ES2353127T3 - Procedimientos de protección contra la radiación usando flagelina. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende flagelina para uso en un procedimiento de protección a un mamífero de los efectos de la radiación.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] Esta invención se refiere a una composición que comprende flagelina para uso como se expone en la reivindicación 1 y al uso de esta composición como se expone en la reivindicación 2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] La progresión de células normales a células tumorales implica una pérdida de los mecanismos negativos de regulación del crecimiento, incluyendo la resistencia a estímulos inhibidores del crecimiento y una falta de dependencia de factores de crecimiento y hormonas. Los tratamientos tradicionales del cáncer que están basados en la radiación o fármacos citotóxicos se basan en las diferencias en el control de crecimiento entre células normales y malignas. Los tratamientos tradicionales del cáncer someten a las células a un estrés genotóxico grave. En estas condiciones, el crecimiento de la mayoría de las células normales se detiene y por lo tanto se salvan, mientras que las células tumorales continúan dividiéndose y mueren. [0003] Sin embargo, la naturaleza de la estrategia del tratamiento convencional del cáncer es tal que los tejidos normales de división rápida o con tendencia a la apoptosis están en riesgo. El daño de estas células de división rápida normales causa los bien conocidos efectos secundarios del tratamiento del cáncer (tejidos sensibles: hematopoyesis, intestino delgado, folículos pilosos). La sensibilidad natural de dichos tejidos está complicada por el hecho de que las células cancerosas frecuentemente adquieren defectos en la maquinaria suicida (apoptótica) y aquellos procedimientos terapéuticos que causan la muerte en tejidos sensibles normales pueden no dañar las células cancerosas. Los intentos convencionales de minimizar los efectos secundarios de terapias del cáncer están basados en (a) preparar células tumorales más susceptibles de tratamiento, (b) preparar terapias del cáncer más específicas de células tumorales o

(c) promover la regeneración del tejido normal después del tratamiento (por ejemplo, eritropoyetina, GM-CSF, y KGF). Se dan a conocer algunas estrategias para la prevención de la lesión por radiación en Seed T. y col., J. Radiation Research, 43, Supl., dic. 2002, pág. 5239-5244. [0004] Sigue existiendo la necesidad de agentes terapéuticos que mitiguen los efectos secundarios asociados a la radioterapia en el tratamiento del cáncer. Esta invención satisface estas necesidades y proporciona otras ventajas relacionadas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0005] Esta invención se refiere a una composición que comprende flagelina para uso como se expone en la reivindicación 1 y al uso de esta composición como se expone en la reivindicación 2. Los siguientes procedimientos y composiciones forman parte de la presente divulgación, pero no son parte de la invención. [0006] Se da a conocer en la presente memoria un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece un cáncer por NF-κB constitutivamente activo, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un agente que induce NF-κB. El agente puede ser flagelina o TGF-β, que puede ser TGF-β latente. El agente puede administrarse antes de, conjuntamente con o después de un tratamiento para el cáncer. El tratamiento puede ser quimioterapia o radioterapia. [0007] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece daño del tejido normal atribuible al tratamiento de un cáncer, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un agente que induce NF-κB. El agente puede ser flagelina o TGF-β, que puede ser TGF-β latente. El agente puede administrarse antes de, conjuntamente con o después de un tratamiento para el cáncer. El tratamiento puede ser quimioterapia o radioterapia. [0008] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece daño del tejido normal atribuible al estrés, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un agente que induce NF-κB. El agente puede ser flagelina o TGF-β, que puede ser TGF-β latente. El agente puede administrarse antes de, conjuntamente con o después de un tratamiento para una enfermedad padecida por el mamífero. [0009] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de modulación del envejecimiento celular en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un agente que induce NF-κB. El agente puede ser flagelina o TGF-β, que puede ser TGF-β latente. El agente puede administrarse antes de, conjuntamente con o después de un tratamiento para una enfermedad padecida por el mamífero. [0010] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva una composición farmacéutica que comprende un agente que induce la actividad de NF-κB, un fármaco quimioterapéutico y opcionalmente un coadyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. El agente puede ser flagelina o TGF-β, que puede ser TGF-β latente.

[0011] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de cribado de un inductor de NF-κB, que comprende añadir un presunto inductor a un sistema de expresión activado por NF-κB y añadir separadamente un control a un sistema de expresión activado por NF-κB, con lo que se identifica un inductor de NFκB por la capacidad de aumentar el nivel de expresión activada por NF-κB. [0012] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de protección de un mamífero de los efectos de la radiación, que comprende administrar a dicho mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que induce NF-κB. El agente puede ser flagelina, que puede derivar de una especie de Salmonella. La composición puede administrarse en combinación con un radioprotector. El radioprotector puede ser un antioxidante, que puede ser amifostina o vitamina E. El radioprotector puede ser también una citocina, que puede ser un factor de células madre. [0013] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de protección de un paciente de uno o más tratamientos o afecciones que desencadenan la apoptosis, que comprende administrar a dicho paciente una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente que induce NF-κB. El agente puede ser flagelina, que puede derivar de una especie de Salmonella. El tratamiento puede ser un tratamiento del cáncer, que puede ser quimioterapia o radioterapia. La afección puede ser un estrés, que puede ser por radiación, herida, envenenamiento, infección y choque térmico. [0014] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de cribado de un modulador de la apoptosis que comprende añadir un presunto modulador a un sistema apoptótico basado en célula y añadir separadamente un control a un sistema apoptótico basado en célula, con lo que se identifica un modulador de la apoptosis por la capacidad de alterar la velocidad de apoptosis, en el que el presunto modulador deriva de un parásito de mamífero. [0015] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de cribado de un modulador de NF-κB, que comprende añadir un presunto modulador a un sistema de expresión activado por NF-κB y añadir separadamente un control a un sistema de expresión activado por NF-κB, con lo que se identifica un modulador de NF-κB por la capacidad de alterar la velocidad de expresión activada por NF-κB, en el que el presunto modulador deriva de un parásito de mamífero. El parásito puede ser de una especie que incluye, pero sin limitación, Salmonella, Mycoplasma y Chlamydia. [0016] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de cribado de un modulador de TGF-β, que comprende añadir un presunto modulador de un sistema de expresión activado por TGF-β y añadir separadamente un control a un sistema de expresión activado por TGF-β, con lo que se identifica un modulador de TGF-β por la capacidad de alterar la velocidad de expresión activada por TGF-β, en el que el presunto modulador deriva de un parásito de mamífero. El TGF-β puede ser TGF-β latente. El parásito puede ser de una especie que incluye, pero sin limitación, Salmonella, Mycoplasma y Chlamydia. [0017] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de cribado de un modulador de p53, que comprende añadir un presunto modulador a un sistema de expresión activado por p53 y añadir separadamente un control a un sistema de expresión activado por p53, con lo que se identifica un modulador de p53 por la capacidad de alterar la expresión activada por p53, en el que el presunto modulador deriva de un parásito de mamífero. El parásito puede ser de una especie que incluye, pero sin limitación, Salmonella, Mycoplasma y Chlamydia. [0018] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un modulador identificado mediante cualquiera de los procedimientos de cribado descritos en la presente memoria descriptiva. Se da a conocer en la presente memoria descriptiva una composición que comprende un modulador descrito en la presente memoria. La composición puede ser una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un modulador descrito en la presente memoria. [0019] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto necesitado de dicho tratamiento una composición farmacéutica que comprende un modulador que potencia la apoptosis. [0020] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de protección de un paciente de uno o más tratamientos que desencadenan la apoptosis, que comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica que comprende un modulador que inhibe la apoptosis. El uno o más tratamientos puede ser un tratamiento del cáncer. El tratamiento del cáncer puede ser quimioterapia o radioterapia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0021] La Fig. 1 demuestra que la infección por Salmonella conduce a la localización nuclear de NF-κB incluso en células no infectadas. Se cultivaron células HT29 en cubreobjetos de vidrio y se infectaron ficticiamente, se dejaron sin tratar o se infectaron con Salmonella typhimurium o se trataron con TNF-α (10 ng/ml). Panel A: se infectaron ficticiamente células HT29 o se infectaron a una MOI de 100 con la cepa SJW1103G de Salmonella typhimurium que expresa GFP a partir del promotor ssaH, que se encuentra activo solamente dentro de células hospedadoras infectadas. Se fotografiaron las células usando microscopia de campo brillante (BF) e inmunofluorescencia para detectar la tinción con GFP o DAPI como se indica. Se fusionaron las imágenes (se superpusieron) para revelar las células que estaban infectadas. Panel B: se dejaron células HT29 sin tratar, se infectaron con la cepa 1103 de Salmonella typhimurium o se trataron con TNF-α. Se controló mediante inmunofluorescencia indirecta la localización de p65(RelA) de NF-κB en diversas condiciones, como se indica. Se visualizaron las células mediante microscopia de campo brillante (BF), se tiñeron los núcleos celulares con DAPI y se visualizó la p65(RelA) con FITC. Se coloreó falsamente de rojo la tinción con DAPI para hacer más fácil distinguir la visualización de la fusión (superposición). [0022] La Fig. 2 demuestra que un factor proteico en caldo de cultivo de Salmonella conduce a la activación de NF-κB. Panel A: se trató caldo de cultivo de Salmonella dublin concentrado 100 veces como se indica, o se usaron bacterias infecciosas como se indica para infectarinfectar células HT29. Se ensayó la actividad de unión a ADN de NF-κB mediante EMSA a partir de extractos de células enteras preparados 45 min después del tratamiento. Se determinó la autenticidad del complejo de ADN de NF-κB:proteína usando superdesplazamientos de anticuerpo específico de p65(RelA) y específico de p50. Panel B: se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño un caldo de cultivo de Salmonella dublin (IN) concentrado exclusión por tamaños en una columna Superose 12. Se analizaron las fracciones de proteína eluída mediante fraccionamiento en PAGE-SDS al 10% y se visualizaron por tinción con azul de Coomasie (CB). Se indican los marcadores de peso molecular para cromatografía y en los geles. Se usaron alícuotas de cada fracción como se indica para estimular las células HT29 y se analizó en los WCE resultantes por EMSA la actividad de unión a ADN de NF-κB. Panel C: se sometió a cromatografía un caldo de cultivo de Salmonella dublin (IN) concentrado mediante cromatografía de intercambio aniónico en matriz POROS HQ. Se eluyeron las proteínas con un gradiente de NaCl creciente como se indica y se analizaron en PAGE-SDS al 10% y se visualizaron por tinción con azul de Coomasie (CB). Se usaron el original y alícuotas de cada fracción como se indica para estimular células HT29 y se analizó en los WCE resultantes por EMSA la actividad de unión a ADN de NF-κB. Se usaron el material eluído correspondiente a las bandas de proteína B1-B6 y una porción de blanco del gel aislado a partir de un gel de PAGE-SDS al 10% duplicado, junto con muestras de tampón del gradiente de tampón de NaCl inicial y final para estimular células HT29 y se analizó en los WCE resultantes por EMSA la actividad de unión a ADN de NF-κB. [0023] La Fig. 3 demuestra que el factor activador de NF-κB en caldo de cultivo de Salmonella es la flagelina, como se identifica por espectrometría de masas: HPLC microcapilar en serie con espectrometría de masas de la banda 2 digerida con tripsina. Los picos correspondientes a los péptidos de Salmonella se numeran e identifican con la correspondiente secuencia peptídica numerada a la derecha. [0024] La Fig. 4 demuestra que los mutantes de flagelina no consiguen activar NF-κB. Panel A: EMSA de ensayo para la actividad de unión de ADN de NF-κB en WCE preparados 45 minutos después a partir de células no infectadas (UN) y después de infección directa de células HT29 con DH5α de E. coli de tipo natural, Salmonella dublin de tipo natural, mutante SopE-, mutante SopB-o mutante doble SopE-/SopB-, cepa 1103 de Salmonella typhimurium de tipo natural, mutante fliC-(fliC::Tn10), mutante doble fliC-/fljB-como se indica, a una MOI de 50. Panel B: EMSA de ensayo de la actividad de unión de ADN de NF-κB en WCE preparados 45 min después de la aplicación de la infección a células HT29 a partir de células no infectadas (UN) o con caldos de cultivo concentrados esterilizados por filtración de bacterias tanto de tipo natural como mutantes como se indica. [0025] La Fig. 5 demuestra que la flagelina es necesaria para activar múltiples rutas de señalización durante la infección por Salmonella y que conduce a la localización nuclear de NF-κB. Panel A: se dejaron células HT29 sin tratar, se estimularon con TNF-α (10 ng/ml) o un cóctel de anisomicina [An] (20 µg/ml)/PMA (12,5 ng/ml) durante 15 min, o se infectaron con la cepa 1103 de Salmonella typhimurium de tipo natural (WT) o la cepa 134 de mutante doble fliC-/fljB-de Salmonella typhimurium como se indica. Se prepararon los WCE a los tiempos indicados o a los 10 min para células tratadas con TNF o a los 15 min para células tratadas con anisomicina/PMA, y se usaron en EMSA para analizar la actividad de unión a ADN de NF-κB, o en ensayos de inmunocinasas (KA) usando anticuerpos dirigidos contraIKK o contra JNK para medir la actividad cinasa IKK y JNK en sus sustratos respectivos GST-IκBα 1-54 y GST-cJun 1-79 (como se indica). Se fraccionaron análisis de inmunotransferencia (IB) de cantidades equivalentes (40 µg) de proteína de cada extracto en geles de PAGE-SDS, se transfirieron a membranas de PVDF y se sondearon con los anticuerpos indicados para detectar las IKK, JNK, ERK y p38 en bruto como se indica. Se indican análisis de inmunotransferencia que usan anticuerpos fosfoespecíficos de ERK y p38 para detectar ERK y p38 activados. Panel

