ES2254408T3 - Procedimiento de tratamiento de tumores usando terapia fotodinamica. - Google Patents
Procedimiento de tratamiento de tumores usando terapia fotodinamica.Info
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Abstract
Un kit de partes que comprende una proteína de unión a la CD40 y un fotosensibilizador para la administración por separado, simultánea o posterior a un individuo para el tratamiento de un tumor o enfermedad precancerosa.
Description
Procedimiento de tratamiento de tumores usando
terapia fotodinámica.
La presente invención se refiere a métodos para
tratar tumores. En particular, la presente invención implica el
tratamiento de individuos que padecen tumores con terapia
fotodinámica combinada con reactivos adicionales.
La terapia fotodinámica (TFD) es un tratamiento
para el cáncer que implica el uso de un fotosensibilizador y luz.
En esta modalidad de tratamiento, se administra un agente
fotosensibilizador a un individuo que padece cáncer o presenta una
enfermedad precancerosa. Las células cancerosas (y precancerosas)
retienen el fotosensibilizador más fácilmente que los tejidos
normales. La exposición posterior de las células a luz de una
longitud de onda específica induce una reacción fotoquímica que
causa la lesión oxidativa de numerosos componentes celulares y
muerte celular (análisis de Dougherty et al., J. Natl.
Cancer Institute 90: 889; 1998).
La CD40 es una proteína transmembrana que se
expresa en diversas células normales, incluidos los linfocitos B,
los monocitos, algunas células epiteliales y las células
dendríticas, y también en varias líneas celulares de carcinoma
transformadas (Clark, Tissue Antigens, 36: 33 (1990). Un
ligando de la CD40 se expresa en los linfocitos T activados
(Spriggs et al, J. Exp. Med., 176: 1453 (1992);
Armitage et al, Nature, 357: 80 (1992). La
unión de la CD40 y el CD40L causa la proliferación de los linfocitos
B en ausencia de algún coestímulo y la inducción de la secreción de
anticuerpos desde los linfocitos B en presencia de citocinas.
Existen formas solubles del CD40L y anticuerpos
agonistas de la CD40 (esto es, que imitan los efectos biológicos
del CD40L) útiles para el tratamiento de las enfermedades
caracterizadas por células neoplásicas que expresan la CD40, como
los linfomas B, los melanomas y los carcinomas (Patente de Estados
Unidos 5.674.492). El CD40L soluble también se ha utilizado para
promover la proliferación y/o diferenciación de células de sarcoma
CD40 positivas, como medio de tratar directamente la neoplasia
maligna o como adyuvante de la quimioterapia o para aumentar la
respuesta inmunitaria de individuos inmunosuprimidos, como los que
padecen una neoplasia maligna (Patente de Estados Unidos
5.945.513). Además, el CD40L soluble se ha utilizado para estimular
una respuesta inmunitaria del efector T con mediación celular (WO
96/26735).
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un kit de partes que comprenden una proteína de unión
a la CD40 y un fotosensibilizador para la administración por
separado, simultánea o posterior a un individuo para el tratamiento
de un tumor o una enfermedad precancerosa, como se define en las
reivindicaciones adjuntas.
Otro objetivo de la presente invención es el uso
de una proteína de unión a la CD40 en la preparación de un
medicamento para el tratamiento fotodinámico de un individuo que
padece un tumor o una enfermedad precancerosa, como se define en
las reivindicaciones adjuntas.
Estos y otros objetos de la presente invención,
que serán evidentes a partir de la descripción detallada de la
presente invención incluida más abajo, se han alcanzado como se
define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención describe además los métodos
antes identificados de tratamiento de individuos que padecen
tumores y los métodos de inducción de una respuesta de los
linfocitos T citolíticos (CTL) que incluyen además la
administración de otros agentes terapéuticos o activos. Entre esos
agentes terapéuticos o activos se incluyen los que inducen la
muerte de células tumorales y/o apoptosis, los que aumentan el
número de células presentadoras de antígeno, los que estimulan la
maduración de células dendríticas y los que llevan a la expansión y
activación inmunitaria de los linfocitos T efectores. Otros agentes
terapéuticos adecuados son, entre otros: FasL, TRAIL, TNF alfa y
CD30L.
La presente invención describe además,
metodologías in vivo y/o in vitro combinadas con el
kit de partes o el uso antes descrito, que implican la terapia
tumoral de base inmunitaria y/o técnicas de expansión y maduración
de las células dendríticas para optimizar los efectos terapéuticos
antitumorales de la TFD y el CD40L. Más particularmente, la
presente invención describe métodos de tratamiento para los
individuos afectados por tumores que implican la administración de
Fft3L al individuo afectado por el tumor; la administración de la
terapia fotodinámica al individuo y la administración del CD40L al
individuo. También pueden administrarse agentes terapéuticos o
activos adicionales que inducen la muerte de las células tumorales
y/o apoptosis, aumentan en número de células presentadoras de
antígeno y estimulan la maduración de las células dendríticas. La
presente invención describe además metodologías in vitro que
implican la recogida de células dendríticas del individuo, la
expansión de las células dendríticas exponiéndolas a
Flt3-L, la infusión de las células dendríticas en
el individuo, el tratamiento del individuo con terapia fotodinámica
y la administración al individuo de la proteína de unión a la CD40.
Antes de la recogida de las células dendríticas, la administración
de Flt3-L al individuo facilita la movilización de
células dendríticas y aumenta el número de células dendríticas
disponibles para su recogida. Como alternativa, los métodos in
vitro pueden incluir la recogida de células madre o progenitoras
hematopoyéticas y el contacto de las células con
Flt3-L para generar células dendríticas, antes de la
infusión de las células dendríticas generadas en el individuo
afectado por el tumor.
En la presente invención pueden emplearse
diversas proteínas de unión a la CD40, incluido, por ejemplo, un
anticuerpo que se une a la CD40; el CD40L de longitud completa unido
a la membrana; una región extracelular soluble de un CD40L; una
proteína de fusión que comprende una región (o dominio) de un CD40L
de unión a la CD40 o un anticuerpo contra la CD40, unido a una
segunda proteína, por ejemplo, un dominio Fc de la inmunoglobulina
o un dominio con estructura en cremallera.
Entre los anticuerpos contra la CD40 adecuados se
incluyen los anticuerpos contra la CD40 que se unen y se
entrecruzan con la CD40, transduciendo de ese modo una señal. Entre
estos están los anticuerpos monoclonales HuCD40-M2
(ATCC HB11459) y las proteínas de unión a la CD40 que comprenden un
dominio de unión al antígeno derivado del anticuerpo HuCD40M2.
Se considera que en la presente invención, un
procedimiento de muerte o lisis tumoral conocido como terapia
fotodinámica (TFD) induce la muerte celular y conduce a la captación
y presentación del antígeno por parte de las células dendríticas
(CD) en las localizaciones que drenan el tumor en proceso de muerte.
Cuando entran en contacto con una proteína de unión a la CD40,
estas CD portadoras de antígenos tumorales inducen una respuesta de
memoria CTL potente específica del tumor. La respuesta de los CTL
lleva a la erradicación o reducción sustancial de la masa tumoral
remanente. Los métodos descritos en la presente memoria pueden
utilizarse para tratar una gama amplia de tumores y células
precancerosas, incluidas, aunque sin limitarse a ellas, las células
basales y escamosas, las neoplasias malignas de la piel, el cáncer
de mama, las neoplasias malignas que forman metástasis cutáneas,
los tumores cerebrales, de cabeza y cuello, de estómago y las
neoplasias malignas del aparato genital femenino, las neoplasias
malignas y las enfermedades precancerosas del esófago como el
esófago de Barrett.
