KR20040108528A

KR20040108528A - Ｂｃｌ2 군 단백질의 소분자 길항제

Info

Publication number: KR20040108528A
Application number: KR10-2003-7015683A
Authority: KR
Inventors: 샤오멩 왕; 데이준 양
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간; 조지타운 유니버시티 메디칼 센터
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2004-12-24
Also published as: WO2002097053A2; US20030008924A1; JP2005515158A; NO20035301D0; HK1071066A1; NZ529792A; ATE474568T1; EP1474121A4; IL159110A0; DE60237115D1; ZA200309306B; MXPA03010977A; WO2002097053A3; EP1474121B1; AU2002305769B2; CA2449245A1; ES2349349T3; EP1474121A2; SG157952A1; CN1589135A

Abstract

본 발명은 Bcl-2 군 단백질의 자연 발생적인 소분자 길항제 및 화학적으로 합성되는 소분자 길항제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 고시폴 (gossypol) 유도체, 및 고시폴 유도체를 Bcl-2 및 Bcl-X_L단백질의 아폽토시스 (apoptosis)억제 효과에 대한 길항제로서, 특히 Bcl-2 군 단백질 (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)을 과발현하는 암세포에서 사용하는 방법을 제공한다.

Description

ＢＣＬ2 군 단백질의 소분자 길항제 {Small Molecule Antagonists of BCL2 Family Proteins}

본 출원은 2001년 5월 30일에 출원된 미국 가출원 제60/293,983호를 우선권으로 주장한다.

다세포 생물은 손상되거나 불필요한 세포가 그 생물의 이익을 위해 스스로를 파괴할 것을 지시하는, 아폽토시스 (apoptosis)라 불리는 프로세스를 이용한다. 아폽토시스 프로세스의 조절은 다세포 생물의 정상적인 발달에 있어서 매우 중요하며, 예를 들어 태아의 손가락 및 발가락이 발달하기 위해서는 아폽토시스에 의해 과다한 결합 조직이 제거되는 조절이 필요하며, 뇌에서 신경 시냅스의 적절한 형성에 있어서도 그러하다. 유사하게, 조절된 아폽토시스는 월경이 시작될 때 자궁 내층 (자궁 내막)의 박리를 초래한다.

아폽토시스는 발달 동안 조직의 형성 및 정상 세포의 유지에 있어서 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 다세포 생물 전체의 안전에 어떤 위협을 가하는 세포에 대한 1차 방어 수단이기도 하다. 예를 들어, 세포 매개 면역 반응에서 이펙터 (effector) 세포 (예, 세포상해성 T 림프구 "CTL")는 바이러스에 감염된 세포가 아폽토시스를 수행하도록 유도하여 상기 감염 세포를 파괴한다. 이후, 다세포 생물은 상기 이펙터 세포가 더 이상 필요치 않게 되면 이 세포를 파괴하는 아폽토시스 프로세스를 따른다. 자가면역은 CTL들이 아폽토시스를 서로, 심지어는 그들 자체에서 유도함으로써 저지된다. 이 프로세스에서의 결함은 홍반성 루프스 및 류마티스성 관절염 등의 다양한 자가면역 질환과 연관이 있다.

다세포 생물은 또한 아폽토시스 프로세스를 이용하여, 손상된 핵산 (예, DNA)을 갖는 세포가 암으로 되기 전에 그 자신을 파괴하도록 지시한다. 그러나, 몇몇 암-유발성 바이러스는 변형된 세포에서 아폽토시스를 방해한다. 예를 들어, 2종의 인간 유두종 바이러스 (HPV)는 p53 아폽토시스 프로모터를 실활화하는 단백질 (E6)을 생산하여 변형된 세포가 아폽토시스에 의해 제거되는 것을 억제함으로써 경부 암을 일으키는데 관여한다. 단핵세포증가증 (mononucleosis) 및 버킷 (Burkitt's) 림프종 (B 림프구의 충실성 종양)의 원인 물질인 엡스타인-바 바이러스 (EBV)는 Bcl-2와 유사한 단백질, 및 변형된 세포가 Bcl-2의 생산을 증가시키도록 유발하는 다른 단백질을 생산한다. 이들 메카니즘은 둘 다 엡스타인-바 바이러스에 의해 변형된 세포가 아폽토시스에 대해 내성을 띠게끔 만들고, 이에 따라 암성 세포가 증식하여 다세포 생물 전체에 퍼지게 된다.

비-바이러스 수단에 의해 발생하는 어떤 암들은 또한 아폽토시스에 의한 파괴로부터 벗어나는 메카니즘을 개발하였다. 예를 들어, 흑색종 세포는 Apaf-1을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써 아폽토시스를 회피한다. 다른 암세포, 특히 폐암 세포 및 결장암 세포는 FasL에 결합하는 증가된 수준의 가용성 데코이 (decoy) 분자를 분비하며, 이 분자는 FasL이 Fas에 결합하는 것을 억제한다. 따라서, CTL이 상기 암세포를 파괴하는 것을 막는다. 다른 암세포는 FasL을 높은 수준으로 발현시키며, 또한 CTL에 의한 파괴를 회피한다. 또 다른 바이러스는 암을 직접 발생시키지 않으면서 세포의 아폽토시스 기구를 조절한다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 개체에서 면역계의 파괴는, 감염된 CD4⁺T 세포 (100,000개 중 약 1개)가 이들 자매 세포의 아폽토시스 수행을 지시함으로써 진행되는 것으로 생각된다.

아폽토시스 기구의 조절 결함은 또한 각종 퇴행성 증상 및 혈관 질환과 관련이 있다.

아폽토시스 프로세스 및 아폽토시스 기구의 조절 제어가 다세포 생물의 생존에 극히 중대한 것임은 분명하다. 통상적으로, 아폽토시스의 수행을 지시받은 세포에서 일어나는 생화학적 변화는 일정한 순서로 일어난다. 그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 아폽토시스 프로세스 및 기구의 조절 결함은 생물에서 심각한 해로운 효과 및 질병의 발생을 유발할 수 있다.

이상 세포 (예, 암세포)에서 아폽토시스 기구의 조절을 제어 및 회복시키기 위한 많은 시도가 있어 왔다. 대개, 이러한 시도는 독성, 비효과 및 고비용 등의 많은 이유 때문에 아폽토시스 기구의 조절 결함을 특징으로 하는 근본적인 질환에 대한 치료 수단으로는 제한적인 성공에 그쳐 왔다. 아폽토시스 프로세스의 조절 결함을 특징으로 하는 질환 및 증상으로 고통받는 대상에서 아폽토시스를 조절하는 개선된 방법 및 이를 위한 조성물이 요구되고 있는 실정이다.

<발명의 개요>

본 발명은 Bcl-2 군 단백질의 자연 발생적인 소분자 길항제 및 화학적으로 합성된 소분자 길항제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고시폴 유도체, 및 고시폴 유도체를 Bcl-2 및 Bcl-X_L단백질의 아폽토시스억제 효과에 대한 길항제로서, 특히 Bcl-2 군 단백질 (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)을 과발현하는 암세포에서 사용하는 방법을 제공한다.

Bcl-2는 한 단백질 군의 기본 구성원이며, 종양유전자 (oncogene)의 생성물로서 최초로 단리되었다. 현재 Bcl-2 단백질 군은 Bcl-2 및 Bcl-X_L과 같은 아폽토시스억제성 분자, 및 Bax, Bak, Bid 및 Bad와 같은 아폽토시스유발성 분자를 둘 다 포함한다. Bcl-2 및 Bcl-X_L은 bcl-2 군에 의해 매개되는 아폽토시스의 중요한 조절자인 것으로 생각된다.

바람직한 실시양태에서, 고시폴 화합물의 투여는 종양성 (neoplastic) 증상 및 세포 (예, 종양 세포)의 이상 과증식을 수반하는 다른 질환에 대한 효과적인 치료를 제공하기 위해 고려된다.

바람직한 다른 실시양태에서, 본 발명은 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L을 억제하는데 효과적인 양의 고시폴 화합물 (또는 그의 유사체)를 대상에게 투여하여, 이에 따라 종양 억제를 증가시키고(시키거나) 아폽토시스를 유도하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 고시폴 화합물 또는 그의 유사체를 종양 세포의 아폽토시스를 촉진하는 물질 (예, 게라닐게라니올 (Geranylgeraniol)[3,7,11,15-테트라메틸-2,6,10,14-헥사데카트라엔-1-올])과 함께 투여한다. 본 발명은 종양의 아폽토시스를 증가시켜 기저 수준의 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L발현과 관련된 정상적인 아폽토시스 조절을 재확립하는 것을 고려한다.

본 발명의 방법은 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L을 포함하지만 이에 한정되지 않는 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암의 치료에 특히 적합하다.

바람직한 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 유방암, 전립선암, 폐암, 림프종, 피부암, 췌장암, 결장암, 흑색종, 난소암, 뇌암, 두부암, 경부암, 간암, 방광암, 비-소세포 (non-small) 폐암, 경부 암종 (cervical carcinoma), 백혈병, 신경모세포종 (neuroblastoma), 교모세포종 (glioblastoma), 및 T 세포 및 B 세포 매개 자가면역 질환 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 증상에 대한 치료를 제공한다.

바람직한 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 유효량의 고시폴론(gossypolone)을 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상이 있는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.

바람직한 한 실시양태에서, 본 발명은 Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 세포 및 고시폴 화합물을 제공하는 단계 및 세포에서 아폽토시스가 조절되는 조건하에 상기 세포를 유효량의 상기 고시폴 화합물로 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 아폽토시스를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 어떤 특정 고시폴 화합물의 투여에 제한되는 것으로 생각되지 않는다. 실제로, 본 발명은 다수의 고시폴 화합물의 거울상이성질체, 대사산물, 유도체 및 제약상 허용되는 염, 및 이들 화합물의 쉬프 (Schiff's) 염기의 투여를 고려한다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 고시폴 화합물로는 (±)-고시폴; (-)-고시폴; (+)-고시폴; (±)-고시폴론; (-)-고시폴론; (+)-고시폴론; (±)-고시폴 아세트산; (-)-고시폴 아세트산; (+)-고시폴 아세트산; (±)-에틸 고시폴; (-)-에틸 고시폴; (+)-에틸 고시폴; (±)-헤미고시폴론; (-)-헤미고시폴론; (+)-헤미고시폴론; (±)-고시폴의 쉬프 염기; (-)-고시폴의 쉬프 염기; (+)-고시폴의 쉬프 염기; (±)-고시폴론의 쉬프 염기; (-)-고시폴론의 쉬프 염기; (+)-고시폴론의 쉬프 염기; (±)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (-)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (+)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (±)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (-)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (+)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (±)-헤미고시폴론의 쉬프 염기; (-)-헤미고시폴론의 쉬프 염기; 및 (+)-헤미고시폴론의 쉬프 염기 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (-)-고시폴 거울상이성질체를 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상이 있는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 고려되는 Bcl-2 군 단백질로는 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1, BOO-DIVA, Bcl-w, Bcl-6, Bcl-8 및 Bcl-y 등이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또 다른 몇몇 실시양태에서, Bcl-2 군 단백질은 아폽토시스유발 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, Bcl-2 군 단백질은 아폽토시스억제 활성을 갖는다.

몇몇 실시양태에서, 질환에 걸린 세포 및 조직을 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 치료한다. 이에 대해, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 다양한 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 질환의 비제한적 예로는 유방암; 전립선암; 폐암; 림프종; 피부암; 췌장암; 결장암; 흑색종; 난소암; 뇌암; 두부암; 경부암; 간암; 방광암; 비-소세포 폐암; 경부 암종; 백혈병; 신경모세포종; 교모세포종; T 세포 및 B 세포 매개 자가면역 질환; 염증성 질환; 감염증; 과증식성 질환; AIDS; 퇴행성 증상; 및 혈관 질환 등이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, 치료되는 암세포는 전이성 암세포이다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료하기에 적합한 감염증으로는 바이러스, 박테리아, 진균 및 미코플라스마 등에 의해 유발되는 감염증이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 그러나, 본 발명이 어떤 특정 감염증 또는 감염제의 처리에 한정되는 것으로 생각되지는 않는다.

바람직한 한 실시양태에서, 본 발명은, Bcl-2 단백질을 과발현하는 조직, 고시폴 화합물 및 항암제를 제공하는 단계 및 세포 분열이 조절되는 조건하에 상기 조직을 유효량의 상기 고시폴 화합물 및 상기 항암제로 처리하는 단계를 포함하는, 조직에서 세포 분열을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 실시양태 중 몇몇에서, 본 발명은 고시폴 화합물이 Bcl-2 군 단백질에 결합하고, 이에 따라 세포 분열을 조절하는 것을 고려한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 고시폴 화합물을 Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상 (예, 환자)의 치료 방법을 제공한다. 이러한 실시양태의 바람직한 한 예에서, 고시폴 화합물은 Bcl-2 군 단백질에 결합한다.

본 발명의 몇몇 실시양태는 고시폴 화합물 및 항암제를 Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

다수의 항암제가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 것으로 고려된다. 실제로, 본 발명은 다수의 항암제, 예를 들어 아폽토시스 유도제; 폴리뉴클레오티드 (예, 라이보자임); 폴리펩티드 (예, 효소); 약물; 생물학적 모방체 (mimetics); 알칼로이드; 알킬화제; 항종양 항생제; 항-대사산물; 호르몬; 백금 화합물; 항암 약물, 독소 및(또는) 방사성핵종과 연결된 모노클로날 항체; 생물학적 반응 변경제 (예, 인터페론 [예, IFN-α등] 및 인터루킨 [예, IL-2 등] 등); 후천성 면역요법제; 조혈 성장 인자; 종양 세포 분화 유도제 (예, 모든 트랜스-레틴산 등); 유전자 요법 시약; 안티센스 요법 시약 및 뉴클레오티드; 종양 백신; 및 혈관신생 (angiogenesis) 억제제 등의 투여를 고려하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 개시된 고시폴 화합물과 공동투여하기에 적합한 화학 요법 화합물 및 항암 요법에 대한 많은 다른 예는 당업자에게 공지되어 있다.

바람직한 실시양태에서, 항암제는 아폽토시스를 유도하거나 자극하는 물질을 포함한다. 아폽토시스를 유도하는 물질로는 방사선 (예, UV); 키나제 저해제 (예, 표피 성장 인자 수용체 [EGFR] 키나제 저해제, 혈관 성장 인자 수용체 [VGFR] 키나제 저해제, 섬유아세포 성장 인자 수용체 [FGFR] 키나제 저해제, 혈소판 유래의 성장 인자 수용체 [PGFR] 키나제 저해제, 및 Bcr-Abl 키나제 저해제, 예를 들어 STI-571, 글레벡 (Gleevec) 및 글리벡 (Glivec)); 안티센스 분자; 항체 [예, 헤르셉틴 (Herceptin) 및 리툭산 (Rituxan)]; 항-에스트로겐 [예, 랄록시펜 및 타목시펜]; 항-안드로겐 [예, 플루타미드, 비칼루타미드, 피나스테리드, 아미노글루테타미드, 케토코나졸 및 코르티코스테로이드]; 시클로옥시게나제 2 (COX-2) 저해제 [예, 셀레콕시브 (Celecoxib), 멜록시캄, NS-398, 및 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)]; 및 암 화학 요법 약물 [예, 이리노테칸 (캠프토사르, Camptosar), CPT-11, 플루다라빈 (플루다라, Fludara), 다카르바진 (DTIC), 덱사메타손, 미톡산트론, 밀로타르그 (Mylotarg), VP-16, 시스플라티넘, 5-FU, 독소루비신 (Doxrubicin), 탁소테레 (Taxotere) 또는 탁솔]; 세포 신호전달 분자; 세라미드 및 사이토카인; 및 스타우로스프린 등이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 고시폴 화합물을 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태는 유효량의 고시폴 화합물 및 항암제를 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 방법은 유효량의 고시폴 화합물을 암 요법에 대한 내성 (예, 화학내성, 방사선 내성 및 호르몬 내성 등)을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 Bcl-2 군 단백질의 활성을 억제하고(하거나) 상기 단백질의 과발현을 감소시키기에 충분한 양의 고시폴 화합물을 상기 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, Bcl-2 군 단백질의 과발현을 감소시키기에 충분한 양의 고시폴 화합물 및 항암제를 상기 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법이 기술된다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, Bcl-2 군 단백질의 활성을 억제하고(하거나) 상기 단백질의 과발현을 감소시키기에 충분한 양의 고시폴 화합물을 상기 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법이 기술된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Bcl-2 군 단백질의 활성을 억제하고(하거나) 상기 단백질의 과발현을 감소시키기에 충분한 양의 고시폴 화합물 및 항암제를 상기 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

다른 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 고시폴 화합물, 및 상기 고시폴 화합물을 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 대상에게 투여하기 위한 지침을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 실시양태는 고시폴 화합물, 및 상기 고시폴 화합물을 암 요법에 대한 내성을 특징으로 하는 대상에게 투여하기 위한 지침을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 키트에 포함된 지침은 미국식약청의 치료 화합물의 조항에 관한 규칙, 규정 및 제안을 준수한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 고시폴 화합물, 시험 화합물 및 제1 세포군을 제공하는 단계; 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시킨 효과를 관찰하는 단계를 포함하는, 고시폴 화합물 및 시험 화합물을 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 이러한 실시양태의 몇몇에서, 본 발명은 또한 상기 제1 세포에서 관찰된 효과를, 상기 고시폴 화합물 단독 또는 상기 시험 화합물 단독과 접촉시킨 제2 세포군과 비교하는 추가의 단계를 제공한다. 관찰될 수 있는 효과로는 세포 증식에서의 변화, 아폽토시스 상태에서의 변화, 및 Bcl-2 군 단백질(예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)의 발현에서의 변화 등이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 스크리닝/확인된 시험 화합물을 판매하는 추가의 방법을 고려한다. 이러한 실시양태의 몇몇에서, 시험 화합물은 판매를 위해 제3자에 의해 한가지 이상의 형태 (예, 시험 화합물을 환자에게 투여하기 위한 지침을 포함하는 키트)로 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 이점, 이익 및 바람직한 실시양태는 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명은 Bcl-2 군 단백질의 자연 발생적인 소분자 길항제 및 화학적으로 합성된 소분자 길항제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고시폴 (gossypol) 유도체, 및 고시폴 유도체를 Bcl-2 및 Bcl-X_L단백질의 아폽토시스 (apoptosis)억제 효과에 대한 길항제로서, 특히 Bcl-2 군 단백질 (예를 들어, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)을 과발현하는 암세포에서 사용하는 방법을 제공한다.

하기 언급된 도면들은 본 명세서의 일부를 이루며, 본 발명의 특정 측면 및 실시양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 그러나, 본 발명을 이들 도면에 구체적으로 언급된 실시양태로 한정하려는 것은 아니다.

도 1은 Bcl-2 (서열 1) 및 Bcl-X_L(서열 2)의 서열 정렬을 나타낸다.

도 2는 Bak BH3 펩티드와 복합체를 이룬 Bcl-2의 전체 구조를 리본 형태로 나타낸다.

도 3은 고시폴이 Bak BH3 펩티드와 Bcl-2 (Bcl-X_L) 사이의 결합을 직접 억제함을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 5A는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 5B는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 6은 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 7은 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 8A는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 8B는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 9는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 10은 고시폴, 고시폴론, 고시폴의 쉬프 염기 및 고시폴론의 쉬프 염기의 화학 구조를 제공한다.

도 11은 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 12는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 13은 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 14는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 15A는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 15B는 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 16은 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

도 17은 본 발명의 한 실시양태의 결합 분석 결과를 나타낸다.

<정의>

본 발명에 대한 이해를 촉진시키기 위해, 많은 용어 및 어구에 대해 하기에서 정의하였다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "고시폴 화합물"은 고시폴 분자의 거울상이성질체, 유도체, 대사산물, 쉬프 염기 및 제약상 허용되는 염을 의미한다. 따라서, 고시폴 화합물에는 (±)-고시폴; (-)-고시폴; (+)-고시폴; (±)-고시폴론; (-)-고시폴론; (+)-고시폴론; (±)-고시폴 아세트산; (-)-고시폴 아세트산; (+)-고시폴 아세트산; (±)-에틸 고시폴; (-)-에틸 고시폴, (+)-에틸 고시폴; (±)-헤미고시폴론; (-)-헤미고시폴론; (+)-헤미고시폴론; (±)-고시폴의 쉬프 염기; (-)-고시폴의 쉬프 염기; (+)-고시폴의 쉬프 염기; (±)-고시폴론의 쉬프 염기; (-)-고시폴론의 쉬프 염기; (+)-고시폴론의 쉬프 염기; (±)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (-)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (+)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (±)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (-)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (+)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (±)-헤미고시폴론의 쉬프 염기; (-)-헤미고시폴론의 쉬프 염기; 및 (+)-헤미고시폴론의 쉬프 염기가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Bcl-2 군 단백질"은 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1, BOO-DIVA, Bcl-w, Bcl-6, Bcl-8 및 Bcl-y를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 Bcl-2 군의 아폽토시스억제성 구성원 및 Bak, Bax, Bad, tBid,Harakiri, Bim 및 Bmf를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 Bcl-2 군의 아폽토시스유발성 구성원 둘 다와, 고시폴 화합물에 의해 조절되는 단백질을 포함하는 BH3 (Bcl-2 상동성 3)의 다른 구성원을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Bcl-2의 과발현" 또는 "Bcl-2 군 단백질의 과발현"은 세포 또는 조직에서 Bcl-2 군 단백질(들)을 코딩하는 mRNA의 수준 및(또는) Bcl-2 군 단백질(들)의 수준이 Bcl-2 군 단백질 코딩 mRNA를 기저 수준으로 발현시키거나 기저 수준의 Bcl-2 군 단백질을 포함하는 상응하는 유사한 정상의 비병원성 세포 및 조직에 비해 상승한 것 (예, 이상 수준)을 의미한다. 세포 또는 조직에서 Bcl-2 군 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준 또는 Bcl-2 군 단백질의 수준을 검출하는 방법으로는 면역조직화학적 방법 및 핵산 증폭 방법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항암제" 또는 "통상의 항암제"는 암의 치료에 이용되는 임의의 화학 요법 화합물, 방사선 요법 또는 수술적 개입을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 인공적인 환경, 및 인공적인 환경내에서 일어나는 프로세스 또는 반응을 의미한다. 시험관내 환경은 시험관 및 세포 배양물로 이루어질 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 "생체내"는 천연 환경 (예, 동물 또는 세포), 및 천연 환경내에서 일어나는 프로세스 또는 반응을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 시험관내 또는 생체내에 위치하는 임의의 진핵 세포 또는 원핵 세포 (예, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포)를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양"은 세포의 임의의 시험관내 배양을 의미한다. 이 용어에는 확립 (continuous) 세포주 (예, 무한 증식하는 표현형을 가짐), 일차 세포 배양물, 유한 세포주 (예, 비-형질전환된 세포), 및 시험관내에서 유지된 임의의 다른 세포 집단 (난모세포 및 배 (embryo) 등)이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 본 발명의 방법에 의해 치료되는생물을 의미한다. 이러한 생물로는 인간이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 용어 "대상"은 통상 Bcl-2 군 단백질 (예, Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A-1(Bfl-1) 및 Boo)의 과발현을 특징으로 하는 질병에 대한 치료 (예, 고시폴 화합물(들), 및 임의로 1종 이상의 항암제의 투여)를 받거나 받을 예정인 개체를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "진단되는"이란 어떤 질환을 그의 징후 및 증상 (예, 통상의 암 요법에 대한 내성), 또는 유전적 분석, 병리학적 분석 및 조직학적 분석 등에 의해 인식하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합에 대해 경쟁하는"은 제2 분자 (예, 아폽토시스유발성 Bcl-2 군 단백질, 예를 들어 Bax, Bak, Bid 및 Bad 등)가 결합하는 기질과 동일한 것 (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)에 결합하는 활성을 갖는 제1 분자 (예, 고시폴 화합물)와 관련하여 사용된다. 제1 분자에 의한 결합의 효율 (예, 반응속도론 또는 열역학)은 제2 분자에 결합하는 기질의 효율과 동일하거나, 그보다 크거나 또는 그보다 작을 수 있다. 예를 들어, 기질에 결합하는 평형 결합 상수 (K_D)는 상기 두 분자에 있어서 다를 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안티센스"는 특이적 RNA 서열 (예, mRNA)에 상보적인 RNA 서열과 관련하여 사용된다. 이 정의에는 박테리아에 의한 유전자 조절에 관여하는 안티센스 RNA ("asRNA") 분자가 포함된다. 안티센스 RNA는 코딩 스트랜드의 합성을 허용하는 바이러스 프로모터에 대해 반대 방향인 대상 유전자(들)을 스플라이싱하여 합성하는 방법을 비롯한 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 배로 도입되는 경우에 상기 전사된 스트랜드는 상기 배에 의해 제조된 천연 mRNA와 결합하여 이중쇄 (duplex)를 형성한다. 이후, 상기 이중쇄는 mRNA의 추가의 전사 또는 그의 번역을 차단한다. 이러한 방식으로, 돌연변이 표현형이 생성될 수 있다. 용어 "안티센스 스트랜드"는 "센스" 스트랜드에 상보적인 핵산 스트랜드와 관련하여 사용된다. 표시 (-) (즉, "네가티브")는 흔히 안티센스 스트랜드와 관련하여 사용되며, 표시 (+)는 흔히 센스 (즉, "포지티브") 스트랜드와 관련하여 사용된다. 안티센스 분자에 접근할 수 있는 핵산 서열의 영역은 이용가능한 컴퓨터 분석 방법을 이용하여 결정할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "샘플"은 그의 가장 넓은 의미로 사용된다. Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상을 나타내는 것으로 추정되는 샘플은 세포, 조직, 유체, 세포로부터 단리된 염색체 (예, 분열 중기 (metaphase)의 펼쳐진 염색체), 게놈 DNA (용액 중 존재하거나, 서던 (Southern) 블롯 분석의 경우에서와 같이 고상 지지체에 결합됨), RNA (용액 중이거나, 노던 (Northern) 블롯 분석의 경우에서와 같이 고상 지지체에 결합됨) 및 cDNA (용액 중이거나, 고상 지지체에 결합됨) 등을 포함할 수 있다. 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 샘플은 세포, 조직 일부 및 1종 이상의 단백질을 포함하는 추출물 등을 포함할 수 있다

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된" 또는 "정제하는 것"은 원치않는 성분들을 샘플에서 제거하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 정제된"은 핵산 또는 아미노산 서열이 이들의 천연 환경으로부터 제거되거나, 단리되거나 또는 분리되는 것을 의미하며, 상기 서열과 자연적으로 결합하는 다른 성분들을 60％ 이상, 바람직하게는 75％ 이상, 가장 바람직하게는 90％ 이상 함유하지 않는다. 따라서, 예컨대 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "게놈"은 생물 또는 숙주 세포의 유전 물질 (예, 염색체)을 의미한다.

