，两步64％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺)11.32,实测)11.44。

2-(4-(4-((8-(4-氨基苄基)-6-(3,5-二甲氧基苯基)-7-氧代-5,6,7,8-四氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯

将2-(4-(4-((6-(3,5-二甲氧基苯基)-8-(4-硝基苄基)-)-氧代-5,6,),8-四氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯(12)mg，0.18mmol)溶解在乙酸(2mL)中，并在室温下加入锌。将悬浮液搅拌3小时，然后过滤、通过硅胶色谱浓缩并纯化，得到标题化合物())mg，0.11mmol，63％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺681.34,实测681.40。

2-(4-(4-((6-(3,5-二甲氧基苯基)-7-氧代-8-(4-丙酰氨基苄基)-5,6,7,8-四氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯

将2-(4-(4-((8-(4-氨基苄基)-6-(3,5-二甲氧基苯基)-)-氧代-5,6,),8-四氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯())mg，0.11mmol)溶解在THF(1mL)中，并用饱和NaHCO₃溶液处理。在0℃下，加入丙酰氯(12mg，0.13mmol)，搅拌5分钟后，加入水，混合物用EtOAc萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩，得到标题化合物(23mg，0.031mmol，28％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺)3).3),实测)36.91。

2-(4-(4-((6-(3,5-二甲氧基苯基)-7-氧代-8-(4-丙酰氨基苄基)-5,6,7,8-四氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸

将2-(4-(4-(4-((6-(3,5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-(4-丙酰氨基苄基)-5,6,),8-四氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯(23mg，0.031)溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(1mL)，并将溶液在室温下搅拌1小时。然后除去溶剂，得到标题化合物。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺681.31,实测681.90。

将2-(4-(4-((6-(3,5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-(4-丙酰氨基苄基)-5,6,),8-四氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸().0mg,0.010mmol)和3-(5-(3-氨基丙氧基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-非那烯-2-基)哌啶-2,6-二酮TFA(3.8mg,0.010mmol)在DMF(1mL)和DIEA(6.6mg,0.052mmol)中合并。在室温下，加入HATU().8mg，0.021mmol)。将溶液搅拌30分钟，然后用HPLC纯化，得到双特异性化合物8(3.3mg，0.0031mmol，31％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1044.43,实测1043.64。

实施例10：N-(4-{[3-(3,5-二甲氧基苯基)-)-{[4-(4-{[(5-{[2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基]氧基}戊基)氨基甲酰基]甲基}哌嗪-1-基)苯基]氨基}-2-氧代-1H,2H,3H,4H-[1,3]二嗪基[4,5-d]嘧啶-1-基]甲基}苯基)丙烯酰胺(9)的合成

双特异性化合物9的合成方法与双特异性化合物8类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1022.44,实测1021.63。

实施例11：N-(4-{[3-(3,5-二甲氧基苯基)-)-[(4-{4-[({2-[2-(2-{[3-(2,6-二氧哌啶-3-基)-2,4-二氧代-3-氮杂三环[).3.1.0⁵，¹³]十三-1(12),5(13),6,8,10-五烯-)-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]哌嗪-1-基}苯基)氨基]-2-氧代-1H,2H,3H,4H-[1,3]二嗪基[4,5-d]嘧啶-1-基]甲基}苯基)丙烯酰胺(10)的合成

双特异性化合物10的合成方法与双特异性化合物8类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1118.4),实测111).56。

实施例12：N-[4-({)-[(叔丁基氨基甲酰基)氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基}氨基)丁基]-2-{[2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基]氧基}乙酰胺(11)的合成

1-(叔丁基)-3-(6-(3,5-二甲氧基苯基)-2-(甲磺酰基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基)脲

这种化合物是用Thompson et al.,J.Med.Chem.48:4628–4653(2005)中描述的方法合成的。

叔丁基(4-((7-(3-(叔丁基)脲基)-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)丁基)氨基甲酸酯

将叔丁基(5-氨基戊基)氨基甲酸酯(101mg，0.54mmol)加入到1-(叔丁基)-3-(6-(3,5-二甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-)-基)脲(223mg，0.49mmol)中，并在50℃下搅拌6小时。蒸发溶剂，通过硅胶色谱纯化粗残余物，得到标题化合物(1)4mg，0.31mmol，63％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺568.32,实测568.40。

1-(2-((4-氨基丁基)氨基)-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-(叔丁基)脲

将叔丁基(4-(()-(3-(叔丁基)脲基)-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)丁基)氨基甲酸酯(1)4mg，0.31mmol)溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(1mL)，并将溶液搅拌2小时。除去溶剂，得到TFA盐形式的标题化合物。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺468.26,实测468.10。

将1-(2-((4-氨基丁基)氨基)-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-)-基)-3-(叔丁基)脲TFA(20mg，0.034mmol)和2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(11mg，0.034mmol)溶解在DIEA(30μL,0.1)mmol)和DMF(1mL)的溶液中。加入HATU(26mg，0.068mmol)，搅拌反应30分钟，然后用HPLC纯化，得到双特异性化合物11(16.8mg，0.021mmol，63％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺)82.32,实测)82.30。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.04(s,1H),8.93(s,1H),8.85(s,1H),).98(s,2H),).91(t,J＝5.8Hz,1H),).83(s,1H),).)2(t,J＝).9Hz,1H),).40(d,J＝).2Hz,1H),).32(d,J＝8.6Hz,1H),6.60–6.53(m,3H),5.04(dd,z J＝12.8,5.4Hz,1H),4.)0(s,2H),3.)4(s,6H),3.33(d,J＝6.5Hz,2H),3.15(d,J＝).9Hz,2H),2.88–2.))(m,1H),2.56–2.46(m,2H),2.00–1.93(m,1H),1.56(s,2H),1.45(s,2H),1.29(s,9H)。

