ES2213158T3

ES2213158T3 - Vacuna celular y su uso para el tratamiento de tumores malignos solidos.

Info

Publication number: ES2213158T3
Application number: ES95906825T
Authority: ES
Inventors: Richard L. Edelson; Francis P. Gasparro
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-25
Publication date: 2004-08-16
Anticipated expiration: 2014-07-25
Also published as: DE69433590T2; DE69433590D1; EP0719150A1; US5820872A; EP0719150A4; JPH09500652A; ATE260666T1; EP0719150B1; WO1995003814A1

Abstract

SE PRESENTAN METODOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA MEJORAR LA EFECTIVIDAD DE LA TERAPIA DE RADIACION PARA EL TRATAMIENTO DE UN SUJETO QUE TENGA UNA MALIGNIDAD TUMORAL SOLIDA INTERNA. LOS METODOS INCLUYEN LA IRRADIACION DEL TUMOR PARA LIBERAR ANTIGENOS DERIVADOS DEL TUMOR "IN VIVO", LA PREPARACION DE UNA VACUNA CELULAR QUE INCLUYA LOS ANTIGENOS AISLADOS MEZCLADOS CON UNA PREPARACION DE CELULAS QUE PRESENTAN ANTIGENOS ALTERADOS Y LA ADMINISTRACION DE LA VACUNA CELULAR AL SUJETO. EN CONFORMACIONES PREFERIDAS, LAS CELULAS QUE PRESENTAN LOS ANTIGENOS SON LEUCOCITOS QUE HAN SIDO FOTOQUIMICAMENTE ALTERADOS EXPONIENDO LAS CELULAS A UNA FOTOFERESIS.

Description

Vacuna celular y su uso para el tratamiento de tumores malignos sólidos.

Esta invención se refiere a composiciones farmacéuticas y su uso para mejorar la eficacia de la terapia de radiación para tratar a un sujeto que tiene una malignidad de tumor sólido interno mediante la combinación de terapia de irradiación con fotoféresis.

El línfoma cutáneo de células T (CTCL, del inglés "Cutaneous T Cell Lymphoma") es una malignidad del sistema inmune causada por la expansión masiva de un clon sencillo de células T aberrantes. La elección del tratamiento de CTCL depende de la extensión del estado de la enfermedad, así como de la salud general y de la edad del paciente. En general, la enfermedad en su estado incipiente limitada a la piel es tratada con terapias tópicas secuenciales tales como la mostaza de nitrógeno tópica, la fototerapia psoraleno ("PUVA", es decir, la administración oral de psoraleno seguida de la irradiación con radiación UVA de la piel) y la terapia total con haz de electrones sobre la piel (TSEB, del inglés "Total-Skin Electron Beam Therapy"). La enfermedad en su estado avanzado, por ejemplo, el síndrome Sezary, es tratada con fotoquimioterapia extracorporal ("fotoféresis").

La fotoféresis para el tratamiento del línfoma cutáneo de células T fue introducida por Edelson en 1987 (Edelson, R., y col., N. Engl. J. Med. 316: 297-303 (1987)). Aunque relativamente nueva, la fotoféresis es considerada ahora como una terapia estándar para las variantes eritrodérmicas del CTCL (Edelson, R., "Light-activated Drugs", Scientific American 256 (8): 68-75 (1988); Edelson, R., "Photopheresis: A Clinically Relevant Immunobiologic Response Modifier", Annals of N. Y. Academy of Sciences 636: 154-164 (1991). La terapia incluye dos etapas: (1) irradiar una preparación de leucocitos del paciente en presencia de un agente fotoactivable (por ejemplo, 8-metoxipsoraleno, "8-MOP") para alterar fotoquímicamente las células y (2) reinfundir las células fotoquímicamente alteradas.

No todos los pacientes con CTCL con eritroderma responden a la terapia de fotoféresis. Aquellos pacientes con CTCL que responden, presentan una tiempo de supervivencia medio de más de 62 meses, es decir, aproximadamente el doble que los pacientes tratados con otras modalidades (Edelson, R., y col., Prog. Dermatol. 25 (3): 1-6 (1991). Sin embargo, debido a que hasta un 25% de los pacientes con CTCL presentan una respuesta limitada a la fotoféresis, se han introducido recientemente la terapia accesoria de TSEB, la quimioterapia (por ejemplo, metrotrexato oral (Rook, A., y col., Arch. Dermatol. 127: 1535-1540 (1991)) o el interferón subcutáneo alfa-2b (Helad, P.W., y col., Yale J. Biol. Med. 62: 629-638 (1989).

El mecanismo de acción de la fotoféresis no ha sido elucidado por completo. La exposición de un clon de célula T maligno a 8-MOP y a luz ultravioleta, seguida de la devolución de las células dañadas irradiadas al paciente, parece provocar una respuesta específica a las células T aberrantes, respuesta que está mediada por los receptores superficiales de célula T. En concordancia con esta hipótesis está la producción de una inmunidad realzada frente a clon(es) patógeno(s) de células T seguido de la reinfusión de leucocitos de sangre irradiada (Edelson R., y col., N. Engl. J. Med. 316: 297-303 (1987); Edelson, R., Yale J. Biol. Med. 62: 565-577 (1989); Rook, A. H., y col., Ciba Foundation Symposium 146, Nueva Cork, John Wiley & Sons, (1989) 171-177).

Además, la fotoféresis, entre otras cosas, ha sido usada para alterar leucocitos no específicos no patógenos, preferiblemente células T, extraídas de un cuerpo mamífero. Estos leucocitos alterados pueden a continuación ser devueltos al mamífero, con lo cual se observa un estado de alerta realzado en el sistema inmune que resulta en un potenciamiento general de la respuesta inmune (Edelson R., Patente de Estados Unidos a-5.147.289, 15 de septiembre de 1992).

Los receptores de células T consiguen una respuesta inmune celular reconociendo un antígeno particular sólo si el antígeno está asociado con un marcador superficial sobre una célula que presenta antígenos. Los marcadores superficiales pertenecen a un grupo de moléculas conocidas como el complejo principal de histocompatibilidad (MHC del inglés "major histocompatibility complex"). La unión del receptor de célula T a la molécula MHC/antígeno sobre una célula que presenta antígenos induce cambios en la célula T. Estos cambios comprenden colectivamente una respuesta inmune mediada por la célula.

Principalmente, dos señales son las responsables de inducir la respuesta mediada por célula T a un antígeno que está asociado con una célula que presenta antígenos. Una primera señal es generada a continuación de la unión de la célula T al antígeno sobre la célula que presenta antígenos. Una segunda señal coestimulante es enviada por moléculas de membrana "accesorias" o por mensajeros solubles desde la célula que presenta antígenos hasta la célula T que responde. Estos mensajeros intercelulares solubles regulan la amplitud y la duración de la respuesta inmune y se los conoce con el término general citoquinas. Las citoquinas incluyen el grupo referido anteriormente en la bibliografía como linfoquinas, monoquinas, interleuquinas, interferones y factor de necrosis tumoral (Essential Immunology, séptima edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Gran Bretaña, 1991, páginas 140-150). Si la célula que presenta antígenos no envía la segunda señal, la célula T se paraliza de forma efectiva, es decir, es incapaz de montar una respuesta inmune al antígeno. Determinados tipos de células que presentan antígenos, por ejemplo, las células T en reposo, son incapaces de enviar la segunda señal. Consecuentemente, en ausencia de citoquina exógena o de otra segunda señal, dichas células T en reposo que también funcionan como células que presentan antígenos regulan a la baja una respuesta inmune al antígeno presentado y conducen a la parálisis inmunológica específica de antígeno de la célula T cuyo receptor de membrana ha sido ocupado. Otros tipos de células que presentan antígenos, por ejemplo, los monocitos, son capaces de liberar citoquinas. Por consiguiente, los monocitos que han sido estimulados para liberar citoquinas regulan al alza una respuesta inmune al antígeno presentado.