용어 "대상 뉴클레오티드 서열"은 임의의 뉴클레오티드 서열 (예, RNA 또는 DNA)을 의미하며, 당업자라면 어떠한 이유 (예, 질환 치료, 향상된 특성 부여 등)로 든지 원한다면 이 서열을 조작할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열로는 구조 유전자 (예, 리포터 유전자, 선별 마커 유전자, 종양유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 등)의 코딩 서열 또는 그의 일부, 및 mRNA 또는 단백질 산물을 코딩하지 않는 비-코딩 조절 서열 (예, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종결 서열, 인핸서 서열 등)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 그의 단편 또는 일부, 및 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하는데, 이들은 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드일 수 있으며, 센스 스트랜드 또는 안티센스 스트랜드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코딩 핵산 분자," "코딩 DNA 서열," "코딩 DNA," "코딩 RNA 서열" 및 "코딩 RNA"는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 스트랜드 상에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 의미한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드또는 리보뉴클레오티드의 순서는 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드 (단백질) 쇄상에 존재하는 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, DNA 또는 RNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.

용어 "유전자"는 폴리펩티드 또는 전구체 (예, 프로인슐린)의 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예, DNA 또는 RNA) 서열을 의미한다. 폴리펩티드는 전장 또는 단편의 바람직한 활성 또는 기능적 특성 (예, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달 등)이 유지된다면 전장 코딩 서열 또는 이 코딩 서열의 어떤 일부에 의해 코딩될 수 있다. 이 용어는 또한 구조 유전자의 코딩 영역을 포함하고, 이 코딩 영역의 인접 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에서부터 각각 약 1 kb 이상 떨어진 거리내에 있는 서열들을 포함하여 상기 유전자는 전장 mRNA의 길이에 상응하게 된다. 코딩 영역의 5'에 위치하며 mRNA 상에 존재하는 서열을 5' 비번역 서열이라고 부른다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하며 mRNA 상에 존재하는 서열을 3' 비번역 서열이라고 부른다. 용어 "유전자"는 한 유전자의 cDNA 형태 및 게놈 형태 둘 다를 포함한다. 한 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론," "개입 (intervening) 영역" 또는 "개입 서열"로 명명된 비-코딩 서열로 단절된 코딩 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 단편이며, 인트론은 인핸서 등의 조절 요소를 포함할 수 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사체로부터 제거되거나 "스플라이스 아웃"되며, 따라서 인트론은 메신저 RNA (mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. mRNA는 번역 동안 발생하는 폴리펩티드에서 아미노산의 서열 또는 순서를 지정하는 기능을 한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성 (exogenous) 유전자"는 숙주 생물 또는 세포에 본래 존재하지 않거나, 숙주 생물 또는 세포로 인공적으로 도입되는 유전자를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 적절한 조절 요소와 결합하는 경우 복제할 수 있으며 세포 사이에서 유전자 서열을 전달할 수 있는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전적 요소를 의미한다. 따라서, 이 용어는 바이러스 벡터뿐 아니라, 클로닝 및 발현 비히클도 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 발현"은 유전자내에 코딩된 유전 정보를 유전자의 "전사"를 통해 (즉, RNA 폴리머라제의 효소 작용을 통해) RNA (예, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 전환시키고, 단백질 코딩 유전자의 경우 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환시키는 프로세스를 의미한다. 유전자 발현은 상기 프로세스의 많은 단계에서 조절될 수 있다. "상향조절 (up-regulation)" 또는 "활성화 (activation)"는 유전자 발현 산물 (즉, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 의미하며, "하향조절 (down-regulation)" 또는 "억제 (repression)"는 생산을 감소시키는 조절을 의미한다. 상향조절 또는 하향조절에 관여하는 분자 (예, 전사 인자)를 흔히 각각 "활성자 (activators)" 및 "억제자 (repressors)"라고 부른다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코딩 핵산 분자," "코딩 DNA 서열," "코딩 DNA," "코딩 RNA 서열" 및 "코딩 RNA"는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 스트랜드상에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 의미한다. 상기 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서는 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드 (단백질) 쇄상에 존재하는 아미노산 순서를 결정한다. 따라서, DNA 또는 RNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.

핵산과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "상동성" 및 "퍼센트 (％) 동일성"은 상보성 정도를 의미한다. 부분적인 상동성 (즉, 부분적인 동일성) 또는 완전한 상동성 (즉, 완전한 동일성)이 있을 수 있다. 부분적으로 상보적인 서열은 완전하게 상보적인 서열이 표적 핵산 서열에 혼성화하는 것을 적어도 부분적으로 억제하는 서열이며, "실질적으로 상동성인"과 같은 기능적인 용어를 사용하여 부른다. 완전하게 상보적인 서열이 표적 서열에 혼성화하는 것을 억제하는 것은 저 엄격도 조건하에 혼성화 분석 (서던 또는 노던 블롯 및 용액 혼성화 등)을 이용하여 조사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브 (즉, 다른 대상 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드)는 완전하게 상동성인 서열이 저 엄격도 조건하에 표적 서열에 결합 (즉, 혼성화)하는 것에 대해 경쟁하거나, 이를 억제할 것이다. 저 염격도 조건이 비-특이적 결합을 허용하는 조건이라고는 말할 수 없지만, 저 엄격도 조건은 2개의 서열이 서로 결합하는 것이 특이적 (즉, 선택적) 상호작용일 것을 요구한다. 비-특이적 결합의 부재는 부분적인 정도의 상보성 조차 없는 (예, 동일성이 약 30％ 미만인) 제2 표적을 사용하여 시험할 수 있으며, 비-특이적 결합의 부재하에 프로브는 제2의 비-상보적 표적에 혼성화하지 않을 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엄격도"는 핵산 혼성화가 수행되는 조건하에서, 온도, 이온 농도, 및 유기 용매와 같은 다른 화합물의 존재에 대한 조건과 관련하여 사용된다. "고 엄격" 조건에서, 핵산의 염기쌍 형성은 높은 빈도의 상보적 염기 서열을 갖는 핵산 단편들 사이에서만 일어날 것이다. 따라서, "약한" 또는 "저" 엄격 조건에는 흔히 상보적 서열의 빈도가 일반적으로 낮기 때문에 유전적으로 다양한 생물들로부터 유래하는 핵산이 요구된다. 저 엄격 조건을 이용하여 본 발명을 실시할 수 있지만, 바람직한 실시양태에서는 중간 내지 고 엄격 조건을 이용한다.

핵산 혼성화와 관련하여 사용되는 경우에 "고 엄격 조건"은 5×SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ㆍH₂O 및 1.85 g/l EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.5％ SDS, 5×덴하르트 (Denhardt's) 시약 [50×덴하르트는 500 ml 당 피콜 (Ficoll) 5 g (Type 400, Pharmacia), BSA 5 g (Fraction V; Sigma)을 포함함], 100 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 50％ (V/V) 포름아미드로 이루어진 용액 중 42 ℃ (예, 철야 조건)에서의 결합 또는 혼성화와 동등한 조건을 포함한다. 이후, 뉴클레오티드 약 500개 길이의 프로브를 사용하는 경우, 혼성화된 DNA 샘플을 실온에서 2×SSPE, 0.1％ SDS를 포함하는 용액에 이어서 42 ℃에서 0.1×SSPE, 1.0％ SDS를 포함하는 용액 중에서 2회 세척한다. 당업자라면 고 엄격 조건하에 혼성화를 촉진시키는 조건 (예를 들어, 혼성화 및(또는) 세척 단계의 온도를 증가시키는 것, 혼성화 용액 중에서 포름아미드를 사용하는 것 등)을 알고 있을 것이다.

핵산 혼성화와 관련하여 사용되는 경우에 "중간 엄격 조건"은 5×SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ㆍH₂O 및 1.85 g/l EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.5％ SDS, 5×덴하르트 시약 [50×덴하르트는 500 ml 당 피콜 5 g (Type 400, Pharmacia), BSA 5 g (Fraction V; Sigma)을 포함함], 100 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 50％ (V/V) 포름아미드로 이루어진 용액 중 42 ℃에서의 결합 또는 혼성화한 다음, 뉴클레오티드 약 500개 길이의 프로브를 사용하는 경우, 실온에서 1.0×SSPE, 1.0％ SDS를 포함하는 용액에 이어서 42 ℃에서 2×SSPE, 0.1％ SDS를 포함하는 용액 중에서 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.

"저 엄격 조건"은 5×SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ㆍH₂O 및 1.85 g/l EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.1％ SDS, 5×덴하르트 시약 [50×덴하르트는 500 ml 당 피콜 5 g (Type 400, Pharmacia), BSA 5 g (Fraction V; Sigma)을 포함함], 100 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 50％ (V/V) 포름아미드로 이루어진 용액 중 42 ℃에서의 결합 또는 혼성화한 다음, 뉴클레오티드 약 500개 길이의 프로브를 사용하는 경우, 42 ℃에서 5×SSPE, 0.1％ SDS를 포함하는 용액 중에서 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다. 또한, 당업자라면, 수많은 동등한 조건을 이용하여 저 엄격 조건을 구성할 수 있는데, 프로브의 길이와 특성 (DNA, RNA, 염기 조성), 표적의 특성 (DNA, RNA, 염기 조성, 용액 중 존재 또는 고정 등), 및 염 및 다른 성분 (예, 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재)의 농도 등의 인자들이 고려되며, 혼성화 용액을 달리하여 상기 나열된 조건들과는 상이하지만 그와 동등한 저 엄격 혼성화 조건을 생성시킬 수 있음을 잘 알 것이다.

단일 스트랜드 핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "실질적으로 상동성인"은 상기 기술된 저 엄격 조건하에 단일 스트랜드 핵산 서열과 혼성화할 수 있는 임의의 프로브 (즉, 프르보는 상기 핵산 서열의 상보체임)를 의미한다. 유전자는 1차 RNA 전사체의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 여러 종류의 RNA를 생산할 수 있다. 동일한 유전자의 스플라이스 변이체인 cDNA는 서열 동일성 또는 완전 상동성 영역 (양쪽 cDNA 상의 동일한 엑손 또는 동일한 엑손의 일부의 존재를 나타냄) 및 완전 비-동일성 영역 (예를 들어, cDNA 1 상의 엑손 "A"의 존재를 나타내며, cDNA 2는 엑손 "B"를 대신 포함함)을 포함할 것이다. 상기 두 cDNA가 서열 동일성 영역을 포함하기 때문에, 이들 cDNA는 전체 유전자로부터 유도된 프로브 또는 이들 cDNA 상에 존재하는 서열을 포함하는 유전자의 일부로부터 유도된 프로브 둘 다와 혼성화할 것이며, 따라서 상기 두 스플라이스 변이체는 서로 실질적으로 상동성이면서, 상기 프로브와도 실질적으로 상동성이다. 본 발명이 완전 상동성인 서열들 사이에서 일어나는 혼성화의 경우에만 한정되는 것은 아니다. 몇몇 실시양태에서, 혼성화는 실질적으로 상동성인 서열들 사이에서 일어난다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상 단백질"은 대상 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 단백질과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "천연 (또는 야생형)"은 부분적으로 상동성인 핵산에 의해 코딩되어 단백질의 아미노산 서열이 다른 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 단백질기능을 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환과 비보존적 아미노산 치환 둘 다를 포함하는 상동성 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 및 단백질 기능의 감소 (널 (null) 돌연변이) 또는 증가를 일으키는 아미노산 치환을 포함하는 상동성 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "리버스 (reverse) 노던 블롯"은 아가로스 겔 상에서 DNA를 전기영동하여 DNA를 크기별로 분리한 다음, 분리된 DNA를 겔로부터 고상 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 상으로 전달하여 DNA를 분석하는 것을 의미한다. 이어서, 고정된 DNA를 표지된 올리고-리보뉴클레오티드 프로브 또는 RNA 프로브로 탐지하여 사용된 리보 프로브에 상보적인 DNA 종을 검출한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "병원체"는 숙주에서 질병 상태 (예, 감염증, 암 등)를 일으키는 생물학적 물질을 의미한다. "병원체"로는 바이러스, 박테리아, 고세균 (archaea), 진균, 원생동물, 미코플라스마 및 기생 생물을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물"은 박테리아, 고세균, 진균, 원생동물, 미코플라스마 및 기생 생물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 종 또는 유형의 미생물을 의미하는데 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "진균"은 곰팡이 및 효모와 같은 진핵 생물 (동종이형 (dimorphic) 진균 등)과 관련하여 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스"는 몇몇 예외가 있지만 광 현미경으로는 관찰되지 않고, 독립적인 대사작용이 없으며, 살아있는 숙주 세포내에서만복제할 수 있는 미세한 감염성 물질을 의미한다. 바이러스의 개별 입자 (즉, 비리온)는 핵산 및 단백질 쉘 (shell) 또는 코트로 구성되며, 어떤 비리온은 지질 함유 막을 갖기도 한다. 용어 "바이러스"는 동물, 식물, 파아지 및 기타 바이러스를 비롯한 모든 유형의 바이러스를 포괄한다.

용어 "박테리아(들)"은 원핵 생물계 (Kingdom Procaryotae) 모든 문 (phyla)의 생물을 포함하는 모든 원핵 생물을 의미한다. 이 용어는 미코플라스마 (Mycoplasma), 클라미디아 (Chlamydia), 액티노마이세스 (Actinomyces), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 리케챠 (Rickettsia)를 포함하여 박테리아로 고려되는 모든 미생물을 포함하는 것으로 생각된다. 이 정의에는 코커스 (coccus), 바실러스 (bacillus), 스피로헤트 (spirochete), 스페로플라스트 (spheroplast), 프로토플라스트 (protoplast) 등을 비롯한 모든 형태의 박테리아가 포함된다. 또한, 이 용어에는 그람 음성 또는 그람 양성인 원핵 생물이 포함된다. "그람 음성" 및 "그람 양성"은 당업계에 잘 알려진 그람 염색 방법에 의한 염색 패턴을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Finegold and Martin, Diagnostic Microbiology, 6th Ed., C V Mosby St. Louis, pp 13-15 (1982)] 참조). "그람 양성 박테리아"는 그람 염색에 사용되는 1차 염료를 보유하는 박테리아이며, 염색된 세포는 현미경 상에서 암청색 내지 보라색으로 보인다. "그람 음성 박테리아"는 그람 염색에 사용되는 1차 염료를 보유하지 않지만, 대비염색제 (counterstain)에 의해 염색된다. 따라서, 그람 음성 박테리아는 적색을 띤다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 단백질"은 특이적 항원에 결합하는 단백질을 의미한다. "항원 결합 단백질"에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키마레 항체, 단쇄 항체, 인간화 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 비롯한 이뮤노글로불린이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 폴리클로날 항체를 제조한다. 항체의 제조를 위해, 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 숙주 동물에게 목적하는 에피토프에 상응하는 펩티드를 주사하여 면역화할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 펩티드를 면역원성 캐리어 (예, 디프테리아 변성독소, 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))에 연결 (conjugate)시킨다. 프로인트 (Freund's) (완전 및 불완전) 보조제, 미네랄 겔, 예를 들어 수산화 알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제, 예를 들어 BCG (Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 보조제를 숙주 종류에 따라 사용하여 면역학적 반응을 증가시킨다.

모노클로날 항체의 제조를 위해, 확립 세포주를 배양하여 항체 분자를 제조하는 임의의 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조). 이러한 기술로는 콜러 (Koehler) 및 밀스타인 (Milstein)에 의해 처음 개발된 하이브리도마 기술 (Koehler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), 및 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(예를 들어, 문헌 [Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)] 참조) 및 인간 모노클로날 항체를 제조하는 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라, 단쇄 항체의 제조를 위해 개시된 기술 (미국 특허 제4,946,778호, 본원에 참고로 포함됨)을 변형시켜 원하는 특이적 단쇄 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시양태에서는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 Fab 발현 라이브러리를 구성함으로써 [Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)] 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 빠르고 쉽게 확인할 수 있다.

항체 분자의 이디오타입 (idiotype) (항원 결합 영역)을 포함하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편으로는 항체 분자의 펩신 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 디술피드 브리지의 환원에 의해 생성시킬 수 있는 Fab' 단편, 및 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성시킬 수 있는 Fab 단편을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

항원 결합 단백질을 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 방법에 의해 단리할 수 있다. 항체의 제조에서, 목적하는 항체의 스크리닝은 당업계에 공지된 기술 [예, 방사성면역분석, ELISA (효소-결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역방사측정 분석, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 원위치 면역분석 (예를 들어, 콜로이드 골드, 효소 또는 방사성동위원소 표지를 사용함), 웨스턴 블롯, 침전반응, 응집 분석 (예, 겔 응집 분석, 혈구응집 분석 등), 보체 고정 분석, 면역형광 분석, 단백질 A 분석 및 면역전기영동 분석 등] 등에 의해 달성할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상기 고시폴 화합물을 대상에게 투여하기 위한 지침"은 세포 또는 조직에서 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상의 치료를 위한 키트내에 포함된 조성물을 사용하기 위한 지침을 포함한다. 이 용어는 또한 1종 이상의 통상의 항암 요법 (예, 화학 요법)에 대한 내성을 특징으로 하는 암을 치료하기 위한 키트에 포함된 조성물을 사용하기 위한 지침을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지침은 21 CFR§201 (이하 참조)에 따라 키트내에 포함된 조성물의 권장 투여량 또는 통상의 투여량에 대한 설명서를 추가로 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 적용가능한 라벨 부착 및 지시 요건에 관한 추가의 정보는 미국 FDA의 인터넷 웹 페이지에서 이용할 수 있다.

용어 "시험 화합물"은 신체 기능의 질환, 질병, 병증 또는 장애를 치료 또는 예방하거나, 샘플의 생리학적 상태 또는 세포의 상태 (예, 세포내 Bcl-2 군 단백질의 수준)를 변화시키는데 사용될 수 있는 임의의 화학 물질, 약제 및 약물 등을 의미한다. 시험 화합물은 공지된 치료 화합물과 잠재적인 치료 화합물을 둘 다 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 시험 화합물이 치료 화합물인지를 결정할 수 있다. "공지된 치료 화합물"은 (예를 들어, 동물 실험 또는 인간에게 투여하는 선행 실험을 통해) 상기 치료 또는 예방에 효과적인 것으로 밝혀진 치료 화합물을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, "시험 화합물"은 항암제이다. 특히 바람직한 실시양태에서, "시험 화합물"은 세포에서 아폽토시스를 유도하는 항암제이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제3 자"는 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상을 치료하기 위해 고시폴 화합물과의 공동투여에 고려되는 시험 화합물을 판매하거나, 창고에 수용하거나, 분배하거나 또는 판매용으로 공급하는데 관여하는 임의의 존재를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절하는"는 세포 성장, 증식 및 아폽토시스 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포 기능의 측면에 영향을 주는 (예를 들어, 촉진시키거나 지연시키는) 화합물 (예, 고시폴 화합물)의 활성을 의미한다.

<발명에 대한 전체적인 설명>

고시폴은 조 면실유 (고시피움 (Gossypium) 종)로부터 유래하는 자연 발생적인 이중 비페놀 화합물이다. 남성용 피임제로서 인간에 대해 고시폴을 실험하여 이 화합물의 장기 투여에 따른 안정성을 입증하였다. 고시폴은 인간에서 충분히 허용되는 것으로 나타났으며, 과도한 예비처치를 받은 불량한 예후의 재발성 교종에 걸린 환자에서 느리기는 하지만 측정가능한 반응 속도를 나타낸다.

본 발명은 고시폴 화합물이 종양 성장을 상당히 억제하는 것을 보여주는 생체내 데이타를 제공하지만, 몇몇 실시양태에서 고시폴 화합물은 1종 이상의 통상의 항암제 (예, 도세탁셀)와 조합 (공동투여)하여 사용하는 경우에 종양 성장을 훨씬 더 억제하게 된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서 고시폴 화합물, 그의 대사산물, 거울상이성질체 및 유도체를 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L의 과발현을 특징으로 하는질환 (예, 암)으로 고통받는 환자에게 투여한다. 고시폴은 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L를 높은 수준으로 발현하는 암세포에서 아폽토시스를 유도하지만, 고시폴은 Bcl-X_L및(또는) Bcl-2를 낮은 수준으로 발현시키는 세포에 대해서는 거의 영향을 주지 않는다.

고시폴은 부작용이 거의 없이 경구로 투여될 수 있는 공지된 정자발생 억제제이다. 그러나, 몇몇 연구자들은 고시폴 투여를 연장하는 경우에 경조증 (hypoklemia)이 발병할 수 있음을 알아냈다. 따라서, 몇몇 실시양태에서 본 발명의 방법 및 조성물은 고시폴 화합물을 처치한 환자에게 공동투여하는 칼륨 보충물을 추가로 포함한다.

고시폴은 1980년 이후 시험관내 및 생체내 모델에서 항암 치료제로서 연구되어 왔다. 그러나, 본 발명의 이전에는 고시폴의 항암 효과 메카니즘이 알려져 있지 않았다. 고시폴이 Bcl-2 및 Bcl-X_L에 대한 강력한 억제제라는 본 발명의 발견은 고시폴의 항종양 활성이 적어도 부분적으로는 Bcl-2 군 단백질을 높은 수준으로 발현하는 암세포에서 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 아폽토시스억제 활성의 억제 및 이후 아폽토시스의 유도로 인한 것임을 보여준다. 따라서, 본 발명은 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 대상을 표적화하는 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다.

최근까지의 임상 실험에서, 고시폴은 환자에서 낮은 독성을 나타냈다. 몇몇 실시양태에서, 고시폴 화합물은 전이성 암에 대해 효과적인 단일 치료제를 제공하는 것으로 고려된다. 또한, 본 발명은 고시폴 화합물이 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 아폽토시스억제 효과를 특이적으로 길항하는 새로운 종류의 항암제임을 고려한다.