实施例13：N-[4-({)-[(叔丁基氨基甲酰基)氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基}氨基)丁基]-2-{[3-(2,6-二氧哌啶-3-基)-2,4-二氧代-3-氮杂三环[).3.1.0⁵，¹³]十三-1(12),5,),9(13),10-五烯-)-基]氧基}乙酰胺(12)的合成

双特异性化合物12的合成方法与双特异性化合物11类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺832.33,实测832.4。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.95(s,1H),10.23(d,J＝13.5Hz,1H),8.9)–8.)3(m,1H),8.41–8.16(m,3H),8.02(s,1H),).96–).83(m,2H),).)6(q,J＝).8Hz,1H),).)1(s,1H),).02(s,1H),6.61–6.44(m,3H),5.)6(dt,J＝11.3,5.2Hz,1H),4.66(s,2H),3.)3(s,6H),3.32(t,J＝6.5Hz,2H),3.16(s,2H),2.95–2.)8(m,1H),2.61–2.46(m,2H),1.9)(td,J＝11.8,9.4,5.0Hz,1H),1.64–1.39(m,4H),1.28(d,J＝4.1Hz,9H)。

实施例14：N-[4-({)-[(叔丁基氨基甲酰基)氨基]-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基}氨基)丁基]-9-{[2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-异吲哚-4-基]氧基}壬酰胺(13)的合成

双特异性化合物13的合成方法与双特异性化合物11类似。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺880.43,实测880.50。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.03(s,1H),8.96(s,1H),8.8)(s,1H),8.03(s,1H),).89(s,1H),).)2(dd,J＝8.5,).2Hz,1H),).6)(s,1H),).42(d,J＝8.5Hz,1H),).36(d,J＝).2Hz,1H),6.)1–6.34(m,3H),4.99(d,J＝5.4Hz,1H),4.11(t,J＝6.4Hz,2H),3.)3(s,6H),3.35–3.29(m,3H),3.0)–2.91(m,2H),2.86–2.)3(m,1H),2.59–2.45(m,1H),1.96(dd,J＝8.9,6.1Hz,3H),1.)2–1.59(m,2H),1.59–1.45(m,2H),1.45–1.32(m,6H),1.30(s,9H),1.26–1.08(m,)H)。

实施例15：(2S,4R)-1-[(2S)-2-{3-[2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基})嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)乙酰氨基]丙酰胺}-3,3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1,3)-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(14)的合成

3-(2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丙酸

将2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸(11mg，0.025mmol)和3-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(5mg，0.025mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(20μL，0.125mmol)，然后加入HATU(19mg，0.050mmol)，并将反应搅拌20分钟。加入水，混合物用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机物，用Na₂SO₄干燥，浓缩，通过硅胶色谱纯化粗残余物，得到叔丁基酯。LC/MS实测)16.)0。将该酯溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(1mL)，溶液在室温下搅拌2小时。在压力下除去溶剂，得到标题化合物(10.6mg，0.016mmol，64％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺661.20,实测660.)0。

将3-(2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丙酸(10.6mg，0.016mmol)和(1R,4S)-2-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐().)mg,0.016mmol)溶解于DMF(1mL)中。加入DIEA(14μL，0.080mmol)，然后加入HATU(12mg，0.032mmol)，搅拌反应20分钟，然后用HPLC纯化，得到白色固体和TFA盐形式的双特异性化合物14().8mg，0.032mmol，45％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺108).41,实测108).60。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.91(s,1H),10.04(s,1H),9.46(s,1H),8.92(s,1H),8.53(s,1H),8.33(s,1H),8.29(d,J＝).8Hz,1H),).92(d,J＝9.2Hz,1H),).41(d,J＝8.5Hz,2H),).3)(d,J＝8.3Hz,2H),).31(d,J＝8.4Hz,2H),6.92(d,J＝9.3Hz,2H),6.84(s,1H),6.39(s,1H),5.06(s,1H),4.85(s,1H),4.4)(d,J＝9.3Hz,1H),4.35(s,1H),4.26–4.20(m,1H),3.89(s,2H),3.8)(s,6H),3.65(d,J＝2.3Hz,2H),3.59–3.49(m,3H),3.49–3.39(m,3H),3.29(q,J＝6.)Hz,2H),3.25(s,3H),3.20(s,2H),3.10–2.95(m,2H),2.39(s,3H),1.96(t,J＝10.5Hz,1H),1.)4(s,1H),1.31(d,J＝).0Hz,3H),0.88(s,9H)。

实施例16：(2S,4R)-1-[(2S)-2-(3-{2-[2-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基})嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)乙酰氨基]乙氧基}丙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1,3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(15)的合成

3-(2-(2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)丙酸

将2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸(11mg，0.025mmol)和3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(20μL，0.125mmol)，然后加入HATU(19mg，0.050mmol)，并将反应搅拌20分钟。加入水，混合物用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机物，用Na₂SO₄干燥，浓缩，通过硅胶色谱纯化粗残余物，得到叔丁基酯。LC/MS实测)60.)。然后将该酯溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(1mL)，溶液在室温下搅拌2小时。然后在压力下除去溶剂，得到标题化合物(9.9mg，0.014mmol，56％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺)05.22,实测)04.80。

将(3-(2-(2-(4-(4-((6-(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)丙酸(9.9mg，0.014mmol)和(1R,4S)-2-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(6.)mg,0.014mmol)溶解于DMF(1mL)中。加入DIEA(12μL，0.0)0mmol)，然后加入HATU(11mg，0.028mmol)，搅拌反应20分钟，然后用HPLC纯化，得到白色固体和TFA盐形式的双特异性化合物15(5.)mg,0.005mmol,36％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1131.43,实测1131.60。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.90(s,1H),10.02(s,1H),9.45(s,1H),8.92(s,1H),8.58(s,1H),8.33(s,1H),8.29(d,J＝8.2Hz,1H),).83(d,J＝9.3Hz,1H),).41(d,J＝8.)Hz,2H),).39–).33(m,2H),).33–).26(m,2H),6.91(d,J＝9.1Hz,2H),6.84(s,1H),6.38(d,J＝1.0Hz,1H),5.05(s,1H),4.85(p,J＝).3Hz,1H),4.4)(d,J＝9.4Hz,1H),4.35(s,1H),4.22(s,1H),3.94(s,2H),3.8)(s,6H),3.65(s,2H),3.60–3.45(m,6H),3.39(d,J＝5.)Hz,3H),3.25(s,3H),3.24(s,2H),3.02(s,2H),2.39(s,4H),2.01–1.91(m,1H),1.)6–1.68(m,1H),1.31(d,J＝).0Hz,3H),0.92(s,2H),0.8)(s,9H)。