Además del CTCL y del escleroma, la fotoféresis ha sido usada para el tratamiento de otros desórdenes autoinmunes, incluyendo pemfigus vulgaris, esclerosis sistémica (Rook, A., "Photopheresis in the Treatment of Autoimmune Disease: Experience with Pemphigus Vulgaris and Systemic Sclerosis", Annals of N. Y. Academy of Science 636: 209-216 (1991)) y la artritis reumatoide (Malawista, S., y col., "Photopheresis for Rheumatoid artritis", Annals of N. Y. Academy of Science 636: 217-226 (1991)). Otras pruebas preliminares actualmente en progreso que muestran resultados prometedores para la terapia de fotoféresis incluyen la diabetes autoinmune o dependiente de insulina de tipo I, el rechazo de transplante cardíaco, los complejos relacionados con el SIDA y la enfermedad aguda de injerto vs. hospedante.

En resumen, se ha demostrado que la fotoféresis produce un beneficio clínico generalizado para una variedad de enfermedades autoinmunes que se caracterizan por un desorden en la regulación de células T. De la lista de estados de enfermedad publicados en la técnica anterior como tratables por la terapia de fotoféresis están ausentes las enfermedades para las cuales todavía no se implicado la expansión clonal de células T aberrantes circulantes, incluyendo, por ejemplo, las malignidades de tumor sólido asociadas a cánceres que son difíciles de tratar, por ejemplo, cánceres de pulmón, de pecho, de ovarios, de útero, de próstata, de testículos, de hígado, de páncreas, de estómago, carcinoma de célula escamosa de falange oral, fibrosarcomas, cáncer de riñón, de vejiga, de cerebro, de espina dorsal, melanoma maligno y carcinoma de célula escamosa metastático de la piel. Hasta la fecha, el tratamiento de dichas malignidades de tumor sólido está limitado a la cirugía, a la irradiación, y/o a la quimioterapia (véase por ejemplo, Harrison´s Principles of Internal Medicine, 12ª edición, eds. J. D. Wilson y col., McGraw-Hill, Inc., N. Y., N. Y. (1991)).

Aunque el uso de irradiación X en combinación con la quimioterapia para el tratamiento de tumores sólidos internos puede tener un beneficio terapéutico generalizado, por ejemplo, destruyendo o inhibiendo la proliferación de al menos algunas células tumorosas, dichos regímenes de tratamientos convencionales están muy lejos del ideal. En particular, estas terapias accesorias están limitadas por los efectos secundarios potencialmente tóxicos que provienen de la falta de especificidad de los agentes quimioterapéuticos.

La presente invención supera los problemas de los enfoques convencionales para el tratamiento de malignidades de tumor sólido usando terapia de radiación para producir un medicamento que está específicamente dirigido a la destrucción del tumor a través del sistema inmune celular del paciente. En esencia, la invención usa una combinación sinérgica de dos métodos terapéuticos, la irradiación X y la fotoféresis, cada uno de los cuales es conocido por ser eficaz para tratar un estado de enfermedad diferente, para fabricar dicho medicamento. La invención de los solicitantes es el descubrimiento de que cuando se combinan estos dos métodos ejercen un beneficio terapéutico sinérgico en el tratamiento de un sujeto que tiene una malignidad de tumor sólido. Debido a que la modulación de la respuesta inmune celular es importante para la ejecución de la invención, se prefiere que el sujeto receptor de la vacuna celular que logra la respuesta inmune celular (descrito más adelante) tenga un sistema inmune competente, como se evidencia por, por ejemplo, niveles absolutos de células positivas CD8 próximos a los normales.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de una preparación de leucocitos para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, siendo dicho medicamento fabricado mediante un método que comprende proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos irradiando el tumor sólido interno con irradiación X que tiene la suficiente energía para inducir la liberación de dichos antígenos desde el tumor; exponer la preparación de leucocitos que contiene una pluralidad de leucocitos a irradiación de luz ultravioleta A o de luz visible en presencia de un agente fotoactivable para formar una preparación de leucocitos fotodesactivada, expresando dichos leucocitos una pluralidad de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad; poner en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación de leucocitos fotodesactivada bajo las condiciones necesarias para asociar los antígenos derivados del tumor con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, formando con ello una pluralidad de leucocitos asociados a los antígenos; y organizar dicha pluralidad de leucocitos asociados a antígenos en una forma aceptable farmacéuticamente.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente fotoactivable para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, siendo dicho medicamento fabricado mediante un método que comprende proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos irradiando el tumor sólido interno con irradiación X que tiene la suficiente energía para inducir la liberación de dichos antígenos desde el tumor; exponer la preparación de leucocitos que contiene una pluralidad de leucocitos a irradiación de luz ultravioleta A o de luz visible en presencia de un agente fotoactivable para formar una preparación de leucocitos fotodesactivada, expresando dichos leucocitos una pluralidad de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad; poner en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación de leucocitos fotodesactivada bajo las condiciones necesarias para asociar los antígenos derivados del tumor con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, formando con ello una pluralidad de leucocitos asociados a los antígenos; y organizar dicha pluralidad de leucocitos asociados a antígenos en una forma aceptable farmacéuticamente.

En un tercer aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una preparación celular que contiene una pluralidad de células que presentan antígenos para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, siendo dicho medicamento fabricado mediante un método que comprende proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos irradiando el tumor sólido interno con irradiación X que tiene la suficiente energía para inducir la liberación de dichos antígenos desde el tumor; tratar la preparación de células para potenciar la expresión mediante dichas células de una molécula del complejo principal de histocompatibilidad, siendo adecuada cada una de dichas células que presentan antígenos para la administración al sujeto; poner en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación celular tratada bajo las condiciones necesarias para formar una pluralidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos; y organizar dicha pluralidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos en una forma aceptable farmacéuticamente.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una preparación de leucocitos asociados a antígenos, en la que dichos leucocitos asociados a antígenos se preparan proporcionando una pluralidad de antígenos derivados del tumor, producida irradiando el tumor sólido interno con irradiación X que tiene energía suficiente para inducir la liberación de dichos antígenos desde el tumor; exponiendo una preparación de leucocitos que contiene una pluralidad de leucocitos a irradiación de luz ultravioleta A o de luz visible en presencia de un agente fotoactivable para formar una preparación de leucocitos fotodesactivada, expresando dichos leucocitos una pluralidad de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad; poniendo en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación de leucocitos fotodesactivados bajo las condiciones necesarias para asociar los antígenos derivados del tumor a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, formando con ello una pluralidad de leucocitos asociados a antígenos.

En un quinto aspecto de la invención, se proporciona una preparación de células que presentan antígenos asociadas a antígenos, en la que dichas células que presentan antígenos asociadas a antígenos se preparan proporcionando una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos por irradiación del tumor sólido interno con irradiación X que tiene energía suficiente para inducir la liberación de dichos antígenos desde el tumor; tratando una preparación celular para potenciar la expresión por dichas células de una molécula del complejo principal de histocompatibilidad, siendo cada una de dichas células que presentan antígenos adecuada para la administración al sujeto; poniendo en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación celular tratada bajo las condiciones necesarias para formar una pluralidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos.

Las realizaciones preferidas de la invención en cualquiera de sus aspectos son las descritas a continuación o como se define en las subreivindicaciones.

Las preparaciones de acuerdo con la invención pueden ser usadas en un método para mejorar la eficacia de la terapia de radiación para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno. Dichos métodos incluyen irradiar el tumor sólido interno para liberar antígenos derivados del tumor, aislar una pluralidad de estos antígenos y poner en contacto los antígenos derivados del tumor con una preparación de leucocitos que previamente ha sido sometida a fotoféresis, es decir, ha sido irradiada en presencia de un agente fotoactivable para formar una preparación de leucocitos fotodesactivados. Los antígenos derivados del tumor son puestos en contacto con la preparación de leucocitos fotodesactivados bajo las condiciones necesarias para formar la vacuna celular, vacuna que es administrada a continuación al sujeto para mejorar la eficacia de la terapia de radiación.