Bcl-2는 아폽토시스억제성 분자 (예, Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1, BOO-DIVA, Bcl-w, Bcl-6, Bcl-8 및 Bcl-y 등) 및 아폽토시스유발성 분자 (예, Bax, Bak, Bid 및 Bad 등) 둘 다를 포함하는 한 단백질 군의 기본 구성원이다.bcl-2 유전자는 18번 염색체 상에 위치하는 인간 원종양유전자 (proto-oncogene)이다.bcl-2 유전자는 B-세포 백혈병에서 전좌된 (translocated) 유전자좌 (locus)로서 발견되었다. 이러한 전좌는 또한 몇몇 B-세포 림프종에서도 발견된다. 암성 B 세포에서,bcl-2 유전자좌를 포함하는 18번 염색체의 일부는 항체 중쇄를 포함하는 14번 염색체의 일부와 상호 (reciprocal) 전좌를 수행한다. 이러한 t(14;18) 전좌는bcl-2 유전자를 중쇄 유전자의 인핸서 가까이에 위치시킨다.bcl-2 유전자의 산물인 Bcl-2 단백질은 소포체 (ER) 막, 핵막 및 미토콘드리아 외막에 존재하는 전체막 (integral membrane) 단백질이다. Bcl-2 및 Bcl-X_L은 결정적인 아폽토시스 길항제로서 기능하는 것으로 고려된다.

본 발명의 실시에 있어서 이러한 메카니즘에 대한 이해가 필요한 것은 아니며 본 발명이 이에 한정되지도 않지만, 아폽토시스억제성 단백질인 Bcl-2 및 Bcl-X_L은 Bak, Bad, Bax, Mtd (Bok), Bim, Hrk (DP5), Blk, Bnip3, Bnip3L 및 Diva와 같은 아폽토시스유발성 Bcl-2 군의 구성원과 헤테로이합체를 형성함으로써 아폽토시스를 억제하는 것으로 생각된다. Bcl-2 군의 다른 아폽토시스억제성 구성원 (또는관련 단백질)으로는 Mcl-1, A1/BFL-1, BOO-DIVA, Bcl-w, Bcl-6, Bcl-8 및 Bcl-y가 포함되는 것으로 생각되지만, 이에 한정되지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 억제를 위한 표적으로서 BH3 도메인-함유 단백질을 제공한다. 명세서가 Bcl-2 단백질 군을 언급하는 경우에 동일한 개시내용은 BH3 도메인-함유 단백질에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서 본 발명은 BH3 도메인-함유 단백질의 이상 발현과 관련된 생물학적 조건의 조절 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다. 유사하게, 다른 몇몇 실시양태에서 본 발명은 BH3 도메인-함유 단백질의 이상 발현을 조절 (예를 들어, 억제 또는 촉진)하는 물질 및 화합물을 스크리닝하는 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다.

Bcl-2 및 Bcl-X_L은 고도로 상동성인 단백질이다. 많은 형태의 인간 암 (예, 골수 백혈병 및 유방암)은 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L을 과발현한다. Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L은 둘 다 인간 유방암에서 과발현되는 것으로 나타났다. 특히, Bcl-2는 인간 유방암의 60％ 내지 80％에서 과발현되는 것으로 나타난다. Bcl-2의 발현은 에스트로겐 수용체 (ER) 양성 유방암과 고도의 상관관계를 갖는다. Bcl-X_L은 인간 유방암의 40％ 내지 70％, 전립선암의 30％ 내지 60％, B-세포 림프종의 80％, 결장직장 선암종의 90％, 및 많은 다른 형태의 암에서 과발현된다. Bcl-X_L은 ER 음성 유방암에서 주로 나타난다. Bcl-X_L의 과발현은 통상적으로 불량한 예후 및 짧은 생존율과 상관관계가 있다.

여러 계통의 증거에 의하면 Bcl-2 및 Bcl-X_L은 암의 진행에 기여할뿐 아니라, 통상의 항암 요법에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 암-내성을 부여할 수도 있음을 알 수 있다. 높은 수준의 세포내 Bcl-2는 세포 (예, 암세포)를 아폽토시스에 의한 파괴로부터 보호한다. 충실성 종양의 대부분은 1종 이상의 아폽토시스억제성 Bcl-2 단백질에 의해 보호된다. 현재 이용가능한 암 화학 요법제의 대부분은 세포의 DNA 일체성 또는 복제를 표적화하며, 종양세포에서 아폽토시스를 간접적으로 개시한다. Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L을 높은 수준으로 발현하는 암은 흔히 화학 요법제 또는 방사선 요법에 대해 내성이 있다.

그러나, Bcl-2 및 Bcl-X_L의 발현 패턴은 Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 암들의 일부에서 상이하다. Bcl-2 또는 Bcl-X_L단백질의 발현이 암세포가 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 Bcl-2 군 매개 내성을 나타내는데 충분함을 시사하는 여러 보고 결과가 있다 (문헌 [J. C. Reed, Pharmacology, 41:501-553 (1997)] 및 [J. C. Reed et al., J. Cell Biochem., 6:23-32 (1996)] 참조). 다른 연구 결과는 몇몇 암세포가 Bcl-2의 과발현을 Bcl-X_L의 과발현으로 전환시킬 수 있음을 시사한다 (문헌 [Z. Han et al., Cancer Res., 56:621-628 (1996)] 참조). 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태는 치료량의 1종 이상의 Bcl-2 길항제 (예, 소분자)를 Bcl-2의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명의 다른 실시양태는 치료량의 1종 이상의 Bcl-X_L길항제 (예, 소분자)를Bcl-X_L의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 2종 이상의 Bcl-2 군 길항제 (예, 소분자)의 조합을 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 본 발명은 Bcl-2 군 단백질(들) (예, 아폽토시스억제성 Bcl-2 군 단백질)에 대한 1종 이상의 길항제 및 1종 이상의 추가의 항암제 (예, 탁솔, 도세탁셀 등)를 포함하는 조성물 및 방법을 제공하는 것을 추가로 고려한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 대상에게 치료 유효량의 고시폴, 고시폴론, 고시폴의 쉬프 염기, 고시폴론의 쉬프 염기, 및 이러한 화합물의 거울상이성질체 및 제약상 허용되는 염을 제공하는 것을 포함하는 항암 방법 및 조성물을 포함한다.

Bcl-2 및 Bcl-X_L의 3차원 (3D) 구조에 대한 연구는 상기 두 분자가 소수성 결합 포켓 (BH3 결합 포켓이라 부름)을 가짐을 보여주었으며, 이 포켓은 이들의 아폽토시스억제 효과에 있어서 중요하다. 추가의 연구는 Bak, Bad 및 Bax가, 상기 분자가 Bcl-2 및 Bcl-X_L에서 BH3 포켓에 결합하도록 허용하는 결합 도메인 (BH3 결합 도메인이라 부름)을 가짐을 보여준다. 특히, 실험에 의해 Bcl-X_L[S. W. Muchmore et al., Nature, 381:335-341 (1996); and M. Aritomi et al., J. Biol. Chem., 272:27886-27892 (1997)] 단독 및 그와 Bak BH3 (Bcl-2 상동성 도메인 3) 펩티드 [S. Michael et al., Science, 275:983-986 (1997)]와의 결합물의 3D 고 해상도 구조가 결정되었다. Bcl-2 및 Bcl-X_L은 이들 아미노산 서열에서 높은 정도의상동성 (45％의 동일성 및 56％의 유사성)을 공유한다. 표적 단백질 (Bcl-2)과 템플레이트 단백질 (Bcl-X_L) 사이에 30％를 넘는 서열 동일성이 있는 경우, 모델러 (MODELLER)[A. Sali et al., Structure, Function, and Genetics, 23:318-326 (1995)]와 같은 최근의 컴퓨터 상동성 모델링 방법은 표적 단백질의 정확한 3D 구조를 제공한다는 것이 입증되었다 (문헌 [A. Sali, Curr. Opin. Biotech., 6:437-451 (1995)] 참조). 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서 컴퓨터 상동성 모델링을 이용하여, Bcl-X_L(템플레이트 단백질)의 실험에 의한 3D 구조 좌표를 기초로 Bcl-2 (표적 단백질)의 3D 구조를 모델링한다.

Bcl-X_L과 복합체를 이루는 고시폴의 고 해상도 3D NMR 구조 분석은 고시폴이 또한 BH3 결합 포켓을 통해 Bcl-X_L과 결합한다는 것을 보여준다. 실험에 의한 구조 기초의 시험 방법은 고시폴 및 그의 거울상이성질체가 Bcl-X_L의 아폽토시스억제 효과를 강력하게 억제하며, Bcl-2의 아폽토시스억제 효과는 그보다 적은 정도로 억제함을 보여주었다.

따라서, Bcl-2/Bcl-X_L의 아폽토시스억제 기능의 억제는 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 어떤 암의 내성을 극복하기 위한 새로운 유망한 전략을 제공한다.

본 발명은 Bcl-2 군 단백질의 자연 발생적인 소분자 길항제 및 화학적으로 합성된 소분자 길항제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고시폴 유도체, 및 고시폴유도체를 Bcl-2 및 Bcl-X_L단백질의 아폽토시스억제 효과에 대한 길항제로서, 특히 Bcl-2 군 단백질 (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)을 과발현하는 암세포에서 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 예는 다음과 같은 섹션들에 보다 상세히 기재되어 있다: I. Bcl-2 및 Bcl-X_L의 결합 활성; II. Bcl-2 및 Bcl-X_L의 소분자 억제제의 발견을 위한 구조 기초의 연구; III. 암세포주에서 Bcl-2 군 단백질의 특성화; IV. 고시폴은 암세포의 성장 및 증식을 억제한다; V. 고시폴 활성에 대한 제안된 메카니즘; VI. MDA-231 이종이식편 마우스에서 고시폴 단독의 활성 및 고시폴과 통상의 항암제와의 조합의 활성; VII. 고시폴과 조합되거나 공동투여되는 치료제; 및 VIII. 약제 제형, 투여 경로 및 투여 고려사항.

I. Bcl-2 및 Bcl-X _L 의 결합 활성

본 발명의 실시에 있어서 상기 메카니즘에 대한 이해가 필요한 것은 아니며 본 발명이 이에 한정되지도 않지만, Bcl-2 및 Bcl-X_L단백질의 아폽토시스억제 효과는 적어도 부분적으로는 Bak, Bax 및 Bad와 같은 아폽토시스유발성 Bcl-2 군 구성원과 헤테로이합체를 형성할 수 있는 능력으로 인한 것으로 생각된다. 실험에 의한 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 구조는 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 BH1 (Bcl-2 상동성 도메인 1), BH2 및 BH3 도메인이, Bak 또는 Bad BH3 도메인이 결합하는 소수성 결합 포켓 (BH3 결합 포켓)을 형성한다는 것을 보여주었다 (예를 들어, 문헌 [S. W. Muchmore et al., Nature, 381:335-341 (1996); M. Aritomi et al., J. Biol. Chem.,272:27886-27892 (1997); S. Michael et al., Science, 275:983-986 (1997); and A. M. Petros et al., Protein Sci., 9:2528-2534 (2000); and A. M. Petros et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:3012-3017 (2001)] 참조). Bcl-2/Bcl-X_L내의 이러한 결합 포켓은 아폽토시스억제 기능에 필수적이다 (예를 들어, 문헌 [X. M. Yin et al., Nature, 369:321-323 (1994); S. C. Cosulich et al., Curr. Biol., 7:913-920 (1997); S. Michael et al., supra; and A. M. Petros et al., supra] 참조). 따라서, 본 발명은 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L내의 BH3 결합 부위에 결합하는 소분자가 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L과 Bcl-2 단백질 군의 아폽토시스유발성 구성원 (예, Bad, Bak 및 Bax 등)과의 헤테로이합체형성을 차단시켜 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L의 아폽토시스억제 기능을 길항하고, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L이 과발현되는 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있음을 고려한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L의 결합 포켓(들) (예, BH3)에 결합하는 소분자 길항제를 제공한다. 이러한 실시양태의 몇몇에서, 본 발명은 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L의 개시된 소분자 억제제 (예, 고시폴 화합물)와 함께 투여되는 1종 이상의 추가의 항암제 (예, 탁솔 및 도세탁셀 등)를 추가로 제공한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 고시폴 화합물은 아폽토시스를 유도하는 1종 이상의 항암제와의 조합으로 투여된다.

본 발명은 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 소분자 억제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체 및 펩티드와 같은 다른 통상의 이용가능한 단백질 길항제에 비해 더 우수한 경구 이용가능성, 더 우수한 안정성 및 저렴한 비용을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 이점을 갖는다는 것을 고려한다.

II. Bcl-2 및 Bcl-X _L 의 소분자 억제제의 발견을 위한 구조 기초의 연구

본 발명은 대용량 3D 화학 데이타베이스로부터 Bcl-2 및 Bcl-X_L과 같은 아폽토시스억제성 Bcl-2 군 단백질의 소분자 길항제를 확인하기 위해 강력한 구조 기초의 사실상의 스크리닝 방법을 이용하였다. 이러한 연구는 표적 단백질내 결합 부위 (예, Bcl-2 및 Bcl-X_L에서 BH3)에 결합하는 잠재적인 유기 소분자 억제제를 확인하기 위한 컴퓨터 도킹 (docking) 방법을 이용한다. 한 실시양태에서, 도킹 연구에서 통합-원자 근사화 (united-atom approximation)를 이용하여 Bcl-X_L단백질을 처리하였다. 극성 수소만을 상기 단백질에 부가하고, 콜만 (Kollman) 통합-원자의 부분 전하를 할당하였다. 모든 물 분자를 제거하였다. 오토도크 (AutoDock) 유틸리티인 애드솔 (AddSol) (오토도크 웹 페이지, 문헌 [G. Morris et al., J. Computational Chemistry, 19:1639-1662 (1998)] 참조)을 사용하여 원자 용매화 파라미터 및 프래그먼트 부피를 상기 단백질 원자에 할당하였다.

다른 실시양태에서, 모델러 (MODELLER) 상동성 모델링 방법을 이용하여 Bcl-2의 3D 구조를 모델링하였다 [A. Sali et al., Structure, Function, and Genetics, 23:318-326 (1995); and A. Sali, Curr. Opin. Biotech., 6:437-451 (1995)]. BLAST 프로그램을 사용하여 Bcl-2와 Bcl-X_L사이에서 얻어진 서열 정렬은도 1에 제시되어 있으며, 본 발명의 상동성 모델링에서 사용되었다. Bak BH3 펩티드가 Bcl-2 및 Bcl-X_L둘 다와 상당한 친화성으로 결합하기 때문에 (문헌 [J. L. Wang et al., Cancer Res., 60:1498-1502 (2000); and J. L. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:7124-7129 (2000)] 참조), Bak BH3 펩티드와 복합체를 이룬 Bcl-2의 3D 구조는 Bak BH3 펩티드와 복합체를 이룬 Bcl-X_L의 실험에 의한 NMR 구조를 기초로 모델링하였다 [S. Michael et al., Science, 275:983-986 (1997)]. 모델링된 3D 복합 구조를, MSI 차암 (CHARMM) 역장 (force field)과 함께 차암 (CHARMM) 프로그램 [B. R. Brooks et al., J. Comp. Chem., 4,187-217 (1983); and P. V. R. Schleyer et al., CHARMM: The Energy Function and Its Parameterization with an Overview of the Program, in The Encyclopedia of Computational Chemistry, 1:271-277 eds., John Wiley & Sons, Chichester (1998)]을 사용하여 분명한 (explicit) 물에서의 분자 역학 (MD) 시뮬레이션을 통해 추가로 세밀화하였다. Bak BH3 펩티드와 복합체를 이룬 Bcl-2의 세밀한 구조는 도 2에 나타나 있다. 도 2는 Bak BH3 펩티드와 복합체를 이룬 Bcl-2의 전체 구조를 리본 모양으로 나타낸다. 잠재적인 억제제는 생화학적 분석 및 생물학적 분석을 통해 확인한다.

랜덤 스크리닝에 비해, 구조 기초의 3D-데이타베이스 검색은 매우 효과적이며, 비용도 저렴하다. 허벌 메디신 (Herbal medicines)으로부터 확인 및 단리된 약 7,000개의 작은 유기 화합물들을 포함하는 3차원 데이타베이스를 구축하고, 프로그램 DOCK [S. Makino and I. D. Kuntz, J. Comput. Chem. 18:1812-1825 (1997)]를 사용하는 최근의 구조 기초의 데이타베이스 스크리닝에서 사용하였다. 가장 높은 DOCK 점수를 나타내는 상위 250개 화합물들은 잠재적인 Bcl-2 및 Bcl-X_L억제제로서 고려되었다. 먼저 선택된 분자들 중에서, 9개의 화합물들은 시판 공급원으로부터 이용할 수 있었으며, 추가의 시험관내 결합 분석을 위해 입수하였다.

민감하고 정량적인 확립된 시험관내 형광 편광 (FP) 기초의 결합 분석 (문헌 [I. J. Enyedy et al., J. Med. Chem., 44: 313-4324 (2001)] 참조)을 이용하여 잠재적인 비-펩티드 소분자 억제제의 추가 시험을 수행하였다. 이 방법을 이용하여 9개의 후보 화합물들을, Bcl-2와 결합하는데 있어서 Bak BH3 펩티드와 경쟁하는 능력에 대하여 스크리닝하였다. 9개의 화합물들 중에서, 3개의 화합물은 25 μM보다 더 양호한 IC₅₀값을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 천연 Bak BH3 펩티드의 IC₅₀값은 FP 결합 분석에서 0.3 μM인 것으로 밝혀졌다. 상기 확인된 3개의 소분자 각각은 Bcl-2 및 Bak BH3 펩티드의 결합을 차단하는 것으로 나타났다. 고시폴은 Bcl-2에 대해 10 M의 결합 친화성을 가지며 Bak 펩티드와 경쟁하는 것으로 밝혀졌다.

Bcl-X_L및 Bcl-2가 유사한 3D 구조를 갖기 때문에, 잠재적인 Bcl-2 억제제의 몇몇은 또한 Bcl-X_L에 결합할 것이라 생각되었다. 따라서, 추가의 스크리닝 노력은 상기 기술된 FP 기초의 결합 분석을 이용하여 Bcl-X_L의 잠재적인 비-펩티드 소분자 길항제를 발견하는 것에 관한 것이었다.

Bcl-2 및 Bcl-X_L이 둘 다 아폽토시스억제 기능을 갖지만, 이들 두 단백질은 인간의 암에서 상이한 발현 패턴을 갖는다. 또한, Bcl-2 및 Bcl-X_L이 구조적으로 유사한 BH3 결합 부위를 공유하지만, 몇몇 차이점이 있다. Bcl-2의 몇몇 소분자 억제제가 또한 Bcl-X_L에 대해 양호한 결합 친화성을 갖지만, 다른 몇몇 소분자 억제제는 (약한 결합제가 억제제로 여전히 사용될 수 있긴 하지만) Bcl-X_L과 단지 약하게만 결합한다는 것이 밝혀졌다. 상반되게, 비교적 약한 몇몇 Bcl-2 소분자 억제제는 Bcl-X_L에 대해 훨씬 더 높은 결합 효능을 갖는다. 특히, 보통 효능의 Bcl-2 억제제인 고시폴은 Bcl-X_L에 결합하는 효능 활성을 0.4 μM의 IC₅₀값으로 나타낸 것으로 밝혀졌다 (도 3). 도 3은 Bak BH3 펩티드와 Bcl-2 (Bcl-X_L) 사이에서 고시폴에 의한 직접적인 결합 억제를 FP 기초의 결합 분석에 의해 측정하여 나타낸다. 비-FP 표지된 Bak 펩티드는 Bcl-X_L에 대해 0.3 μM의 IC₅₀값을 갖는다.

상기 FP 기초의 Bcl-X_L결합 분석에서, Bak 펩티드는 Bcl-X_L에 대한 결합에서 0.3 μM의 IC₅₀값을 갖는 것으로 결정되었다. 따라서, 고시폴은 Bak 펩티드와 유사한 효능을 갖는 강력한 Bcl-X_L억제제이며, 또한 Bcl-2에 대하여는 보통 효능의 억제제이다.

III. 암세포주에서 Bcl-2 군 단백질의 특성화

Bcl-2 및 Bcl-X_L의 소분자 억제제의 분자 메카니즘을 더 잘 이해하기 위해, Bcl-2 군 단백질의 발현을 미국 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 항암 약물 스크리닝 프로그램으로부터 여러 유방암 세포주 및 다른 암세포주에서 특성화하였다. 5가지 대표적 암세포주 (즉, MDA-MB-231, T-47D, MDA-435 유방암 세포주, HL-60 백혈병 세포주, 및 HT-29 결장암 세포주) 및 1가지 정상 섬유아세포 (WI-38) 세포주로부터의 결과가 도 4에 나타나 있다. HL-60 백혈병 세포주는 가장 높은 수준의 Bcl-2 발현을 나타냈으며, MDA-MB-231 및 MDA-MB-435 유방암 세포주도 매우 높은 수준의 Bcl-2 발현을 나타냈다. 또한, 유방암 세포주인 MDA-MB-231 및 T-47D와, 결장암 세포주인 HT-29는 매우 높은 수준의 Bcl-X_L발현을 나타냈다. 정상 섬유아세포주는 낮은 수준의 Bcl-2 및 Bcl-X_L발현을 나타냈다.

Bcl-2 단백질 군은 프로그래밍된 세포 사멸의 조절자로서 작용한다. 아폽토시스억제성 분자 (예, Bcl-2 및 Bcl-X_L)와 아폽토시스유발성 분자 (예, Bid, Bax, Bak 및 Bad) 사이의 균형은 아폽토시스에 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 이유로, 암세포주인 MDA-MB-231, T-47D, MDA-435, HL-60 및 HT-29, 및 정상의 섬유아세포주인 WI-38에서 아폽토시스유발성 단백질인 Bid, Bax, Bak 및 Bad의 발현 상황을 또한 결정하였다 (도 4). 정상의 섬유아세포주인 WI-38을 비롯한 시험된 모든 세포주는 Bax를 높은 수준으로 발현하며, 암세포주의 대부분은 또한 Bak를 높은 수준으로 발현한다. 다른 세포주들 사이에서 Bid 및 Bad의 발현 수준에 있어서는 상당한 변화가 있다. 종합하면, 시험된 5가지 암세포주는 모두 아폽토시스억제성 및아폽토시스유발성 Bcl-2 군 단백질을 높은 수준으로 나타냈으며, 정상의 섬유아세포주 (WI-38)는 Bcl-2 및 Bcl-X_L을 낮은 수준으로 나타냈지만 아폽토시스유발성 Bcl-2 군 단백질인 Bax 및 Bad를 높은 수준으로 나타냈다.

국립 암 연구소 (NCI)에 의해 항암 약물 스크리닝 연구에서 사용되는 여러 다른 유방암 세포주를 또한 시험하였다. 이러한 세포주로는 BT-549, HS 578T, MCF-7 및 NCI/ADR-Resistant를 들 수 있다. 이들 중에서, MCF-7 및 BT-549는 높은 수준의 Bcl-2 단백질을 포함하지만, BT-549는 또한 높은 수준의 Bcl-X_L단백질을 포함한다. HS 578T 및 NCI/ADR-RES는 중간 수준의 Bcl-X_L단백질을 포함한다. 따라서, 조사된 7가지 인간 유방암 세포주 (즉, MDA-MB-231, T-47D, MDA-435, BT-549, HS 578T, MCF-7, 및 NCI/ADR-Resistant) 중에서 5가지 세포주는 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 어느 하나 또는 둘 다를 높은 수준으로 발현한다. 2가지 유방암 세포주는 Bcl-2 또는 Bcl-X_L을 중간 수준으로 발현한다. 시험된 7가지 유방암 세포주 중에서 어느 것도 Bcl-2 및 Bcl-X_L을 낮은 수준으로 발현하지 않았다.

IV. 고시폴은 암세포의 성장 및 증식을 억제한다

형광 편광 분석 결과는 고시폴이 Bak BH3 펩티드의 Bcl-2 및 Bcl-X_L로의 결합을 치환한다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명은 Bcl-2 또는 Bcl-X_L의 BH3 결합 도메인에 결합하는 소분자 억제제 (예, 고시폴)가 상기 분자의 아폽토시스억제기능을 차단하며, 따라서 상승된 발현 수준의 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L을 포함하는 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 것을 고려한다. 또한, 소분자 억제제 (예, 고시폴)는 높은 발현 수준의 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L을 포함하는 암세포의 생존성 및 증식을 감소시킬 것으로 생각된다. 고시폴은 암, 보다 구체적으로는 인간 유방암 (예, MDA-MB-231)의 세포 증식 (성장)을 억제한다. MDA-MB-231 유방암 세포주는 Bcl-2 및 Bcl-X_L둘 다를 높은 수준으로 발현한다. 고시폴이 MDA-MB-231 세포의 성장을 억제하는 능력을 5일 동안의 MTT 분석에서 시험하였다. 고시폴은 MDA-MB-231 세포의 성장을 2.0 μM의 IC₅₀값으로 억제하는 것으로 나타났다.