实施例1)：(2S,4R)-1-[(2S)-2-[3-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基})嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)丙酰氨基]-3,3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1,3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(16)的合成

3-(4-(4-((6-(3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)丙酸

将3-溴丙酸叔丁酯(12mg，0.05)mmol)加入到3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-甲基-1-(6-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)脲(20mg，0.038mmol)和K₂CO₃(16mg，0.11mmol)在DMF(0.)5mL)中的混合物中。将混合物在50℃下搅拌过夜，然后再加入20mg溴化物，混合物在室温下搅拌过夜。加入DCM和水，将混合物分配，蒸发有机物，通过硅胶色谱纯化粗残余物，在DCM中使用从0到15％的甲醇(1.)5N NH3)的梯度，以提供叔丁酯。LC/MS实测659.90。然后将酯溶解在DCM(1mL)中，并加入TFA(1mL)。在室温下搅拌2小时后，在压力下蒸发溶剂，得到标题化合物(20mg，0.030，)9％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺604.19,实测603.)9。

将3-(4-(4-((6-(3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)丙酸(20mg，0.030mmol)和(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(13mg,0.030mmol)溶解于DMF(1mL)中。加入DIEA(26μL，0.15mmol)，稍后加入HATU(23mg，0.060mmol)。搅拌反应20分钟后，加入DMSO，然后用HPLC纯化混合物，得到白色固体和TFA盐形式的双特异性化合物16(15.2mg，0.015mmol，49％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1030.39,实测1029.64。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.90(s,1H),9.53(s,1H),9.46(s,1H),8.92(s,1H),8.40–8.26(m,2H),8.20(d,J＝9.2Hz,1H),).51–).34(m,4H),).31(d,J＝8.2Hz,2H),6.39(s,1H),6.93(d,J＝9.1Hz,2H),6.84(s,1H),4.88(s,1H),4.90–4.)9(m,1H),4.48(d,J＝9.2Hz,1H),4.36(s,1H),4.23(d,J＝4.2Hz,2H),3.8)(s,6H),3.)6–3.66(m,2H),3.60–3.41(m,4H),3.34(s,2H),3.25(d,J＝3.0Hz,3H),3.12(s,2H),2.90(d,J＝12.5Hz,2H),2.80–2.)0(m,1H),2.69(d,J＝8.3Hz,1H),2.04–1.85(m,1H),1.)9–1.)1(m,1H),1.31(d,J＝).0Hz,3H),0.90(s,9H)。

实施例18：(2S,4R)-1-[(2S)-2-[4-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基})嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)丁酰氨基]-3,3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1,3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(17)的合成

4-(4-(4-((6-(3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)丙酸

将4-溴丁酸叔丁酯(13mg，0.05)mmol)加入到3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-甲基-1-(6-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)脲(20mg，0.038mmol)和K₂CO₃(16mg，0.11mmol)在DMF(0.)5mL)中的混合物中。将混合物在50℃搅拌3小时，再加入9mg溴化物，并将混合物搅拌过夜。用水和DCM稀释反应物，分配，蒸发有机层。粗残余物通过硅胶色谱纯化，在DCM中使用0-15％的甲醇(1.)5N NH₃)梯度，以提供叔丁酯。LC/MS实测6)3.80。然后将残余物溶解在1mLDCM中，加入0.5mLTFA。将溶液搅拌1小时，在压力下蒸发溶剂，得到标题化合物(1)mg，0.023mmol，61％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺618.19,实测61).99。

将4-(4-(4-((6-(3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-甲基脲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸(1)mg，0.023mmol)和(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(12mg,0.023mmol)溶解于DMF(1mL)中。加入DIEA(24μL，0.14mmol)，然后加入HATU(1)mg，0.046mmol)。搅拌反应20分钟后，用DMSO稀释溶液，然后用HPLC纯化，得到白色固体和TFA盐形式的双特异性化合物17(15.0mg，0.013mmol，56％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1044.40,实测1043.)3。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.91(s,1H),9.)1(s,1H),9.46(s,1H),8.92(s,1H),8.33(s,1H),8.30(d,J＝).8Hz,1H),).99(d,J＝9.2Hz,1H),).46–).34(m,4H),).34–).28(m,2H),6.93(d,J＝8.8Hz,2H),6.84(s,1H),6.39(s,1H),4.92–4.))(m,1H),4.4)(d,J＝9.3Hz,1H),4.36(t,J＝8.1Hz,1H),4.26–4.1)(m,1H),3.8)(s,6H),3.)0(d,J＝12.)Hz,2H),3.58–3.45(m,5H),3.25(s,3H),3.09(d,J＝11.0Hz,6H),2.95–2.88(m,1H),2.39(s,3H),2.09–1.92(m,1H),1.85(s,1H),1.)4(m,1H),1.31(d,J＝).0Hz,3H),0.89(s,9H)。

实施例19：(2S,4R)-1-[(2S)-2-[6-(4-{4-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基})嘧啶-4-基)氨基]苯基}哌嗪-1-基)六氨基]-3,3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1,3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(18)的合成

(1R，4S)-2-((S)-2-(6-溴己酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺

将(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(15mg，0.029mmol)和6-溴己酸(8.5mg，0.044mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(25μL，0.015mmol)，然后加入HATU(22mg，0.058mmol)。将反应物搅拌15分钟，然后用水和DCM稀释。然后将混合物分配，浓缩有机层并通过硅胶色谱纯化，得到标题化合物。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺620.21,实测620.89。