En determinados aspectos, la invención proporciona una vacuna celular para mejorar la eficacia de la terapia de radiación. La vacuna celular incluye una cantidad efectiva de una mezcla que contiene una pluralidad de antígenos derivados del tumor mezclados con una pluralidad de células que presentan antígenos que han sido tratadas para inducir expresión de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I vacío y/o de clase II vacío. Típicamente, dicha inducción se lleva a cabo mediante fotoféresis y a las células inducidas se las denomina células que presentan antígenos "fotodesactivadas". La mezcla se coloca en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa aquí, una "cantidad eficaz" de la mezcla es aquella cantidad suficiente para mejorar la eficacia de la terapia de radiación para tratar al sujeto. Si la cantidad es una "cantidad eficaz" es determinado de acuerdo con los criterios conocidos por alguien con una habilidad normal en la técnica. En las realizaciones preferidas, las células que presentan antígenos usadas para preparar la vacuna celular son células antólogas, es decir, aisladas del sujeto receptor, que han sido fotodesactivadas sometiendo una preparación de leucocitos a fotoféresis. Sin embargo, también se proporcionan fuentes alternativas de células que presentan antígenos y métodos para producir el equivalente funcional de los leucocitos fotodesactivados. Debido a que los antígenos derivados de tumor sólido son aislados a partir de fluidos corporales tales como la sangre entera, el fluido linfático y posiblemente la orina, la vacuna celular opcionalmente incluye una cantidad detectable del fluido corporal a partir del cual se aisló el antígeno.

La invención proporciona un método para fabricar la vacuna celular mencionada anteriormente. El método incluye proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor, exponer una preparación de leucocitos a irradiación en presencia de un agente fotoactivable para formar una preparación de leucocitos fotodesactivados bajo las condiciones necesarias para formar la vacuna celular. Si la mezcla no está contenida ya en un vehículo farmacéuticamente aceptable, es colocada en dicho vehículo antes de la administración al sujeto.

Las preparaciones inventivas pueden ser usadas en un método alternativo para mejorar la eficacia de la terapia de radiación para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno. El método incluye irradiar el tumor sólido para liberar antígenos derivados del tumor in vivo, aislar una pluralidad de los antígenos derivados del tumor, tratar una preparación celular (que contiene células que presentan antígenos que son adecuadas para la administración al sujeto) para potenciar la expresión superficial mediante las células de una molécula del complejo principal de histocompatibilidad, poner en contacto los antígenos derivados del tumor con la preparación celular tratada bajo las condiciones necesarias para formar una pluralidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos, y administrar las células que presentan antígenos asociadas a antígenos al sujeto. Los métodos para tratar la preparación celular para potenciar la expresión de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad incluyen, por ejemplo, someter la preparación celular a uno o más de los siguientes procedimientos o condiciones extracorporales: (1) fotoféresis, (2) temperaturas inferiores a las temperaturas fisiológicas y (3) poner en contacto la preparación celular con una o más citoquinas conocidas por inducir expresión de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad. En una realización preferida, las células que presentan antígenos son células autólogas, es decir, las células son aisladas a partir del sujeto receptor. Más preferiblemente, las células son monocitos o células B.

Las preparaciones inventivas también pueden ser usadas en un método para potenciar una respuesta del sistema inmune contra un antígeno de tumor específico. El método incluye liberar una pluralidad de antígenos derivados del tumor in vivo, aislar los antígenos derivados del tumor y poner en contacto los antígenos aislados con una preparación celular que contiene células que presentan antígenos, preparación que ha sido tratada para potenciar la expresión a partir de las células de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías. Preferiblemente, las células que presentan antígenos son leucocitos, más preferiblemente monocitos o células B. En las realizaciones preferidas, la preparación celular es tratada para potenciar la expresión de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías mediante cualquiera de los procedimientos extracorporales mencionados antes, por ejemplo, sometiendo la preparación celular a fotoféresis y/o a una temperatura inferior a la temperatura fisiológica. La vacuna celular para potenciar el sistema inmune frente a un antígeno de tumor específico se forma poniendo en contacto la preparación celular descrita antes con la pluralidad de antígenos derivados del tumor bajo las condiciones conocidas para potenciar la asociación de los antígenos con las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías presentes sobre la superficie de las células que presentan antígenos. A partir de entonces, la vacuna es administrada al sujeto de acuerdo con métodos conocidos por alguien con una habilidad normal en la técnica.

La Figura 1 muestra los efectos de 8-MOP y de la radiación UVA sobre la supervivencia de células RMA, determinada por exclusión de azul de tripano; y

La Figura 2 muestra el transcurso del tiempo para la potenciación de moléculas MHC de clase I D^{b} sobre células RMA tratadas con 100 ng/ml de 8-MOP y 1 J/cm^{2} de radiación UVA para un conjunto de experimentos.

Se proporciona una preparación usada en un método para mejorar la eficacia de la terapia de radiación para tratar a un sujeto que tiene una malignidad de tumor sólido interno. El método combina de forma sinérgica dos métodos terapéuticos: irradiación X para el tratamiento de una malignidad de tumor sólido interno y un método para estimular el sistema inmune para que reconozca específicamente antígenos de tumor específicos. Los antígenos de tumor específicos son liberados del tumor sólido después de la irradiación. La respuesta inmune específica se logra mediante la administración de una vacuna celular (descrita más adelante) que contiene los antígenos derivados del tumor. En su forma más sencilla, la vacuna celular incluye una cantidad eficaz de una mezcla que contiene una pluralidad de los antígenos derivados del tumor mezclados con una pluralidad de leucocitos fotodesactivados. La mezcla está contenida en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La preparación es usada preferiblemente en un método para mejorar la eficacia de la radiación para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, incluyendo dicho método irradiar el tumor sólido interno para liberar los antígenos derivados del tumor in vivo, aislar una pluralidad de los antígenos derivados del tumor y poner en contacto los antígenos aislados con una preparación de leucocitos fotodesactivados para formar la vacuna celular. En las realizaciones más preferidas, la preparación de leucocitos fotodesactivados se forma irradiando la preparación de leucocitos con radiación ultravioleta A ("UVA") o con luz visible en presencia de un agente fotoactivable, es decir, sometiendo la preparación de leucocitos a fotoféresis. Las condiciones para activar psoralenos en presencia de luz visible se describen en la solicitud de EE. UU con Nº de Serie 08.013.831, presentada el 4 de febrero de 1993.

La vacuna celular se forma mezclando los antígenos derivados del tumor sólido con las preparaciones de leucocitos fotodesactivados bajo las condiciones necesarias para cargar los antígenos derivados del tumor en moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías de clase I o de clase II de las células que presentan antígenos. En general, dichas condiciones incluyen mezclar las células a temperaturas entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente 30ºC para potenciar la estabilidad de las moléculas vacías de clase I o de clase II. En el Ejemplo 3 se presentan ejemplos de condiciones necesarias para cargar los antígenos en moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías de clase I.

Como se enumera en la solicitud de EE.UU. anterior, 5.462.435, otros métodos diferentes a la fotodesactivación con luz UVA en presencia de un psoraleno son útiles para preparar una preparación de células que tienen una expresión potenciada de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías de clase I o de clase II. Ejemplos de métodos alternativos incluyen la irradiación ultravioleta B ("UVB"), poner en contacto las células con un(os) agente(s) quimioterapéutico(s) y/o una(s) citoquina(s) tal como el factor de necrosis tumoral (TNF del inglés "Tumor Necrosis Factor"), exponer las células a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 22ºC a aproximadamente 30ºC, exponer las células a una disolución salina o a un medio de cultivo de tejidos hipotónicos o hipertónicos y exponer las células a presión hidrostática.

Las moléculas vacías de clase I son termodinámicamente inestables a temperaturas fisiológicas. En consecuencia, se cree que la exposición de la preparación celular a una temperatura que es inferior a las temperaturas fisiológicas da como resultado una "expresión potenciada" de las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías de clase I mediante la estabilización de las moléculas "vacías". Como es usado aquí, el término "expresión potenciada" se refiere a una célula que tiene sobre su superficie sustancialmente más moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías que las estarían presentes sobre la superficie de una célula que presenta antígenos correspondiente, que existe de forma natural.