20 μM의 고시폴로 24시간 동안 처리한 MB-231 및 WI-38 세포에 대하여 획스트 (Hoechst) 염료 분석에 의해 검출한 결과는 각각 도 5A 및 5B에 나타나 있다. MDA-MB-231 암세포를 고시폴로 처리하면 상기 암세포에서 아폽토시스가 유도되지만, 정상적인 WI-38 섬유아세포에서는 유도되지 않는다. 도 5A는 MDA-231 세포에서의 아폽토시스 유도를 나타낸다. 도 5B는 고시폴 처리가 Bcl-2 및 Bcl-X_L을 낮은 수준 (예, 기저 수준)으로 발현하는 정상적인 WI-38 섬유아세포에서 아폽토시스를 유도하지 않음을 나타낸다.

다른 시험에서 고시폴은, Bcl-X_L을 높은 수준으로 발현하지만 Bcl-2는 낮은 수준으로 발현하는 T-47D 유방암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 고시폴은 Bcl-X_L을 높은 수준으로 발현하는 다른 암세포주, 예를 들어인간 결장암 세포주인 HT-29에서 아폽토시스를 유도하지만, Bcl-2 및 Bcl-X_L을 낮은 수준으로 발현하는 암세포주, 예를 들어 전립선암 세포주인 DU-145에서는 아폽토시스를 유도하지 않는 것으로 나타났다.

어넥신 (Annexin)-V 유동세포계수 (FACS) 분석을 이용하는 다른 시험을 수행하여, MDA-MB-231 유방암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 고시폴의 효능을 보다 정량적으로 평가하였다. 예를 들어, 도 6은 고시폴로 24시간 동안 처리한 인간 MDA-MB-231 유방암 세포에서 고시폴에 의해 유도된 아폽토시스를 어넥신-V 유동세포계수법으로 검출하여 나타낸다. 5.0 μM의 고시폴은 세포의 59％가 아폽토시스를 수행하도록 유도한 것으로 관찰되었다. 고시폴에 의한 아폽토시스의 유도는 투여량 의존적이다. 10 μM 및 20.0 μM에서, 고시폴은 각각 암세포의 74％ 및 96％가 아폽토시스를 수행하도록 유도하였다. MDA-231은 Bcl-2 및 Bcl-X_L둘 다를 과발현한다.

고시폴은 강력한 Bcl-X_L억제제이기 때문에, 본 발명은 고시폴이 높은 수준의 Bcl-X_L및 낮은 수준의 Bcl-2를 포함하는 암세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있음을 고려한다. 실제로, 고시폴은 상기 나타낸 바와 같이 높은 수준의 Bcl-X_L및 낮은 수준의 Bcl-2를 포함하는 인간 T-47D 유방암 세포에서 아폽토시스를 투여량 의존적인 방식으로 유도한다. 도 7은 고시폴로 24시간 동안 처리한 인간 TD-47 암세포에서 아폽토시스의 투여량 의존적 유도를 어넥신-V 유동 세포 계수법으로 검출하여 나타낸다.

상기 시험은 고시폴이 강력한 Bcl-X_L억제제이며, Bcl-X_L을 높은 수준으로 발현 (예를 들어, 정상 세포 예의 경우의 기저 발현 속도에 비해 과발현)하는 암세포가 아폽토시스를 수행하도록 유도하지만, Bcl-2 및 Bcl-X_L을 정상적인 수준으로 발현하는 세포 (예, WI-38)에서는 아폽토시스를 유도하지 않음을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 1종 이상의 고시폴 화합물을 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상이 있는 대상에게 투여하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용하기 위한 것으로 고려되는 고시폴 화합물으로는 (±)-고시폴; (-)-고시폴; (+)-고시폴; (±)-고시폴론; (-)-고시폴론; (+)-고시폴론; (±)-고시폴 아세트산; (-)-고시폴 아세트산; (+)-고시폴 아세트산; (±)-에틸 고시폴; (-)-에틸 고시폴; (+)-에틸 고시폴; (±)-헤미고시폴론; (-)-헤미고시폴론; (+)-헤미고시폴론; (±)-고시폴의 쉬프 염기; (-)-고시폴의 쉬프 염기; (+)-고시폴의 쉬프 염기; (±)-고시폴론의 쉬프 염기; (-)-고시폴론의 쉬프 염기; (+)-고시폴론의 쉬프 염기; (±)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (-)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (+)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기; (±)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (-)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (+)-에틸 고시폴의 쉬프 염기; (±)-헤미고시폴론의 쉬프 염기; (-)-헤미고시폴론의 쉬프 염기; 및 (+)-헤미고시폴론의 쉬프 염기, 및 상기 고시폴 분자의 고시폴 유도체, 대사산물 및 제약상 허용되는 염이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

특히 바람직한 실시양태에서, (-)-고시폴 거울상이성질체 (그의 유도체, 대사산물, 쉬프 염기 및 제약상 허용되는 염 등)를 환자에게 투여한다.

(-)-고시폴 및 (+)-고시폴 거울상이성질체의 결합에 대한 NMR 분석은 (-)-고시폴 거울상이성질체 및 (+)-고시폴이 둘 다 Bcl-X_L에 결합한다는 것을 결론적으로 보여준다 (도 8A 및 8B).

도 9는 MDA-MB-231 (2-LMP) 유방암 세포주에서 (-)-고시폴 거울상이성질체, (+)-고시폴 거울상이성질체 및 라세미체 고시폴을 비교하는 성장 억제 실험으로부터의 데이타를 나타낸다 (3000/200 ㎕/웰, MTT 분석 이용, 5 일; 라세미체 고시폴 IC₅₀3.2 μM; (-)-고시폴 IC₅₀1.7 μM; 및 (+)-고시폴 IC₅₀10 μM). 상기 연구는 인간에서 (+)-고시폴 거울상이성질체의 제거 T_1/2이 (-)-고시폴의 29배라는 것을 보여주었다. 따라서, (+)-고시폴 거울상이성질체는 (-)-고시폴 거울상이성질체보다 잠재적으로 보다 독성을 띤다. 따라서, 몇몇 실시양태에서 본 발명은 (-)-고시폴 거울상이성질체의 투여가 고시폴 또는 (+)-고시폴 거울상이성질체의 라세미체 형태보다 잠재적으로 독성이 적음을 고려한다.

다른 실시양태에서, (-)-고시폴은 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 두부-경부 암에 걸린 환자에게 (수퍼-G) 투여된다. 하기 제시된 표 1은 (-)-고시폴 및 시스플라틴 (두부-경부 암에 대한 표준 치료제)에 의한 다수의 두부-경부 암세포주의 세포 성장 억제를 비교한다. 표 1은 (-)-고시폴이 증가된 Bcl-X_L단백질을 포함하는 인간 두부-경부 암세포주에서 암세포의 성장을 강력하게 억제함을보여준다. 이러한 암세포주는 두부-경부 암의 치료를 위한 표준 화학 요법제인 시스플라틴에 대해 매우 내성이 있다.

	수퍼-G(IC₅₀, μM)	Bcl-X_L	Bcl-2	시스플라틴(IC₅₀, μM)
UM-SCC-23	1.5	+++	-	25
UM-SCC-1	1.5	+++	-	30
UM-SCC-25	8	+	-	43

V. 고시폴 활성에 대한 제안된 메카니즘

본 발명의 실시에 있어서 상기 메카니즘에 대한 이해가 필요한 것은 아니며 본 발명이 이에 한정되지도 않지만, Bcl-2/Bcl-X_L매개 아폽토시스 경로에서 주요 분자의 하나는 시토크롬-c (Cyt-c)인 것으로 고려된다. 따라서, Bcl-2/Bcl-X_L의 주요 기능의 하나는 Bax, Bak 또는 Bad와 헤테로이합체를 형성하여 미토콘드리아로부터 Cyt-c의 방출을 차단하는 것으로 생각된다. 즉, 암세포에서 Cyt-c가 미토콘드리아로부터 세포질로 방출되도록 유도하는 고시폴의 능력을 시험하였다. 유방암 세포주인 MDA-231 및 T47D를 5 μM 내지 20 μM의 고시폴로 24시간 동안 처리하였다. 도 11은 MDA-231 및 T47D 유방암 세포주 둘 다에 20 μM의 고시폴을 처리한 후, Cyt-c가 미토콘드리아로부터 세포질로 방출되었음을 나타낸다 (HM, Cyt-c는 두꺼운 막에 존재하며, Cytosol, Cyt-c는 세포질에 존재함).

어떤 특정 메카니즘에 한정하려는 것은 아니지만, Cyt-c가 미토콘드리아로부터 방출되는 경우에 Bcl-2 매개 아폽토시스는 카스파제 (예, 카스파제-3 및 카스파제-9) 활성화를 수반하는 것이 또한 고려된다. 따라서, 고시폴이 카스파제-3을 활성화하는지를 결정하기 위한 시험을 수행하였다. 고시폴 처리로부터 12시간 또는 24시간 후에 MDA-231 유방암 세포의 용해물 중 카스파제-3 절단물의 양을 측정하였다. 도 12는 카스파제-3이 고시폴 처리 이후에 투여량 의존적인 방식으로 17 kD 및 21 kD 크기의 단편들로 절단되었음을 나타낸다. 고시폴로 처리한 T-47D 인간 유방암 세포 및 HT-29 결장암 세포에서 유사한 결과를 얻었으며, 이들 세포는 둘 다 처리 이후에 Bcl-X_L을 높은 수준으로 발현하며 Bcl-2는 비교적 낮은 수준으로 발현한다. 대조적으로, Bcl-2 및 Bcl-X_L을 낮은 수준으로 발현하는 인간 DU-145 전립선 암세포를 5 μM, 10 μM 또는 20 μM의 고시폴로 24시간 동안 처리한 결과, 카스파제-3의 활성화에 영향을 주지 않았다. 따라서, 고시폴에 의한 카스파제-3의 활성화는 암세포에서 Bcl-X_L의 발현 수준에 대해 특이적이며 그와 상관관계에 있다.

VI. MDA-231 이종이식편 마우스에서 고시폴 단독의 활성 및 고시폴과 통상의 항암제와의 조합의 활성

고시폴 화합물의 항암 치료제로서의 가능성을 누드 (nude) 마우스의 인간 유방암 MDA-MB-231 (서브클론 2LMP) 이종이식편 모델에서 추가로 평가하였다. 마우스 종양의 직경이 8 내지 10 mm에 이르렀을 때인 7일째, 고시폴 처리 요법을 시작하였다. 각 처리 군은 10개의 인간 종양 (각 측면상에 1개의 종양)을 보유하는 5마리의 마우스를 포함하였다. 대조군은 고시폴을 투여하지 않은 5마리의 마우스를 포함하였다. 처리된 마우스에서, 고시폴을 2가지 다른 경구 투여량, 즉 30 mg/kg 및 90 mg/kg의 투여량으로 3주 동안 매일 투여하였다. 29일째, 30 mg/kg 및 90 mg/kg의 일일 투여량 둘 다에서는 95％를 넘는 신뢰 수준에서 고시폴에 의해 종양 성장이 70％ 넘게 억제되는 것으로 나타났다. 고시폴로 처리한 마우스에서 체중 감소 또는 사망은 관찰되지 않았다. 30 mg/kg 및 90 mg/kg의 투여량에서 고시폴의 항암 활성에서 어떤 유의한 차이는 없는 듯이 보였다. 이러한 결과는 고시폴 30 mg/kg을 매일 투여하면 고시폴 요법을 보조제 또는 추가의 항암 화합물 또는 요법으로 보충하지 않아도 종양 성장을 성공적으로 억제한다는 것을 시사한다.

Bcl-X_L의 과발현은 암세포를 몇몇 통상의 항암 요법 (예, 도세탁셀)에 의해 유도되는 아폽토시스로부터 보호하는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태는 유효량(들)의 고시폴 (및 그의 거울상이성질체, 유도체 및 제약상 허용되는 염)을 1종 이상의 통상의 항암 요법 (예, 화학 요법제, 예컨대 도세탁셀, 및(또는) 방사선 요법)과 조합하여 투여하는 방법을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 고시폴을 1종 이상의 통상의 항암 요법과의 조합으로 투여하여 Bcl-2 군 단백질 (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)의 과발현을 특징으로 하는 질환 (예, 암)을 치료한다.

본 발명의 실시에 있어서 상기 메카니즘에 대한 이해가 필요한 것은 아니며 본 발명이 이에 한정되지도 않지만, 1종 이상의 고시폴 화합물을 통상의 항암 요법(예, 화학 요법제, 예를 들어 도세탁셀)과 조합하여 투여하는 것은 통상의 항암 요법에 내성이 있는 Bcl-2 군 단백질 (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)을 높은 수준으로 발현하는 암세포가 고시폴 및(또는) 추가의 항암제 (예, 도세탁셀)를 사용하는 처리에 대해 민감해지게끔 만드는 것으로 고려된다. 그러나, 본 발명은 고시폴 화합물과 항암 치료제의 어떤 특정 조합의 투여에 한정되지 않으며, 투여되는 물질들의 어떤 특정 순서 또는 수준에도 한정되지 않는다.

고시폴은 약 30 mg/kg의 일일 투여량에서 종양의 성장을 상당히 억제하기 때문에, 이러한 투여량 수준을 선택하여 고시폴과 다른 통상의 항암 치료제와의 조합을 시험하였다. 10마리의 마우스로 이루어진 군에게 7일째에 시작하여 4주 동안 계속 고시폴을 30 mg/kg의 일일 투여량으로 경구 투여하였다. 또한, 동일한 10마리의 마우스에게 7일째에 시작하여 3주 동안 도세탁셀 (7.5 mg/kg)을 매주 복강내 투여하였다. 이 실험 결과는 도 13에 나타나 있다. 특히, 도 13은 인간 유방암 이종이식편 MDA-MB-231 누드 마우스에서 고시폴 단독, 도세탁셀 단독 또는 이들의 조합에 의한 종양 성장 억제를 나타낸다. 각 실험 군은 10마리의 동물을 포함한다. 도 13은 고시폴 단독 (일일 투여량 30 mg/kg) 또는 도세탁셀 단독을 최적에 준하는 투여량 (주당 7.5 mg/kg)으로 투여하자 시험 동물에서 종양 성장이 상당히 억제되었지만, 고시폴 및 도세탁셀의 조합 요법을 받은 시험 동물에서는 종양 성장이 훨씬 더 많이 억제되었음을 보여준다. 중요하게도, 이 군에서 고시폴 및 도세탁셀의 조합으로 처리한 10마리의 마우스 중 3마리 (6개의 종양)에서 완전한 종양퇴화가 나타났다. 전반적으로, 조합 요법 군에서는 대조군에 비해 종양 성장이 90％ 넘게 억제되었다. SAS (문헌 [G. Verbeke and G. Molenberghs, Linear mixed models in practice: An SAS-orientated approach, Springer-Verlag, vol. 126 (1997)] 참조) 프로그램을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 결과는 하기 나타낸 표 2에 제시되어 있다.

	대조군	고시폴	도세탁셀
고시폴	0.008^*(0.06⁺⁺)
도세탁셀	0.003(0.01)
고시폴 + 도세탁셀	0.00001(0.0000004)	0.005(0.009)	0.01(0.002)
^*41일⁺⁺47일

상기 결과는 연구 41일 및 47일째 둘 다에서 고시폴 및 도세탁셀의 항암 활성이 대조군에 비해 통계적으로 유의함을 나타낸다. 또한, 고시폴 및 도세탁셀 조합의 항암 활성은 대조 (비처리) 군 및 고시폴 단독 또는 도세탁셀 단독 처리군에 비해 유의하다. 종합하면, 상기 데이타로부터 고시폴이 단독으로 유의한 항암 활성을 갖지만, 몇몇 실시양태에서는 통상의 항암제 (예, 화학 요법제, 예를 들어 도세탁셀)와 조합하여 투여하는 경우 훨씬 더 큰 항암 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서 상기 메카니즘에 대한 이해가 필요한 것은 아니며 본 발명이 이에 한정되지도 않지만, 통상의 항암제와 고시폴 화합물의 어떤 조합에서 관찰되는 상승 효과는 상기 두 화합물의 상이한 작용 메카니즘 (예를 들어, 고시폴에 의한 Bcl-X_L의 활성 억제 및 도세탁셀에 의한 미세관 (microtubule)의 표적화)으로 인한 것으로 고려된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 실시에 있어서 상기 메카니즘에 대한 이해가 필요한 것은 아니며 본 발명이 이에 한정되지도 않지만, 통상의 항암제와 고시폴 화합물의 어떤 조합에서 관찰되는 상승 효과는 상기 두 화합물의 유사한 작용 메카니즘 (예를 들어, 고시폴 및 1종 이상의 추가의 항암제 둘 다에 의한 Bcl-X_L의 활성 억제)으로 인한 것으로 고려된다.

예를 들어, 한 실시양태에서 통상의 항암 치료제인 탁솔과 공동투여되는 (-)-고시폴 거울상이성질체는 상승작용의 이점을 제공한다. 도 14는 (-)-고시폴 거울상이성질체와 탁솔의 공동 투여에 의한 상승 효과를 나타낸다. 요컨대, 이 실험에서는 MCF-7 유방암 세포주에서 (-)-고시폴 거울상이성질체 및 (+)-고시폴 거울상이성질체 대 탁솔을 각각 100:1의 비율로 사용하였다 ((-)-고시폴 IC₅₀8.71 μM; (+)-고시폴 IC₅₀22.88 μM; 탁솔 + (-)-고시폴 IC₅₀2.755 μM; 및 탁솔 + (+)-고시폴 IC₅₀10.57 μM). 유사하게, 도 15A 및 15B는 (-)-고시폴과 탁솔 사이 및 (+)-고시폴과 탁솔 사이에 매우 강한 상승작용이 있음을 나타내는 조합 지수를 제공한다. 도 16은 고시폴론의 Bcl-X_L로의 결합을 나타낸다. 도 17은 (-)-고시폴의 에틸 쉬프 염기의 결합을 나타낸다.

VII. 고시폴과 조합되거나 공동투여되는 치료제

본 발명에는 넓은 범위의 치료제가 사용된다. 본 발명에는 고시폴 화합물과 공동투여되거나 고시폴 화합물과 관련될 수 있는 임의의 치료제를 사용하는 것이 적합하다.

본 발명의 몇몇 실시양태는 유효량의 고시폴 (및 그의 거울상이성질체, 유도체 및 제약상 허용되는 염) 및 1종 이상의 항암제 (예, 통상의 항암제, 예를 들어 화학 요법 약물, 및(또는) 방사선 요법)를 대상에게 투여하는 방법을 제공한다. 이러한 실시양태 중 몇몇에서, 대상은 Bcl-2 군 단백질 (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)의 세포내 과발현을 특징으로 하는 질환을 앓는다.

본 발명에 사용하기에 적합한 항암제 메카니즘은 아폽토시스를 유도하는 물질, 핵산 손상을 유도(유발)하는 물질, 핵산 합성을 억제하는 물질, 미세관 형성에 영향을 주는 물질, 및 단백질 합성 또는 안정성에 영향을 주는 물질이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항암제 종류로는 1) 미세관 억제제 (예, 빈크리스틴 (Vincristine), 빈블라스틴 (Vinblastine) 및 빈데신 (Vindesine) 등), 미세관 안정화제 (예, 파클리탁셀 (Paclitaxel)[탁솔, Taxol], 및 도세탁셀 (Docetaxel) 등)를 포함하는 알칼로이드, 및 토포이소머라제 저해제, 예를 들어 에피포도필로톡신 (예, 에토포시드 (Etoposide)[VP-16] 및 테니포시드 (Teniposide)[VM-26] 등), 및 토포이소머라제 I을 표적화하는 물질 (예, 캄프토테신 (Camptothecin) 및 이시리노테칸 (Isirinotecan)[CPT-11] 등)을 포함하는 크로마틴 기능 저해제, 2) 니트로겐 머스타드 (예, 메클로레타민 (Mechlorethamine), 클로람부실 (Chlorambucil), 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 이포스파미드 (Ifosphamide) 및 부술판 (Busulfan)[밀레란, Myleran] 등), 니트로소우레아 (예, 카르무스틴 (Carmustine), 로무스틴 (Lomustine) 및 세무스틴 (Semustine) 등) 및 다른 알킬화제 (예, 다카르바진 (Dacarbazine), 히드록시메틸멜라민 (Hydroxymethylmelamine), 티오테파 (Thiotepa) 및 미토시신 (Mitocycin) 등)를 포함하는 공유 DNA-결합 물질 [알킬화제], 3) 핵산 억제제 (예, 닥티노마이신 (Dactinomycin)[액티노마이신 D, Actinomycin D] 등), 안트라시클린 (예, 다우노루비신 (Daunorubicin)[다우노마이신 (Daunomycin) 및 세루비딘 (Cerubidine)], 독소루비신 (Doxorubicin)[아드리아마이신, Adriamycin], 및 이다루비신 (Idarubicin)[이다마이신, Idamycin] 등), 안트라세네디온 (예, 안트라시클린 유사체, 예를 들어 미톡산트론 [Mitoxantrone] 등), 블레오마이신 (Blenoxane) 및 플리카마이신 (미트라마이신, Mithramycin) 등을 포함하는 비공유 DNA-결합 물질 [항종양 항생제], 4) 안티폴레이트 (예, 메토트렉세이트 (Methotrexate), 폴렉스 (Folex) 및 멕세이트 (Mexate) 등), 퓨린 항-대사산물 (예, 6-메르캅토퓨린 (Mercaptopurine)[6-MP, 퓨리네톨 (Purinethol)], 6-티오구아닌 (Thioguanine)[6-TG], 아자티오프린 (Azathioprine), 아시클로비어 (Acyclovir), 갠시클로비어 (Ganciclovir), 클로로데옥시아데노신 (Chlorodeoxyadenosine), 2-클로로데옥시아데노신 (Chlorodeoxyadenosine)[CdA], 및 2'-데옥시코포르마이신 (Deoxycoformycin)[펜토스타틴, Pentostatin] 등), 피리미딘 길항제 (예, 플루오로피리미딘 [예, 5-플루오로우라실 (아드루실, Adrucil), 5-플루오로데옥시우리딘 (FdUrd)(플록수리딘, Floxuridine)] 등) 및 시토신 아라비노시드 (예, 시토사르 (Cytosar)[ara-C] 및 플루다라빈 (Fludarabine) 등)를 포함하는 항-대사산물, 5) L-아스파라기나제를 포함하는 효소 및 히드록시우레아 등, 6) 글루코코르티코이드, 예를 들어 항-에스트로겐 (예, 타목시펜 (Tamoxifen) 등), 비-스테로이드 항-안드로겐 (예, 플루타미드 (Flutamide) 등)을 포함하는 호르몬, 및 아로마타제 저해제 (예, 아나스트로졸 [아리미덱스, Arimidex] 등), 7) 백금 화합물 (예, 시스플라틴 (Cisplatin) 및 카르보플라틴 (Carboplatin) 등), 8) 항암 약물, 독소 및(또는) 방사성핵종 등과 연결된 모노클로날 항체, 9) 생물학적 반응 변경제 (예, 인터페론 [예, IFN-α등] 및 인터루킨 [예, IL-2 등] 등), 10) 수동 면역요법, 11) 조혈 성장 인자, 12) 종양 세포 분화 유도제 (예, 모든-트랜스-레틴산 등), 13) 유전자 요법 기술, 14) 안티센스 요법 기술, 15) 종양 백신, 16) 종양 전이에 대하여 지시된 요법 (예, 바티미스타트 (Batimistat) 등), 및 17) 혈관신생 억제제를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 아폽토시스를 유도하는 유효량의 고시폴 및 1종 이상의 통상의 항암제를 대상에게 투여하는 방법을 제공한다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 대상은 Bcl-2 군 단백질(들) (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)의 과발현을 특징으로 하는 질환을 앓는다. 바람직한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은유효량의 고시폴 및 탁산 (예, 도세탁셀 (Docetaxel))을 Bcl-2 군 단백질(들) (예, Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)의 과발현을 특징으로 하는 질환에 걸린 대상에게 투여하는 방법을 제공한다.