La presente invención describe la combinación de
la TFD con la administración de la proteína de unión a la CD40 en
un individuo que padece un tumor. En otra realización, los métodos
descritos por la presente invención incluyen además terapias
combinadas de administración de uno o más agentes activos para
aumentar la terapia tumoral de base inmunológica. Más
particularmente, además de la administración de la proteína de unión
a la CD40 combinada con la TFD, la presente invención describe la
administración de uno o más agentes de movilización para aumentar
el número de células dendríticas; y/o la administración de uno o más
agentes para inducir la maduración de las células dendríticas; y/o
la administración de uno o más agentes que estimulan la
proliferación de los linfocitos T.
Las células dendríticas pueden aumentarse in
vivo administrando Flt3L y/o GM-CSF a un
individuo afectado por un tumor. Agentes adecuados para inducir la
maduración de las células dendríticas incluyen el CD40L, el TNF
alfa, el RANKL, el LPS y medio de cultivo acondicionado de
monocitos. Puede administrarse sistémicamente o localmente en la
localización tumoral o cerca de la misma agentes para la maduración
de las células dendríticas. Entre los agentes adecuados para la
estimulación de la proliferación y función de los linfocitos T se
incluyen, entre otros, IL-2, IL-15,
IL-7, IL-12 e IFN gamma. Los agentes
que estimulan la proliferación de los linfocitos T pueden
administrarse sistémicamente o en la vecindad del tumor o los
ganglios linfáticos de drenaje.
Además de los métodos in vivo para generar
células dendríticas y como alternativa a los mismos, es posible
utilizar métodos in vitro para generar células dendríticas a
administrar posteriormente al individuo que padece el tumor. Por
ejemplo, pueden recogerse células CD34+, utilizando los métodos de
recogida y separación conocidos, después de la movilización in
vivo con Flt3L, G-CSF, GM-CSF,
SCF o ciclofosfamida y/o otros agentes de movilización. Las células
dendríticas derivadas de las células CD34+ recogidas pueden
cultivarse in vitro utilizando agentes activos de generación
de células dendríticas como Flt3L, GM-CSF, CD40L e
IL-15. Como alternativa, pueden recogerse PBMC con
el propósito de generar células dendríticas in vitro,
utilizando opcionalmente reactivos como GM-CSF e
IL-4 para generar las células dendríticas. Las
células dendríticas generadas in vitro pueden infundirse en
el individuo afectado por el tumor que recibe la TFD para aumentar
el número de células dendríticas para inducir una respuesta de los
CTL.
Los métodos para la movilización in vivo e
in vitro y la generación de células dendríticas y los métodos
que estimulan la proliferación de los linfocitos T se describen en
el documento WO 97/12633 y las solicitudes pendientes junto con
esta S/N 09/154.903, 09/444.027, 09/448.378.
El procedimiento de muerte o lisis tumoral
utilizado en la presente invención, la TFD, es un tratamiento
antineoplásico que utiliza una reacción fotoquímica para destruir
las células neoplásicas y las células que son precancerosas o
precursoras de células neoplásicas (análisis realizado por Dougherty
et al., J. Natl. Cancer Institute 90: 889; 1998). La
aplicación de la TFD se ajusta a los métodos conocidos en la técnica
que generalmente implican la administración de uno o más
fotosensibilizadores a un individuo afectado por un tumor seguida de
un paso de activación lumínica en el cual se dirige luz de una
longitud de onda específica al tumor donde se fija el
fotosensibilizador.
El efecto citotóxico de la TFD está mediado
primariamente por la formación de oxígeno molecular en estado
singlete generado por la transferencia de energía al oxígeno en
estado fundamental desde un fotosensibilizador activado por la luz
localizado en un tejido. El oxígeno molecular en estado singlete
tiene un radio de acción corto y puede causar lesión oxidativa a
numerosos componentes celulares que se encuentran en el lugar en que
se ha generado o próximo a este (Gollnick et al., Cancer
Res., 57: 3904-3090 (1997)).
La lesión oxidativa mediada por la TFD tiene
diversos efectos sobre las células tumorales, el sistema
microvascular que se encuentra dentro al tumor y próximo éste y
sobre las células del sistema inmunitario. La TFD induce cambios en
la membrana plasmática y las membranas de las organelas celulares de
las células afectadas, aumentando la expresión de algunos genes de
estrés proteico y activando ciertos genes involucrados en la
apoptosis, además de llevar a la liberación de mediadores
inflamatorios potentes. Aunque el papel de los diversos efectos
inducidos por la TFD no está claro, se considera que la combinación
de los efectos es necesaria para la erradicación de las células
cancerosas (Dougherty et al., antes citado).
La fase aguda de la reacción inmunitaria a la TFD
es de naturaleza inflamatoria; sin embargo, el control de los
tumores a largo plazo parece ser el resultado de una inmunidad
antitumoral específica. La eficacia de esa inmunidad específica del
tumor es impredecible debido a que la TFD puede suprimir
significativamente ciertas funciones inmunitarias, en especial
aquellas en las que participan los linfocitos T efectores (Elmets
et al., Cancer Res. 46: 1608-1611
(1986); Simkin et al, Proc. Int. Soc. Optical Eng.,
2392-2333 (1995); Gruner et al, Scand. J.
Immunol., 21: 267-273 (1985)). Se considera que
los efectos supresores involucran la mediación de citocinas
moduladoras inmunitarias, como la IL-6 y la
IL-10 (Gollnick et al, antes citado).
La TFD se ha utilizado con eficacia en el
tratamiento de diversos tumores humanos y enfermedades
precancerosas, incluidas las de células basales y escamosas, los
cánceres de piel, el cáncer de mama, la metástasis cutáneas, los
tumores cerebrales, los de cabeza y cuello y del aparato genital
femenino, los cánceres y las enfermedades precancerosas del esófago
como el esófago de Barrett (Patente de Estados Unidos 6.013.053,
Marcus, En: Future Directions and Applications in Photodynamic
Therapy, Gomer, Ed., Bellingham, WA SPIE Optical Engineering
Press (1990) páginas 5-56 y Overhold et al.,
Sem. Surg. Oncol., 11: 1-5 (1995)).
Entre los ejemplos de un fotosensibilizador útil
que puede emplearse en la presente invención se incluyen las
hematoporfirinas (Kessel, Cancer Lett., 39:
193-198 (1988), las uroporfirinas, las ftalocianinas
(Kreimer-Birnbaum, Sem. Hematol., 26:
157-173 (1989), las purpurinas (Morgan et al,
Photochem. Photobiol., 51: 589-592 (1990) y
Kessel, Photochem. Photobiol. 50: 169-174
(1989), los tintes de acridina, las bacterioclorofilas (Beems et
al, Photochem. Photobiol., 46: 639-643
(1987) y Kessel et al., Photochem. Photobiol., 49:
157-160 (1989) y las bacterioclorinas (Gurinovich
et al., J. Photochem. Photobiol.
B-Biol., 13: 51-57 (1992)).
Los fotosensibilizadores adecuados para el uso en
la presente invención incluyen los resumidos en parte en la Tabla 1
de la patente de Estados Unidos 5.942.534. Una alternativa a la
administración del propio fotosensibilizador, es la de un precursor
de ese compuesto. Por ejemplo, el ácido
5-aminolevulínico causa la producción endógena del
fotosensibilizador protoporfirina IX (Morgan et al., J.
