EA010291B1 - Способы защиты млекопитающего от радиации - Google Patents

Способы защиты млекопитающего от радиации Download PDF

Info

Publication number
EA010291B1
EA010291B1 EA200601079A EA200601079A EA010291B1 EA 010291 B1 EA010291 B1 EA 010291B1 EA 200601079 A EA200601079 A EA 200601079A EA 200601079 A EA200601079 A EA 200601079A EA 010291 B1 EA010291 B1 EA 010291B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
flagellin
cells
radiation
activity
mammal
Prior art date
Application number
EA200601079A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200601079A1 (ru
Inventor
Андрей В. Гудков
Original Assignee
Кливлэнд Клиник Фаундейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Кливлэнд Клиник Фаундейшн filed Critical Кливлэнд Клиник Фаундейшн
Publication of EA200601079A1 publication Critical patent/EA200601079A1/ru
Publication of EA010291B1 publication Critical patent/EA010291B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A61K31/355—Tocopherols, e.g. vitamin E
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A61K31/568—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/661—Phosphorus acids or esters thereof not having P—C bonds, e.g. fosfosal, dichlorvos, malathion or mevinphos
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4748—Details p53
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу защиты млекопитающего от радиации, который включает введение млекопитающему композиции, содержащей флагеллин.

Description

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 60/526460, поданной 2 декабря 2003 г., предварительной заявки на патент США № 60/526461, поданной 2 декабря 2003 г., предварительной заявки на патент США № 60/526496, поданной 2 декабря 2003 г., а также предварительной заявки на патент США № 60/526666, поданной 2 декабря 2003 г., содержание которых приводится здесь путем ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к использованию флагеллина для защиты млекопитающих от апоптотических эффектов, а именно, к использованию флагеллина для защиты млекопитающих от воздействия стрессов, таких как радиация и терапия рака.
Предпосылки создания изобретения
Превращение нормальных клеток в опухолевые сопровождается утратой клеточных механизмов негативной регуляции роста, включающей устойчивость к стимулам, ингибирующим рост, а также потерю зависимости от факторов роста и гормонов. Традиционная терапия рака, использующая радиоактивное облучение или применение цитотоксических лекарств, основана на различиях в регуляции роста нормальных и раковых клеток.
При традиционной терапии рака клетки подвергаются сильному генотоксическому стрессу. В этих условиях деление большинства нормальных клеток блокируется, и поэтому они выживают, в то время как опухолевые клетки продолжают делиться и погибают.
Однако природа традиционной стратегии терапии рака такова, что при проведении такой терапии риску подвергаются и обычные ткани, в которых происходит быстрая пролиферация или апоптоз. Повреждение этих, в норме быстро делящихся клеток является причиной хорошо известных побочных эффектов терапии рака (чувствительными тканями являются кроветворные органы, тонкая кишка, волосяные фолликулы). К естественной чувствительности таких тканей добавляется то, что в раковых клетках зачастую появляются дефекты механизмов апоптоза, и те терапевтические процедуры, которые приводят к гибели клеток в нормальных чувствительных тканях, могут не быть столь же губительными для раковых клеток. Обычно предпринимаемые попытки свести к минимуму побочные эффекты при лечении рака основаны на (а) придании клеткам опухоли большей восприимчивости к воздействию, (б) придании методам лечения рака большей селективности по отношению к клеткам опухоли, или (с) стимулировании регенерации нормальных тканей после лечения (например, с использованием эритропоэтина, фактора, стимулирующего рост колоний гранулоцитов-макрофагов (СМ-С8Р - дгапи1осу1е тасгорйаде со1опу 8Йти1а1юп ГасЮг), и фактора роста кератиноцитов (КСР - кегайпосу1е що\\111 ГасЮг)).
На настоящий момент существует острая необходимость создания терапевтических агентов, способных уменьшить побочные эффекты, вызываемые химиотерапией и лучевой терапией при лечении рака. Настоящее изобретение восполняет эту необходимость и предоставляет другие преимущества при решении близких проблем.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к способу защиты пациента при одном или нескольких видах терапии, вызывающей апоптоз, который включает введение пациенту композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность ΝΡ-кВ (пис1еаг ГасЮг кВ - ядерный транскрипционный фактор каппа В). Таким агентом может быть флагеллин или ΤΟΡβ (ЦаиГогттд дго\\!11 ГасЮг β - трансформирующий фактор роста β), который, в свою очередь, может быть латентным ΤΟΡβ. Терапией может быть терапия рака, которая может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию.
Изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от рака, сопровождающегося конститутивной активностью ΝΡ-кВ, включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность ΝΡ-кВ. Таким агентом может быть флагеллин или ΤΟΡβ, который, в свою очередь, может быть латентным ΤΟΡβ. Этот агент можно вводить до, во время или после терапии рака. Терапия может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения здоровых тканей, возникшего в результате терапии рака, включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность ΝΡ-кВ. Агентом может являться флагеллин или ΤΟΡβ, который, в свою очередь, может быть латентным ΤΟΡβ. Агент можно вводить до, во время или после терапии рака. Терапией может являться химиотерапия или облучение.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения здоровых тканей, связанного со стрессом, включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность ΝΡкВ. Таким агентом может быть флагеллин или ΤΟΡβ, который, в свою очередь, может быть латентным ΤΟΡβ. Агент можно вводить до, во время или после терапии заболевания, которым страдает млекопи
- 1 010291 тающее.
Настоящее изобретение относится также к способу регуляции старения клеток у млекопитающих, включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность ΝΡ-κΒ. Таким агентом может быть флагеллин или ΤΟΡβ, который, в свою очередь, может быть латентным ΤΟΡβ. Агент можно вводить до, во время или после терапии заболевания, которым страдает млекопитающее.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей агент, индуцирующий активность ΝΡ-κΒ, химиотерапевтическое лекарство, а также, возможно, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель или носитель. Агентом может быть флагеллин или ΤΟΡβ, который, в свою очередь, может быть латентным ΤΟΡβ.
Настоящее изобретение относится также к способу выявления индукторов ΝΡ-κΒ, включающему добавление предполагаемого индуктора к системе экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ, и отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ, при этом индуктор ΝΡκΒ определяется по способности увеличивать уровень экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ.
Настоящее изобретение также относится к способу защиты млекопитающего от воздействия радиоактивного облучения, включающему введение указанному млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность ΝΡ-κΒ. Таким агентом может быть флагеллин, который может быть выделен из какого-либо вида 8а1тоие11а. Композиция может вводиться в комбинации с радиопротектором. Радиопротектором может быть антиоксидант, которым может быть амифостин или витамин Е. Радиопротектором также может быть цитокин, который, в свою очередь, может являться фактором стволовых клеток.
Настоящее изобретение относится к способу защиты пациента при одном или нескольких видах терапии или состояния, вызывающих апоптоз, который включает введение указанному пациенту композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество агента, индуцирующего ΝΡ-κΒ. Таким агентом может быть флагеллин, выделенный из какого-либо вида 8а1тоие11а. Терапия может быть терапией рака, которая, в свою очередь, может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию. Состоянием может быть стресс, который, в свою очередь, может представлять собой радиоактивное облучение, рану, отравление, инфекцию и температурный шок.
Настоящее изобретение также относится к способу выявления модуляторов апоптоза, включающему добавление предполагаемого модулятора к апоптотической клеточной системе, и отдельное добавление контроля к апоптотической клеточной системе, при этом модулятор апоптоза определяется по способности изменять апоптотический индекс, причем предполагаемый модулятор выделяют из паразита млекопитающего.
Настоящее изобретение относится также к способу выявления модуляторов ΝΡ-κΒ, включающему добавление предполагаемого модулятора к системе экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ, и отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ, при этом модулятор ΝΡ-κΒ определяют по способности изменять уровень экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ, причем предполагаемый модулятор получают из паразитов млекопитающих. Паразит принадлежит к видам, включающим 8а1тоие11а, Муеор1акта и СЫатуШа, но не ограничивающимся ими.
Настоящее изобретение относится также к способу выявления модулятора ΤΟΡβ, включающему добавление предполагаемого модулятора к системе экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ, И отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность ΝΡ-κΒ, при этом модулятор ΤΟΡβ определяют по способности изменять уровень экспрессии, отражающей активность ΤΟΡβ, причем предполагаемый модулятор получают из паразитов млекопитающих. ΤΟΡβ может быть латентным ΤΟΡβ. Паразит может принадлежать к видам, включающим 8а1тоие11а, Муеор1а§та и СЫатуШа, но не ограничивающимся ими.
Настоящее изобретение относится также к способу выявления модулятора р53, включающему добавление предполагаемого модулятора к системе экспрессии, отражающей активность р53, и отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность р53, при этом модулятор р53 определяют по способности изменять уровень экспрессии, отражающей активность р53, причем предполагаемый модулятор получают из паразитов млекопитающих. Паразит может принадлежать к видам, включающим 8а1тоие11а, Муеор1а§та, и СЫатуШа, но не ограничивающимся ими.
Настоящее изобретение относится также к модулятору, выявленному с помощью описанных здесь способов. Также настоящее изобретение относится к композиции, включающей описанный здесь модулятор. Композиция может являться фармацевтической композицией, содержащей фармацевтически приемлемое количество описанного здесь модулятора.
Настоящее изобретение относится также к способу лечения рака, включающему введение объекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции, содержащей модулятор, усиливающий апоптоз.
Настоящее изобретение относится также к способу защиты пациента при одном или нескольких ви
- 2 010291 дах лечения, вызывающих апоптоз, который включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей модулятор, ингибирующий апоптоз. Один или несколько видов лечения могут представлять собой терапию рака. Терапия рака, в свою очередь, может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано, что инфекция Ба1топе11а приводит к локализации ΝΤ-κΒ в ядрах даже неинфицированных клеток. Клетки НТ29 выращивали на покровных стеклах, причем клетки либо ложно инфицировали, либо не подвергали обработке, либо инфицировали Ба1топе11а (урЫтипит. либо обрабатывали фактором некроза опухоли α (ΤΝΤα - (итог песгов1в Гас(ог α) (10 нг/мл).
А: НТ29 клетки искусственно инфицировали при множественности инфекции (МИ) 100 штаммом Ба1топе11а 1ур1ппшп БНУ 11030, экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок (ΟΤβ - дгееп Г1иогевсеп1 рго1еш) под промотором вваН, который является единственным активным промотором в инфицированной клетке-хозяине. Клетки фотографировали с помощью микроскопии по методу светлого поля (МСП), и детектировали с помощью иммунофлуоресценции окрашивание 0РР или 6-диамидино-2фенилиндол дигидрохлоридом (ΌΆΡΙ - 6-б1ат1бто-2-р1епу1шбо1 бШубгосЫопбе). Для выявления зараженных клеток изображения совмещали наложением.
Б: Клетки НТ29 оставляли необработанными, инфицировали штаммом 1103 Ба1топе11а (урЫтипит или обрабатывали ΤΝΤα. Как указанно, локализацию субъединицы р65 ΝΤ-κΒ (Ке1Л) при различных условиях контролировали с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Визуализацию клеток осуществляли с помощью микроскопии по методу светлого поля (МСП), ядра клеток окрашивали с помощью ΌΆΡΙ, а субъединицу р65 (Ке1Л) визуализировали с помощью флуоресцеин изотиоцианата (МТС - Г1иогевсеш 1во11посуапа1е). Цвет окраски ΌΆΡΙ искусственно изменен на красный, чтобы сделать визуализацию этой окраски лучше опознаваемой при наложении.
На фиг. 2 показано, что белковый фактор в культуральной жидкости Ба1топе11а приводит к активации ΝΤ-κΒ.
А: 100-кратно концентрированную культуральную жидкость Ба1топе11а биЫт, обрабатывали, как указано выше, или проводили, как указано, стимуляцию клеток НТ29 инфекционными бактериями. ДНКсвязывающую активность ΝΤ-κΒ определяли методом анализа задержки в геле (ЕМБА - е1ес1гор1югейс тойййу вЫй аввау) на экстрактах целых клеток, приготовленных через 45 мин после обработки. Аутентичность ΝΤ-κΒ ДНК-белкового комплекса определяли, используя суперсдвиг р65 (Ке1Л)-специфичных и р50-специфичных антител.
Б: концентрированную культуральную жидкость Ба1топе11а биЫт (ΙΝ) изучали с помощью гельпроникающей хроматографии на колонке с гелем Супероуз 12 (Бирегове 12). Элюированные белковые фракции анализировали фракционированием и методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (10% БЭБ-РЛ0Е - 10% вобшт бобесу1 ви1Га(е ро1уасгу1 аппбе де1 е1ес1гор1югев1в) и визуализировали с помощью окраски кумасси голубым (КГ). Отмечены маркеры молекулярного веса для гель-проникающей хроматографии. Аликвоты каждой фракции использовали, как указано, для стимулирования клеток НТ29 и анализировали с помощью ЕМБА ДНК-связывающую активность ΝΤ-κΒ в полученных в результате экстрактах целых клеток (ЭЦК).
В: концентрированную культуральную жидкость Ба1топе11а биЫш (ΙΝ) анализировали ионообменной хроматографией на матрице РОК.ОБ НЦ. Белки элюировали в возрастающем градиенте ИаС1, как указано, и анализировали с помощью 10% БЭБ-РА0Е, а затем визуализировали окрашиванием Кумасси голубым (КГ). Расход и аликвоты каждой фракции использовали, как указано, для стимуляции клеток НТ29, и получающиеся в результате ЭЦК анализировали с помощью ЕМБА на ДНК-связывающую активность ΝΤ-κΒ. Элюированный материал, соответствующий белковым полосам В1-В6, и пустой участок геля, выделенный из дубликата 10% БЭБ-РА0Е геля, вместе с образцами буфера из начала и конца буферного градиента №1С1 использовали для стимулирования клеток НТ29, затем полученные в результате ЭЦК анализировали с помощью ЕМБА на ДНК связывающую активность ΝΤ-κΒ.
На фиг. 3 показано, что фактор, активирующий ΝΤ-ΝΤ-κΒ в культуральной жидкости Ба1топе11а, представляет собой флагеллин, что обнаружено с помощью метода масс-спектрометрии. На фиг. 3 показаны результаты тандемной масс-спектрометрии в сочетании с микрокапиллярной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) В2, переваренной трипсином. Пики, соответствующие белкам Ба1топе11а, пронумерованы и идентифицированы в соответствии с номерами пептидных цепочек справа.
На фиг. 4 показано, что мутантные формы флагеллина не вызывают активации ΝΤ-κΒ.
А: ЕМБА анализ на ДНК-связывающую активность ΝΤ-κΒ в ЭЦК, полученных через 45 мин из неинфецированных клеток (ϋΝ) и после прямого инфицирования клеток НТ29 диким типом Е.сой ΌΗ5α, диким типом Ба1топе11а биййп или мутантом БорЕ-, мутантом БорΒ-, двойным мутантом БорЕ-/БорΒ-, диким типом Ба1топе11а 1урЫтипит, штамм 1103, мутантом ГИС- (ГИС- ::Тп10), двойным мутантом Г11С /Β)Β-, как указано, при МИ 50.
Б: ЕМБА анализ на ДНК связывающую активность ΝΤ-κΒ на ЭЦК, полученных через 45 мин после контрольного заражения клеток НТ29 из незараженных клеток (ϋΝ) или на стерильно фильтрованных
- 3 010291 концентрированных культуральных жидкостях бактерий дикого типа и мутантных бактерий.
На фиг. 5 показано, что флагеллин необходим для активации многих сигнальных путей при инфекции 8а1топе11а и приводит к локализации в ядре ΝΡ-κΒ.
А: Клетки НТ29 не подвергались обработке или стимулировались ΤΝΡα (10 нг/мл) или смесью анизомицина (20мг/мл)/форболмиристат ацетата (РМА - ркогЬо1 тугБ1а1е аее!а!е) (12,5 нг/мл) в течение 15 мин, или инфицировались диким типом (ДТ) 8а1топе11а 1ур1итипит. штамм 1103, или 8а1топе11а 1урЫтцгшт, двойным мутантом Πίί.'-/ΠίΒ-. штамм 134. ЭЦК изготавливали через указанное время или через 10 мин в случае клеток, обработанных ΤΝΡ, либо через 15 мин в случае клеток, обработанных анизомицином/РМА; далее указанные ЭЦК использовали для анализа ДНК связывающей активности ΝΡ-κΒ, или в иммунно-киназном анализе (ИКА), с использованием анти-ΙΚΚ (ΙκΒ ктаке - киназа ΙκΒ) или анти-ΡΝΚ (е-1ип Ν-^ηηίπ;·ι1 кшаке - с-1ип Ν-концевая киназа) антител для измерения ΙΚΚ и ΡΝΚ киназной активности на соответствующих субстратах ΙκΒα 1-54 и с1ип 1-79, меченных 68Τ (д1и1а1юп-8-1гап51ега8е - глютатион-8-трансфераза) (как указано). Иммунноблот-анализ (ИБА) эквивалентных количеств (40 мкг) белка из каждого экстракта разделяли на фракции на 8Ό8-ΡΑ6Ε геле и переносили на поливиниледенфторидные (РУЭР-ро1уу|п|11Йепе Пиопйе) мембраны, затем осаждали с указанными антителами с обнаружением основной массы ΙΚΚ, ΡΝΚ, ΕΚΚ (ех!гасе11и1аг 81дпа1 гедц1а!ей ките - киназа, регулируемая внеклеточным сигналом), а также субъединицы р38, как указано. В иммунноблот-анализах использовали фосфоспецифичные антитела на ΕΚΚ и субъединицу р38 для обнаружения активированных ΕΚΚ и р38.