(1R，4S)-2-((S)-2-(6-溴己酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺(18mg，0.029mmol)、K₂CO₃(12mg，0.08)mmol)和3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-1-甲基-1-(6-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)脲(15mg，0.029mmol)溶解在DMF(1mL)中并在室温下搅拌2天。然后将温度升至50℃持续6小时。然后将混合物过滤，在DMSO中稀释，并通过HPLC纯化，得到白色固体和TFA盐形式的双特异性化合物18(12.2mg，0.010mmol，34％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺10)2.43,实测10)1.64。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.90(s,1H),9.46(s,2H),8.92(s,1H),8.43–8.14(m,2H),).)6(d,J＝9.4Hz,1H),).51–).1)(m,6H),).04–6.85(m,2H),6.84(s,1H),6.39(d,J＝1.1Hz,1H),4.90–4.)6(m,1H),4.4)(d,J＝9.4Hz,1H),4.35(t,J＝8.1Hz,1H),4.22(d,J＝3.3Hz,1H),3.8)(s,6H),3.)0(d,J＝12.9Hz,2H),3.53(t,J＝11.0Hz,4H),3.25(s,3H),3.08(d,J＝11.0Hz,4H),2.88(s,2H),2.39(s,3H),2.23(dt,J＝14.),).6Hz,1H),2.10(d,J＝).2Hz,1H),1.95(td,J＝9.4,8.1,4.6Hz,1H),1.)3(m,1H),1.62(q,J＝14.3,10.)Hz,2H),1.52–1.38(m,3H),1.31(d,J＝).0Hz,3H),1.2)–1.12(m,2H),0.8)(d,J＝).0Hz,9H)。

实施例20：(2S，4R)-1-[(2S)-2-(2-{4-[3-({)-[(叔丁基氨基甲酰基)氨基]-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基}氨基)丙基]哌嗪-1-基}乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1，3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(19)的合成

4-(3-(1，3-二氧异吲哚啉-2-基)丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯

将N-Boc哌嗪(1.0g，5.3)mmol)和N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(1.44g，5.3)mmol)溶解在DMF(15mL)中。加入K₂CO₃(1.48g，10.)4mmol)和NaI(1.3)g，8.06mmol)，混合物在室温下搅拌24小时。加入DCM(80mL)，过滤混合物，蒸发滤液，残留物通过硅胶色谱纯化，在DCM中使用0-10％的MeOH(1.)5NNH₃)梯度，得到浅黄色晶体形式的标题化合物(1.)1g，4.59mmol，85％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺3)4.20,实测3)3.9)。

4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯

将4-(3-(1，3-二氧异吲哚啉-2-基)丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(819mg，2.20mmol)溶解在EtOH(12mL)中，并加入水合肼(50％，)00μL，11.0mmol)。反应在室温下搅拌过夜，形成白色沉淀。加入DCM(50mL)，混合物搅拌30分钟，然后过滤，得到澄清溶液。浓缩滤液，得到白色固体，将其溶解在DCM中，并再次过滤。再次浓缩滤液，得到浅黄色油状标题化合物(543mg，2.22mmol，101％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺244.19,实测244.09。

1-(叔丁基)-3-(6-(3，5-二甲氧基苯基)-2-((3-(哌嗪-1-基)丙基)氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基)脲

将1-(叔丁基)-3-(6-(3，5-二甲氧基苯基)-2-(甲磺酰基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-)-基)脲(459mg，1.0mmol)溶解在二恶烷(5mL)中。加入Et₃N(1)8μL，1.0mmol)，然后加入4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(26)mg，1.1mmol)。将溶液在50℃搅拌6小时。蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，在DCM中使用0-10％MeOH(1.)5N NH₃)的梯度，以提供4-(3-(()-(3-(叔丁基)脲基)-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)丙基)哌嗪-1-羧酸酯(594mg，0.96mmol，96％)。然后将氨基甲酸酯溶解在DCM(2mL)中，加入TFA(1mL)。将反应搅拌2小时，并在压力下除去溶剂。然后将残留物溶于THF，加入饱和NaHCO₃水溶液，将悬浮液搅拌2小时，然后过滤。用水洗涤固体，使其干燥，然后将其溶解在8mL DCM和200μL 4MHCl的二恶烷中，过滤并浓缩，得到标题化合物HCl盐(439mg，0.)9mmol，82％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺523.31,实测523.08。

2-(4-(3-((7-(3-(叔丁基)脲基)-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)丙基)哌嗪-1-基)乙酸

将1-(叔丁基)-3-(6-(3，5-二甲氧基苯基)-2-((3-(哌嗪-1-基)丙基)氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-)-基)脲HCl(1)mg，0.030mmol)和K₂CO₃(1)mg，0.12mmol)加入到MeCN(1mL)中。然后加入溴乙酸叔丁酯(8，8mg，0.045mmol)，反应在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，在DCM中使用0-10％的甲醇(1.)5N NH₃)梯度，得到2-(4-(3-(()-(3-(叔丁基)脲基)-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)丙基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯。LC/MS m/z计算为[M+2H–tBu]⁺290.65,实测291.1。然后将该酯溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(1mL)，溶液在室温下搅拌2小时。除去溶剂，得到TFA盐形式的标题化合物(8.9mg，0.01)mmol，5)％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺581.31,实测580.89。

将2-(4-(3-(()-(3-叔丁基)脲基)-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)丙基)哌嗪-1-基)乙酸(8.9mg，0.01)mmol)和(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐().5mg,0.01)mmol)溶解于DMF(1mL)中。加入DIEA(15μL，0.085mmol)，然后加入HATU(13mg，0.034mmol)。搅拌反应20分钟，然后用HPLC纯化，得到黄色固体和TFA盐形式的双特异性化合物19(16.8mg,0.015mmol,88％)。LC/MS m/z计算为[M+2H]⁺504.26,实测504.20。