B: Inmunofluorescencia que demuestra que el mutante de flagelina de Salmonella no consigue infectar células HT29 y que la estimulación con flagelina purificada de células HT29 conduce a una localización nuclear de p65 (RelA) de NF-κB como se determina por inmunofluorescencia indirecta. La formación de imágenes de células HT29 con el tratamiento indicado cultivadas en cubreobjetos era esencialmente la misma que en las Fig. 1A y B. Se usó una falsa coloración del tinte DAPI para potenciar la visualización tanto de los núcleos teñidos con DAPI como de la localización nuclear de p65. [0026] La Fig. 6 demuestra que la flagelina purificada activa rutas de señalización y la expresión génica proinflamatoria en células epiteliales intestinales que imitan las de una infección por Salmonella de tipo natural. Se dejaron las células HT29 sin tratar

o se trataron con TNF-α (10 ng/ml) o un cóctel de anisomicina [An] (2 µg/ml)/PMA (12,5 ng/ml) durante 10 min, o con flagelina (1 µg/ml) durante los tiempos indicados. Se prepararon WCE y se analizaron por EMSA la actividad de unión a ADN de NFκB, ensayos de inmunocinasa (KA) o análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos fosfoespecíficos de ERK o p38 para detectar la activación y con anticuerpos específicos de cinasa como se describen en la Fig. 5A para detectar la abundancia de cinasa en bruto como se indica. Panel A: EMSA para detectar la actividad de unión a ADN de NF-κB. Panel B: ensayos de inmunotransferencia y cinasa para detectar las actividades de IKK, JNK, ERK y p38 cinasa y la abundancia de proteína como en la Fig. 5A. Panel C: PCR-FI semicuantitativo de la expresión génica proinflamatoria de células no tratadas, infectadas con Salmonella typhimurium de tipo natural y mutante doble de flagelina, estimuladas con TNF-α (10 ng/ml) o flagelina (1 mg/ml). Se recogieron las células HT29 en los tiempos indicados después de los tratamientos indicados y se usó el ARN aislado para preparar una primera cadena de ADNc que se usó posteriormente en reacciones de PCR-FI que usan cebadores específicos de gen para IL1α, IL1β, IL-8, TNFα, MCP1 y β-actina. Se usó la β-actina como estándar para normalizar los patrones de expresión. Se fraccionaron los productos de PCR resultantes en geles de agarosa al 2% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. [0027] La Fig. 7 demuestra que la activación mediada por flagelina de NF-κB es dependiente de MyD88. Se usaron Salmonella dublin de tipo natural infecciosa (MOI de 100), IL-1 (20 ng/ml), flagelina purificada (1 µg/ml) (como se indica), sobrenadante de retenido de filtrado de 100 kDa (spt) esterilizado por filtración y concentrado de Salmonella dublin de tipo natural y la cepa SE1 SB2 (S2, como se indica) de Salmonella dublin mutante doble SopE-/SopB-para infectar MEF de tipo natural, con delección génica MyD88-/-o con delección génica doble TLR2-/-/TLR4-/-como se indica. Se prepararon WCE 45 min después de los tratamientos y se examinaron por EMSA para analizar la actividad de unión a ADN de NF-κB. Se usó IL-1 (20 ng/ml) como control positivo para controlar la función de MyD88. [0028] La Fig. 8 demuestra que TLR5 inhibe la actividad del gen informador de NF-κB mediada por flagelina. Se transfectaron células HT29 por triplicado en discos de 6 pocillos usando los vectores de expresión de mamífero DN-TLR o los TLR5 de sentido contrario (AS (TLR5) (2 µg/pocillo) indicados, gen informador 2x NF-κB Luc (100 ng/pocillo), luciferasa de Renilla con pRL-TK para normalización (50 ng/pocillo) ajustada a 4 µg de ADN total/pocillo con ADN del vector vacío pCDNA3.1. Panel A: Inducción en veces del gen informador 2x NF-κB Luc en células no estimuladas (sombreado claro) y en células tratadas con TNF-α (10 ng/ml) (sombreado oscuro). Se prepararon los lisados 12 h después de la estimulación. Se muestran los resultados de un experimento representativo. Panel B: Se trataron células HT29 transfectadas como en la Fig. 8A con flagelina (1 µg/ml) y se prepararon y se analizaron los lisados celulares como en la Fig. 8A. Se muestran los resultados de un experimento representativo. [0029] La Fig. 9 demuestra que la estimulación con flagelina de células epiteliales intestinales conduce a la activación de un subconjunto de genes TLR. Se estimularon las células HT29 con flagelina (1 mg/ml), se aisló el ARN después de 3 h usando Trizol, y se usó para preparar la primera cadena de ADNc. Se representan los productos de PCR-FI generados usando cebadores específicos de gen para cada TLR como se indica. Se usó β-actina como estándar para normalizar los patrones de expresión. [0030] La Fig. 10 demuestra que TLR5 se expresa en numerosos tipos celulares y que tiene respuestas variables a la flagelina. Panel A: se prepararon extractos de células enteras a partir de células T84, HT29, A549, HeLa, 293T y T98G no estimuladas y se fraccionaron en un gel de PAGE-SDS al 8%, se transfirieron las proteínas a membrana de PVDF y se sondearon con anticuerpo anti-TLR5 para análisis de inmunotransferencia (IB). Se examinó la carga de proteína sondeando con un anticuerpo anti-actina. Panel B: Se dejaron células HT29, A549, HeLa, 293T y T98G sin tratar (-), se trataron con flagelina (F) o TNFα (T) y se prepararon WCE después de 45 min y se usaron en EMSA para controlar la actividad de unión a ADN de NF-κB.

Se ensayó la autenticidad del desplazamiento de banda de NF-κB con el superdesplazamiento del complejo con anticuerpo específico de p65(RelA). [0031] La Fig. 11 demuestra que la deficiencia de p53 aceleraba el desarrollo del síndrome GI en ratones. Panel A: la inyección I.P. de PFTα (10 mg/kg) protege a ratones C57B1/6J (si no se indica otra cosa, aquí y en lo sucesivo se usaron ratones macho de 6-8 semanas) de una dosis única de 9 Gy de radiación gamma y de una dosis de radiación acumulada fraccionada de 12,5 Gy (5 x 2,5 Gy). El PFTα no tiene efecto sobre la supervivencia de ratones tratados con dosis únicas de 12,5 y 25 Gy de RI: (se muestran los resultados de experimentos representativos; se usó una fuente de cesio 137 Shepherd a 4000 Ci a un índice de dosificación de 4 Gy por minuto). Panel B: los ratones C57B1/6J de tipo natural y sin p53 difieren en su sensibilidad relativa ante dosis bajas (10 Gy) y altas (15 Gy) de radiación gamma: los ratones de tipo natural eran más sensibles a 10 Gy pero más resistentes a 15 Gy en comparación con ratones sin p53. Panel C: Se inyectaron a ratones tratados con 11 Gy de irradiación gamma corporal total 12 h después 1,5 x 107 células de médula ósea de ratones C57B1/6J de tipo natural o singénicos sin p53. (Esta dosis causa un 100% de mortalidad en el grupo de ratones de control no reconstituidos). Dos meses después, tras la recuperación completa de la hematopoyesis, se trataron los animales con 15 Gy de radiación gamma corporal total y no se mostró diferencia en las tasas de mortalidad entre los dos grupos que diferían en el estado de p53 en su médula ósea. Panel D: la comparación de la dinámica de lesión de los intestinos delgados de ratones de tipo natural y sin p53 en los puntos temporales indicados después de 15 Gy de radiación gamma indica un daño acelerado en ratones sin p53 (secciones de parafina teñidas con hematoxilina-eosina, x125 aumentos). Los paneles de 24 h incluyen imágenes de tinción con TUNEL si son secciones de criptas: es evidente una apoptosis masiva en el epitelio de tipo natural pero no en el deficiente en p53. [0032] La Fig. 12 demuestra la dinámica de la proliferación y supervivencia celular en el intestino delgado de ratones de tipo natural y sin p53. Panel A: comparación de las tasas de proliferación en intestinos de ratones de tipo natural y sin p53 después de tratamiento con RI. (Izquierda) Autorradiografías de secciones de cuerpo entero (x 1,7 aumentos) de ratones de tipo natural y sin p53 de 4 semanas con inyección intraperitoneal de 14C-timidina (10 µCi por animal) tratados o no tratados con 15 Gy de radiación gamma (Westphal y col. 1997). Las flechas apuntan a los intestinos. (Derecha) Comparación de la incorporación de BrdU en el intestino delgado de ratones de tipo natural y sin p53 en diferentes puntos temporales después de 15 Gy de radiación gamma. Se inyectó BrdU (50 mg/kg) 2 h antes de sacrificar los ratones y se realizó la inmunotinción como se describe anteriormente (Watson & Pritchard 2000). Se muestran fragmentos de los paneles de 96 h a los máximos aumentos (x400). Panel B: comparación del número de células positivas de BrdU/cripta en el intestino delgado de ratones de tipo natural y sin p53 en diferentes puntos temporales después de 15 Gy de radiación gamma. Se analizaron tres animales por cada punto temporal, se prepararon cinco secciones transversales de íleon por cada animal y se analizaron microscópicamente para estimar el número de criptas y vellosidades. Se contó el número de células positivas de BrdU en las criptas en 5 campos aleatorios a x200 aumentos (100-30 criptas) y se representó el número medio de células positivas de BrdU. Panel C: seguimiento del número y posición de las células marcadas con BrdU en el intestino delgado de ratones de tipo natural y sin p53 en diferentes puntos temporales después de 15 Gy de radiación gamma. Se inyectó BrdU 30 min antes de la irradiación y se sacrificaron los ratones en los puntos temporales indicados. Se observó una migración acelerada de criptas a vellosidades seguida de una rápida eliminación de las células marcadas en ratones sin p53.

[0033]

La Fig. 13 demuestra que la flagelina recombinante es capaz de activar el

NF-κB.

[0034]

La Fig. 14 muestra un experimento representativo que ensaya la capacidad

de la flagelina de proteger a ratones de la radiación. Se inyectaron a ratones C56BL6 (de 6 semanas, 10 animales por grupo) por vía i.v. 2,0 µg (0,1 mg/kg) o 5 µg (0,25 mg/kg) de flagelina en PBS. 4 horas después, se irradiaron los ratones con 15 Gy y se controló diariamente la supervivencia de los ratones. [0035] La Fig. 15 muestra secciones histológicas (teñidas con HE) del epitelio de intestino delgado de ratones que se trataron con 15 Gy de radiación gamma con o sin inyección i.v. de 0,25 mg/kg de flagelina. La completa destrucción de criptas y vellosidades en los ratones de control contrasta con la morfología normal del tejido del animal tratado con flagelina. [0036] La Fig. 16 muestra el efecto de la flagelina sobre la sensibilidad del ratón a 10 Gy de radiación gamma corporal total. [0037] La Fig. 17 muestra el efecto de la flagelina inyectada i.v. en los tiempos indicados antes de la irradiación sobre la sensibilidad del ratón a 13 Gy (izquierda) y 10 Gy (derecha) de radiación gamma corporal total. [0038] La Fig. 18 muestra el efecto de la flagelina sobre la sensibilidad del ratón a 10, 13 y 15 Gy de radiación gamma corporal total.

[0039] La Fig. 19 muestra la estructura de dominios de la flagelina bacteriana. El esqueleto de Ca sigue la distribución del núcleo hidrófobo y la información estructural de F41. Hay cuatro núcleos hidrófobos distintos que definen los dominios D1, D2a, D2b y D3. Se exponen con el esqueleto de Ca todos los átomos de cadena lateral hidrófobos. Los átomos de cadena lateral están codificados por color: Ala, amarillo; Leu, Ile o Val, naranja; Phe y Tyr, morado (átomos de carbono) y rojo (átomos de oxígeno). Posición y región de diversos rasgos estructurales en la secuencia aminoacídica de la flagelina: se muestran, de arriba a abajo, el fragmento F41 en azul, tres plegamientos de lámina β en marrón, la distribución de estructura secundaria con una hélice α en amarillo, la estructura β en verde y los giros β en morado, un apóstrofe cada 50 residuos en azul, los dominios D0, D1, D2 y D3, la región de contacto con la subunidad axial en el protoelemento, en cian, la secuencia aminoacídica bien conservada en rojo y la región variable en violeta: mutaciones puntuales en F41 que producen elementos de diferentes superenrrollamientos. Las letras inferiores indican la morfología de los elementos mutantes: L (D107E, R124A, R124S, G426A), L de tipo lineal; R (A449V), R de tipo lineal; C (D313Y, A414V, A427V, N433D), espiral33 . (Samatey y col., Nature 2001).

DESCRIPCIÓN DETALLADA [0040] Esta invención se basa en proteger células y tejidos normales de la apoptosis causada por estreses que incluyen radioterapia y radiación. Hay dos mecanismos principales que controlan la apoptosis en la célula: la ruta de p53 (proapoptótica) y la ruta de NF-κB (antiapoptótica). Ambas rutas están frecuentemente desreguladas en tumores: habitualmente p53 se pierde, mientras que NF-κB se vuelve constitutivamente activo. Por tanto, la inhibición de p53 y la activación de NF-κB en células normales puede protegerlas de la muerte causada por estreses tales como tratamiento del cáncer, pero no volvería las células tumorales más resistentes al tratamiento porque tienen estos mecanismos de control desregulados. Esto contradice la opinión convencional sobre p53 y NF-κB, que se consideran dianas para activación y represión, respectivamente. [0041] Esta divulgación se refiere a inducir la actividad de NF-κB para proteger células normales de la apoptosis. Al inducir la actividad de NF-κB en un mamífero, las células normales pueden protegerse de la apoptosis atribuible al estrés celular, que aparece en tratamientos del cáncer, hipertermia y exposición a dosis dañinas de radiación, por ejemplo, trabajadores en centrales nucleares, la industria militar o la producción radiofarmacéutica y militares; y al envejecimiento celular. Puesto que NFκB está constitutivamente activo en muchas células tumorales, la inducción de la actividad de NF-κB puede proteger células normales de la apoptosis sin proporcionar un efecto beneficioso a las células tumorales. Una vez reparadas las células normales, la actividad de NF-κB puede restaurarse a los niveles normales. La actividad de NF-κB puede inducirse para proteger a aquellos tejidos sensibles a la radiación y la quimioterapia como el sistema hematopoyético (incluyendo el sistema inmunitario), el epitelio intestinal y los folículos pilosos. [0042] Los inductores de la actividad de NF-κB pueden usarse también para varias otras aplicaciones. Pueden resultar consecuencias patológicas y muerte causadas por la exposición de mamíferos a una variedad de condiciones graves incluyendo, pero sin limitación, radiación, heridas, envenenamiento, infección, envejecimiento y choque térmico, por la actividad de mecanismos fisiológicos normales de respuesta al estrés, tales como la inducción de muerte celular programada (apoptosis) o la liberación de proteínas bioactivas, las citocinas. [0043] La apoptosis funciona normalmente “limpiando” los tejidos de células atacadas y genéticamente dañadas, mientras que las citocinas sirven para movilizar el sistema de defensa del organismo frente al patógeno. Sin embargo, en condiciones de lesión grave, ambos mecanismos de respuesta al estrés pueden actuar por sí mismos como causas de muerte. Por ejemplo, la mortalidad por radiación puede resultar de una apoptosis masiva relacionada con p53 que aparece en los sistemas hematopoyético, inmunitario y digestivo. La regulación farmacológica racional del NF-κB puede aumentar la supervivencia en condiciones de estrés grave. El control de estos factores puede permitir el control tanto de la respuesta inflamatoria como de la decisión de vida