Б: Данные иммунофлуоресценции, показывающие, что мутант 8а1топе11а по флагеллину не инфицирует клетки НТ29, и что стимуляция клеток НТ29 очищенным флагеллином приводит к локализации ΝΡ-κΒ субъединицы р65 (Ке1А) в ядрах, что установлено с помощью непрямой иммуннофлуоресценции. Изображения отмеченных обработанных НТ29 клеток, выращенных на покровном стекле, точно такие же, как на фиг. 1А и В. Искусственное изменение цвета метки ΌΑΡΙ использовано для усиления визуализации как окрашенных ядер ΌΑΡΙ, так и ядерной локализации субъединицы р65.
На фиг. 6 показано, что очищенный флагеллин активирует сигнальные пути и экспрессию противовоспалительных генов в клетках эпителия кишечника, что имитирует эффект инфекции диким типом 8а1топе11а. ΗΤ29 оставляли необработанными или обрабатывали ΤΝΡα (10 нг/мл) или сывороткой анизомицина (20 мкг/мл)/РМА (12,5 нг/мл) в течение 10 мин, или флагеллином (1 мкг/мл) за такое же время. ЭЦК готовили и анализировали методом ΕΜ8Α, определяя ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ, методами иммунно-киназного анализа (ИКА) и иммуноблот-анализа (ИБА) с использованием фосфоспецифических антител на ΕΚΚ или р38, обнаруживая таким образом их активацию, и с помощью киназа-специфических антител, как описано на фиг. 5А, определяя общее количество киназ.
Α: ΕΜ8Α анализ, определяющий ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ.
Б: иммунноблот-анализ и анализ киназной активности, выявляющий киназную активность ΙΚΚ, ΡΝΚ, ΕΚΚ и р38, а также общее количество белка, как на фиг. 5.
В: полуколичественная ΚΤ-РСК (геуегке 1гап8сг1р1а8е ро1утегаке скат геасйоп -полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой), выявляющая экспрессию противовоспалительных генов у не обработанных, обработанных диким типом, двойным мутантом по флагеллину 8а1топе11а (урктшпит и стимулированных ΤΝΡα (10 нг/мл) или флагеллином (1 мкг/мл) клеток. Клетки НТ29 были собраны в указанное время после описанной выше обработки, и выделенная РНК использовалась как матрица для первой цепи комплементарной ДНК, которую затем использовали в ΚΤ-РСК с ген-специфическими праймерами для интерлейкина 1α (ΙΕ1α), интерлейкина 1β (ΙΜ β), инерлейкина 8 (ΙΕ-8), фактора некроза опухоли α (ΤΝΡα), белка-хемоаттрактанта макрофагов 1 (МСР 1 - тасгоркаде скетоа11гас1ап1 рго1еш) и βактина. β-актин использовался в качестве контроля для нормализации паттернов экспрессии. Конечные продукты ΚΤ-РСК разделяли на фракции в 2% агарозном геле и выявляли окраской бромистым этидием.
На фиг. 7 показано, что активация ΝΡ-κΒ, опосредованная флагеллином, зависит от МуЭ88. Инфекционный дикий тип 8а1топе11а йнЬкп (МИ 100), ΙΕ-1 (20 нг/мл), очищенный флагеллин (1 мкг/мл) (как отмечено), стерильно-профильтрованный и сконцентрированный через фильтр 100 кДа ультраконцентрат надосадочной жидкости культуры дикого типа 8а1топе11а йиЬкп и 8орΕ-/8орΒ- двойной мутант 8а1топе11а йиЬкп штамма 8Ε18Β2 (как отмечено 82), использовались для стимулирования дикого типа (ДТ), МуЭ88-/- нокаутов и ΤΕΚ277ΤΕΚ47- двойных нокаутов эмбриональных мышиных фибробластов (ΜΕΡ - тоике етЬгуо ПЬгоЫаЧ). ЭЦК готовили через 45 мин после обработки и анализировали методом ΕΜ8Α на ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ. РС-1 (20 нг/мл) использовали в качестве положительного контроля при исследовании функции ΜνΩ88.
На фиг. 8 показано, что ΤΕΚ5 (1о11-Пке гесер!ог 5 - 1о11-подобный рецептор 5) ингибирует флагеллинопосредованную активность репортерного гена ΝΡ-κΒ. Проводили трансфекцию клеток НТ29 на 6луночном планшете трижды, используя указанные доминантно-негативные экспрессионные векторы ΤΕΚ млекопитающих (ΌΝ-ΤΕΚ векторы), или антисмысловую РНК ΤΕΚ5 (Α8 ΤΕΚ5) (2 мкг/лунка), генрепортер 2χΝΡ-κΒ Ьис (100 нг/лунка), рКЬ-ΤΚ люциферазу Ренилла для нормализации (50 нг/лунка), доведенную до общего количества 4 мкг ДНК/лунка с помощью ДНК пустого вектора плазмидной кДНК 3.1. (ροϋΝΑ3.1).
- 4 010291
А: двукратное индуцирование ΝΡ-кВ Ьис-репортерного гена в нестимулированных клетках (светлая штриховка) и обработанных ΤΝΡα (10 нг/мл) клетках (темная штриховка). Лизат готовили через 12 ч после стимуляции. Приведены результаты показательных экспериментов.
Б: проводили трансфекцию клеток НТ29 как на фиг. 8 А, затем обрабатывали их флагеллином (1 мкг/мл) и получали и анализировали клеточный лизат. Приведены результаты показательных экспериментов.
На фиг. 9 показано, что стимуляция флагеллином клеток эпителия кишечника приводит к активации подсистемы генов ТБК. Клетки НТ29 стимулировали флагеллином (1 мкг/мл) и спустя 3 ч выделяли РНК, используя тризол. Эту РНК затем использовали для получения первой нити комплементарной ДНК. В КТ-РСК. использовали ген-специфичные праймеры для каждого ТЕК. В качестве стандарта для нормализации образцов экспрессии использовали β-актин.
На фиг. 10 показано, что ТЬК5 экспрессируется во многих типах клеток и проявляет различный ответ на флагеллин.
А: экстракт целых клеток получали из нестимулированных клеток Т84, НТ29, А549, 293Т и Т98С и разделяли на фракции на 8% 8Ό8-ΡΑΟΕ геле, белки переносили на поливинилдифторидную мембрану и брали пробы для иммунноблот-анализа (ИБА) с анти-ТЕК5 антителами. Общее количество белка выявляли антителами на актин.
Б: клетки НТ29, А549, НеЬа, 293Т и Т98С оставляли необработанными (--), обрабатывали флагеллином (Ρ), или Т№а (Т), затем спустя 45 мин готовили ЭЦК и использовали их в ΕΜ8Α для определения ДНК связывающей активности ΝΡ-κΒ. Аутентичность сдвига полосы ΝΡ-κΒ определяли, используя суперсдвиг р65 (Ке1А)-специфичных антител.
На фиг. 11 показано, что недостаток р53 ускоряет развитие синдрома гамма-облучения у мышей.
А: внутрибрюшинная инъекция РРТа (ρίΠίρτίη а1рйа - пифитрин альфа) (10 мг/кг) защищает мышей линии С57В1/61 (если не отмечено иначе, здесь и ниже использовали самцов мышей 6-8 недельного возраста) при однократном облучении дозой 9 Гр и серии облучений общей дозой 12,5 Гр (5 раз по 2,5 Гр). РРТа не влиял на выживание мышей, которых подвергали однократному воздействию ионизирующего излучения дозой 12,5 и 25 Гр (приведены результаты показательных экспериментов, использовали источник 811ер11егй 4000 Кюри, Цезий 137, мощность дозы 4 Гр/мин).
Б: мыши дикого типа и р53-нулевые мутанты линии С57В1/61 отличаются по относительной чувствительности к низким (10 Гр) и высоким (15 Гр) дозам гамма-излучения: мыши дикого типа были более чувствительными к облучению дозой 10 Гр, но более устойчивы к облучению дозой 15 Гр по сравнению с р53-нулевыми мутантами.
В: мышам, все тело которых облучали гамма-излучением дозой 11 Гр, через 12 ч после облучения инъецировали 1,5х107 клетки костного мозга (ККМ) мышей дикого типа или синнгенных р53-нулевых мутантов линии С57В1/61. (Данная доза вызывает стопроцентный летальный исход в контрольной группе мышей, не подвергавшихся инъекции). Два месяца спустя после полного восстановления гемопоэза, животных облучали по всему телу гамма-излучением дозой 15 Гр, и при этом обнаружили отсутствие разницы в показателе смертности между двумя группами, различающимися по статусу активности р53 клетках костного мозга.
Г: сравнение динамики поражения тонкой кишки мышей дикого типа и р53-нулевых мутантов в указанные точки времени после воздействия гамма-излучением дозой 15 Гр показало увеличение повреждений у р53-нулевых мутантов (парафиновый срез, окрашенный гематоксилином/эозином; 125-кратное увеличение). Приведены фотографии, сделанные спустя 24 ч, срезов крипт, окрашенных методом ^ΝΕΕ (Тегшша1 йеохупис1ео!1йу1 ТгапкЕегаке Вюйп-йИТР №ск Εηά ЬаЬе1шд - мечение йИТР биотином концов однонитевых разрывов с помощью терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы), на которых очевидны значительные объемы апоптоза у дикого типа, но не в р53-дефицитном эпителии.
На фиг. 12 показана динамика пролиферации и продолжительности жизни клеток в тонкой кишке мышей дикого типа и р53-нулевых мутантов.
А: сравнение скорости пролиферации в кишечнике мышей дикого типа и р53-нулевых мутантов после воздействия ионизирующего излучения (слева). Радиоаутограммы срезов всего тела (1,7-кратное увеличение) 4-недельных мышей дикого типа и р53-нулевых мутантов, которым инъецировали внутрибрюшинно 14С-тимидин (10 мкКи на животное) и воздействовали гамма-излучением дозой 15 Гр, или не подвергали воздействию (по ^е81рйа1 и др. 1997). Стрелками обозначен кишечник. (Справа) сравнение включения Вгйи (Ьготойеохшпйше - бромдеоксиуридин) клетками тонкой кишки мышей дикого типа и р53-нулевых мутантов в различные промежутки времени после облучения дозой в 15 Гр. Вгйи (50 мг/кг) инъецировали за 2 ч до умерщвления животного и проводили иммунохимическое окрашивание согласно процедуре, описанной ранее (ХУабоп и Ргйсйагй 2000). Фотографии 96-часовых опытов приведены в большем увеличении (в 400 раз).
Б: сравнение количества Вгйи положительных клеток на крипту в тонком кишечнике мышей дикого типа и р53-нулевых мутантов в разные моменты времени после воздействия гамма-излучением дозой 15 Гр. На каждый момент времени анализировали трех животных, с каждого животного делали пять по
- 5 010291 перечных срезов подвздошной кишки и изучали их под микроскопом с целью установить число крипт и ворсинок. Количество Вгби-положительных клеток в криптах подсчитывали в пяти областях размером 100-300 крипт, выбранных случайным образом при 200-кратном увеличении, и общее число ВгбИ положительных клеток наносили на диаграмму.
В: Определение количества ВгбИ-меченых клеток в тонком кишечнике мышей дикого типа и р53нулевых мутантов в разные моменты времени после воздействия гамма-излучением дозой 15 Гр. ВгбИ инъецировали за 30 мин до облучения и умертвляли мышей в указанные моменты времени. Была обнаружена повышенная миграция из крипт в ворсинки, за которой последовала быстрая гибель меченых клеток.
На фиг. 13 показано, что рекомбинантный флагеллин способен активировать ΝΓ-кВ.
На фиг. 14 показаны результаты экспериментов, направленных на определение способности флагеллина защищать мышей от радиации. Мышам линии С56ВЬ6 (самцы шестинедельного возраста, по 10 животных в группе) инъецировали внутрибрюшинно 2,0 мкг (0,1 мг/кг) или 5,0 мкг (0,25 мг/кг) флагеллина в РВБ. Спустя 4 ч мышей подвергали облучению дозой 15 Гр и ежедневно отслеживали выживание мышей.
На фиг. 15 показаны гистологические срезы (окрашивание гематоксилин/эозин) эпителия тонкой кишки мышей, облученных дозой 15 Гр, которым инъецировали внутрибрюшинно 0,25 мг/кг флагеллина, и не подвергавшихся инъекции. У контрольных мышей наблюдалось полное разрушение крипт и ворсинок в отличие от животных, обработанных флагеллином, у которых наблюдалась нормальная морфология: тканей.
На фиг. 16 показано влияние флагеллина на чувствительность мышей к воздействию на все тело гамма-излучением дозой 10 Гр.
На фиг. 17 показано влияние флагеллина, инъецированного внутрибрюшинно в указанные моменты времени до облучения, на чувствительность мышей к воздействию на все тело гамма-излучением дозой 13 Гр (слева) и 10 Гр (справа).
На фиг. 18 показано влияние флагеллина на чувствительность мышей к воздействию на все тело гамма-излучением дозами 10, 13 и 15 Гр.
На фиг. 19 показана доменная структура бактериального флагеллина. Показаны очертания Са остова, распределение гидрофобных ядер и структурная информация о Р41. Четыре отдельных гидрофобных ядра представляют собой домены Ό1, Ό2, Э2Ь и Ό3. Вместе с Са остовом показаны все гидрофобные атомы боковой цепи. Группы в боковой цепи маркированы цветом: А1а (аланин) - желтый; Ьеи (лейцин), 11е (изолейцин) или Уа1 (валин) - оранжевый; РЬе (фенилаланин) и Туг (тирозин) - фиолетовый (атомы углерода) и красный (атомы кислорода), (с) обозначает позиции и регионы различных структурных черт последовательности аминокислот флагеллина. На чертеже приведены (сверху вниз): фрагмент Р41 - голубой, три складки β-листа - коричневый, распределение вторичной структуры α-спиралей - желтый, βструктура - зеленый и β-поворот - фиолетовый; метка на каждом 50 остатке - голубой; домены Ό0, Ό1, Ό2, и Ό3; регион контакта с осевой субъединицей в протоэлементе - бирюзовый; высоко консервативная аминокислотная последовательность - красный, и вариабельный регион - лиловый; точечные мутации в Р41, продуцирующие элементы различных суперспиралей. Буквы указывают морфологию мутантных элементов: Ь (Ό107Ε, В124А, В124Б, О426А), линия Ь-типа; В (А449У), линия В-типа; С (Ό313Υ, А414У, А427У, Ν433Ό), виток 33. (Баша1еу е! а1., ΝοΙιιιό 2001).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на защите нормальных клеток и тканей от апоптоза, вызванного стрессом, включающим химиотерапию, лучевую терапию и облучение, но не ограничивающимся ими. Есть два основных механизма контроля апоптоза в клетке: путь р53 (проапоптический) и ΝΓ-кВ путь (антиапоптический). Регуляция обоих путей в опухолях часто нарушается: р53 обычно утрачивается, в то время как ΝΓ-кВ становится конститутивно активным. Так, ингибирование р53 и активация ΝΓ-кВ в нормальных клетках может обеспечить защиту клеток от смерти, вызванной стрессом, таким как терапия рака, но клетки опухоли не станут более устойчивыми к терапевтическим воздействиям, поскольку в них эти механизмы контроля нерегулируемы. Эти данные опровергают традиционный взгляд на р53 и ΝΓ-кВ, которые рассматриваются в качестве мишеней для активации и репрессии соответственно.
Настоящее изобретение относится к индуцированию активности ΝΓ-кВ с целью защиты нормальных клеток от апоптоза. Индуцируя ΝΓ-кВ активность у млекопитающих, можно защитить нормальные клетки от апоптоза, связанного с клеточным стрессом, который возникает при терапии рака, гипертермии, облучении опасными дозами излучения, риску которого в высокой степени подвержены, например, солдаты, рабочие на атомных станциях, оборонной промышленности или при радиационно-опасном производстве фармпрепаратов, а также предотвратить клеточное старение. Поскольку ΝΓ-кВ конститутивно активен в большинстве опухолевых клеток, путем индукции активности ΝΓ-кВ можно защитить нормальные клетки от апоптоза, не оказывая нежелательного положительного воздействия на клетки опухоли. Как только нормальные клетки восстановятся, можно восстановить нормальный уровень ΝΓ-кВ активности. Активность ΝΓ-кВ можно индуцировать для защиты тканей, восприимчивых к облучению и
- 6 010291 химиотерапии, к которым относятся, например, ткани кроветворной системы (включая иммунную систему), ткани эпителия кишечника и волосяные фолликулы.
Индукторы активности ΝΡ-κΒ могут применяться также по различным другим назначениям. Патологии и смерть, являющиеся следствием действия на млекопитающих различных факторов, включающих радиацию, ранения, отравления, инфекции, старение, а также температурный шок, но не ограничивающихся указанным, могут быть, следствием действия нормальных физиологических механизмов ответа на стресс, таких как индукция программируемой смерти клеток (апоптоз) или выделение биоактивных белков, цитокинов.
Обычной функцией апоптоза является «чистка» тканей от поврежденных, в том числе генетически клеток, в то время как цитокины служат для мобилизации защитных механизмов организма против патогенных воздействий. Однако в условиях сильной травмы сами механизмы ответа на стресс могут вызывать смерть. Например, смерть от облучения может являться следствием обширного апоптоза, опосредованного р53, который происходит в кроветворной, иммунной и пищеварительной системах. Целесообразная фармакологическая регуляция ΝΡ-κΒ может повысить выживаемость в условиях сильного стресса. Управление этими факторами может также сделать возможным контроль как над противовоспалительной системой, так и над выбором между жизнью и смертью в клетках пораженного органа.