탁산 (예, 도세탁셀 (Docetaxel))은 효과적인 항암 화학 요법제의 한 종류이다 (예를 들어, 문헌 [K. D. Miller and G. W. Sledge, Jr. Cancer Investigation, 17:121-136 (1999)] 참조). 본 발명을 어떤 특정 메카니즘에 한정하려는 것은 아니지만, 탁산의 매개에 의한 세포 사멸은 세포내 미세관 안정화 및 이후의 아폽토시스 경로의 유도를 통해 진행하는 것으로 생각된다 (예를 들어, 문헌 [S. Haldar et al., Cancer Research, 57:229-233 (1997)] 참조). 많은 시스템에서, Bcl-2 및 Bcl-X_L은 상기 경로에서 음성 조절자로서 기능한다.

다른 몇몇 실시양태에서, 시스플라틴 및 탁솔은 고시폴 화합물과 함께 사용하기 위해 특별히 고려된다. 시스플라틴 및 탁솔이 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하는 작용은 잘 정의되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Lanni et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9679 (1997); Tortora et al., Cancer Research 57:5107 (1997); and Zaffaroni et al., Brit. J. 암 77:1378 (1998)] 참조). 그러나, 상기 화학 요법제 및 다른 화학 요법제를 사용하는 처리에서는 상당한 독성이 나타나는 것을 막기가 어렵다. 현재 사용되는 치료제는 일반적으로 불량한 수용성, 상당한 독성을 나타내며, 질병에 걸린 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 영향을 주는 투여량으로 제공된다. 예를 들어, 발견된 가장 유망한 항암 화합물들 중 하나인 파클리탁셀(Taxol)은 불량한 수용성을 나타낸다. 파클리탁셀은 B16 흑색종, L1210 백혈병, MX-1 유방 종양 및 CS-1 결장 종양 이종이식편과 같은 폭넓게 다양한 종양 모델에서 우수한 항종양 활성을 나타냈다. 그러나, 파클리탁셀의 불충분한 수용성은 인간에 대한 투여시 문제를 일으킨다. 따라서, 현재 사용되는 파클리탁셀 제제는 이 약물을 용해시키는 크레마포르 (cremaphor)를 필요로 한다. 인간에 대한 임상 투여량 범위는 200 mg 내지 500 mg이다. 이러한 투여량은 에탄올:크레마포르의 1:1 용액 중에 용해되며, 정맥내로 투여되는 유체 1리터로 희석된다. 현재 사용되는 크레마포르는 폴리에톡실레이트화 캐스터유이다. 이는 크레마포르 혼합물 중에 용해시키고 큰 부피의 수성 비히클로 희석시켜 주입법으로 제공한다. 직접적인 투여 (예, 피하 투여)는 국소적인 독성 및 낮은 수준의 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 시스플라틴 및(또는) 탁솔을 대상에게 전달한 후, 치료 성과를 모니터링하는 기회를 제공한다. 예를 들어, 상기 약물이 시험관내에서 아폽토시스를 유도하는 능력의 측정은 생체내 효능에 대한 마커인 것으로 보고된다 [Gibb, Gynecologic Oncology, 65:13 (1997)]. 따라서, 효과적인 항-종양 요법을 제공하고 독성을 감소시키는 상기 약물들 중 하나 또는 둘 다를 표적화하여 전달하는 것 이외에도, 아폽토시스의 유도를 모니터링하는 본 발명의 기술에 의해 치료 효과를 평가할 수 있다. 중요하게는, 상기 두 치료제는 유방암 및 결장암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 넓은 범위의 종양 유형에 대해 활성이 있다 [Akutsu et al., Eur. J. Cancer 31A:2341 (1995)].

본 발명에서는 암 치료에서 일상적으로 사용되는 임의의 약제가 사용된다.개시된 고시폴 화합물과 함께 투여하기에 적합한 통상의 항암제로는 아드리아마이신, 5-플루오로우라실, 에토포시드, 캄프토테신, 액티노마이신-D, 미토마이신 C, 또는 보다 바람직하게는 시스플라틴이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 약제를 본원에 기재된 면역 요법제와 조합하여 조합된 치료 조성물 또는 키트로서 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 치료제 고시폴 화합물의 처리는 핵산 (예, DNA)과 직접 가교결합하여 DNA 손상을 촉진시키는 1종 이상의 물질을 추가로 포함하여 본 발명의 상승작용성 항종양제를 형성시킨다. 시스플라틴과 같은 약제 및 다른 DNA 알킬화제를 사용할 수 있다. 시스플라틴은 총 3가지 과정으로 매 3주마다 5일 동안 임상에서 사용되는 20 mg/M²의 유효 투여량으로 암을 치료하는데 널리 사용되어 왔다. 본 발명의 조성물은 정맥내 주사, 피하 주사, 종양내 주사, 복강내 주사 또는 국소 주사 (예, 점막 표면)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법을 통해 전달할 수 있다.

또한, DNA를 손상시키는 물질로는 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물이 포함된다. 이러한 화학 요법 화합물로는 독소루비신으로도 알려져 있는 아드리아마이신, 에토포시드, 베라파밀 및 포도필로톡신 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 화합물은 신생물 (neoplasm)의 치료를 위해 임상에서 널리 사용되며, 볼루스 (bolus) 주사를 통해 아드리마이신의 경우 21일 간격으로 25 mg/M²내지 75 mg/M²범위의 투여량으로 정맥내 투여하거나, 에토포시드의 경우 35 mg/M²내지 50 mg/M²범위의 투여량으로 정맥내 투여하거나 또는 경구 투여의 경우 정맥내 투여량을 두배로 하여 투여한다.

핵산 전구체 및 서브유닛의 합성 및 충실도 (fidelity)를 파괴하는 물질은 또한 DNA 손상을 초래하며, 본 발명에서 화학 요법제로서 사용된다. 다수의 핵산 전구체가 개발되어 왔다. 폭넓은 시험을 수행한, 쉽게 이용가능한 물질들이 특히 유용하다. 그래서, 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 물질이 종양성 조직에서 우선적으로 사용되며, 이로서 이 물질은 종양성 세포로 표적화하는데 있어서 특히 유용해진다. 전달되는 투여량은 3 mg/kg/일 내지 15 mg/kg/일의 범위일 수 있지만, 투여량은 질병의 단계, 요법에 대한 세포의 순응성, 및 물질에 대한 내성 정도 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 상당히 달라질 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 항암제는 개시된 고시폴 화합물과 공동투여에 순응성이거나 또는 개시된 고시폴 화합물과 관련되는 항암제로서 항암 효과의 충실도의 감소 없이 대상, 조직 또는 세포로 전달될 수 있다. 백금 착물, 베라파밀, 포도필로톡신, 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 비술판, 니토로소우레아, 아드리아마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드 (VP16), 타목시펜, 탁솔, 트랜스플라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트 등의 암치료제 및 다른 유사한 항암제에 대한 보다 상세한 설명을 위해, 당업자라면 문헌[Physician's Desk reference] 및 [Goodman and Gilman's "Pharmaceutical Basis of Therapeutics" ninth edition, Eds. Hardman et al., 1996]을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다수의 지침서를 참고할 것이다.

몇몇 실시양태에서, 상기 약물은 광절단가능한 링커 (linker)를 사용하여 고시폴 화합물에 부착된다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 여러가지 이종이관능성의 광절단가능한 링커는 문헌 [Ottl et al., Bioconjugate Chem, 9:143 (1998)]에 기재되어 있다. 이들 링커는 수용성이거나 유기 가용성일 수 있다. 이들은 아민 또는 알콜과 반응할 수 있는 활성화된 에스테르를 함유하고, 티올기와 반응할 수 있는 에폭시드를 함유한다. 상기한 2개 기 사이에 존재하는 3,4-디메톡시-6-니트로페닐 광이성질체화 기는 근자외선 광 (365 nm)에 노출될 경우에 아민 또는 알콜을 원래의 형태로 방출한다. 따라서, 치료제는 상기 링커에 의해 본 발명의 조성물에 연결되는 경우 대상 부위가 근자외선 광에 노출됨으로써 생물학적으로 활성이거나 활성화가능한 형태로 방출될 수 있다.

예시적인 실시양태에서, 탁솔의 알콜기는 유기 가용성 링커의 활성화된 에스테르와 반응한다. 이어서, 이 생성물은 적절한 덴드리머 (dendrimer)의 부분적으로 티올화된 표면과 반응한다 (덴드리머의 1차 아민은, 화학량론보다 적은 양의 2-이미노티올라노와의 반응에 의해 부분적으로 티올 함유기로 전환될 수 있음). 시스플라틴의 경우, 상기 약물의 아미노기는 수용성 형태의 링커와 반응한다. 아미노기가 충분히 반응성이 아닌 경우에는, 시스플라틴의 1차 아미노-함유 활성 유사체, 예를 들어 Pt(II) 술파디아진 디클로라이드 ([Pasani et al., Inorg. Chim.Acta 80:99 (1983)] 및 [Abel et al., Eur. J. Cancer 9:4 (1973)])를 사용할 수 있다. 이와 같이 연결된 상기 약물은 불활성이고, 정상 세포에 해롭지 않다. 상기 결합물이 종양 세포내에 국한된 경우, 이를 적당한 근자외선 파장의 레이저 광에 노출시켜 활성 약물이 세포 내로 방출되도록 한다.

유사하게, 본 발명의 다른 실시양태에서 시스플라틴 (또는 그의 유사체)의 아미노기는 매우 소수성인 광절단가능한 보호기, 예를 들어 2-니트로벤질옥시카르보닐기와 연결된다 [Pillai, V.N.R. Synthesis: 1-26 (1980)]. 상기 소수성기는 근자외선 광 (약 365 nm)에 노출될 경우에 절단되어 원형 약물이 방출된다. 상기 약물 자체는 친수성이기 때문에, 이는 덴드리머를 벗어나 종양 세포 내로 확산되며, 여기서 아폽토시스를 개시한다.

광절단가능한 링커에 대한 대안은 효소 절단가능한 링커이다. 수많은 광절단가능한 링커가 효과적인 항-종양 결합물로서 입증되어 왔고, 독소루비신 등과 같은 암 치료제를 적당하게 짧은 펩티드 링커를 통해 수용성 중합체에 부착시켜 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Vasey et al., Clin. Cancer Res., 5:83 (1999)] 참조). 링커는 세포 밖에서 안정하지만, 일단 세포 내에 존재하게 되면 티올프로테아제에 의해 절단된다. 바람직한 실시양태에서는 결합물 PK1을 사용한다. 광절단가능한 링커 전략에 대한 대안으로서, 효소 분해가능한 링커, 예를 들어 Gly-Phe-Leu-Gly를 사용할 수 있다.

본 발명은 치료 기술의 특성에 의해 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 다른 결합물의 예로는 BNCT용의 연결된 붕소 더스터 (boron duster) [Capala etal, Bioconjugate Chem., 7:7 (1996)]의 사용, 방사성동위원소의 사용 및 리신 등의 독소 결합물 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서는 항미생물 치료제를 치료제로서 사용할 수도 있다. 미생물을 사멸시키거나, 그의 기능을 억제 또는 감쇠시키는 임의의 물질뿐 아니라, 이러한 활성을 보유하는 것으로 여겨지는 임의의 물질도 사용할 수 있다. 항미생물제로는 예를 들어 천연 및 합성 항생제, 항체, 억제 단백질, 안티센스 핵산, 막 파괴제 등의 단독 또는 이들의 조합 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 실제로, 항-박테리아제, 항-바이러스제 및 항-진균제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 항생제를 사용할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 다른 성분은 특정 세포 유형 (예를 들어 종양 세포)을 특이적으로 표적화할 수 있는 표적화제와 결합된 고시폴 화합물 (고시폴 화합물-표적화제 복합체)이다. 일반적으로, 표적화제와 결합된 고시폴 화합물은 표적화제와 세포 표면 잔기와의 상호작용을 통해 종양성 세포를 표적화하며, 수용체-매개 엔도사이토시스 (endocytosis)를 통해 세포에 흡수된다.

표적 세포 (예를 들어 종양 세포)의 표면에 위치하는 것으로 알려진 임의의 잔기를 본 발명에 사용한다. 예를 들어, 이러한 잔기에 대해 지시된 항체는 본 발명의 조성물을 상기 잔기를 함유하는 세포 표면에 표적화시킨다. 별법으로, 표적화 잔기는 세포 표면에 존재하는 수용체에 대해 지시된 리간드일 수 있고, 또는 그 반대일 수 있다. 유사하게, 비타민을 사용하여 본 발명의 치료제를 특정 세포에 표적화할 수도 있다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 표적화 잔기는 표적화제 (리간드)가 예를 들어 암성배아 (carcinoembryonic) 항원, 전립선 특이적 항원, 티로시나제, ras, 시알릴 루이스 항원, erb, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, MN, gp100, gp75, p97, 프로테이나제 3, 뮤신, CD81, CID9, CD63, CD53, CD38, CO-029, CA125, GD2, GM2 및 O-아세틸 GD3, M-TAA, M-fetal 또는 M-urinary 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 특이적 항원과 결합하도록 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 특정 종양을 확인하기 위한 물질로서 기능할 수도 있다. 별법으로, 표적화 잔기는 종양 억제제, 사이토카인, 케모카인 (chemokine), 종양 특이적 수용체 리간드, 수용체, 아폽토시스 인듀서 (inducer) 또는 분화제일 수 있다.

표적화에 고려되는 종양 억제제 단백질로는 p16, p21, p27, p53, p73, Rb, 윌름스 (Wilms) 종양 (WT-1), DCC, 신경섬유종증 1형 (NF-1), 폰 힙펠-린도우 (von Hippel-Lindau) (VHL)병 종양 억제제, 마스핀, 브러쉬 (Brush)-1, BRCA-1, BRCA-2, 다발성 종양 억제제 (MTS), 인간 흑색종의 gp95/p97 항원, 신장 세포 암종-관련 G250 항원, KS 1/4 pan-암종 항원, 난소 암종 항원 (CA125), 전립선 특이적 항원, 흑색종 항원 gp75, CD9, CD63, CD53, CD37, R2, CD81, CO029, TI-1, L6 및 SAS 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 물론, 이들은 단지 예시적인 종양 억제제에 불과하며, 본 발명은 당업자에게 종양 억제제로 공지되어 있거나 종양 저해제로 공지될 임의의 다른 물질과 함께 사용될 수 있다고 여겨진다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 표적화는 종양유전자 (예를 들어bcl-2및(또는)bcl-X _L )에 의해 발현된 인자에 대해 지시된다. 이들로는 티로신 키나제 (막-결합 형태 및 세포질 형태 모두), 예를 들어 Src 군 구성원, 세린/트레오닌 키나제, 예를 들어 Mos, 성장 인자 및 수용체, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자 (PDDG), SMALL GRPase (G 단백질), 예를 들어ras군, 사이클린-의존성 단백질 키나제 (cdk),myc군 구성원, 예를 들어c-myc,N-myc,L-myc및bcl-2군 구성원 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명과 관련하여 사용되는 수용체 및 그들의 관련 리간드로는 폴레이트 수용체, 아드레날린성 수용체, 성장 호르몬 수용체, 황체형성 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 표피 성장 인자 수용체 및 섬유아세포 성장 인자 수용체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 표적화 측면에 사용되는 호르몬 및 그들의 수용체로는 성장 호르몬, 프롤락틴, 태반 락토겐, 황체형성 호르몬, 여포-자극 호르몬, 융모막 고나도트로핀, 티로신-자극 호르몬, 렙틴, 아드레노코르티코트로핀 (ACTH), 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, α-엔도르핀, α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH), 콜레시스토키닌, 엔도텔린 I, 갈라닌, 위산 억제 펩티드 (GIP), 글루카곤, 인슐린, 아밀린, 리포트로핀, GLP-1 (7-37) 뉴로피신 및 소마토스타틴 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 표적화제로서 사용되는 비타민 (지용성 및 비-지용성 비타민 모두)을 사용하여 이들 비타민에 대한 수용체를 보유하거나 이들 비타민을 흡수하는 세포를 표적화할 수 있음을 고려한다. 이러한 측면에 특히 바람직한 것은 비타민 D 및 이의 유사체, 비타민 E, 비타민 A 등의 지용성 비타민 및 비타민 C 등의 수용성 비타민이다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 임의의 수의 암 세포 표적화기를 고시폴 화합물에 결합시킨다. 따라서, 표적화기와 결합된 고시폴 화합물은 암 세포의 표적화에 있어서 특이적이다 (즉, 암 세포에는 훨씬 더 잘 부착되지만 건강한 세포에는 그렇지 않음).

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 표적화기는 짧은 길이의 결합 (예를 들어, 직접적인 커플링), 중간 길이의 결합 (예를 들어, 소분자 이관능성 링커, 예를 들어 피어스 케미칼 컴파니 (Pierce Chemical Company)가 시판하는 SPDP) 또는 긴 길이의 결합 (예를 들어, 쉬어워터 폴리머스 (Shearwater Polymers)가 시판하는 PEG 이관능성 링커)을 통해 고시폴 화합물에 결합 (예를 들어, 공유 결합 또는 비공유 결합)된다.

몇몇 실시양태에서, 고시폴 화합물을 덴드리머 (예를 들어 PAMAM) 또는 리포좀 또는 다른 캐리어에 결합시킨다. 당업자는 다가 구조의 덴드리머를 이용하는 덴드리머 고시폴 화합물 분자를 쉽게 설계할 수 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 표적화제는 항체이거나 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, Fab 단위)이다. 예를 들어, 여러 암 (유방 HER2 종양 등)의 표면에 존재하는 충분히 연구된 항원은 당단백질 p185이며, 이는 오로지 악성 세포에서만 발현된다 [Press et al., Oncogene 5:953 (1990)]. 재조합 인간화 항-HER2모노클로날 항체 (rhuMabHER2)는 HER2를 과발현하는 유방암 세포의 성장을 억제하는 것으로 밝혀진 바 있고, 진전된 유방암을 치료하기 위한 임상 제3상 실험에서 평가 중에 있다 (통상의 화학 요법제와 병용함) [Pegram et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 14:106 (1995)]. 박 (Park) 등은 rhuMabHER2의 Fab 단편을 작은 단일층상 리포좀에 부착시켰고, 이후에는 이것에 화학요법제인 독소루비신 (dox)을 로딩 (load)하여 HER2를 과발현하는 종양의 이종이식편에 표적화할 수 있었다 ([Park et al, Cancer Lett., 118:153 (1997)] 및 [Kirpotin et al., Biochem., 36:66 (1997)]). 이들 dox-로딩된 "면역리포좀"은 표적화되지 않은 상응하는 dox-로딩된 리포좀 또는 유리 dox에 비해 종양에 대한 세포독성이 증가하고, 유리 dox에 비해 전신 독성이 감소한 것으로 나타났다.

항체를 생성하여, 여러가지 생물학적 표적 (예를 들어 병원체, 종양 세포, 정상 조직)상의 항원 또는 면역원 (예를 들어 종양, 조직 또는 병원체 특이적 항원)을 표적화할 수 있다. 이러한 항체로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 몇몇 실시양태에서, 항체는 종양 특이적 에피토프 (예를 들어 TAG-72 ([Kjeldsen et al., Cancer Res. 48:2214-2220 (1988)], 미국 특허 제5,892,020호, 동 제5,892,0l9호 및 동 제5,512,443호)), 인간 암종 항원 (미국 특허 제5,693,763호, 동 제5,545,530호 및 동 제5,808,005호), 골암종 (osteocarcinoma) 세포로부터의 TP1 및 TP3 항원 (미국 특허 제5,855,866호), 선암종 세포로부터의 톰센-프리덴라이히 (Thomsen-Friedenreich) (TF)항원 (미국 특허 제5,110,911호),인간 전립선 선암종으로부터의 "KC-4 항원" (미국 특허 제4,708,930호 및 동 제4,743,543호), 인간 직장결장암 항원 (미국 특허 제4,921,789호), 낭포선암으로부터의 CA125 항원 (미국 특허 제4,921,790호), 인간 유방 암종으로부터의 DF3 항원 (미국 특허 제4,963,484호 및 동 제5,053,489호), 인간 유방 종양 항원 (미국 특허 제4,939,240호), 인간 흑색종의 p97 항원 (미국 특허 제4,918,164호), 암종 또는 오로소뮤코이드 (orosomucoid)-관련 항원 (CORA) (미국 특허 제4,914,021호), 인간 편평세포 폐암종과 반응하지만 인간 소세포 폐암종과는 반응하지 않는 인간 폐암종 항원 (미국 특허 제4,892,935호), 인간 유방 암종 당단백질의 T 및 Tn 합텐 [Springer et al., Carbohydr. Res. 178:271-292 (1988)], MSA 유방암종 당단백질 [Tjandra et al., Br. J. Surg. 75:811-817 (1988)], MFGM 유방 암종 항원 [Ishida et al., Tumor Biol. 10:12-22 (1989)], DU-PAN-2 췌장 암종 항원 [Lan et al., Cancer Res. 45:305-310 (1985)], CA125 난소 암종 항원 [Hanisch et al., Carbohydr. Res. 178:29-47 (1988)], YH206 폐암종 항원 [Hinoda et al., Cancer J., 42:653-658 (1988)])를 인식한다. 특히, 전술한 참고문헌 각각은 본원에 참고로 도입된다.

당업계에 공지된 여러가지 방법들을 이용하여 폴리클로날 항체를 제조한다. 항체 제조를 위해서, 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러가지 숙주 동물에 목적하는 에피토프에 상응하는 펩티드를 주사하여 이들을 면역화할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 펩티드는 면역원성 캐리어 (예를 들어, 디프테리아 톡소이드, 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 연결된다. 숙주의 종에 따라, 프로인트 (Freund's) (완전 및 불완전) 보조제, 무기 겔, 예를 들어 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제, 예를 들어 BCG (Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르븀 (Corynebacterium parvum) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러가지 보조제를 사용하여 면역 반응을 증가시킨다.

모노클로날 항체를 제조하기 위해서는, 연속 세포주 배양에 의해 항체 분자를 제조하는 임의의 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조). 이러한 기술로는 쾰러 (Koehler)와 밀스타인 (Milstein)에 의해 최초로 개발되었던 하이브리도마 기술 [Koehler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)] 뿐 아니라 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (예를 들어 문헌 [Kozbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983)] 참조) 및 인간 모노클로날 항체를 제조하는 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)] 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체는 최근의 기술을 이용하여 무균 동물에서 제조할 수 있다 (예를 들어 PCT/US90/02545 참조). 본 발명에 따라서, 인간 항체를 사용할 수 있고, 이는 인간 하이브리도마를 사용하여 수득하거나 [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)] 인간 B 세포를 EBV 바이러스로 시험관내 형질전환시켜 수득할 수 있다 [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96 (1985)].

본 발명에 따라서, 단쇄 항체의 제조에 관해 기재된 기술 (미국 특허 제4,946,778호, 본원에 참고로 도입됨)을 채택하여 특이적 단쇄 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시양태에서는 Fab 발현 라이브러리의 구축과 관련하여 기재된 기술 [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]을 이용하여, 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 쉽게 확인할 수 있다.

항체 분자의 이디오타입 (idiotype) (항원 결합 영역)을 함유하는 항체 단편은 공지된 기술로 생성할 수 있다. 이러한 단편의 예로는 항체 분자의 펩신 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편, F(ab')2 단편의 디술피드 결합을 환원시켜 생성할 수 있는 Fab' 단편 및 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성할 수 있는 Fab 단편 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

항체 제조에 있어서, 원하는 항체의 스크리닝은 당업계에 공지된 기술 (예를 들어, 방사선면역 분석, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역방사분석, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 원위치 면역분석 (예를 들어 콜로이드 골드, 효소 또는 방사성동위원소 표지를 사용함), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 분석 (예를 들어 겔 응집 분석, 혈구응집 분석 등), 보체 고정 분석, 면역형광 분석, 단백질 A 분석 및 면역전기영동 분석 등)로 수행할 수 있다.

유방암의 경우, 엽산, EGF, FGF, 및 종양-관련 항원 MUC1, cMet 수용체 및 CD56 (NCAM)에 대한 항체 (또는 항체 단편)를 사용하여 세포 표면을 해 표적화할수 있다.