La vacuna celular es administrable al sujeto de acuerdo con cualquier modo de administración apropiado conocido en la técnica, por ejemplo, introducción en la corriente sanguínea o en el sistema inmune del paciente. La inyección intradérmica es un método de administración preferido. Sin embargo, pueden usarse la inyección subcutánea, la inyección intramuscular y/o cualquier otro modo de depositar la vacuna celular en un reservorio tal que los antígenos derivados del tumor son expuestos al sistema inmune celular del sujeto, es decir, las células que comprenden el sistema inmune celular pueden reconocer y reaccionar a la presencia del antígeno derivado del tumor. En consecuencia, la vacuna celular incluye además un vehículo farmacéuticamente aceptable que es apropiado para el modo de administración seleccionado. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, disoluciones salinas normales para vacunas pensadas para administración por inyección en el sistema sanguíneo.

El sujeto es, preferiblemente, un humano que tiene un tumor sólido interno que es tratable por terapia de irradiación X. Como se usa aquí, la frase "tratable por terapia de irradiación X" en referencia a un tumor sólido significa un tumor que contiene al menos algunas células tumorosas que son susceptibles de sufrir daño celular como respuesta a la irradiación, daño que es suficiente para liberar antígenos derivados del tumor in vivo.

El término "irradiación" como se usa aquí, tiene su significado convencional y sólo está limitado a la extensión de que la irradiación X tenga energía suficiente para penetrar el cuerpo y ser capaz de inducir la liberación de antígenos específicos del tumor in vivo. La intensidad de radiación óptima para dañar un tipo particular de tumor es conocida por alguien con una habilidad normal en la técnica. En general, cualquier forma o intensidad de radiación que es aceptable en la técnica para tratar tumores sólidos internos es útil para liberar antígenos derivados del tumor in vivo para los propósitos de la invención inmediata.

La radiación es medida en RADS, con una dosis típica de irradiación X que oscila entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 4.000 RADS para la terapia de irradiación tumoral. El intervalo de dosis de radiación para la presente invención oscila dentro del intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 6.000 RADS. Puesto que se necesita menos radiación para dañar el tumor para inducir la liberación de antígenos derivados del tumor in vivo que la que se necesita para destruir el tumor (el objetivo de la terapia de radiación convencional), la presente invención permite de forma ventajosa el uso de dosis más bajas de radiación, evitando con ello los efectos secundarios tóxicos asociados a dosis elevadas de irradiación X. Típicamente, la radiación es administrada en dosis fraccionadas a lo largo de varias semanas, no administrándose más de 300 RADS por tratamiento.

Debido a que la terapia de combinación alerta al sistema inmune del sujeto para apuntar específicamente y destruir al tumor interno, se prefiere que el sujeto receptor de la terapia combinada tenga un sistema inmune competente. En general, la inmunocompetencia de un sujeto particular es determinada midiendo la cantidad de células T positivas CD8 en una muestra de sangre tomada del sujeto. Los sujetos que tienen niveles absolutos de células T positivos CD8 próximos a lo normal se considera que son inmunocompetentes para los propósitos de la presente invención. En general, un sujeto que tiene un nivel de CD8 que es al menos de aproximadamente 100 células CD8/100 ml de sangre se considera que es inmunocompetente.

La frase "tumor sólido interno" se refiere a un linfoma de célula T extracutáneo, es decir, no cutáneo, neoplasma. Si un tratamiento particular o una terapia de combinación es eficaz en detener la progresión del neoplasma o no es determinado mediante criterios conocidos por cualquiera con una habilidad normal en la técnica. Por ejemplo, la eficacia puede ser demostrada observando un cambio en la velocidad de crecimiento del tumor (por ejemplo, una velocidad de crecimiento estática o reducida como se evidencia por la velocidad de cambio del tamaño del tumor con el tiempo) y/u observando un ralentizamiento en la progresión del estado de la enfermedad (por ejemplo, una reducción en los síntomas asociados a la enfermedad con el tiempo). Dichos criterios son útiles para determinar si el tumor sólido es tratable mediante terapia de radiación o no, así como para establecer si los métodos y/o las composiciones de la presente invención mejoran la eficacia de la terapia de radiación para tratar al sujeto. A continuación se presentan ejemplos de malignidades de tumor sólido tratables mediante los métodos y las composiciones de la presente invención.

El daño o la muerte celular inducidos por irradiación X dan como resultado la liberación in vivo de una miríada de oligopéptidos, proteínas y/o otros componentes celulares de las células irradiadas. Estos componentes celulares previamente inmóviles (es decir, asociados al tumor sólido) entran en los sistemas linfático y/o sanguíneo desde los que pueden ser aislados de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se usa aquí, el término "aislados" se refiere a una preparación (por ejemplo, una recopilación de antígenos derivados del tumor o una preparación de leucocitos) que ha sido eliminada de su entorno natural. De este modo, por ejemplo, una muestra de sangre extraída de un sujeto es "aislada" como se define aquí, incluso si la muestra de sangre es parte de una corriente continua que posteriormente es reinfundida dentro del sujeto.

El término "antígenos derivados del tumor" se refiere colectivamente a componentes que son liberados del tumor sólido después de la irradiación. No se requiere que los antígenos derivados del tumor sean purificados o concentrados antes de su uso de acuerdo con los métodos o las composiciones de la presente invención. Sin embargo, la concentración de antígenos derivados del tumor en la preparación aislada es enriquecida opcionalmente antes de su almacenamiento para potenciar la estabilidad del antígeno en el almacenamiento. Por "enriquecida" se da a entender que el antígeno derivado del tumor está presente en una concentración superior a aquella a la que estaba presente cuando fue aislado a partir del sujeto. En general, se prefiere una preparación enriquecida de antígenos derivados del tumor debido a que la mayor concentración del antígeno, cuando se mezcla con las células que presentan antígenos tratadas, favorece cinéticamente la carga de antígeno derivado del tumor en las moléculas vacías de complejo principal de histocompatibilidad de clase I o de clase II de las células tratadas que presentan antígenos.

Las condiciones de almacenamiento de antígenos son conocidas por aquellos con conocimientos normales en la técnica e incluyen, por ejemplo, el almacenamiento a una temperatura reducida (por ejemplo, a -70ºC) en presencia de agentes estabilizadores de proteínas tales como los inhibidores de proteasa y/o agentes que se sabe que estabilizan la conformación nativa de antígenos de péptido y/o de proteína (por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO)). Dichos agentes son conocidos por alguien con una habilidad normal en la técnica e incluyen, por ejemplo, glicerol, sacarosa y urea.

La vacuna celular se prepara poniendo en contacto los antígenos derivados del tumor con una preparación celular que ha sido "alterada" (por ejemplo, fotodesactivada) para potenciar la interacción (por ejemplo, la asociación) de los antígenos derivados del tumor con las células contenidas en la preparación celular. Como se usa aquí, la frase "preparación celular" se refiere a una preparación de células que presentan antígenos. Las células que presentan antígenos son una clase de células del sistema inmune que son capaces de reconocer el antígeno si está asociado con una molécula de complejo principal de histocompatibilidad. Las células que presentan antígenos incluyen unos tipos de células diversos como leucocitos (por ejemplo, monocitos, macrófagos y linfocitos tales como células T y células B), así como células sintéticas ("artificiales").

Estos diversos tipos de células tienen en común la capacidad de presentar antígenos de una forma que es reconocida por receptores de célula T específicos. Las células que presentan antígenos preferidas son los leucocitos, más preferiblemente, los monocitos o las células B. La preparación de leucocitos es aislada a partir de, por ejemplo, la sangre, el fluido linfático, la médula espinal, el tejido de órgano linfático o el fluido de cultivo de tejido. Opcionalmente, los monocitos o células B son cultivados in vitro para expandir el número de células disponibles para formar la vacuna celular in vitro.

Como se ha discutido previamente, cada clon de linfocito T, por ejemplo, un clon de célula ayudante T o un clon de célula T citotóxica, expresa un receptor superficial diferente que reconoce un antígeno solo si está asociado con una molécula de complejo principal de histocompatibilidad sobre la superficie de una célula que presenta antígenos. En general, el término "molécula de complejo principal de histocompatibilidad" se refiere a una molécula o a una célula que presenta antígenos que tiene la capacidad de asociarse con el antígeno para formar una célula que presenta antígenos asociada al antígeno. El reconocimiento de esta célula que presenta antígenos asociada al antígeno por la célula T se logra mediante el receptor superficial de la célula T. En las realizaciones preferidas, la molécula del complejo principal de histocompatibilidad es una molécula de clase I o de clase II. Cuando el antígeno está asociado con una molécula de complejo principal de histocompatibilidad de clase II, una célula T citotóxica se une al antígeno. Cada uno de estos tipos de células T funcionan para lograr la respuesta inmune del sujeto al tumor.