Защитная роль ΝΡ-κΒ опосредована активацией транскрипции множества генов, кодирующих: (а) антиапоптические белки, блокирующие оба главных пути апоптоза, (б) цитокины и факторы роста, индуцирующие пролиферацию и поддержание жизни гемопоэтических и других стволовых клеток, и (в) белки, являющиеся мощными антиоксидантами, утилизирующими активные формы кислорода, например ΜηδΘΌ (таидаиеке 8ирегох1бе бйтШаке 2 - дисмутаза супероксида марганца 2). Таким образом, временно активируя ΝΡ-κΒ для защиты от излучения, можно достичь не только подавления апоптоза у больных раком, но и уменьшить вероятность вторичного возникновения рака благодаря одновременному иммуностимулирующему эффекту, которого можно достичь, если активировать ΝΡ-κΒ через активацию Τо11-рецепторов.
Другой выгодной особенностью использования ΝΡ-κΒ в качестве мишени является возможность его активации с помощью многих природных факторов, которые можно рассматривать в качестве возможных радиопротекторов. Среди них можно отметить различные связанные с патогенами молекулярные паттерны (ПМП). ПМП являются молекулами, отсутствующими в организме хозяина, они характерны для больших групп болезнетворных организмов и мало подвергаются мутациям. Они распознаются ШИ-подобными рецепторами (ΊΕΡ.), которые являются ключевыми чувствительными элементами врожденного иммунитета. 1ЪК действуют как первый предупреждающий механизм иммунной системы, индуцируя миграцию и активацию иммунокомпетентных клеток непосредственно или через выделение цитокина. ΤΕΚ. представляют собой мембранные рецепторы I типа, о которых известно, что они действуют как гомо- и гетеродимеры. Связывая лиганды, ΤΡΚ активируют белки МуЭ88, который является необходимым адаптером сигналинга для большинства ΤΕΕ. Последующий путь активации сигнала приводит к эффекту, включающему: (1) активацию пути ΝΡ-κΒ, и (2) активацию МАРК (тйодеи асЬуа!еб рго!ет ктакек - киназы, активируемые митогенами), включая Ν-концевую киназу бии (6ΝΚ). Активация пути ΝΡ-κΒ лигандами ΤΡΚ дает выгодную возможность использовать эти лиганды в качестве радиопротекторов. В отличие от цитокинов эффекты большинства ПМП, иные чем активация ΤΕΕ, незначительны, то есть судя по всему, они почти не обладают побочным действием. Более того, многие ПМП присутствуют в организме человека.
В соответствии со своей функцией активации иммуноцитов, все ΤΕΕ экспрессируются в селезенке и лейкоцитах периферической крови, а более специфические паттерны экспрессии ΊΕΚ наблюдаются в других лимфоидных органах и субпопуляциях лейкоцитов. Однако ΤΡΚ также экспрессируются и в других тканях и органах тела, например, ΤΡΚ 1 экспрессируется повсеместно, ΤΕΚ5 обнаружен также в желудочно-кишечном эпителии и эндотелии, а также известно, что ΤΡΚ 2, 6, 7 и 8 экспрессируются в легких.
1. Определения.
Следует понимать, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных воплощений и не ограничивает объем изобретения. Следует отметить, что используемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа также подразумевают и формы множественного числа, если в контексте четко не оговаривается иное.
Используемый здесь термин «введение», используемый для описания дозы агента, индуцирующего активность ΝΡ-κΒ, означает одиночную дозу или многократные дозы возбудителя.
Используемый здесь термин «аналог», применяемый при описании пептидов или полипептидов, означает пептид или полипептид, содержащий одну или более нестандартных аминокислот или других структурных вариаций обычного набора аминокислот.
Используемый здесь термин «антитело» означает антитело, принадлежащее к какому-либо из классов иммуноглобулинов 1дО, 1дМ, 1дА, 1др или 1дЕ, или его фрагменты, или производные, включая ЕаЬ, Е(а1')2, Гб, а также одноцепочечные антитела, димерные антитела, биспецифические антитела, бифунк
- 7 010291 циональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой моноклональное антитело, поликлональное антитело, афинно-очищенное антитело или их смеси, которые проявляют достаточную специфичность связывания по отношению к желаемому эпитопу или полученной из него последовательности. Антитело также может представлять собой химерное антитело. Антитело может быть производным, полученным путем присоединения одного или нескольких химических веществ, пептидов или полипептидных компонентов, известных из уровня техники. Антитело можно конъюгировать с химическим компонентом.
Используемый здесь термин «апоптоз» относится к форме клеточной смерти, которая включает прогрессирующее сжатие клетки с сохранением целостности цитоплазматических органелл; конденсацию хроматина (т.е. конденсацию ядра), выявляемую методами световой или электронной микроскопии; и/или расщепление ДНК на фрагменты размером с нуклеосому, что выявляется методами осаждения при центрифугировании. Смерть клеток происходит, когда нарушается целостность клеточной мембраны (т.е. блеббинг мембраны), а интактные клеточные фрагменты (апоптозные тела) поглощаются фагоцитами.
Используемый здесь термин «рак» означает любое состояние, характеризующееся устойчивостью к апоптотическим стимулам.
Используемый здесь термин «терапия рака» означает любой вид лечения рака, известный из уровня техники, включая химиотерапию и лучевую терапию, но не ограничиваясь ими.
Используемый здесь термин «в сочетании с», при описании введения агента, индуцирующего активность ΝΡ-κΒ, и дополнительного лечения означает, что агент можно вводить до, совместно или после дополнительного лечения или в комбинируя эти способы.
Используемый здесь при описании пептида или полипептида термин «производное» означает пептид или полипептид, отличающийся чем-либо, кроме первичной структуры (аминокислоты или аналоги аминокислот). В качестве иллюстрации производными могут быть гликолизированные белки (одна из форм пострансляционной модификации). Например, пептиды или полипептиды могут имеет паттерны гликолизования, обусловленные экспрессией в гетерологичных системах. Если при этом сохраняется хотя бы один вид биологической активности, такие пептиды или полипептиды согласно изобретению являются производными. Другие производные включают, но не ограничиваются ими, рекомбинантные пептиды или полипептиды, имеющие ковалентно модифицированные Ν- или С-концы, подиэтиленгликоль-коньюгированные пептиды или полипептиды, пептиды или полипептиды, ассоциированные с липидными компонентами, алкилированные пептиды или полипептиды, пептиды или полипептиды, соединенные через функциональные группы боковых аминокислот с другими пептидами, полипептидами или химикатами, и другие модификации, известные из уровня техники.
Используемый здесь термин «флагеллин» означает флагеллин, полученный из любого источника, включая любые штаммы бактерий, но не ограничиваясь ими. Флагеллин может быть получен из штаммов 8а1тоие11а. Также конкретно рассматриваются фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные указанного флагеллина, а также их комбинации. Различные фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные описанные здесь могут быть идентичными флагеллину дикого типа на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99%.
Применяемый здесь при описании пептида или полипептида термин «фрагмент» означает пептиды, состоящие примерно из 8-50 аминокислот. Фрагментом может являться цепочка из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 аминокислот.
Используемый здесь при описании пептида или полипептида термин «гомолог» означает пептид или полипептид, имеющий общий эволюционный предшественник с рассматриваемым пептидом или полипептидом.
Используемый здесь термин «латентный ΤΟΡβ» означает предшественник ΤΟΡβ, пребывающий в неактивной форме. Латентным ΤΟΡβ может быть предшественник ΤΟΡβ, содержащий активный ΤΟΡβ и пептид, ассоциированный с латентностью (ЬАР - 1а1еису а55ОС1а1еб рерйбе). Латентный ΤΟΡβ может также включать ЬАР, присоединенный к белку, связывающему латентный ΤΟΡβ. Латентый ΤΟΡβ может также представлять собой большой латентный комплекс. Также латентный ΤΟΡβ может представлять собой латентный ΤΟΡβ, модифицированный так, что скорость его превращения в активную форму ΤΟΡβ или способность к такому превращению является пониженной. Модифицированным латентным ΤΟΡβ может быть, например, ΤΟΡβ, несущий мутацию, предотвращающую или замедляющую превращение ΤΟΡβ в активную форму.
Используемый здесь термин «ΤΟΡβ» означает любую изоформу активного или латентного ΤΟΡβ, включая ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2, ΤΟΡβ3, ΤΟΡβ4, или ΤΟΡβ5, а также их комбинации, но не ограничиваясь ими. Также конкретно рассматриваются фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные указанной изоформы ΤΟΡβ, а также их комбинации. Разнообразные фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные, описанные здесь, могут быть идентичными изоформе ΤΟΡβ на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99%.
- 8 010291
Используемые здесь термины «лечить», «лечение» или «терапия», относящиеся к защите млекопитающего от состояний, означают предотвращение, подавление, остановку или устранение состояния. Предотвращение состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению до возникновения состояния. Подавление состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению после возникновения состояния, но до его клинического проявления. Остановка состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению после клинического проявления состояния с тем, чтобы ослабить состояние или не дать ему прогрессировать. Устранение состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению после клинического проявления состояния с тем, чтобы млекопитающее избавилось от этого состояния.
Используемый здесь термин «раковая клетка» означает любую клетку, характеризующуюся устойчивостью к апоптотическим стимулам.
Используемый здесь для описания пептида или полипептида термин «вариант», означает пептид или полипептид, отличающийся последовательностью аминокислот, а именно наличием вставок, делеций или консервативным замещением аминокислот, но сохраняющий, по меньшей мере, один вид биологической активности. В контексте задач настоящего изобретения «биологическая активность» включает способность связываться со специфическими антителами, но не ограничивается ей. Консервативное замещение аминокислоты, т.е. замещение аминокислоты другой аминокислотой с подобными свойствами (например, гидрофильностью, степенью заряженности и распределением заряженных областей) понимается в данной области техники как обычная второстепенная замена. Такие второстепенные замены можно определить, в частности, с помощью индекса гидрофобности аминокислот, как это известно из уровня техники. (Ку!е е1 а1., Р Мо1. Вю1., 157:105-132 (1982)). Расчет индекса гидрофобности аминокислоты основан на определении ее гидрофобности и заряда. Из уровня техники известно, что аминокислоты с одинаковым индексом гидрофобности могут взаимно замещаться с сохранением функций белка. Известно, что аминокислоты, имеющие индекс гидрофобности V 2, являются взаимозамещаемыми. Определение гидрофильности аминокислот также позволяет обнаружить замещения, которые можно производить с сохранением биологической функции белка. Анализ гидрофильности аминокислот при изучении пептидов позволяет рассчитать наибольшее локальное среднее значение гидрофильности этого пептида, которое, как было описано, является критерием, хорошо коррелирующим с антигенными и иммуногенными свойствами. (Патент США № 4554101 включен здесь посредством ссылки). Замещение аминокислот, имеющих одинаковые значения гидрофильности, приводит в результате к сохранению биологической активности пептидов, например имунногености, как это понятно из уровня техники. Известно, что такое замещение можно производить с аминокислотами, индекс гидрофильности которых различается на ±2 для каждой аминокислоты. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияют определенные боковые группы этих аминокислот. В соответствии с этими наблюдениями возможность замещения аминокислот, не приводящего к утрате желаемой биологической функции, зависит от относительного сходства аминокислот, а также конкретных боковых групп этих аминокислот, что определяется по гидрофобности, гидрофильности, заряду, размерам и другим свойствами этих групп и аминокислот.
2. Способы лечения.
а. Опухоли с конститутивно активным ΝΡ-кВ.
Настоящее изобретение относиться к способам лечения млекопитающего, страдающего от рака, ассоциированного с конститутивно активным ΝΡ-кВ, включающим введение млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, индуцирующего активность ΝΡ-кВ. Агент, индуцирующий активность ΝΡ-кВ можно вводить в сочетании с другими видами терапии рака.
Указанный агент можно вводить одновременно или поочередно с применением других видов противораковой терапии, например химиотерапии или лучевой терапии. Термин «одновременный» или «одновременно», используемый здесь, означает, что промежуток времени между применением других видов противораковой терапии и введением соединения по изобретению составляет 48 ч, предпочтительно 24 ч, более предпочтительно 12 ч, еще более предпочтительно 6 ч и наиболее предпочтительно в 3 ч и менее. Термин «поочередно», используемый здесь, означает введение соединений в иной момент времени, чем время проведения химиотерапии, с определенной частотой относительно повторного введения и/или режима химиотерапии.
Указанный агент можно вводить в любое время до проведения терапии рака, например, но не ограничиваясь этим, приблизительно за 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10 часов, 8, 6, 4, 3, 2 или 1 ч. Агент можно вводить в любой момент после проведения терапии рака, например, но не ограничиваясь этим, спустя приблизительно 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ч после проведения терапии.
Терапия рака может включать введение цитотоксических агентов или цитостатических агентов, или их комбинацию. Цитотоксические агенты препятствуют размножению раковых клеток посредством: (1) подавления способности клеток к репликации ДНК и (2) индукции клеточной гибели и/или апоптоза в раковых клетках. Цитостатические агенты действуют, модулируя, препятствуя или подавляя процессы
- 9 010291 передачи сигнала в клетках, регулирующие клеточную пролиферацию, в том числе поддерживающие её на непрерывном низком уровне.
Классы соединений, которые можно использовать в качестве цитотоксических агентов включают следующие: алкилирующие агенты (включая, но не ограничиваясь указанным, азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитромочевины и триазены): урамустин, хлорметин, циклофосфамид (СуЮхап®). ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, пипоброман, триэтилен-меламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин и темозоломид; антиметаболики (включая, но не ограничиваясь указанным, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозин деаминазы): метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, цитарабин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабина фосфат, пентостатин и гемцитабин, натуральные продукты и их производные (например, алкалоиды барвинка, противоопухолевые антибиотики, ферменты, лимфокины и эпиподофиллотоксины): винбластин, винкристин, виндесин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, цитозин-арабинозид, паклитаксел (паклитаксел имеется в продаже под торговым наименованием Таксол®), митрамицин, дезоксикоформицин, митомицин-ц, 1-аспарагиназа, интерфероны (предпочтительно α-интерферон), этопозид и тенипозид.
Другими цитотоксическими агентами, воздействующими на пролиферацию, являются навелбен, СРТ-11 (иринотекан), анастразол, летразол, капецитабин, релоксафен, циклофосфамид, ифосамид и дролоксафен.
Агенты, действующие на микротрубочки, которые хорошо известны из уровня техники, препятствуют митозу благодаря цитотоксической активности. Агенты, действующие на микротрубочки, которые применяются в изобретении, включают, не ограничиваясь указанным, аллоколхицин (Ы8С 406042), халихондрин В (Ы8С 609395), колхицин (Ы8С 757), производные колхицина (например, Ы8С 33410), доластатин 10 (Ы8С 376128), майтансин (Ы8С 153858), ризоксин (Ы8С 332598), паклитаксел (Таксол®, Ы8С 125973), производные Таксола® (например, N80 608832), тиоколхицин (N80 361792), тритил цистеин (N80 83265), винбластин сульфат (Ν8ϋ 49842), винкристин сульфат (Ν8ϋ 67574), натуральные и синтетические эпотилоны, включая, но не ограничиваясь указанным, эпоптилон А, эпоптилон В, а также дискодермолид (см. 8егу1се, (1996) 8е1еисе, 274:2009) эстрамустин, нокодазол, МАР4 и т.п. Примеры таких агентов также описаны в Ви1ткк1 (1997) 1. Се11 8с1. 110:3055 3064; Рапба (1997) Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8с1. И8А 94:10560-10564; МиЫгаб! (1997) Сапсег Век. 57:3344-3346; №со1аои (1997) Уинге 387:268-272; Уакдне/ (1997) Мо1. Вю1. Се11. 8:973-985; а также Рапба (1996) 1. Вю1. С1ет 271:29807-29812.
Также подходят цитотоксические агенты, такие как эпидофиллотоксин, противоопухолевый фермент; ингибитор топоизомеразы, прокарбазин, митоксантрон, координационные комплексы с платиной, например, цисплатин и карбоплатин, модификаторы биологического ответа, ингибиторы роста, антигормональные терапевтические агенты, лейковорин, тегафур, а также гемопоэтические факторы роста.
Цитостатические агенты, которые можно использовать, включают гормоны и стероиды (включая синтетические аналоги): 17-альфа-этинилэстрадиол, диэтилстилбестрол, тестостерон, преднизон, флуоксиместерон, дромостанолон пропионат, тестолактон, мегестролацетат, метилпреднизолон, метилтестостерон, преднизолон, триамицинолон, хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглютетимид, эстрамустин, медроксипрогестеронацетат, леупролид, флутамид, торемифен, золадекс, но не ограничиваются ими.
Также в объем настоящего изобретения включены другие цитостатические агенты, препятствующие росту сосудов, такие как ингибиторы металлопротеаз матрикса, а также другие ингибиторы УБОР (уакси1аг епбоШейиш дго\\111 ГасЮг - фактор роста эндотелия сосудов), такие как антитела к УЕОР и микромолекулы, например ΖΌ6474 и 8и 6668 (ингибиторы киназной активности рецептора УЕОР типа 2). Также можно использовать антитела на Нег-2 (Питан ер1бегта1 дго\\111 ГасЮг гесерЮг 2 - рецептор человеческого эпидермального фактора роста типа 2) от Джинтек. Подходящими ингибиторами ЕОРВ (ер1бегта1 дго\\И1 ГасЮг гесерЮг - рецептор эпидермального фактора роста) является ЕКВ-569 (необратимый ингибитор). Также включены антитела С225, специфичные к ЕОРВ, и ингибиторы 8гс-киназ.
Также подходит для использования в качестве цитостатического агента Касодекс® (бикалутамид, Астра Зенека), который запрещает пролиферацию андрогензависимых карцином. Еще одним примером цитостатического агента является антиэстроген Тамоксифен®, ингибирующий пролиферацию и рост эстрогензависимых опухолей молочной железы. Ингибиторы передачи пролиферативных сигналов в клетке являются цитостатическими агентами. Иллюстративные примеры включают ингибиторы эпидермальных факторов роста, ингибиторы Нег-2, ингибиторы МЕК-1 киназ, ингибиторы МАРК киназ, ингибиторы Р13 (р1юкр11аббу1 шокйо1 3-р1юкрНа1е - фосфатидил-инозитол 3-фосфат), ингибиторы 8гс-киназ, а также ингибиторы РИ6Р (р1а1е1е! бепгеб дго\\111 ГасЮг - фактор роста тромбоцитов).