o muerte de las células de los órganos lesionados. [0044] El papel protector del NF-κB está mediado por la activación transcripcional de múltiples genes que codifican: a) proteínas antiapoptóticas que bloquean ambas rutas apoptóticas principales, b) citocinas y factores de crecimiento que inducen la proliferación y supervivencia de HP y otras células madre y c) proteínas antioxidantes potentes secuestrantes de ROS, tales como MnSOD (SOD-2). Por tanto, mediante la activación temporal de NF-κB para radioprotección, puede ser posible conseguir no sólo la supresión de la apoptosis en pacientes de cáncer, sino también la capacidad de reducir la tasa de incidencia de cáncer secundario debido al efecto inmunoestimulante simultáneo, que puede conseguirse si se llega a la activación de NF-κB mediante la activación de receptores de tipo Toll. [0045] Otra propiedad atractiva de la ruta de NF-κB como diana es su activación por numerosos factores naturales que pueden considerarse como candidatos a radioprotectores. Entre estos se encuentran múltiples patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Los PAMP son moléculas que no se encuentran en el organismo hospedador, son característicos de grandes grupos de patógenos y no pueden mutar fácilmente. Se reconocen por los receptores de tipo Toll (TLR), los elementos sensores clave de la inmunidad innata. Los TLR actúan como un primer mecanismo de aviso del sistema inmunitario al inducir la migración y activación de células inmunitarias directamente o mediante la liberación de citocina. Los TLR son proteínas de membrana de tipo I, conocidas por funcionar como homodímeros y heterodímeros. Tras la unión a ligando, los TLR agrupan a la proteína MyD88, un adaptador de señalización indispensable para la mayoría de TLR. La cascada de señalización posterior conduce a efectos que incluyen (i) la activación de la ruta de NF-κB, y (ii) la activación de MAPK, incluyendo la cinasa N-terminal Jun (JNK). La activación de la ruta de NF-κB por ligandos de receptor de tipo Toll hace a los ligandos atractivos como radioprotectores potenciales. Al contrario que las citocinas, muchos PAMP tienen pocos efectos aparte de activar los TLR y por tanto es improbable que produzcan efectos secundarios. Además, muchos PAMP están presentes en seres humanos. [0046] De forma coherente con su función de activación de inmunocitos, todos los TLR se expresan en bazo y leucocitos de sangre periférica, con más patrones de expresión específicos de TLR en otros órganos linfoides y subconjuntos de leucocitos. Sin embargo, los TLR se expresan también en otros tejidos y órganos del cuerpo, por ejemplo, el TLR1 se expresa ubicuamente, el TLR5 se encuentra también en el epitelio GI y el endotelio, mientras que los TLR 2, 6, 7 y 8 son conocidos por expresarse en pulmón.

1. Definiciones [0047] Ha de entenderse que la terminología usada en la presente memoria descriptiva es con el fin de describir realizaciones particulares solamente y no se pretende que sea limitante. Debe observarse que, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto imponga claramente otra cosa. [0048] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “administrar”, cuando se usa para describir la dosificación de un agente que induce la actividad de NF-κB, significa una dosis única o dosis múltiples del agente. [0049] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “análogo”,

cuando se usa en el contexto de un péptido o polipéptido, comprende uno o más aminoácidos no estándar u otras variaciones estructurales del conjunto convencional de aminoácidos. [0050] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “anticuerpo” significa un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, o fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo Fab, F(ab’)2, Fd y anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo purificado por afinidad o mezclas de los mismos que exhiba suficiente especificidad de unión por un epítopo deseado o una secuencia derivada del mismo. El anticuerpo puede ser también un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede derivatizarse mediante la unión a uno o más restos químicos, peptídicos o polipeptídicos conocidos en la técnica. El anticuerpo puede conjugarse con un resto químico. [0051] Como se usa en la presente memoria descriptiva, “apoptosis” designa una forma de muerte celular que incluye la contracción progresiva del volumen celular con la conservación de la integridad de los orgánulos citoplasmáticos, la condensación de la cromatina (concretamente, condensación nuclear), como se observa por microscopio óptico o electrónico, y/o la escisión de ADN en fragmentos de tamaño de nucleosoma, como se determina mediante ensayos de sedimentación por centrifugación. La muerte celular aparece cuando se pierde la integridad de membrana de la célula (por ejemplo, vacuolización de membrana) con la absorción de fragmentos celulares intactos (“cuerpos apoptóticos”) por células fagocíticas. [0052] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “cáncer” significa cualquier afección caracterizada por la resistencia a estímulos apoptóticos. [0053] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “tratamiento del cáncer” significa cualquier tratamiento para el cáncer conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, quimioterapia y radioterapia. [0054] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “combinación con”, cuando se usa para describir la administración de un agente que induce la actividad de NF-κB y un tratamiento adicional, significa que el agente puede administrarse antes de, junto con o después del tratamiento adicional, o una combinación de los mismos. [0055] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “derivado”, cuando se usa en el contexto de un péptido o polipéptido, significa un péptido o polipéptido diferente de otro en estructura primaria (aminoácidos y análogos aminoacídicos). A modo de ilustración, los derivados pueden diferir por estar glucosilados, una forma de modificación postraduccional. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos pueden exhibir patrones de glucosilación debido a la expresión en sistemas heterólogos. Si se retiene al menos una actividad biológica, entonces estos péptidos o polipéptidos son derivados según la invención. Otros derivados incluyen, pero sin limitación, péptidos de fusión o polipéptidos de fusión que tienen un extremo N o C modificado covalentemente, péptidos o polipéptidos PEGilados, péptidos o polipéptidos asociados con restos lipídicos, péptidos o polipéptidos alquilados, péptidos o polipéptidos ligados mediante un grupo funcional de cadena lateral aminoacídica a otros péptidos, polipéptidos o productos químicos y modificaciones adicionales como se entendería en la técnica. [0056] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “flagelina” significa flagelina de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitación, cualquier especie bacteriana. La flagelina puede ser de una especie de Salmonella. Se contemplan específicamente también fragmentos, variantes, análogos, homólogos o derivados de dicha flagelina, y combinaciones de los mismos. Los diversos fragmentos, variantes, análogos, homólogos o derivados descritos en la presente memoria pueden ser un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticos a una flagelina de tipo natural. [0057] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “fragmento”, cuando se usa en el contexto de un péptido o polipéptido, significa un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. El fragmento puede ser de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 aminoácidos de longitud. [0058] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “homólogo”, cuando se usa en el contexto de un péptido o polipéptido, significa un péptido o polipéptido que comparte un antecesor evolutivo común. [0059] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “TGF-β latente” significa un precursor de TGF-β que no está en forma activa. Un TGF-β latente puede ser un precursor de TGF-β que contiene TGF-β activo y péptido asociado a latencia (LAP). Un TGF-β latente puede comprender también LAP ligado con proteína de unión a TGF-β latente. Un TGF-β latente puede ser también el complejo latente grande. Además, un TGF-β latente puede ser un TGF-β latente que está modificado de modo que se haya reducido la velocidad de conversión en TGF-β activo

o la capacidad de convertirse en TGF-β. El TGF-β latente modificado puede ser, por ejemplo, un TGF-β mutante que evita o reduce la conversión en TGF-β activo. [0060] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “TGF-β” significa cualquier isoforma de TGF-β activo o latente incluyendo, pero sin limitación, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 o TGF-β5, y combinaciones de los mismos. Se contemplan también específicamente fragmentos, variantes, análogos, homólogos o derivados de dichas isoformas de TGF-β, y combinaciones de los mismos. Los diversos fragmentos, variantes, análogos, homólogos o derivados descritos en la presente memoria pueden ser un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticos a una isoforma de TGF-β. [0061] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “tratar” o “tratamiento”, cuando designa la protección de un mamífero frente a una afección, significa prevenir, suprimir, reprimir o eliminar la afección. Prevenir la afección implica administrar una composición de esta invención a un mamífero antes del inicio de la afección. Suprimir la afección implica administrar una composición de esta invención a un mamífero después de inducir la afección, pero antes de su aparición clínica. Reprimir la afección implica administrar una composición de esta invención a un mamífero después de la aparición clínica de la afección de tal modo que la afección se reduzca o mantenga. La eliminación de la afección implica la administración de una composición de esta invención a un mamífero después de la aparición clínica de la afección de tal modo que el mamífero no padezca ya más la afección. [0062] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “célula tumoral” significa cualquier célula caracterizada por resistencia a estímulos apoptóticos. [0063] Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “variante”, cuando se usa en el contexto de un péptido o polipéptido, significa un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia aminoacídica por la inserción, deleción o sustitución conservativa de aminoácidos, pero que retiene al menos una actividad biológica. Con los fines de esta invención, “actividad biológica” incluye, pero sin limitación, la capacidad de unirse a un anticuerpo específico. Una sustitución conservativa de un aminoácido, concretamente reemplazar un aminoácido por un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilia, grado y distribución de regiones cargadas) se reconoce en la técnica que implica típicamente un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, como se entiende en la técnica. Kyte y col., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido está basado en la consideración de su hidrofobia y carga. Es conocido en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden sustituirse y seguir reteniendo función proteica. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. La hidrofilia de los aminoácidos puede usarse también para revelar sustituciones que resultarían en proteínas que retienen la función biológica. La consideración de la hidrofilia de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la mayor hidrofilia media local de ese péptido, una medida útil que se ha notificado que se correlaciona bien con la antigenicidad e inmunogenicidad, patente de EE.UU. nº 4.554.101. La sustitución por aminoácidos que tienen valores de hidrofilia similares puede dar como resultado péptidos que retienen la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. En un aspecto, las sustituciones se efectúan con aminoácidos que tienen valores de hidrofilia de ± 2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobia como el valor de hidrofilia de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De forma coherente con esa observación, se entiende que las sustituciones aminoacídicas que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente de las cadenas laterales de esos aminoácidos, como se revela por la hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y otras propiedades.

2. Procedimientos de tratamiento

a. Tumor con NF-κB constitutivamente activo [0064] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece un cáncer con NF-κB constitutivamente activo, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que induce la actividad de NF-κB. El agente que induce la actividad de NF-κB puede administrarse en combinación con un tratamiento del cáncer. [0065] El agente puede administrarse simultánea o regularmente con otros tratamientos anticancerosos tales como quimioterapia y radioterapia. El término “simultáneo” o “simultáneamente”, como se usa en la presente memoria descriptiva, significa que el otro tratamiento anticanceroso y el compuesto de esta invención se administran separados por 48 horas, preferiblemente 24 horas, más preferiblemente 12 horas, aún más preferiblemente 6 horas y lo más preferiblemente 3 horas o menos. El término “regularmente”, como se usa en la presente memoria descriptiva, significa que la administración de los compuestos en momentos diferentes de la quimioterapia y con cierta frecuencia respecto a la administración repetida y/o al régimen de quimioterapia. [0066] El agente puede administrarse en cualquier momento anterior a la exposición al tratamiento del cáncer incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h o 1 h antes de la exposición. El agente puede administrarse en cualquier momento posterior a la exposición al tratamiento del cáncer incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h o 48 h después de la exposición. [0067] El tratamiento del cáncer puede comprender la administración de un agente citotóxico o agente citostático, o combinación de los anteriores. Los agentes citotóxicos previenen que las células cancerosas se multipliquen (1) interfiriendo con la capacidad de la célula de replicar ADN y (2) induciendo la muerte celular y/o apoptosis de las células cancerosas. Los agentes citostáticos actúan mediante la modulación, interferencia o inhibición de los procesos de transducción de señal celular que regulan la proliferación celular y a veces a bajos niveles continuos. [0068] Las clases de compuestos que pueden usarse como agentes citotóxicos incluyen los siguientes: agentes alquilantes (incluyendo, sin limitación, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triazenos), mostaza de uracilo, clorometina, ciclofosfamida (Cytoxan®), ifosfamida, melfalán, clorambucilo, pipobromán, trietilenmelamina, trietilentiofosforamina, busulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina y temozolomida; antimetabolitos (incluyendo, sin limitación, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa): metotrexato, 5fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina; productos naturales y sus derivados (por ejemplo, alcaloides de vinca, antibióticos antitumorales; enzimas, linfocinas y epipodofilotoxinas): vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, ara-C, paclitaxel (el paclitaxel está comercialmente disponible como Taxol®), mitramicina, desoxicoformicina, initomicina-c, 1-asparaginasa, interferones (preferiblemente IFN-α), etopósido y tenipósido. [0069] Otros agentes citotóxicos proliferativos son navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida y droloxafina.

[0070] Los agentes que alteran los microtúbulos interfieren con la mitosis celular y son bien conocidos en la técnica por su actividad citotóxica. Los agentes que afectan a microtúbulos útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, alocolquicina (NSC 406042), halicondrina B (NSC 609395), colquicina (NSC 757), derivados de colquicina (por ejemplo, NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®, NSC 125973), derivados de Taxol® (por ejemplo NSC 608832), tiocolquicina (NSC 361792), tritilcisteína (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato de vincristina (NSC 67574), epotilones naturales y sintéticos incluyendo, pero sin limitación, epotilón A, epotilón B y discodermolida (véase Service, (1996) Science, 274: 2009), estramustina, nidazol, MAP4 y similares. Se describen también ejemplos de dichos agentes en Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110: 3055 3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57: 3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8: 973-985 y Panda (1996) J. Biol. Chem. 271: 29807-29812. [0071] Son también adecuados agentes citotóxicos tales como epidofilotoxina, una enzima antineoplásica, un inhibidor de topoisomerasa, procarbazina, mitoxantrona, complejos de coordinación de platino tales como cisplatino y carboplatino, modificadores de la respuesta biológica, inhibidores del crecimiento, agentes terapéuticos antihormonales, leucovorina, tegafur, y factor des crecimiento hematopoyéticos. [0072] Los agentes citostáticos que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos): 17-α-etinilestradiol, dietilestilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, acetato de megestrol, metilprednisolona, metiltestosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolida, flutamida, toremifeno, zoladex. [0073] Otros agentes citostáticos son antiangiogénicos tales como inhibidores de metaloproteasa de matriz, y se incluyen también otros inhibidores de VEGF tales como anticuerpos contra VEGF y moléculas pequeñas tales como ZD6474 y SU6668. Pueden usarse también anticuerpos anti-Her2 de Genetech. Es un inhibidor de EGFR adecuado el EKB-569 (un inhibidor irreversible). Se incluyen también imolona, un anticuerpo C225 inmunoespecífico de EGFR, e inhibidores de src. [0074] Es también adecuado para uso como agente citostático Casodex® (bicalutamida, Astra Zeneca) que vuelve no proliferativos los carcinomas androgenodependientes. Aún otro ejemplo de agente citostático es el antiestrógeno Tamoxifen®, que inhibe la proliferación o el crecimiento de cáncer de mama dependiente de estrógeno. Los inhibidores de la transducción de señales proliferativas celulares son agentes citostáticos. Los ejemplos representativos incluyen inhibidores del factor de crecimiento epidérmico, inhibidores de Her-2, inhibidores de cinasa MEK-1, inhibidores de cinasa MAPK, inhibidores de PI3, inhibidores de cinasa Src e inhibidores de PDGF. [0075] Pueden tratarse una variedad de cánceres incluyendo, pero sin limitación, los siguientes: carcinoma incluyendo de vejiga (incluyendo cáncer de vejiga acelerado y metastásico), mama, colon (incluyendo cáncer colorrectal), riñón, hígado, pulmón (incluyendo carcinomas de pulmón microcíticos y no microcíticos y adenocarcinoma pulmonar), ovario, próstata, testículos, tracto genitourinario, sistema linfático, recto, laringe, páncreas (incluyendo carcinoma pancreático exocrino), esófago, estómago, vesícula biliar, cuello del útero, tiroides y piel (incluyendo carcinoma de células escamosas), tumores hematopoyéticos de linaje linfoide incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkins, linfoma no de Hodgkins, tricoleucemia, linfoma histiocítico y linfoma de Burkitt, tumores hematopoyéticos de linaje mieloide incluyendo leucemias mielogenosas aguda y crónica, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide y leucemia promielocítica, tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas, tumores de origen mesenquimático incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscarcoma y osteosarcoma y otros tumores incluyendo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma.

b.