La molécula de clase I, compuesta por una cadena pesada y por una molécula de beta-2-microglobulina unida de forma no covalente, incluye una grieta o hendidura para recibir el antígeno derivado del tumor. En consecuencia, el antígeno derivado del tumor preferido tiene un tamaño y una dimensión que permita la entrada del antígeno en la hendidura de la molécula de clase I. (Véase por ejemplo, F. Latron, "A Critical Role for Conserved Residues in the Cleft of HLA-A2 in the Presentation of a Nonapeptide to T-cells", Science, 257: 964-967 (1992) para una discusión de las dimensiones de hendidura de una molécula de clase I). Aunque el antígeno derivado del tumor se ajusta sustancialmente al interior de la hendidura, todavía es accesible a una célula T capaz de reconocer el antígeno si está asociado con la molécula de clase I. De este modo, en una realización preferida, el antígeno derivado del tumor es un péptido que tiene entre aproximadamente ocho y aproximadamente dieciséis aminoácidos. En una realización más preferida, el antígeno derivado del tumor es un péptido que tiene entre ocho y diez aminoácidos, dos de los cuales son residuos hidrófobos para retener el péptido en la hendidura. La asociación del antígeno derivado del tumor con la molécula de clase I es determinada usando ensayos de monitorización que son capaces de distinguir entre moléculas de clase I vacías y moléculas de clase I llenas. En el Ejemplo 3 se describe un ejemplo de ensayo de monitorización.

La asociación de un antígeno derivado del tumor con una molécula de complejo principal de histocompatibilidad de una célula que presenta antígenos es un prerrequisito para inducir la respuesta inmune celular al tumor. Por consiguiente, aquí se describen varios métodos para potenciar la expresión de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías sobre la superficie de las células que presentan antígenos.

El método preferido para potenciar la expresión de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías es la fotoféresis.

En las patentes de EE.UU. Nº 5.147.289 ("Edelson '289") y 4.838.852 ("Edelson '852") describen los procedimientos de fotoféresis.

La fotoféresis se puede llevar a cabo en una corriente continua, como se describe en la patente de Edelson '289, o puede ser llevada a cabo por lotes. Se cree que sometiendo la preparación a fotoféresis se interrumpen las rutas metabólicas de las células responsables de procesar el antígeno intracelular en una forma que se ajuste a la hendidura definida por la molécula de complejo principal de histocompatibilidad, produciendo con ello una pluralidad de células que presentan antígenos que tienen moléculas de complejo principal de histocompatibilidad sin rellenar (es decir, "vacías") sobre su superficie. Estas células fotodesactivadas se unen a los antígenos derivados del tumor que cumple el requisito de características de tamaño y carga descrito antes. Una vez unidas, las células que presentan antígenos asociadas a antígenos derivados del tumor son administradas al sujeto en la forma de una vacuna celular.

Si el agente fotoactivable es un psoraleno (descrito más adelante), la radiación para la fotoactivación es irradiación ultravioleta A o luz visible que tiene una longitud de onda superior a aproximadamente 420 nm (Gasparro, F., y col., "The Excitation of 8-methoxypsoralens with Visible Light. Reversed Phase HPLC Quantitation of Monoaducts and Crosslinks", Photochemistry and Photobiology 57: 1007-1010 (1993)).

Otro modo más para potenciar la expresión de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías, es poner en contacto la preparación celular con una citoquina. El término citoquina denota las moléculas previamente referidas en la bibliografía como linfoquinas, monoquinas, interleuquinas, interferones y factor de necrosis tumoral (TNF) (Essential Immunology, 7ª edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Gran Bretaña, pp. 140-150 (1991)) e incluye, por ejemplo, el interferón gamma, el factor de necrosis tumoral alfa y el factor estimulante de colonias de monocitos granulocitos. Se sabe que las citoquinas incrementan la expresión de las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad en algunas células que presentan antígenos, por ejemplo, en los monocitos o células B.

Las células que presentan antígenos alteradas descritas anteriormente, por ejemplo, alteradas mediante fotoféresis o por exposición a una citoquina, son puestas en contacto con los antígenos derivados del tumor bajo las condiciones necesarias para formar la vacuna celular. Como se usa aquí, la frase "vacuna celular" se refiere a una preparación de células que, cuando se introduce en un sujeto, provoca una respuesta inmune celular que es específica de un componente (por ejemplo, el antígeno derivado del tumor) presente en la vacuna celular. El término "vacuna" se usa aquí porque aunque sólo se trata una pequeña porción del total de leucocitos del sujeto, se obtiene un efecto terapéutico de largo alcance con respecto al tumor irradiado después de la inyección de la vacuna.

La vacuna celular es, preferiblemente, almacenada antes de ser administrada al sujeto. Preferiblemente, la vacuna es almacenada en alícuotas que contienen una cantidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos derivados del tumor suficiente para disparar la respuesta inmune celular del sujeto frente al tumor sólido. La determinación de la cantidad de vacuna necesaria para disparar la respuesta inmune del paciente está dentro de la habilidad normal de la técnica. Preferiblemente, una cantidad de células que oscila entre un mínimo de aproximadamente 10.000 y un máximo de aproximadamente 200 x 10^{6} células que presentan antígenos es suficiente para disparar la respuesta inmune del sujeto. La cantidad de células usadas dependerá, en parte, de si las células que presentan antígenos son eficaces, por ejemplo, las células B o los monocitos, o ineficaces, por ejemplo, las células T.

El antígeno y los componentes celulares de la vacuna celular difieren de sus correspondientes contrapartidas naturales en varios aspectos. Las células que presentan antígenos asociadas a antígenos de la presente invención representan una población de células relativamente homogénea. Esto es principalmente porque el antígeno derivado del tumor no sigue siendo procesado por las células que presentan antígenos antes de la asociación con la molécula de complejo principal de histocompatibilidad sobre la superficie de la célula que presenta antígenos. En segundo lugar, las células que presentan antígenos de la presente invención opcionalmente tienen una elevada concentración de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad tomando una base por célula. Además, la composición farmacéutica opcionalmente incluye microglobulina beta-2 para facilitar la asociación del antígeno con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad. La concentración de microglobulina beta-2 en la preparación es superior a la que se encontraría in vivo. La selección de la concentración de microglobulina beta-2 necesaria para aumentar la asociación del antígeno derivado del tumor con la molécula del complejo principal de histocompatibilidad está dentro de la habilidad normal dentro de la técnica. En general, la concentración in vivo de microglobulina beta-2 está en el intervalo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 100 \mug/ml, más preferiblemente entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 10 \mug/ml (Rock y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 87: 7517-7521 (1990)).

La vacuna celular estimula el sistema inmune para reconocer específicamente el tumor del sujeto receptor, mejorando con ello la eficacia de la terapia de radiación para tratar al sujeto. Aunque la preparación celular típicamente es una preparación que contiene leucocitos, se considera que otros tipos de células que presentan antígenos están dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, el término "equivalente funcional" de una preparación de leucocitos fotodesactivados se refiere a una preparación que contiene células que presentan antígenos que ha sido tratada con métodos fotoquímicos (por ejemplo, fotoféresis) o no fotoquímicos (por ejemplo, exposición de la célula a temperaturas reducidas) para potenciar la expresión de las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías sobre la superficie de las células presentes en la preparación.

La etapa de irradiación tiene lugar en presencia de un agente fotoactivable. Se pueden usar otros métodos (descritos anteriormente) para inducir la expresión de las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías. El agente fotoactivable puede ser cualquier agente que tiene una afinidad por un componente importante de la célula leucocito o de otra célula que presenta antígenos y que, a través de la unión con el componente, potencia y/o estabiliza la expresión de las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad. Ejemplos de agentes fotoactivables son los psoralenos, las porfirinas, los pirenos, la ftalocianina, la cortisona fotoactivada, los anticuerpos fotoactivados específicamente reactivos a la célula que presenta antígenos, y los anticuerpos monoclonales que han sido unidos a moléculas de porfirina.