Согласно данному изобретению можно лечить многие виды рака, включая следующие: карцинома, включая карциному мочевого пузыря (в том числе ускоренный и метастатический рак мочевого пузыря), груди, толстой кишки (в том числе рак прямой кишки), почек, печени, легких (в том числе мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого и аденокарциному легкого), яичников, простаты, семенников, мочеполового тракта, лимфатической системы, прямой кишки, гортани, поджелудочной железы (включая
- 10 010291 ациноцитарную карциному), пищевода, желчного пузыря, шеи, щитовидной железы и кожи (включая плоскоклеточную карциному); гематопоэтические опухоли лимфоидного типа, включая лейкемию, острый лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, гистиоцитарную лимфому, лимфому Буркета; гематопоэтические опухоли миелоидного типа, включая острые и хронические миелоидные лейкемии, миелодиспластический синдром, миелоидную лейкемию, а также промиелоцитарую лейкемию; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому, невриному; опухоли мезенхимального происхождения включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому, а также другие виды опухолей, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакнтому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы, тератокарциному, но не ограничиваясь ими. В предпочтительном воплощении, данное изобретение используется для лечения рака желудочно-кишечного тракта.
б. Лечение побочных эффектов, возникающих при терапии рака.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения нормальных тканей, возникающего вследствие лечения рака, ассоциированного с конститутивной активностью ΝΡ-κΒ. Агент, индуцирующий активность ΝΡ-κΒ, можно применять совместно с другими видами терапии рака, описанными выше.
в. Модулирование клеточного старения.
Данное изобретение также относится к способу модулирования клеточного старения у млекопитающих, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества агента, индуцирующего активность ΝΡ-κΒ. Агент, индуцирующий активность ΝΡ-κΒ можно применять совместно с другими видами лечения.
Агент можно вводить в любой промежуток времени до проведения другого вида лечения, включая промежутки времени около 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2 или 1 ч до проведения другого вида лечения, но не ограничиваясь этим временем. Указанный агент также можно вводить в любой промежуток времени после проведения другого вида лечения, включая промежутки времени около 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 в, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ч после проведения другого вида лечения, но не ограничиваясь этим временем.
г. Лечение стресса.
Настоящее изобретение относится также к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения нормальных тканей, обусловленного стрессом, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества агента, индуцирующего активность ΝΡ-κΒ. Агент, индуцирующий активность ΝΡ-κΒ, можно вводить совместно с применением иных видов лечения. Стресс может вызываться облучением, ранением, отравлением, инфекцией или температурным шоком, а также другими видами воздействий.
Композицию, содержащую индуктор активности ΝΡ-κΒ, можно вводить за любое количество времени до воздействия факторов стресса, включая промежутки времени около 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2 или за 1 ч до воздействия стресса, но не ограничиваясь этим временем. Композицию, содержащую индуктор ΝΡ-κΒ, можно вводить в любой промежуток времени после воздействия стрессовых нагрузок, включая промежутки времени около 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ч после воздействия, но не ограничиваясь этим временем.
д. Облучение.
Настоящее изобретение также относится к защите клеток от эффектов, вызванных радиоактивным облучением. Поражение и смерть клеток в результате действия ионизирующего излучения является совокупностью поражений, вызванных непосредственно облучением незащищенных клеток и активностью генетически обусловленных механизмов ответа клетки на стресс, вызываемый действием радиации, которая приводит в результате к самоубийству клетки или к апоптозу. Апоптоз играет ключевую роль в массовой гибели клеток, происходящей в некоторых чувствительных к излучению органах (например, кроветворная и иммунная системы, эпителий пищеварительного тракта и т.д.), и неустойчивость этих органов к излучению определяет общую чувствительность организма к воздействию излучения.
Воздействие ионизирующего излучения (ИИ) может быть коротким или длинным, его можно производить однократно или несколько раз, подвергать ему все тело или только отдельные участки. Так, ядерные аварии или военные действия могут приводить к облучению всего тела одиночной дозой высокой мощности (иногда за этим следует длительное отравление радиоактивными изотопами). То же самое происходит (но под строгим контролем мощности дозы излучения) при предварительной терапии, проводящейся перед трансплантацией костного мозга, в случаях, когда это необходимо для подготовки кроветворных органов реципиента для пересадки донорского костного мозга путем «очищения» их от клеток-предшественников крови реципиента. Лечение рака может вовлекать использование нескольких доз местного облучения, причем общая сумма этих доз, если бы облучению подвергалось все тело, намного превосходила бы летальную дозу. Отравление или лечение радиоактивными изотопами приводит к длительному облучению органов-мишеней (например, щитовидной железы, при ингаляции 1251). Наконец,
- 11 010291 существует много физических форм ионизирующего излучения, существенно различающихся по силе биологического действия.
На молекулярном и клеточном уровне радиоактивные частицы способны вызвать разрыв и образование поперечных связей в ДНК, белках, клеточных мембранах и других макромолекулярных структурах.
Ионизирующее излучение также вызывает вторичные повреждения клеточных компонентов, создавая свободные радикалы и активные формы кислорода. Многие системы репарации борются с такими повреждениями, так, несколько путей репарации ДНК восстанавливают целостность ДНК и правильную последовательность нуклеотидов, антиоксиданты химической и ферментативной природы утилизируют свободные радикалы и уменьшают количество окисленных белков и липидов. Системы точек контроля клеточного цикла выявляют дефекты ДНК и приостанавливают клеточный цикл до тех пор, пока повреждения не будут устранены, или блокируют рост клеток, либо направляют клетку на путь апоптоза.
Излучение может причинять вред организму млекопитающего, начиная от умеренного мутагенного и канцерогенного влияния при небольших дозах, и заканчивая смертельным исходом при высоких дозах. Общая радиочувствительность организма определяется патологическими нарушениями, которые возникают в нескольких чувствительных тканях, в числе которых гемопоэтическая система, половая система и различные эпителиальные ткани с высокой скоростью клеточного цикла.
Степень выраженности патологических последствий, вызываемых гамма-излучением и приводящих к смерти, зависит от дозы и определяется поражением конкретных органов, определяющих порог чувствительности организма к каждой определенной дозе. Так, летальный исход при низкой дозе возникает от аплазии костного мозга, в то время как смерть при умеренных дозах наступает быстрее вследствие гастроинтестинального синдрома. Очень высокие дозы излучения практически во всех случаях приводят к немедленной смерти, вызванной дегенерацией нейронов.
Организм, переживший период острой токсичности, вызванной радиацией, может в течение длительного времени страдать от поздних последствий, среди которых вызываемые радиацией канцерогенез и фиброз, развивающиеся в облученных органах (например, почки, печень или легкие) в течение нескольких месяцев или лет после облучения.
Клеточная ДНК является главной мишенью для ионизирующего излучения, которое вызывает различные виды повреждений ДНК (генотоксический шок), действуя напрямую или опосредованно (например, с помощью свободных радикалов). Во всех организмах функционируют системы репарации ДНК, которые способны эффективно восстанавливать поврежденную радиоактивным излучением ДНК; нарушения процесса репарации ДНК могут приводить к мутациям.
Опухоли обычно являются наиболее чувствительными к гамма-излучению, и их можно лечить несколькими местными дозами, которые вызывают относительно небольшие повреждения нормальных тканей. Однако в некоторых случаях возможность повреждения нормальных тканей ограничивает применение гамма-излучения при лечении рака. Использование при раковой терапии обычного трехмерного конформного гамма-облучения или даже более сфокусированного облучения с помощью системы ВеатСа111 также имеет дозовые ограничения, связанные с токсичностью, обусловленной кумулятивным эффектом излучения и индуцированием повреждений стволовых клеток в норме быстро восстанавливающихся тканей, таких как ткани костного мозга и желудочно-кишечного тракта.
Высокие дозы облучения вызывают летальный исход, связанный с так называемыми гемопоэтическим и гастроинтестинальным синдромами. Гемопоэтический синдром характеризуется утратой кроветворных клеток и их предшественников, что делает невозможным обновление крови и лимфатической системы. Смерть, как правило, наступает вследствие инфекции (результат иммуносупрессии), кровопотери и/или анемии. Гастроинтестинальный синдром возникает вследствие массовой смерти клеток эпителия кишечника, в основном тонкого кишечника, за которым следует разрушение стенок кишечника и смерть в результате бактериемии и сепсиса. Гематопоэтический синдром чаще возникает при меньших дозах излучения и приводит к более медленной смерти, нежели чем при гастроинтестинальном синдроме.
Ранее в качестве радиопротекторов как правило использовались антиоксиданты как синтетические, так и натуральные. Совсем недавно в список радиопротекторов были добавлены цитокины и факторы роста; считается, что механизм их радиопротективного действия является результатом влияния на чувствительные ткани, облегчающего их восстановление. Однако нет четкого функционального разграничения между обеими группами радиопротекторов, поскольку некоторые цитокины индуцируют экспрессию клеточных антиоксидантов, таких как дисмутаза супероксида марганца (ΜηδΘΌ - таидаиеке кирегох1бе б15ти!а5е) и металлотионеин.
Степень протективного действия каждого конкретного агента выражается в факторе модификации дозы или факторе уменьшения дозы (ФМД или ФУД). ФМД определяется воздействием на объекты, получающие радиопротектор, и контрольные объекты, не получающие радиопротектор, несколькими дозами облучения и последующим сравнением количества выживших или других критериев. ФМД обычно рассчитывается при наблюдении за выживанием объектов в течение 30 дней (вычисляется отношение количества выживших в группе, получившей ЛД (летальную дозу) 50/30 и принимавших лекарство, к
- 12 010291 количеству выживших в группе, получившей ЛД 50/30 и принимавших пустой наполнитель) и количественно определяет защитное действие исследуемого вещества на гемопоэтическую систему. Оценивая защитное действие на гастроинтестинальную систему, рассчитывают ЛД 50 и ФМД при наблюдении за выживанием в течение 6 или 7 дней. Величины ФМД приведенные здесь, рассчитаны при 30-дневном наблюдении, если не указано иначе.
Агенты, индуцирующие активность ΝΡ-кВ, оказывают действие, в значительной мере способствующее выживанию клеток и всего организма. В ответ на сверхлетальную дозу излучения индукторы ΝΡ-кВ ингибируют гастроинтестинальный и гематопоэтический синдром, которые являются главными причинами возникновения смерти при сильном излучении. Благодаря этим свойствам, агенты, индуцирующие ΝΡ-кВ, можно использовать для лечения последствий облучения, произошедшего в результате естественных причин или ядерных аварий. Более того, поскольку индукторы ΝΡ-кВ действуют по механизмам, иным, чем все известные в настоящее время радиопротекторы, их можно использовать в комбинации с другими радиопротекторами, таким образом, значительно повышая степень защиты от ионизирующего излучения.
В отличие от традиционных агентов-радиопротектров (например, ловушки свободных радикалов), антиапоптические агенты могут не уменьшать первичные повреждения, вызванные излучением, но они действуют против вторичных явлений, включающих активную реакцию клеток на первичное повреждение, таким образом, дополняя существующие способы защиты. Пифитрин-альфа, фармакологический ингибитор р53 (ключевой медиатор ответа клеток млекопитающих на облучение), является примером нового класса радиопротекторов. Однако активность ингибиторов р53 ограничена защитой гемопоэтической системы и не оказывает защитного действия на кишечный тракт (не защищает от гастроинтестинального синдрома), что понижает лечебно-профилактическое значение этих соединений. Антиапоптические фармпрепараты с более широким спектром активности являются в высшей степени необходимыми.
Индукторы ΝΡ-кВ можно использовать в качестве агентов, защищающих от излучения, в результате чего можно расширить диапазон приемлемых доз облучения, усиливая устойчивость человеческого организма к облучению до уровня большего, чем достигаемый с помощью доступных на сегодняшний день средств (экранирование или применение существующих биопротекторов), и значительно увеличить шансы на спасение персонала в случае ядерных аварий на предприятиях, или при широкомасштабном действии солнечных частиц высокой энергии. При том, что средний ФМД (30 дней) флагеллина больше 1,5, этот индуктор ΝΡ-кВ более эффективен, чем любые другие известные ныне природные соединения.
Индукторы ΝΡ-кВ также пригодны для лечения утраты невозобновляемых клеток, вызванной излучением небольшой мощности, например, в центральной нервной системе и репродуктивных органах. Индукторы ΝΡ-кВ можно также применять во время химиотерапии рака для лечения побочных эффектов, связанных с химиотерапией, включая облысение.
В одном из воплощений, млекопитающее подвергают терапии против действия излучения, включающей введение млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество индуктора ΝΡ-кВ. Композицию, содержащую индуктор ΝΡ-кВ, можно вводить в комбинации с одним или более радиопротектором. Одним или более радиопротектором может являться любой агент, применяемый при лечении от последствий действия излучения, включая антиоксиданты, ловушки свободных радикалов и цитокины, но не ограничиваясь указанным.
Индукторы ΝΡ-кВ могут ингибировать апоптоз, вызванный действием излучения, повреждающего ДНК и другие клеточные структуры, однако, они не могут исправлять клеточные повреждения и предотвращать мутации. Свободные радикалы и активные формы кислорода являются главной причиной мутаций и других внутриклеточных повреждений. Антиоксиданты и ловушки свободных радикалов эффективно предотвращают повреждения, вызываемые свободными радикалами. Комбинация индуктора ΝΡкВ и антиоксидантов или ловушки свободных радикалов может приводить к уменьшению силы поражения, большей выживаемости и улучшению здоровья облученных млекопитающих. Антиоксиданты и ловушки свободных радикалов, которые можно применять при практическом использовании изобретения, включают тиолы, такие как цистеин, цистеамин, глутатион и билирубин; амифостин (^К-2721); витамин А, витамин С, витамин Е; флавоноиды, такие как индийский базилик священный (Оатит 8апс1ит), ориентин и виценин, но не ограничиваются ими.
Индукторы ΝΡ-кВ можно также применять в комбинации с некоторыми цитокинами и факторами роста, которые обеспечивают защиту от излучения посредством обновления и/или защиты популяций стволовых клеток, чувствительных к излучению. Защита от излучения с минимальными побочными эффектами может быть достигнута при использовании фактора стволовых клеток (8СЕ - Чет се11 1щапй. скй лиганд), Е11-3 лиганд, а также фрагмент интерлейкина-1 1Ь-1Ь-гй. Также защитный эффект наблюдается при индуцировании пролиферации стволовых клеток (все отмеченные цитокины) и предотвращении их апоптоза (8СЕ). Указанные виды терапии делают возможным накопление лейкоцитов и их предшественников до облучения, благодаря чему после облучения происходит более быстрое восстановление иммунной системы. 8СЕ эффективно спасает мышей, облученных летальной дозой, причем значение ФМД
- 13 010291 находится в интервале 1,3-1,35. Также он эффективен при терапии гастроинтестинального синдрома. Ρ1ΐ3 лиганд также проявляет выраженный защитный эффект при воздействии на мышей (70-80% 30-дневное выживание при ЛД 100/30, эквивалентной ФМД >1,2) и кроликов (15, 16).
Несколько факторов не цитокиновой природы стимулируют пролиферацию иммуноцитов и могут использоваться в комбинации с индукторами ΝΡ-κΒ. 5-ΑΕΌ (5-апбго81епебю1 - 5-андростендиол) представляет собой стероид, стимулирующий экспрессию цитокинов и повышающий устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям. Подкожная инъекция 5-ΑΕΌ мышам за 24 ч до облучения повышает выживаемость с ФМД >1,26. Синтетические соединения, такие как трихлор(диоксоэтилен-О,О'-)теллурат аммония (А8-101), также позволяют индуцировать секрецию некоторых цитокинов, и их также можно использовать в комбинации с возбудителями ΝΡ-κΒ.
Факторы роста и цитокины также можно использовать для обеспечения защиты от гастроинтестинального синдрома. Фактор роста кератиноцитов (ΚΟΡ - кегабпосуГе дго\\111 ГасЮг) способствует пролиферации и дифференциации клеток слизистой оболочки кишки, а также увеличивает выживаемость стволовых клеток в криптах кишечника после облучения. Гемопоэтические цитокины и радиопротекторы, такие как фактор стволовых клеток, также могут повышать выживаемость стволовых клеток кишечника и связанное с ней кратковременное выживание организма.
Индукторы ΝΡ-κΒ могут также предохранять как от гастроинтестинального, так и от гемопоэтического синдрома. Так как мыши, которых облучали по всему телу летальной дозой 15 Грэй, умирали в основном от гастроинтестинального синдрома, композиция, содержащая индукторы ΝΡ-κΒ в сочетании с одним или несколькими ингибиторами гастроинтестинального синдрома может быть более эффективной. Ингибиторы гастроинтестинального синдрома, которые можно использовать при практическом осуществлении изобретения, включают цитокины, такие как фактор стволовых клеток (8СГ) и фактор роста кератиноцитов (ΚΟΡ), но не ограничиваются ими.
Композицию, содержащую индукторы ΝΡ-κΒ, можно вводить в любой промежуток времени до облучения, включая промежутки времени около 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2 или 1 ч до облучения, но не ограничиваясь этим временем. Композицию, содержащую возбудители ΝΡ-κΒ, можно также вводить в любой промежуток времени после облучения, включая промежутки времени около 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ч после облучения, но не ограничиваясь этим временем.
3. Агенты.
Настоящее изобретение также относится к агентам, индуцирующим активность ΝΡ-κΒ. Агент может быть искусственно синтезированным или встречающимся в природе соединением. Агентами также могут быть соединения с малым молекулярным весом, полипептиды или пептиды или их фрагменты, аналоги, гомологи, варианты или производные.