实施例21：(2S，4R)-1-[(2S)-2-(4-{4-[3-({)-[(叔丁基氨基甲酰基)氨基]-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基}氨基)丙基]哌嗪-1-基}乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1，3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(20)的合成

4-(4-(3-((7-(3-(叔丁基)脲基)-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)丙基)哌嗪-1-基)丁酸

将4-溴丁酸叔丁酯(13mg，0.05)mmol)加入到1-(叔丁基)-3-(6-(3，5-二甲氧基苯基)-2-((3-(哌嗪-1-基)丙基)氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-)-基)脲盐酸盐(20mg，0.038mmol)和K₂CO₃(16mg，0.11mmol)在DMF(0.)5mL)中的混合物中。混合物在50℃下搅拌3小时，此时加入另外的溴化物(13mg)，溶液在室温下搅拌过夜。加入水和DCM，将混合物分配，有机层浓缩并通过硅胶色谱纯化，在DCM中使用0-10％的MeOH(1.)5N NH₃)梯度，以提供4-(4-(3-(()-(3-叔丁基)脲基)-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)丙基)哌嗪-1-基)丁酸叔丁酯。LC/MS m/z计算为[M+2H]⁺333.21,实测332.9)。然后将该酯溶解在DCM(1mL)中，加入TFA(0.5mL)，溶液在室温下搅拌2小时。除去溶剂，得到TFA盐形式的标题化合物(1)mg，0.023mmol，61％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺609.34,实测608.89。

将4-(4-(3-(()-(3-叔丁基)脲基)-6-(3，5-二甲氧基苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)丙基)哌嗪-1-基)丁酸(1)mg，0.023mmol)和(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(12mg,0.023mmol)溶解于DMF(1mL)中。加入DIEA(24μL，0.14mmol)，然后加入HATU(1)mg，0.046mmol)。搅拌反应20分钟，并用HPLC纯化，得到黄色固体和TFA盐形式的双特异性化合物20(15mg,0.013mmol,56％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1035.55,实测1034.)4。

实施例22：(2S，4R)-1-[(2S)-2-{2-[4-(4-{[6-(3，5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-[(4-丙酰胺基苯基)甲基]-5H，6H，)H，8H-[1，3]二氮杂[4，5-d]嘧啶-2-基]氨基}苯基)哌嗪-1-基]乙酰胺基}-3，3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1，3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(21)的合成

2-(4-(4-((6-(3，5-二甲氧基苯基)-7-氧代-8-(4-丙酰氨基苄基)-5，6，7，8-四氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸

将N-(4-((3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-氧代-)-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)丙酰胺(22mg，0.030mmol)和K₂CO₃(1)mg，0.12mmol)加入到MeCN(1mL)中。然后加入溴乙酸叔丁酯(9mg)，反应在室温下搅拌过夜。除去溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，在DCM中使用0-10％MeOH(1.)5N NH₃)的梯度，以提供2-(4-(4-((6-(3，5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-(4-丙酰氨基苄基)-5，6，)，8-四氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶基-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯(8.2mg，0.011mmol,3)％)。LC/MS m/z计算为[M+2H–tBu]²⁺340.69,实测340.89。然后将氨基甲酸酯溶解在DCM(1mL)和TFA(1mL)中，在室温下搅拌2小时，然后在压力下除去溶剂，得到标题化合物。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺681.31,实测680.90。

将2-(4-(4-((6-(3，5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-(4-丙酰胺基苄基)-5，6，)，8-四氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)乙酸(8.1mg，0.11mmol)和(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(5.5mg，0.011mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(10μL，0.055mmol)，然后加入HATU(8.4mg，0.022mmol)。将混合物搅拌20分钟，然后通过HPLC纯化，获得浅黄色固体和TFA盐形式的双特异性化合物21(6.8mg，0.0056mmol，51％)。LC/MS m/z计算为[M+2H]⁺554.26,实测553.89。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.00(s,1H),9.)5(s,1H),9.33(s,1H),8.91(s,1H),8.80–8.62(m,1H),8.33(d,J＝).8Hz,1H),8.06(s,1H),).45(d,J＝8.6Hz,1H),).41–).34(m,4H),).32(d,J＝8.4Hz,2H),).18(d,J＝8.2Hz,2H),6.)9(d,J＝9.0Hz,2H),6.52(d,J＝2.2Hz,2H),6.38(t,J＝2.2Hz,1H),5.08(s,2H),4.85(q,J＝6.9Hz,1H),4.68(s,2H),4.51(d,J＝9.1Hz,1H),4.43–4.32(m,1H),4.25(s,1H),4.19–3.89(m,2H),3.68(s,6H),3.65–3.54(m,3H),3.54–3.39(m,3H),3.24(s,2H),2.9)(s,2H),2.38(s,3H),2.26–2.14(m,2H),2.01–1.90(m,1H),1.84–1.66(m,1H),1.42(d,J＝).0Hz,1H),1.32(d,J＝).0Hz,3H),1.23–1.14(m,1H),0.98(t,J＝).5Hz,3H),0.91(s,9H)。

实施例23：(2S，4R)-1-[(2S)-2-{4-[4-(4-{[6-(3，5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-[(4-丙酰胺基苯基)甲基]-5H，6H，)H，8H-[1，3]二氮杂[4，5-d]嘧啶-2-基]氨基}苯基)哌嗪-1-基]丁酰氨基}-3，3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1，3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(22)的合成

4-(4-(4-((6-(3，5-二甲氧基苯基)-7-氧代-8-(4-丙酰氨基苄基)-5，6，7，8-四氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸

将4-溴丁酸叔丁酯(9mg，(0.041mmol)加入到N-(4-((3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-氧代-)-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)丙酰胺(20mg，0.02)mmol)和K₂CO₃(15mg，0.11mmol)在DMF(1mL)中的混合物中。将反应在50℃搅拌3小时，此时加入另外的溴化物(9mg)，反应在室温下搅拌过夜。加入水和DCM，将混合物分配，有机物浓缩并通过硅胶色谱纯化，得到4-(4-(4-((6-(3，5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-(4-丙酰胺基苄基)-5，6，)，8-四氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸叔丁酯。然后将酯溶解在DCM(1mL)和TFA(1mL)中，搅拌2小时，然后在压力下除去溶剂，得到标题化合物(19mg，0.023mmol，85％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺)09.34,实测)09.00。

将4-(4-(4-((6-(3，5-二甲氧基苯基)-)-氧代-8-(4-丙酰胺基苄基)-5，6，)，8-四氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸(19mg，0.023mmol)和(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(12mg，0.023mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(40μL，0.23mmol)，然后加入HATU(1)mg，0.046mmol)。将混合物搅拌20分钟，然后通过HPLC纯化，以获得TFA盐和黄色固体形式的双特异性化合物22(9.4mg，0.00)5mmol，33％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺1135.55,实测1134.92。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.)5(s,1H),9.50(s,1H),9.31(s,1H),8.92(s,1H),8.30(d,J＝).8Hz,1H),8.06(d,J＝3.1Hz,1H),).99(d,J＝9.3Hz,1H),).51–).41(m,1H),).41–).34(m,4H),).34–).2)(m,2H),).18(d,J＝8.4Hz,2H),6.82(d,J＝9.1Hz,1H),6.52(d,J＝2.3Hz,2H),6.38(t,J＝2.2Hz,1H),5.08(s,2H),4.90–4.))(m,1H),4.68(s,2H),4.48(d,J＝9.3Hz,1H),4.36(t,J＝8.1Hz,1H),4.23(s,1H),3.68(s,6H),3.65(s,2H),3.5)–3.46(m,6H),3.09(d,J＝11.5Hz,6H),2.84(t,J＝12.0Hz,2H),2.39(s,2H),2.21(d,J＝).6Hz,2H),1.95(d,J＝9.9Hz,1H),1.84(d,J＝).9Hz,3H),1.)4(s,1H),1.42(d,J＝).0Hz,1H),1.31(d,J＝).0Hz,3H),0.99(t,J＝).5Hz,3H),0.88(s,9H)。

实施例24：(2S，4R)-1-[(2S)-2-{4-[(3S)-3-{4-氨基-3-[2-(3，5-二甲氧基苯基)乙炔基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基}吡咯烷-1-基]丁酰氨基}-3，3-二甲基丁酰基]-4-羟基-N-[(1R)-1-[4-(4-甲基-1，3-噻唑-5-基)苯基]乙基]吡咯烷-2-甲酰胺(23)的合成

(S)-4-(3-(4-氨基-3-((3，5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丁酸

将(S)-3-((3，5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺TFA(15mg，0.031mmol，类似于WO2013108809A1所述制备)和K₂CO₃(12.8mg，0.093)加入到DMF(1mL)中，然后加入4-溴丁酸叔丁酯(11mg，0.04)mmol)。混合物在50℃搅拌3小时，加入另外的溴化物(11mg)，然后在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，得到叔丁基酯。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺50).26,实测506.9)。然后将酯溶解在DCM(1mL)和TFA(1mL)中，搅拌2小时，然后除去溶剂，得到标题化合物(10mg，0.016mmol，52％)。LC/MSm/z计算为[M+H]⁺451.20,实测450.98。

将(S)-4-(3-(4-氨基-3-((3，5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丁酸TFA(10mg，0.016mmol)和(1R，4S)-2-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((R)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)环戊烷-1-甲酰胺二盐酸盐(8.3mg，0.016mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(28μL，0.16mmol)，然后加入HATU(12mg，0.032mmol)。将混合物搅拌20分钟，然后通过HPLC纯化，得到TFA盐和白色固体形式的双特异性化合物23(11.2，0.012mmol，)3％)。LC/MS m/z计算为[M+H]⁺88).41,实测8)6.82。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.13(s,1H),8.92(s,1H),8.29(d,J＝).8Hz,1H),8.24(s,1H),).96(t,J＝9.5Hz,1H),).3)(d,J＝8.2Hz,2H),).31(d,J＝8.1Hz,2H),6.86–6.)9(m,2H),6.5)(t,J＝2.3Hz,1H),5.)0–5.4)(m,1H),4.99(s,2H),4.85(s,1H),4.51–4.42(m,1H),4.35(t,J＝8.1Hz,1H),4.21(s,2H),4.10(s,1H),3.99–3.89(m,1H),3.81(s,1H),3.)2(s,6H),3.58–3.46(m,2H),3.38(d,J＝11.3Hz,1H),3.31–3.20(m,2H),3.19–3.08(m,2H),2.)0–2.53(m,1H),2.38(s,3H),2.2)–2.14(m,1H),1.95(t,J＝10.4Hz,1H),1.88–1.)6(m,2H),1.)6–1.68(m,1H),1.30(d,J＝).0Hz,3H),0.8)(s,9H)。

实施例25：在不同细胞系中敲除FGFR2

用0、0.1、1或10μM的双特异性化合物6或0.5μM THAL-SNS-032(已知的CDK9降解剂和CDK9降解的阳性对照；例如，可从MedChem

Cat.No.HY-10008,MonmouthJunction,NJ获得)处理Kato III细胞16小时。然后在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物

的RIPA缓冲液(Millipore

)中裂解细胞。蛋白质浓度通过双肉桂酸测定(BCA)分析(Pierce^TM)来测量。等量的蛋白质被4-12％Tris-Base凝胶(Invitrogen^TM)溶解，然后转移到免疫印迹PVDF膜