적당한 펩티드 표적화기를 확인하고 선별하는데 매우 융통성있는 방법은 파지 디스플레이 기술 (예를 들어 문헌 [Cortese et al., Curr. Opin. Biotechol., 6:73 (1995)] 참조)이며, 시판되는 키트를 사용하여 편리하게 수행할 수 있다. 파지 디스플레이 방법은 파지 표면에 부착된 펩티드의 크고 다양한 조합형 라이브러리를 생성하고, 고정된 표면 수용체에 대해 스크리닝하여 강력한 결합을 찾아낸다. 강력하게 결합된 후에는, 바이러스 구조물을 단리하고 서열분석하여 펩티드 서열을 확인한다. 최적의 펩티드를 그 다음 펩티드 라이브러리에 대한 출발점으로서 사용하여 이러한 사이클을 반복한다. 사실상, 적합하게 고친화성인 펩티드를 확인하고, 이후 생체적합성 및 표적 특이성에 대하여 스크리닝한다. 이러한 방법으로, 덴드리머에 연결될 수 있는 펩티드를 제조하여 표적 세포 수용체 (예를 들어 종양 세포 수용체) 또는 목적하는 다른 표적에 대해 고특이성 및 고친화성이 있는 다가 결합물을 제조하는 것이 가능하다.

상기 기재한 표적화 방법에 관련된 것이 "예비표적화 (pretargeting)" 방법이다 (예를 들어, 문헌 [Goodwin and Meares, Cancer (suppl.) 80:2675 (l997)] 참조). 이러한 전략의 예는, 환자에게 우선 종양-특이적 모노클로날 항체와 스트렙타비딘의 결합물을 처치하는 것을 포함한다. 혈류에 잔류하는 가용성 결합물은 적당한 비오티닐화된 제거제로 제거한다. 종양에 국한된 결합물만이 남아있는 경우에는, 고시폴에 연결되고 비오티닐화된 물질을 도입하는데, 이는 강력하고 특이적인 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용으로 인해 종양 부위에 국한된다

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 표적화제 (잔기)는 바람직하게는 핵산 (예를 들어 RNA 또는 DNA)이다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 표적화 잔기는 염기쌍 형성에 의해 특정 핵산 (예를 들어 염색체 DNA, mRNA 또는 리보솜 RNA)과 혼성화되도록 설계된다. 다른 실시양태에서, 상기 핵산은 리간드 또는 생물학적 표적에 결합한다. 하기의 단백질에 결합하는 핵산이 확인되었다: HIV의 역전사효소, Rev 및 Tat 단백질 [Tuerk et al., Gene, 137(1):33-9 (1993)], 인간 신경 성장 인자 [Binkley et al., Nuc. Acids Res., 23(16):3198-205 (1995)] 및 혈관 내피 성장 인자 [Jellinek et al., Biochem., 83(34):10450-6 (1994)]. 리간드와 결합하는 핵산의 확인 방법은 당업계에 많이 공지되어 있지만, SELEX 방법으로 확인하는 것이 바람직하다 (예를 들어 미국 특허 제5,475,096호, 동 제5,270,163호 및 동 제5,475,096호, PCT 공개 WO 97/38134, 동 WO 98/33941 및 동 WO 99/07724를 참조하며, 이들은 모두가 본원에 참고로 도입됨).

VIII. 약제 제형, 투여 경로 및 투여 고려사항

하기의 논의는 치료제의 전달을 설명하기 위해서 주로 암 치료를 위한 고시폴 화합물 및 도세탁셀의 전달에 중점을 두고 이루어지지만, 본 발명이 도세탁셀과 고시폴 화합물의 공동투여를 포함하는 방법 및 이를 위한 조성물에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 1종 이상의 고시폴 화합물을 포함할 수 있는 제약 조성물을 제공하고, 바람직한 실시양태에서는 고시폴 화합물 및 1종 이상의 통상의 항암제를 포함할 수 있는 제약 조성물을 제공하며, 고시폴 화합물 및 항암제는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 멸균된 생적합성 제약 담체 중에서 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 1종의 물질 (예를 들어, 고시폴 화합물)을 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 2종 이상의 물질 (예를 들어, 고시폴 화합물 및 1종 이상의 통상의 항암제)의 혼합물을 함유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 하기 조건하에서 환자에게 투여되는 2종 이상의 물질 (예를 들어, 고시폴 화합물 및 1종 이상의 통상의 항암제)를 함유할 수 있다: 상이한 투여 주기, 상이한 기간, 상이한 농도, 상이한 투여 경로 등.

본 발명의 조성물 및 방법은 Bcl-2 군 단백질 (예를 들어 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1 및 BOO-DIVA 등)의 과발현을 특징으로 하는 질환을 치료하거나 그러한 생리적 상태를 변경시키는데 사용된다. 본 발명은 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1 및 BOO-DIVA 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 아폽토시스억제성 Bcl-2 군 단백질의 길항제를 투여하여 아폽토시스를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명은 허용가능한 약제 전달 방법 및 제조 기술에 따른 고시폴 화합물 및, 몇몇 실시양태에서 1종 이상의 통상의 항암제의 투여를 고려한다. 예를 들어, 고시폴 화합물 및 적합한 항암제는 생리 염수 등과 같은 제약상 허용가능한 담체 중에서 대상에게 정맥내 투여될 수 있다. 약제 물질의 세포내 전달을 위한 표준 방법 (예를 들어, 리포좀을 이용한 전달법)을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 제제는 정맥내, 피하, 근육내 및 복강내 투여 등과 같은 비경구 투여에 유용하다. 고려되는 몇가지 항암제 (예를 들어 치료용 폴리펩티드)의 치료적 공동투여는 상기 기재한 유전자 요법을 이용하여 달성될 수도 있다.

의료 분야에 잘 알려진 바와 같이, 임의의 환자에 대한 투여량은 환자의 체구, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 상태 및 동시에 투여될 다른 약물과의 상호작용 등을 비롯한 많은 인자에 따라 달라진다.

따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 고시폴 화합물은 환자에게 단독으로 투여되거나, 1종 이상의 통상의 항암제 (예를 들어 뉴클레오티드 서열, 약물, 호르몬 등)와의 조합으로 투여되거나 또는 부형제(들) 또는 다른 제약상 허용가능한 담체와 혼합된 제약 조성물로 투여된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약상 허용가능한 담체는 제약상 불활성이다.

치료될 증상에 따라서, 이들 제약 조성물은 제제화되어 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 제제화 및 투여 기술은 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.)]의 최신판에서 찾을 수 있다. 적합한 경로의 예로는 경구 또는 경점막 투여, 및 비경구 전달, 예를 들어 근육내, 피하, 골수내, 경막내, 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비내 투여 등을 들 수 있다.

주사의 경우, 본 발명의 제약 조성물은 수용액 중에서, 바람직하게는 생리적으로 상용가능한 완충액, 예를 들어 행크 (Hank's)액, 링거 (Ringer's)액 또는 생리적 완충 염수 중에서 제제화할 수 있다. 조직 또는 세포내 투여를 위해서는 특정 장벽을 투과하기에 적당한 침투제를 제제 중에 사용한다. 일반적으로, 이러한 침투제는 당업계에 공지되어 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 당업계에 잘 알려진 제약상 허용가능한 담체를 사용하여 경구 투여에 적합한 투여량으로 제제화될 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물이 치료될 환자에 의해 경구 또는 비내 섭취되도록 정제, 환제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제 및 현탁액제 등으로 제제화될 수 있게 한다. 바람직한 실시양태에서, 고시폴 화합물은 환자에게 경구 투여된다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 제약 조성물은, 활성 성분들이 의도한 목적의 달성에 효과적인 양으로 함유되어 있는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 고시폴 화합물의 유효량은 특정 세포 또는 조직의 정상적인 비-병리 예에 비해 Bcl-2 군 단백질 수준이 상승된 상기 세포 또는 조직에서 아폽토시스를 유도하는 양일 수 있다. 유효량의 결정은, 특히 본원에 개시한 내용에 비추어 볼 때 당업자의 능력 내에 있다.

바람직한 제약 조성물은 활성 성분 뿐 아니라 활성 화합물을 제약적으로 사용할 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 제약상 허용가능한 적합한 담체를 함유할 수 있다. 경구 투여용으로 제제화된 제제는 정제, 당의정제, 캡슐제 또는 용액제 형태일 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 그 자체로 공지된 방식 (예를 들어 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정제 제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 가공)으로 제조될 수 있다.

비경구 투여용 제약 제제는 수용성 형태의 활성 화합물들의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 화합물의 현탁액제는 적합한 오일상 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지질성 용매 또는 비히클은 세삼유 등의 지방 오일, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드 등의 합성 지방산 에스테르 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액제는 현탁액의 점성을 증가시키는 물질, 예를 들어 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 경우에 따라, 상기 현탁액제는 적합한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액을 제조할 수 있게 하는 물질도 함유할 수 있다.

경구용 제약 제제는 활성 화합물 (예, 고시폴 화합물)을 고체 부형제와 배합하고, 경우에 따라서는 생성된 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 가공하고, 원한다면 적합한 보조제를 첨가한 후에 정제 또는 당의정제 코어를 제조함으로써 얻을 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예를 들어 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당, 옥수수, 밀, 쌀, 감자 등으로부터의 전분, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로스 등의 셀룰로스, 아라비아 검 및 트라가칸트 검 등을 비롯한 검, 및 젤라틴 및 콜라겐 등의 단백질이다. 원하는 경우에는, 붕해제 또는 가용화제, 예를 들어 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 그의 염, 예를 들어 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다.

본 발명의 섭취가능한 제제는 미국 농업부가 식품에 포함시키는 것을 승인한임의의 물질 및 일반적으로 안전하다고 인정되는 물질 (Generally Recognized As Safe, GRAS), 예를 들어 식품 첨가제, 향미제, 착색제, 비타민, 미네랄 및 피토뉴트리언트 (phytonutrient) 등을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 피토뉴트리언트라는 용어는 식물로부터 단리된, 생물학적 효과를 갖는 유기 화합물을 지칭하며, 이들로는 하기와 같은 종류의 화합물이 있으나 이에 제한되지 않는다: 이소플라보노이드, 올리고머 프로안트시아니딘, 인돌-3-카르비놀, 술포라폰, 섬유성 리간드, 식물 피토스테롤, 페룰산, 안토시아노시드, 트리테르펜, 오메가 3/6 지방산, 폴리아세틸렌, 퀴논, 테르펜, 카테킨, 갈레이트 및 퀘르시틴.

당의정제 코어에는 농축된 당 용액 등과 같은 적합한 코팅물이 제공되며, 코팅물은 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및(또는) 이산화티탄, 래커 용액, 적합한 유기 용매 및 용매 혼합물을 함유할 수도 있다. 정제 또는 당의정제 코팅물에는, 제품을 확인하거나 활성 화합물의 양 (즉, 투여량)을 기입하기 위한 염료 또는 안료를 첨가할 수 있다.

경구로 사용할 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된, 푸쉬-핏 (push-fit) 방식의 캡슐제 뿐 아니라, 젤라틴 및 코팅물, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 밀봉 캡슐제를 포함한다. 푸쉬-핏 방식의 캡슐제는 충전제 또는 결합제, 예를 들어 락토스 또는 전분, 윤활제, 예를 들어 활석 또는 스테아르산마그네슘 및 경우에 따라 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐제에서, 활성 화합물은 안정화제의 존재 또는 부재하에 적합한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해되거나 현탁될 수 있다.

제약상 허용가능한 담체 중에 제제화된, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조하여 적합한 용기 중에 넣고, 적응증의 치료에 관한 라벨을 부착할 수 있다. 고시폴 화합물의 경우, 상기 라벨상에 지시된 증상은 아폽토시스의 조절 결함, 과증식성 질환, 암, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 퇴행성 증상 및 혈관 질환의 치료를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러가지 산을 사용하여 형성될 수 있다. 염은 수용성 용매, 또는 상응하는 유리 염기 형태의 다른 양성자성 용매 중에서 더욱 가용성이 되는 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 1 mM 내지 50 mM 히스티딘, 0.1％ 내지 2％ 수크로스, 2％ 내지 7％ 만니톨 (pH 범위 4.5 내지 5.5) 중에서 동결건조된 산제일 수 있고, 사용 전에 완충액과 합한다.

본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물의 경우, 우선, 세포 배양 분석을 통해 치료 유효 투여량을 추정할 수 있다. 이어서, 바람직하게는 투여량을 동물 모델 (특히, 쥐과동물 모델)에서 공식화하여, Bcl-2 군 단백질의 수준이 상승된 세포 내에서의 아폽토시스 유도에 바람직한 순환 농도 범위를 달성할 수 있다. 치료 유효 투여량은 질환 상태 (예를 들어, 암 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포 증식이 조절되지 않는 질환)의 증상을 개선시키는 고시폴 화합물의 양 (및 몇몇 실시양태에서는 1종 이상의 추가의 통상의 항암제)을 지칭한다. 이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차, 예를 들어LD₅₀(집단의 50％에 치명적인 양) 및 ED₅₀(집단의 50％에 치료 효과적인 양)을 측정하여 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비율이 치료 지수이며, 이는 LD₅₀/ED₅₀의 비율로 표현할 수 있다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 추가의 동물 연구를 통해 얻은 데이타를 사용하여 예를 들어 포유동물 (예를 들어, 인간, 에쿠스 카발루스 (Equus caballus), 펠리스 카투스 (Felis catus) 및 카니스 파밀리아리스 (Canis familiaris) 등)에 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있는 것이 바람직하지만, 본 발명은 이 농도로 제한되지 않는다. 투여량은 사용되는 투여 형태, 환자의 민감성 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라진다.

정확한 투여량은 치료받을 환자의 개인 주치의가 선택한다. 투여량 및 투여는 활성 잔기가 충분한 수준으로 제공되도록 또는 원하는 효과가 유지되도록 조절한다. 고려할 수 있는 추가의 인자로는 질환 상태의 중증도, 환자의 연령 및 성별, 식이요법, 투여 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 요법에 대한 허용성/반응 등이 있다. 장기간 작용하는 제약 조성물은 특정 제제의 반감기 및 제거율에 따라 3일 내지 4일 마다 투여되거나, 매주 투여되거나 또는 2주 당 1회 투여될 수 있다. 다른 제약 조성물은 매일 투여되거나 1일 수회 투여될 수 있다.

통상적인 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100,000 ㎍ (총 투여량은 약 1 g 이하)에서 달라질 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌 (예를 들어 미국 특허 제4,657,760호, 동 제5,206,344호 또는 동 제5,225,212호를 참조하며, 상기 문헌은 모두가 본원에 참고로 도입됨)에 제공되어 있다. 몇가지 물질을 환자 골수에 투여하는 것은 정맥내 주사와는 상이한 전달 방식을 필요로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 유효량의 고시폴을 환자에게 투여하여 세포 (예를 들어 암 세포) 증식을 억제하는 방법 및 이를 위한 제약 조성물을 제공한다. 다른 몇몇 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 고시폴 화합물과 유효량의 1종 이상의 통상의 항암제를 환자에게 공동투여하여 세포 (예를 들어 암 세포) 증식이 억제되도록 하는 방법 및 이를 위한 제약 조성물을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 대상은 Bcl-2 군 단백질 (예를 들어 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1 및 BOO-DIVA 등)의 과발현을 특징으로 하는 질환에 걸려 있다. 몇몇 실시양태에서, Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 질환으로는 과증식성 질환, 암, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 퇴행성 증상 및 혈관 질환 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료하기에 적합한 암으로는 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 결장암, 흑색종, 난소암, 뇌암, 간암, 방광암, 비-소세포 폐암, 경부암, 골수종, 부신 암종, 백혈병, 신경모세포종 및 교모세포종 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 유형의 암 치료에 제한되지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명으로 치료하기에 적합한, Bcl-2 군 단백질(들)의수준이 특징적으로 상승되었을 것이라고 의심되는 질환은 Bcl-2 군 단백질 (예를 들어 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1 및 BOO-DIVA 등)의 수준이 높을 것이라고 의심되는 대상 샘플 (예를 들어 세포, 조직, 체액 등)을 수득하고, 하나 이상의 잘 확립된 면역조직화학 기술 (예를 들어 ELISA 및 웨스턴 블롯팅 등)을 이용하여 샘플 중의 Bcl-2 군 단백질의 수준을 측정하고, 샘플 중 Bcl-2 군 단백질 수준을 이와 관련된 참조용 비-병리 샘플에서의 Bcl-2 군 단백질의 수준과 비교함으로써 선택된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 Bcl-2 군 단백질 (예를 들어 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1 및 BOO-DIVA 등)의 수준이 특징적으로 상승되었을 것이라고 의심되는 질환은 샘플 (예를 들어 세포, 조직, 체액 등) 중 Bcl-2 군 단백질의 수준 상승을 직접 또는 간접적으로 지시하는 1종 이상의 마커 (예를 들어 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 지질 등)의 수준을 이와 관련된 비-병리 샘플에서의 이들 마커 수준과 비교함으로써 선택된다. 또 다른 실시양태에서, Bcl-2 군 단백질 (예를 들어 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1 및 BOO-DIVA 등)의 수준이 특징적으로 상승되었을 것이라고 의심되는 질환은 1종 이상의 통상의 항암 요법 (예를 들어, 화학요법, 방사선 요법 및(또는) 수술적 개입)을 이용한 치료에 반응하지 않거나 반응을 멈춘 질환으로부터 선택된다.

본 발명은 대상에게 물질을 전달하기 위해 선택한 투여 경로에 제한되지 않는다. 사실상, 수많은 적합한 투여 경로가 고려되며, 이의 선택은 당업자의 기술 내에 있다.

일부 바람직한 실시양태에서, 고시폴 화합물은 환자에게 약 1 내지 200 mg/일, 약 5 내지 50 mg/일, 가장 바람직하게는 약 10 내지 40 mg/일의 투여량 범위로 투여된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 고시폴 화합물은 환자에게 어떤 생물학적 활성 (예를 들어, Rb 및 사이클린 D1 수준의 변화)을 나타내는 허용가능한 1일 투여량 (예를 들어, 30 내지 40 mg/일)으로 투여 (예를 들어, 경구 투여)된다.

다른 바람직한 실시양태에서, 탁산 (예를 들어, 도세탁셀)을 고시폴 화합물과 조합하여 환자에게 투여한다. 이러한 통상의 도세탁셀 투여 스케쥴은 3주당 80 내지 100 mg/m2이다. 그러나, 최근의 연구는 탁산이 주당 스케쥴로 아마도 더 높은 투여 강도에서도 안전하게 투여될 수 있음을 시사한다 (예를 들어 문헌 [J.D. Hainsworth et al., J. Clin. Oncology, 16:2164-2l68 (1998)], [J.D. Hainsworth et al., J. Clin. Oncology, 19:3500-3505 (2001)] 및 [C. Kouroussis et al., Cancer Chemo. Pharm., 46:488-492 (2000)] 참조). 탁산 투여와 관련된 환자 독성은 호중구감소증, 무력증, 탈모증, 과민 반응, 피부 독성 및 부종을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 탁산을 매주 투여하여, 환자 독성은 감소시키면서 물질의 효능은 보존시킨다. 다른 실시양태에서, 개시된 고시폴 화합물로 환자를 치료하는 기간 동안에 탁산 (예를 들어 도세탁셀)을 주당 1회가 넘는 빈도로 투여하는 것은 상승 효과를 나타낼 것이라 기대된다.

본 발명은 임의의 특정 메카니즘에 제한되지 않고, 투여된 물질의 작용에 대한 이해에도 제한되지 않지만, 하기의 예는 고시폴 화합물 및 고시폴과의 공동투여를 위한 후보물질인 1종 이상의 항암제 사이에서 잠재적인 약물 상호작용을 측정하는데 이용되는 전형적인 시험 방법에 대한 설명을 제공한다.

도세탁셀은 특이적인 시토크롬 p450 효소인 CYP3A4에 의해 광범위하게 대사된다. 도세탁셀에 대해 얻은 약동학 데이타는 환자들마다 이의 제거율에 커다란 차이가 있음을 지시한다. 불량한 도세탁셀 제거율은 곡선하면적 (AUC)을 증가시킬 수 있기 때문에 환자 독성이 더 높다. 몇가지 조사를 통해, 고시폴이 시토크롬 P-450 및 혼합 기능 옥시다제를 감소시키는 것으로 보고되었지만, 이러한 결과가 검증된 것은 아니고, 이러한 사안에 특별하게 주안을 둔 인간 연구는 수행되지 않았다. 따라서, 고시폴이 CYP3A4 활성을 억제할 수 있고 일부 환자에서 독성 도세탁셀을 축적시키는 것이 가능하다.

한 실시양태에서, 환자에게 1주 동안 고시폴을 매일 투여한 후에 도세탁셀을 처음으로 투여한다. 환자에게 도세탁셀을 처음으로 투여한 후에는, 환자의 시스템에서 도세탁셀의 약동학 프로파일을 평가한다 (문헌 [R. Bruno et al., J. Clin. Oncol., 16:187-196 (1998)] 참조). 도세탁셀 투여는 약 15 mg/m2/주의 적은 투여량으로 출발한다. 도세탁셀의 투여량을 약 35 mg/m2/주의 최대 허용 투여량까지 점차 증가시킨다. 동시에, CYP3A4의 형질 발현에 미치는 고시폴의 투여 효과에 대한 정보를 수집한다.

CYP3A4의 형질 발현은 에리트로마이신 호흡 시험법 (ERMBT)을 이용하여 쉽고 재현가능하게 측정할 수 있다 (예를 들어 문헌 [P. Watkins, Pharmacogenetics, 4:171-184 (1994)] 및 [J. Hirth et al., Clin. Cancer Res., 6:1255-1258 (2000)] 참조). ERMBT 시험은 CYP3A4 기질인 약물의 혈액 수준으로 볼 때 정상 (steady)상태로 예측되는 결과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태는 고시폴 화합물과 탁산 (예를 들어, 도세탁셀)을 공동투여하고, ERMBT를 이용하여 고시폴과 탁산 사이에서 잠재적인 약물 상호작용을 측정하는 방법에 관한 것이다. 당업자라면, 유사한 시험 방법을 이용하여 고시폴 화합물 및 이와 공동투여할 후보 화합물 사이의 잠재적 상호작용을 측정할 수 있음을 알 것이다.

몇몇 실시양태에서는 표준 면역조직화학 기술을 이용하여, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 치료 후에 또는 이러한 치료 동안에 환자에서 얻은 샘플에 대해 Bcl-2 군 단백질 (예를 들어 Bcl-2, Bcl-X_L및 Bax 등)의 수준 변화를 측정한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, Bcl-2에 대한 항체 (미국 캘리포니아주 카르핀테리아에 소재하는 다코 (DAKO) 제품), Bcl-X_L및(또는) Bax에 대한 항체 (미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코에 소재하는 지메드 (Zymed) 제품)를 사용하는 면역조직화학 기술을 통해, 환자 샘플 중 이들 Bcl-2 단백질의 수준을 측정한다. 바람직한 실시양태에서, 면역조직화학 연구를 통해 얻은 결과를 당업자에게 공지된 잘 확립된 기준에 따라 해석하는데, 임의의 세포질 또는 핵 염색이 양성으로 고려될 것이다. Bcl-2, Bcl-X_L및 Bax의 발현 수준은 각 경우마다 1,000개 이상의 종양성 세포를 계수하여 측정하고, 퍼센트 (％)로 표현한다. 양성 세포의 퍼센트 (％)가 Bcl-2 및 Bcl-X_L에 대하여 > 25％이고, Bax에 대하여 > 50％인 경우에는 발현 수준이 높은 것으로 고려한다 (예를 들어 문헌 [G. Rassidakis et al., Amer. J. Path., 159:527-535 (2001)] 및 [S. Shi et al., J. Histochem. Cytochem., 39:74l-748(1991)] 참조). 다른 실시양태에서, 전혈 샘플을 간헐적으로 얻어 순환하는 상피 세포의 면역자기성 선별 분석 및 말초혈 림프구 (PBL)에서의 Bcl-2 및 Bcl-X_L발현에 대한 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 수행한다.

바람직한 실시양태에서, 투여량 연구는 특정 항암 조합 요법 후보물질과의 조합으로 투여된 고시폴 화합물의 최대 허용되는 투여량이 확립될 때 (특정 1일 투여량, 예를 들어 30 mg/일에서) 1차 종료한다. 몇몇 실시양태에서, 투여량-제한 독성 (DLT)은, 주어진 샘플 (예를 들어 세포, 조직 또는 체액 샘플)이 500개 초과의 호중구를 나타내거나 또는 환자에 대해 연구하는 임의의 시점에서 3 또는 4 등급에 해당하는 임의의 다른 독성을 나타낼 때 수립된다.