Агентами также могут быть цитокины, индуцирующие активность ΝΡ-κΒ, включая 1Ь2 (интерлейкин 2), 1Ь6 (интерлейкин 6), ΤΝΡ (фактор некроза опухоли) и ΤΟΡβ (трансформирующий фактор роста β), но не ограничиваясь ими. Возбудителем может быть также простагландин. Агентами также могут быть факторы роста, включая ΚΟΡ (фактор роста кератиноцитов) и ΡΌΟΡ (фактор роста тромбоцитов), но не ограничиваясь ими. Агентом может также быть антитело, индуцирующее активность ΝΡ-κΒ.
а. Флагеллин.
В одном из воплощений агентом является флагеллин, который может быть получен из бактерий, включая виды рода 8а1топе11а, такие как 8. 1урЫтиг1ит, но не ограничиваясь ими. Как показано в примерах ниже, флагеллин обладает сильной активностью, стимулирующей выживание как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма.
Фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное индуктора ΝΡ-κΒ, такого как флагеллин, с желаемыми свойствами можно получить, основываясь на доменной структуре флагеллина. Доменная структура флагеллина 8а1топе11а описана в литературе (фиг. 19). Флагеллин имеет консервативные домены (Ό1 и Ό2) на Ν-конце и С-конце и промежуточный гипервариабельный домен (Ό3) (8атаГеу, е1 а1., 2001, Еауе8-Ру1е§ Τ, е1 а1., 2001а). Результаты исследований рекомбинантого белка, содержащего Νконцевые Ό1 и Ό2, и С-концевые Ό1 и Ό2, разделенные участком белка ЕксйепсЫа сой (ΝΌ12/ЕСН/СЭ2) показывают, что Ό1 и Ό2 являются биологически активными при слиянии с ЕСН элементом. Данный химерный белок, но не элемент ДНК Е.сой отдельно, индуцирует деградацию 1кВа, активацию ΝΡ-κΒ, а также образование ΝΟ и 1Ь-8 (интерлейкина 8) в линиях клеток кишечного эпителия. Неконсервативный Ό3 домен находится на поверхности жгутиковой нити и содержит основные антигенные эпитопы. Сильная противовоспалительная активность флагеллина, скорее всего, связана с чрезвычайно консервативными Ν- и С-концевыми Ό1 и Ό2 доменами.
б. Индукторы ΝΡ-κΒ из паразитов.
Свойства флагеллина позволяют предполагать, что у паразитических организмов можно обнаружить дополнительные модуляторы ΝΡ-κΒ. Существуют паразиты, жизнедеятельность которых требует подавления апоптоза, поскольку они не могут выжить без клеток хозяина. Эти организмы должны быть адаптированы к эффективному выживанию в организме хозяина и выделять антиапоптотические факто
- 14 010291 ры. Подобно опухолям на поздних стадиях развития, эти организмы выделяют факторы, способные увеличивать их выживаемость и решать конфликт с защитными механизмами ответа хозяина на стресс.
Антиапоптические факторы паразитирующих или симбиотических организмов прошли миллионы лет адаптации для сведения к минимуму ущерба организму хозяина, влияющего на его жизнеспособность. В результате, эти факторы если и требуют дополнительных модификаций, то небольших, и их можно использовать непосредственно в их природной форме или с небольшими модификациями. Такие факторы могут быть пригодными для лечения апоптоза, вызванного стрессом, например побочными эффектами, связанными с химиотерапией и лучевой терапией.
Настоящее изобретение также относится к способам скрининга паразитов для выявления модуляторов ΝΤ-κΒ. Предполагаемые модуляторы могут быть получены из паразитов человека или иных приматов. Предпочтительны внеклеточные паразиты организма-хозяина. Паразитами могут также быть симбионты. Паразиты, из которых можно выделить модуляторы по изобретению, включают Мусор1акша, СЫашуФа и 8а1шопс11а. но не ограничиваются ими. Эти модуляторы можно выявить, используя методы скрининга, описанные здесь, а также способы биохимической и генетической селекции, тестирование ίη νίΐτο, агенты, защищающие от смерти клеток, и ίη νίνο.
4. Композиция.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество индуктора ΝΤ-κΒ. Композиция может быть фармацевтической композицией, которую можно получить, используя способы, хорошо известные из области техники. Как описано выше, композицию, содержащую индуктор ΝΤ-κΒ, можно вводить млекопитающему для лечения состояний, связанных с апоптозом, включающих облучение, побочные эффекты, вызванные терапией рака, стресс и старение клеток, но не ограничивающихся ими. Композиция может также содержать дополнительные агенты, включающие радиопротекторы или лекарства для химиотерапии, но не ограничивающиеся ими.
а. Применение.
Композиции по изобретению можно применять любым способом, включая оральное, парентеральное, сублингвальное, подкожное, ректальное введение, введение через слизистую, локальное введение, ингаляцию, введение через рот или их комбинацию, но не ограничиваясь этим. Парентеральное введение включает внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, интратекальное и внутрисуставное введение, но не ограничивается ими. При ветеринарном использовании композицию можно вводить в подходящей лекарственной форме, в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринары могут легко определить режим дозирования и способ введения, наиболее подходящий для данного животного.
б. Состав.
Композиции по изобретению могут быть представлены в форме таблеток или пастилок, составленных обычным образом. Например, таблетки и капсулы для орального применения могут содержать подходящие наполнители, включая связующие агенты, наполнители, скользящие вещества, дезинтегрирующие и увлажняющие агенты, но не ограничиваясь ими. Связующие агенты включают сироп, камедь, желатин, сорбитол, трагакант, крахмальный клейстер и поливиниллпирролидон, но не ограничиваются ими. Наполнители включают лактозу, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, фосфат кальция и сорбитол, но не ограничиваются ими. Скользящие вещества включают стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и окись кремния, но не ограничиваются ими. Дезинтегрирующие агенты включают картофельный крахмал и натриевый гликолат крахмала, но не ограничиваются ими. Увлажнители включают лаурилсульфат натрия, но не ограничиваются им. Таблетки могут быть покрыты оболочкой, как это известно из уровня техники.
Композиции по изобретению могут также представлять собой жидкие лекарственные формы, включая водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры, но не ограничиваясь ими. Композиция может быть представлена в виде сухого продукта для разбавления водой или другими подходящими разбавителями перед использованием. Подобные жидкие препараты могут содержать добавки, включая суспендирующие агенты, эмульгаторы, неводные разбавители и консерванты, но не ограничиваясь ими. Суспендирующие агенты включают сироп сорбитола, метилцеллюлозу, сироп глюкозы/сахара, желатин, гидроксицеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия, а также гидрогенизированные пищевые жиры, но не ограничиваются ими. Эмульгирующие агенты включают лецитин, сорбитола моноолеат и камедь, но не ограничиваются ими. Неводные разбавители включают пищевые масла, миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, масляные эфиры, пропиленгликоль и этиловый спирт, но не оканчиваются ими. Консерванты включают метил или пропил пгидроксибензоат и сорбиновую кислоту, но не ограничиваются ими.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в форме суппозиториев, которые могут содержать основу для суппозитория, включая масло кокоса или глицериды, но не ограничиваясь ими.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в формах, пригодных для ингаляции, включающих, но не ограничивающихся указанным, суспензии, или эмульсии, которые можно
- 15 010291 применять в виде сухого порошка или в виде аэрозоля, и распыляющие вещества, такие как дихлордифторметан или трихлорфторметан. Композиции по изобретению могут также быть в форме составов для кожи, содержащих водные или неводные разбавители, включая кремы, мази, лосьоны, пасты, лекарственные пластыри, накладки или мембраны, но не ограничиваясь ими.
Композиции по изобретению могут быть также составлены для парентерального введения, включая инъекции или продолжительную инфузию. Препараты для инъекции могут быть в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных разбавителях, а также могут содержать дополнительные агенты, включая суспендирующие, стабилизирующие, диспергирующие агенты, но не ограничиваясь ими. Композиции могут быть также представлены в виде порошка для разведения с подходящим разбавителем, включая стерильную воду, не содержащую пирогенных веществ, но не ограничиваясь ей.
Композиции по изобретению также могут быть в представлены форме препарата с замедленным высвобождением, который можно вводить путем имплантации или внутримышечной инъекции. Композиции могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (такими как, например, эмульсии в подходящем масле), ионообменными смолами, или в виде постепенно растворяемых производных (таких как, например, постепенно растворяемая соль).
в. Дозировка.
Терапевтически эффективное количество агента, необходимое для использования в разных видах терапии, изменяется в зависимости от природы состояния, которое будут лечить, продолжительности времени, в течение которого требуется индукция активности ΝΕ-кВ, возраста и состояния пациента, и в конечном счете определяется лечащим врачом. В основном, однако, дозы, применяемые для лечения взрослого человека, обычно находятся в диапазоне от 0,001 до, примерно 200 мг/кг в день. Доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 10 мкг/кг в день. Требуемую дозу можно вводить однократно, или за несколько раз через соответствующие интервалы времени, например, два, три, четыре или более раз в день. Множественное введение чаще более желательно или даже требуется, поскольку активность ΝΕ-кВ в нормальных клетках может понижаться в течение некоторого времени с момента введения индуктора.
Дозировка индуктора ΝΕ-кВ может быть любой, включая примерно 1, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975 мкг/кг или 1 мг/кг.
5. Способы выявления.
Настоящее изобретение также относится к способам выявления агентов, индуцирующих активность ΝΕ-кВ. Агенты, индуцирующие активность ΝΕ-кВ, можно определять способом, включающим добавление предполагаемого активатора ΝΕ-кВ к системе экспрессии, отражающей активность ΝΕ-кВ, и сравнение уровня экспрессии, отражающей активность ΝΕ-кВ, с контролем, где активатор ΝΕ-кВ определяется по способности повышать уровень экспрессии в системе, отражающей активность ΝΕ-кВ.
Предполагаемые агенты могут присутствовать в библиотеке (т.е. коллекции соединений). Такие агенты могут, например, кодироваться ДНК экспрессионных библиотек.
Предполагаемые соединения могут присутствовать в кондиционированной среде или клеточном экстракте. Другие подобные агенты включают соединения, известные из уровня техники как «малые молекулы», имеющие молекулярную массу менее 105 Да, предпочтительно менее 104 Да, более предпочтительно менее 103 Да. Такие предполагаемые возбудители могут быть элементами комбинированной библиотеки, которая включает синтетические агенты (например, белки), полученные в результате определенных многоступенчатых химических реакций. Любой специалист в данной области поймет, что при выполнении установленных методов можно получить различный набор таких библиотек, и элементы библиотеки подозреваемых возбудителей можно подвергать скринингу одновременно или последовательно в соответствии с описанным здесь способом.
Скрининг можно проводить различными способами, включая ίη νίίτο, клеточный и ίη νίνο анализ. Для клеточного анализа можно использовать любые клетки. Согласно данному изобретению предпочтительно использовать клетки млекопитающего, более предпочтительно - клетки человека и иных приматов. Скрининг с использованием клеточного анализа можно проводить, используя генетически модифицированные клетки опухоли, экспрессирующие суррогатные маркеры активации ΝΕ-кВ. Такие маркеры включают бактериальную бета-галактозидазу, бактериальную люциферазу и улучшенный зеленый флуоресцирующий белок (епйапсеб дгееп Ниогексеп! рго1ет - Ε6ΕΡ), но не ограничиваются ими. Уровень экспрессии суррогатных маркеров можно измерять, используя методы, стандартные для данной области техники, включая колориметрию, люминеметрию и флуориметрию, но не ограничиваясь ими.
Условия, при которых предполагаемые модуляторы добавляют в клетку, например, путем смешивания, представляют собой условия, при которых клетка может претерпеть апоптоз или сигналинг, если другие регуляторные вещества, препятствующие апоптозу или сигналингу, по существу, отсутствуют. Эффективные условия включают подходящую среду, температуру, уровень рН и присутствие кислорода, позволяющие клеткам расти, но не ограничиваются ими. Подходящей средой обычно является твердая или жидкая среда, содержащая факторы роста и источники ассимилируемого углерода, азота и фосфора, а также подходящие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины, на
- 16 010291 пример, это может быть эффективная среда, в которой клетку можно культивировать таким образом, что она будет способна к апоптозу или сигналингу. Например, в случае клеток млекопитающего, среда может включать среду Дульбекко-Игла, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки.
Клетки можно культивировать в различных контейнерах, включая флаконы для культур тканей, тестовые пробирки, микротитровальную посуду и чашки Петри, но не ограничиваясь ими. Клетки культивируют при подходящих температуре, уровне рН и содержании диоксида углерода. Такие условия культивирования также известны специалистам в данной области.
Способы введения предполагаемых модуляторов в клетку включают электропорацию, микроинъекции, клеточную экспрессию (т.е. использование систем экспрессии, таких как молекулы депротеинизированных нуклеиновых кислот, рекомбинантные вирусы, ретровирусные векторы экспрессии и аденовирусная экспрессия), использование агентов для образования пары ионов, а также использование детергентов для улучшения проницаемости мембраны.
Настоящее изобретение имеет множество аспектов, которые иллюстрируются приведенными ниже примерами, не ограничивают объем настоящего изобретения.
Пример 1. Ускоренное развитие гастроинтестинального синдрома у мышей, обусловленное недостаточностью р53.
Основная причина смерти млекопитающих от действия ионизирующего излучения (ИИ) может быть разной в зависимости от дозы облучения. При дозах выше 9-10 Гр мыши умирают спустя 12-20 дней, в основном, от смертельного гемопоэтического синдрома/синдрома истощения костного мозга. Облученных такими дозами мышей можно спасти от смерти путем пересадки костного мозга. Животные, получившие дозу выше 15 Гр, умирали в течение 7-12 дней после облучения (т.е. до того, как они могли бы умереть от гемопоэтического синдрома - ГПС) от осложнений гастроинтестинального синдрома (ГИС) (Гудков и Комарова, 2003). Как в случае ГПС, так и ГИС, повреждение тканей, приводящее к смерти, начинается с массового р53-зависимого апоптоза (Ро!!еи 1992, Мет!! 1994, Сш е! а1., 1995, Ройеи е! а1., 1994), и это наблюдение позволило нам ранее предположить, что р53 может быть фактором, определяющим наступление смерти при облучении. В частности, мыши с недостаточной экспрессией р53 устойчивы к дозам облучения, вызывающим смерть от ГПС (\Уек1рНа1 е! а1., 1997, Котагоу е! а1., 1999); также можно уменьшить смертность животных дикого типа, получивших дозу гамма-излучения мощностью 6-11 Гр, посредством временного фармакологического ингибирования р53 с помощью низкомолекулярного ингибитора р53 пифитрина-альфа (ПФА) (Комаров и др., 1999). То, что р53 является фактором, определяющим чувствительность тканей к генотоксическому стрессу, было далее подтверждено демонстрацией зависимости потери волос (облысения), возникающей в результате экспериментальной химиотерапии или облучения, от р53 (Бочкарев и др., 2000). Следовательно, основываясь на полученных ранее результатах, можно предположить, что р53 продолжает играть важную роль в развитии летального ГИС после облучения высокими дозами ИИ. Неожиданно оказалось, что дефицит р53 делает мышей чувствительными к высоким дозам ИИ, вызывающим летальный ГИС (фиг. 11). Продолжительная пролиферация клеток в криптах эпителия с дефицитом р53 после воздействия ИИ коррелирует с ускорением гибели поврежденных клеток крипты и быстрым разрушением ворсинок. р53 продлевает жизнь, индуцируя блокаду роста в криптах тонкого кишечника и защищая таким образом целостность пищеварительного канала (фиг. 12). Таким образом, проапоптическая функция р53 активизирует гемопоэтический синдром, в то время как его функция блокировки роста задерживает развитие гастроинтестинального синдрома.
Кинетику клеточной популяции в тонкой кишке очень тщательно анализировали. Пролиферация клеток в эпителии пищеварительного канала ограничена криптами, где расположены стволовые клетки и ранние пролиферирующие клетки-предшественники. После нескольких делений уже дифференцированные потомки стволовых клеток поднимаются по ворсинкам и слущиваются с их кончиков. В тонком кишечнике мышей полное «перемещение» клеток (от пролиферативного компартмента до кончика ворсинки) обычно занимает от 3 до 5 дней (Ройеи 1992, Ройеи е! а1., 1997, Воо111 е! а1., 2002, потоку е! а1., 2002). Хотя реакция тонкого кишечника на гамма-излучение хорошо изучена на патоморфологическом уровне, до сих пор остается неясным, что именно является причиной летального эффекта ГИС, в том числе и первопричина смерти. Смерть может наступить как прямое следствие повреждения клеток крипт эпителия и последующего оголения ворсинок, приводящего к жидкостному и электролитическому дисбалансу, бактериемии и эндотоксикозу. Помимо воспалительного и стромального откликов, дисфункция эндотелия, вероятно, является важным фактором возникновения летального исхода (Ройеи е! а1., 1997, потоку е! а1., 2002). Подводя итог вышесказанному, фармакологическое торможение р53, которое, как было показано, является весьма эффективным методом защиты от гемопоэтического синдрома, вызванного ИИ, оказывается неприменимым (если не вредным) для защиты от ГИС. Поэтому необходимо разработать альтернативные подходы для защиты эпителия тонкой кишки от действия излучения, основанные на другом механизме, например на активации ΝΡ-κΒ и последующем ингибировании смерти клеток.
Пример 2. Инфекция 8а1тоие11а активирует ΝΡ-κΒ.