Tratamientos de los efectos secundarios debidos a tratamiento del cáncer [0076] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece daño del tejido normal atribuible al tratamiento de un cáncer con NF-κB constitutivamente activo, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que induce la actividad de NF-κB. El agente que induce la actividad de NF-κB puede administrarse en combinación con un tratamiento del cáncer descrito anteriormente.

c.

Modulación del envejecimiento celular [0077] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un procedimiento de

modulación del envejecimiento celular en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que induce la actividad de NF-κB. El agente que induce la actividad de NF-κB puede administrarse en combinación con otros tratamientos. [0078] El agente puede administrarse en cualquier momento anterior a la administración del otro tratamiento incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h o 1 h antes de la administración. El agente puede administrarse después de la administración del otro tratamiento incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h o 48 h después de la administración.

d.

Tratamiento del estrés [0079] Esta divulgación se refiere también a un procedimiento de tratamiento de un mamífero que padece daño del tejido normal atribuible a estrés, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que induce la actividad de NF-κB. El agente que induce la actividad de NF-κB puede administrarse en combinación con otros tratamientos. El estrés puede ser atribuible a cualquier fuente incluyendo, pero sin limitación, radiación, heridas, envenenamiento, infección y choque térmico. [0080] La composición que comprende un inductor de NF-κB puede administrarse en cualquier momento anterior a la exposición al estrés incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h o 1 h antes de la exposición. La composición que comprende un inductor de NF-κB puede administrarse en cualquier momento posterior a la exposición al estrés incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h o 48 h después de la exposición.

e.

Radiación [0081] Esta invención está relacionada con la protección de células de los efectos de la exposición a la radiación. La lesión y muerte de células normales por radiación ionizante es una combinación del daño inducido por la radiación directa en las células expuestas y una reacción celular programada genéticamente activa ante el estrés inducido por radiación que da como resultado la muerte suicida o apoptosis. La

apoptosis desempeña un papel clave en la pérdida celular masiva que aparece en varios órganos radiosensibles (concretamente, sistemas hematopoyéticos e inmunitario, epitelio del tracto digestivo, etc.), cuyo fallo determina la radiosensibilidad general del organismo. [0082] La exposición a radiación ionizante (RI) puede ser a corto o largo plazo, puede aplicarse como dosis única o múltiples al cuerpo entero o localmente. Por tanto, los accidentes nucleares o ataques militares pueden implicar la exposición a una dosis alta única de irradiación de cuerpo entero (a veces seguida de un envenenamiento a largo plazo con isótopos radiactivos). Lo mismo es cierto (con un control estricto de la dosis aplicada) para el tratamiento de pacientes para transplante de médula ósea cuando es necesario preparar los órganos hematopoyéticos para la médula ósea del donante “limpiándolos” de los precursores sanguíneos del hospedador. El tratamiento del cáncer puede implicar dosis múltiples de irradiación local que superarían en gran medida la dosis letal si se aplicaran como irradiación de cuerpo entero. El envenenamiento o tratamiento con isótopos radiactivos da como resultado una exposición local a largo plazo a radiación de los órganos diana (por ejemplo, la glándula tiroides en el caso de inhalación de 125I). Finalmente, hay muchas formas físicas de radiación ionizante que difieren significativamente en la gravedad de los efectos biológicos. [0083] En el nivel molecular y celular, las partículas de radiación son capaces de producir la rotura y entrecruzamiento de ADN, proteínas, membranas celulares y otras estructuras macromoleculares. La radiación ionizante induce también daño secundario a los componentes celulares, dando lugar a los radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS). Múltiples sistemas de reparación contrarrestan este daño, tales como varias rutas de reparación de ADN que restauran la integridad y fidelidad del ADN, y los productos químicos antioxidantes y enzimas que secuestran los radicales libres y ROS reducen las proteínas y lípidos oxidados. Los sistemas de punto de regulación celular detectan los defectos de ADN y retardan la progresión del ciclo celular hasta que se repara el daño o se alcanza la decisión de obligar a la célula a la detención del crecimiento o la muerte celular programada (apoptosis). [0084] La radiación puede causar daño al organismo de mamíferos en el intervalo de efectos mutagénicos y carcinogénicos moderados de dosis bajas a la muerte casi instantánea por dosis altas. La radiosensibilidad global del organismo está determinada por las alteraciones patológicas desarrolladas en varios tejidos sensibles que incluyen sistema hematopoyético, sistema reproductivo y diferentes epitelios con una alta tasa de recambio celular. [0085] El resultado patológico agudo de la irradiación gamma que conduce a la muerte es diferente para las diferentes dosis y se determina por el fallo de órganos de barrera que definen el umbral de sensibilidad del organismo a cada dosis particular. Por tanto, la mortalidad a dosis bajas se produce por aplasia de médula ósea, mientras que las dosis moderadas matan más rápidamente induciendo un síndrome gastrointestinal (GI). Las dosis muy altas de radiación pueden causar una muerte casi instantánea desencadenando la degeneración neuronal. [0086] Los organismos que sobreviven a un periodo de toxicidad aguda por radiación pueden padecer consecuencias remotas a largo plazo que incluyen carcinogénesis inducida por radiación y fibrosis que se desarrollan en los órganos expuestos (por ejemplo, riñón, hígado o pulmones) meses y años después de la irradiación. [0087] El ADN celular es la diana principal de la RI, que causa una variedad de tipos de daño de ADN (estrés genotóxico) mediante mecanismos directos e indirectos (basados en radicales libres). Todos los organismos mantienen un sistema de reparación de ADN capaz de una recuperación eficaz del ADN dañado por radiación, los errores en el proceso de reparación de ADN pueden conducir a mutaciones. [0088] Los tumores son generalmente más sensibles a la radiación gamma y pueden tratarse con dosis múltiples locales que causan un daño relativamente bajo al tejido normal. No obstante, en algunos casos, el daño de los tejidos normales es un factor limitante en la aplicación de radiación gamma para el tratamiento del cáncer. El uso de radiación gamma durante la terapia del cáncer mediante suministro convencional conformado tridimensionalmente, o incluso BeamCath más enfocado, tiene también toxicidades limitantes de la dosis causadas por el efecto acumulativo de la irradiación y la inducción de daño de las células madre de renovación rápida de tejidos normales, tales como médula ósea y tracto gastrointestinal (GI). [0089] A dosis altas, la mortalidad inducida por la radiación está asociada a los denominados síndromes de radiación hematopoyético y gastrointestinal. El síndrome hematopoyético se caracteriza por la pérdida de células hematopoyéticas y sus progenitoras, haciendo imposible regenerar la sangre y el sistema linfoide. La muerte ocurre normalmente como consecuencia de una infección (resultado de la inmunosupresión), hemorragia y/o anemia. El síndrome GI está causado por una muerte celular masiva en el epitelio intestinal, predominantemente en el intestino delgado, seguido de la desintegración de la pared celular y la muerte por bacteremia y sepsis. El síndrome hematopoyético prevalece habitualmente a las dosis bajas de radiación y conduce a una muerte más lenta que el síndrome GI. [0090] En el pasado, los radioprotectores eran típicamente antioxidantes, tanto sintéticos como naturales. Más recientemente, se han añadido citocinas y factores de crecimiento a la lista de radioprotectores; el mecanismo de su radioprotección se considera que es el resultado de facilitar el efecto sobre la regeneración de tejidos sensibles. No hay una clara distinción funcional entre ambos grupos de radioprotectores, sin embargo, puesto que las citocinas inducen la expresión de proteínas antioxidantes celulares, tales como superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD) y metalotioneína. [0091] La medida de la protección por un agente particular se expresa por el factor de modificación de la dosis (FMD). El FMD se determina irradiando el sujeto tratado con radioprotector y los sujetos de control no tratados con un intervalo de dosis de radiación, y comparando entonces la supervivencia o algún otro criterio de valoración. El FMD se calcula comúnmente para la supervivencia de 30 días (DL50/30 tratados con fármaco dividido entre DL50/30 tratados con vehículo) y cuantifica la protección del sistema hematopoyético. Para estimar la protección del sistema gastrointestinal, se calculan DL50 y FMD para la supervivencia de 6 o 7 días. Los valores de FMD proporcionados en la presente memoria son de 30 días a menos que se indique otra cosa. [0092] Los inductores de NF-κB poseen una fuerte actividad a favor de la supervivencia al nivel celular y sobre el organismo en conjunto. En respuesta a dosis superletales de radiación, los inductores de NF-κB inhiben ambos síndromes gastrointestinal y hematopoyético, que son las causas principales de muerte por exposición aguda a radiación. Como resultado de estas propiedades, los inductores de NF-κB pueden usarse para tratar los efectos de eventos de radiación naturales y accidentes nucleares. Además, puesto que los inductores de NF-κB actúan mediante un mecanismo diferente que todos los radioprotectores actualmente conocidos, pueden usarse en combinación con otros radioprotectores, aumentando drásticamente así la escala de protección por radiación ionizante. [0093] En contraposición con los agentes radioprotectores convencionales (por ejemplo, secuestrantes de radicales libres), los agentes antiapoptóticos pueden no reducir el daño mediado por la radiación primaria, pero pueden actuar contra eventos secundarios que implican una reacción celular activa sobre el daño primario, complementando por lo tanto las líneas de defensa existentes. La pifitrina α, un inhibidor farmacológico de p53 (un mediador clave de la respuesta a la radiación en células de mamífero), es un ejemplo de esta nueva clase de radioprotectores. Sin embargo, la actividad de los inhibidores de p53 está limitada a la protección del sistema hematopoyético y no tiene efecto protectivo sobre el tracto digestivo (síndrome gastrointestinal), reduciendo por lo tanto el valor terapéutico de estos compuestos. Se necesitan urgentemente productos farmacéuticos antiapoptóticos con un intervalo de actividad más amplio. [0094] Los inductores de NF-κB pueden usarse como agente radioprotector para extender el intervalo de dosis de radiación tolerable al aumentar la radiorresistencia del organismo humano más allá de los niveles alcanzables por las medidas actualmente disponibles (blindaje y aplicación de los agentes bioprotectores existentes) y aumenta drásticamente las oportunidades de supervivencia de la tripulación en el caso de accidentes nucleares a bordo o eventos de partículas solares a gran escala. Con un FMD (supervivencia a 30 días) mayor de 1,5, el inductor de NF-κB flagelina es más eficaz que cualquier compuesto natural notificado actualmente. [0095] Los inductores de NF-κB son también útiles para tratar la pérdida celular irremplazable causada por irradiación a dosis baja, por ejemplo, en el sistema nervioso central y órganos reproductivos. Los inductores de NF-κB pueden usarse también durante la quimioterapia del cáncer para tratar los efectos secundarios asociados a la quimioterapia, incluyendo alopecia. [0096] Un mamífero puede tratarse por exposición a la radiación mediante la administración al mamífero de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un inductor de NF-κB. La composición que comprende un inductor de NF-κB puede administrarse en combinación con uno o más radioprotectores. El uno o más radioprotectores pueden ser cualquier agente que trate los efectos de la exposición a la radiación incluyendo, pero sin limitación, antioxidantes, secuestrantes de radicales libres y citocinas. [0097] Los inductores de NF-κB pueden inhibir la muerte celular programada inducida por la radiación en respuesta al daño en el ADN y otras estructuras celulares; sin embargo, los inductores de NF-κB no pueden tratar el daño en la célula y no pueden prevenir mutaciones. Los radicales libres y especies de oxígeno reactivo (ROS) son la causa principal de mutaciones y otros daños intracelulares. Los antioxidantes y secuestrantes de radicales libres son eficaces para prevenir el daño por radicales libres. La combinación de un inductor de NF-κB y un antioxidante o secuestrante de radicales libres puede dar como resultado una lesión menos extensa, una mayor supervivencia y una salud mejorada para el mamífero expuesto a la radiación. Los antioxidantes y secuestrantes de radicales libres que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero sin limitación, tioles tales como cisteína, cisteamina, glutatión y bilirrubina, amifostina (WR-2721), vitamina A, vitamina C, vitamina E y flavonoides tales como albahaca morada (Ocimum sanctum), orientina y vicenina. [0098] Los inductores de NF-κB pueden administrarse también en combinación con una serie de citocinas y factores de crecimiento que confieren radioprotección al reponer y/o proteger las poblaciones de células madre radiosensibles. Puede conseguirse una radioprotección con efectos secundarios mínimos mediante el uso de factor de células madre (SCF, ligando de c-kit), ligando de Flt-3 y el fragmento IL-1brd de interleucina 1. Puede conseguirse protección mediante la inducción de la proliferación de células madre (todas las citocinas mencionadas) y la prevención de su apoptosis (SCF). El tratamiento permite la acumulación de leucocitos y sus precursores antes de la irradiación, posibilitando así una reconstitución más rápida del sistema inmunitario después de la irradiación. El SCF salva eficazmente a ratones irradiados mortalmente con FMD en el intervalo de 1,3-1,35 y es también eficaz contra el síndrome gastrointestinal. El ligando de Flt-3 proporciona también una fuerte protección en ratones (70-80% de supervivencia a 30 días a una DL100/30 equivalente a un FMD> 1,2) y conejos (15, 16). [0099] Varios factores, aunque no de naturaleza tipo citocina, estimulan la proliferación de inmunocitos y pueden usarse en combinación con inductores de NFκB. El 5-AED (5-androstenodiol) es un esteroide que estimula la expresión de citocinas y aumenta la resistencia a infecciones bacterianas y víricas. Una inyección subcutánea de 5-AED en ratones 24 h antes de la irradiación mejoró la supervivencia con FMD= 1,26. Pueden usarse también compuestos sintéticos, tales como tricloro(dioxoetilen-O,O’)-telurato de amonio (AS-101), para inducir la secreción de numerosas citocinas y para la combinación con inductores de NF-κB. [0100] Pueden usarse también factores de crecimiento y citocinas para proporcionar protección frente al síndrome gastrointestinal. El factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) promueve la proliferación y diferenciación en la mucosa intestinal, y aumenta la supervivencia celular después de la irradiación en las criptas intestinales. La citocina hematopoyética y el SCF radioprotector pueden aumentar también la supervivencia de células madre intestinales y la supervivencia a corto plazo asociada del organismo. [0101] Los inductores de NF-κB pueden ofrecer protección frente a ambos síndromes gastrointestinal (GI) y hematopoyético. Puesto que los ratones expuestos a 15 Gy de irradiación mortal de cuerpo entero morían en su mayoría por síndrome GI, una composición que comprende un inductor de NF-κB y uno o más inhibidores del síndrome GI puede ser más eficaz. Los inhibidores del síndrome GI que pueden usarse en la práctica incluyen, pero sin limitación, citocinas tales como SCF y KGF. [0102] La composición que comprende un inductor de NF-κB puede administrarse en cualquier momento anterior a la exposición a la radiación incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h o 1 h antes de la exposición. La composición que comprende un inductor de NF-κB puede administrarse en cualquier momento posterior a la exposición a la radiación incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h o 48 h después de la exposición a la radiación.