일부 다른 실시양태에서, 투여량 증가를 평가하기 위해서는 각 투여량 수준에서 출발한 2명의 환자에 대해 최소 9주간의 치료가 필요하다. 최대 허용되는 투여량 (MTD)은, 환자의 33％가 DLT에 도달하는 투여량으로 정의된다. 특정 투여량이 MTD에 도달하지 않을 경우에는, 이러한 투여량 수준을 MTD로서 정의한다. 바람직한 실시양태에서, 투여량은 TITE-CRM (Time-to-Event CRM)이라고 지칭되는, 문헌 [Continual Reassessment Method (J. O'Quigley et al., Biometrics 46:33-48 (1990)]에 기재된 기준에 따라 환자에게 할당한다 [K. Cheung and R. Chappell, Biometrics (in press)]. 요컨대, TITE-CRM 방법은 모델을 독성 반응의 발생 시간에 대하여 투여량의 함수로서 가정하고, 새로운 환자의 투여량 수준을 정할 때, 시험에 참여한 모든 환자로부터의 정보가 이용되도록 한다. 이 방법은 각 투여량으로 치료한 환자의 수 측면에서 매우 융통성이 있기 때문에, 환자를 안전성 프로파일에 부합되는 투여량으로 치료하고 있는 한, 대상이 계속 시험에 동원(動員)될 수 있다 (동원이 중단되지 않음).

바람직한 실시양태에서, 치료 후에는 질환에 걸린 세포 및 조직을 세포 생존성, 아폽토시스 유도, 예를 들어 형태 변화, DNA 일체성, 미토콘드리아 경로, Bcl-2 군 단백질의 발현 변경 및 카스파제 활성화 뿐 아니라, 카스파제 및 카스파제 억제제의 상류 및 하류 이펙터에 대해 분석한다. 당업자라면, 이러한 파라미터 및 치료되는 세포 및 조직에서의 수많은 다른 세포 파라미터 및 생화학적 파라미터를 시험하는 분석법을 쉽게 고안하고 수행할 수 있을 것이다.

하기 실시예는 특정한 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명하고 추가로 예시하기 위해 제공하며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하지 않는다.

실시예 1

상동성 모델링

인간 Bcl-2의 서열을 진뱅크로부터 수득하였다 (진입 번호 gi4557355) (서열 1). Bcl-2와의 아미노산 서열 동일성 45％, 서열 유사성 56％, 갭 3％를 갖는 Bcl-X_L의 NMR 구조 (pdb 코드: 단백질 데이타뱅크로부터 1BXL)를 주형으로서 사용하였다. 상동성-모델링 프로그램인 모델러 (MODELLER) (버전 4.0)를 이용하여 Bcl-2의 구조를 구축하였다 ([A. Sali et al., Structure, Function, and Genetics,23:318-326 (1995)] 및 [A. Sali, Curr. Opin. Biotech., 6:437-451 (1995)]). 분자 역학 프로그램인 차암 (CHARMM) (버전 27b2)을 이용하여 추가로 세밀화하였다 [B. R. Brooks, J. Comput. Chem., 4:187-217 (1983)]. 수소 원자를 프로그램 콴타 (QUANTA) (미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 몰레큘라 시뮬레이션즈 인크. (Molecular Simulations Inc.) 제품)를 이용하여 모델링된 구조에 할당시켰다. Bak BH3 펩티드를 Bak BH3 펩티드와 복합체를 이룬 Bcl-X_L의 NMR 구조에서와 동일한 위치의 Bcl-2 BH3 도메인 결합 부위에 놓았다 (단백질 데이타뱅크에서 1BXL) [S. Michael et al., Science, 275:983-986 (1997)]. 복합 구조체를 직경 60Å의 TIP3P 물 스피어에 삽입하고 임의의 단백질 중원자로부터 2.5Å 미만에서 중원자를 보유하는 용매 분자를 제거함으로써 복합 구조체를 용매화하였다.

콴타 98 중의 MSI 차암 역장 (force field) (ref 23), 유전 상수 ε= 1 및 항온 T = 300K로 설정한 모든 원자 파라미터를 이용하여 MD 시뮬레이션을 행하였다. 1 fs 타입 스텝을 갖는 등짚고 넘기 (leap frog) 방법을 적용하여 수치 적분하였다. 장거리-범위 정전력을 8 내지 12Å의 전환 범위를 갖는 힘 전환법 (force switch method)으로 처리하였다 [B. R. Brooks et al., J. Comput. Chem., 4:187-217 (1983)]. 상기 전환법 및 12Å의 컷오프를 이용하여 반 데르 발스 힘을 계산하였다. 비결합 리스트를 14Å로 유지하고 경험적으로 업데이트하였다. 차암에서 실행한 바와 같이 구형의 여러가지 평균 장 전위를 이용하여 용매인 물이 증발되지 않도록 유지하였다 (상기의 [B. R. Brooks]). 급감소법 (Steepest Descentmethod)을 이용한 100회의 순환 및 공인된-기초 뉴턴 래프선법 (Adopted-Basis Newton Raphson method)을 이용한 추가의 1000회의 순환을 실행하여 용매화된 단백질의 에너지를 최소화하였다. 그 후, 3.0 ns MD 시뮬레이션을 하였다. 시뮬레이션은 국립 건강 연구소 (National Institutes of Health) 내의 고등 생물의학 평가 센터 (Advanced Biomedical Computing Center)에서 오리진 (Origin) 2000 컴퓨터상에서 수행하였다.

실시예 2

Bc1-X _L 단백질의 발현 및 정제

N-말단 His-태그를 보유하는 재조합 Bc1-X_L단백질을 pET15b 발현 벡터 (독일 단스타트에 소재하는 노파겐 (Novagen) 제품)로부터 과발현시켰다. 이와 관련하여, 추정의 C-말단 막-앵커링 (membrane-anchoring) 영역 (잔기 214-237) 및 헬릭스 (helix) 1과 헬릭스 2 사이의 루프 (잔기 49-88)를 제거하여 단백질 정제를 용이하게 하였다. 상기 루프는 단백질의 아폽토시스억제 활성과 무관한 것으로 이미 밝혀졌다 [S. W. Muchmore et al., Nature, 381:335-341 (1996)]. 현 Bcl-X_L의 구조물은 1 L의 세포 배양으로부터 약 20 mg의 정제된 Bcl-X_L단백질을 생산하였다.

스크리닝하기 위해 NMR 연구용 단백질 샘플을¹⁵N으로 불균일하게 표지하고, 문헌 [M. Jansson et al., J. Biomol. NMR, 7:131-141 (l996)] 및 [M. L. Cai et al., J. Biomol. NMR, 11:97-102 (1998)]에 기재된 방법에 따라 구조를 특성화하기위해¹⁵N 및¹³C로 불균일하게 이중 표지하였다.

실시예3

인간 암 세포에서 Bcl-2 군 단백질의 발현

다양한 수준의 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L단백질을 발현하는 몇몇의 암 세포주 (표 3)를 선택하여 인간 암 세포의 증식을 억제하는 고시폴의 활성을 시험하였다.

	암 세포주	Bcl-2 발현	BCl-X_L발현
1군	T-47 유방암MDA-453 유방암	±·	++++++
2군	MDA-435 유방암	+++	±
3군	MDA-231 유방암	+++	+++
4군	WI-38 정상SK-MEL-28 흑색종	·±	··

표 3에 나타낸 적절히-특성화된 암 세포주를 사용하는 실험으로 잠재성 항암제로서 고시폴의 몇가지 중요한 특성을 시험하였다. 첫째, 다양한 수준의 Bcl-2 군 단백질을 발현하는 다수의 암 세포 유형을 이용한 결합 분석법에서 고시폴의 활성 및 선택성은 고시폴로 처리하기에 적합한 후보인 암 유형의 범위를 나타낸다고 예상하였다. 둘째, Bcl-2 및 Bcl-X_L수준이 높은 암 세포에서 고시폴을 시험함으로써 1종의 단백질의 단독 억제가 아폽토시스 유도에 충분한지 또는 2종의 단백질 모두의 동시 억제가 더 큰 효능을 달성할 것인지의 여부가 나타날 것이다. 셋째, 다양한 수준의 Bcl-2 군 단백질을 발현하는 다수의 암 세포 유형을 이용하여 분석함으로써 고시폴이 Bcl-2 및 Bcl-X_L발현이 모두 낮은 암 세포에서 선택성을 나타내는지의 여부가 나타날 것이다.

실시예 4

형광 편광 기초의 결합 분석법

본 발명은 이미 확립되어 있는 민감하고 정량적인 생체내 형광 편광-기초의 (Fluorescence Polarization-based; FP) 결합 분석을 이용하여 소분자 억제제 (예를 들어 고시폴 화합물)와 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 생체내 결합 친화성을 결정하였다 (예를 들어 [J. L. Wang et al., Cancer Res., 60:1498-1502 (2000)], [J. L. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:7124-7129 (2000)], [A. Degterev et al., Nat. Cell Biolog., 3:173-182 (2001)] 및 [I. J. Enyedy et al., J. Med. Chem., 44:4313-4324 (2001)] 참조). 상기 분석으로 재조합 Bcl-2 또는 Bcl-X_L단백질로부터의 형광 표지된 BH3 도메인 펩티드의 치환을 모니터링하였다. 일단 펩티드가 Bcl-2 또는 Bcl-X_L단백질과 결합하면, 형광 편광이 증가하였다. 소분자 억제제가 Bcl-2 또는 Bcl-X_L단백질과 결합하고 형광 표지된 BH3 도메인 펩티드를 치환한 경우, 형광 편광은 감소하였다. 2종의 단백질 모두에 대한 결합 친화성을 결정하는 것은 그들의 선택성을 결정하기 위해 중요하였다. Bcl-2 및 Bcl-X_L의 구조가 매우 유사하지만, 상기 2종의 단백질 사이에는 여러 차이가 존재하였다. Bcl-2/Bcl-X_L의 소분자 억제제는 상기 2종의 단백질 사이에서 어떤 선택성을 나타내었다. 따라서, 고시폴과 Bcl-2 및 Bcl-X_L단백질의 결합은 본원에서 개괄한 NMR 방법을 이용하여추가로 측정하고 확인하였다.

Bcl-2 억제제 (예를 들어 고시폴, 그의 거울상이성질체, 유도체 및 제약상 허용가능한 염)의 초기 스크리닝은 200 μM에서 수행하였다. 억제제에 대해 유의한 억제가 관찰되는 경우 (50％ 초과), 그의 IC₅₀값을 결정하였다. 반응 완충액 중의 시험 화합물 5 mL를 동일한 농도에서 제공되는 추적자 (tracer) 및 Bcl-2 또는 Bcl-X_L단백질을 함유하는 웰에 첨가하였다. 모든 화합물에서 DMSO의 최종 농도는 0.5％ 미만이어야 한다. 최종 판독은 실온에서 10분간의 인큐베이션 후에 수행하였다. 초기 활성 화합물의 IC₅₀을 결정하는 경우, 1 nM 내지 200 μM에서 9가지 내지 10가지 농도를 사용하였다. 비-표지된 Bak 펩티드를 양성 대조군으로 사용한 반면, 비활성 화합물을 음성 대조군으로서 사용하였다.

한 실시양태에서, Bcl-2 형광 편광 분석을 하기와 같이 수행하였다. 형광-표지된 16-mer 펩티드 추적자 Flu-Bak BH3 (Bak BH3 도메인으로부터 유도된 서열 GQVGRQLAIIGDDINR (서열 2))을 아미노 말단에서 합성하고 표지하였다. 46-kDa 재조합 가용성 GST와 융합된 Bcl-2 단백질을 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology) (미국 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재)로부터 구입하였다. 1X 인산염-완충 염수 10 ㎕, GST-Bcl-2 단백질 5 ㎕ 및 펩티드 추적자 5 ㎕를 함유하는 웰 당 20 ㎕의 총 부피로 반응을 수행하였다. 반응물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 울트라 리더 (Ultra Reader) (미국 노쓰 캐롤리나주 리서치 트라이앵글 파크에 소재하는 테칸 유. 에스. 인크 (Tecan U. S. Inc) 제품)를 이용하여 485 nm 및 535 nm에서 판독하였다. 배경, 완충액, Bcl-2 단백질, 추적자 및 Bcl-2 단백질과 추적자의 혼합물을 통해 수득된 최대 및 최소 신호를 분석하여 일련의 확인 실험을 수행하였다. 5.4 nM 내지 540 nM의 농도 범위 및 0.145 nM 내지 1,450 nM의 형광 추적자 농도 범위에서 Bcl-2 단백질을 적정하여 Bcl-2 단백질과 16-mer 플루오레세인-표지된 펩티드 사이의 결합의 K_d를 측정하였다. 형광 추적자 290 nM 및 Bcl-2 단백질 270 nM의 최종 농도에서 최적 결합을 달성하였다. 특이성을 확인하기 위하여, 형광 표지된 펩티드의 결합을 비표지된 16-mer 펩티드와 경쟁시켰다. 데이타는 비표지된 16-mer 펩티드가 문헌에 보고된 값과 유사한 값인 약 0.3 μM의 IC₅₀으로 표지된 추적자의 결합을 해제시킬 수 있었음을 나타낸다.

고시폴 및 고시폴 유사체의 초기 스크리닝은 200 μM에서 수행하였다. 시험 화합물 5 ㎕를 반응 완충액 중에서 이전에 측정한 농도와 동일한 농도의 추적자 및 Bcl-2 단백질을 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 모든 화합물에서 DMSO의 최종 농도는 1％ 미만이었다. 최종 판독은 실온에서 10분간의 인큐베이션 후에 수행하였다. 활성 화합물의 IC₅₀을 측정하기 위해, 200 μM에서 출발하여 6 내지 7개의 점에서 단계적으로 3회 희석하였다.

세포 및 시약. 인간 유방 세포주 (T47D, MDA-231, MDA-453) 및 인간 백혈병 세포 KL-60을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 수득하였다. 모든 종양 세포주는 기본 매질로서 둘베코 (Dulbecco)의 변형된 이글 (Eagle) 배지가 사용된 MDA-MB-231을 제외하고, 10％ FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 성장시키고 유지시켰다. 37℃ 및 5％ CO₂의 습윤 인큐베이터에서 배양물을 유지시켰다.

실시예 5

Bcl-X _L 에 결합한 고시폴의 NMR에 의한 확인

고 해상도 NMR 기술을 이용하여 고시폴과 Bcl-X_L의 결합을 측정하였다. pH 7.2에서 NMR 실험을 수행하였으므로, 역방향의 물 플립 (flip)을 갖는 펄스 장 구배 (Pulse Field Gradient; PFG) HSQC를 사용하여 신호 강도를 최대화하고 ([S. Grzesiek and A. Bax., J. Am. Chem. Soc., 115:12593-12594 (1993)] 및 [G. S. Sheppard et al., Abstracts of Papers of the Amer. Chem. Soc., 213:81 (1997)]), 물 신호로부터의 파괴를 최소화하였다. Bcl-X_L의 HSQC 스펙트럼을 억제제 농축 용액의 첨가 전 (유리 Bcl-X_L)과 후에 기록하였다. 이어서, 2개의 스펙트럼을 비교하여 억제제 첨가로 유도된 화학적 이동을 확인하였다. 엔엠알파이프 (nmrPipe), 피프 (pipp) 및 엔엠알드로 (nmrDraw) 소프트웨어를 이용하여 데이타 처리를 수행하였다 ([D. S. Garrett et al., J. Magn. Reson. Ser., B 95:214-220 (1991)] 및 [F. Delaglio et al., J. Biomol. NMR, 6:277-293 (1995)] 참조). 이동된 피크를 할당표와 상호 참조함으로써 억제제의 존재로 영향을 받은 잔기를 나타내었다.

실시예 6

Bcl-X _L 에 대한 고시폴의 결합 친화성의 NMR에 의한 측정

Bcl-X_L에 대한 유사한 HSQC 실험을 수행하여 nM 내지 mM의 Bcl-X_L의 농도를 적정함으로써 소분자 억제제의 결합 친화성을 구하였다. 소분자 억제제는 NMR 시간 규모에서 신속한 교환 한계에서 Bcl-X_L단백질에 결합하므로, 일부 피크의 이동은 억제제의 양이 증가함에 따라 최대 이동 위치를 향하여 단계적인 방식으로 일어났다. 화학적 이동 값 대 억제제 농도에서의 변화를 분석하여 그의 K_d값을 구하였다 (예를 들어 [P. E. Johnson et al., Biochemistry, 35:13895-13906 (1996)] 참조).

실시예 7

고시폴에 의해 유도된 아폽토시스의 메카니즘 연구

일련의 생화학적 분석을 수행하여 Bcl-2 군 단백질 (예를 들어 Bcl-2 및(또는) Bcl-X_L)의 소분자 억제제로서 고시폴 화합물의 작용 메카니즘을 결정하였다. 메카니즘의 이해가 본 발명을 실행하는데 필수적인 것은 아니며 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니지만, 고시폴 화합물이 Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 세포 및 조직에서 작용하는 메카니즘을 이해하는 것이 본 발명에 유리하다고 고려된다.

다양한 투여량 및 횟수의 고시폴 화합물로 처리한 세포에서 Bcl-2 단백질의 발현 및 인산화 상태를 측정하였다. 특히, 이후에 Bcl-2, Bcl-X_L, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bax, Bid의 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 특이적 항체로 측정하였다. Bcl-2, Bcl-X_L및 Bad 등과 같은 단백질에 대한 인산화 상태는 인산화된 단백질을 인식하는 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

세포의 미토콘드리아에서 고시폴의 효과를 몇가지 방법으로 조사하였다. 가장 중요한 2가지 분석은 사이토크롬 c 방출 및 공극 형성 분석법이다. 세포를 억제제로 24 내지 48시간 동안 처리하고, 문헌 [R. K. Kluck et al., Science, 275:1132-1136 (1997)]에 기재된 방법을 일부 변형하여 세포 분류를 수행하였다. 요약하자면, 세포를 수거하고 빙냉된 PBS로 1회 세척하고, 프로테아제 억제제 혼합물 (PIM) 및 빙냉된 완충액 C (pH 7.4에서 10 mM 허페스 (Hepes)-KOH, 0.42 M NaCl, 2.5％ (v/v) 글리세롤, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 mM 나트륨 EDTA, 0.5 mM EGTA, 1 mM 디티오트레이톨) 1 mL 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 빙상에서 22 게이지 니들을 통하여 15회 통과시킴으로써 균질화시켰다. 균질액을 4℃에서 750 g로 10분 동안 2회 원심분리하여 핵을 제거하였다. 핵 처리 후의 상층액 분액을 4℃에서 10,000 g로 15분 동안 원심분리하고, 생성된 미토콘드리아-풍부 펠렛을 PIM (냉각) + 완충액 C 100 mL 중에 재현탁시켰다. 미토콘드리아 처리 후의 상층액을 4℃에서 10,000 g로 1시간 동안 원심분리하여 막 오염물질을 제거하고, 생성된 상층액 (가용성 부분)을 사용하여 세포질성 사이토크롬-c 방출을 검출하였으며, 펠렛은 미토콘드리아 막 (무거운 막 단백질) 부분이었다. 가용성 단백질 분액 및 등량의 무거운 막 단백질을 SDS-PAGE에 적용시키고, 사이토크롬-c에 대한 항체 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크에 소재하는 벡톤 딕킨슨 (Becton Dickinson) 제품), 전압-의존성음이온 채널 (Voltage-Dependent Anion Channel; VDAC) (미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 캘바이오켐 (Calbiochem) 제품), Smac 및 AIF (아폽토시스 유도 인자) (미국 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재하는 산타 크루즈 바이오테크놀로지 제품)를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 세포 (예를 들어 암 세포)를 3개의 미토콘드리아 경로 (시토-c 방출, Smac 방출 및 AIF 방출)에 걸쳐 고시폴 화합물로 처리한 후 아폽토시스 신호전달을 측정하였다.

처리한 세포를 수집하여 PBS로 세척하고, 처리 후에 25 mM 허페스 (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 5 mM EDTA, 5 mM 디티오티온, 2 mM 페닐메탄술포닐 플루오라이드, 10 g/mL 펩스타틴 A 및 10 g/mL 류펩틴 중에 현탁시켜 카스파제의 활성을 측정하였다. 이어서, 처리한 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 4℃에서 12000×g로 20분 동안 원심분리하여 투명하게 만들었다. 상층액 중의 카스파제-1, -2, -3, -6, -8 및 -9 활성을 형광성 카스프에이스 분석 시스템 (CaspACE Assay System) (미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션 (Promega Corp.) 제품)으로 측정하였다. 요약하자면, 비신코닌산 분석법 (프로메가 코포레이션)으로 측정한 총 단백질 50 mg을 50 mM 기질 Ac-YVAD-AMC, Ac-VDVAD-AMC, Ac-DEVD-AMC, Ac-VEID-AMC, Ac-IETD-AMC 또는 Ac-LEHD-AMC와 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 문헌 [G. Denecker et al., Cell Mol. Life Sci., 58:356-370 (200l)] 및 [V. M. Kolenko et al., Apoptosis, 5:l7-20 (2000)]에 따른 형광 분광광도계 (히다찌 (Hitachi) F-4500)를 이용하여, 360 nm에서의 여기 및 460 nm에서의 발광에 의해 메틸쿠마릴-7-아민 (AMC)의 방출을 측정하였다.

고시폴 화합물의 활성면에서의 카스파제 억제제 (예를 들어 Z-VAD-FMK (비-특이성), Z-DEVD-FMK (카스파제-3, -6, -7, -8 및 -10) 및 Z-LEHD-FMK (카스파제-9))의 효과는 표준 카스파제 억제 분석을 이용하여 측정하였다. 상기 카스파제 억제제 모두는 시판되는 것이다 (미국 캘리포니아주 리버모아에 소재하는 엔자임 시스템 프로덕트 (Enzyme System Product) 제품).

실시예 8

세포 생존 분석법

세포를 24 또는 96-웰-플레이트에 접종시키고, 배지에서의 2배 내지 10배 희석으로 고시폴 화합물을 제조하였다. 세포 생존력의 억제는 세포를 고시폴 화합물로 24시간 동안 처리하여 측정하고, 트립판-블루 분석법으로 측정하였다. 세포 성장의 억제는 세포를 억제제로 3 내지 6일 동안 처리하여 측정하고, MTT 분석법으로 측정하였다.

MTT 분석법은 신속 정확하며, 세포 생존력 측정치를 수득하기 위한 신뢰성있는 방법이다. MTT 분석법은 모스만에 의해 처음 개발되었다 [Mosmann, J. Immunol. Meth., 65:55 (1983)]. 상기 분석은 간단한 비색계 분석이며, 독성 결과를 수득하기 위해 다수의 실험실에서 사용하고 있다 (예를 들어 [Kuhlmann et al., Arch. Toxicol., 72:536 (1998)]. 요약하자면, 미토콘드리아는 ATP를 생산하여 세포에 충분한 에너지를 공급한다. 이를 위하여 미토콘드리아는 피루베이트를 대사시켜 아세틸 CoA를 공급한다. 미토콘드리아 내에서, 아세틸 CoA는 트리카르복실산사이클 내의 다양한 효소와 반응하여 ATP를 생산한다. MTT 분석법에 특히 유용한 효소들 중 하나는 숙시네이트 디히드로게나제이다. MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2 디페닐 테트라졸륨 브로마이드)는 황색의 기질이며, 숙시네이트 디히드로게나제로 절단되어 자색 포르마잔 생성물을 형성한다. 색의 변화로 미토콘드리아 기능의 변화를 확인하였다. 생존하지 못한 세포는 포르마잔을 생산할 수 없으므로, 포르마잔 생산량은 생존 세포의 양과 직접 관련된다. 540 nm에서의 흡광도를 이용하여 포르마잔 생성물의 양을 측정하였다.