Инфекция 8а1тоие11а приводит к сильной активации 1КК и ΝΡ-κΒ, а также к активации противовоспалительной генетической программы (Е1етеаи! е! а1., 1999). Предыдущие исследования позволяют
- 17 010291 предположить, что при типичной инфекции 8а1тоие11а в культивированных клетках эпителия кишечника примерно 30-40% клеток кишечного эпителия оказываются зараженными (Уа1бМа е( а1., 1996). Здесь мы хотели бы рассмотреть вопрос о том, каким образом бактериальная инфекция приблизительно 30% клеток хозяина может увеличивать ДНК связывающую активность ΝΡ-κΒ, до величины, эквивалентной той, которая наблюдается при активации ΝΡ-κΒ практически во всех стволовых клетках, как это происходит при терапии ΤΝΡα.
Для того чтобы детально изучить этот феномен, клетки НТ29 или инфицировали, или подвергли ложной инфекции при МИ (множественности инфекции) 50 в течение одного часа диким типом 8. 1ур1итигшт, трансформированным плазмидой рГМ10.1, которая кодирует зеленый флуоресцирующий белок (ΟΡΡ) под промотором гена ккаН 8а1тоие11а и функционирует, только когда бактерия поразила клетку хозяина (Уа1бМа е( а1., 1997). Клетки, пораженные 8а1тоие11а, обнаруживали по экспрессии ΟΡΡ, которую непосредственно выявляли флуоресцентной микроскопией. Локализацию субъединицы р65 (Ке1А) определяли с помощью непрямой иммунофлуоресценции кроличьих антител к р65, выявляемых с помощью ИТС-конъюгированных антител теленка. Для окрашивания ядер использовали ΌΑΡΙ.
Как можно увидеть на фиг. 1А, экспрессия ΟΡΡ наблюдается примерно в 40% клеток. Далее мы изучили локализацию р65 субъединицы ΝΡ-κΒ в необработанных (ложно инфицированных) клетках и клетках, инфицированных 8а1тоие11а или стимулированных ΤΝΡα (10 нг/мл). Субъединица р65 (Ке1А) была локализирована в цитоплазме необработанных клеток, в то время как в клетках, инфицированных 8а1тоие11а или ΤΝΡα, субъединица р65 (Ке1А) была локализована в ядрах (фиг. 1Б). Эти результаты показывают, что инфекция 8а1тоие11а активирует экспрессию ΝΡ-κΒ практически во всех клетках, хотя инфицированной является только небольшая часть клеток.
Пример 3. Флагеллин активирует ΝΡ-κΒ.
Поскольку при инфицировании 8а1тоие11а клеток эпителия кишечника наблюдается инфицирование лишь приблизительно 30% клеток, а активация ΝΡ-κΒ, напротив, происходит практически во всех клетках, мы предположили, что активация ΝΡ-κΒ происходит в ответ на распознавание клетками хозяина структурных компонентов бактерий или продуктов, производимых бактериями, и не связана с процессом инвазии. Было показано, что инвазия сама по себе не требуется для активации генетической программы защиты от воспаления, как это полагали ранее (16). Для того чтобы проверить это предположение, стерильно фильтрованную культуральную жидкость 8. биЬ1ш либо не подвергали обработке, либо кипятили в течение 20 мин и использовали для контрольного заражения клеток эпителия кишечника НТ29, а затем изучали ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ к с помощью анализа задержки в геле (ЕМ8А) целого клеточного экстракта (ЦКЭ), приготовленного по прошествии 45 мин после облучения (3, 40). В обоих случаях была обнаружена сильная активация ΝΡ-κΒ в ответ на внесение культуральной жидкости, что показывает устойчивость активирующего фактора к нагреванию.
Нативную стерильно фильтрованную концентрированную культуральную жидкость затем обрабатывали ДНКазой, рибонуклеазой, протеиназой К, или выполняли грубое фракционирование через 100 кДа фильтры Центрикон. Культуральные среды, подвергавшиеся различной обработке, затем использовали для контрольного заражения НТ29 клеток эпителия кишечника, по прошествии 45 мин готовили ЭЦК, и затем анализировали ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ с помощью ЕМ8А (фиг. 2А). Прямое инфицирование НТ29 8. (урЫтипит 1103 или воздействие культуральной среды, как отмечалось, индуцировало ΝΡ-κΒ связывающую активность, причем было обнаружено, что фактор, инициирующий активность, чувствителен к расщеплению протеазами и удерживается фильтром 100 кДа (фиг. 2А). Далее, чтобы точно установить природу активности, индуцирующей ΝΡ-κΒ, стерильно фильтрованную концентрированную культуральную среду разделяли с помощью гель-проникающей хроматографии в геле Супероуз 12 (8ирегоке 12) (фиг. 2Б) и анионообменной хроматографии (фиг. 2В). Отбирали аликвоты хроматографических фракций и анализировали их способность активировать ΝΡ-κΒ в клетках НТ29, а затем анализировали с помощью анализа задержки в геле (ЕМ8А). Как показывает окрашивание геля красителем Кумасси голубым (фиг. 2Б, верх), возрастание ДНК-связывающей активности ΝΡ-κΒ (фиг. 2Б, низ, кривые 4-6) соответствует увеличению общей массы белка примерно до 55 кДа. Анионообменная хроматография на матрице ΡΟΚΟ8 НО и элюирование связанных белков с помощью возрастающего солевого градиента, как указано (фиг. 2В), показывает, что ДНК-связывающая и индуцирующая активность ΝΡ-κΒ соответствует хроматографическим фракциям, содержащим увеличенную до 55 кДа общую массу белка (фиг. 2В, верх, а также не приводящиеся здесь результаты). Элюированные фракции, показанные на фиг. 2В, концентрировали и фракционировали на препаративном 12% 8П8ШАОЕ геле, полосы, соответствующие В1-В6, вырезали из геля, затем белки элюировали, осаждали, ренатурировали и использовали для стимулирования клеток НТ29. ЭЦК из этих клеток анализировали на ДНК-связывающую и индуцирующую активность ΝΡ-κΒ с помощью анализа задержки в геле (ЕМ8А), и установили, что только полоса 2 (В2), соответствующая белку с массой 55кДа (фиг. 2В, низ), способна активировать ДНКсвязывающую активность ΝΡ-κΒ, в то время как буфер из конца и начала солевого градиента не обнаружил способности активировать ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ.
- 18 010291
Белки, соответствующие полосам В1-В6, и пустые области геля далее использовали для секвенирования пептидов. Обработка трипсином белковой фракции полосы В2 и анализ с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии по методу электрораспыления с ионной ловушкой позволили идентифицировать аминокислотные последовательности двадцати одного пептида. Флагеллин (75% охват двадцатью одним пептидом) был однозначно определен как белок, индуцирующий ДНК-связывающую активность ΝΡ-кВ (фиг. 3).
Пример 4. Флагеллин требуется для активации ΝΡ-кВ в клетках эпителия кишечника.
Чтобы определить, действительно ли флагеллин является фактором, отвечающим за инициацию ΝΡ-кВ в клетках эпителия кишечника, подвергающихся непосредственной бактериальной инфекции или действию фильтрованной культуральной жидкости патогенной 8а1топе11а, мы приготовили инфекционные бактерии, прокипятили и отфильтровали культуральную жидкость из не имеющего жгутиков штамма Е. со11 ΌΗ5α, патогенного штамма 8. йиЫш 2229, изогенного мутанта 8. биЫш 2229 8орЕ-, изогенного мутанта 8. биЫш 2229 8орВ-, двойного изогенного мутанта 8. йиЫш 2229 8орЕ-/8орВ-(штамм 8Е18В2), штамма 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη 1103, изогенного инсерционного мутанта 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη Тп/0 (штамм 86) и изогенного двойного мутанта 8. 1урЫшигшт 1103 П|С'-/П)В-. 8орЕ является белком, кодируемым патогенным по отношению к 8а1топе11а бактериофагом, который вводится в клетку хозяина, действует как фактор обмена для малых В1ю ГТФаз Вас1 и С6С42 и инициирует перестройку цитоскелета и окончательную активацию путей МАРК (шйодеп асРуаЮб рго!еш кшаке - киназа, активируемая митогенами), 8АРК (Чге55 асРуаЮб рго!ет ктаке - киназа, активируемая стрессом) и ΝΡ-кВ (7, 15), в то время как 8орВ является белком 8а1топе11а, который действует как инозитолфосфат фосфатаза и участвует в перестройке цитоскелета, а также стимулирует секрецию хлоридов клетками хозяина (44). Бактерии и культуральную жидкость использовали для контрольного заражения клеток НТ29 эпителия кишечника, спустя 45 мин изготовили ЦКЭ и провели анализ ДНК-связывающей активности ΝΡ-кВ к с помощью ЕМ8А. Штаммы 8а1топе11а были способны активировать ΝΡ-кВ, тогда как штаммы 8а1топе11а (мутанты ГИС и ГИС-/ГЦВ-, как указано) оказались не способны продуцировать флагеллин и активировать ΝΡ-кВ (фиг. 4А и Б). Штамм Е. со11 ΌΗ5α не имеет жгутиков и не продуцирует флагеллин, вследствие чего он не способен активировать ΝΡ-кВ. В ходе многочисленных экспериментов мы также отметили, что прямое инфицирование 8. биЫш всегда активирует ΝΡ-кВ в большей степени, чем 8. 1урЫтигшт, как отмечено на фиг. 4 А, тогда как культуральные жидкости обоих видов активируют ΝΡ-кВ практически в одинаковой степени (фиг. 4Б). Мы полагаем, что эта разница может быть вызвана тем, что 8. биЫш выделяет больше флагеллина в культуральную среду по сравнению 8. 1ур1итипит при прямой инфекции, поскольку внесение флагеллина, выделенного из культуры 8. биЫш и 8. 1урЫтигшт и эквивалентных количеств хроматографически очищенного флагеллина дает схожий профиль активации ΝΡ-кВ. Примечательно, что общая неспособность двойных мутантов по гену флагеллина активировать ΝΡ-кВ в сравнении с очень небольшой способностью к его активации, наблюдаемой у одиночного инсерционного мутанта по флагеллину фазы I Я'бТОНО (предпоследняя кривая на фиг. 4А и Б), вероятно, является следствием очень сильно ограниченной экспрессии флагеллина фазы II (у П|В), хотя штаммы 8а1топе11а, используемые здесь, либо генетически неспособны к смене фаз экспрессии флагеллина, либо проявляют такую способность крайне редко. Поскольку оказалось, что флагеллин необходим для активации пути ΝΡ-кВ при прямом инфицировании клеток эпителия кишечника, оказывается возможным, что флагеллин является также основной детерминантой других главных митогенных и активируемых стрессом путей сигналинга, активируемых при инфекции патогенным штаммом 8а1топе11а клеток эпителия кишечника. Прямое инфицирование 8а1топе11а клеток эпителия кишечника приводит к активации ΙΝΙ< (8) и также активации ΝΡ-кВ посредством 1КК киназного пути (3).
Пример 5. Флагеллин запускает активацию активируемой митогеннами протеинкиназы (МАРК), активируемой стрессом протеинкиназы (8АРК) и путей 1кВ киназного (1КК) сигналинга.
Клетки эпителия кишечника выступают как индикаторы инвазии поверхности просвета кишечника и осуществляют привлечение иммуноцитов-эффекторов к очагу инфекции, продуцируя хемокины, такие как интерлейкин-8 (1Ь-8) и белок хемоаттрактант макрофагов 1 (МСР 1), и противовоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли α (ΤΝΡα), интерлейкин-1 (1Ь-1) и интерлейкин-6 (1Ь-6) (1,4-6). Экспрессия этих генов исходно зависит от активности транскрипционных факторов, которые активируются в ответ на передачу сигналов через МАРК, 8АРК и 1КК сигнальные пути. Поскольку ΝΡ-кВ считается главным регулятором/активатором противовоспалительных генетических программ, мы решили исследовать эффект, который мутантный штамм 8а1топе11а, не продуцирующий флагеллин, оказывает на активацию МАРК, 8АРК и 1КК путей сигналинга, и сравнить его с эффектом, наблюдаемым при инфицировании клеток эпителия кишечника диким типом 8а1топе11а, или при воздействии на клетки эпителия кишечника очищенного флагеллина. Инфицирование клеток НТ29 диким типом 8. 1урЫшигшт приводит к активации МАРК, ЕВК (киназы, регулируемые внеклеточными сигналами) 1&2, 8АРК, субъединицу р38 и ΙΝΙ< (1ип Ν-концевая киназа), а также 1КК (фиг. 5), что было показано с использованием фосфоспецифичных антител, выявляющих активацию, методом иммунноблот-анализа (ИБ), и методом антите
- 19 010291 ло-специфичного иммунно-киназного анализа (КА) для 1ΝΚ и ΙΚΚ с использованием соответствующих им субстратов Лип 1-79 и ΟδΤ-ΙκΒα 1-54, меченых глутатион-8-трансферазой (С8Т). Интересно, что стимуляция МАКК имеет временную природу, причем спад активности начинается спустя 45 мин, тогда как активность р38, 1ΝΚ и ΙΚΚ в течение последующего часа увеличивается. Как можно увидеть на фиг. 4, двойной мутант 8а1топе11а ΠίΟ-/Π)Β- также неспособен индуцировать активность ΙΚΚ и ΝΡ-κΒ (как показано на фиг. 5). Неожиданно оказалось, что двойной мутант 8а1топе11а Π^С-/ΠΤ^Β-неспособен индуцировать 8АРК§ р38 и 1ΝΚ и активирует МАКК лишь на короткое время (15 мин). Этот результат сложно интерпретировать, поскольку другие белки 8а1топе11а, такие как 8орЕ и 8орЕ2, могут активировать малые ГТФазы Кас и С6С42. и эти ГТФазы К1о семейства, будучи связанными с активацией 1ΝΕ и р38 (7, 8, 14, 15), как выяснилось, не работают у штамма, негативного по флагеллину.
Двойной мутант 8а1топе11а Πίί,'ΠίΒ- неспособен заражать НТ29 клетки в отличие от штамма дикого типа 8а1топе11а, как было установлено с помощью анализа методом гентамициновой защиты/инвазии. Двойной мутант по флагеллину ί1^С-/ί1^Β-продемонстрировал способность заражать НТ29 клетки, отличающуюся на 4 порядка. Для того чтобы проверить это наблюдение, мы инфицировали клетки НТ29 диким типом 8а1топе11а и двойным мутантом 8а1топе11а Πίί.'7ΠίΒ- (штамм 134), причем оба штамма трансформировали плазмидой рРМ10.1, которая кодирует 6РР под контролем промотора 8§аН 8а1топе11а и функционирует, только когда бактерия поразила клетку хозяина (10, 36). Способность дикого типа 8а1топе11а инфицировать клетки НТ29 была очевидной (СРР, фиг. 5Б), тогда как мутант по флагеллину этой бактерии, как оказалось, не способен поражать клетки НТ29, что было с очевидностью показано по отсутствию экспрессии СРР (фиг. 5Б). Чтобы определить, достаточно ли присутствия флагеллина для того, чтобы призошла инвазия, или для этого требуются также какие-либо другие белки, продуцируемые бактериями, мы вносили очищенный флагеллин, или стерильно фильтрованную культуральную жидкость, или их комбинацию в клетки НТ29, которые контрольно инфицировали двойным мутантом 8а1топе11а ί1^7Π)Β-, а затем исследовали степень их инвазии бактериями. Ни одна из тестируемых комбинаций - ни очищенный флагеллин, ни культуральная жидкость - не способствовала инфицированию бактерий штаммом с двойной мутацией Π№7Π)Β-. Предполагается, что прямая связь между генами флагеллина и эффективностью доставки системой секреции типа ΙΙΙ белков, продуцируемых бактериями, таких как 8орЕ и 81рА, а также других 81р-белков (7, 14, 15, 45, 46), которые играют важную роль в инициировании бактериальной интернализации, отсутствует. Более того, для оценки эффективности стимулирования флагеллином локализации субъединицы р65 (Ке1А) в ядрах клеток эпителия кишечника, мы провели контрольное заражение клеток НТ29 очищенным флагеллином и исследовали локализацию субъединицы р65 (Ке1А), используя непрямую иммуннофлуоресценцию, и обнаружили локализацию р65 (Ке1А) в ядрах почти всех клеток (как показано на фиг. 5).
Очищенный флагеллин (0,5 мкг/мл) в значительной степени активирует ΝΡ-κΒ в клетках НТ29, подобно тому, как это наблюдается у обработанных фактором некроза опухоли (ΤΝΡ) (10 нг/мл) НТ29 клеток, причем активация зависит от времени. Это показано в серии экспериментов (фиг. 6А), где спустя разное время после воздействия, как указано, готовили ЭЦК и анализировали ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ с помощью ЕМ8А. Результаты анализа МАКК, 8АРК и 1КК путей (фиг. 6Б) в тех же ЭЦК с использованием активационно-специфичных фосфоантител для мониторинга активации МАКК и р38 киназ и анализа 1ΝΙ< и 1КК активности методом антитело-специфичной иммуннокиназной преципитации показывают, что активность 1ΝΙ< и 1КК увеличивается спустя один час, в то время как активность р38 и МАКК (ЕКК1 и 2) достигает пика спустя 30 мин и затем начинает снижаться, достигая значительно более низкого уровня через час (как показывает фиг. 6Б). Кривые активации МАКК, 8АРК и 1КК сигнальных молекул ЕКК1&2, р38, 1ΝΙ< и 1КК в клетках эпителия кишечника в ответ на. воздействие очищенного флагеллина в значительной степени похожи на кривые активации в клетках кишечного эпителия, инфицированных диким типом 8а1топе11а (фиг. 5А). Из полученных данных мы заключили, что временная активация сигнальных путей (МАКК, 8АРК и 1КК), изученная здесь, которая отражает ранние события, происходящие при инфицировании 8а1топе11а, определяется почти исключительно распознаванием флагеллина и ответом на него со стороны клеток эпителия кишечника.