3. Agente [0103] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva un agente que induce la actividad de NF-κB. El agente puede ser un compuesto sintetizado artificialmente o un compuesto de origen natural. El agente puede ser un compuesto de bajo peso molecular, polipéptido o péptido, o un fragmento, análogo, homólogo, variante o derivado del mismo. [0104] El agente puede ser también una citocina inductora de NF-κB incluyendo, pero sin limitación, IL2, IL6, TNF y TGF-β. El agente puede ser también una prostaglandina. El agente puede ser también un factor de crecimiento incluyendo, pero sin limitación, KGF y PDGF. El agente puede ser también un anticuerpo que induce la actividad de NF-κB.

a. Flagelina [0105] El agente puede ser una flagelina, que puede proceder de una bacteria incluyendo, pero sin limitación, una especie de Salmonella tal como S. typhimurium. Como se muestra en los ejemplos siguientes, la flagelina posee una fuerte actividad a favor de la supervivencia al nivel celular y sobre el organismo en conjunto. [0106] Puede obtenerse un fragmento, variante, análogo, homólogo o derivado de un inductor de NF-κB, tal como flagelina, con propiedades beneficiosas mediante un diseño razonado basado en la estructura de dominios de la flagelina. La estructura de dominios de flagelina de Salmonella se describe en la bibliografía (Fig. 19). La flagelina tiene dominios conservados (D1 y D2) en el extremo N y el extremo C y un dominio hipervariable medio (D3) (Samatey, y col. 2001, Eaves-Pyles T, y col. 2001a). Los resultados con una proteína recombinante que contiene los D1 y D2 en amino y D1 y D2 en carboxilo separados por una bisagra de Escherichia coli (ND12/ECH/CD2) indican que D1 y D2 son bioactivos cuando se acoplan con un elemento ECH. Esta quimera, pero no la bisagra sola, inducía la degradación de IκBα, la activación de NF-κB y la producción de NO e IL-8 en dos líneas celulares epiteliales intestinales. El dominio D3 no conservado está en la superficie del filamento flagelar y contiene los epítopos antigénicos principales. La potente actividad proinflamatoria de la flagelina puede residir en las regiones D1 y D2 en N y C altamente conservadas.

b. Inductores parasitarios de NF-κB [0107] Las propiedades de la flagelina sugieren que pueden encontrarse moduladores adicionales de NF-κB en parásitos. Hay una serie de parásitos que dependen de la represión de la apoptosis puesto que no pueden sobrevivir sin las células del hospedador. Estos organismos pueden haberse adaptado para una persistencia eficaz en el organismo hospedador secretando factores antiapoptóticos. Como los tumores avanzados, estos organismos secretan factores que pueden ser capaces de aumentar su propia supervivencia y resolver su conflicto con el mecanismo defensivo de respuesta al estrés del hospedador. [0108] Los factores antiapoptóticos de organismos parasitarios o simbióticos han pasado por millones de años de adaptación para minimizar el daño al organismo hospedador que afectaría a la viabilidad. Como resultado, estos factores requieren pocas, o ninguna, modificación adicional y pueden usarse directamente como tal o con modificaciones mínimas. Los factores pueden ser útiles para tratar apoptosis mediada por estrés, tales como efectos secundarios asociados a la quimioterapia y radioterapia. [0109] Se describen en la presente memoria descriptiva procedimientos para cribar parásitos para identificar los moduladores de NF-κB. Los moduladores candidatos pueden proceder de parásitos de seres humanos o primates no humanos. Los parásitos son preferiblemente parásitos extracelulares del hospedador. Los parásitos pueden ser también simbiontes. Los parásitos de los que pueden aislarse moduladores incluyen, pero sin limitación, Mycoplasma, Chlamydia y Salmonella. Estos moduladores pueden identificarse usando los procedimientos de cribado descritos en la presente memoria, así como mediante enfoques de selección bioquímica y genética, ensayo in vitro, agentes protectores de la muerte celular e in vivo.

4. Composición [0110] Se da a conocer en la presente memoria descriptiva una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inductor de NF-κB. La composición puede ser una composición farmacéutica, que puede producirse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se ha descrito anteriormente, la composición que comprende un inductor de NF-κB puede administrarse a un mamífero para el tratamiento de afecciones asociadas a la apoptosis incluyendo, pero sin limitación, exposición a la radiación, efectos secundarios de tratamientos del cáncer, estrés y envejecimiento celular. La composición puede comprender también agentes adicionales incluyendo, pero sin limitación, un radioprotector o un fármaco quimioterapéutico.

a.

Administración [0111] Las composiciones para uso según esta invención pueden administrarse de cualquier manera incluyendo, pero sin limitación, por vía oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosa, tópica, por inhalación, por administración bucal o combinaciones de las mismas. La administración parenteral incluye, pero sin limitación, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal e intraarticular. Para uso veterinario, la composición puede administrarse en forma de una formulación adecuadamente aceptable según la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración que es más apropiada para un animal particular.

b.

Formulación [0112] Las composiciones para uso según esta invención pueden estar en forma de comprimidos o pastillas masticables formuladas de manera convencional. Por ejemplo, los comprimidos y cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales incluyendo, pero sin limitación, agentes aglutinantes, cargas, lubricantes, disgregantes y agentes humectantes. Los agentes aglutinantes incluyen, pero sin limitación, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucílago de almidón y polivinilpirrolidona. Las cargas incluyen, pero sin limitación, lactosa, azúcar, celulosa microcristalina, almidón de maíz, fosfato de calcio y sorbitol. Los lubricantes incluyen, pero sin limitación, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol y sílice. Los disgregantes incluyen, pero sin limitación, almidón de patata y glicolato sódico de almidón. Los agente humectantes incluyen, pero sin limitación, laurilsulfato de sodio. Los comprimidos pueden comprimirse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. [0113] Las composiciones para uso según esta invención pueden ser también formulaciones líquidas incluyendo, pero sin limitación, suspensiones, disoluciones,

emulsiones, jarabes y elixires acuosos u oleosos. Las composiciones pueden formularse también en forma de producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Los agentes de suspensión incluyen, pero sin limitación, jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, estearato de aluminio en gel y grasas hidrogenadas comestibles. Los agentes emulsionantes incluyen, pero sin limitación, lecitina, monooleato de sorbitán y goma arábiga. Los vehículos no acuosos incluyen, pero sin limitación, aceites comestibles, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilenglicol y alcohol etílico. Los conservantes incluyen, pero sin limitación, p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico. [0114] Las composiciones para uso según esta invención pueden formularse también como supositorios, que pueden contener bases de supositorio que incluyen, pero sin limitación, manteca de cacao o glicéridos. Las composiciones para uso según esta invención pueden formularse también para inhalación, que puede ser en una forma que incluye, pero sin limitación, una disolución, suspensión o emulsión que puede administrarse en forma de polvo seco o en forma de un aerosol usando un propelente, tal como diclorodifluorometano o triclorofluorometano. Las composiciones para uso según esta invención pueden formularse también en formulaciones transdérmicas que comprenden vehículos acuosos o no acuosos incluyendo, pero sin limitación, cremas, ungüentos, lociones, pastas, emplastos medicados, parches o membranas. [0115] Las composiciones para uso según esta invención pueden formularse también para administración parenteral incluyendo, pero sin limitación, mediante inyección o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden estar en forma de suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilización y dispersión. La composición puede proporcionarse también en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado incluyendo, pero sin limitación, agua estéril exenta de pirógenos. [0116] Las composiciones para uso según esta invención pueden formularse también en forma de una preparación de liberación prolongada, que puede administrarse mediante implante o inyección intramuscular. Las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (como una emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo), resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles (como sal escasamente soluble, por ejemplo).

c. Dosificación [0117] La cantidad terapéuticamente eficaz de agente necesaria para uso en terapia varía con la naturaleza de la afección que se esté tratando, la duración de tiempo que se desee la inducción de la actividad de NF-κB y la edad y estado del paciente, y está determinada en última instancia por el facultativo a cargo. Sin embargo, en general, las dosis empleadas para el tratamiento de seres humanos adultos están típicamente en el intervalo de 0,001 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg al día. La dosis puede ser de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 µg/kg al día. La dosis deseada puede administrarse convenientemente en una dosis única, o como dosis múltiples administradas a intervalos apropiados, por ejemplo a dos, tres, cuatro o más subdosis al día. A menudo se desean o requieren dosis múltiples, porque la actividad de NF-κB en células normales puede reducirse una vez deja de administrarse el agente. [0118] La dosificación de un inductor de NF-κB puede estar a cualquier dosificación incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 1 µg/kg, 25 µg/kg, 50 µg/kg, 75 µg/kg, 100 µg/kg, 125 µg/kg, 150 µg/kg, 175 µg/kg, 200 µg/kg, 225 µg/kg, 250 µg/kg, 275 µg/kg, 300 µg/kg, 325 µg/kg, 350 µg/kg, 375 µg/kg, 400 µg/kg, 425 µg/kg, 450 µg/kg, 475 µg/kg, 500 µg/kg, 525 µg/kg, 550 µg/kg, 575 µg/kg, 600 µg/kg, 625 µg/kg, 650 µg/kg, 675 µg/kg, 700 µg/kg, 725 µg/kg, 750 µg/kg, 775 µg/kg, 800 µg/kg, 825 µg/kg, 850 µg/kg, 875 µg/kg, 900 µg/kg, 925 µg/kg, 950 µg/kg, 975 µg/kg

o 1 mg/kg.

5. Procedimientos de cribado [0119] Se dan a conocer en la presente memoria descriptiva procedimientos de identificación de agentes que inducen la actividad de NF-κB. Puede identificarse un agente que induce la actividad de NF-κB mediante un procedimiento que comprende añadir un presunto inductor de actividad de NF-κB a un sistema de expresión activado por NF-κB y comparar el nivel de expresión activada por NF-κB con un control, con lo que se identifica un inductor de la actividad de NF-κB por su capacidad de aumentar el nivel del sistema de expresión activado por NF-κB. [0120] Los agentes candidatos pueden estar presentes en una colección (concretamente, una colección de compuestos). Dichos agentes pueden estar codificados, por ejemplo, por moléculas de ADN en una colección de expresión. El agente candidato está presente en medios acondicionados o en extractos celulares. Otros de dichos agentes incluyen compuestos conocidos en la técnica como “moléculas pequeñas”, que tienen pesos moleculares menores de 105 Da, preferiblemente menores de 104 Da y aún más preferiblemente menores de 103 Da. Dichos agentes candidatos pueden proporcionarse como miembros de una colección combinatoria que incluye agentes sintéticos (por ejemplo péptidos) preparados según reacciones químicas múltiples predeterminadas. Los expertos en la técnica apreciarán que se puede preparar una selección distinta de dichas colecciones según procedimientos establecidos, y que los miembros de una colección de agentes candidatos pueden cribarse simultánea o secuencialmente como se describe en la presente memoria. [0121] Los procedimientos de cribado pueden efectuarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos in vitro, basados en células e in vivo. Puede usarse cualquier célula en los ensayos basados en células. Preferiblemente, las células incluyen células de mamífero, más preferiblemente células de seres humanos y primates no humanos. El cribado basado en células puede efectuarse usando células tumorales modificadas genéticamente que expresan marcadores vicarios de la activación de NF-κB. Dichos marcadores incluyen, pero sin limitación, β-galactosidasa bacteriana, luciferasa y proteína fluorescente verde potenciada (EGFP). La cantidad de expresión del marcador vicario puede medirse usando técnicas estándar en la técnica incluyendo, pero sin limitación, colorimetría, luminometría y fluorometría. [0122] Las condiciones en que se añade un presunto modulador a una célula, tal como mediante mezclado, son condiciones en que la célula puede experimentar apoptosis o señalización si no están esencialmente presentes otros compuestos reguladores que interfieran con la apoptosis o señalización. Las condiciones eficaces incluyen, pero sin limitación, condiciones apropiadas de medio, temperatura, pH y oxígeno que permitan el crecimiento celular. Es un medio apropiado típicamente un medio sólido o líquido que comprende factores de crecimiento y fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, así como sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados tales como vitaminas, e incluye un medio eficaz en que la célula puede cultivarse de tal modo que la célula pueda exhibir apoptosis o señalización. Por ejemplo, para una célula de mamífero, el medio puede comprender medio Eagle modificado por Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal de ternero. [0123] Las células pueden cultivarse en una variedad de recipientes incluyendo, pero sin limitación, matraces de cultivo de tejido, tubos de ensayo, discos de microvaloración y placas Petri. El cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de dióxido de carbono apropiados para la célula. Dichas condiciones de cultivo están también dentro de las habilidades de la técnica. [0124] Los procedimientos para añadir un presunto modulador a la célula incluyen electroporación, microinyección, expresión celular (concretamente, uso de un sistema de expresión que incluye moléculas de ácido nucleico desnudas, virus recombinantes, vectores de expresión retrovíricos y expresión de adenovirus), el uso de agentes emparejadores de iones y el uso de detergentes para la permeabilización celular.