Los psoralenos son una clase preferida de agentes fotoactivables. Se han descrito las interacciones de los psoralenos con el ADN, y con componentes de proteínas y lípidos de células T ("T Cell Molecular Targets for Psoralens", Annals of N. Y. Academy of Science 636: 196-208 (1991), Malane, M. y Gasparro, F. Después de la administración oral, los psoralenos son absorbidos por el tracto digestivo, alcanzado niveles pico en sangre y en otros tejidos en de una a cuatro horas y son excretados casi por completo en las 24 horas posteriores a la administración oral.

Estos agentes también pueden ser añadidos directamente a la preparación celular extracorporal. Las moléculas de psoraleno son inertes antes de su exposición a la irradiación con luz ultravioleta o con luz visible y son activados de forma transitoria a un estado excitado después de la irradiación. Estas moléculas activadas de forma transitoria son capaces de fotomodificar moléculas biológicas (por ejemplo, de ADN, de proteína) y de generar otras especies reactivas, por ejemplo, oxígeno singlete, que son capaces de modificar otros componentes celulares. Otros agentes, por ejemplo, la mitomicina C y los compuestos de cis-platino, dañan el ADN entrecruzando cadenas del ácido nucleico. Sin embargo, dichos agentes permanecen en un estado activo cuando son devueltos al paciente y por tanto no son tan deseables como los psoralenos para alterar células con el fin de potenciar la expresión de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad vacías.

Los psoralenos preferidos incluyen 8-metoxipsoraleno (8-MOP), 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (AMT), 5-metoxipsoraleno (5-MOP) y trimetoxipsoraleno (TMP). El 8-MOP es a la vez un fármaco anticancerígeno, un modulador del sistema inmune yun prototipo para el desarrollo de una clase de fármacos que son fotoactivables. El AMT es un análogo sintético soluble en agua del 8-MOP. Este y otros análogos sintéticos solubles en agua del 8-MOP son descritos en Berger y col., "The Medical and Biological Effects of Light", Annals of N. Y. Academy of Science 453: 80-90 (1985). Algunos investigadores han informado de que el 5-MOP no es tan eficaz como el 8-MOP para el tratamiento de la soriasis (Calzavara-Pinton, y col., Exptl. Dermatol. 1: 46-51 (1992)). El TMP es ampliamente usado para tratar pacientes con vitiligo dando como resultado la repigmentación de las áreas de piel despigmentadas.

Los anticuerpos monoclonales que reconocen los fotoaductos 8-MOP-ADN en células irradiadas pueden ser usadas para determinar la cantidad óptima de irradiación de luz ultravioleta o de luz visible para alcanzar la fotodesactivación celular óptima (véase Yang y col., "8-MOP DNA Photoadducts in Patients Treated with 8-MOP and UVA", J. Invest. Dermatol. 92: 59-63 (1989).

Ejemplos Ejemplo 1 Estudios del caso de tres pacientes diagnosticados con Linfoma Cutáneo de Células T (CTCL)

Es bien sabido que el Linfoma Cutáneo de Células T (CTCL) en la etapa de tumor no responde, en términos de supervivencia de pacientes y de periodos libres de enfermedad prolongados, a la quimioterapia convencional y a la radioterapia Total del Cuerpo con Haz de Electrones (TBEB). En general, el tiempo de supervivencia medio de un paciente de CTCL con dos o más tumores superiores a 3 cm de diámetro es de dieciocho meses.

Los estudios de tres casos son presentados a continuación. En cada estudio, un paciente de CTCL fue tratado con terapia de radiación Total del Cuerpo con Haz de Electrones (TBEB) y con terapia de fotoféresis. Después del tratamiento, a cada paciente se le examinó mensualmente la presencia de tumores de piel y recibió biopsias de piel periódicas y escáneres regulares de CAT para determinar si se habían desarrollado linfomas internos. En contraste con la progresión esperada para la enfermedad, cada uno de los pacientes de CTCL descrito a continuación ha mantenido la piel libre de tumores.

(a) Paciente M. K. Perfil del paciente y diagnosis

El paciente M. K., un granjero lechero varón blanco de 68 años de edad, se presentó a nosotros en febrero de 1990 con tumores de piel ampliamente extendidos que había desarrollado a lo largo de un periodo de aproximadamente 1 año. Se llevaron a cabo biopsias de piel y fue diagnosticado de CTCL; un escáner CAT descartó la presencia de linfomas internos obvios.

Terapia

M. K. recibió un total de 3600 RADS de radiación Total del Cuerpo con Haz de Electrones (TBEB) en dos grupos de 18 tratamientos (es decir, 100 RADS/tratamiento) a lo largo de un periodo de nueve semanas. Aproximadamente a mitad de la terapia de radiación TBEB, M. K. recibió terapia de fotoféresis (en dos días sucesivos) por primera vez. M. K. continúa recibiendo mensualmente terapia de fotoféresis en dos días sucesivos.

Evaluación del paciente

Desde el tratamiento, M. K. ha mantenido la piel libre de tumores.

(b) Paciente C. Q Perfil del paciente y diagnosis

El paciente C. Q., un ejecutivo varón blanco de 64 años de edad, se presentó a nosotros en 1986 con grandes tumores de piel (es decir, tumores que tienen un diámetro superior a 3 cm) ampliamente extendidos. Se llevaron a cabo biopsias de piel y se le diagnosticó CTCL; un escáner CAT descartó la presencia de linfomas internos obvios.

Terapia

C. Q. recibió un total de 3600 RADS de radiación Total del Cuerpo con Haz de Electrones (TBEB) en 36 tratamientos (es decir, 100 RADS/tratamiento; cuatro tratamientos por semana) a lo largo de un periodo de nueve semanas. Aproximadamentea mitad de la terapia de radiación TBEB, C. Q. recibió su primera terapia de fotoféresis en dos días sucesivos. C. Q. continuó recibiendo mensualmente terapia de fotoféresis en dos días sucesivos hasta 1992 cuando la terapia de fotoféresis fue interrumpida.

Evaluación del paciente

Desde el tratamiento (siete años), C. Q. ha mantenido la piel libre de tumores.

(c) Paciente C. D. Perfil del paciente y diagnosis

El paciente C. D., un ejecutivo varón blanco de 48 años de edad, se presentó a nosotros en 1988 con más de cincuenta tumores, incluyendo un tumor ulcerado muy grande (es decir, un tumor que tiene un diámetro superior a 7 cm) sobre su muslo derecho. Se llevaron a cabo biopsias de piel y se le diagnosticó CTCL; un escáner CAT descartó la presencia de linfomas internos obvios.

Terapia

C. D. recibió un total de 3600 RADS de radiación Total del Cuerpo con Haz de Electrones (TBEB) en 36 tratamientos (es decir, 100 RADS/tratamiento; cuatro tratamientos/ semana) a lo largo de un periodo de nueve semanas. Aproximadamente a mitad de la terapia de radiación TBEB, C. D. recibió su primera terapia de fotoféresis en dos días sucesivos. C. D. continúa recibiendo mensualmente terapia de fotoféresis en dos días sucesivos.

Evaluación del paciente

Desde el tratamiento, C. D. ha mantenido la piel libre de tumores.

Ejemplo 2 Estudio del caso de un paciente diagnosticado con carcinoma metastático de colon Perfil del paciente y diagnosis

El paciente S. C., un varón de 78 años de edad blanco se presentó a nosotros con una tos severa productiva (escupiendo sangre rojo brillante) y se le diagnosticó que tenía carcinoma metastático de colon y lesiones en el pulmón y el hígado. Una biopsia de la lesión pulmonar mediante broncoscópia demostró que la mayor parte del pulmón derecho del paciente era carcinoma de colon.

Terapia

S. C. fue tratado inicialmente con quimioterapia de 5-fluorouracilo pero no respondió. Por consiguiente, S. C. recibió un total de 3000 RADS de irradiación X en la lesión pulmonar en diez dosis divididas de 300 RADS cada una a lo largo de un periodo de 12 días. La lesión de hígado no recibió irradiación X. Aproximadamente a mitad de la terapia con irradiación X, S. C. recibió su primera terapia de fotoféresis en dos días consecutivos. Se continuó con la terapia mensual de fotoféresis en dos días consecutivos durante cuatro meses.