Med. Chem., 32: 904-908 (1989).
La CD40 es un integrante de la familia de
receptores del factor de necrosis tumoral (TNF)/factor de
crecimiento nervioso (NGF) que se ha encontrado expresado en los
linfocitos B, los monocitos, algunas células epiteliales y las
células dendríticas (Clark, Tissue Antigens, 36: 33;
1990). Se ha encontrado que este antígeno de la superficie celular
desempeña un papel importante en la proliferación y diferenciación
de los linfocitos B y en el crecimiento de las células malignas
sobre las cuales se expresa.
El ligando de la CD40 (a partir de ahora
"CD40L") se ha identificado y caracterizado, y el ADN que lo
codifica se ha clonado a partir de linfocitos T de la sangre
periférica (Spriggs et al., J. Exp. Med., 176:
1453 (1992); Armitage et al., Nature, 357: 80 (1992)
y Armitage et al, patentes de Estados Unidos número
5.961.974, 5.962.406 y 5.981.724. La actividad biológica del CD40L
está mediada por la unión de esta citocina a la CD40 e incluye la
proliferación de linfocitos B en ausencia de cualquier coestímulo y
la inducción de secreción de anticuerpos desde los linfocitos B, en
presencia de citocinas.
Según se utiliza en la presente memoria, la
"proteína de unión a la CD40" se refiere a polipéptidos que se
unen específicamente a la CD40 por una interacción no covalente
basada en la conformación correcta de la proteína de unión a la
CD40 y la propia CD40. Preferiblemente, la proteína de unión a la
CD40 tiene actividad agonista, es decir, que imita al ligando
nativo de la CD40 (CD40L) que está presente en los linfocitos T
activados por su unión a un linfocito que expresa la CD40 y la
transducción de la señal a la misma. Las determinaciones de las
actividades biológicas del CD40L son útiles para evaluar la
actividad agonista. Otros métodos para medir la actividad agonista
de una proteína de unión a la CD40 incluyen el análisis de la
proteína de unión a la CD40 para evaluar su capacidad de inhibir la
unión de la CD40 al CD40L. Según se ha determinado observando como
mínimo aproximadamente el 90% de inhibición de la unión de la CD40
soluble al CD40L, las proteínas de unión a la CD40 que se unen a la
CD40 e inhiben la unión de la CD40 al CD40L, tienen actividad
agonista.
Entre las proteínas de unión a la CD40 útiles en
la presente invención se incluyen anticuerpos contra la CD40
(incluidos los anticuerpos humanizados o los anticuerpos que se han
manipulado por medios recombinantes para hacerlos más adecuados
para el uso terapéutico), el CD40L, el CD40L soluble y las proteínas
de fusión que comprenden un CD40L soluble o un anticuerpo contra la
CD40 y una segunda proteína. Más particularmente, las proteínas de
unión a la CD40 incluyen anticuerpos contra la CD40 que se
entrecruzan con la CD40 y transducen una señal; el CD40L de
longitud completa; las formas oligoméricas solubles del CD40L o los
fragmentos del mismo que se unen a la CD40 (p. ej., el dominio
extracelular del CD40L y los fragmentos del mismo); las proteínas
de fusión del CD40L, p. ej., las fusiones solubles del CD40L/Fc y
las fusiones en cremallera de la CD40L/leucina. Las formas
oligoméricas solubles del CD40L incluyen el dominio extracelular del
CD40L o los fragmentos del dominio extracelular que se unen a la
CD40 que están en una forma oligomérica. Uno de esos ejemplos del
CD40L oligomérico soluble es el fragmento de dominio extracelular
de los aminoácidos 113-261 de la SEC. ID nº: 2 y la
cremallera de leucina de la SEC. ID nº: 3. Cuando el fragmento y la
cremallera de leucina se combinan, se produce una forma oligomérica
del CD40L.
El CD40L de longitud completa incluye
polipéptidos que comprenden los aminoácidos 1 a 260 de la SEC. ID
nº: 1 y los aminoácidos 1 a 261 de la SEC. ID nº: 2. Las formas
solubles del CD40L incluyen aminoácidos 47 a 260, 113 a 260 y 120 a
260 de SEC. ID nº:1 y los aminoácidos 47 a 261, 112 a 261, 113 a 261
y 120 a 261 de SEC. ID nº:2. Además, las proteínas de unión a la
CD40 incluyen fragmentos del dominio extracelular del CD40L (SEC.
ID nº: 1 y SEC. ID nº: 2) que se unen a la CD40. Esa unión es
suficiente para inhibir la unión de la CD40 soluble al CD40L, según
se ha determinado por la observación de como mínimo aproximadamente
el 90% de la inhibición de la unión de la CD40 soluble al
CD40L.
Entre las realizaciones alternativas del
polipéptido CD40L, los polipéptidos solubles CD40L y fragmentos
adecuados de los mismos se incluyen polipéptidos en los cuales se
sustituye una cisteína del aminoácido 194 de la SEC. ID nº:2 por
triptofano. Otras realizaciones más comprenden el polipéptido CD40L
y los polipéptidos solubles CD40L que están codificados por el
complemento del ADN que hibridiza a un ADN que codifica cualquiera
de los polipéptidos antes mencionados en condiciones muy rigurosas
(hibridización en 6 X SSC a 63ºC durante toda una noche; lavado en
3 X SSC a 55ºC) y que se une a la CD40 soluble. Esa unión es
suficiente para inhibir la unión de la CD40 soluble al CD40L,
según se ha determinado por la observación de por lo menos el 90%,
aproximadamente, de la inhibición de a unión de la CD40 soluble al
CD40L.
Una proteína de unión a la CD40 preferida es un
CD40L oligomérico soluble en el cual la porción soluble es un
fragmento del dominio extracelular oligomerizado de la SEC. ID nº: 2
y la cisteína del aminoácido 194 se sustituye por triptofano.
Preferiblemente el CD40L oligomérico soluble incluye un dominio de
oligomerización en cremallera (p. ej., cremallera de leucina) como
el de la SEC. ID nº: 3 o un péptido variante en el cual se han
realizado sustituciones conservadoras de los aminoácidos, en las que
el péptido es capaz de formar una proteína oligomérica soluble de
fusión a la CD40. Una proteína oligomérica soluble de fusión en
cremallera CD40L/leucina como tal incluye un polipéptido que tiene
los aminoácidos 113-261 de la SEC ID nº: 2 y la
leucina en cremallera de la SEC. ID nº: 3 (CD40L/LZ).
También se describen métodos de expresión de los
polipéptidos CD40L recombinantes en las patentes Armitage. Pueden
utilizarse métodos similares para la expresión de otras proteínas de
unión a la CD40. Además, quienes son expertos en la técnica de la
biología molecular conocen numerosos sistemas de expresión,
incluidos los sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos.
Los sistemas de expresión seleccionados pueden afectar la
naturaleza de la proteína recombinante de unión a la CD40 expresada.
Por ejemplo, el CD40L expresado en sistemas de expresión en
mamíferos (p. ej., en células COS7) puede ser similar a un CD40L
nativo en cuanto a peso molecular y patrón de glucosilación,
mientras que el CD40L expresado en levadura puede estar más
glucosilado que el CD40L nativo. La expresión del CD40L en los
sistemas de expresión bacterianos como E. coli, proporciona
moléculas no glucosiladas.
Los anticuerpos contra la CD40 que pueden
emplearse en la presente invención pueden ser policlonales o
monoclonales. El anticuerpo contra la CD40 agonista particular
utilizado en la presente invención no es crítico para el mismo.