Ejemplo 1 La deficiencia de p53 aceleraba el desarrollo del síndrome GI en ratones [0125] La causa principal de muerte por radiación ionizante (RI) de mamíferos depende de la dosis de radiación. A dosis de hasta 9-10 Gy, los ratones mueren al cabo de 12-20 días, principalmente por el síndrome hematopoyético/de agotamiento mortal de la médula ósea (HP). A esta dosis, los ratones irradiados pueden salvarse de la muerte por transplante de médula ósea. Los animales que recibieron > 15 Gy, mueren entre 7-12 días después del tratamiento (antes de que el síndrome hematopoyético pueda matarlos) por complicaciones del daño al intestino delgado-síndrome gastrointestinal (GI) (Gudkov & Komarova 2003). En ambos casos de síndromes HP y GI, el daño mortal de tejidos se inicia con una apoptosis masiva dependiente de p53 (Potten 1992, Merritt 1994, Cui y col. 1995, Potten y col. 1994), observación que permitió sugerir anteriormente que la p53 podría ser un determinante de la muerte inducida por radiación. De forma coherente, los ratones deficientes en p53 son resistentes a dosis de radiación que matarían por el síndrome HP (Westphal y col. 1997, Komarov y col. 1999), y la mortalidad de los animales de tipo natural que reciben 6-11 Gy de radiación gamma puede reducirse por la inhibición farmacológica temporal de p53 por la molécula pequeña inhibidora de p53 pifitrina α (PFT) (Komarov y col 1999). La definición de p53 como un factor sensibilizante de tejidos ante el estrés genotóxico se reforzó adicionalmente al demostrarse la dependencia de p53 de la pérdida de cabello (alopecia) que ocurre como resultado de quimioterapia o radiación experimental (Botchkarev y col. 2000). Por tanto, basándose en observaciones previas, podría esperarse que p53 siguiera desempeñando un papel importante en el desarrollo del síndrome GI mortal después de dosis altas de RI. Sorprendentemente, la deficiencia en p53 sensibiliza a los ratones a dosis altas de RI, causando síndrome gastrointestinal mortal (Fig. 11). La proliferación celular continua en las criptas de epitelio deficiente en p53 después de RI se correlaciona con la muerte acelerada de las células dañadas de cripta y la destrucción rápida de las vellosidades. La p53 prolonga la supervivencia al inducir la detención del crecimiento en las criptas del intestino delgado, manteniendo así la integridad de los intestinos (Fig. 12). Por tanto, la función proapoptótica de p53 promueve el síndrome hematopoyético, mientras que su función de detención del crecimiento retarda el desarrollo del síndrome gastrointestinal. [0126] Se ha analizado con gran detalle la dinámica de la población celular en el intestino delgado. La proliferación celular en los epitelios intestinales está limitada a las criptas, donde están localizadas las células madre y progenitoras de proliferación temprana. Después de un par de divisiones celulares, los descendientes ya diferenciados de células madre de cripta se transfieren a las vellosidades para segregarse por la punta de la vellosidad. En el intestino delgado de ratón, todo el “viaje” de la célula (desde el compartimento proliferativo a la punta de la vellosidad) dura normalmente entre 3 y 5 días (Potten 1992, Potten y col. 1997, Booth y col. 2002, Somosy y col. 2002). Aunque la reacción del intestino delgado a la radiación gamma se ha examinado bien a nivel morfopatológico, sigue siendo incierto cuál es la causa exacta de mortalidad GI, incluyendo el evento primario. La muerte puede ocurrir como consecuencia directa del daño de células de cripta epitelial seguido de denudación de las vellosidades, que conduce al desequilibrio de fluidos y electrolitos, bacteremia y endotoxemia. Además de las respuestas de inflamación y estromal, las disfunciones endoteliales parecen ser factores importantes que contribuyen a la mortalidad (Potten y col. 1997, Somosy y col. 2002). En resumen, la supresión farmacológica de p53, que se ha revelado tan eficaz como procedimiento de protección del síndrome HP inducido por RI, es inútil (si no perjudicial) frente al síndrome GI. Por lo tanto, es necesario desarrollar enfoques alternativos para la radioprotección del epitelio del intestino delgado que se basen en otro mecanismo tal como, por ejemplo, la activación de NFκB y posterior inhibición de la muerte celular.

Ejemplo 2 La infección por Salmonella activa NF-κB [0127] La infección por Salmonella conduce a una potente activación de IKK y NF-κB y a la activación del programa genético proinflamatorio (Elewaut y col. 1999). Estudios previos sugieren que aproximadamente un 30-40% de las células epiteliales intestinales se infectan durante una infección típica por Salmonella en células epiteliales intestinales cultivadas (Valdivia y col. 1996). Se deseaba plantear la pregunta de cómo una infección bacteriana de aproximadamente un 30% de las células hospedadoras podía dar lugar a una actividad de unión a ADN de NF-κB equivalente a la activación de NF-κB en casi todas las células hospedadoras como hace el TNF-α. [0128] Para examinar este fenómeno con detalle, se infectaron células HT29 ficticiamente o se infectaron a una MOI de 50 durante 1 hora con S. typhimurium de tipo natural, que se había transformado con el plásmido pFM10.1 que codifica proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor ssaH de Salmonella y funciona solamente una vez la bacteria ha invadido la célula hospedadora (Valdivia y col. 1997). Se detectaron las células que se invadieron por Salmonella mediante microscopia de fluorescencia directa de la expresión de GFP. Se controló la localización de p65 (RelA) mediante inmunofluorescencia indirecta de anticuerpo anti-p65 de conejo detectado con anticuerpo de asno anti-conejo conjugado con FITC. Se usó DAPI para teñir los núcleos. [0129] Como puede observarse en la Fig. 1A, la expresión de GFP ocurre en aproximadamente 30 a 40% de las células. Se examinó a continuación la localización de la subunidad p65 (RelA) de NF-κB en células no tratadas (infectadas ficticiamente), infectadas por Salmonella o estimuladas con TNF-α (10 ng/ml). Se localizó la p65 (RelA) en el citoplasma de células no tratadas, mientras que se localizó la p65 (RelA) en el núcleo de células infectadas por Salmonella o en células tratadas con TNF-α (Fig. 1B). Estos resultados demuestran que la infección por Salmonella activa NF-κB virtualmente en todas las células aunque sólo se hayan infectado una minoría de ellas.

Ejemplo 3 La flagelina activa NF-κB [0130] Puesto que la infección por Salmonella de células epiteliales intestinales en cultivo conducía a una infección de solo aproximadamente un 30% pero a la activación de NF-κB en casi todas las células, se previó que la activación de NF-κB era la respuesta al reconocimiento por la célula hospedadora de componentes estructurales o productos bacterianos producidos por la bacteria y no al proceso de invasión. Se ha demostrado que la invasión misma no es necesaria para la activación del programa genético proinflamatorio como se había pensado previamente (16). Para investigar esta posibilidad, se usó caldo de cultivo de S. dublin esterilizado por filtración dejado sin tratar o hervido durante 20 minutos para infectar células epiteliales intestinales HT29 y se controló la actividad de unión a ADN de NF-κB mediante ensayos de desplazamiento por electromovilidad (EMSA) de extractos celulares completos (WCE) preparados 45 minutos después de la exposición (3, 40). Se observó una potente activación de NF-κB en respuesta al caldo en ambas condiciones, indicando que el factor activador era termoestable. [0131] Se trató posteriormente el caldo nativo concentrado esterilizado por filtración con DNasa, RNasa, proteinasa K o se fraccionaron en bruto por tamaño en filtros Centricon de 100 kDa. Se usaron entonces los caldos diversamente tratados para infectar células epiteliales intestinales HT29, se prepararon WCE después de 45 minutos y se analizó la actividad de unión a ADN de NF-κB por EMSA (Fig. 2A). La infección directa de células HT29 por S. typhimurium 1103 o la exposición a los caldos de cultivo (sobren.), como se indica, indujeron la actividad de unión a ADN de NF-κB, mientras que se encontró que el factor inductor de actividad era sensible a la digestión por proteasa y se retenía por un filtro de 100 kDa (Fig. 2A). Para determinar adicionalmente la identidad de la actividad inductora de NF-κB, se fraccionó el cultivo de caldo concentrado esterilizado por filtración mediante cromatografía de exclusión por tamaños en gel Superose 12 (Fig. 2B) y mediante cromatografía de intercambio aniónico (Fig. 2C). Se ensayó en alícuotas de fracciones de cromatografía su capacidad de activar NF-κB en células HT29 y se analizaron por EMSA. Como puede observarse a partir del gel teñido con azul de Coomasie (Fig. 2B, panel superior), la actividad de unión a ADN de NF-κB aumentada (Fig. 2B, panel inferior, bandas 4-6) correspondía a la abundancia aumentada de una proteína de aproximadamente 55 kDa. La cromatografía de intercambio aniónico en matriz POROS HQ y la elución de las proteínas unidas con un gradiente salino creciente como se indica (Fig. 2C) demostraron que la actividad inductora de unión a ADN de NF-κB correspondía a fracciones cromatográficas que contenían una abundancia aumentada de la proteína de 55 kDa (Fig. 2C panel superior, y datos no mostrados). Se concentraron las fracciones eluidas observadas en la Fig. 2C y se fraccionaron en geles preparativos de PAGESDS al 12% y se las cortaron bandas correspondientes a B1-B6 de los geles y se eluyeron las proteínas, se precipitaron, se volvieron a naturalizar y se usaron para estimular células HT29. Se ensayó en los extractos de células enteras de estas células la actividad inductora de unión a ADN de NF-κB por EMSA y solamente la banda 2 (B2) correspondiente a la proteína de 55 kDa (Fig. 2C panel inferior) era capaz de desencadenar la actividad de unión a ADN de NF-κB, mientras que el tampón desde el inicio o el final del gradiente salino no conseguía activar la actividad de unión a ADN de NF-κB. [0132] Se procesaron adicionalmente proteínas correspondientes a las bandas de proteína B1-B6 y las zonas de blanco del gel para procesamiento peptídico. La digestión con tripsina de la proteína correspondiente a B2 y el análisis por CL/EM con trampa iónica por electropulverización identificaron la secuencia aminoacídica de 21 péptidos. Se identificó inequívocamente a la flagelina (75% de cobertura por los 21 péptidos) como la proteína coherente con la inducción de la actividad de unión a ADN de NF-κB (Fig. 3).

Ejemplo 4 La flagelina es necesaria para activar NF-κB en células epiteliales intestinales [0133] Para determinar si la flagelina era de hecho el factor responsable de desencadenar la activación de NF-κB después de exposición de células epiteliales intestinales a infección bacteriana directa o a caldos de cultivo filtrados de Salmonella patógena, se prepararon bacterias infecciosas y se hirvieron y filtraron caldos de cultivo de DH5-α de E. coli no flagelada, cepa 2229 patógena de S. dublin, un mutante SopE-isogénico de S. dublin 2229, un mutante SopB-isogénico de S. dublin 2229, un mutante doble SopE-/SopB-(cepa SE1SB2) de S. dublin 2229, cepa 1103 de S. typhimurium y un mutante de inserción isogénico fliC Tn10 de S. typhimurium (cepa 86) y un mutante doble fliC-/fljB-isogénico de S. typhimurium 1103. SopE es una proteína codificada por bacteriófago de Salmonella patógeno que se inyecta en la célula hospedadora y actúa como factor de intercambio de las GTPasas de rho pequeña Rac1 y CdC42 iniciando las redistribuciones citoesqueléticas y la eventual activación de las rutas de MAPK, SAPK y NF-κB (7, 15), mientras que SopB es una proteína de Salmonella que funciona como fosfato de inositol fosfatasa y participa en redistribuciones citoesqueléticas y estimula la secreción de cloruro de la célula hospedadora (44). Se usaron bacterias y caldos de cultivo para infectar células epiteliales intestinales HT29, se prepararon extractos WCE después de 45 minutos y se analizó la actividad de unión a ADN de NF-κB por EMSA. Las cepas de Salmonella podían activar NF-κB, mientras que las cepas de Salmonella que no conseguían producir flagelina (mutantes fliC-y fliC-/fljB-como se indica) tampoco conseguían activar NF-κB (Fig. 4A y B). La DH5-α de E. coli que no está flagelada y no produce flagelina no consiguió activar NF-κB. Se observó también mediante numerosos experimentos que las infecciones directas por S. dublin activaban siempre NF-κB en mayor extensión que S. typhimurium, como se observa en la Fig. 4A, mientras que los caldos de cultivo de ambas especies activaban NF-κB casi igualmente bien (Fig. 4B). Se cree que esta diferencia es debida quizás a que S. dublin libera más flagelina en el medio de cultivo celular que S. typhimurium durante la infección, puesto que la purificación de flagelina de ambas S. dublin y S. typhimurium y la adición de cantidades equivalentes de flagelina purificada cromatográficamente dieron perfiles de activación de NF-κB similares. Ha de observarse la incapacidad total de los mutantes dobles del gen de flagelina para activar NF-κB en comparación con la activación muy minoritaria observada en el mutante de inserción único fliC::Tn10 de flagelina en fase I (cerca de los últimos bandas en las Fig. 4A y B) que probablemente es debida a la expresión extremadamente limitada de flagelina en fase II (de fljB), aunque las cepas de Salmonella usadas aquí son genéticamente incapaces o raramente pasan a las fases de producción de flagelina. Puesto que la flagelina parece necesaria para la activación de la ruta de NF-κB tras infección directa de células epiteliales intestinales, parecía posible que la flagelina pudiera ser también el determinante principal de otras rutas mitogénicas y de señalización activada por el estrés principales tras la infección por Salmonella patógena de células epiteliales intestinales: la infección directa por Salmonella de células epiteliales intestinales da como resultado la activación de JNK

(8) y también la activación de NF-κB a través de IKK (3).