Evaluación del paciente

Al final del cuarto mes de la terapia de fotoféresis, la metástasis del hígado todavía estaba presente (determinada mediante escáner CAT), pero la lesión pulmonar ya no era evidente. Como quedó establecido por los escáneres CAT, el pulmón permaneció libre de tumores hasta la muerte del paciente aproximadamente tres años después del tratamiento inicial de irradiación X/ fotoféresis.

Ejemplo 3 Inducción de moléculas de MHC de clase I vacías con 8-MAP/UVA en la superficie celular: asociación de moléculas de MHC de clase I vacías con péptidos exógenos Diseño experimental Perspectiva general

Se evaluó la presencia de expresión de clase I vacía después del tratamiento con 8-MOP/UVA en células RMA (Ljunggren y col., Nature 346: 476-480 (1990)) mediante citofluorimetría para determinar si el 8-MOP/UVA desacopla el transporte de los complejos de MHC de clase I asociados a péptidos hasta la superficie celular. Las células fototratadas fueron expuestas a temperaturas que específicamente potencian la aparición de MHC de clase I vacías (aproximadamente 28ºC). Después de la fotodesactivación, las moléculas de clase I vacías fueron cuantificadas añadiendo cualquiera de los péptidos (Secuencia I. D. Números 1 y 2), de cada uno de los cuales se sabe que se une a y estabiliza moléculas MHC (dos fragmentos específicos de nucleoproteína de la gripe). Para determinar si las células tratadas liberaron oligopéptidos que se unen a moléculas de clase I, las moléculas de clase I vacías también fueron cuantificadas inicialmente después del tratamiento.

Células

P. Cresswell (Yale Immunobiology) proporcionó células RMA de murina que contienen sólo unas pocas moléculas de clase I vacías y células de RMA-S, una línea de células mutantes, en las que las moléculas de clase I vacías se ha demostrado que son estables a temperatura ambiente, pero lábiles a la temperatura del cuerpo.

Tratamiento con 8-MOP/UVA

Se expuso células RMA suspendidas en PBS a dosis terapéuticas de 8-MOP (20-200 ng/ml) y de radiación UVA (1-10 J/cm^{2}) con el objetivo de determinar la sensibilidad específica de estas células al fototratamiento. Se evaluó la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano inmediatamente después del tratamiento.

Productos inmunoquímicos

Se obtuvo anticuerpos monoclonales con reactividades específicas a MHC de clase I (K^{b}, hibridoma Y3 de murina ATCC nº HB176 y D^{b}, hibridoma 28148S de murina ATCC nº HB27) a partir de ATCC (Rockville MD). Se preparó oligopéptidos de nucleoproteína del virus de la gripe (NP365-380 y NP345-360) en el Centro Keck de Proteínas. El K^{b} 16 mero de unión (Secuencia I. D. Nº 2 que tiene la secuencia SFIRGTKVSPRGKLST) y el D^{b} 9 mero óptimamente unido (Secuencia I. D. Nº 1 que tiene la secuencia AENENMETM) fueron disueltos en medio IMDM (medio de Dulbecco modificado Iscove, GIBCO, Grand Island NY) en PBS a 50 \muM y almacenados a 4ºC.

Análisis FACS de moléculas MHC de clase I

Las células RMA-S sirvieron como controles positivos para la expresión de moléculas de MHC de clase I. Las células fueron cultivadas en 5% de IMDM, 10% de suero de ternero fetal (FCS, del inglés "Fetal Calf Serum") complementado con 1% de antibióticos pen-strep (GIBCO). Las células fueron recogidas de la incubación (37ºC, 5% de CO_{2}), cultivadas en matraces de tejidos (10^{6}/ml) con tapas ajustadas. Para determinar la estabilidad/labilidad térmica de las moléculas de clase I, las células fueron incubadas en un baño de agua ajustable durante 48 horas a una temperatura dada. Para los ensayos citofluorométricos, se incubó 2 x 1066 células en hielo con 10% de suero humano tipo A B (GIBCO), a continuación con 0,15 ml de sobrenadante de cultivo de tejido de anticuerpo monoclonal anticuase I durante 30 minutos en hielo, fueron lavadas dos veces PBS, y a continuación fueron incubadas con 0,15 ml de inmunoglobulina anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma, St. Louis MO) sobre hielo durante 30 minutos, fueron lavadas dos veces con PBS, fijadas en 1% de formaldehído y analizadas sobre un clasificador de células FACS. Para estabilizar moléculas de MHC de clase I, se añadieron fragmentos de nucleoproteínas de la gripe (Secuencia I. D. Nº 1 ó 2) (50 \muM).

Resultados

La Figura 1 muestra los efectos del 8-MOP (10-300 ng/ml) y de radiación UVA (1 J/cm^{2}) en la supervivencia de células RMA (determinadas por exclusión de azul de tripano). La viabilidad de las células que no fueron expuestas a 8-MOP o a radiación UVA está designada como "no Tx" (es decir, sin tratamiento) en la figura. La viabilidad de las células que fueron expuestas a radiación UVA pero que no fueron expuestas a 8-MOP está designada como "1 J/cm^{2}" en la figura. Se observó un incremento de daño celular dependiente de la dosis al aumentar las dosis de 8-MOP usado en combinación con 1 J/cm^{2}. Las dosis crecientes están indicadas en la figura (es decir, las designaciones de 10, 30, 100 y 300 se refieren a la concentración de 8-MOP en ng/ml).

Los efectos de 8-MOP (100 ng/ml) y de radiación UVA (1 J/cm^{2}) sobre la expresión de clase I y sobre la unión de oligopéptidos específicos (Secuencia I. D. Nº 1) sobre moléculas de clase I de RMA fueron determinados. La Figura 2 representa un conjunto de experimentos que muestran el curso del tiempo para el potenciamiento de moléculas D^{b} MHC de clase I sobre células RMA tratadas con 100 ng/ml de 8-MOP y 1 J/cm^{2} de radiación UVA. En esta serie de experimentos, las células tratadas con 8-MOP/UVA fueron comparadas con las células expuestas sólo a radiación UVA (1 J/cm^{2}).

Se usó análisis FACS para calibrar la extensión de la expresión de clase I usando anticuerpos ATCC específicos para moléculas D^{b} de clase I. El cambio en el canal medio de fluorescencia (\Delta% CMF) fue calculado tomando la diferencia en señal para las células incubadas con y sin oligopéptido de clase I (Secuencia I. D. Nº 2, es decir, AENENMETM). La Figura 2 ilustra que la señal óptima (es decir, el mayor incremento en la expresión de molécula de clase I), fue detectada a las 10 horas del tratamiento 8-MOP/UVA.

El tiempo óptimo para la inducción de expresión de clase I se determina realizando estudios cinéticos más detallados, por ejemplo, evaluando las células a intervalos más frecuentes y en diferentes condiciones de temperatura después del tratamiento con 8-MOP/UVA.

Los antígenos son seleccionados por su capacidad para asociarse con moléculas de clase I vacías usando el método descrito anteriormente FACS. De este modo, el ensayo FACS sirve de protocolo de monitorización para seleccionar las condiciones óptimas para inducir expresión de molécula de clase I vacía, así como de protocolo de monitorización para seleccionar antígenos que son capaces de unirse a y de estabilizar las moléculas de clase I vacías. De este modo, varios péptidos, y las concentraciones óptimas para cada uno, son monitorizados para seguir su capacidad para estabilizar moléculas de clase I vacías.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Universidad de Yale

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(B): CALLE: Collage Street 451

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(C): CIUDAD: New Haven

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(D): ESTADO: Connecticut

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): CÓDIGO POSTAL: 06520

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(i): INVENTOR:

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(A): NOMBRE: Edelson, Richard L.

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(B): CALLE: Coleytown Road 76

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(C): CIUDAD: Westport

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(D): ESTADO: Connecticut

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): CÓDIGO POSTAL: 06880

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(i): INVENTOR:

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(A): NOMBRE: Gasparro, Francis P.