Ejemplos de esos anticuerpos contra la CD40 son el
HuCD40-M2 (ATCC nº HB11459) y el
HuCD40-M3 y los dominios de unión al antígeno de
los mismos. Otros anticuerpos monoclonales contra la CD40 que
pueden utilizarse en la presente invención pueden generarse
utilizando las técnicas convencionales (véanse las patentes de
Estados Unidos RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993. También
pueden construirse anticuerpos agonistas útiles utilizando técnicas
de ADN recombinante para "humanizar" un anticuerpo murino o
preparar anticuerpos de cadena simple como los descritos en la
patente de Estados Unidos 5.801.227.
Una vez que se hayan obtenido las proteínas de
unión a la CD40, pueden aislarse o purificarse mediante muchas
técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica. Entre las
técnicas adecuadas se incluyen las columnas de afinidad peptídicas
o proteicas, la HPLC o la RP-HPLC, la purificación
en columnas de proteína A o proteína G o cualquier combinación de
estas técnicas. Puede preparase proteínas de unión a la CD40
recombinantes según los métodos habituales y probarse la
especificidad de la unión a la CD40 utilizando determinaciones
conocidas en la técnica incluidas, por ejemplo, las determinaciones
ELISA, ABC o de inmunotransferencia (dot blot), además de
las determinaciones de bioactividad como las descritas para el
anticuerpo monoclonal CD40.
La proteína de unión a la CD40 puede
administrarse en un diluyente o vehículo a un individuo,
preferiblemente un ser humano. Por lo tanto, por ejemplo, la
proteína de unión a la CD40 puede administrarse por inyección en
bolo, subcutánea o IP, infusión continua, infusión i.v.
intermitente, implantes de liberación sostenida u otra técnica
adecuada.
Típicamente una proteína de unión a la CD40 se
administrará en la forma de una composición farmacéutica que
comprende una proteína de unión a la CD40 purificada junto con
vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables.
Esos vehículos son atóxicos para los individuos a las dosis y las
concentraciones empleadas. Normalmente, la preparación de esas
composiciones supone la combinación de una proteína de unión a la
CD40 con tampones, antioxidantes como el ácido ascórbico,
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
residuos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono que incluyen
la glucosa, la sacarosa o los dextranos, agentes quelantes como
EDTA, glutation y otros estabilizadores y excipientes. La solución
salina neutra tamponada o la solución salina mixta con albúmina
sérica de la misma especie son ejemplos de diluyentes adecuados.
La cantidad terapéuticamente eficaz particular
empleada no es crítica para la presente invención y variará
dependiendo de la proteína de unión a la CD40 concreta seleccionada,
el tipo, la frecuencia y la intensidad de TFD, además de la edad,
el peso y el sexo del individuo. Típicamente, las dosis eficaces
terapéuticamente (dosis que proporcionan actividad antineoplásica o
dosis suficientes como para proporcionar un aumento de la respuesta
de los CTL) de las proteínas de unión a la CD40 estarán comprendidas
en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0
mg/kg de peso corporal. Más típicamente las dosis se encuentran
comprendidas en el intervalo de los 0,05 a 0,2 mg/kg de peso
corporal. Como se describe más abajo, la administración de la
proteína de unión a la CD40 puede realizarse uno o más días antes de
la administración de la TFD, continuarse durante un periodo en el
cual sea eficaz el aumento de la respuesta de los CTL y el aumento
de la respuesta inmunitaria y/o el aumento de la maduración de las
células presentadoras de antígeno. Como alternativa, la
administración de la proteína de unión a la CD40 puede comenzar el
día de la TFD o los días posteriores. En cualquier caso, se
prefiere que la proteína de unión a la CD40 esté presente para
aumentar una respuesta inmunitaria simultáneamente o inmediatamente
después de la TFD.
Las proteínas de unión a la CD40 también pueden
utilizarse en conjugados o combinadas con fármacos, toxinas o
compuestos radiactivos. La preparación de esos conjugados para el
tratamiento de diversas enfermedades es conocida en la técnica
(véase, por ejemplo, Waldmann, Science, 252: 1657
(1991)).
La terapia fotodinámica o TFD se realiza por
métodos conocidos en la técnica. Los métodos para administrar la
TFD se describen en Dougherty et al., J. Natl. Cancer
Institute 90: 889; 1998. Esos métodos incluyen la
administración de un fotosensibilizador o una mezcla de
fotosensibilizadores, seguida de la exposición del individuo (el
área corporal afectada) a la luz que es absorbida por el
fotosensibilizador. Tras la absorción de la luz, el
fotosensibilizador se excita y causa la generación de oxígeno
molecular en estado singlete. El oxígeno en estado singlete es muy
tóxico, pero tiene un radio de acción muy corto. En la técnica se
conocen diversas modalidades de administración de un
fotosensibilizador y serán útiles en la presente invención. Por
ejemplo, el fotosensibilizador puede administrarse por vía oral, por
vía tópica, por vía parenteral o localmente (es decir, directamente
dentro de un tumor o zona precancerosa o cerca de la misma). Los
fotosensibilizadores también pueden administrarse utilizando
vehículos como vesículas de fosfolípidos o emulsiones oleosas. El
uso de vehículos basados en lípidos puede resultar en el aumento de
la acumulación del fotosensibilizador en células neoplásicas.
Métodos alternativos de administración que también pueden estar
comprendidos en la presente invención incluyen el uso de
microesferas o anticuerpos monoclonales u otras proteínas que se
unen específicamente a una proteína (o proteínas) localizada sobre
la superficie de las células neoplásicas.
El fotosensibilizador particular utilizado no es
crucial para la presente invención. En la presente memoria se
describen ejemplos de fotosensibilizadores útiles en la presente
invención que incluyen hematoporfirinas, uroporfirinas,
ftalocianinas, purpurinas, tinturas acridinas, bacterioclorofilas,
bacterioclorinas y otras. Un fotosensibilizador preferido empleado
es Photofrin® (QLT, Vancouver, Canadá); en la presente memoria se
describen otros ejemplos y se comentan en Dougherty et al,
además de varios recursos más aquí descritos.
La cantidad de fotosensibilizador administrada
variará dependiendo del fotosensibilizador particular empleado, la
edad, el peso y el sexo del individuo, el modo de administración,
además del tipo, el tamaño y la localización del tumor. Por
ejemplo, Photofrin® puede utilizarse a dosis de 2,0 o 2,5 mg por kg
de peso corporal. La dosis de otros tipos de fotosensibilizadores
puede variar, dentro de un intervalo de 0,3 a 7,2 mg por kg de peso
corporal. Conforme a ello, los expertos en la técnica son capaces de
determinar las dosis preferidas de varios agentes
fotosensibilizadores después de examinar la información de
dosificación correspondiente del fabricante y/u otros expertos en
el campo.
La longitud de onda de la luz a la cual se expone
el individuo variará dependiendo del fotosensibilizador empleado y
la localización y la profundidad del tumor o las células
precancerosas. Por lo general, el individuo se expondrá a luz de
una longitud de onda de aproximadamente 600 a 900 nm,
preferiblemente de aproximadamente 600 a aproximadamente 640 nm
para Photofrin®. Varios agentes fotosensibilizadores más tienen
absorbancias más intensas a longitudes de onda mayores, desde
aproximadamente 650 a 850 nm, que pueden ser ventajosas para los
tumores más profundos porque la luz de longitud de onda más larga
penetra más dentro del tejido. Por el contrario, una longitud de
onda de aproximadamente 410 nm puede dar resultados mejores cuando
se desea una penetración poco profunda; esas dosis también están
comprendidas dentro del alcance de la presente invención.