시험관내 시험의 결과를 생체내 독성 시험과 비교하여 생 동물 조건에 외삽하였다. 전형적으로는, 물질의 단일 투여량으로부터의 급성 독성을 평가하였다. 몇몇의 실시양태에서, 동물을 임의의 독성 징후 (온도 증가, 호흡 곤란, 사망 등)에 대해 14일에 걸쳐 모니터링하였다. 통상적으로는, 급성 독성의 표준은 평균 치사량 (LD50)이고, 이는 처리한 집단의 반이 사망하는 것으로 예견된 투여량이다. 상기 투여량은 시험 동물을 통제된 조건하에서 일련의 기하학적 투여량에 노출시킴으로써 결정하였다. 다른 시험으로는 아급성 독성 시험 등이 있고, 아급성 독성 시험은 14일 이하 동안의 고시폴 화합물 (또는 1종 이상의 통상적인 항종양제)의 반복 투여량에 대한 동물의 반응을 측정한다. 아만성 독성 시험은 90일 동안의 반복 투여 시험을 포함한다. 만성 독성 시험은 아만성 시험과 유사하나 90일 이상의 기간에 걸쳐 지속될 수 있다. 생체내 시험은 특정 조직에 관한 독성을 결정하기 위해서도 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 종양 독성 (즉, 종양 조직의 생존에 관한 본 발명의 조성물의 효과)은 (예를 들어 종양 조직의크기 변화 및(또는) 성장 변화를 검출함으로써) 결정하였다.

세포를 억제제로 처리한 후에 세포 형태학의 질적 평가를 수행하여 세포 팽윤, 핵 팽윤, 막 수포화, 공포화 (vacuolization) 및 아폽토시스성 바디 형성 등과 같이 아폽토시스와 관련된 특성을 결정하였다.

몇몇의 실시양태에서, 아폽토시스의 DNA 수준 검출은 투넬 (TUNEL) 분석법을 이용하여 DNA 분열을 검출함으로써 수행하였다. 세포가 아폽토시스를 수행하는 경우, 아폽토시스성 엔도뉴클레아제는 고전적 DNA 래더 (ladder)를 생산함으로써 세포성 DNA에 영향을 줄 뿐 아니라, 상기 DNA 단편의 말단에서 유리 3'-OH기를 발생시킨다. 상기 기는 분자생물학-토대의 기술, 말단-표지 기술, 조직화학 기술 또는 세포화학 기술을 이용하여 아폽토시스 세포를 검출하는 TdT-FragFLTM DNA 프래그멘테이션 키트 (Fragmentation Kit) (미국 메사추세츠주 보스톤에 소재하는 온코젠 (Oncogene) 제품)로 말단-표지된다. 상기 분석법의 원리는 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (TdT)가 아폽토시스 신호에 반응하여 생성된 DNA 단편의 노출된 3'-OH 말단에 결합하고, 비오틴-표지된 디옥시뉴클레오티드 및 비표지된 디옥시뉴클레오티드의 첨가를 촉매하는 것이다. 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 (Strepavidin-Horseradish Peroxidase; HRP) 결합물을 이용하여 비오티닐화된 뉴클레오티드를 검출하였다. 디아미노벤지딘은 표지된 샘플과 반응하여 DNA 절단 부위에서 불용성의 발색 기질을 생산한다 (예를 들어 [L. Lagneaux et al., Br. J. Haematol., 112:344-352 (2001)] 및 [K. Kitamura, Leukemia, 14:1743-1750 (2000)] 참조).

다른 실시양태에서, 핵 수준 검출법 (예를 들어 형광 염료 훽스트 (Hoechst) 33258 및 요오드화 프로피듐 염색)을 사용하여 처리된 세포에서의 아폽토시스의 징후를 정량하였다. 2.5 ㎍/ml 비스벤즈이미드 훽스트 33258 형광색소 (미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 칼바이오켐 (Calbiochem) 제품)로 염색한 후에 형광 현미경으로 검사함으로써 아폽토시스를 수행하는 세포의 핵 염색질에서의 형태학적 변화를 검출하였다. 일부의 실험에서는 세포를 요오드화 프로피듐 (PI, 2.5 ㎍/ml) 및 훽스트 33258 (2.5 ㎍/ml)로 이중 염색하여 괴저 세포와 아폽토시스 세포를 구별하였다. 무손상 청색 핵, 농축된/절단된 청색 핵, 농축된/절단된 분홍색 핵 및 무손상 분홍색 핵을 각각 생존, 초기 아폽토시스, 후기 아폽토시스 및 괴저 세포로 간주하였다 (예를 들어 [B. R. Gastman et al. Cancer Res., 60:6811-6817 (2000)] 및 [N., Hail Jr., and R. Lotan, R. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 9:1293-1301 (2000)] 참조).

추가의 실시양태에서, 본 발명은 유동 세포 분석에 의한 아폽토시스 사건의 세포 수준 검출을 사용하였다. 아폽토시스를 수행하는 세포는 488 nm 레이저 선을 발사하는 팩스캔 (FACSCAN) (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크에 소재하는 벡톤 딕킨슨 제품)을 이용하여 유동 세포분석으로 검출하였고, 셀 퀘스트 (Cell Quest) 소프트웨어 (벡톤 딕킨슨 제품)를 이용하여 분석하였다. 세포의 외부에 노출된 포스파티딜세린 (아폽토시스의 주요 특성 중 하나)은 TACSTM 어넥신 (Annexin) V-FITC 키트 (미국 메릴랜드주 게이터스버그에 소재하는 트레비겐 (Trevigen) 제품)로 측정하였다. 어넥신 V-FITC 형광은 FL-1에서 검출하고, 요오드화 프로피듐은 FL-2에서검출하였다 [Hail Jr., and R. Lotan, R. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 9:1293-1301 (2000)].

실시예 9

연질-아가로스에서의 콜로니-형성

연질-한천 콜로니 형성 분석법을 이용하여 종양 세포의 변형 능력을 직접 측정하였다. 상기 분석은 생체내 종양발생과 관련된다고 공지되어 있다.

기존에는, Bcl-2 안티센스 G3139가 단독으로 세포 증식을 억제하는 경우, 화학치료적 약물과의 조합 처리가 효과를 더욱 우수하게 함이 보고되었다. 조합 처리를 이용하여 실험을 수행하여 공지된 화학치료제와의 조합시의 아폽토시스 효과 또는 Bcl-2 억제제의 세포 증식 억제를 평가하였다. 바람직한 실시양태에서, 상기 결과를 이용하여 상승적인 물질 조합을 선택하였다.

실시예 10

생체내 항종양 활성 연구

생체내 예비 연구는 고시폴이 강력한 Bcl-X_L억제제이고, 단독으로 및 추가의 통상적인 항종양제 (예를 들어 도세탁셀 (Docetaxel))와 조합되어 유의한 항-종양 활성을 발휘함을 나타내었다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 인간 암 이종이식 모델을 이용하여 철저한 생체내 항-종양 효능 및 선택성 연구를 제공하였다.

고시폴 요법에 대한 최적 투여 스케쥴을 계획하기 위하여, 본 연구는 먼저 인간 유방암 세포주 MDA-231 (클론 2LMP)을 사용한 후에 MDA-435 (LCC6) 및 T47D등과 같은 추가의 종양 이종이식 모델을 사용하였다. MDA-231은 고수준의 Bcl-2 및 고수준의 Bcl-X_L을 발현하고, MDA-435는 고수준의 Bcl-2를 발현하나 저수준의 Bcl-X_L을 발현하며, T47D는 저수준의 Bcl-2를 발현하나 고수준의 Bcl-X_L을 발현하였다. 검사된 7개의 모든 인간 유방암 세포주 중 어떤 세포주도 저수준의 Bcl-2과 저수준의 Bcl-X_L모두를 발현하지는 않았다. 그러나, 인간 전립선 DU-145 마우스 이종이식 모델은 저수준의 Bcl-2과 저수준의 Bcl-X_L를 모두 발현하므로, 이를 일부의 실시양태에서 음성 대조군으로서 사용하여 고시폴 및 고시폴 유도체의 특이성을 시험하였다.

MDA-231 모델에서, 일련의 포괄적인 투여량 및 스케쥴 조사를 수행하여 1) 95％의 통계학적 신뢰 수준에서 대조군 대비 50％의 종양 성장 억제로서 정의되는 최소 활성 투여량, 2) 25％ 초과의 체중 감소로서 정의되는 독성을 유발시키지 않는, 종양 성장의 억제에 있어 최적 투여 스케쥴, 3) 거대 종양 (2,000 mm³초과)에서 고시폴 효과, 4) 발병 또는 사망 (예를 들어 체중 감소)을 유발하지 않으면서 대조군의 마우스에게 고시폴을 투여할 수 있는 기간을 결정하였다.

최적 투여량 및 스케쥴을 확인한 후에 1종 이상의 추가의 통상적 화학치료제와의 조합 요법 시험을 수행하였고, 상기 시험에는 1) 독소루비신 (4 mg/kg), 2) 5-FU (10 mg/kg), 3) VP-16/에토포시드 (40 mg/kg), 4) 시클로포스파미드 (100 mg/kg) 및 5) 시스플라틴 (10 mg/kg) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 양성대조군으로서 탁소테레를 7.5 mg/kg의 투여량으로 사용하였다. 대조군 마우스는 비처리하거나 비히클 단독으로 처리하였다. 통계학적 신뢰성을 달성하기 위하여, 조합 요법에서는 1군 당 최소 10마리의 마우스를 사용하였다.

모든 시험에서, 마우스를 무작위로 선택한 후에 혈청을 제거한 매질에서 제조된 1 내지 5 ×10⁶개의 세포를 지방층에 주사하였다. 처리 기간 동안 상기 동물을 1주에 2회씩 측정하고 칭량한 후, 추가의 4 내지 6주 동안 1주에 2회씩 측정하였다. 각 동물의 전체적인 시각상 부검은 사망시 또는 최종 살생시에 수행하였다.

투넬 (TUNEL) 방법 (말단 디옥시리보뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 [TdT]-매개 dUTP-디옥시게닌 닉 말단 표지화)을 이용하여 조직에서의 아폽토시스 비율을 측정하여 조직 및 세포에서의 아폽토시스를 검출하였다. 상기 방법은 매우 민감하고, 계내에서 매우 소수의 아폽토시스 세포를 측정해낸다 ([Y. Gavrieli et al., J. Cell Biol., 119:493-501 (1992)] 및 [M. Dowsett et al., Cytometry, 32:291-300 (1998)] 참조). 파라핀-매입 조직을 절개하고, 절편을 표지된 완충액 중에서 5분 동안 인큐베이션한 후에 표지된 완충액 중 TdT, dNTP 혼합물 및 Mg⁺⁺를 보유하는 습윤 챔버에서 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제를 각 샘플에 10분 동안 적용하고, 세척하고, 메틸 그린 또는 헤마토크실린으로 대비염색하였다. 아폽토시스 세포의 수를 세고, 40배 배율의 광 현미경 시야 당 관찰되는 총 세포수로 나누어 아폽토시스 비율을 계산하여 퍼센트(％)로 표현하였다.

실시예 11

고시폴과 도세탁셀의 약물 상호작용

CYP3A4 대사에 대한 표현형 시험인 에리트로마이신 호흡 시험 (ERMBT)에서 고시폴 단독의 효과를 1주의 고시폴 예비 처리 후에 기저 ERMBT 수준과 비교하여 평가하였다 (예를 들어 [P. Watkins, Pharmacogenetics, 4:171-184 (1994)] 및 [J. Hirth et al., Clin. Cancer Res., 6:1255-1258 (2000)]. ERMBT는 1시간 당 방출되는¹⁴C의 비율(％)의 측정치를 제공하며, 통상적으로 정규 분포를 이용하여 근사치를 구한다 [D. Wagner, Clin. Pharm. Therap., 64:129-130 (1998)]. 표준 (알파 = 0.05), 양측, 대응 t 시험을 이용하여¹⁴C 방출량/시간의 평균 수준을 비교하였다. 기저선 평균¹⁴C 방출량/시간 (n = 21, 평균 = 2.41), 그의 표준 편차 (SD = 1.08), 시간에 따른 ERMBT 측정치의 관계 (r = 0.81)에 대한 기존의 연구 [J. Hirth et al., Clin. Cancer Res., 6:1255-1258 (2000)]로부터의 추정치를 이용하고 각 측정치에서의 일정한 분산을 추정하여 30명의 대상으로부터의 데이타를 보유하는 본 연구는 평균 ERMBT 수준에서 96％의 힘으로 20％의 감소 (2.41에서 1.93으로)를 검출하고 81％의 힘으로 15％의 감소 (2.41에서 2.05로)를 검출하였다. 평균 표준 편차 및 ERMBT 값의 범위는 대응 t 시험의 의의에 따라 표로 만들어 보고할 것이다.

실시예 12

환자 샘플에서의 도세탁셀의 약동학적 서술

고시폴과 조합 처리된 경우의 도세탁셀의 약동학적 서술을 위해 최적 샘플링전략을 이용하여 혈액을 채취하였다 [P. Baille et al., Clin. Cancer Res., 3:1535-1538 (1997)]. 도세탁셀의 주입완료 (End Of Infusion; EOI) 이전에, EOI 후 0.25, 0.75, 3.00, 6.50 및 24시간에 혈액을 직접 채취하였다. 모든 샘플을 동일한 시간에서 분석하였다. 측정된 약물 수준 및 기존에 추정된 개체 약동학적 파라미터 [R. Bruno et al., J. Clin. Oncol., 16:187-196 (1988)]를 토대로 한 도세탁셀 혈장 농도 곡선하면적 (AUC)을 도세탁셀 단독 투여에 대해 논멤 (NONMEM) 소프트웨어를 이용하여 계산하기 위하여, 베이에시안 (Bayesian) 기준을 이용하였다 [S. L. Beal and L. B. Shener, Nonlinear Mixed Effects Model Users Guides (San Francisco, CA, NONMEM Project Group, University of California at San Francisco), (1999)]. 비선형 혼합 효과 모델에 합치시켜 클리어런스 (CL)를 직접 추정하였다 [R. Bruno et al., J. Clin. Oncol., 16:187-196 (1998)]. AUC를 투여량 및 클리어런스의 함수로서 계산하고, AUC를 투여량/CL로 정의하였다. 기저선 및 그 후 1주의 고시폴 예비처리로부터의 ERMBT 값을 클리어런스에 대해 개별적으로 플롯팅하였다. 통상의 최소 자승 역행법을 사용하여 도세탁셀 CL과 ERMBT 또는 ERMBT의 자연 로그 사이의 관계를 정의하였다. 추정된 기울기를 단일 처리 도세탁셀 CL에 대해 기존에 공개된 값 [J. Hirth et al., Clin. Cancer Res., 6:1255-1258 (2000)]과 함께 나타냄으로써 고시폴과의 조합 투여시 대 단독 물질로 투여시의 도세탁셀 CL의 임의의 차이를 기재하였다.

실시예 13

환자 샘플에서의 Bcl-2 군 단백질의 발현

파라핀 블록 중에 수집된 조직 샘플에서의 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 발현은 표준 면역조직화학적 (IHC) 분석 방법을 이용하여 분석하였다. IHC 결과를 두개로 나누고 표로 만들어 상기 마커를 발현하는 환자의 비율(％)을 보고하였다. 또한, 항-종양 반응에 대한 결과를 표로 만들었다. 카이-스퀘어 통계학 또는 피셔 (Fisher) 정밀 시험을 수행하여 결과표의 예상되는 세포 수의 크기에 따라 발현과 항-종양 반응 사이의 관계를 평가하였다.

실시예 14

말초 혈액 림프구 연구

연구 처리 전 제8일 (1주의 고시폴 예비처리 후) 및 제9주 (고시폴과 도세탁셀의 1주기 완료 후)에 연구 참가자로부터 수집된 혈액 샘플을 말초 혈액 림프구 (Peripheral Blood Lymphocyte; PBL) 및 순환 상피 세포 (Circulating Epithelial Cell; CEC)를 포함하는 탐구용 연구에 사용하였다. 형광 활성화 세포 분류 (Fluorescent Activated Cell Sorting; FACS) 기술을 이용하여, PBL을 고시폴 투여 전과 후에 Bcl-2 및 Bcl-X_L의 PBL의 발현에 대해 특성화하였다. 발현된 PBL의 평균 수 및 그의 표준 편차를 각 회마다 보고하였다. 기존에 기재된 면역자기성 분리 방법 ([T. Walker et al., Proc. Amer. Soc. Clin. Oncology, 19:54b (2001)] 참조)을 이용하여 각 환자에 대해 CEC 발견의 실행가능성을 결정하였다. 수집된 혈액 10 mL 당 평균 CEC의 수 및 각 회마다 환자에 따른 그의 표준 편차를 보고하였다.

상기 명세서에서 언급한 모든 공개물 및 특허는 본원에 참조로서 혼입된다. 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않는한 본 발명의 기재된 방법 및 시스템에 대한 다양한 변형 및 변화는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시양태에 관하여 기재하였으나, 본 발명은 청구된 바와 같이 이러한 특정 실시양태에 부당하게 제한되지 않음을 이해해야 한다. 실제로, 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식을 다양하게 변형하는 것은 하기 청구항의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

<110> Weng, Shaomeng Yang, Dajun <120> Small Molecule Antagonists of BCL-2 Family Protein <130> UM-07232 <140> 10/158,769 <141> 2002-05-30 <150> 60/293,983 <151> 2001-05-30 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Asn Arg Glu Ile Val Met Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Glu Trp Asp Ala Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Gly Ile Phe Ser Ser Gln Pro Val Val His Leu Thr 35 40 45 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe 50 55 60 Ala Glu Met Ser Arg Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 65 70 75 80 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 85 90 95 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 100 105 110 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 115 120 125 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 130 135 140 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu Asn Arg Thr Glu 20 25 30 Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu 35 40 45 Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu 50 55 60 Thr Ser Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu 65 70 75 80 Gln Val Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile 85 90 95 Val Ala Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp 100 105 110 Lys Glu Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr 115 120 125 Tyr Leu Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp 130 135 140 Asp Thr Phe Val Glu Leu Tyr Gly 145 150 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg 1 5 10 15

Claims

(a) (i) Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 세포 및 (ii) 고시폴 (gossypol) 화합물을 제공하는 단계, 및

(b) 상기 세포에서 아폽토시스 (apoptosis)가 조절되는 조건하에 상기 세포를 유효량의 상기 고시폴 화합물로 처리하는 단계

를 포함하는, 세포에서 아폽토시스를 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 상기 Bcl-2 군 단백질에 결합하고, 상기 세포에서 아폽토시스가 조절되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-고시폴인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-고시폴인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-고시폴인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-고시폴론 (gossypolone)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-고시폴론인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-고시폴론인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-고시폴 아세트산인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-고시폴 아세트산인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-고시폴 아세트산인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-에틸 고시폴인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-에틸 고시폴인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-에틸 고시폴인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-헤미고시폴론인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-헤미고시폴론인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-헤미고시폴론인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-고시폴의 쉬프 (Schiff's) 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-고시폴의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-고시폴의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-고시폴론의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-고시폴론의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-고시폴론의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-고시폴 아세트산의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-에틸 고시폴의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-에틸 고시폴의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-에틸 고시폴의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (±)-헤미고시폴론의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (-)-헤미고시폴론의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 (+)-헤미고시폴론의 쉬프 염기인 방법.
제1항에 있어서, 상기 Bcl-2 군 단백질이 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, A1/BFL-1 및 BOO-DIVA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 질환에 걸린 세포인 방법.
제34항에 있어서, 상기 질환이 과증식성 질환, 암, AIDS, 퇴행성 증상, 혈관 질환 및 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 유방암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 전립선암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 림프종을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 피부암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 췌장암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 결장암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 흑색종을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 난소암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 뇌암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 간암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 방광암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 비-소세포 (non-small) 폐암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 경부 암종 (cervical carcinoma)을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 골수종을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 부신 암종을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 백혈병을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 신경모세포종 (neuroblastoma)을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 교모세포종 (glioblastoma)을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 두부-경부 암을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 암이 전이성 암인 방법.
제35항에 있어서, 상기 감염증이 병원체에 의해 유발되는 것인 방법.
제56항에 있어서, 상기 병원체가 박테리아인 방법.
제56항에 있어서, 상기 병원체가 진균인 방법.
제56항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스인 방법.
(a) (i) Bcl-2 단백질을 과발현하는 조직, (ii) 고시폴 화합물 및 (iii) 항암제를 제공하는 단계; 및

(b) 세포 분열이 조절되는 조건하에 상기 조직을 유효량의 상기 고시폴 화합물 및 상기 항암제로 처리하는 단계

를 포함하는, 조직에서 세포 분열을 조절하는 방법.
제60항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 상기 Bcl-2 군 단백질에 결합하고, 상기 세포에서 세포 분열이 조절되는 것인 방법.
고시폴 화합물을 Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법.
제62항에 있어서, 상기 고시폴 화합물이 상기 Bcl-2 군 단백질에 결합하는 것인 방법.
고시폴 화합물 및 항암제를 Bcl-2 군 단백질을 과발현하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법.
유효량의 고시폴 화합물을 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 증상이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 암을 치료하는 방법.
제65항에 있어서, Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 상기 증상이 과증식성 질환, 암, AIDS, 퇴행성 증상, 혈관 질환 및 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 증상을 포함하는 것인 방법.
제66항에 있어서, 상기 암이 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 결장암, 흑색종, 난소암, 뇌암, 간암, 방광암, 비-소세포 폐암, 경부 암종, 골수종, 부신 암종, 백혈병, 신경모세포종 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제66항에 있어서, 상기 암이 전이성 암인 방법.
제66항에 있어서, 상기 감염증이 병원체에 의해 유발되는 것인 방법.
제69항에 있어서, 상기 병원체가 박테리아인 방법.
제69항에 있어서, 상기 병원체가 진균인 방법.
제69항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스인 방법.
유효량의 고시폴 화합물 및 항암제를 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법.
유효량의 고시폴 화합물을 암 요법에 대한 내성을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법.
제74항에 있어서, 상기 암 요법이 화학 요법인 방법.
제74항에 있어서, 상기 암 요법이 방사선 요법인 방법.
제74항에 있어서, 상기 암 요법이 호르몬 요법인 방법.
Bcl-2 군 단백질의 과발현을 감소시키기에 충분한 양의 고시폴 화합물을 상기 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법.
Bcl-2 군 단백질의 과발현을 감소시키기에 충분한 양의 고시폴 화합물 및 항암제를 상기 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 암에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 암을 치료하는 방법.
(a) 고시폴 화합물, 및 (b) 상기 고시폴 화합물을 Bcl-2 군 단백질의 과발현을 특징으로 하는 대상에게 투여하기 위한 지침을 포함하는 제약 조성물.
(a) 고시폴 화합물, 및 (b) 상기 고시폴 화합물을 암 요법에 대한 내성을 특징으로 하는 대상에게 투여하기 위한 지침을 포함하는 제약 조성물.
(a) (i) 고시폴 화합물, (ii) 시험 화합물 및 (iii) 제1 세포군을 제공하는 단계;

(b) 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시킨 효과를 관찰하는 단계

를 포함하는, 고시폴 화합물 및 시험 화합물을 스크리닝하는 방법.
제82항에 있어서, (d) 상기 세포에서 관찰된 상기 효과를 상기 고시폴 화합물 단독 또는 상기 시험 화합물 단독과 접촉시킨 제2 세포군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제82항에 있어서, 상기 관찰 단계가 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시켜 상기 제1 세포군의 증식에 대한 효과를 관찰하는 것을 포함하는 것인 방법.
제82항에 있어서, 상기 관찰 단계가 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시켜 상기 제1 세포군의 아폽토시스에 대한 효과를 관찰하는 것을 포함하는 것인 방법.
제82항에 있어서, 상기 관찰 단계가 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시켜 상기 제1 세포군의 Bcl-2 군 단백질의 발현에 대한 효과를 관찰하는 것을 포함하는 것인 방법.
제82항에 있어서, 상기 관찰 단계가 상기 제1 세포군을 상기 고시폴 화합물 및 상기 시험 화합물과 접촉시켜 상기 제1 세포군의 카스파제 수준에 대한 효과를 관찰하는 것을 포함하는 것인 방법.
제82항에 있어서, (e) 상기 시험 화합물을 판매하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제88항에 있어서, 상기 화합물의 판매 단계가 고시폴 화합물을 함께 판매하는 것을 포함하는 것인 방법.
제88항에 있어서, 상기 시험 화합물이 키트로 판매되는 것인 방법.
제90항에 있어서, 상기 키트가 상기 시험 화합물을 대상에게 투여하기 위한 지침을 포함하는 것인 방법.
제88항에 있어서, 상기 시험 화합물이 제3자에 의해 판매되는 것인 방법.