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(B): CALLE: Myra Road 37

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(C): CIUDAD: Hamden

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(D): ESTADO: Connecticut

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): CÓDIGO POSTAL: 06517

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna Celular y Métodos de Uso para el Tratamiento de Malignidades de Tumor Sólido.

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: Wolf, Greenfield & Sacks, P. C.

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(B): CALLE: Atlantic Ave. 600

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(C): CIUDAD: Boston

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(D): ESTADO: MA

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 02210

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(v): FORMA LEGIBLE POR UNA COMPUTADORA:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): COMPUTADORA: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25

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(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: No disponible

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: Adjunta

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(vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/100691

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de Julio de 1993

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(viii): INFORMACIÓN DE AGENTE/ABOGADO:

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(A): NOMBRE: Plumer, Elizabeth R.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36.637

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(C): REFERENCIA/Nº DE CASO: Y0060/7005

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: 617/720-3500

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(B): TELEFAX: 617/720-2441

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ IF NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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\sa{Ala Glu Asn Glu Asn Met Glu Thr Met}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ IF NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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\sa{Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr}

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Claims

1. Uso de una preparación de leucocitos para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, siendo fabricado dicho medicamento mediante un método que comprende:

(a): proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos irradiando el tumor sólido interno con radiación X que tiene suficiente energía para inducir la liberación de dichos antígenos por el tumor;

(b): exponer la preparación de leucocitos que contiene una pluralidad de leucocitos a irradiación con luz ultravioleta A o con luz visible en presencia de un agente fotoactivable para formar una preparación de leucocitos fotodesactivada, expresando dichos leucocitos una pluralidad de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad;

(c): poner en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación de leucocitos fotodesactivada bajo las condiciones necesarias para asociar los antígenos derivados del tumor con las moléculas de complejo principal de histocompatibilidad, formando mediante ello una pluralidad de leucocitos asociados a antígenos; y

(d): organizar dicha pluralidad de leucocitos asociados a antígenos en una forma farmacéuticamente aceptable.

2. Uso de un agente fotoactivable para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, siendo dicho medicamento fabricado mediante un método que comprende:

(a): proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos irradiando el tumor sólido interno con radiación X que tiene suficiente energía para inducir la liberación de dichos antígenos del tumor;

(b): exponer una preparación de leucocitos que contiene una pluralidad de leucocitos a irradiación con luz ultravioleta A o con luz visible en presencia de un agente fotoactivable para formar una preparación de leucocitos fotodesactivada, expresando dichos leucocitos una pluralidad de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad;

3. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tumor sólido interno está asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, de pecho, de ovarios, de útero, de próstata, de testículos, de hígado, de páncreas, de estómago, carcinoma celular escamoso de la falange oral, fibrosarcomas, cáncer de riñón, de vejiga, de cerebro, de espina dorsal, melanoma maligno y carcinoma celular escamoso metastático de la piel.

4. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la composición es para administración a un sujeto que tiene un sistema inmune competente.

5. Un uso según la reivindicación 4, en el que la composición es para administración a un sujeto que tiene niveles absolutos de células T CD8 positivas próximos a los normales.

6. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que irradiar el tumor sólido interno comprende irradiar el tumor con una dosis total de entre 100 y aproximadamente 6000 RADS.

7. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que aislar la pluralidad de antígenos derivados del tumor comprende aislar dichos antígenos a partir de sangre entera.

8. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tratamiento comprende además la etapa de preparar una preparación de antígenos que tiene una concentración enriquecida de antígenos derivados del tumor, y/o la etapa de almacenar la pluralidad de antígenos derivados del tumor antes de ponerlos en contacto con dicha preparación de leucocitos irradiada.

9. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha preparación de leucocitos es aislada a partir del sujeto y, opcionalmente, comprende una pluralidad de linfocitos y/o una pluralidad de monocitos o células B.

10. Un uso según la reivindicación 9, en el que dicha preparación de leucocitos comprende una pluralidad de monocitos o células B y el tratamiento comprende además la etapa de cultivar dichos monocitos o dichas células B antes de exponer dicha preparación a irradiación.

11. Un uso según la reivindicación 9, en el que dicha preparación de leucocitos comprende una pluralidad de linfocitos y es aislada a partir de una fuente seleccionada del grupo que consiste en sangre, fluido linfático, médula ósea, tejido de órgano linfático y fluido de cultivo de tejido.

12. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el agente fotoactivable es un psoraleno y dicho psoraleno, preferiblemente, es seleccionado del grupo que consiste en 8-metoxipsoraleno, amino-metil-trimetilpsoraleno, 5-metoxipsoraleno y trimetilpsoraleno, y, más preferiblemente es 8-metoxipsoraleno.

13. Un uso según la reivindicación 12, en el que dicha radiación ultravioleta A tiene una longitud de onda superior a aproximadamente 420 nm.

14. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor es puesta en contacto con dicha preparación de leucocitos fotodesactivada a una temperatura entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente 30ºC.

15. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la forma farmacéuticamente aceptable de dicho leucocito asociado a antígenos es adecuada para el almacenamiento previo a la administración.

16. Un uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la forma farmacéuticamente aceptable de dicho leucocito asociado a antígenos es adecuada para ser inyectada en la corriente sanguínea del sujeto o para inyección intradérmica.

17. Un uso de una mezcla que contiene una pluralidad de antígenos derivados del tumor sólido mezclados con una pluralidad de células B fotodesactivadas o de monocitos para la fabricación de un medicamento para mejorar la eficacia de la terapia de irradiación X para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, en el que el medicamento comprende una cantidad eficaz de dicha mezcla y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. El uso de una preparación celular que contiene una pluralidad de células que presentan antígenos para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un tumor sólido interno, siendo fabricado dicho medicamento mediante un método que comprende:

(a): proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos irradiando el tumor sólido interno con radiación X que tiene suficiente energía para inducir la liberación de dichos antígenos del tumor.

(b): tratar la preparación celular para potenciar la expresión mediante dichas células de una molécula de complejo principal de histocompatibilidad, siendo cada una de dichas células que presentan antígenos adecuada para la administración al sujeto;

(c): poner en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación celular tratada bajo las condiciones necesarias para formar una pluralidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos; y

(d): organizar dicha pluralidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos en una forma farmacéuticamente aceptable.

19. Un uso según la reivindicación 18, en el que las etapas de tratar dicha preparación celular para potenciar la expresión de una molécula de complejo principal de histocompatibilidad comprende someter a dicha preparación a una temperatura entre aproximadamente 22ºC y 30ºC, y/o irradiar dicha preparación celular en presencia de un agente fotoactivable, y/o poner en contacto dicha preparación celular con una o más citoquinas que se sabe que inducen expresión de una molécula de complejo principal de histocompatibilidad.

20. Una preparación de leucocitos asociados a antígenos, en el que dicha preparación de leucocitos asociados a antígenos es preparable del siguiente modo:

(a): proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor, producida irradiando el tumor sólido interno con radiación X que tiene energía suficiente para inducir la liberación de dichos antígenos del tumor;

(c): poner en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación de leucocitos fotodesactivada bajo las condiciones necesarias para asociar los antígenos derivados del tumor con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, formando mediante ello una pluralidad de leucocitos asociados a antígenos.

21. Una preparación de leucocitos asociados a antígenos según la reivindicación 20, para su uso como medicamento.

22. Una preparación de células que presentan antígenos asociadas a antígenos, en la que dicha preparación de células que presentan antígenos asociadas a antígenos es preparable del siguiente modo:

(a): proporcionar una pluralidad de antígenos derivados del tumor producidos irradiando un tumor sólido interno con radiación X que tiene energía suficiente para inducir la liberación de dichos antígenos del tumor.

(b): tratar una preparación celular para potenciar la expresión mediante dichas células de una molécula de complejo principal de histocompatibilidad, siendo cada una de dichas células que presentan antígenos adecuada para su administración al sujeto;

(c): poner en contacto dicha pluralidad de antígenos derivados del tumor con dicha preparación celular tratada bajo las condiciones necesarias para formar una pluralidad de células que presentan antígenos asociadas a antígenos.

23. Una preparación de células que presentan antígenos asociadas a antígenos según la reivindicación 22, para su uso como medicamento.