La dosis de luz a la cual se expone el individuo
variará dependiendo del fotosensibilizador empleado. Por lo
general, el individuo se expondrá a una dosis de luz de
aproximadamente 50 a 500 J/cm^{2} de luz roja para Photofrin®.
Otros sensibilizadores pueden ser más eficientes y, por lo tanto,
requerir flujos menores, típicamente aproximadamente una densidad
de flujo de 10 J/cm^{2}. A densidades de flujo mayores, puede
producirse hipertermia, que puede aumentar la TFD; además, la
hipertermia y la TFD pueden actuar sinérgicamente. En la técnica se
conocen varias fuentes de luz diferentes; cualquier fuente de luz
adecuada capaz de administrar una dosis adecuada de una longitud de
onda seleccionada puede utilizarse en los métodos de la
invención.
El tiempo de exposición a la luz dependerá del
fotosensibilizador utilizado, la naturaleza y la localización del
tumor o de las células precancerosas y de los métodos de
administración. Típicamente, la exposición a la luz se produce a
aproximadamente una hora a cuatro días después de la administración
del fotosensibilizador. Por otra parte, puede utilizarse periodos
más cortos, dependiendo nuevamente del fotosensibilizador y de la
naturaleza y la localización del tumor. Por ejemplo, la exposición a
la luz después de la administración tópica de un fotosensibilizador
puede producirse tan temprano como diez minutos o aproximadamente
tres horas después de la administración (véase la patente de
Estados Unidos 6.011.563).
Los kits integrados por partes y el uso de la
presente invención incluyen uno o más agentes activos a administrar
para mejorar la inmunoterapia antitumoral. Más particularmente,
además de la administración de la proteína de unión a la CD40
combinada con TFD, la presente invención describe la administración
de uno o más agentes de movilización para aumentar el número de
células dendríticas; y/o la administración de uno o más agentes
para inducir la maduración de las células dendríticas; y/o la
administración de uno o más agentes que estimulan la proliferación
de células T, la expansión y la activación inmunitaria de los
linfocitos T efectores.
Las células dendríticas pueden aumentarse in
vivo administrando Flt3L (descrito en la patente de Estados
Unidos 5.554.512) y/o GM-CSF al individuo que
padece un tumor. Por ejemplo, antes de administrar la TFD a un
individuo que padece un tumor, puede administrarse
Flt3-L durante un periodo de aproximadamente 2 días
a 18 días y preferiblemente durante 10 a 14 días a una dosis de 5
\mug/kg a 250 \mug/kg y preferiblemente desde 25 \mug/kg a 150
\mug/kg. Como alternativa, puede administrarse Flt3L a niveles
que varían entre los 50 \mug/kg y los 450 \mug/kg cada 5
días.
Además de los métodos para generar células
dendríticas in vivo o como alternativa a los mismos, las
células dendríticas pueden generarse utilizando métodos in
vitro y administrándolas posteriormente al individuo que padece
el tumor. Por ejemplo, antes de la administración de la TFD y
posteriormente al uso de la movilización in vivo con Flt3L,
G-CSF, GM-CSF, ciclofosfamida, SCF
y/o otros agentes de movilización, pueden recogerse las células
CD34+, las células madre o progenitoras utilizado los métodos de
recogida y separación de células conocidos. Las células dendríticas
derivadas de las CD34+, las células madre o progenitoras recogidas
pueden cultivarse in vitro utilizando agentes activos
conocidos de generación de células como Flt3L,
GM-CSF, CD40L u otra proteína de unión a la CD40 e
IL-15. Como alternativa pueden recogerse PBMC con el
propósito de generar células dendríticas in vitro. Las
células dendríticas generadas in vitro pueden infundirse
dentro del individuo que presenta el tumor que recibe TFD para
aumentar el número de células dendríticas para inducir una respuesta
CTL. El medio de cultivo celular que incorpora
Flt3-L y/o otros agentes para la generación in
vitro y la movilización de las células dendríticas incluye
estos agentes en cantidades suficientes como para mantener el número
de células dendríticas para la posterior infusión al individuo que
padece el tumor o el individuo que presenta una enfermedad
precancerosa. Esas cantidades pueden variar entre 0,1 \mug/mL a 5
\mug/mL y típicamente son de aproximadamente 2 \mug/mL.
Los métodos para la movilización y generación
in vivo e in vitro de células dendríticas para
estimular la proliferación de linfocitos T se describen en el
documento WO 97/12.633 y las solicitudes pendientes junto con esta
S/N 09/154.903, 09/444.027, 09/448.378.
De acuerdo con la presente invención, es posible
administrar proteínas de unión a la CD40 para estimular la
maduración de las CD, aumentando su capacidad de estimular una
respuesta antitumoral citotóxica eficaz, específica. Pueden
utilizarse las proteínas de unión a la CD40 junto con otros factores
de maduración de CD, como TNF-alfa, un ligando para
el activador del receptor del NF-kappaB (RANKL) y
sustancias como lipopolisacárido. Además, pueden utilizarse los
agentes que aumentan una respuesta CTL junto con la proteína de
unión a la CD40. Esos agentes incluyen las interleucinas 2, 15, 7 y
12 y los interferones gamma y alfa. Los agentes de maduración de
células dendríticas pueden administrarse sistémicamente o localmente
y en la localización del tumor o cerca del mismo. Las dosis de las
proteínas de unión a la CD40 y específicamente las formas solubles
oligoméricas de la CD40L pueden variar entre 0,01 mg/kg y 1 mg/kg,
y se encuentran preferiblemente en el intervalo de los 0,05 mg/kg y
los 0,2 mg/kg. La dosificación puede variar frecuentemente desde
cada día a día por medio y puede limitarse a una vez a la semana
cuando la modalidad de administración favorece esa frecuencia (por
ejemplo, la administración intravenosa).
El uso de una proteína de unión a la CD40 junto
con la TFD, de acuerdo con la presente invención, significa que la
proteína de unión a la CD40 puede administrarse antes, durante o
después de la TFD. Preferiblemente, una proteína de unión a la
CD40 debe administrase después de la TFD, más preferiblemente la
administración de la proteína de unión a la CD40 comienza el día de
la administración de la TFD o aproximadamente uno o dos días
después de la misma. Además, la combinación de una proteína de unión
a la CD40 y la TFD puede complementarse con el uso de agentes
activos adicionales como los descritos en la presente memoria.
Pueden administrarse agentes activos adicionales en el mismo
momento, antes o después de la administración de la proteínas de
unión a la CD40, según sea conveniente para el agente y el
resultado deseado. Por ejemplo, FasL, TRAIL, CD30L y TNF alfa
pueden administrarse junto con la proteína de unión a la CD40. La
presencia de estos agentes activos en terapias combinadas mejora
las características de erradicación del tumor de la combinación de
la proteína de unión a la CD40 y la TFD. En una realización, el
agente activo o los agentes activos deben administrarse dentro del
tumor o cerca del mismo.
La TFD es un proceso completamente diferente de
la radioterapia (irradiación ionizante), la quimioterapia y la
cirugía y, por lo tanto, el uso de la TFD no se imposibilita por la
radioterapia previa, la quimioterapia o la cirugía (Hsi et
al, Drugs, 57: 7250734 (1999); y McCaughan, Drugs
& Aging, 15: 49068 (1999)); por lo tanto, puede utilizarse
junto con esos procesos (es decir, antes, durante o después de un
proceso alternativo como la radioterapia). La toxicidad
relativamente baja de la TFD también la hace adecuada como una forma
repetible de terapia. Además, las mejoras descritas en la presente
memoria pueden hacer posible reducir más los efectos secundarios al
disminuir la cantidad de fotosensibilizador o la dosis de luz
necesaria.