Далее нам требовалось изучить влияние очищенного флагеллина и флагеллина, присутствующего в клетках 8а1топе11а на временной характер экспрессии противовоспалительных цитокинов в клетках эпителия кишечника, для того чтобы отделить влияние флагеллина в чистом виде от других воздействий, происходящих при инфекции жгутиковыми или безжгутиковыми штаммами 8а1топе11а. Клетки НТ29 оставляли необработанными, стимулировали ΤΝΡα (10 нг/мл), или стимулировали флагеллином (0,5 ультраграмм/мл), либо инфицировали диким типом 8а1топе11а ФрЫтшгит или двойным мутантом 8а1топе11а П1С/П|Β при множественности инфекции (МИ) 50. Спустя отмеченное время после обработки или инфекции, клетки НТ29 собирали в охлажденный до 0°С фосфатный буфер и лизировали дебрис в тризоле, затем РНК очищали и использовали для получения первой нити комплементарной ДНК (см. описание эксперимента). Аликвоты кДНК использовали в полуколичественной КТ-РСК с использованием специфичных праймеров для генов 1Ь1а, ΙΒ-1β, 1Ь-8, ΤΝΡα, МСР1 и β-актина (сведения о последовательности предоставляются по требованию), затем продукты фракционировали в агарозном геле, содер
- 20 010291 жащем 1,2% бромистого этидия. Экспрессия известных генов-мишеней ΝΤ-κΒ, таких как ГЬ-1 β, ΙΕ-8, ΤΝΤα и МСР1, увеличивалась в ответ на ΤΝΤα или воздействие очищенным флагеллином (фиг. 6В). Инфицирование диким типом Ба1топе11а также приводило к активации этих генов, однако, по сравнению с результатами упомянутых выше эекспериментов, экспрессия ΤΝΤα и МСР1 была временной и возникала сразу после инфицирования. Двойной мутант Ба1топе11а ΠίΟ'ΪΠίΒ-, как оказалось, не способен индуцировать экспрессию ΙΠ-1 β, ΙΕ-8, ΤΝΤα, однако, индуцирует экспрессию МСР 1, хотя уровни этой экспрессии ниже по сравнению с экспрессией, индуцируемой диким типом Ба1топе11а. К тому же индуцируемая двойным мутантом экспрессия МСР 1 не была временной, а продолжалась на протяжении всего времени наблюдения (9 ч) (фиг. 6В). В качестве внутреннего стандарта для сравнения использовался уровень экспрессии β-актина. Интересно, что в ответ на все виды контрольного заражения НТ29 клеток наблюдалась стимуляция ΙΕ-1, который не является геном-мишенью ΝΤ-κΒ. Очевидно, двойной мутант Ба1топе11а Πί(.'7ΠίΒ- может активировать другие неизвестные сигнальные пути, приводящие к экспрессии ΙΕ-1α.
Пример 6. Флагеллин активирует связывание ΝΤ-κΒ с ДНК через МуО88-зависимый путь.
Поскольку флагеллин, как оказалось, способен активировать требуемые для активации противовоспалительных генов сигнальные пути, и эта активность схожа с действием цитокинов, подобных ΤΝΤα, которые активируют все клетки, имеющие на поверхности соответствующие функциональные рецепторы (см. фиг. 1 и 5В, где видна локализация р65 [Ке1 А] в ядрах), мы решили изучить способность То11подобных рецепторов, известных рецепторов, распознающих связанный с патогеном паттерн, активировать ΝΤ-κΒ путь в ответ на действие флагеллина. Для того чтобы проверить это предположение, мы исследовали действие аденовируса, экспрессирующего доминантно-негативный МуО88 (аа 152-296) (47) на опосредованную флагеллином активацию ΝΤ-κΒ в клетках НТ29. МуО88 является адаптерным белком, утилизируемым рецептором ΙΠ-1 и всеми известными ТЕК, которые имеют цитоплазменные сигнальные домены, гомологичные таковым ΙΕ-1, и необходимы для немедленной активации ΝΤ-κΒ путей. Чтобы проверить это предположение, мы сначала использовали эмбриональные мышиные фибробласты (ЭМФ) дикого типа и мутанты МуО88-/- и ТЕК277ТЕК47-/- (подарок С. Акира, Университет Осака, Япония) для уточнения роли МуЭ88 и для изучения потенциальной роли двух ТЕК при ответе на действие флагеллина или на прямое инфицирование диким типом Ба1топе11а, и при активации ΝΤ-κΒ (фиг. 7). Инфекция диким типом Ба1топе11а приводила к значительной активации ΝΤ-κΒ как у дикого типа, так и у мутантов, дефектных по ТЕК (полосы 2 и 15), но в ЭМФ, дефектных по МуО88, эта активация являлась несколько неполноценной (полоса 10). Контрольное инфицирование всех трех типов клеток концентрированной стерильно фильтрованной жидкостью из культуры дикого типа Б. биЫт или двойного изогенного мутанта БорЕ-/БорΒ- штамма БЕ1БΒ2 Б. биЫт приводила к активации ΝΤ-κΒ в ЭМФ дикого типа и клетках двойных мутантов по ТБК2/4, но не активировала ΝΤ-κΒ в клетках, лишенных МуО88 (сравнение полос 11 и 12 с полосами 3, 4, 6, 7, 16 и 17). В ЭМФ дикого типа под действием очищенного флагеллина (0,5 мкг/мл) наблюдалась значительная активация ΝΤ-κΒ, и поэтому возможность того, что в активиации ΝΤκΒ в этих экспериментах играют роль липополисахариды, была исключена. Исключение липополисахаридов из основных причин активации ΝΤ-κΒ также подтверждается значительным уровнем его активации в ЭМФ, несущих двойную мутацию по ТЕК2/4 (полосы 16 и 17), так как ТБК 2 и 4 отвечают на бактериальные липопептиды, пептидогликаны, некоторые липополисахариды, в том числе липополисахариды грамотрицательных бактерий (50-52). Стимуляция ΙΠ-1 подтвердила функциональную необходимость наличия МуО88 для передачи сигналов, опосредованных ΙΠ-1 и флагеллином.
С целью далее исследовать роль ТБК рецепторов в распознавании флагеллина мы проанализировали способность ΝΤ-κΒ быть активированным при гиперэкспрессии ΊΈΚ в клетках, которые обычно слабо реагируют на действие флагеллина. Выбирая клетки, которые слабо реагировали на очищенный флагеллин, подтвердили то, что сигнальные компоненты и адаптеры, которые используются в ответе на флагеллин, присутствуют в этих клетках и являются функциональными, а также то, что лимитирующим фактором, вероятно, является только рецептор, отвечающий на флагеллин. Обнаружив, что клетки НеБа и НЕК293Т стимулируют ДНК-связывающую активность ΝΤ-κΒ в ответ на стимуляцию ΙΕ-1, но плохо реагируют на действие флагеллина, мы выбрали клетки НЕК293Т для дальнейшего использования благодаря тому, что их можно более эффективно трансфецировать. В клетках НЕК293Т в результате временной трансфекции достигали гиперэкспрессии генов ТБК 1-9, меченных эпитопом РЕАС по Ν-концу, (подарок Р. Меджитова, Йельский Университет и Р. Улевича, Научно-Исследовательский Институт Скриппса) (42, 43) а также репортерного гена люциферазы, управляемого 2х-NΤ-κΒ-зависимым промотором, и при этом выявили экспрессию люциферазы в ответ на воздействие флагеллина (0,5 мкг/мл) или ТКТа (10 нг/мл). ТБК5 был единственным представителем рецепторов группы ΊΈΚ, экспрессия которого вызвала значительный ответ клеток на иммунизацию флагеллином (табл. 1).
Для дальнейшего проверки того, действительно ли активация ΝΤ-κΒ флагеллином проходит именно при участии ТБК5, мы внесли в ген ΊΈΚ доминантно-негативные сигнальные мутации, которые представляли собой делеции карбоксильного конца каждого из ТБК до консервативного триптофана в ΉΚ домене. Подобная мутация в рецепторе ΙΠ-1 делает его неспособным активировать ΝΤ-κΒ (54, 55). Все
- 21 010291 доминантно негативные ΤΕΚ вместе с клонированным с кДНК ΤΕΚ5 (31111^11^(^8)-^^5 - антисмысловой ΤΕΚ5) клонировали в экспрессионном векторе млекопитающих ρί.ΌΝΑ3.1 ([пуйгодеп). Все мутантные белки хорошо экспрессировались. Каждый вектор экспрессии доминантно-негативного ЕБК и пустой вектор экспрессии вместе с 2-х ΝΡ-κΒ Ьис использовали, как описано выше (3), для трансформации клеток НТ29, которые очень хорошо реагировали на флагеллин. Трансфецированные клетки оставили необработанными, либо стимулировали ΤΝΡα (10 нг/мл) или очищенным флагеллином (0,5 мкг/мл). Было обнаружено, что экспрессия доминантно-негативных ΤΕΚ не влияет на экспрессию репортерных генов в ответ на стимуляцию трансфецированных ΤΝΡα клеток (фиг. 8А); однако, только экспрессия как доминантно-негативного ΤΕΚ5, так и антисмысловой конструкции ΤΕΚ5 приводит, соответственно, примерно к 50%-ному и 25%-ному ингибированию опосредованной флагеллином активации репортерного гена (фиг. 8В), в то время как доминнано-негативный ΤΕΚ2 также показал умеренное ингибирование экспрессии генов репортеров, вызываемой флагеллином. Эти результаты означают, что ΤΕΚ5 принимает участие в распознавании флагеллина клеточной поверхностью и инициирует пути сигналинга, приводящие к активации ΝΡ-κΒ. Влияние доминантно-негативного ΊΈΚ2 на зависимую от ΝΡ-κΒ активацию репортерного гена, возможно, является неспецифическим, поскольку его экспрессия также ингибирует опосредованную ΤΝΡα активацию репортера как и экспрессия других доминантно-негативных ЕБК. Доминантно негативный ΤΈΚ2 может также конкурировать с ΤΕΚ5 за некий неизвестный белок адаптор. В любом случае, результаты, представленные на фиг. 7 показывают, что ΤΈΚ2 и ΤΕΚ4 не требуются для активации ΝΡ-κΒ, опосредованной флагеллином.
Пример 7. Опосредованная флагеллином активация ΝΡ-κΒ, приводит к увеличению экспрессии генов подсемейства ΤΕΚ.
Стимуляция клеток эпителия кишечника 8. (урЫттцт или очищенным флагеллином приводит к активации программы противовоспалительных генов (фиг. 6С). Нам требовалось проверить, может ли экспрессия генов ЕБК также изменяться в клетках, стимулированных флагеллином. НТ29 клетки обрабатывали очищенным флагеллином (0,5 мгк/мл) и из необработанных и обработанных клеток, через 3 ч после стимуляции выделяли тотальную фракцию РНК и использовали ее для получения первой нити комплементарной ДНК. Полуколичественную ΚΤ-РСК с использованием ген-специфичных праймеров для каждого ΤΕΚ и первой нити кДНК, полученной из нестимулированных или стимулированных флагеллином клеток, использовали для генерации ДНК, которую разделяли в 1,2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Экспрессия ЕБК 2, 3 и 7 увеличивалась после стимуляции флагеллином (фиг. 9). Паттерн экспрессии других ЕБК оставался неизменным. В качестве внутреннего количественного контроля использовался β-актин.
ΤΕΚ5 экспрессируется в клетках, не показывающих значительного ответа на флагеллин. В ходе данного исследования, а также ряда других (22, 33), было показано, что флагеллин активирует ΝΡ-κΒ именно через ΤΕΚ5. В предыдущих сообщениях не указывалось точно наличие и количественное содержание ЕБК в клетках, которые использовались для определения функции флагеллина (22, 33). Нам требовалось установить, уменьшается ли количество ΤΕΚ5 и присутствует ли он вообще в клетках, которые показывают очень слабый ответ, или полное его отсутствие, на контрольное инфицирование флигеллином. Количество ΤΕΚ5 в нескольких клеточных линиях исследовали иммунноблот-анализом (ИБА) с использованием 'ГЬЮ-специфических антител и сравнивали со способностью очищенного флагеллина индуцировать ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ в ЭЦК, полученных из этих клеток. Использовали клеточные линии эпителия кишечника Т84 и НТ29, а также клеточную линию аденокарциномы легкого А549, клеточную линию НеЬа шейной аденокарциномы человека, клеточную линию почки человеческого эмбриона, экспрессирующую большой Т-антиген НЕК293Т, а также клеточную линию глиобластомы Τ98Ο. Белок ΤΕΚ5 обнаружили во всех клеточных линиях, изученных с помощью иммуноблот анализа с антителами, специфичными к ΤΕΚ5 (фиг. 10 А). В клетках Т84 наблюдалось самое большое количество ΤΕΚ 5, тогда как в других клеточных линиях уровни экспрессии различались не более чем в 2 раза (фиг. 10А). ДНК-связывающая активность ΝΡ-κΒ в не стимулированных, стимулированных ΤΝΡα и стимулированных флагелином клетках анализировали на ЭЦК, полученных из каждого типа клеток, методом ΕΜ8Α (фиг. 10В). НТ29 и А549 клетки сильно реагировали на стимуляцию флагеллином и ΤΝΡα, тогда как НеЬа, 293Т и Τ98Ο клетки слабо (НеЬа, 293Τ) или вовсе (Τ98Ο) не реагировали на стимуляцию флагеллином. Аутентичность комплекса ΝΡ-κΒ и ДНК определяли, используя р65-специфичные антитела для суперсдвига ΝΡ-κΒ и ДНК-белкового комплекса. Интересно то, что некоторые клетки, экспрессирующие ΤΕΚ5, проявляли или очень слабый ответ, или вообще никакого. Такой результат может быть следствием либо недостаточного присутствия рецепторов на плазматической мембране и внутри клетки, инактивационной или субвитальной мутации в гене ΤΕΚ5 в этих клеточных линиях, либо отсутствия или небольшого количества требуемых ко-рецепторов или адапторных белков (как это имеет место в некоторых клетках для ΤΕΚ4 и его корецепторов/адапторов ΜΌ2 (30, 56, 57). Интерлейкин-1 может стимулировать ДНК-связывающую активность ΝΡ-κΒ во всех изученных клеточных линиях, из чего следует, что механизмы, передающие сигнал от ΜνΩ88 к ΝΡ-κΒ остаются неповрежденными.
Пример 8. Изолирование рекомбинантного флагеллина.
- 22 010291
Для того чтобы подтвердить способность рекомбинантного флагеллина индуцировать ΝΡ-κΒ, провели тест на активность флагеллина, используя репортерные клетки, несущие ΝΡ-κΒ-чувствительную люциферазу (Ьис). Описанная конструкция содержала три ΝΡ-κΒ-связывающих сайта из промотора Еселектина, скомбинированного с минимальным промотором Нкр70, который обычно используют для детекции ΝΡ-κΒ. Люциферазную активность измеряли в клеточном лизате спустя 6 ч после добавления флагеллина в среду. В качестве положительного контроля использовали ΤΝΡα. Результаты репрезентативного эксперимента представлены на фиг. 13 и показывают, что рекомбинантный флагеллин способен активировать ΝΡ-κΒ.
Пример 9. Флагеллин замедляет смерть мышей от ГИС, вызванного ионизирующим излучением.
Как отмечено выше, флагеллин является мощным активатором ΝΡ-κΒ и вероятно может действовать как ингибитор клеточной гибели по механизму апоптоза. Поскольку цитокины, способные индуцировать ΝΡ-κΒ, действуют как радиопротекторы, мы проверили, может ли флагеллин также выступать в качестве радиопротектора.
Мыши, все тело которых подвергают гамма-излучению дозой 15 Гр, гибнут в течение 8 дней от гастроинтестинального синдрома. Такие эксперименты представляют собой стандартную модель для изучения повреждений желудочно-кишечного (ЖК) тракта, вызванных ИИ (см. выше). Для изучения способности флагеллина защищать эпителий ЖК тракта от ИИ, мы протестировали влияние внутривенной инъекции флагеллина на динамику смертности мышей после облучения дозой 15 Гр. Мы использовали различные дозы флагеллина, каждая из которых была значительно ниже, чем наиболее высокая толерантная доза, известная из литературных источников (300 мкг/мышь, Еауек-Ру1ек Τ, е1 а1., 2001Б). Облучение производили через 4 ч после обработки. Результаты репрезентативных экспериментов приведены на фиг. 14. Как мы и ожидали, облученные контрольные мыши (которые получили раствор хлорида натрия, забуференного фосфатом) умерли спустя 5-8 дней после облучения, тогда как животные, получившие флагеллин, жили значительно дольше; причем срок, на который продлевалась их жизнь, коррелировал с дозой флагеллина. Патоморфологический анализ, проведенный на 7 день после облучения, выявил значительную разницу между тонким кишечником мышей, обработанных флагеллином, и мышей из контрольной группы (фиг. 15). Внутривенные, интраперитонеальные и подкожные инъекции 0,2 мг/кг флагеллина, за которыми следовало облучение дозой 13 Гр, подобным образом увеличивали время жизни примерно 85-90% мышей на 30 дней (данные не приводятся). Эксперименты проводили, в целом, также, как и эксперименты с оптимальной дозой, описанные выше, но использовали дозу облучения 13 Гр и изменяли способы введения.
Пример 10. Флагеллин предотвращает смерть мышей от гемопоэтического синдрома, вызванного ионизирующим излучением.
Далее мы изучали влияние флагеллина на смерть мышей от гемопоэтического синдрома, вызванного ИИ, который экспериментально индуцировали с помощью низких доз излучения (обычно до 11 Гр), которые не способны вызвать смертельный ГИС. Эксперименты проводили так же, как и описанные выше (фиг. 14 и 15), однако, вместо дозы 15 Гр мыши получили дозу 10 Гр, вызвавшую 100% летальный исход в контрольной группе к 13 дню (фиг. 16). Группа, которой вводили флагеллин (5 мкг/мышь), оказалась полностью защищенной от такой дозы ИИ, что доказывает, что флагеллин защищает от действия излучения, предохраняя не только от гастроинтестинального, но и гемопоэтического синдромов, вызываемых ИИ.