Ejemplo 5 La flagelina desencadena la activación de la proteína cinasa activada por mitógeno, la proteína cinasa activada por estrés y las rutas de señalización de IKK [0134] Las células epiteliales intestinales actúan como centinelas en la invasión de superficies luminales y orquestan la atracción de células inmunitarias efectoras a la zona mediante la producción de genes de quimiocina como IL-8 y proteína 1 quimioatractora de macrófagos (MCP1), genes de citocinas proinflamatorias tales como TNF-α, IL-1 e IL-6 (1, 4-6). La expresión de estos genes depende principalmente de la acción de los factores de transcripción que se activan en respuesta a la transmisión de señales a través de las rutas de señalización de MAPK, SAPK e IKK. Puesto que NF-κB se considera un regulador/activador clave del programa génico proinflamatorio, se decidió examinar el efecto que tenían cepas mutantes de Salmonella no productoras de flagelina sobre la activación de las rutas de señalización de MAPK, SAPK e IKK, en comparación con la infección de células epiteliales intestinales con Salmonella de tipo natural o mediante exposición de las células epiteliales intestinales a flagelina purificada. La infección de células HT29 con S. typhimurium de tipo natural dio como resultado la activación de las MAPK ERK1 y 2, las SAPK p38 y JNK e IKK (Fig. 5), como se determina mediante el uso de anticuerpos fosfoespecíficos indicativos de activación en análisis de inmunotransferencia (IB) o ensayos de inmunocinasa específicos de anticuerpo (KA) para JNK e IKK usando sus sustratos respectivos GST-cJun 1-79 y GST-IκBα 1-54. De forma interesante, la estimulación de MAPK es de naturaleza transitoria, ya que la activación se reduce a partir de los 45 minutos, mientras que la actividad de p38, JNK e IKK aumenta con el tiempo durante 1 hora. Como se observa en la Fig. 4, el mutante doble fliC-/fljB-de Salmonella tampoco consiguió inducir actividad de IKK y NF-ΚB (Fig. 5 como se indica). Sorprendentemente, el mutante doble fliC-/fljB-de Salmonella no consiguió inducir las SAPK p38 y JNK y sólo brevemente activó MAPK (15 minutos). Este resultado es extraño, puesto que otras proteínas de Salmonella tales como SopE y SopE2 pueden activar las GTPasas pequeñas Rac y CdC42, y estas GTPasas de la familia rho se han ligado a la activación de JNK y p38 (7, 8, 14, 15), aunque parecen no funcionar en la cepa de flagelina menos. [0135] El mutante doble f]iC-/fljB-de Salmonella no consiguió invadir células HT29 en comparación con las cepas de Salmonella de tipo natural, como se determina mediante el ensayo de protección/invasión de gentamicina. El mutante doble fliC-/fljBde Salmonella exhibía una diferencia de cuatro órdenes de magnitud en su capacidad de invadir células HT29. Para demostrar adicionalmente este punto, se infectaron células HT29 con Salmonella de tipo natural o mutante doble fliC-/fljB-de Salmonella (cepa 134), y se transformaron ambas cepas con el plásmido pFM10.1 que codifica GFP bajo el control del promotor ssaH de Salmonella y sólo funciona una vez la bacteria ha invadido la célula hospedadora (10, 36). La Salmonella de tipo natural era claramente capaz de infectar células HT29 (GFP, Fig. 5B), mientras que las bacterias mutantes de flagelina no conseguían invadir células HT29 como se evidencia por la falta de expresión de GFP (Fig. 5B). Para determinar si la flagelina es suficiente o si se requieren otras proteínas producidas por bacterias para la invasión, se añadieron flagelina purificada o caldos de cultivo esterilizados por filtración o una combinación de ambos a células HT29, a las que se aplicó infección con el mutante doble fliC-/fljBde Salmonella y se ensayó la invasión. Las células epiteliales intestinales no fueron invadidas usando todas las combinaciones ensayadas de flagelina purificada y/o caldos de cultivo con la cepa mutante doble fliC-/fljB-2. No se cree que haya una conexión directa entre los genes de flagelina y la eficacia del sistema de secreción de tipo III para suministrar proteínas producidas por bacterias tales como SopE, SopE2 y SipA u otras proteínas Sip (7, 14, 15, 45, 46) que desempeñan papeles importantes en el inicio de la internalización bacteriana. Además, para evaluar la eficacia de la flagelina para estimular la localización nuclear de p65 (RelA) en células epiteliales intestinales, se aplicó infección a células HT29 con flagelina purificada y se examinó la localización de p65 (RelA) usando inmunofluorescencia directa, encontrándose la localización nuclear de p65 (RelA) en casi cada célula (Fig. 5B como se indica). [0136] La flagelina purificada (0,5 µg/ml) activaba potentemente NF-κB en células HT29 de forma similar a lo observado para el tratamiento con TNF (10ng/ml) de células HT29 de manera dependiente del tiempo (Fig. 6A) cuando se preparaban WCE a diversos tiempos como se indica después de la exposición y se ensayaba la actividad de unión a ADN de NF-κB en EMSA. El análisis de las rutas de señalización de MAPK, SAPK e IKK (Fig. 6B) en estos mismos extractos usando fosfoanticuerpos específicos de activación para controlar la activación de las cinasas MAPK y p38 o los ensayos de inmunoprecipitación de cinasa específica de anticuerpo para las actividades de JNK e IKK, demostró que la actividad de JNK e IKK aumentaba con el tiempo hasta 1 hora, mientras que la actividad de p38 y MAPK (ERK1 y 2) tenía un máximo a 30 minutos y empezaba a reducirse a niveles notablemente menores al cabo de una hora (Fig. 6B como se indica). El perfil de activación de las moléculas señalizadoras de MAPK, SAPK e IKK ERK1 y 2, p38, JNK e IKK en células epiteliales intestinales en respuesta a la exposición a flagelina purificada se parecía notablemente a la de las células epiteliales intestinales infectadas con Salmonella de tipo natural (Fig. 5A). A partir de estas observaciones, se concluyó que la activación temporal de las rutas de señalización examinadas aquí (MAPK, SAPK e IKK), que reflejan eventos tempranos en la infección por Salmonella, está determinada casi exclusivamente por el reconocimiento y respuesta de células epiteliales intestinales a la flagelina. [0137] Se deseaba examinar adicionalmente el efecto de flagelina purificada y flagelina presente en Salmonella sobre el patrón temporal de expresión génica de citocinas proinflamatorias en células epiteliales intestinales para diferenciar los efectos de la infección por flagelina sola frente a Salmonella flagelada o Salmonella no flagelada. Se dejaron células HT29 sin tratar, se estimularon con TNF-α (10 ng/ml) o se estimularon con flagelina (0,5 µg/ml), o se infectaron con Salmonella typhimurium de tipo natural o el mutante doble fliC-/fljB-de Salmonella (a una MOI de 50). Después de los tiempos indicados tras el tratamiento o la infección, se recogieron las células HT29 en PBS enfriado con hielo y se lisaron los sedimentos celulares en trizol, se purificó el ARN y se usó para preparar la primera cadena de ADNc (véanse los Procedimientos Experimentales). Se usaron alícuotas de ADNc en reacciones de PCRFI semicuantitativas usando cebadores específicos de genes de IL-1α, IL-1β, IL-8, TNFα, MCP1 y β-actina (secuencias disponibles a demanda) y se fraccionaron los productos en geles de agarosa que contenían un 1,2% de bromuro de etidio. La expresión de los genes diana de NF-κB conocidos, IL-1β, IL-8, TNF-α y MCP1, aumentó en respuesta a la exposición a TNF-α o flagelina purificada (Fig. 6C). La infección por Salmonella de tipo natural condujo también a la activación de estos mismos genes, aunque la expresión de TNF-α y MCP era transitoria en comparación y ocurría inmediatamente después de la infección. El mutante doble fliC-/fljB-de Salmonella no conseguía inducir la expresión de IL-1β, IL-8 y TNF-α, sin embargo, se indujo la expresión de MCP1, aunque a menores niveles que los inducidos por Salmonella de tipo natural, y la expresión de MCP1 no era tampoco de naturaleza transitoria sino que continuaba a lo largo del tiempo (9 h) (Fig. 6C). El nivel de expresión de β-actina servía como patrón interno para comparación. De forma interesante, la IL-1α, que no es un gen diana de NF-κB, se estimulaba en respuesta a la aplicación de infección a células HT29 por todos los tratamientos. Obviamente, el doble mutante fliC-/fljB-de Salmonella puede activar otras rutas de señalización desconocidas que conduzcan a la expresión de IL-1α.

Ejemplo 6 La flagelina activa la unión a ADN de NF-κB de manera dependiente de MyD88 [0138] Puesto que la flagelina era capaz de activar las rutas de señalización necesarias coherentemente con la activación génica proinflamatoria y esta actividad recordaba la acción de una citocina como TNF-α, que activa todas las células en las que está presente un receptor de superficie funcional para ella (véase la localización nuclear de p65 [RelA] en las Fig. 1 y Fig. 5C), se decidió examinar el potencial de los receptores de tipo Toll, conocidos receptores de reconocimiento de patrón patógeno, para activar la ruta de NF-κB en respuesta a la exposición a flagelina. Para ensayar esta hipótesis, se examinó el efecto que tenía un adenovirus que expresa MyD88 (aa 152296) (47) negativo dominante sobre la activación de NF-κB mediada por flagelina en células HT29. La MyD88 es una proteína adaptadora usada por el receptor de IL-1 y todos los TLR conocidos, que comparte homología con IL-1 a través de su dominio de señalización citoplasmático y es necesaria para la activación inmediata de la ruta de NF-κB (48, 49). La expresión de DN-MyD88 en células HT29 bloqueaba la activación de la actividad de unión a ADN de NF-κB ensayada por análisis EMSA en respuesta a la exposición a IL-1 o flagelina, coherentemente con la acción de una activación de NF-κB mediada por TLR. Para examinar adicionalmente esta posibilidad, se usaron inicialmente MEF de tipo natural, MyD88-/-y TLR2-1-/TLR4-/-(un obsequio de S. Akira, Univ. de Osaka, JA) para verificar el papel de MyD88 y para examinar el papel potencial de dos de los TLR para responder a flagelina o para dirigir la infección por Salmonella de tipo natural y conducir a la activación de NF-κB (Fig. 7). La infección por Salmonella de tipo natural activa potentemente NF-κB en MEF tanto de tipo natural como deficiente en TLR (bandas 2 y 15), pero esta activación es algo defectiva en los MEF deficientes en MyD88 (carril 10). La aplicación de infección a los tres tipos de células con caldos de cultivo de S. dublin de tipo natural esterilizados por filtración y concentrados o del mutante doble isogénico SopE-/SopB-de la cepa SE1SB2 de S. dublin activaba NF-κB en MEF de tipo natural y células deficientes dobles en TLR2/4, pero no conseguía activar NF-κB en células deficientes en MyD88 (comparar los bandas 11 y 12 con los bandas 3, 4, 6, 7, 16 y 17). Se activó potentemente NF-κB en MEF de tipo natural mediante exposición a flagelina purificada (0,5 µg/ml) y por lo tanto se eliminaba la posibilidad de que el LPS desempeñara un papel en la activación de NF-κB en estos experimentos. La exclusión del LPS como contribuyente principal a la activación de NF-κB está proporcionada también por la potente activación de MEF deficientes dobles en TLR2/4 (bandas 16 y 17). Los TLR 2 y 4 responden a los lipopéptidos bacterianos, peptidoglicanos, ciertos LPS y LPS gramnegativos, respectivamente (50-52). La estimulación de IL-1 verificaba el requisito funcional de MyD88 en la transmisión de señales mediadas por IL-1 y flagelina. [0139] Para definir adicionalmente el posible papel de los TLR en el reconocimiento de flagelina, se ensayó la capacidad de TLR expresados en exceso para activar NF-κB en células que normalmente responden mal a la exposición a flagelina. Elegir células que responden ligeramente a flagelina purificada aseguraba que los componentes de señalización y adaptadores que usa la flagelina estuvieran presentes y funcionales y que el factor limitante fuera probablemente solo el receptor que responde a la flagelina. Se encontró que las células HeLa y células HEK293T activaban la actividad de unión a ADN de NF-κB en respuesta a la estimulación con IL-1, pero poco ante la exposición a flagelina, y se eligieron las células HEK293T para uso adicional debido a su mayor eficacia de transfección. Se expresaron por exceso los TLR 1-9 marcados con epítopo FLAG aminoterminal (amables obsequios de R. Medzhitov, Yale Univ. y R. Ulevitch, TSRI) (42, 43) en células HEK 293T en transfecciones transitorias junto con el gen informador de luciferasa activado por el promotor dependiente de 2x-NF-κB y se determinó la expresión de luciferasa en respuesta a ningún tratamiento, flagelina (0,5 µg/ml) o TNF-α (10 ng/ml). El TLR5 fue el único TLR cuya expresión daba como resultado una respuesta mensurable ante la exposición a flagelina de las células (Tabla 1). [0140] Para determinar adicionalmente la probabilidad de que TLR5 fuera el TLR a través del cual la flagelina activaba NF-κB, se construyeron mutaciones de señalización negativa dominante mediante delección de la porción carboxilo de cada TLR hasta un triptófano conservado en el dominio TIR. Una mutación similar en el receptor de IL-1 anula su capacidad de conducir a la activación de NF-κB (54, 55). Se clonó cada DN-TLR junto con un TLR5 clonado inverso (AS-TLR5) en el vector de expresión mamífero pCDNA3.1 (Invitrogen). Todas las proteínas mutantes se expresaban bien. Se transfectó cada vector de expresión mamífero con DN-TLR y vector de expresión vacío junto con 2x NF-κB Luc como se ha descrito anteriormente

(3) en células HT29 que responden muy bien a la flagelina. Se dejaron las células transfectadas sin tratar, se estimularon con TNF-α (10 ng/ml) o con flagelina purificada (0,5 µg/ml). Se observó que la expresión del gen informador no estaba afectada por la expresión de DN-TLR en respuesta a la estimulación por TNF-α de células transfectadas (Fig. 8A); sin embargo, solamente la expresión de DN-TLR5 o de un constructo de TLR5 de sentido contrario dio como resultado una inhibición de casi un 50% y un 25% de la activación del gen informador mediado por flagelina respectivamente (Fig. 8B), mientras que se encontró también que DN-TLR2 inhibía moderadamente la expresión del informador mediado por flagelina. Estos resultados implican que TLR5 interviene en el reconocimiento de superficie celular de la flagelina e inicia la ruta de señalización que conduce a la activación de NF-κB. El efecto de DN-TLR2 sobre la activación del gen informador dependiente de NF-κB puede ser no específico, puesto que su expresión inhibía también la activación del informador mediado por TNF-α en comparación con los otros DN-TLR. El DN-TLR2 puede competir también por una proteína adaptadora desconocida que podrían compartir ambos TLR2 y TLR5. En cualquier caso, se mostró por los resultados presentados en la Fig. 7 que TLR2 y TLR4

o eran necesarios para la activación de NF-κB mediada por flagelina.

Ejemplo 7 La activación de NF-κB mediada por flagelina conduce a una expresión aumentada de un subconjunto de TLR [0141] La estimulación de células epiteliales intestinales con S. typhimurium o con flagelina purificada conducía a la activación del programa génico proinflamatorio (Fig. 6C). Se deseó examinar si la expresión de genes de TLR se alteraría o no también en células estimuladas con flagelina. Se trataron células HT29 con flagelina purificada (0,5 µg/ml) y se aisló el ARN total a partir de células no tratadas y tratadas 3 horas después de la estimulación, y se usaron para preparar la primera cadena de ADNc. Se usó PCR-FI semicuantitativa que usaba cebadores específicos de gen para cada uno de los TLR y primera cadena de ADNc preparada a partir de células no estimuladas o estimuladas con flagelina para generar productos de ADN, que se fraccionaron en geles de agarosa que contenían bromuro de etidio a un 1,2%. La expresión de TLR 2, 3 y 7 aumentaba después de la estimulación con flagelina (Fig. 9). El patrón de expresión de los demás TLR permanecía sin cambios y la expresión de β-actina servía como control de abundancia interno. [0142] El TLR5 se expresa en células que no responden bien a la flagelina. Este estudio y otros (22, 23) han identificado TLR5 como el TLR probable a través del cual la flagelina activa NF-κB. Informes anteriores no determinaron la presencia o abundancia de TLR5 en las células que se usaron para evaluar su función (22, 33). Se deseó determinar si la abundancia de proteína TLR5 estaba ausente o se reducía en gran medida en células que no conseguían responder o respondían mal a la aplicación de infección por flagelina. Se examinó la abundancia de TLR5 en una serie de líneas celulares mediante análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo específico de TLR5 y se comparó con la capacidad de la flagelina purificada de inducir la actividad de unión a ADN de NF-κB de WCE preparados a partir de ellas. Se usaron las líneas celulares epiteliales intestinales T84 y HT29 así como la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549, la línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino humano HeLa, la línea celular de riñón embriónico humano que expresa el antígeno T grande HEK293T y la línea celular de glioblastoma T98G. Se detectó la proteína TLR5 en todas las líneas celulares examinadas por inmunotransferencia con anticuerpo específico de TLR5 (Fig. 10A). Las células T84 exhibían la mayor abundancia, mientras que los niveles de expresión de las otras líneas celulares eran similares y no parecían diferir en más de dos veces (Fig. 10A). Se analizó la actividad de unión a ADN de NF-κB en células no estimuladas, estimuladas con TNF-α y con flagelina mediante ensayos EMSA de WCE preparados a partir de cada tipo celular (Fig. 10B). Las células HT29 y A549 respondieron fuertemente a la estimulación con flagelina y TNF-α, mientras que las células HeLa, 293T y T98C respondieron mal (HeLa, 293T) o nada en absoluto (T98G) a la estimulación con flagelina. Se determinó la autenticidad del complejo de unión a ADN de NF-κB usando anticuerpo específico de p65 para superdesplazamiento del complejo de ADN de NF-κB:proteína. Es interesante que algunas células que expresan TLR5 no respondan en absoluto o lo hagan muy mal. Esto puede ser debido a la falta de presencia del receptor en la membrana plasmática y a la localización intracelular, a mutaciones inactivantes o perjudiciales en el gen de TLR5 en estas líneas celulares o a la falta o baja abundancia de un correceptor o proteína adaptadora necesario (como es el caso en algunas células para TLR4 y su correceptor/adaptador MD2 (30, 56, 57)). La IL-1 puede activar la actividad de unión a ADN de NF-κB en todas las líneas celulares examinadas, de modo que parece que el aparato de señalización de NF-κB aguas abajo de MyD88 está intacto.

Ejemplo 8 Aislamiento de flagelina recombinante [0143] Para confirmar que la flagelina recombinante era capaz de inducir NF-κB, se ensayó la actividad usando células informadoras que portan luciferasa sensible a NF-κB (luc). La construcción informadora contiene tres sitios de unión a NF-κB del promotor de E-selectina combinados con el promotor mínimo de Hsp70 y se usa rutinariamente para la detección de NF-κB. Se midió la actividad de luciferasa en lisados celulares 6 horas después de la adición de flagelina al medio. Se usó TNF-α como control positivo. Se muestran en la Fig. 13 los resultados de un experimento representativo e indican que la flagelina recombinante es capaz de activación de NFκB.

Ejemplo 9 La flagelina retarda la muerte de ratones causada por el síndrome GI inducido por RI [0144] Como se indica anteriormente, la flagelina es un potente activador de NFκB y presuntamente puede actuar como inhibidor de la muerte apoptótica. Puesto que las citocinas capaces de inducir NF-κB actúan como radioprotectores, se ensayó si la flagelina podría servir también como radioprotector. [0145] La irradiación de cuerpo entero de ratones con 15 Gy de radiación gamma conduce a la muerte al cabo de 8 días por síndrome GI, proporcionando un modelo convencional de daño del tracto GI inducido por radiación (véase anteriormente). Para ensayar si la flagelina es capaz de proteger al epitelio GI de la RI, se ensayó el efecto de flagelina inyectada por vía i.v. sobre la dinámica de la mortalidad de ratones después de 15 Gy de radiación. Se usó un intervalo de dosis de flagelina, todas las cuales eran significativamente menores que la dosis mayor tolerable conocida por la bibliografía (300 µg/ratón, Eaves-Pyles T, y col. 2001b). Se realizó la irradiación 4 horas después del tratamiento. Se muestran en la Fig. 14 los resultados de un experimento representativo. Como se esperaba, los ratones irradiados de control (que recibieron PBS por vía i.v.) murieron entre 5 y 8 días después del tratamiento, mientras que los animales que recibieron flagelina vivieron significativamente más tiempo; la extensión de la supervivencia animal se correlacionaba con la dosis de flagelina. El análisis morfopatológico del intestino delgado el día 7 después de la irradiación revela una drástica diferencia entre los grupos tratados con flagelina y de control (Fig. 15). El suministro intravenoso, intraperitoneal y subcutáneo de 0,2 mg/kg de flagelina seguido de 13 Gy de irradiación proporcionó un grado similar de protección, conduciendo a un 85-90% de supervivencia a 30 días de los ratones (datos no mostrados). Los experimentos se efectuaron esencialmente como se ha descrito anteriormente para experimentos de dosificación óptima, pero con 13 Gy de irradiación y diversas rutas de suministro.

Ejemplo 10 La flagelina salva a ratones del síndrome hematopoyético inducido por RI letal [0146] A continuación, se ensayó si la flagelina tiene efecto sobre la muerte inducida por RI por síndrome HP en ratones que se induce experimentalmente por dosis bajas de radiación (habitualmente de hasta 11 Gy) que no pueden causar toxicidad GI mortal. Se realizaron los experimentos de forma similar a los anteriormente descritos (Fig. 14 y 15), sin embargo, en lugar de 15 Gy, los ratones recibieron 10 Gy, la dosis que causaba un 100% de muertes en el grupo de control para el día 13 (Fig. 16). El grupo tratado con flagelina (5 µg/ratón) mostraba una protección completa frente a RI por esta dosis, indicando que la radioprotección mediada por flagelina actúa no sólo contra el síndrome GI sino también el HP inducidos por RI.

Ejemplo 11 Dependencia del tiempo sobre el efecto protector de la flagelina [0147] Para estimar la dependencia de la actividad radioprotectora de la flagelina del tiempo de tratamiento, se inyectaron ratones en diferentes momentos antes de la irradiación gamma con 13 Gy . Se muestran en la Fig. 17 los resultados de uno de dichos experimentos. Los resultados obtenidos muestran que la flagelina es eficaz como radioprotector de 13 Gy si se inyecta 1-4 h antes del tratamiento, pero deja de ser eficaz si se inyecta 24 h antes de la irradiación. [0148] Para estimar la dependencia de la actividad radioprotectora de la flagelina del tiempo de tratamiento, se inyectaron ratones en varios momentos temporales respecto al momento de irradiación gamma. Se realizaron los experimentos esencialmente como se ha explicado anteriormente, usando una inyección intraperitoneal de 5 µg/ratón (0,2 mg/kg) de CBLB-501 o, para ratones de control, 5 µg/ratón (0,2 mg/kg) de ARN polimerasa bacteriana. Se efectuaron los experimentos en la cepa de ratón NIH-Swiss. Los resultados muestran que la flagelina proporciona ~90% de supervivencia después de 13 Gy de irradiación si se inyecta 1 o 2 horas antes del tratamiento (Fig. 17). Se muestra solamente el gráfico de -1 h por claridad, sin embargo, ambos momentos temporales (-1 y -2 h) proporcionan grados y dinámicas similares de supervivencia. El momento temporal a 4 h muestra una protección algo menor. La flagelina inyectada 24 horas antes de la irradiación no tenía efecto protector frente a la muerte inducida por 13 Gy. [0149] De forma interesante, la administración de flagelina 24 horas antes de irradiación gamma de 10 Gy proporcionaba un 100% de protección. Aunque la irradiación con 13 Gy en ratones induce principalmente la muerte por síndrome GI, la muerte inducida por 10 Gy está mediada mayoritariamente por el síndrome hematopoyético. En consecuencia, dicha protección a largo plazo por irradiación de 10 Gy puede estar mediada por una proliferación o supervivencia potenciada de células madre hematopoyéticas inducida por flagelina y/o citocinas secundarias de larga vida.

Ejemplo 12 Determinación de DL50/30, DL50/7 y FMD para flagelina [0150] Se obtuvo una estimación de la protección dependiente de la dosis de radiación para la flagelina. Como se muestra anteriormente (Fig. 17), el tratamiento con flagelina era suficiente para un 100% de protección frente a 10 Gy de irradiación gamma (esta dosis causa la muerte por síndrome hematopoyético) y un 90% de supervivencia a 30 días a 13 Gy (ambos síndromes hematopoyético y GI). Se efectuaron experimentos como se describe anteriormente, usando flagelina 5 µg/ratón (0,2 mg/kg), inyectada por vía intraperitoneal 1 h antes de la irradiación. [0151] A 15 Gy, sin embargo, un 100% de supervivencia a 7 días estaba seguida por muerte retardada después de 13 días (0% de supervivencia a 30 días), mientras que el grupo de control había sucumbido totalmente al síndrome GI para el día 7 (Fig. 18). La cinética de la mortalidad del grupo tratado con CBLB-501 después de 15 Gy de irradiación recuerda a la del grupo de control a 10 Gy, sugiriendo una muerte causada por síndrome hematopoyético. Los resultados proporcionan una estimación de la DL50/30 de flagelina de aproximadamente 13,5-14 Gy y un FMD30 de aproximadamente 1,75-1,8. Este grado de radioprotección es significativamente mayor que cualquiera notificado para un compuesto natural.

imagen1

Tabla I

El TLR5 responde a la flagelina y activa NF-κB Se transfectaron células 293T con vector vacío (pCDNA3.1) o los alelos de TLR de tipo natural enumerados individuales en discos de 6 pocillos por triplicado. Las células se dejaron sin tratar (sin estim.), se trataron con TNF-α (10 ng/ml) o flagelina (1 µg/ml). Se ajustó la actividad informadora de NF-κB normalizando la expresión para controlar la actividad de luciferasa de Renilla y se calculó la inducción en veces como la actividad del gen informador en células tratadas/actividad del gen informador en células no estimuladas. ND es no determinado

No estim.

TNF FliC

Vector

1 13,5 4,9

TLR1

1,7 ND 5,1

TLR2

1,6 ND 5,3

TLR3

1,5 ND 5,0

TLR4

1,8 ND 5,4

TLR5

1,6 ND 9,2*

TLR7

1,5 ND 5,2

TLR8

1,4 ND 5,0

TLR9

1,5 ND 5,1

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el 5 máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción 10 • US 4554101 A [0063] Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

•

Seed T. et al. J. Radiation Research, December 2002, vol. 43, 5239-5244 [0003] 15 • Kyte et al. J. Mol. Biol., 1982, vol. 157, 105-132 [0063]

•

Service. Science, 1996, vol. 274, 2009 [0070]

•

Bulinski. J. Cell Sci., 1997, vol. 110, 3055-3064 [0070]

•

Panda. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 10560-10564 [0070]

•

Muhlradt. Cancer Res., 1997, vol. 57, 3344-3346 [0070] 20 • Nicolaou. Nature, 1997, vol. 387, 268-272 [0070]

•

Vasquez. Mol. Biol. Cell, 1997, vol. 8, 973-985 [0070]

•

Panda. J. Biol. Chem, 1996, vol. 271, 29807-29812 [0070]

Claims (13)

1.

Una composición que comprende flagelina para uso en un procedimiento de protección a un mamífero de los efectos de la radiación.

2.

Uso de una composición que comprende flagelina en la fabricación de un medicamento para proteger a un mamífero de los efectos de la radiación.

3.

La composición para uso según la reivindicación 1 o el uso según la reivindicación 2, en los que la composición o medicamento es para administración en combinación con un radioprotector

4.

La composición para uso o el uso según la reivindicación 3, en los que el radioprotector es un antioxidante.

5.

La composición para uso o el uso según la reivindicación 4, en los que el antioxidante se selecciona del grupo constituido por amifostina y vitamina E.

6.

La composición para uso o el uso según la reivindicación 3, en los que el radioprotector es una citocina.

7.

La composición para uso o el uso según la reivindicación 6, en los que la citocina es un factor de células madre.

8.

La composición para uso según la reivindicación 1 o el uso según la reivindicación 2, en los que la composición o el medicamento es para administración en combinación con un factor de crecimiento.

9.

La composición para uso o el uso según la reivindicación 8, en los que el factor de crecimiento es factor de crecimiento de queratinocitos.

10.

La composición para uso según la reivindicación 1 o el uso según la reivindicación 2, en los que la composición o el medicamento es para administración en combinación con 5-androstenodiol.

11.

La composición para uso según la reivindicación 1 o el uso según la

reivindicación 2, en los que la composición o el medicamento es para administración en combinación con tricloro(dioxoetilen-O’O-)telurato de amonio.

12.

La composición para uso o el uso según una cualquiera de las

5 reivindicaciones precedentes, en los que la composición o el medicamento es para administración antes de, junto con o después del tratamiento con radiación.

13. La composición para uso o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que el mamífero es un ser humano.

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