Estos resultados presentados en la presente
memoria indican que las proteínas de unión a la CD40 pueden tener
un uso clínico importante en el tratamiento de varios tumores. El
término tratamiento, como se entiende por lo general en la técnica,
se refiere al inicio de una terapia después de haberse observado los
síntomas o signos clínicos de la enfermedad. En una realización, el
tumor puede expresar la CD40, por ejemplo, los linfomas B, los
melanomas o los sarcomas. En otra realización, el tumor no expresa
la CD40. Ejemplos de esos tumores incluyen los linfomas y las
leucemias de linfocitos T, muchos tumores de tejidos conectivos y
neuroblastomas.
Además, la presente invención será útil en el
tratamiento de las enfermedades precancerosas (como el esófago de
Barrett) para las cuales puede emplearse la TFD. Cuando se utilizan
de esta manera, los métodos de la invención descritos en la
presente memoria pueden considerarse medidas preventivas en lugar de
un tratamiento estrictamente definido para un individuo
afectado.
La presente invención puede utilizarse junto con
otras terapias adecuadas para los individuos afectados, incluidas
la quimioterapia, la radioterapia y la inmunoterapia.
Los ejemplos siguientes tienen la intención de
ilustrar realizaciones particulares y no limitan el ámbito de la
invención.
Este ejemplo demuestra que la respuesta de
protección antitumoral inducida por la TFD in vivo depende de
la interacción CD40:CD40L. Ratones hembra BALB/c (n = 45) se
inocularon subcutáneamente (S.C.) con 5,0 X 10^{4} células EMT6
de carcinoma mamario de ratones BALB/c. El día 6 después de la
inoculación, 30 de los ratones portadores del tumor se inocularon
por vía intraperitoneal (I.P.) con Photofrin® (un fotosensibilizador
adquirido a QLT, Vancouver, Canadá) a una dosis de 5,0 mg/kg. El
resto de los ratones portadores del tumor no recibió Photofrin®
(control negativo). Al día siguiente (día 7), 15 de los ratones
portadores de tumor a los cuales se inyectó Photofrin se trataron
con 135 J/cm^{2} de luz roja con una longitud de onda de 630 nm.
Se eliminaron quirúrgicamente los tumores de los 15 ratones
portadores de tumor restantes inyectados con Photofrin que no se
expusieron a la luz roja. Inmediatamente después del tratamiento de
luz o la cirugía, 5 ratones de cada grupo de tratamiento recibieron
200 \mug de de IgG de rata (Sigma) por vía intraperitoneal, 200
\mug de M158 monoclonal anti-muCD40L de rata
(Immunex Corporation, Seattle, WA) o ninguna inyección de
anticuerpo. Estas inyecciones de anticuerpo se repitieron los días
8, 10 y 12. El grupo de ratones de control negativo también recibió
inyecciones de anticuerpos los días 7, 8, 10 y 12. El día 13, se
aislaron células de ganglios linfáticos de todos los grupos de
tratamiento y se mezclaron con células tumorales EMT6 frescas a
razón de 500 células de ganglios linfáticos a 1 célula tumoral, es
decir, 2,5 x 10^{6} células de ganglios linfáticos y 5,0 x
10^{4} células EMT6, y la mezcla resultante se inyectó por vía
subcutánea a los ratones BALB/c no portadores de tumor. La
incidencia de tumor y el crecimiento tumoral se vigiló desde el día
18 hasta el día 90. Los resultados se presentan en la Tabla 1
siguiente:
| Terapia antitumoral | Tratamiento con anticuerpos | Presencia de tumor (% incidencia) el día 90 |
| Ninguna | Ninguno | 5/5 (100%) |
| Ninguna | IgG de rata | 4/5 (80%) |
| Ninguna | M158 anti-CD40L | 5/5 (100%) |
| TFD | Ninguno | 1/5 (20%) |
| TFD | IgG de rata | 0/5 (0%) |
| TFD | M158 anti-CD40L | 3/5 (60%) |
| Extirpación quirúrgica | Ninguno | 4/5 (80%) |
| Extirpación quirúrgica | IgG de rata | 5/5 (100%) |
| Extirpación quirúrgica | M158 anti-CD40L | 4/5 (80%) |
Como se observa en la Tabla 1, el tratamiento de
los ratones portadores de tumor con TFD indujo una respuesta
inmunitaria antitumoral intensa que se transfirió a los ratones que
nunca habían recibido tratamiento provocados por un tumor EMT6;
9/10 o el 90% de los tumores que recibieron terapia TFD presentaron
una respuesta inmunitaria antitumoral protectora. Sin embargo, la
administración de M158, un anticuerpo específico de muCD40L que
neutraliza la actividad biológica del CD40L a los ratones después
de la terapia TFD evitó el desarrollo de una respuesta inmunitaria
antitumoral protectora en el 60% de los ratones. La proteína IgG de
rata de control no alteró el desarrollo de la inmunidad antitumoral
inducida por la TFD. La eliminación quirúrgica del tumor tampoco
indujo una respuesta inmunitaria protectora.
Estos resultados indican que se requiere una
función CD40L para el desarrollo de la respuesta inmunitaria
antitumoral protectora que se produce después del tratamiento con
TFD. El hecho de que el CD40L sea biológicamente importante en la
generación de inmunidad antitumoral protectora in vivo
inducida por TFD es una observación importante y novedosa. La TFD
es un tratamiento único, por lo tanto puede utilizarse cuando la
cirugía, la quimioterapia y/o la radioterapia no han eliminado el
cáncer. La combinación de TFD con la administración de una proteína
de unión a la CD40 debe mejorar significativamente la respuesta
inmunitaria antitumoral in vivo a diversos tumores.
Este ejemplo demuestra que la administración de
una proteína de unión a la CD40 (CD40L soluble, trimérica
denominada CD40LT) a individuos que padecen un tumor junto con TFD
in vivo mejora el tratamiento antitumoral. Se inoculan
ratones hembra BALB/c por vía subcutánea (S.C.) con células
tumorales derivadas de un tumor débilmente inmunógeno. Se deja
crecer las células tumorales durante un tiempo suficiente como para
establecer un tumor que no puede erradicarse totalmente con TFD;
una parte de los ratones reciben inyección intraperitoneal (I.P.)
de Photofrin® (un fotosensibilizador adquirido a QLT, Vancouver,
Canadá) a una dosis de 5,0 mg/kg. El resto de los ratones
portadores de tumor no recibe Photofrin® (control negativo). El día
posterior a la administración de Photofrin®, la mitad de los
ratones portadores de tumor inyectados con Photofrin se trata con
135 J/cm^{2} de luz roja con una longitud de onda de 630 nm. Se
eliminan quirúrgicamente los tumores del resto de los ratones
portadores de tumor inyectados con Photofrin que no se expusieron a
luz roja. Dentro del plazo de uno o dos días posteriores al
tratamiento de luz o la cirugía, la mitad de los ratones de cada
grupo de tratamiento recibe 200 \mug de IgG de rata (Sigma) por
vía intraperitoneal o CD40LT. Se vigila la incidencia tumoral y el
crecimiento tumoral según se requiera. La siguiente tabla presenta
una matriz de tratamiento utilizada para asignar un número adecuado
de ratones a cada grupo.
| Terapia antitumoral | Tratamiento con anticuerpos |
| Ninguna | IgG de rata |
| Ninguna | CD40LT |
| TFD | IgG de rata |
| TFD | CD40LT |
| Extirpación quirúrgica | IgG de rata |
| Extirpación quirúrgica | CD40LT |
<110> Immunex Corporation
\hskip1cmFanslow III, William C.