Пример 11. Зависимость защитного действия флагеллина от времени.
Для того чтобы установить, как радиопротективная активность флагеллина зависит от времени воздействия, мышам инъецировали флагеллин за разные промежутки времени до воздействия гаммаизлучением дозой 13 Гр. Результаты одного из таких экспериментов приведены на фиг 17. Эти результаты показывают, что флагеллин оказывает эффективное радиопротективное действие, предохраняя от излучения дозой 13 Гр, если его вводить за 1-4 ч до облучения, но не является эффективным, если его вводить за 24 ч до облучения.
Для того чтобы установить зависимость радиопротективной активности флагеллина от времени, мышей подвергали инъекции в различные промежутки времени относительно момента гамма-облучения. Эксперименты проводили согласно описанному выше, проводя внутрибрюшинную инъекцию СΒ^Β-501 в количестве 5 мкг/мышь (0,2 мг/кг), а мышам контрольной группы инъецировали бактериальную РНК полимеразы в количестве 5 мкг/мышь (0,2 мг/кг). Эксперименты проводили с линией мышей ΝΙ1ι-8\νίκκ. Результаты этих экспериментов демонстрируют, что флагеллин-501 обеспечивает выживание 90% животных после облучения дозой 13 Гр, если вводить флагеллин за 1 или 2 ч до облучения (фиг. 17). Для ясности приведен только график, соответствующий 1 ч до облучения, однако, мыши, которым проводили инъекцию за 2 ч до облучения, демонстрировали такую же степень и динамику выживания. При введении флагеллина за 4 ч до облучения защитный эффект проявляется в несколько меньшей степени. Флагеллин, введенный за 24 ч до облучения, не оказывает защитного эффекта при облучении дозой 13 Гр, вызывающей смерть.
Интересно, что введение флагеллина за 24 ч до воздействия гамма-излучением дозой 10 Гр обеспе- 23 010291 чивает 100% защиту. В то время как облучение мышей дозой 13 Гр вызывает смерть от ГИС, смерть, вызываемая облучением дозой 10 Гр, обусловлена гемопоэтическим синдромом. Соответственно, такая длительная защита от облучения дозой 10 Гр может быть обусловлена усиленной пролиферацией или выживанием кроветворных стволовых клеток, индуцированными флагеллином и/или долгоживущими вторичными цитокинами.
Пример 12. Определение летальной дозы 50/30, детальной дозы 50/7 и фактора модулирования дозы для флагеллина.
Мы произвели оценку способности флагеллина защищать от облучения в зависимости от дозы. Как показано выше (фиг. 17), обработка флагеллином была достаточной, чтобы обеспечить 100% защиту от действия гамма-излучением дозой 10 Гр (такая доза вызывает смерть от гемопоэтического синдрома) и выживание в течение 30 дней в 90% случаев при получении дозы 13 Гр (гемопоэтические и гастроинтестинальный синдром). Эксперименты выполняли, как описано выше, используя дозу флагеллина 5 мкг/мышь (0,2 мг/кг), вводящуюся внутрибрюшинно за 1 ч до облучения.
Тем не менее, при облучении дозой 15 Гр за 7-дневным выживанием последовала смерть, и к 13 дню 100% животных были мертвы (30-дневное выживание в 0% случаев), тогда как в контрольной группе в течение 7 дней все мыши погибли от гастроинтестинального синдрома (фиг. 18). Кинетика смертности группы, обработанной СВЬВ-501 после облучения дозой 15 Гр, напоминает кинетику смертности контрольной группы, получившей дозу 10 Гр, из чего можно сделать вывод, что причиной смерти был гемопоэтический синдром. Исходя из представленных результатов, можно заключить, что смертельная доза 50/30 для флагеллина составляет около 13,5-14 Гр и фактор модулирования дозы 30 составляет около 1,75-1,8. Такой уровень радиопротекции существенно выше, чем известные для любых других природных соединений уровни.
Таблица
ТЬК.5 демонстрирует ответ на флагеллин и активирует ΝΡ-кВ
Клетки 293 Т трансфецировали пустым вектором (рСПЫА3.1) или индивидуально перечисленными аллелями дикого типа ТЬК трижды на 6-луночном планшете (1мкг/мл). Репортерная активность ΝΡ-кВ была отрегулирована нормализацией экспрессии до контрольного уровня активности люциферазы Ренилла, и кратность индуцирования рассчитывалась как отношение активности гена-репортера в обработанных клетках к активности гена-репортера в нестимулированных клетках (но - не определено).
нестимулированные
Вектор I
ТЬК1 1,7
ТЬК.2 1,6
ТЬКЗ 1,5
ТЬК4 1,8
ТЬК.5 1,6
ТЬК.7 1,5
ТЬК.8 1,4
ТЬК9 1,5
ΤΝΡ ГНС
13,5 4,9
НО 5,1
но 5,3
но 5,0
но 5,4
но 9,2*
но 5,2
но 5,0
но 5,1

Claims (18)

1. Способ защиты млекопитающего от радиации, который включает введение млекопитающему, нуждающемуся в такой защите, композиции, которая содержит флагеллин.
2. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят радиопротектор.
3. Способ по п.2, где указанный радиопротектор представляет собой антиоксидант.
4. Способ по п.3, где указанный антиоксидант выбран из группы, состоящей из амифостина и вита- мина Е.
5. Способ по п.2, где указанный радиопротектор представляет собой цитокин.
6. Способ по п.5, где указанный цитокин представляет собой фактор стволовых клеток.
7. Способ по п.1, где указанную композицию вводят до, после или одновременно с воздействием радиации.
8. Способ по п.1, где радиация представляет собой ионизирующее излучение.
9. Способ по п.8, где радиация индуцирует гастроинтестинальный синдром или гематопоэтический синдром.
10. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят фактор роста.
11. Способ по п.10, где фактор роста представляет собой фактор роста кератиноцитов.
12. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят стероид.
- 24 010291
13. Способ по п.12, где стероид представляет собой 5-андростендиол.
14. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят аммония трихлор(диоксоэтиленО,О')теллурат.
15. Способ по любому из пп.1-14, где млекопитающее представляет собой человека.
16. Способ по п.1, где указанный флагеллин содержит последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична областям Ό1 и Ό2 флагеллина.
17. Способ по п.16, где млекопитающему дополнительно вводят радиопротектор.
18. Способ по п.16, где флагеллин получен из бактерий 8а1шопе11а.
Фиг. 1
- 25 010291
СО
Интенсивность х 10
Фиг. 2 г ель-проникаюшая хроматография. Кумасси голубой
Анионообменная хроматография РОРО5 НО
EA200601079A 2003-12-02 2004-12-02 Способы защиты млекопитающего от радиации EA010291B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52646103P 2003-12-02 2003-12-02
US52649603P 2003-12-02 2003-12-02
US52646003P 2003-12-02 2003-12-02
US52666603P 2003-12-02 2003-12-02
PCT/US2004/040753 WO2005056042A2 (en) 2003-12-02 2004-12-02 Methods of protecting against radiation using flagellin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200601079A1 EA200601079A1 (ru) 2006-12-29
EA010291B1 true EA010291B1 (ru) 2008-08-29

Family

ID=34682348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601079A EA010291B1 (ru) 2003-12-02 2004-12-02 Способы защиты млекопитающего от радиации

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11235028B2 (ru)
EP (1) EP1706133B1 (ru)
JP (1) JP4750716B2 (ru)
KR (1) KR101287905B1 (ru)
CN (1) CN1913915B (ru)
AT (1) ATE483467T1 (ru)
AU (1) AU2004296828B2 (ru)
CA (1) CA2547869C (ru)
DE (1) DE602004029500D1 (ru)
DK (1) DK1706133T3 (ru)
EA (1) EA010291B1 (ru)
HK (1) HK1102492A1 (ru)
IL (1) IL175974A (ru)
PL (1) PL1706133T3 (ru)
PT (1) PT1706133E (ru)
SG (2) SG148215A1 (ru)
SI (1) SI1706133T1 (ru)
UA (1) UA83272C2 (ru)
WO (3) WO2005057218A2 (ru)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8580321B2 (en) * 2003-12-02 2013-11-12 The Cleveland Clinic Foundation Method for reducing the effects of chemotherapy using flagellin related polypeptides
US8007812B2 (en) 2004-12-22 2011-08-30 Cleveland Clinic Foundation Flagellin related polypeptides and uses thereof
MX2007015834A (es) * 2005-06-13 2008-09-15 Cleveland Biolabs Inc Metodos de proteccion contra apoptosis utilizando polipeptidos.
WO2009036059A2 (en) 2007-09-10 2009-03-19 Boston Biomedical, Inc. Novel stat3 pathway inhibitors and cancer stem cell inhibitors
EP2320948B1 (en) * 2008-08-01 2013-03-06 Cleveland Biolabs, Inc. Methods for treating reperfusion injuries
KR101254244B1 (ko) * 2010-11-01 2013-04-12 한국원자력의학원 ＴＧＦ－β１을 유효성분으로 함유하는 방사선 피폭 또는 조사에 의한 세포손상의 예방 또는 치료용 조성물
AU2012205681B2 (en) 2011-01-10 2016-07-28 Cleveland Biolabs, Inc. Use of toll-like receptor agonist for treating cancer
CN102965386A (zh) * 2011-09-02 2013-03-13 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种重组细菌鞭毛蛋白衍生多肽的制备和活性鉴定方法
WO2014169078A2 (en) 2013-04-09 2014-10-16 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
KR20150085146A (ko) * 2014-01-13 2015-07-23 한국원자력의학원 소포체 스트레스 저해제를 포함하는 방사선 방호용 조성물
KR20170031251A (ko) 2014-07-30 2017-03-20 클리브랜드 바이오랩스, 아이엔씨. 플라젤린 조성물 및 용도
US10183056B2 (en) 2014-10-16 2019-01-22 Cleveland Biolabs, Inc. Methods and compositions for the treatment of radiation-related disorders
KR101634380B1 (ko) 2015-06-23 2016-06-28 한국생산기술연구원 Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법
EP3390653B1 (en) * 2015-12-16 2022-08-10 F. Hoffmann-La Roche AG Improved recombinant production method
WO2018102427A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Boston Biomedical, Inc. Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof
CA3062656A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
US20210236594A1 (en) * 2018-04-24 2021-08-05 Genome Protection, Inc. Methods for improving frailty and aging
KR102524577B1 (ko) * 2019-04-22 2023-04-21 전남대학교산학협력단 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
WO2022086190A1 (ko) * 2020-10-20 2022-04-28 주식회사 메디스팬 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399494A (en) 1983-03-04 1995-03-21 The University Of Maryland System Vibrio cholerae strain CVD103Hgr, method of making same, and vaccines derived therefrom
US6130082A (en) * 1988-05-05 2000-10-10 American Cyanamid Company Recombinant flagellin vaccines
US20020009747A1 (en) * 1997-08-25 2002-01-24 Freda Diane Miller Methods and reagents for identifying modulators of neuronal apoptosis
US7300749B2 (en) * 2000-02-17 2007-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Molecules of the pyrin domain protein family and uses thereof
AU2002216500A1 (en) * 2000-11-28 2002-06-11 Genesis Research And Development Corporation Limited Methods for modulating apoptotic cell death
US20030077262A1 (en) * 2001-10-02 2003-04-24 Guido Franzoso Methods and compositions for modulating apoptosis
US7078165B2 (en) * 2003-03-27 2006-07-18 Institut Pasteur Method for modulating Nod1 activity, use of a MTP related molecule for modulating Nod1 activity, and therapeutic applications thereof
US7638485B2 (en) 2003-12-02 2009-12-29 Cleveland Biolabs, Inc. Modulating apoptosis
US8007812B2 (en) 2004-12-22 2011-08-30 Cleveland Clinic Foundation Flagellin related polypeptides and uses thereof

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EAVES-PYLES T. ET AL.: "Flagellin, a novel mediator of Salmonella-induced epithelial activation and systemic inflammation: I kappa B alpha degradation, induction of nitric oxide synthase, induction of proinflammatory mediators, and cardiovascular dysfunction". JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILLIAMS & WILKINS CO, US, vol. 166, no. 2, 15 January 2001 (2001-01-15), p 1248-1260, XP002210841, ISSN: 0022-1767, p. 1253, left-hand column, paragraph 2 - right-hand column, paragraph 1; figure 4 *
EAVES-PYLES T.D. ET AL.: "Salmonella f1agellin-dependent proinf1ammatory responses are localized to the conserved amino and carboxyl regions of the protein", JOURNAL OF IMMUNOLOGY (BALTIMORE, MD.: 1950) 15 DEC 2001, vol. 167, no. 12, 15 December 2001 (2001-12-15), p. 7009-7016, XP002341395, ISSN: 0022-1767, p. 7012, left-hand column, paragraph 1 ÔÇô p. 7013, left-hand column, paragraph 1; figure 2 *
GRDINA DAVID J. ET AL.: "Relationships between cytoprotection and mutation prevention by WR-1065", MILITARY MEDICINE. FEB 2002, vol. 167, no. 2 Suppl, February 2002 (2002-02), p. 51-53, XP008051184, ISSN: 0026-4075, p. 51, right-hand column, last paragraph - page 52, left-hand column, paragraph 1; figure 1 *
MURLEY JEFFREY S. ET AL.: "Delayed cytoprotection after enhancement of Sod2 (MnSOD) gene expression in SA-NH mouse sarcoma cells exposed to WR-1065, the active metabolite of amifostine", RADIATION RESEARCH, vol. 158, no. 1, July 2002 (2002-07), p. 101-109, XP008051326, ISSN: 0033-7587, abstract *
MURLEY JEFFREY S. ET AL.: "Delayed radioprotection by NFkappaB-mediated induction of Sod2 (MnSOD) in SA-NH tumor cells after exposure to clinically used thiol-containing drugs", RADIATION RESEARCH, vol. 162, no. 5, November 2004 (2004-11), p. 536-546, XP008051185, ISSN: 0033-7587 *
SEED THOMAS ET AL.: "New strategies for the prevention of radiation injury: Possible implications for countering radiation hazards of long-term space travel", JOURNAL OF RADIATION RESEARCH, vol. 43, no. Supplement, December 2002 (2002-12), p. S239-S244, XP008051327, ISSN: 0449-3060, table 1 *
TALLANT THOMAS ET AL.: "Flagellin acting via TLR5 is the major-activator of key signaling pathways leading to NF-kappaB and proinflammatory gene program activation in intestinal epithelial cells", BMC MICROBIOLOGY, vol. 4, no. August 23, 23 August 2004 (2004-08-23), XP002341239, ISSN: 1471-2180, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005056055A3 (en) 2006-05-18
CN1913915A (zh) 2007-02-14
CA2547869C (en) 2014-01-14
EA200601079A1 (ru) 2006-12-29
SG148215A1 (en) 2008-12-31
WO2005056042A3 (en) 2005-11-10
SG176524A1 (en) 2011-12-29
KR101287905B1 (ko) 2013-07-23
EP1706133A2 (en) 2006-10-04
JP2007513183A (ja) 2007-05-24
DE602004029500D1 (de) 2010-11-18
EP1706133B1 (en) 2010-10-06
PL1706133T3 (pl) 2011-04-29
PT1706133E (pt) 2010-12-07
WO2005057218A2 (en) 2005-06-23
DK1706133T3 (da) 2011-01-17
CA2547869A1 (en) 2005-06-23
AU2004296828B2 (en) 2011-07-07
US11235028B2 (en) 2022-02-01
CN1913915B (zh) 2010-12-01
IL175974A0 (en) 2006-10-05
AU2004296828A1 (en) 2005-06-23
US20190381139A1 (en) 2019-12-19
US20220105155A1 (en) 2022-04-07
IL175974A (en) 2015-09-24
WO2005056042A2 (en) 2005-06-23
JP4750716B2 (ja) 2011-08-17
ATE483467T1 (de) 2010-10-15
WO2005056055A2 (en) 2005-06-23
SI1706133T1 (sl) 2011-02-28
HK1102492A1 (en) 2007-11-23
UA83272C2 (ru) 2008-06-25
KR20070009533A (ko) 2007-01-18
WO2005057218A3 (en) 2005-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010291B1 (ru) Способы защиты млекопитающего от радиации
US10406206B2 (en) Protection against stress-mediated damage from ionizing radiation
JP5285278B2 (ja) フラゲリン関連ポリペプチドおよびその使用
JP5000644B2 (ja) リポペプチドを用いてアポトーシスから保護するための方法
US20070202551A1 (en) TGFBeta
JP2012505922A (ja) 癌の阻害剤としてのｍｕｃ−１細胞質ドメインペプチド
KR101051785B1 (ko) 암세포를 선택적으로 사멸시키기 위한 ＲａｓＧＡＰ 유래펩티드
JP5706818B2 (ja) ＡｐｏＥペプチドにより癌を治療する方法
US20030087809A1 (en) Alpha 2HS glycoprotein for treatment of cancer and a method for preparation thereof
WO2005056054A2 (en) METHODS OF INHIBITING APOPTOSIS USING INDUCERS OF NF-κB
US20100279407A1 (en) Alpha 1-acid glycoprotein, alpha 2-hs glycoprotein, alpha 1-antitrypsin, and fragments thereof induce apoptosis in cancer cell lines
ES2353127T3 (es) Procedimientos de protección contra la radiación usando flagelina.
WO2012112869A2 (en) Targeted cancer therapy using ets transcriptional inhibitors
EP2578227B1 (en) Cancer therapy method
JP2021534826A (ja) がんの処置のためのペプチド治療薬およびその使用
KR20120118978A (ko) ｐ53을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM