ES2303630T3 - Sensibilizacion de celulas para apoptosis por bloqueo selectivo de citoquinas. - Google Patents

Sensibilizacion de celulas para apoptosis por bloqueo selectivo de citoquinas. Download PDF

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Abstract

Uso de un antagonista de IL-4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de tiroides, en combinación con al menos un compuesto activo en el cual el medicamento comprende adicionalmente un antagonista de IL-10, en donde ambos antagonistas son anticuerpos en donde el compuesto activo se selecciona de agentes citostáticos, agonistas de receptores de muerte y reguladores negativos de proteínas antiapoptóticas.

Description

Sensibilización de células para apoptosis por bloqueo selectivo de citoquinas.
La presente invención se refiere a combinaciones de anticuerpos de IL-4 e IL-10 junto con un agente activo, IL-4 e IL-10 para el tratamiento del cáncer de tiroides.
Los mecanismos moleculares que controlan el equilibrio entre la supervivencia de las células y la muerte celular juegan un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos. La maquinaria de la denominada "apoptosis" o "muerte celular programada" es crucial para la capacidad celular de inducir la muerte de células excedentarias, mal ubicadas o deterioradas con alta especificidad y eficiencia.
Las enfermedades y afecciones en las cuales ha sido implicada la apoptosis están comprendidas en dos categorías, aquéllas en las cuales existe una supervivencia celular incrementada (es decir, la apoptosis está reducida) y aquéllas en las cuales hay un exceso de muerte celular (es decir, está incrementada la apoptosis). Enfermedades en las cuales existe una acumulación excesiva de células debido a supervivencia celular incrementada incluyen cáncer, trastornos autoinmunes e infecciones virales. Para estas y otras afecciones en las cuales se cree que está implicada una apoptosis insuficiente, es deseable la promoción de la apoptosis. Esto puede lograrse por ejemplo, promoviendo la apoptosis celular o aumentando la sensibilidad de las células a estímulos apoptóticos endógenos o exógenos, por ejemplo, moléculas u otras citoquinas de señalización celular, fármacos citotóxicos o radiación. La promoción de o la sensibilización a la apoptosis se cree que tiene relevancia clínica en la sensibilización de las células del cáncer a los fármacos quimioterapéuticos o la radiación.
Actualmente, un tratamiento principal para los tumores cancerosos es la extirpación quirúrgica de las áreas afectadas del tejido, órgano, o glándula. Sin embargo, las elevadas tasas de recurrencia son un obstáculo fundamental para la erradicación completa de las células cancerosas. Se cree que, aunque las células del cáncer en los tumores malignos pueden eliminarse quirúrgicamente, las células cancerosas que han invadido el tejido circundante o los ganglios linfáticos causan frecuentemente la recurrencia del tumor. Una razón para la recurrencia frecuente de los tumores puede ser que, durante el desarrollo del cáncer primario, es extremadamente difícil la extirpación completa de la totalidad de las células cancerosas por procedimientos quirúrgicos. Aunque la irradiación, la quimioterapia y la terapia hormonal apropiada inducen todas ellas la apoptosis de las células tumorales en cierto grado, pueden requerirse dosis mayores de los fármacos o la radiación para suprimir el crecimiento de las células cancerosas, lo cual, a su vez, puede causar efectos secundarios graves en los pacientes.
Así pues, el problema subyacente en la presente invención concierne a la identificación de compuestos que modulen específicamente los distintos pasos en el camino de la apoptosis sin causar los efectos secundarios deletéreos descritos.
La curación eficaz de los pacientes que padecen cáncer es difícil en muchos casos dado que muchas células tumorales han desarrollado resistencia a los fármacos anti-cáncer utilizados para la quimioterapia. El fenotipo descrito implica una diversidad de estrategias que utilizan las células tumorales para evadirse de los efectos citostáticos de los fármacos anti-cáncer. Los mecanismos para la resistencia a los fármacos incluyen modificaciones en la destoxificación y caminos de reparación del DNA, cambios en los sitios celulares de secuestración de fármacos, disminuciones en la afinidad fármaco-diana, síntesis de inhibidores específicos de los fármacos en el interior de las células, y eliminación o secreción acelerada de fármacos. Adicionalmente, las células cancerosas fallan comúnmente en lo que se refiere a sufrir apoptosis. Así pues, los efectos de la apoptosis parecen ser un problema fundamental en la terapia del cáncer dado que los mismos confieren resistencia a muchos tumores contra los protocolos de tratamiento actuales, conduciendo a la progresión del tumor.
Los caminos de apoptosis implican diversos grupos de moléculas. Una serie de mediadores implicados en la apoptosis son las denominadas caspasas, cisteína-proteasas que escinden su sustrato específicamente en los restos aspartato. Las caspasas transportan la señal apoptótica en una cascada proteolítica, escindiendo y activando las caspasas otras caspasas que degradan subsiguientemente otras dianas celulares dando finalmente como resultado la disgregación de la célula. La activación de las caspasas propiamente dicha puede ser desencadenada por estímulos externos que afectan a ciertos receptores de la propia superficie, conocidos por las personas expertas en la técnica como los denominados receptores de muerte, o por respuesta intracelular al estrés por la vía de las mitocondrias, que conduce a la liberación de proteínas mitocondriales. Receptores de muerte conocidos que median la apoptosis incluyen miembros de la super-familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) tales como, v.g. CD95 (APO-1/Fas) o los receptores TRAIL (ligando inductor de la apoptosis afín a TNF) 1 y 2. La estimulación de los receptores de muerte con sustancias inductoras de apoptosis conduce, entre otras cosas, a la activación de la caspasa 8, que activa a su vez otras caspasas que actúan aguas abajo.
La inducción o la inhibición de la apoptosis está controlada en parte por los miembros de la familia Bcl-2. Varios de tales genes, con inclusión de Bcl-2 y Bcl-x_{L}, contrarrestan la apoptosis por preservar la integridad de la membrana mitocondrial y prevenir la liberación del citocromo c en el citoplasma. En contraste, los miembros pro-apoptóticos tales como Bax y Bad antagonizan la función de Bcl-2 y Bcl-x_{L}, induciendo la formación de heterodímeros y la permeabilización de la membrana mitocondrial con liberación de citocromo c.
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En los cánceres humanos, se encuentra comúnmente una fuerte expresión de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2, y contribuye tanto a la expansión de las células neoplásticas como a la resistencia a la acción terapéutica de los fármacos quimioterapéuticos. La sobreexpresión de Bcl-2 puede hacer las células resistentes a la apoptosis, favoreciendo con ello el crecimiento maligno. Además, dado que muchos agentes quimioterapéuticos destruyen las células tumorales por inducción de la apoptosis, la sobreexpresión de Bcl-2 o Bcl-x_{L} puede inducir a un fenotipo de multirresistencia a los fármacos.
La expresión de una diversidad de genes implicados en la supervivencia o la muerte de diferentes células diana, con inclusión de miembros de la familia Bcl-2, está regulada por las denominadas citoquinas. Las citoquinas pertenecen a un grupo diverso de proteínas solubles, no-anticuerpo, secretadas por una diversidad de tipos de células del sistema inmunitario, que modulan las actividades funcionales de las células individuales por interacción con receptores específicos de la superficie celular, v.g. interferón, interleuquina. Las personas expertas en la técnica conocen dos subgrupos funcionalmente distintos de las denominadas células T adyuvantes que han sido caracterizados sobre la base de la producción de citoquinas. Un subgrupo, las células Th1, secretan IFN-\gamma y otras citoquinas asociadas con la inflamación y las respuestas inmunitarias mediadas por las células, en tanto que las células Th2 promuevan la respuesta humoral que libera IL-4, IL-5 e IL-10.
En la técnica, es conocido que los tipos de cáncer de origen linfoide (y probablemente también los de origen mieloide) producen de modo autocrino citoquinas tales como IL-1 e IL-6, y que v.g. IL-4 aumenta la supervivencia de las células B en la leucemia linfocítica crónica (CLL) in vitro por inhibición de la apoptosis (véase, v.g., Lu Zhao Yan et al., Blood, 1995, Vol. 86, páginas 3123-3131; Mainou-Fowler et al., Leukemia and Lymphoma, 1996, Vol. 21, páginas 369-377). Por otra parte, las citoquinas producidas por los linfocitos T o B en el entorno de un tumor, v.g. el cáncer de tiroides, promueven la supervivencia y/o el crecimiento de dicho tumor (Stassi et al., Nature Reviews Immunology, 2002, Vol. 2, páginas 195-204).
Con respecto a la resolución del problema subyacente en la presente invención, es decir la identificación de compuestos que modulan específicamente pasos distintos de la apoptosis, los autores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que las células del cáncer de tiroides producen de modo autocrino niveles elevados de IL-4 e IL-10, en comparación con los tejidos normales, en tanto que IFN-\gamma era apenas detectable en dichas células cancerosas. El cáncer de tiroides es la enfermedad maligna endocrina más común, responsable de aproximadamente el 60% de los fallecimientos secundarios a cáncer endocrino. Tres tipos principales de tumores malignos se originan a partir del epitelio tiroideo. Los carcinomas de tiroides más diferenciados, el papilar (PTC) y el folicular (FTC) dan cuenta de la gran mayoría de los tumores malignos, en tanto que los carcinomas anaplásticos no diferenciados (UTC) son extremadamente raros. Los elevados niveles de IL-4 e IL-10 en las células del cáncer de tiroides están correlacionados con una sobreexpresión de Bcl-x_{L} y Bcl-2, lo cual protege a su vez las células del cáncer de tiroides contra el efecto citotóxico de los fármacos quimioterapéuticos, sugiriendo un papel potencial de estas proteínas anti-apoptóticas en la resistencia del cáncer de tiroides contra la citotoxicidad inducida por los fármacos.
Las personas expertas en la técnica son conocedoras del hecho de que las células del cáncer de tiroides pertenecen a los denominados cánceres epiteliales, que se distinguen claramente de los tipos de cáncer linfoides o mieloides.
Así pues, un primer objeto de la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-4 en combinación con un antagonista de IL-10 en donde ambos antagonistas son anticuerpos, y al menos un compuesto activo como se define más adelante para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de tiroides. La combinación de antagonistas de IL-4 e IL-10 modula la función de las citoquinas respectivas, para la regulación decreciente de una proteína preventiva de la muerte celular en una célula. Como resultado de la regulación decreciente de una proteína preventiva de la muerte celular, se sensibiliza la célula para la muerte celular. En el contexto de la presente invención, el término "muerte celular" hace referencia a cualquier mecanismo y proceso que puede causar la muerte de una célula. El técnico experto distingue dos procesos denominados apoptosis y necrosis, los dos cuales se abordan dentro del alcance de la presente invención. Sin embargo, el uso de antagonistas de IL-4 e IL-10 de acuerdo con la presente invención es particularmente eficaz si el proceso de muerte para el que se sensibiliza la célula es la apoptosis.
El término "célula" hace referencia a células que fracasan en lo referente a sufrir apoptosis como se describe en la introducción.
De acuerdo con la invención, la célula de cáncer es una célula del cáncer de tiroides.
En una célula de cáncer, el fallo en sufrir la apoptosis puede haber hecho la célula resistente a diversas estrategias de tratamiento que se valen de compuestos anti-neoplásticos. La célula de cáncer a la que se aplica preferiblemente la citoquina puede ser resistente también a compuestos que no conducen necesariamente de modo directo a la muerte celular, pero que sensibilizan estas células para la apoptosis. El técnico experto sabe que tales compuestos incluyen agonistas existentes naturalmente para receptores de muerte, a saber ligandos de receptores o anticuerpos agonísticos para dichos receptores de muerte, así como fármacos quimioterapéuticos.
La "citoquina" de la presente invención es una combinación de IL-4 e IL-10.
Dentro del alcance de la presente invención, las "proteínas anti-apoptóticas" incluyen miembros de la familia Bcl tales como Bcl-2, Bcl-x_{L}, cFLIP, Mcl-1, Bcl-w, A1/BFL1, BOO/DIVA, NR-13, sentrina, TOSO, CPAN, PED, DFF45, y análogas. Las proteínas anti-apoptóticas de la presente invención incluyen también las denominadas "Proteínas Inhibidoras de Apoptosis" (IAPs). Las IAPs se fijan a caspasas de acción precoz, impidiendo con ello la progresión del proceso de apoptosis. Las mismas se expresan a niveles elevados en muchos tumores y, por inhibición de las caspasas, contribuyen a la resistencia de los cánceres contra la inducción de la apoptosis. Ejemplos de IAPs incluyen NAIP, XIAP (hILP), cIAP-1, cIAP-2, ML-IAP (livina), KIAP, BIRC5 (survivina), TIAP, y Apolo. Finalmente, proteínas anti-apoptóticas pueden ser otras tales como fortilina, y análogas.
En una realización preferida de la presente invención, las proteínas anti-apoptóticas incluyen PED, cFLIP, Bcl-2 y Bcl-x_{L}, y combinaciones de las mismas. Muy preferiblemente, las proteínas anti-apoptóticas que son reguladas decrecientemente por los antagonistas de IL-4 e IL-10 son Bcl-2 y/o Bcl-x_{L}.
El término "antagonista de citoquinas" hace referencia a una combinación de antagonistas de IL-4 e IL-10 en la cual ambos antagonistas son anticuerpos, que es capaz de modular directamente la función de las citoquinas conduciendo así a la regulación decreciente de las proteínas anti-apoptóticas.
En el contexto de la presente invención, la modulación de la expresión y/o la función de la citoquina/receptor de citoquina, a la que se hace referencia en lo sucesivo como la "modulación", por el uso del antagonista de citoquinas de acuerdo con la presente invención puede ocurrir al nivel de las proteínas.
La presente invención abarca anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de reconocer específicamente uno o más epítopes de los productos de los genes de citoquina, epítopes de variantes conservadas de los productos de los genes de citoquina, epítopes de productos de genes de citoquinas mutantes, o fragmentos peptídicos de productos de genes de citoquina. Tales anticuerpos pueden incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de fijación de epítope de cualquiera de los anteriores. El antagonista de citoquinas, que es un anticuerpo como se ha descrito arriba, puede utilizarse para capturar y neutralizar cantidades excesivas de citoquinas que se sobreexpresan en células de cáncer farmacorresistentes. Puede ser deseable para la presente invención que el anticuerpo reconozca más de una de las citoquinas arriba mencionadas. Con objeto de capturar y neutralizar más de una citoquina sobreexpresada, el anticuerpo utilizado como antagonista de citoquinas de la presente invención puede poseer más de una especificidad, es decir que es, por ejemplo, biespecífico, triespecífico o multiespecífico.
Epítopes y regiones antigénicas útiles para generación de anticuerpos pueden encontrarse en las secuencias de aminoácidos de las citoquinas (v.g. los números SWISS-PROT P05112 para IL-4, P22301 para IL-10 o P35225 para IL-13) por procedimientos disponibles para una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, pueden identificarse secuencias peptídicas cortas singulares en las secuencias de aminoácidos que tienen poca o ninguna homología con secuencias de aminoácidos conocidas. Preferiblemente, la región de una proteína seleccionada para actuar como epítope o antígeno peptídico no es enteramente hidrófoba; se prefieren regiones hidrófilas dado que dichas regiones constituyen probablemente epítopes de superficie en lugar de regiones internas de las proteínas y polipéptidos presentes. Estos epítopes de superficie son detectados más fácilmente en las muestras sometidas a ensayo respecto a la presencia de las proteínas y polipéptidos presentes.
Los péptidos pueden producirse por cualquier procedimiento conocido por una persona con experiencia en la técnica, por ejemplo, por utilización de procedimientos de traducción o síntesis química in vitro. Los péptidos cortos que proporcionan un epítope antigénico pero que son en sí mismos demasiado pequeños para inducir una respuesta inmunitaria pueden conjugarse a un vehículo adecuado. Vehículos y métodos adecuados de enlace son bien conocidos en la técnica. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos y aminoácidos polímeros. Ejemplos incluyen seroalbúminas, hemocianina de lapa bocallave, ovoalbúmina y polilisina. Una persona con experiencia en la técnica puede utilizar procedimientos y reactivos de acoplamiento disponibles para enlazar el epítope peptídico deseado a un vehículo de este tipo. Por ejemplo, pueden utilizarse reactivos de acoplamiento para formar enlaces disulfuro o enlaces tioéter del vehículo al péptido de interés. Si el péptido carece de un grupo disulfuro, puede proporcionarse uno por la adición de un residuo cisteína. Alternativamente, el acoplamiento puede realizarse por activación de grupos carboxilo.
El tamaño mínimo de los péptidos útiles para la obtención de anticuerpos específicos de antígeno puede variar ampliamente. El tamaño mínimo tiene ser suficiente para proporcionar un epítope antigénico que es específico para la proteína o el polipéptido. El tamaño máximo no es crítico a no ser que se desee obtener anticuerpos para un solo epítope particular. Por ejemplo, un polipéptido de gran tamaño puede comprender epítopes múltiples, siendo uno de los epítopes particularmente útil y siendo un segundo epítope inmunodominante.
De acuerdo con la presente invención, el antagonista de citoquinas hace referencia a una combinación de anticuerpos contra IL-4, e IL-10. Se entenderá que el anticuerpo que se utiliza como antagonista de citoquinas puede poseer más de una especificidad, como se ha descrito arriba, es decir, que esté dirigido a más de una de las IL mencionadas, v.g. un anticuerpo biespecífico para IL-4 e IL-10.
Con objeto de actuar adecuadamente como antagonista de las citoquinas y a fin de realizar el método descrito, es deseable que el antagonista de citoquinas se suministre al sitio de acción, es decir a la proximidad de una célula y/o en una célula. Las personas expertas en la técnica son conocedoras de una diversidad de métodos en cuanto al modo de suministrar los antagonistas de citoquinas descritos a o en la proximidad de la célula diana.
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El antagonista de citoquinas que se describe en la presente invención puede utilizarse como producto farmacéutico en combinación con al menos un compuesto activo, para el tratamiento del cáncer. El término "compuesto activo" hace referencia a un compuesto distinto del antagonista de citoquinas que es capaz de inducir o sensibilizar para la muerte celular, con preferencia apoptosis, o que inhibe la proliferación celular.
Los compuestos activos de acuerdo con la invención se seleccionan de agentes citostáticos, agonistas de los receptores de muerte y reguladores negativos de las proteínas anti-apoptóticas.
La terapia de radiación está basada en el principio de que la radiación a dosis altas suministrada a un área diana dará como resultado la muerte de las células reproductoras tanto en los tejidos tumorales como en los normales. El régimen de dosificación de la radiación se define generalmente en términos de dosis de radiación absorbida (rad), tiempo y fraccionamiento, y debe estar definido cuidadosamente por el oncólogo. La cantidad de radiación que recibe un paciente dependerá de diversas consideraciones, pero las dos consideraciones más importantes son la localización del tumor con relación a otras estructuras u órganos críticos del cuerpo, y la extensión hasta la que se ha propagado el tumor. Ejemplos de agentes radioterapéuticos se proporcionan, pero sin carácter limitante, en la terapia de radiación y son conocidos en la técnica (Hellman, Principles of Radiation Therapy, Cancer, en Principles and Practice of Oncology, 24875 (Devita et al., compiladores, 4th ed., v1, 1993). Avances recientes en la terapia de radiación incluyen radiación con haces externos tridimensionales adaptables, terapia de radiación modulada en intensidad (IMRT), radiocirugía estereotáctica y braquiterapia (terapia de radiación intersticial), situando la última la fuente de radiación directamente en el tumor como "semillas" implantadas. Estas modalidades de tratamiento más recientes suministran dosis mayores de radiación al tumor, lo cual justifica su eficacia incrementada cuando se compara con la terapia estándar de radiación con haces externos. Los radionucleidos emisores beta están consignados como los más útiles para aplicaciones radioterapéuticas debido a la transferencia de energía lineal moderada (LET) de la partícula ionizante (electrón) y su alcance intermedio (típicamente varios milímetros en el tejido). Los rayos gamma suministran dosificación a niveles más bajos en distancias mucho mayores. Las partículas alfa representan el otro extremo; las mismas suministran una dosificación LET muy alta, pero tienen un alcance extremadamente limitado y deben, por tanto, estar en contacto íntimo con las células del tejido a tratar. Adicionalmente, los emisores alfa son generalmente metales pesados, lo cual limita la química posible y presenta riesgos excesivos de fuga del radionucleido del área a tratar. Dependiendo del tumor a tratar, son admisibles todas las clases de emisores dentro del alcance de la presente invención.
Por regla general, la terapia de radiación puede combinarse temporalmente con compuestos activos enumerados más adelante para mejorar el resultado del tratamiento. Existen diversos términos para describir la relación temporal de administración de la terapia de radiación junto con otros compuestos activos, y los ejemplos que siguen son los regímenes de tratamiento preferidos y son conocidos generalmente por los expertos en la técnica, proporcionándose únicamente para ilustración y no debiendo entenderse que limitan el uso de otras combinaciones. La administración de terapia de radiación con otros compuestos activos puede ser "secuencial", es decir separada en el tiempo a fin de permitir la administración independiente, "concomitante", que hace referencia a la administración en el mismo día, y, finalmente, "alternante", que hace referencia a la administración de la terapia de radiación los días en los cuales no se habrían administrado otros compuestos activos.
Una clase de compuestos activos son compuestos químicos que tienen un efecto citostático o anti-neoplástico ("compuesto citostático"). Compuestos citostáticos incluidos en la presente invención comprenden, pero sin carácter restrictivo, (i) antimetabolitos, tales como citarabina, fludarabina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina, gemcitabina, hidroxiurea o metotrexato; (ii) agentes de fragmentación del DNA, tales como bleomicina, (iii) agentes de reticulación del DNA, tales como clorambucil, cisplatino, ciclofosfamida o mostaza nitrogenada; (iv) agentes de intercalación tales como adriamicina (doxorrubicina) o mitoxantrona; (v) inhibidores de la síntesis de proteínas, tales como L-asparaginasa, cicloheximida, puromicina o toxina de la difteria; (vi) venenos de topoisomerasa I, tales como camptotecina o topotecán; (vii) venenos de topoisomerasa II, tales como etoposido (VP-16) o teniposido; (viii) agentes dirigidos a los microtúbulos, tales como colcemid, colchicina, paclitaxel, vinblastina o vincristina; (ix) inhibidores de las quinasas tales como flavopiridol, estaurosporina, STI571 (CPG 57148B) o UCN-01 (7-hidroxiestaurosporina); (x) agentes de investigación diversos tales como tioplatino, PS-341, butirato de fenilo, ET-18-OCH_{3}, o inhibidores de la farnesil-transferasa (L-739749, L-744832); polifenoles tales como quercetina, resveratrol, piceatannol, galato de epigalocatequina, teaflavinas, flavanoles, procianidinas, ácido betulínico y derivados del mismo; (xi) hormonas tales como glucocorticoides o fenretinida; (xii) antagonistas de hormonas, tales como tamoxifeno, finasterida o antagonistas de LHRH.
Otros compuestos citostáticos incluyen citostáticos derivados de plantas (de Viscum y derivados); alcaloides tales como vindesina; podofilotoxinas tales como vinorrelbina; agentes alquilantes tales como nimustrina, carmustrina, lomustina, estramustrina, melfalam, ifosfamida, trofosfamida, bendamustina, dacarbazina, busulfano, procarbazina, treosulfano, tremozolamida, tiotepa; antibióticos citotóxicos tales como aclarrubicina, daurorrubicina, epirrubicina, irarrubicina, mitomicina, dactinomicina; antimetabolitos afines al ácido fólico tales como metotrexato, análogos de purina tales como cladribina, mercaptopurina, tioguanina y análogos de pirimidina tales como citarabina, fluorouracilo, docetaxel; compuestos de platino tales como carboplatino, oxaliplatino; amsacrina, irinotecano, interferón-\alpha, tretinoína, hidroxicarbamida, miltefosina, pentostatina, aldesleuquina; compuestos antineoplásticos derivados de órganos, v.g. anticuerpos monoclonales tales como trastuzumab, rituximbab, o derivados de enzimas tales como pegaspargasa; compuestos antineoplásticos con efecto endocrino pertenecientes a hormonas, v.g. estrógenos tales como poliestradiol, fosfestriol, etinilestradiol, gestágenos tales como medroxiprogesterona, caproato de gestonorona, megestrol, noretisterona, linestrenol, hormonas hipotalámicas tales como triptorrelina, leuprorrelina, buserelina, goserelina, otras hormonas tales como testolactona, testosterona; compuestos antineoplásticos con acción endocrina pertenecientes a los antagonistas de hormonas, v.g. antiestrógenos tales como toremifeno; antiandrógenos tales como flutamida, bicalutamida, ciproterano; compuestos antineoplásticos con efecto endocrino pertenecientes a los inhibidores de enzimas tales como anastrol, exemestano, letrozol, formestano, aminoglutetimida, todos los cuales pueden administrarse ocasionalmente junto con los denominados protectores tales como folinato de calcio, amifostina, lenograstina, molgromostina, filgastrina, mesna o los denominados aditivos tales como palmitato de retinol, timo D9, y amilómero.
En una realización preferida de la presente invención, el compuesto activo que tiene un efecto citostático se selecciona del grupo constituido por cisplatino, doxorrubicina y paclitaxel (taxol).
Otra clase de compuestos activos que pueden utilizarse en la presente invención comprenden aquéllos que son capaces de sensibilizar para o inducir la apoptosis por unión a receptores de muerte ("agonistas de receptores de muerte"). Los agonistas de receptores de muerte incluyen ligandos de receptores de muerte tales como el factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha), el factor \beta de necrosis tumoral (TNF-\beta, linfotoxina-\alpha), LT-\beta (linfotoxina-B), TRAIL (Apo2L, ligando DR4), ligando CD95 (Fas, APO-1), ligando TRAMP (DR3, Apo-3), ligando DR6 así como fragmentos y derivados de cualquiera de dichos ligandos. Adicionalmente, los agonistas de receptores de muerte comprenden anticuerpos agonísticos para los receptores de muerte tales como anticuerpo anti-CD95, anticuerpo anti-TRAIL-R1 (DR4), anticuerpo anti-TRAIL-R2 (DR5), anticuerpo anti-DR6, anticuerpo anti-TNF-R1 (p55 TNF-R) y anticuerpo anti-TRAMP (DR3) así como fragmentos y derivados de cualquiera de dichos anticuerpos. Preferiblemente, los anticuerpos agonísticos se seleccionan del grupo constituido por anticuerpo anti-TRAIL-R1, anticuerpo anti-TRAIL-R2, y anticuerpo anti TNF-R1 y fragmentos y derivados de cualquiera de dichos anticuerpos.
Otra clase de compuestos activos que pueden utilizarse en combinación con el antagonista de citoquinas son péptidos, proteínas o inhibidores de molécula pequeña que regulan negativamente o inhiben las proteínas anti-apoptóticas arriba descritas. Ejemplos de péptidos reguladores negativos incluyen Smac/DIABLO, NRAGE y TAK1, fragmentos y derivados de los mismos, que inhiben particularmente las IAPs arriba descritas. Estos péptidos pueden estar modificados de tal manera que los mismos puedan internalizarse rápidamente en las células tumorales por absorción celular. La modificación puede ocurrir por fijación de un péptido vehículo que media la absorción celular como se ha descrito arriba para el compuesto activo.
La combinación de antagonistas de IL-4 e IL-10 se administra en combinación con uno o más compuestos activos. Los últimos pueden administrarse antes, después o simultáneamente con la administración de los antagonistas de citoquinas. La dosis de cualquiera de los antagonistas de citoquinas o el compuesto activo, así como la duración y la temperatura de incubación pueden ser variables y dependen de la diana que vaya a tratarse.
Un objeto adicional de la presente invención son preparaciones farmacéuticas que comprenden una dosis eficaz de al menos un antagonista de IL-4 en combinación con al menos un antagonista de IL-10, en donde ambos antagonistas son anticuerpos en combinación con al menos un compuesto activo como se define arriba y un vehículo farmacéuticamente aceptable, es decir una o más sustancias vehículo y/o aditivos farmacéuticamente aceptables.
El producto farmacéutico de acuerdo con la invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo en forma de píldoras, tabletas, tabletas barnizadas, tabletas recubiertas de azúcar, gránulos, cápsulas de gelatina dura y blanda, soluciones, jarabes, emulsiones o suspensiones acuosas, alcohólicas o aceitosas, o por vía rectal, por ejemplo en forma de supositorios. La administración puede realizarse también por vía parenteral, por ejemplo por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa en la forma de soluciones para inyección o infusión. Otras formas de administración adecuadas son, por ejemplo, la administración percutánea o tópica, por ejemplo en forma de ungüentos, tinturas, sprays o sistemas terapéuticos transdérmicos, o la administración por inhalación en forma de sprays nasales o mezclas de aerosoles, o, por ejemplo, microcápsulas, implantes o bastoncillos. La forma de administración preferida depende, por ejemplo, de la enfermedad a tratar y de su gravedad.
La preparación de las composiciones farmacéuticas puede realizarse de una manera conocida per se. A este fin, los antagonistas de citoquinas y el compuesto activo, junto con una o más sustancias vehículo y/o aditivos (o sustancias adyuvantes) farmacéuticos sólidos o líquidos y, en caso deseado, en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos que tengan acción terapéutica o profiláctica, se ponen en una forma de administración o forma de dosificación adecuada que puede utilizarse luego como producto farmacéutico en medicina humana o veterinaria.
Para la producción de píldoras, tabletas, tabletas recubiertas de azúcar y cápsulas de gelatina dura es posible utilizar, por ejemplo, lactosa, almidón, por ejemplo almidón de maíz, o derivados de almidón, talco, ácido esteárico o sus sales. Vehículos para cápsulas de gelatina blanda y supositorios son, por ejemplo, grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites naturales o hidrogenados, etc. Vehículos adecuados para la preparación de soluciones, por ejemplo soluciones para inyección, o de emulsiones o jarabes son, por ejemplo, agua, solución fisiológica de cloruro de sodio, alcoholes tales como etanol, glicerol, polioles, sacarosa, azúcar invertido, glucosa, manitol, y aceites vegetales. Es asimismo posible liofilizar el antagonista de citoquinas y/o el compuesto activo y utilizar los liofilizados resultantes, por ejemplo, para producir preparaciones para inyección o infusión. Vehículos adecuados para microcápsulas, implantes o bastoncillos son, por ejemplo, copolímeros de ácido glicólico y ácido láctico.
Las preparaciones farmacéuticas pueden contener también aditivos, por ejemplo cargas, desintegrantes, aglomerantes, lubricantes, agentes humectantes, estabilizadores, emulsionantes, dispersantes, conservantes, edulcorantes, colorantes, saborizantes, aromatizantes, espesantes, diluyentes, sustancias tampón, disolventes, solubilizadores, agentes para conseguir un efecto de acción prolongada, sales para alterar la presión osmótica, agentes de recubrimiento o antioxidantes.
La dosificación del antagonista de citoquinas, en combinación con uno o más compuestos activos a administrar, depende del caso individual, y debe, como es habitual, adaptarse a las circunstancias individuales a fin de alcanzar un efecto óptimo. Así, la misma depende de la naturaleza y la gravedad del trastorno a tratar, así como del sexo, la edad, el peso y la respuesta individual del humano o animal a tratar, de la eficacia y duración de acción de los compuestos utilizados, de si la terapia es aguda o crónica o profiláctica, o de si se administran otros compuestos activos además del antagonista de citoquinas.
Los antagonistas de citoquinas de acuerdo con la presente invención, o respectivamente los medicamentos que contienen los últimos, pueden utilizarse para el tratamiento de tipos del cáncer de tiroides que son resistentes a la apoptosis debido a la expresión de proteínas anti-apoptóticas. Ejemplos de tales tipos de cáncer son carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma folicular de tiroides, y carcinoma anaplástico de tiroides.
Ejemplos de tipos de cáncer en los cuales el uso de los antagonistas de citoquinas de acuerdo con la presente invención, o respectivamente los medicamentos que contienen los últimos, es particularmente ventajoso, incluyen todas las formas de carcinomas de tiroides (carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma folicular de tiroides, y carcinoma anaplástico de tiroides).
La invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos siguientes:
Ejemplos Ejemplo 1 Las células del cáncer de tiroides son resistentes a la muerte celular inducida por quimioterapia
Aunque pruebas clínicas con agentes individuales o con combinaciones de fármacos quimioterapéuticos han producido respuesta positiva rara y limitada, sin aumento en la mediana y el valor medio del tiempo de supervivencia en comparación con la historia natural de la enfermedad, algunos compuestos han exhibido varios efectos beneficiosos en términos de tasas de respuesta parciales y reducción de la expansión metastática del tumor.
Para investigar la sensibilidad de las diferentes variantes histológicas de carcinomas epiteliales de tiroides a los fármacos quimioterapéuticos convencionales, se midió la viabilidad de los tirocitos recién purificados normales y neoplásticos expuestos a cisplatino (300 ng/ml), doxorrubicina (5 \muM) y taxol (5 \muM), utilizando dosis compatibles con los niveles in vivo observados durante el tratamiento del cáncer. En línea con la modesta eficacia clínica consignada en las pruebas clínicas, las células noplásticas primarias derivadas de la totalidad de las variantes histológicas de carcinomas epiteliales de tiroides exhibieron una resistencia considerable a los fármacos quimioterapéuticos en comparación con los tirocitos normales (Fig. 1). Dicha resistencia persistía durante varios días y se perdía generalmente al cabo de 8 a 10 días de cultivo in vitro (resultados no presentados).
Ejemplo 2 Las células del cáncer de tiroides expresan Bcl-2 y Bcl-x_{L}
La refractariedad a la quimioterapia de las células de carcinoma de tiroides puede ser resultado de la acción inhibidora de genes anti-apoptóticos. Por esta razón, se evaluó la expresión de proteínas anti-apoptóticas relevantes, potencialmente capaces de proteger las células del cáncer de tiroides contra la actividad citotóxica de los fármacos quimioterapéuticos. El análisis inmunohistoquímico de secciones de PTC, FTC y UTC incrustadas en parafina demostró que Bcl-2 y Bcl-x_{L} estaban regulados en sentido creciente en un grado considerable en las células del carcinoma de tiroides (Fig. 2a y b). Para determinar más exactamente la diferencia entre tirocitos normales y malignos, se lisaron y analizaron por inmunotransferencia células de tiroides de control y neoplásticas recién purificadas. Como se muestra en Fig. 2c y d, Bcl-x_{L} se expresaba débilmente en las células normales y en una magnitud 4 a 5 veces mayor en todas las variantes de cáncer histológico, en tanto que Bcl-2 se encontraba aproximadamente en una magnitud tres veces mayor en las células de FTC y dos veces mayor en las células de PTC y UTC, en comparación con los tirocitos normales. Se utilizaron como control positivo corazones de ratones transgénicos Bcl-x_{L} y Bcl-2. La capacidad de sobreexpresión de Bcl-x_{L} y Bcl-2 para proteger algunos tipos de células contra el efecto citotóxico de los fármacos quimioterapéuticos sugiere un papel potencial de estas proteínas anti-apoptóticas en la resistencia del cáncer de tiroides a la citotoxicidad inducida por los fármacos.
Ejemplo 3 Bcl-2 y Bcl-x_{L} exógenos protegen los tirocitos contra la muerte celular inducida por los agentes quimioterapéuticos
Para demostrar que la regulación creciente de Bcl-x_{L} y Bcl-2 protege los tirocitos contra la apoptosis inducida por los fármacos quimioterapéuticos y puede ser responsable de la supervivencia de las células del cáncer de tiroides, se transdujeron tirocitos normales con un vector retroviral (PINCO) que llevaba la proteína fluorescente verde (GFP) como gen informador. Después de la infección, los tirocitos transducidos con vector vacío, Bcl-x_{L} y Bcl-2 se seleccionaron por citometría de flujo y se expusieron a cisplatino, doxorrubicina y taxol a fin de evaluar la extensión de la apoptosis inducida por quimioterapia. Las inspecciones se monitorizaron por análisis de inmunotransferencia a fin de confirmar la eficiencia del suministro génico (Fig. 3a). Los tirocitos transducidos con Bcl-x_{L} o Bcl-2 estaban casi totalmente protegidos contra los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos (Fig. 3b y c), lo que indicaba que la sobreexpresión de cualquiera de los dos genes era suficiente para prevenir la destrucción de las células del cáncer de tiroides. Así pues, Bcl-x_{L} y Bcl-2 representan candidatos probables para mediar la refractariedad de las células del cáncer de tiroides a la quimioterapia.
Ejemplo 4 Producción autocrina de IL-4 e IL-10 en las células del cáncer de tiroides
Para investigar si el microentorno tumoral puede influir en el fenotipo y la función de las células del cáncer de tiroides, se evaluó a continuación la presencia de aquellas citoquinas que se habían encontrado previamente modulan la susceptibilidad de los tirocitos a la apoptosis. Se investigó la presencia de las citoquinas Th1 y Th2 en la glándula tiroides neoplástica por inmunohistoquímica en secciones de carcinomas de tiroides incrustadas en parafina y por inmunocitoquímica y análisis de inmunotransferencia en células de carcinoma de tiroides recién aisladas. Todas las variantes histológicas analizadas por inmunohistoquímica exhibían una reactividad alta para IL-4 e IL-10, en comparación con los tejidos normales, en tanto que IFN-\gamma era apenas detectable (Fig. 4a). Resultó interesante que la reactividad contra las citoquinas Th2 se localizaba en los folículos del tiroides, lo que sugería que las células tiroideas neoplásticas eran la fuente de producción tanto de IL-4 como de IL-10 (Fig. 4a). Para excluir la posibilidad de que estas citoquinas fueran liberadas por células T infiltrantes, se analizaron células del cáncer de tiroides recién purificadas por inmunocitoquímica e inmunotransferencia en cuanto a la expresión de las citoquinas Th1 y Th2. Como se observó en los experimentos de inmunohistoquímica, las células del cáncer de tiroides purificadas exhibían una reactividad intensa tanto para IL-4 como para IL-10, en tanto que no era detectable expresión alguna de IFN-\gamma (Fig. 4b y c). Se utilizaron 20 nanogramos de IL-4, IL-10 e IFN-\gamma humanas recombinantes como controles positivos para el análisis por inmunotransferencia. La comparación entre los controles positivos y las muestras de cáncer indicaba que las células tiroideas malignas producen cantidades considerables de dichas citoquinas Th2 que han exhibido actividad anti-apoptótica sobre las células foliculares tiroideas.
Ejemplo 5 IL-4 e IL-10 protegen los tirocitos contra la muerte celular inducida por los agentes quimioterapéuticos
Se investigó a continuación si IL-4 e IL-10 pueden modular la sensibilidad a la apoptosis inducida por quimioterapia y la expresión de proteínas anti-apoptóticas en células de tiroides. Resultó interesante que tanto IL-4 como IL-10 evitaban drásticamente la muerte de los tirocitos normales expuesto a cisplatino, doxorrubicina y taxol (Fig. 5a), lo que sugiere que la producción autocrina de estas citoquinas en las células del cáncer de tiroides es responsable de la refractariedad a la quimioterapia. Adicionalmente, tanto IL-4 como IL-10 regulaban en sentido creciente Bcl-x_{L} y Bcl-2 al cabo de 48 horas de cultivo (Fig. 5b), en tanto que IFN-\gamma no era eficaz. Así pues, es probable que la expresión incrementada de proteínas anti-apoptóticas y la protección subsiguiente de las células tumorales contra la quimioterapia están mediadas por la liberación autocrina de IL-4 e IL-10.
Ejemplo 6 El bloqueo de la actividad autocrina de IL-4 e IL-10 sensibiliza la célula del cáncer de tiroides para la destrucción mediada por quimioterapia
Para ensayar si la liberación autocrina de IL-4 y/o IL-10 por los tumores de tiroides es responsable de la regulación creciente de proteínas anti-apoptóticas, se trataron células tumorales durante 2 días con Abs neutralizantes específicos para IL-4 y/o IL-10 y se midió la expresión de Bcl-x_{L} y Bcl-2. Como se muestra en Fig. 6a, los niveles de ambas proteínas disminuían espectacularmente en las células de tumores tiroideos expuestas a los Abs neutralizantes contra IL-4 e IL-10, en tanto que el bloqueo de una sola citoquina tenía un efecto muy limitado. Para ensayar si el aumento mediado por las citoquinas de los niveles de Bcl-x_{L} y Bcl-2 era responsable de las resistencia de las células de tumor de tiroides a la quimioterapia, se trataron células PTC, FTC y UTC durante 2 días con Abs neutralizantes anti-IL-4 y anti-IL-10 y se analizaron en cuanto a viabilidad y sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos. Un porcentaje significativo de células de tumor de tiroides de todas las variantes histológicas sufrieron apoptosis espontánea después de 48 horas de exposición a los anticuerpos anti-IL-4 y anti-IL-10 (Fig. 6A), lo que indicaba que estas citoquinas actúan de hecho como factores de supervivencia para las células del cáncer de tiroides. Además, estas células adquirían sensibilidad a la citotoxicidad inducida por quimioterapia y exhibían muerte masiva después de tratamiento durante 24 horas con cisplatino, doxorrubicina o taxol (Fig. 6B). Así pues, la neutralización de IL-4 e IL-10 liberadas por las células del cáncer de tiroides hace posible su destrucción mediante el uso de fármacos quimioterapéuticos.
Ejemplo 7 La regulación decreciente de las proteínas anti-apoptóticas sensibiliza las células para la muerte celular inducida por TRAIL
Para determinar el potencial de apoptosis mediada por TRAIL, se documentó la expresión in vivo del receptor TRAIL (TR) en células normales y células de carcinoma de tiroides. Para determinar la presencia de TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 y TRAIL-R4 se realizaron tinciones inmunohistoquímicas de secciones de tejido de tiroides incrustadas en parafina de pacientes afectados por PTC, FTC y UTC, y se compararon con secciones de lóbulos de tiroides normales contralaterales al lóbulo canceroso en pacientes con cáncer de tiroides. Se encontró que TRAIL-R1-TR4 se expresaban fuertemente en la totalidad de los tumores papilares analizados y estaban completamente ausentes en los tumores foliculares y anaplásticos (datos no presentados). Para ensayar si la liberación autocrina de IL-4 e IL-10 es responsable de la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en todas las variantes histológicas del cáncer de tiroides examinadas, se trataron células de carcinoma durante 2 días con anticuerpos neutralizantes de IL-4 e IL-10, y se midió luego la resistencia de las células tumorales a la apoptosis inducida por TRAIL. Un porcentaje significativo de células tumorales eran apoptóticas después de exposición durante 48 horas a los anticuerpos anti-IL-4 y anti-IL-10, lo que indicaba que dichas citoquinas actúan como factores de supervivencia para estas células (datos no presentados). Así pues, la regulación decreciente de proteínas anti-apoptóticas tales como FLIP, Bcl-X_{L} y Bcl-2, por la inhibición de las citoquinas Th2, sensibiliza estas células para la muerte celular inducida por TRAIL.
Ejemplo 8 IL-4 inhibe la apoptosis inducida por quimioterapia y CD95 en las células de cáncer de vejiga (ejemplo comparativo)
Se ha observado una relación Th1/Th2 disminuida en una gran diversidad de cánceres humanos, donde se ha propuesto correlacionar la misma con la fase y el grado de malignidad. Se ha demostrado que IL-4 liberada por los linfocitos Th2 asociados a tumores promueve el crecimiento del cáncer metastático pulmonar en los ratones, lo que sugiere un papel específico de esta citoquina en la influencia de la supervivencia de las células tumorales. Por esta razón, se investigó la capacidad de IL-4 para modular la sensibilidad a la apoptosis de las células derivadas de diferentes tumores humanos sólidos.
El tratamiento anticanceroso utilizando fármacos citotóxicos media la muerte celular por activación del programa intracelular apoptótico. Para determinar si IL-4 era capaz de inhibir la apoptosis inducida por los fármacos quimioterapéuticos, se pretrataron células de tumor de vejiga (RT112) durante dos días con concentraciones diferentes de IL-4 y se expusieron subsiguientemente a camptotecina o etoposido. Si bien un número considerable (\sim 60%) de las células tumorales sufrían apoptosis en respuesta a los agentes quimioterapéuticos, las células preincubadas con IL-4 estaban significativamente protegidas contra la muerte inducida por los fármacos (Fig. 7A), lo que sugiere que IL-4 interfiere con el programa apoptótico activado por los agentes anticáncer en las células tumorales. El efecto protector de IL-4 era ya consistente al cabo de 24 horas de pretratamiento y se mantenía estable desde el segundo día del tratamiento a no ser que se retirara IL-4 del medio de cultivo (Fig. 7B y datos no presentados).
La observación de que las células tumorales tratadas con IL-4 exhiben una sensibilidad reducida a los fármacos quimioterapéuticos condujo a los autores de la invención a investigar si esta citoquina podría influir en la expresión de genes reguladores de la apoptosis. Se realizó un análisis por transferencia Western de proteínas relacionadas con la apoptosis sobre líneas de células de cáncer tratadas durante 48 horas con IL-4 en comparación con controles sin tratar o tratados con IL-2. Entre las proteínas examinadas se encontró que aumentaban los niveles de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en las células tumorales tratadas con IL-4, en tanto que los niveles de caspasas y otros miembros de la familia Bcl-2 pro- y anti-apoptóticos se mantenían inalterados (Fig. 7 C-D y datos no presentados). La presión incrementada de cFlip/FLAME-1 incitó a los autores de la invención a investigar si IL-4 podría proteger las células tumorales contra la estimulación de los receptores de muerte. El ligando CD95 (CD95L) es una de las moléculas efectoras principales de los linfocitos T y células NK citotóxicos(as). Se ha demostrado que el camino de CD95 está implicado en el aclaramiento de los tumores in vivo. Se ha encontrado mutación o modulación decreciente de CD95 en varios tumores, y se ha sugerido que el desarrollo de resistencia a la muerte celular inducida por CD95 contribuye a la evasión inmune de las células malignas. Como se muestra en Fig. 7E, el tratamiento con IL-4 era capaz de inhibir significativamente la apoptosis inducida por CD95 en las células de cáncer de vejiga, lo que sugiere que IL-4 puede afectar negativamente a la respuesta inmune contra los tumores.
Ejemplo 9 IL-4 inhibe la apoptosis inducida por quimioterapia y CD95 en las células de cáncer de próstata y mama (ejemplo comparativo)
Se partió de la hipótesis de que la capacidad de IL-4 para proteger las células de cáncer de vejiga contra la quimioterapia y contra la apoptosis inducida por CD95 podría ser exhibida también por otros tumores caracterizados por la presencia de IL-4, tales como los cánceres de próstata y mama. Por esta razón, se pretrataron líneas de células tumorales derivadas de carcinomas de próstata (LNCaP) y mama (MDA-MB-232) durante dos días con IL-4 y se expusieron subsiguientemente a aquellos agentes antineoplásticos que exhibían la actividad citotóxica máxima frente a cada línea de células. En tanto que un porcentaje considerable de células tumorales de próstata y mama cultivadas en medio solo o pretratadas con IL-2 sufrían apoptosis en respuesta a los agentes quimioterapéuticos, las células preincubadas con IL-4 estaban protegidas significativamente contra la muerte inducida por los fármacos (Fig. 8A-B). Análogamente, IL-4 reducía notablemente la apoptosis inducida por anti-CD95 (Fig. 8C), lo que sugiere que la presencia de IL-4 el infiltrado del tumor puede proteger las células de cáncer contra la terapia citotóxica y la respuesta inmunitaria. Inversamente, el pretratamiento de las células con IL-2 no ejercía efecto protector alguno, demostrando la especificidad de las señales mediadas por IL-4 en la inhibición de la apoptosis iniciada por CD95 en las células del cáncer. Notablemente, las células pretratadas con IL-4 no sólo exhibían una supervivencia incrementada a los fármacos citotóxicos y la estimulación por CD95, sino que recuperaba la actividad proliferante total cuando se retiraba el estímulo citotóxico (datos no presentados). Por consiguiente, resulta que IL-4 es capaz de ejercer un efecto significativo sobre la supervivencia y el crecimiento de las células tumorales, incluyendo una expansión más rápida de las células que sobreviven al tratamiento por quimioterapia.
Ejemplo 10 IL-4 regula en sentido creciente la expresión de proteínas anti-apoptóticas en las células de cáncer de próstata y mama (ejemplo comparativo)
La observación de que las células tumorales de próstata y mama tratadas con IL-4 exhiben una sensibilidad reducida a la muerte inducida por CD95 y los fármacos quimioterapéuticos condujo a los autores de la invención investigar si esta citoquina podría influir en la expresión de genes reguladores de la apoptosis. Como en el caso de las células de tumor de vejiga, se encontró que los niveles de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 estaban regulados considerablemente en sentido creciente después de tratamiento con IL-4 en las células de cáncer de próstata LNCaP (Fig. 9A), proporcionando así una posible explicación de la protección mediada por IL-4 contra los sucesos apoptóticos iniciados por la quimioterapia y el receptor CD95. De modo diferente, únicamente un incremento moderado en cFlip/FLAME-1 no se observó en las células MDA-MB-231, donde Bcl-X_{L} representa análogamente el efector primario de la protección mediada por IL-4 contra la apoptosis (Fig. 9B). Por consiguiente, la supervivencia incrementada mediada por IL-4 en las células de cáncer de vejiga, próstata y mama está asociada con la regulación creciente de proteínas anti-apoptóticas.
Ejemplo 11 La expresión exógena de Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 protege las células tumorales contra la apoptosis inducida por fármacos (ejemplo comparativo)
Los miembros de la familia anti-apoptótica Bcl-2 regulan la liberación de citocromo c por las mitocondrias y se han visto implicados en la modulación de la apoptosis de las células tumorales expuestas a fármacos quimioterapéuticos. Se ha comunicado que la expresión incrementada de cFlip/FLAME-1 inhibe la apoptosis de las células malignas dependiente de CD95, dando así como resultado el escape de los tumores frente a la inmunidad de las células T in vivo. Para determinar si la expresión incrementada de estos dos efectores anti-apoptóticos era capaz de proteger las células tumorales contra la apoptosis inducida por los fármacos quimioterapéuticos, RT112, MDA-MB-231 y LNCaP se transdujeron con un vector retroviral que contenía el cDNA para Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 y GFP como gen informador. La infección retroviral producía 100% de poblaciones de células GFP-positivas, las cuales se analizaron luego respecto a la expresión de los genes transducidos. Por titulación del sobrenadante viral y modulación del número de ciclos de infección, fue posible obtener niveles de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en células transducidas comparables a los de las células tratadas con IL-4, como se demostró por análisis de inmunotransferencia y cuantificación por densitometría (Fig. 9C-E). Las células se expusieron luego a fármacos quimioterapéuticos, y se evaluó la protección contra la apoptosis ejercida por Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 exógenos en relación a las células no transducidas pretratadas con IL-4 o con la citoquina de control IL-2. En tanto que las células de control eran destruidas eficazmente por los fármacos citotóxicos, la expresión exógena de Bcl-X_{L} protegía las células tumorales contra la apoptosis inducida por los fármacos a niveles similares a los producidos por IL-4 (Fig. 10). Se observó también una inhibición parcial de la muerte inducida por los fármacos en las células que sobreexpresaban cFlip/FLAME-1 (Fig. 10), lo que reflejaba posiblemente la capacidad de cFlip/FLAME-1 para activar señales anti-apoptóticas a través de NF-kP o indicando alternativamente la implicación de sucesos mediados por receptores de muerte en la apoptosis inducida por quimioterapia.
Ejemplo 12 La expresión exógena de Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 protege las células tumorales contra la apoptosis inducida por CD95 (ejemplo comparativo)
Se ha demostrado que tanto Bcl-X_{L} como cFlip/FLAME-1 interfieren con las señales apoptóticas iniciadas en el receptor CD95, aunque con mecanismos diferentes. cFlip/FLAME-1 inactiva el DISCO CD95 por bloqueo de la activación de la caspasa 8, en tanto que la sobreexpresión de Bcl-X_{L} inhibe los caminos apoptóticos mitocondriales, que contribuyen a la fase de ejecución de la señalización por receptores de muerte. Para determinar la capacidad de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 para inhibir la apoptosis de las células tumorales inducida por CD95, se estimularon células RT112, MDA-MB-231 y LNCaP que sobreexpresaban de manera estable Bcl-X_{L}, y células RT112 y LNCaP que sobreexpresaban cFlip/FLAME-1 con anticuerpos agonísticos anti-CD95. Bcl-X_{L} era capaz de inducir una protección significativa de las 3 líneas de células contra la muerte mediada por CD95, lo que indicaba un papel importante de sucesos mitocondriales en la apoptosis mediada por CD95 de estas células (Figs. 10A-C), en tanto que cFlip/FLAME-1 protegía eficientemente las células LNCaP y RT112 contra la apoptosis inducida por CD95 a niveles comparables a los obtenidos por el tratamiento con IL-4 (Figs. 10A y B). Estos resultados respaldan la hipótesis de que la regulación creciente de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 inducida por IL-4 puede contribuir a una resistencia incrementada de los tumores a la apoptosis mediada por los fármacos quimioterapéuticos y por los efectores del sistema inmunitario.
Ejemplo 13 La producción in vivo de IL-4 está asociada con la regulación creciente de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en el cáncer de vejiga y de próstata (ejemplo comparativo)
Para determinar el papel de IL-4 en la protección de las células tumorales in vivo, se analizaron muestras de cáncer de vejiga, próstata y mama por inmunohistoquímica con objeto de detectar la presencia de IL-4 y la expresión de proteínas anti-apoptóticas inducidas por IL-4. En línea con los datos de la bibliografía, los tejidos normales y neoplásticos indicaban consistentemente la presencia de IL-4 en todos los tipos diferentes de cáncer examinados, en tanto que los tejidos normales eran esencialmente negativos (Fig. 12A-C). El análisis de secciones seriadas indicaba que la reactividad de IL-4 estaba asociada con la presencia de un infiltrado inmune de CD45^{+}, que representa probablemente la fuente principal de producción de IL-4 en los diferentes tumores (Fig. 12A-C). El análisis de las proteínas relacionadas con la apoptosis demostraba que los tumores de vejiga, próstata y mama exhiben reactividad alta tanto para Bcl-X_{L} como para cFlip/FLAME-1, cuya expresión en los tejidos normales era extremadamente baja o indetectable (Fig. 13A). Como era de esperar, los tres tipos de tumores expresaban el receptor de IL-4, que estaba presente también en los tejidos normales (Fig. 13A). Además, los niveles de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 observados in vivo se compararon con los de líneas de células cuya presión exógena de Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 confería protección contra los fármacos quimioterapéuticos y anti-CD95. La expresión tanto de Bcl-X_{L} como de cFlip/FLAME-1 era similar o incluso mayor en el cáncer de vejiga y próstata en comparación con las líneas de células correspondientes que llevaban el gen exógeno (Fig. 13B y C), en tanto que la expresión in vivo de Bcl-X_{L} en el cáncer de mama era ligeramente menor que la encontrada en MDA-MB-231 transducidas (Fig. 13D). Así pues, la producción in vivo de IL-4 en el cáncer de vejiga y de próstata está asociada con una expresión alta de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1, que protegen las células de cáncer contra la quimioterapia y la apoptosis mediada por CD95.
Ejemplo 14 La producción in vivo de IL-4 protege las células de cáncer de mama contra la quimioterapia (ejemplo comparativo)
Para confirmar que la regulación creciente de Bcl-X_{L} inducida por IL-4 es capaz de proteger las células epiteliales de mama contra la apoptosis, se expusieron a IL-4 células epiteliales normales de mama aisladas recientemente y se analizó la expresión de Bcl-X_{L} y la sensibilidad a un panel de fármacos quimioterapéuticos utilizados comúnmente para tratar el cáncer de mama. El tratamiento con IL-4 de las células epiteliales normales de mama aumentaba considerablemente la expresión de Bcl-X_{L}, que alcanzaba niveles ligeramente menores que los observados en las células neoplásticas aisladas recientemente (Fig. 14A). De acuerdo con ello, IL-4 protegía significativamente las células epiteliales normales de mama contra la apoptosis inducida por cisplatino, doxorrubicina y taxol (Fig. 14B). Para confirmar que la exposición in vivo a IL-4 es responsable de la alta expresión de Bcl-X_{L} y la resistencia a la quimioterapia en el cáncer de mama, se midió la expresión y sensibilidad a la apoptosis de las células de carcinoma primario de mama cultivadas en presencia o ausencia de IL-4. Las células de cáncer de mama recién aisladas expresaban niveles altos de Bcl-X_{L} y eran apenas sensibles a los fármacos quimioterapéuticos (Fig. 14C y D). Sin embargo, después de 6 días de cultivo in vitro en ausencia de IL-4, las células de cáncer de mama regulaban decrecientemente Bcl-X_{L} y se volvían sensibles a la apoptosis inducida por quimioterapia, en tanto que en presencia de IL-4 mantenían niveles elevados de Bcl-X_{L} y sensibilidad baja a los fármacos quimioterapéuticos (Fig. 14C y D). Así pues, la producción de IL-4 in vivo promueve la supervivencia de las células de cáncer de mama.
Materiales y métodos (con referencia a los Ejemplos 1 a 7 y las Figuras 1 a 6)
Especímenes. Se obtuvieron tejidos de tiroides afectados por ocho PTC (de edad 28 \pm 5), ocho FTC (de edad 44 \pm 3) y cuatro UTC (de edad 65 \pm 4,5), en el momento de la tiroidectomía. Se obtuvieron especímenes de tiroides normales de los lóbulos contralaterales, no implicados, de glándulas tiroideas con tumores. La diagnosis histológica se basó en la identificación de elementos papilares, en las características de comportamiento de las células de carcinoma (invasión vascular y capsular) y atipia nuclear (forma y patrón de cromatina). Se utilizaron como controles positivos corazones de ratones transgénicos que expresaban Bcl-2 y Bcl-X_{L} humanos, proporcionados por G.L. Condorelli (Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA).
Purificación y cultivo de las células de tiroides. Tejidos de tiroides procedentes de PTC, FTC y UTC normales se digirieron durante 2 horas con colagenasa (1,5 mg/ml) (Gibco BRL, Grand Island, NY) y hialuronidasa (20 \mug/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en DMEM. Se purificaron tirocitos a partir de los tejidos digeridos por agotamiento de las células hematopoyéticas con perlas acopladas a anti-CD45 (Dynal, Wirral Merseyside, Reino Unido) y 12 horas de adherencia en frasco, lo que permitió la eliminación de otras células. Después de 12 horas adicionales de cultivo, se dejó que las células de tiroides crecieran en monocapa para la inmunocitoquímica o se desprendieron con tripsina + EDTA después de exposición a citoquinas o agentes quimioterapéuticos para análisis funcionales y de proteínas. Los tirocitos se cultivaron en DMEM estándar con 10% de FBS desactivado por calentamiento (Hyclone Laboratories, Logan, Reino Unido) en presencia o ausencia de IL-4 humana recombinante (20 ng/ml), IL-10 (40 ng/ml) o IFN-\gamma (1000 UI/ml) (Euroclone, Paignton, Reino Unido) y cisplatino (300 ng/ml), doxorrubicina (5 \muM) y taxol (5 \muM) (Sigma) o TRAIL (Alexis, San Diego, EE.UU.). Para neutralización de IL-4 e IL-10, las células del cáncer de tiroides se pretrataron durante 48 horas con anticuerpos neutralizantes anti-IL-4 e IL-10 humanas (1 \mug/ml) (R&D Systems, MN, EE.UU.).
Cuantificación de la muerte celular. Se evaluaron los sucesos apoptóticos de los tirocitos neoplásticos por tinción del DNA y análisis por citometría de flujo. Se resuspendieron los pelets de células de tiroides en solución hipotónica de fluorocromo que contenía yoduro de propidio (50 \mug/ml), en citrato de sodio al 0,1% y Triton X-10 al 0,1%. El porcentaje de núcleos hipodiploides se evaluó como se ha descrito con anterioridad. Alternativamente, los tirocitos recién purificados se extendieron en placas 96-fondo por triplicado a 15.000 células/pocillo y se cultivaron. El número de células viables se detectó con el Kit de Ensayo Acuoso del Título de Células (Promega Corporation, WI, EE.UU.) por adición de 20 \mul del reactivo de solución directamente a los pocillos de cultivo, incubación durante 1 hora a 37ºC y registro de la absorbancia a 490 nm.
Procedimiento de inmunotinción. Las tinciones inmunohistoquímicas se realizaron en secciones de tiroides de 5 \mum de espesor incrustadas en parafina. Las secciones desparafinadas se pretrataron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min a la temperatura ambiente a fin de inhibir la peroxidasa endógena. Se incubaron luego portaobjetos durante 10 min con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 3% de seroalbúmina bovina (BSA) para bloquear la tinción inespecífica. Después de eliminación del exceso de suero, las secciones se expusieron durante 1 hora a anticuerpos específicos contra Bcl-X_{L} (H-5, IgG_{1} de ratón, Santa Cruz-Technology, Inc., Santa Cruz, CA), Bcl-2 (124, IgG1 de ratón, Dako), IL-4 (IgG1 B-S4 de ratón, Caltag Laboratories, Burlingame, CA), IL-10 (IgG2a B-N10 de ratón, Caltag), IFN-\gamma (B27, IgG1 de ratón, Caltag), TRAIL-R1 a R4 (Alexis, San Diego, EE.UU.) o controles isotipo coincidentes a diluciones apropiadas. Antes de la inmunotinción para Bcl-2 y Bcl-x1, las secciones desparafinadas se trataron durante 10 min en un horno microondas en tampón de citrato 0,1 M. Después de dos lavados en PBS, las secciones se trataron con inmunoglobulinas anti-conejo o anti-ratón biotiniladas, se lavaron en TBS y se incubaron con estreptavidina-peroxidasa (Kit Dako LSAB 2, Dako Corporation, Carpinteria, CA, EE.UU.). La tinción se detectó utilizando 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) como sustrato colorimétrico. La contratinción de las secciones de tejido se realizó utilizando hematoxilina acuosa.
Aislamiento de Proteínas y Transferencia Western. Los sedimentos de células se resuspendieron en tampón de lisis NP-40 enfriado en hielo (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, 1% NP-40) que contenía PMSF 1 mM, leupeptina (1 \mug/ml), pepstatina (1 \mug/ml) y aprotinina (1 \mug/ml). Cada lisado (30 \mug) se fraccionó en geles de SDS-poliacrilamida al 12% y se transfirió a nitrocelulosa (Hybond, Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra, Reino Unido). La membrana se bloqueó durante 1 h con leche desnatada seca en TBS que contenía 0,05% de Tween 20 y se incubó sucesivamente durante 2 h con Abs específicos para actina (Ab-1, IgM de ratón, Calbiochem, Darmstadt, Alemania), Bcl-2 (124, IgG1 de ratón, Upstate Biotechnology Inc.), Bcl-X_{L} (H-5, IgG1 de ratón, Santa Cruz Biotechnology), IL-4 (3007,11, IgG1 de ratón, R&D Systems, Ing., Minneapolis EE.UU.), IL-10 (23738,111, IgG2b de ratón, R&D Systems), IFN-\gamma (25708,111, IgG2a de ratón, R&D Systems). Después del lavado, las transferencias se incubaron durante 1 hora con Abs anti-ratón conjugado con HRP (Amersham) y se visualizaron utilizando un sistema de detección por quimioluminiscencia mejorado (Sustrato de Duración Prolongada SuperSignal West Dura, Pierce, Illinois, EE.UU.). Como control positivo se utilizaron rhIL-4, hrIL-10 y rhIFN-\gamma (Euroclone).
Producción de partículas retrovirales e infección de tirocitos. Se clonaron cDNAs de Bcl-2 y Bcl-X_{L} en vector PINCO. La línea de células de empaquetamiento anfotrópica Phoenix se transfectó transitoriamente con PINCO utilizando el método de fosfato de calcio/cloroquina. La infección se realizó por cultivo de 5 x 10^{5} tirocitos en 1 ml de partículas virales de 0,45 mM que contenían el sobrenadante filtrado. A continuación, se centrifugaron las células durante 45 min a 1800 rpm y se pusieron nuevamente en la incubadora de CO_{2} durante 2 horas. Se realizaron 3 ciclos de infección antes de poner de nuevo los tirocitos en medio con suplemento. Las células positivas clasificadas y enriquecidas se extendieron en placas y se expusieron a cisplatino, doxorrubicina y taxol para evaluación de la muerte celular.
Materiales y métodos (con referencia a los Ejemplos 8 a 14 y las Figuras 7 a 14) Cultivo de Células y Reactivos
La línea de células de cáncer de próstata humana LNCaP y la línea de células de cáncer de mama humana MDA-MB-231 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). La línea de células de carcinoma de vejiga humana RT111 fue proporcionada amablemente por el Dr. M. Cippitelli (Instituto del Cáncer Regina Elena, Roma, Italia). Las células se dejaron crecer en RPMI 1640 (Life Technologies Inc., Grand Island, NY) que contenía 10% de suero bovino fetal desactivado por calentamiento, complementado con L-glutamina 2 mM y 100 unidades/ml de Penicilina-Estreptomicina. Las células se mantuvieron en una atmósfera con 5% de CO_{2} y se sometieron rutinariamente a pasos cuando se alcanzó el 80-85% de confluencia. Se adquirieron IL-2 e IL-4 humanas recombinantes de PeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ). Camptotecina, cisplatino, daunorrubicina, etoposido y vincristina se adquirieron de Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO) y se resuspendieron en DMSO (cisplatino, camptotecina y etoposido) o en agua (daunorrubicina y vincristina). El anticuerpo agonístico anti-CD95 (clon CH11) se adquirió de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). El anticuerpo monoclonal anti-Bcl-X_{L} (H5, ratón) era de Santa Cruz (Santa Cruz, CA), el anticuerpo anti-cFlip/FLAME-1 (NF6, ratón) fue proporcionado amablemente por el Dr. P.H. Krammer (Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg, Alemania). El anticuerpo anti-\beta-actina (de cabra) se adquirió de Oncogene (Boston, MA):
Tejidos normales y cancerosos de especímenes de mama, próstata y vejiga se digirieron durante 3 horas con colagenasa (1,8 ng/ml) (Gibco BRL, Grand Island, NY) y hialuronidasa (25 \mug/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en DMEM. Después de 12 horas de cultivo, las células normales y cancerosas se desprendieron con tripsina + EDTA subsiguientemente a la exposición a citoquinas o agentes quimioterapéuticos para análisis funcionales y de proteínas. Las células se cultivaron en DMEM estándar con 10% de FBS desactivado por calentamiento (Hyclone Laboratories, Logan, Reino Unido) en presencia o ausencia de citoquinas humanas recombinantes.
Ensayo de viabilidad de las células
Se determinó la viabilidad de las células utilizando el CellTiter 96® AQ_{UEOUs} One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo está basado en la reducción de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxi-fenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna (MTS) a un producto coloreado de formazano que se mide espectrofotométricamente. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC en una incubadora con 5% de CO_{2} durante una noche. Al día siguiente se añadieron IL-2 o IL-4 a una concentración de 20 ng/ml. Después de dos días, se trataron las células durante 10 horas con fármacos quimioterapéuticos o anti-CD95, después de lo cual se añadieron a cada pocillo 20 \mul de MTS. Después de 3 horas de incubación a 37ºC con el reactivo MTS, las placas se leyeron en un Contador Multilabel (Victor2, Wallac, Perkin-Elmer Inc., Norwalk, CT) y se midió la absorbancia del tinte a 490 nm.
Procedimiento de inmunotinción. Los análisis inmunohistoquímicos se realizaron en secciones de 7 \mum de espesor incrustadas en parafina. Las secciones desparafinadas se trataron durante 10 min en un horno microondas en tampón de citrato 0,1 M. Después de eliminación del exceso de suero, las secciones se expusieron durante una hora a anticuerpos específicos contra Bcl-X_{L} (H-5, IgG_{1} de ratón, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), CD45RO (UCHL1, IgG2a de ratón, Dako Corporation Carpintera CA, EE.UU.), IL-4 (IgG_{1} B-S4 de ratón, Caltag Laboratories, Burlingame, CA), cFLIP (IgG policlonal de conejo, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), L-4R (C-20, IgG policlonal de conejo, Santa Cruz, CA) o controles isotipo coincidentes en diluciones apropiadas. Después de dos lavados en TBS, las secciones se trataron con inmunoglobulinas anti-conejo o anti-ratón biotiniladas, se lavaron en TBS y se incubaron con estreptavidina-peroxidasa (Kit Dako LSAB 2). La tinción se detectó utilizando 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), como sustrato colorimétrico. La contratinción de las células y las secciones de tejido se realizó utilizando hematoxilina acuosa.
Transferencia Western
Se lavaron dos veces los sedimentos de células con PBS fría y se lisaron en hielo durante 30 minutos con tampón de lisis NP40 al 1% (Tris-HCl 20 mM de pH 7,2, NaCl 200 mM, NP40 al 1%) en presencia de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y 2 \mug/ml de cada una de aprotinina, leupeptina y pepstatina. Se separaron los residuos celulares por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se determinó la concentración del lisado utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratory Richmond, CA). Partes alícuotas de los extractos celulares que contenían 30 \mug de proteína total se resolvieron por SDS-PAGE al 10% o 12% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Hybond-C extra (Amerhsam Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Los filtros se bloquearon durante una hora a la temperatura ambiente en leche desnatada-seca al 5% disuelta en TBS-T (Tris-HCl 10 mM de pH 8,0, NaCl 150 mM, y 0,2% de Tween 20) y se incubaron luego en BSA/TBS-T al 1% que contenía una dilución de anticuerpo primario (anti Bcl-X_{L} 1:200, anti cFlip 1:10 y anti \beta-actina 1:10.000) durante 3 horas (Bcl-X_{L} y \beta-actina) o durante una noche (cFlip). Después de lavado en tampón TBS-T, los filtros se incubaron durante 45 minutos en leche desnatada seca al 5% disuelta en TBS-T que contenía una dilución 1:4.000 del anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa (Amersham). Las proteínas se visualizaron con la técnica de quimioluminiscencia intensificada (Super Signal West Pico Pierce, Rockford, IL).
Producción de partículas retrovirales e infección de líneas de células
Se clonaron cDNAs de cFlip y Bcl-X_{L} en el vector retroviral PINCO que llevaba la Proteína Fluorescente Verde (GFP) como gen informador (25). Se transfectó la línea de células de empaquetamiento anfotrópica Phoenix con los plásmidos PINCO-1/Bcl-X_{L}, PINCO-1/cFlip o con el vector vacío por el método estándar de fosfato de calcio-cloroquina. Los sobrenadantes de cultivo que contenían partículas virales se recogieron al cabo de 48 horas, se filtraron (0,45 \mum) y se añadieron a 3 x 10^{5} células extendidas en placas de 6 pocillos. Para un ciclo de infección, se centrifugaron las células a 1800 rpm durante 45 minutos a 32ºC y se mantuvieron en la incubadora durante 75 minutos.
Se sometieron las células a dos ciclos de infección cada día durante 2 días consecutivos y se pusieron luego en medio estándar. Las células GFP-positivas se analizaron por citometría de flujo 24 horas después del último ciclo de infección (FACScan, Becton Dickinson, San José, CA).
Análisis estadístico
El porcentaje de células apoptóticas se dedujo del porcentaje de células viables que se calculó directamente a partir de los valores de ensayo MTS. El porcentaje de protección contra la apoptosis se determinó como:
% protección = 100% -X
X se calculó con la fórmula:
(C1-C2):100 = (S1-S2): X
donde:
C1 es la viabilidad de las células de control sin tratar, C2 es la viabilidad de las células de control tratadas con el estímulo apoptótico, S1 y S2 son la viabilidad de las células preincubadas con citoquinas o transducidas con genes anti-apoptóticos, (S1) sin tratar o (S2) tratadas con los estímulos apoptóticos.
Se utilizó el ensayo t apareado para analizar la significación estadística de los resultados experimentales. Valores de P menores que 0,05 se consideraron significativos. Los datos se presentan como valores medios \pm una desviación estándar de la media.
Descripción de los dibujos
Figura 1. Resistencia a la muerte celular apoptótica inducida por fármacos quimioterapéuticos en las células del cáncer de tiroides. Porcentaje de células apoptóticas en tirocitos recién purificados de glándula tiroides normal, PTC, FTC y UTC, expuestas durante 6, 12 y 24 h a cisplatino (300 ng/ml), doxorrubicina (5 \muM) y taxol (5 \muM). (Los datos son valor medio \pm d.e. de cuatro experimentos independientes).
Figura 2. Expresión de moléculas anti-apoptóticas en el cáncer de tiroides. (a, b) Análisis inmunohistoquímico de Bcl-X_{L} y Bcl-2 en secciones de glándula tiroides normal, PTC, FTC y UTC incrustadas en parafina, reveladas por AEC (tinción roja). (b, c) Análisis por inmunotransferencia de Bcl-X_{L} y Bcl-2 en lisados de tirocitos recién purificados de normal, PTC, FTC y UTC. Se utilizaron como controles positivos corazones transgénicos de Bcl-X_{L} y Bcl-2 (control +). Se realizaron controles de carga por detección de \beta-actina en la misma transferencia de membrana (se muestra uno de cuatro experimentos representativos).
Figura 3. Protección contra la muerte celular inducida por quimioterapia en tirocitos transducidos con Bcl-X_{L} y Bcl-2. Análisis por inmunotransferencia de (a) Bcl-X_{L} y (b) la expresión de Bcl-2 en tirocitos clasificados por citometría de flujo transducidos con vector vacío (Vector), Bcl-X_{L} y Bcl-2. El control de carga se evaluó por tinción con \beta-actina. (c) Porcentaje de apoptosis en tirocitos normales transducidos como en a y b después de exposición a fármacos quimioterapéuticos. (d) células GFP-positivas teñidos con bromuro de etidio y observadas por microscopio de inmunofluorescencia. Se muestra un experimento representativo de tres realizados.
Figura 4. Expresión de IL-4 e IL-10 en células del cáncer de tiroides. (a) Análisis inmunohistoquímico de IL-4, IL-10 e IFN-\gamma en secciones de glándula tiroides normal, PTC, FTC y UTC incrustadas en parafina (tinción roja). (b) Inmunotinción para IL-4, IL-10 e IFN-\gamma de tirocitos purificados de todas las variantes histológicas de carcinoma epitelial de tiroides. (c) Análisis Western de IL-4, IL-10 e IFN-\gamma en tirocitos de cáncer recién purificados. Como control positivo se utilizaron rhIL-4, rhIL-10 y rhIFN-\gamma (20 ng/pista). Estos experimentos son representativos de los resultados de tres experimentos independientes, utilizando cada uno cultivos de especímenes de pacientes diferentes.
Figura 5. IL-4 e IL-10 restablecen los tirocitos normales contra la muerte celular apoptótica inducida por quimioterapia. (a) Porcentaje de sucesos apoptóticos de células de tiroides normales purificadas pretratadas durante 48 h con medio de control (panel izquierdo), rhIL-4 (20 ng/ml) o rhIL-10 (40 ng/ml) y cultivadas luego con cisplatino, doxorrubicina y taxol durante 12 horas más. (b) Análisis por inmunotransferencia de tirocitos normales cultivados con IL-4 o IL-10 como en a o rhIFN-\gamma (1000 UI/ml).
Figura 6. Los anticuerpos neutralizantes contra IL-4 e IL-10 sensibilizan las células de carcinoma de tiroides para la quimioterapia. (a) Cinética de células viables en tirocitos de carcinoma cultivados con medio solo o con anti-IL-4 o con anti-IL-10 o con anti-IL-4 + anti-IL-10. Porcentaje de células de carcinoma de tiroides viables purificadas pretratadas durante 48 h con medio de control, anti-IL-4 (1 \mug/ml) o anti-IL-10 (1 \mug/ml) o anti-IL-4 + anti-IL-10 y cultivadas luego con fármacos quimioterapéuticos durante 24 horas más (panel derecho). (Se muestra el valor medio de un experimento representativo de cuatro). (b) Porcentaje de células viables PTC, FTC y UTC pretratadas durante 48 h con anti-IL-4 + anti-IL-10 y cultivadas luego con cisplatino, doxorrubicina y taxol durante 12 y 24 horas.
Figura 7. IL-4 protege las células de carcinoma de vejiga RT112 contra la apoptosis inducida por quimioterapia y anti-CD95 (no es asunto de la invención)
(A) Porcentaje de células viables de carcinoma de vejiga RT112 pretratadas durante 2 días con dosis crecientes de IL-4 (5, 10, 20, 50 y 100 ng/ml) que se mantuvieron también durante incubación con fármacos quimioterapéuticos y se expusieron a 50 ng/ml de camptotecina de etoposido 7 \muM. El tratamiento con 20 ng/ml de IL-4 durante 2 días es capaz de proteger las células contra la apoptosis inducida por quimioterapia. El efecto protector se mantiene a concentraciones de IL-4 mayores que 20 ng/ml. Se determinó la viabilidad de las células después de 24 horas utilizando el ensayo MTS como se describe en Materiales y Métodos, y se calculó el porcentaje de protección contra la muerte de las células como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados representados son el valor medio \pm d.e. de cuatro experimentos independientes.
(B) Evolución en el tiempo de las células de carcinoma de vejiga RT112 después de exposición con IL-4 están protegidas contra la muerte celular inducida por etoposido desde el día 2 al día 4, hasta que se mantiene IL-4 en el medio de cultivo. Las células, pretratadas hasta 3 días con IL-4 o IL-2, se expusieron a 7 \muM de etoposido durante 2 días, se lavaron y se pusieron en medio reciente sin citoquinas hasta el día 6. Cuando se retira la citoquina por lavado, el porcentaje de protección se modula decrecientemente.
(C) Análisis por inmunotransferencia de los niveles de expresión de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en RT112. Células sin tratar (0), o tratadas se expusieron durante 2 días a 5, 10, 20, 50 ó 100 ng/ml de IL-4. Se muestra un experimento representativo de dos realizados.
(D) Análisis por inmunotransferencia de los niveles de expresión de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en RT112 sin tratar (día 0) o tratadas desde el día 1 al día 3 con IL-4 y lavadas y puestas en medio reciente sin IL-4 desde el día 3 al día 6.
(E) IL-4 previene contra la apoptosis inducida por CD95. Porcentaje de células RT112 viables pretratadas durante 2 días con IL-4 o IL-2 y mantenidas en presencia de citoquinas durante todo el experimento. Sucesivamente, las células se incubaron con 30 ng/ml de anticuerpo agonístico anti-CD95 en medio estándar. Las células de control (-) se estimularon con anti-CD95 en ausencia de pretratamiento con citoquina. Los resultados mostrados son el valor medio \pm d.e. de cuatro experimentos independientes.
* Indica P < 0,05 versus control; ** P < 0,01 versus IL-2; *** P < 0,001 versus control o IL-2.
Figura 8. IL-4 previene la apoptosis inducida por fármacos quimioterapéuticos (no es asunto de la invención). Porcentaje de apoptosis de células de cáncer de próstata LNCaP (A) y células de cáncer de mama MDA-MB-231 (B) pretratadas durante dos días con IL-4 o IL-2. Células LNCaP se trataron con 300 ng/ml de cisplatino (izquierda) o 1 \muM de vincristina (derecha) y las células MDA-MB 231 se trataron con 300 ng/ml de cisplatino (izquierda) o 5 \muM de daunorrubicina (derecha). Las células de control (-) se estimularon con fármacos quimioterapéuticos en ausencia de pretratamiento con citoquina. Los resultados representados son el valor medio \pm d.e. de cuatro experimentos independientes.
*** Indica P < 0,001 versus control e IL-2.
IL-4 protege las células de carcinoma contra la apoptosis inducida por CD95. Evaluación de la apoptosis de las células LNCaP (C) y MDA-MB-231 (D) en presencia de IL-4 o IL-2 e incubadas con 30 ng/ml de anticuerpo agonístico anti-CD95. Las células de control (-) se estimularon con anti-CD95 en ausencia de pretratamiento con citoquinas. Los resultados representados son el valor medio \pm d.e. de cuatro experimentos independientes.
* Indica P < 0,05 versus control; ** P < 0,01 versus IL-2; *** P < 0,001 versus control o IL-2.
Figura 9 (no es objeto de la invención). IL-4 regula en sentido creciente los niveles de expresión de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1. Análisis de inmunotransferencia de los niveles de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en LNCaP (A) y MDA-MB-231 (B). Se muestra un experimento representativo de cuatro realizados.
Comparación de la expresión de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en RT112 (C), LNCaP (D) y MDA-MB-231 (E) tratadas con IL-4 versus la expresión exógena de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en células de cáncer transducidas retroviralmente. Los datos muestran el aumento de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en líneas de células tumorales tratadas con IL-4 en comparación con líneas de células tratadas con IL-2 (barras llenas) versus líneas de células sometidas a transducción génica en comparación con líneas de células transducidas con vector vacío (barras vacías).
Las poblaciones de células 100% positivas para la expresión de GFP se analizaron 48 horas después del último ciclo de infección.
Figura 10 (no es asunto de la invención). La expresión exógena de Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 previene las células tumorales contra la apoptosis inducida por quimioterapia. Líneas de células que sobreexpresaban de manera estable Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 se trataron con fármacos quimioterapéuticos como se describe en Fig. 1 y Fig. 2. Las células RT112 se trataron con camptotecina (A) o etoposido (B), las células LNCaP se trataron con cisplatino (C) o vincristina (D), y las células MDA-MB-231 se trataron con cisplatino (E) o daunorrubicina (F). Los resultados representados son el valor medio \pm d.e. de 5 experimentos independientes.
Figura 11 (no es asunto de la invención). La expresión exógena de Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 protege las células tumorales contra la apoptosis inducida por anti-CD95. Líneas de células RT112 (A), LNCaP (B) y MDA-MB-231 (C) que sobreexpresan de manera estable Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 tratadas con anticuerpo agonístico anti-CD95. Los resultados representados son el valor medio \pm d.e. de cinco experimentos independientes.
\newpage
Figura 12 (no es asunto de la invención). Análisis inmunohistoquímico de CD45 e IL-4 sobre secciones normales o secciones de cáncer de vejiga (A); próstata (B) y mama (C) incrustadas en parafina reveladas por AEC (tinción roja).
Figura 13 (no es asunto de la invención). (A) Análisis inmunohistoquímico de Bcl-X_{L}, cFlip/FLAME-1 o IL-4R en secciones de parafina de especímenes normales o de cáncer de vejiga, próstata y mama (color rojo). Expresión exógena de Bcl-X_{L} y cFlip/FLAME-1 en células de cáncer transducidas retroviralmente, RT112 (B), LNCaP (C) y MDA-MB-231 (D) en comparación con células de tumor primario. El análisis de inmunotransferencias de células de cáncer transducidas con vector vacío (vector), con Bcl-X_{L} o cFlip/FLAME-1 (gen) y células de cáncer primario (cáncer). Se muestra un experimento representativo de 3 realizados para cada línea de células.
Figura 14 (no es asunto de la invención). (A) Análisis de inmotransferencia de los niveles de expresión de Bcl-X_{L} en células de cáncer primario sin tratar (C) o tratadas con IL-2 o IL-4. (B) Porcentaje de muerte celular en células sin tratar y pretratadas con IL-4 y expuestas a cisplatino, doxorrubicina o taxol. Las células de control se estimularon con fármacos quimioterapéuticos en ausencia de pretratamiento con citoquinas. (C) Análisis de inmunotransferencias de Bcl-X_{L} en células de cáncer primario preincubadas durante 6 días con o sin IL-4. (D) Porcentaje de muerte celular apoptótica en células de tumor primario incubadas con IL-4 y expuestas a cisplatino, doxorrubicina y taxol.

Claims (7)

1. Uso de un antagonista de IL-4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de tiroides, en combinación con al menos un compuesto activo en el cual el medicamento comprende adicionalmente un antagonista de IL-10, en donde ambos antagonistas son anticuerpos en donde el compuesto activo se selecciona de agentes citostáticos, agonistas de receptores de muerte y reguladores negativos de proteínas antiapoptóticas.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto activo se selecciona del grupo constituido por antimetabolitos, preferiblemente citarabina, fludarabina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina, gemcitabina, hidroxiurea o metotrexato; agentes de fragmentación del DNA, preferiblemente bleomicina, agentes de reticulación del DNA, preferiblemente clorambucil, cisplatino, ciclofosfamida o mostaza nitrogenada; agentes de intercalación, preferiblemente adriamicina (doxorrubicina) o mitoxantrona; inhibidores de la síntesis de proteínas, preferiblemente L-asparaginasa, cicloheximida, puromicina o toxina de la difteria; venenos de topoisomerasa I, preferiblemente camptotecina o topotecán; venenos de topoisomerasa II, preferiblemente etoposido (VP-16) o teniposido; agentes dirigidos a los microtúbulos, preferiblemente colcemid, colchicina, paclitaxel, vinblastina o vincristina; inhibidores de quinasas, preferiblemente flavopiridol, estaurosporina, STI571 (CPG 57148B) o UCN-01 (7-hidroxistaurosporina); agentes de investigación diversos, preferiblemente PS-341, butirato de fenilo, ET-18-OCH_{3}, o inhibidores de la farnesil-transferasa (L-739749, L-744832); polifenoles, preferiblemente quercetina, resveratrol, piceatannol, galato de epigalocatequina, teaflavinas, flavanoles, procianidinas, ácido betulínico; hormonas, preferiblemente glucocorticoides o fenretinida; antagonistas de hormonas, preferiblemente tamoxifeno, finasterida o antagonistas de LHRH; citostáticos derivados de plantas (de Viscum y derivados); alcaloides, preferiblemente vindesina; podofilotoxinas, preferiblemente vinorrelbina; agentes alquilantes, preferiblemente nimustrina, carmustrina, lomustina, estamustrina, melfalam, ifosfamida, trofosfamida, bendamustina, dacarbazina, busulfano, procarbazina, treosulfano, tremozolamida, tiotepa; antibióticos citotóxicos, preferiblemente aclarrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina, dactinomicina; antimetabolitos afines a análogos del ácido fólico, preferiblemente metotrexato, análogos de purina, preferiblemente cladribín, mercaptopurín, tioguanina y análogos de pirimidina, preferiblemente citarabina, fluorouracilo, docetaxel; otros antineoplásticos, compuestos de platino, preferiblemente tioplatino, carboplatino, oxaliplatino; amsacrina, irinotecano, interferón-\alpha, tretinoína, hidroxicarbamida, miltefosina, pentostatina, aldesleuquina; compuestos antineoplásticos derivados de órganos, v.g. anticuerpos monoclonales, preferiblemente trastuzumab, rituximab, o derivados de enzimas, preferiblemente pegaspargasa; compuestos antineoplásticos con efecto endocrino pertenecientes a hormonas, v.g. estrógenos, preferiblemente poliestradiol, fosfestriol, etinilestradiol, gestágenos, preferiblemente medroxiprogesterona, caproato de gestonorona, megestrol, noretisterona, linestrenol, hormonas hipotalámicas, preferiblemente triptorrelina, leuprorrelina, buserelina, goserelina, otras hormonas, preferiblemente testolactona, testosterona; compuestos antineoplásticos con efecto endocrino pertenecientes a los antagonistas de hormonas, v.g. antiestrógenos, preferiblemente toremifeno; antiandrógenos, preferiblemente flutamida, bicalutamida, ciproterano; compuestos antineoplásticos con efecto endocrino pertenecientes a los inhibidores de enzimas, preferiblemente anastrol, exemestano, letrozol, formestano, aminoglutetimida, todos los cuales pueden administrarse ocasionalmente junto con los denominados protectores, preferiblemente folinato de calcio, amifostín, lenograstín, molgromostín, filgrastín, mesna o los denominados aditivos, preferiblemente palmitato de retinol, timo D9 o amilómero.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto activo es un antagonista de receptores de muerte.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agonista de receptores de muerte es un ligando de receptores de muerte seleccionado del grupo constituido por TNF-a, TNF-b, LT-b, TRAIL, ligando CD95, ligando TRAMP, ligando DR6 y fragmentos y derivados de los mismos.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agonista de receptores de muerte es un anticuerpo contra un receptor de muerte, un derivado o fragmento del mismo, seleccionado del grupo constituido por anticuerpo anti-CD95, anticuerpo anti-TRAIL-R1, anticuerpo anti-TRAIL-R2, anticuerpo anti-DR6, anticuerpo anti-TNF-R1 y anticuerpo anti-TRAMP.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto activo es un regulador negativo de proteínas anti-apoptóticas, preferiblemente IAPs.
7. Un medicamento para el tratamiento del cáncer, que comprende un antagonista de IL-4 en combinación con un antagonista de IL-10, en donde ambos antagonistas son anticuerpos y al menos un compuesto activo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el compuesto activo es como se define en la reivindicación 1.
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