\hskip1cmThomas, Elaine K.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES
UTILIZANDO TERAPIA FOTODINÁMICA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2922-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> -pendiente de asignación-
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-04-24
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
Claims (37)
1. Un kit de partes que comprende una
proteína de unión a la CD40 y un fotosensibilizador para la
administración por separado, simultánea o posterior a un individuo
para el tratamiento de un tumor o enfermedad pre-
cancerosa.
cancerosa.
2. Un kit de partes como el reivindicado en
la reivindicación 1, en el que el kit comprende además un agente
activo seleccionado del grupo constituido por:
- a)
- FasL,
- b)
- CD30L,
- c)
- TRAIL, y
- d)
- TNF alfa.
3. Un kit de partes como el reivindicado en
la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que dicha
proteína de unión a la CD40 se selecciona de un grupo compuesto
por:
- a)
- Un anticuerpo contra la CD40,
- b)
- CD40L,
- c)
- CD40L soluble, y
- d)
- una proteína oligomérica de fusión CD40L soluble que comprende 1) un CD40L soluble o un anticuerpo contra la CD40 y 2) una segunda proteína.
4. Un kit de partes como el reivindicado en
la reivindicación 3, el cual dicho anticuerpo contra la CD40 se
selecciona de un grupo constituido por un anticuerpo monoclonal
HuCD40-M2 (ATCC HB11459) y anticuerpos que
presentan un dominio de unión al antígeno del anticuerpo
HuCD40M2.
5. Un kit de partes como el reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha proteína
de unión a la CD40 se selecciona de un grupo constituido por:
- a)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 260 de la SEC. ID nº 1, 47 a 260 de la SEC. ID nº: 1, 113 a 260 de la SEC. ID nº 1 o 120 a 260 de la SEC. ID nº 1.
- b)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 261 de la SEC. ID nº 2, 47 a 261 de la SEC. ID nº: 2, 112 a 261 de la SEC. ID nº 2, 113 a 261 de la SEC. ID. Nº 2 o 120 a 261 de la SEC. ID nº 2.
- c)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de los polipéptidos de la SEC. ID nº 1 en el que el fragmento se une a la CD40.
- d)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de los polipéptidos de la SEC. ID nº 2 en el que el fragmento se une a la CD40.
- e)
- Un polipéptido conforme a (b) o (c) en el que la cisteína del aminoácido 194 de la SEC. ID nº 2 se sustituye por triptofano, y
- f)
- Un polipéptido codificado por el complemento de un ADN que se hibridiza a ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos (a)-(e) en condiciones muy rigurosas (hibridización en 6 X SSC a 63ºC durante toda una noche; lavado en 3 X SSC a 55ºC) en el que el polipéptido codificado se une a la CD40 soluble.
6. Un kit de partes como el reivindicado en
la reivindicación 3, en el que dicha segunda proteína se selecciona
del grupo constituido por un dominio Fc de la inmunoglobulina y un
dominio de oligomerización en cremallera.
7. Un kit de partes como el reivindicado en
la reivindicación 6, en el que el dominio de oligomerización en
cremallera se selecciona del grupo constituido por:
- a)
- Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID nº 3, y
- b)
- Una variante del péptido de (a), en la que la variante consiste esencialmente del péptido de (a) con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras, en la que la variante es capaz de formar una proteína oligomérica de fusión al CD40L.
8. Un kit de partes como el reivindicado en
la reivindicación 1, en el que la proteína de unión a la CD40
comprende los aminoácidos 113 a 261 de la SEC. ID nº 2 y el
péptido de la SEC. ID nº 3.
9. Un kit de partes como el reivindicado en
la reivindicación 3 en el que la CD40 oligomérica soluble comprende
los aminoácidos 113-261 de la SEC. ID nº 2 y el
péptido de la SEC. ID nº 3, en el que la cisteína del aminoácido
194 de la SEC. ID nº; 2 se sustituye por triptofano.
10. Un kit de partes como el reivindicado en las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho tumor se selecciona del
grupo constituido por un linfoma B, un melanoma y un carcinoma.
11. El uso de una proteína de unión a la CD40 en
la preparación de un medicamento para el tratamiento fotodinámico
de un individuo que padece un tumor o una enfermedad
precancerosa.
12. El uso como en la reivindicación 11 en el que
el medicamento comprende adicionalmente un agente activo,
seleccionado del grupo comprendido por:
- e)
- FasL,
- f)
- CD30L,
- g)
- TRAIL, y
- h)
- TNF alfa.
13. El uso como en la reivindicación 11 en el que
dicha proteína de unión a la CD40 se selecciona del grupo
comprendido por:
- e)
- Un anticuerpo contra la CD40,
- f)
- CD40L,
- g)
- CD40L soluble, y
- h)
- una proteína oligomérica de fusión CD40L soluble que comprende 1) un CD40L soluble o un anticuerpo contra la CD40 y 2) una segunda proteína.
14. Uso como el reivindicado en la reivindicación
13 en el que dicho anticuerpo contra la CD40 se selecciona de un
grupo constituido por un anticuerpo monoclonal
HuCD40-M2 (ATCC HB11459) y anticuerpos que presentan
un dominio de unión al antígeno del anticuerpo HuCD40M2.
15. Uso como el reivindicado en una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 14, en el que dicha proteína de unión a
la CD40 se selecciona de un grupo constituido por:
- g)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 260 de la SEC. ID nº 1, 47 a 260 de la SEC. ID nº: 1, 113 a 260 de la SEC. ID nº 1 o 120 a 260 de la SEC. ID nº 1.
- h)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 261 de la SEC. ID nº 2, 47 a 261 de la SEC. ID nº: 2, 112 a 261 de la SEC. ID nº 2, 113 a 261 de la SEC. ID. Nº 2 o 120 a 261 de la SEC. ID nº 2.
- i)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de los polipéptidos de la SEC. ID nº 1 en el que el fragmento se une a la CD40,
- j)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de los polipéptidos de la SEC. ID nº 2 en el que el fragmento se une a la CD40.
- k)
- Un polipéptido conforme a (b) o (c) en el que la cisteína del aminoácido 194 de la SEC. ID nº 2 se sustituye por triptofano, y
- l)
- Un polipéptido codificado por el complemento de un ADN que se hibridiza a ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos (a)-(e) en condiciones muy rigurosas (hibridización en 6 X SSC a 63ºC durante toda una noche; lavado en 3 X SSC a 55ºC) en el que el polipéptido codificado se une a la CD40.
16. Uso como el reivindicado en la reivindicación
13, en el que dicha segunda proteína se selecciona del grupo
constituido por un dominio Fc de la inmunoglobulina y un dominio de
oligomerización en cremallera.
17. Uso como el reivindicado en la reivindicación
16, en el que el dominio de oligomerización en cremallera se
selecciona del grupo constituido por:
- c)
- Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID nº 3, y
- d)
- Una variante del péptido de (a), en la que la variante consiste esencialmente en el péptido de (a) con una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, en la que la variante es capaz de formar una proteína oligomérica de fusión al CD40L.