上，用抗FGFR2(细胞信号传导)、CDK9(细胞信号传导)和β-Actin(细胞信号传导)的一级抗体免疫印迹，然后用

800标记的山羊抗兔IgG和

800标记的山羊抗小鼠IgG

二级抗体免疫印迹。膜在OdysseyCLx系统上检测。

如图1A所示的结果表明，双特异性化合物6在所示浓度下16小时后诱导FGFR2的降解，而THAL-SNS-032诱导CDK9的降解。

用10μM BGJ398(母体化合物和已知的FGFR1/2/3抑制剂；例如，可从MedChem

Cat.No.HY-13311,Monmouth Junction,NJ获得)、10μM对照-1(VHL配体)、0.5μM硼替佐米(一种蛋白酶体抑制剂；例如可从Millipore

Cat.No.1)9324-69-),Burlington,MA获得)和1μM MLN4924(一种内酰化抑制剂；例如，可从MedChem

Cat.No.HY-)0062,Monmouth Junction,NJ)预处理Kato III细胞2小时，然后用0.1μM双特异性化合物6处理4小时。如上所述裂解细胞并用针对FGFR2和β-肌动蛋白的抗体免疫印迹。

对照-1的结构如下。

对照-1

如图1B所示，结果显示BGJ398、对照-1、硼替佐米和MLN4924挽救了由双特异性化合物6诱导的FGFR2降解，表明FGFR2降解是配体和蛋白酶体依赖性的。

用0、0.1或0.5μM双特异性化合物6处理Kato III细胞4、8、12或16小时。裂解细胞并如上所述用FGFR2和β-肌动蛋白抗体免疫印迹。图1C所示的结果表明，在0.1和0.5μM的浓度下，在4小时内发生了显著的FGFR2降解，并且持续了至少16小时。

用0、0.1、1或10μM的双特异性化合物6或0.5μM THAL-SNS-032处理CCLP1细胞16小时，然后裂解并用针对FGFR1(细胞信号传导)、CDK9和β-Actin的抗体免疫印迹。如图2A所示的结果表明，双特异性化合物6在指定浓度下16小时后诱导FGFR1降解，而THAL-SNS-032诱导CDK9降解。

用0、0.1、1或10μM的双特异性化合物6或0.5μM THAL-SNS-032处理JHH)细胞16小时，然后裂解并用针对FGFR3(细胞信号传导)、FGFR4(细胞信号传导)、CDK9和β-Actin的抗体免疫印迹。结果如图2B所示，表明双特异性化合物6在所示浓度下16小时后不诱导FGFR3和FGFR4的降解。THAL-SNS-032诱导CDK9降解。

用0、0.1或0.5μM的双特异性化合物6处理CCLP1细胞2、4、8或16小时。裂解细胞并用FGFR1和β-肌动蛋白的抗体免疫印迹。图2C所示的结果表明，在0.1和0.5μM的浓度下，在2小时内发生了显著的FGFR1降解，并且持续了至少16小时。

用双特异性化合物6或BGJ398以指定浓度处理Kato III细胞)2小时。根据制造商的说明，使用细胞滴度Glo(Promega^TM)测定细胞活力。使用GraphPad Prism).0(GraphPad

)估算IC₅₀值(定义为将细胞存活率降低至载体DMSO对照的50％所需的化合物浓度)。如图3A所示，结果显示双特异性化合物6和BGJ398的IC₅₀值都在1nM左右，表明化合物6具有与BGJ398相似的有效抗增殖作用。

用双特异性化合物1-4或BGJ398以指定浓度处理Kato III细胞)2小时。根据制造商的说明，使用细胞滴度Glo(Promega^TM)测定细胞活力。通过使用GraphPad Prism).0(GraphPad

)估算IC₅₀值。结果如图3B所示，表明双特异性化合物1-4和BGJ398具有良好的抗增殖效果。

用0、0.1、1或10μM的双特异性化合物6或7处理Kato III细胞4小时。将细胞裂解并如上所述用FGFR2和β-肌动蛋白的抗体免疫印迹。如图4A所示的结果表明，双特异性化合物6在所示浓度下4小时后诱导FGFR2降解，而双特异性化合物7在所示浓度下不降解FGFR2。

用双特异性化合物6、双特异性化合物7或BGJ398以指定浓度处理Kato III细胞)2小时。根据制造商的说明，使用细胞滴度Glo(Promega^TM)测定细胞活力。通过使用GraphPadPrism).0(GraphPad

)估算IC₅₀值(定义为将细胞存活率降低至载体DMSO对照的50％所需的化合物浓度)。

如图4B所示，结果显示双特异性化合物6和BGJ398的IC₅₀值都在1nM左右，表明双特异性化合物6具有与BGJ398相似的有效抗增殖作用。双特异性化合物7(阴性对照)显示出))倍弱的抗增殖效果，其IC₅₀值约为))nM。

用0或1μM的双特异性化合物6和14-22处理Kato III细胞6小时。细胞被裂解并如上所述用FGFR2和β-肌动蛋白的抗体免疫印迹。如图5A所示，结果表明化合物6和20在1μM的浓度下6小时后诱导FGFR2的降解。

Kato III细胞用10μM FIIN2(母体化合物和已知的FGFR1/2/3/4抑制剂；例如，可从Selleckchem,Cat.No.S))14,休斯顿,TX获得)，10μM对照-1(VHL配体)，0.5μM硼替佐米(一种蛋白酶体抑制剂；例如，可从Millipore Sigma,Cat.No.1)9324-69-),Burlington,MA获得)和1μM MLN4924(一种内酰化抑制剂；例如，可从MedChemExpress,Cat.No.HY-)0062,Monmouth Junction,NJ获得)预处理2小时，然后用1μM双特异性化合物20处理4小时。将细胞裂解并如上所述用针对FGFR2和β-肌动蛋白的抗体进行免疫印迹。

如图5B所示，结果显示FIIN2、对照-1、硼替佐米和MLN4924挽救了由双特异性化合物20诱导的FGFR2降解。这表明FGFR2的降解是配体和蛋白酶体依赖性的。

用0或1μM的双特异性化合物6和14-22处理CCLP1细胞6小时。细胞被裂解并如上所述用FGFR1和β-肌动蛋白的抗体免疫印迹。如图6A所示，结果表明双特异性化合物6和20在1μM的浓度下6小时后诱导FGFR1的降解。

用0或1μM的双特异性化合物6和14-22处理JHH)细胞6小时。细胞被裂解并如上所述用FGFR4和β-肌动蛋白的抗体免疫印迹。如图6B所示，结果表明双特异性化合物6和20在1μM的浓度下6小时后诱导FGFR4的降解。

所有专利出版物和非专利出版物都表明了本发明所属领域技术人员的技能水平。所有这些出版物(包括其被引用的任何特定部分)都通过引用并入本文，如同每个单独的出版物都被具体地和单独地指出通过引用并入本文。

尽管本文已经参照特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，这些实施方案仅仅是本发明的原理和应用的说明。因此，应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对说明性实施方案进行许多修改，并且可以设计出其他配置。

Claims (32)

1.一种具有下式所示结构的双特异性化合物：

其中靶向配体代表结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的部分，降解决定子代表结合E3泛素连接酶的部分，接头代表共价连接降解决定子和靶向配体的部分，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

2.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其由式(I-1)表示:

其中

R₃独立地是卤素、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的氨基、任选取代的酰氨基、羧基、丙烯酰胺、任选取代的碳环基或任选取代的杂环基；和

m是整数0-4。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中R₃独立地是甲基、氯或甲氧基。

4.根据权利要求2所述的化合物，其中m是0。

5.根据权利要求2所述的化合物，其中m是2。

6.根据权利要求2所述的化合物，其中m是4。

7.根据权利要求2所述的双特异性化合物，其由式I-1a、I-1b、I-1c、I-1d或I-1e表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

8.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其由式(I-2)表示:

其中：

R¹是H或任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的氨基、任选取代的酰氨基、羧基、丙烯酰胺、任选取代的碳环基或任选取代的杂环基；和

n是整数0-4；或其药学上可接受的盐或立体异构体。

9.根据权利要求8所述的双特异性化合物，其由式(I-2a)表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

10.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其由式(I-3a)或(I-3b)表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

11.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其由式(I-4)表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

12.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其中所述接头是亚烷基链或二价亚烷基链，它们中的任一个可以在一个或两个末端被–O–、–S–、–N(R')–、–C≡C–、–C(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–C(NOR')–、–C(O)N(R')–、–C(O)N(R')C(O)–、–C(O)N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)–、–N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)O–、–OC(O)N(R')–、–C(NR')–、–N(R')C(NR')–、–C(NR')N(R')–、–N(R')C(NR')N(R')–、–OB(Me)O–、–S(O)₂–、–OS(O)–、–S(O)O–、–S(O)–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–N(R')S(O)₂–、–S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)–、–S(O)N(R')–、–N(R')S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)N(R')–、C_3-12亚碳环基、3至12元亚杂环基、5至12元亚杂芳基或其任意组合中的至少一个中断和/或终止，其中R’是H或C₁-C₆烷基，其中所述中断和所述一个或两个终止基团可以相同或不同。

13.根据权利要求12所述的双特异性化合物，其中所述接头是具有1-10个亚烷基单元并被

中断或终止于

的亚烷基链。

14.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其中所述接头是聚乙二醇链，其可以在一个或两个末端在以下至少一个中终止：–S–、–N(R')–、–C≡C–、–C(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–C(NOR')–、–C(O)N(R')–、–C(O)N(R')C(O)–、–C(O)N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)–、–N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)O–、–OC(O)N(R')–、–C(NR')–、–N(R')C(NR')–、–C(NR')N(R')–、–N(R')C(NR')N(R')–、–OB(Me)O–、–S(O)₂–、–OS(O)–、–S(O)O–、–S(O)–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–N(R')S(O)₂–、–S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)–、–S(O)N(R')–、–N(R')S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)N(R')–、C_3-12亚碳环基、3-至12-元亚杂环基、5-至12-元亚杂芳基或其任意组合，其中R’是H或C₁-C₆烷基，其中所述一个或两个端基可以相同或不同。

15.权利要求14所述的双特异性化合物，其中所述接头是具有2-8个PEG单元并终止于

的聚乙二醇接头。

16.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其由以下结构中的任一种表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的双特异性化合物，其中所述降解决定子结合cereblon。

18.根据权利要求17所述的双特异性化合物，其中所述降解决定子由式D1-a或D1-b表示:

其中

Y是NH、NMe或O；并且

Z是NH、O或C≡。

19.根据权利要求18所述的双特异性化合物，其由以下结构中的任一种表示:

其中

Y是NH、NMe或O；并且

Z是NH、O或C≡；

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

20.根据权利要求1-16中任一项所述的双特异性化合物，其中所述降解决定子结合vonHippel-Landau(VHL)。

21.根据权利要求20所述的双特异性化合物，其中所述降解决定子由以下结构中的任一种表示:

其中Y’是键、N、O或C；

其中Z^’是环状基团；

其中Y”是键、CH₂、NH、NMe、O或S；

或其立体异构体。

22.根据权利要求21所述的双特异性化合物，其由以下结构中的任一种表示:

其中Y’是键、NH、O或CH₂；

其中Z’是环状基团，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

23.根据权利要求1-16中任一项所述的双特异性化合物，其中所述降解决定子结合凋亡蛋白的抑制剂(IAP)。

24.根据权利要求23所述的双特异性化合物，其中所述降解决定子由以下结构中的任一种表示:

或其立体异构体。

25.根据权利要求24所述的双特异性化合物，其由以下结构中的任一种表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

26.根据权利要求1所述的双特异性化合物，其是：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

27.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1所述的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体。

28.一种治疗以FGFR2异常活性为特征或由FGFR2异常活性介导的疾病或病症的方法，包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1所述的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症是肝脏癌。

31.根据权利要求31所述的方法，其中所述癌症是胆道癌(BTC)。

32.根据权利要求32所述的方法，其中所述BTC是肝内胆管癌(ICC)或肝外胆管癌(ECC)。

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