18. Uso como el reivindicado en la reivindicación
11, en el que la proteína de unión a la CD40 comprende los
aminoácidos 113 a 261 de la SEC. ID nº 2 y el péptido de la SEC.
ID nº 3.
19. Uso como el reivindicado en la reivindicación
13 en el que la CD40 oligomérica soluble comprende los aminoácidos
113-261 de la SEC. ID nº 2 y el péptido de la
SEC. ID nº 3, en el que la cisteína del aminoácido 194 de la SEC.
ID nº; 2 se sustituye por triptofano.
20. Uso como el reivindicado en las
reivindicaciones 11 a 19, en el que dicho tumor se selecciona del
grupo constituido por un linfoma B, un melanoma y un carcinoma.
21. Un kit de partes que comprende una proteína
de unión a la CD40 y un fotosensibilizador para la administración
separada, simultánea o posterior a un individuo para inducir un
respuesta de memoria CTL en un individuo portador de un tumor, en
la que la respuesta de memoria CTL es especifica del tumor.
22. Un kit de partes como el reivindicado en la
reivindicación 21, en el que dicha proteína de unión a la CD40 se
selecciona de un grupo compuesto por:
- a)
- Un anticuerpo contra la CD40,
- b)
- CD40L,
- c)
- CD40L soluble, y
- d)
- una proteína oligomérica de fusión CD40L soluble que comprende 1) un CD40L soluble o un anticuerpo contra la CD40 y 2) una segunda proteína.
23. Un kit de partes como el reivindicado en la
reivindicación 22, en el que dicho anticuerpo contra la CD40 se
selecciona de un grupo constituido por:
- a)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 260 de la SEC. ID nº 1, los aminoácidos 47 a 260 de la SEC. ID nº: 1, los aminoácidos 113 a 260 de la SEC. ID nº 1 o los aminoácidos 120 a 260 de la SEC. ID nº 1.
- b)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 261 de la SEC. ID nº 2, los aminoácidos 47 a 261 de la SEC. ID nº: 2, los aminoácidos 112 a 261 de la SEC. ID nº 2, los aminoácidos 113 a 261 de la SEC. ID. Nº 2 o los aminoácidos 120 a 261 de la SEC. ID nº 2.
- c)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de aminoácidos 47-260 de la SEC. ID nº 1 en el que el fragmento se une a la CD40,
- d)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de aminoácidos 47-261 de la SEC. ID nº 2 en el que el fragmento se une a la CD40.
- e)
- Un polipéptido de (b) o (c) en el que la cisteína del aminoácido 194 se sustituye por triptofano, y
- f)
- Un polipéptido codificado por una secuencia de aminoácido que está codificada por el complemento del ADN que se hibridiza a ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos (a)-(f) en condiciones muy rigurosas (hibridización en 6 X SSC a 63ºC durante toda una noche; lavado en 3 X SSC a 55ºC) en el que el polipéptido soluble codificado se une a la CD40.
24. Un kit de partes como el reivindicado en la
reivindicación 22, en el que dicha segunda proteína se selecciona
del grupo constituido por un dominio Fc de la inmunoglobulina y un
dominio de oligomerización en cremallera.
25. Un kit de partes como el reivindicado en la
reivindicación 24, en el que el dominio de oligomerización en
cremallera se selecciona del grupo constituido por:
- a)
- Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID nº 3, y
- b)
- Una variante del péptido de (a), en la que la variante consiste esencialmente en el péptido de (a) con una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las cuales la variante es capaz de formar una proteína oligomérica de fusión al CD40L.
26. Un kit de partes como el reivindicado en la
reivindicación 22, en el que la proteína oligomérica de unión a la
CD40 comprende los aminoácidos 113 a 261 de la SEC. ID nº 2 y el
péptido de la SEC. ID nº 3, en el que la cisteína del aminoácido
194 de la SEC. ID nº 2 se sustituye por triptofano.
27. Un kit de partes como el reivindicado en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que el kit
comprende adicionalmente Flt3L.
28. Un kit de partes como el reivindicado en la
reivindicación 1 o la reivindicación 27 que incluye Flt3L para el
tratamiento de células madre o progenitoras hematopoyéticas de un
individuo para obtener células dendríticas.
29. Un kit de partes como el reivindicado en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 10 o en la reivindicación
27 combinado con células dendríticas.
30. El uso de una proteína de unión a la CD40 en
la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de
memoria CTL en un individuo portador de un tumor junto con una
terapia fotodinámica en la que la respuesta de memoria CTL es
específica del tumor.
31. El uso como en la reivindicación 30, en el
que dicha proteína de unión a la CD40 se selecciona de un grupo que
comprende:
- e)
- Un anticuerpo contra la CD40,
- f)
- CD40L,
- g)
- CD40L soluble, y
- h)
- una proteína oligomérica de fusión CD40L soluble que comprende 1) un CD40L soluble o un anticuerpo contra la CD40 y 2) una segunda proteína.
32. Uso como el reivindicado en la reivindicación
31 en el que dicho anticuerpo contra la CD40 se selecciona de un
grupo constituido por
- g)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 260 de la SEC. ID nº 1, los aminoácidos 47 a 260 de la SEC. ID nº: 1, los aminoácido 113 a 260 de la SEC. ID nº 1 o los aminoácido 120 a 260 de la SEC. ID nº 1.
- h)
- Un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 261 de la SEC. ID nº 2, los aminoácidos 47 a 261 de la SEC. ID nº: 2, los aminoácidos 112 a 261 de la SEC. ID nº 2, los aminoácidos 113 a 261 de la SEC. ID. Nº 2 o los aminoácidos 120 a 261 de la SEC. ID nº 2.
- i)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de aminoácidos 47-260 de la SEC. ID nº 1 en el que el fragmento se une a la CD40,
- j)
- Un polipéptido que comprende un fragmento de aminoácidos 47-261 de la SEC. ID nº 2 en el que el fragmento se une a la CD40.
- k)
- Un polipéptido conforme a (b) o (D) en el que la cisteína del aminoácido 194 se sustituye por triptofano, y
- l)
- Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el complemento de un ADN que se hibridiza a ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos (a)-(f) en condiciones muy rigurosas (hibridización en 6 X SSC a 63ºC durante toda una noche; lavado en 3 X SSC a 55ºC) en el que el polipéptido codificado se une a la CD40 soluble.
33. Uso como el reivindicado en la reivindicación
31, en el que dicha segunda proteína se selecciona del grupo
constituido por un dominio Fc de la inmunoglobulina y un dominio de
oligomerización en cremallera.
34. Uso como el reivindicado en la reivindicación
33, en el que el dominio de oligomerización en cremallera se
selecciona del grupo constituido por:
- c)
- Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. ID nº 3, y
- d)
- Una variante del péptido de (a), en la que la variante consiste esencialmente en el péptido de (a) con una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las cuales la variante es capaz de formar una proteína oligomérica de fusión al CD40L.
35. Uso como el reivindicado en la reivindicación
31, en el que la proteína oligomérica soluble de unión a la CD40
comprende los aminoácidos 113 a 261 de la SEC. ID nº 2 y el
péptido de la SEC. ID nº 3 en el que la cisteína del aminoácido
194 de la SEC. ID. Nº 2 se sustituye por triptofano.
36. Uso como el reivindicado en las
reivindicaciones 11 a 20 en el que el kit o medicamento comprende
además Flt3L.
37. Uso como el reivindicado en la reivindicación
11 o la reivindicación 36 que incluye Flt3L para el tratamiento de
células madre o progenitoras hematopoyéticas de un individuo para
obtener células dendríticas.
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