PT668772E - Modulacao especifica do sistema imunitario - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA “MODULAÇÃO ESPECÍFICA DO SISTEMA IMUNITÁRIO”

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a métodos e a compostos farmacêuticos especificamente para alterar uma resposta imunitária a um antigénio. Os métodos incluem o tratamento de um antigénio de uma célula para intensificar a manifestação dos maiores complexos de histocompatibilidade de molecular, fazendo em seguida reagir o antigénio, com a colocação de um antigénio na parte exterior do corpo com a finalidade de formar um antigénio associado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As respostas do sistema imunitário podem ser classificados como humoral ou por células mediadoras. Uma resposta humoral é mediada por linfócitos B sob a forma de anticorpos livremente difusíveis. A resposta de uma célula mediadora é mediada particularmente por linfócitos assassinos, como os linfócitos T (“células T”), em vez de anticorpos.

As células T reagem a antigénios externos através de receptores na superfície que são distintos para cada clone da célula T. Os receptores na superfície da célula T são geralmente compostos por duas cadeias ligadas de proteínas de bissulfato com uma única sequência de aminoácido (Edelson, R., “Photopheresis: A Clinically Relevant Immunobiologic Response Modifier”, Annals of N.Y. Academy of Sciences 636: 154-164 (1991). As propriedades físicas destes receptores conferem capacidades específicas de ligação e permitem a cada um dos vários milhões de clones das células T num indivíduo, a actuarem independentemente. O receptor da célula T é capaz de reconhecer especificamente um antigénio só quando este está associado a um criador de superfície num antigénio de uma célula, como um macrófago. Os criadores de superfície pertencem a um grupo de moléculas, conhecido como o maior complexo de histocompatibilidade (MHC). São a ligação do receptor da célula T ao antigénio da célula que induz modificações na célula T, estas modificações constituem colectivamente a resposta da célula mediadora. 1 A indução da expressão de “vazio”, ou seja, desprovido de peptídeo, o maior composto de histocompatibilidade classe I de moléculas submetidas a condições de baixas temperaturas tem sido demonstrado numa linha de célula mutante de murídeo linfoma (Ljuggren et al., Nature 346: 476-480 (1990)). A linha da célula mutante não tem o mecanismo intracelular adequado para carregar os peptídeos intracelulares nas fendas de ligação da recente classe I de moléculas sintetizadas. A linha da molécula mutante classe I, as moléculas são substancialmente vazias e instáveis aos 37°C, mas são estabilizadas quando fornecido uma fonte exógena de peptídeos os quais ligam à classe I de moléculas vazias. Um aumento do nível da maior manifestação do complexo de histocompatibilidade classe I, tem sido também usado para a espécie da linha da célula correspondente (ibid.) quando desenvolvida a temperaturas abaixo dos 37°C. No entanto, os testes utilizados para identificar manifestações classe I nesse sistema não distinguiram a classe I das moléculas vazias, da classe I das moléculas associadas com peptídeos.

Tem também sido demonstrado melhoramento na relativa ineficiência da substituição de um peptídeo exogenamente acrescentado, para peptídeos já presentes nas fendas das moléculas classe I pela adição de exógeno livre B-2-microglobulina (Rock et al., PNAS (USA) 87: 7517-7521 (1990). São necessários dois sinais para induzir a resposta da célula T mediadora, a um antigénio da célula o qual está associado a um outro antigénio. Um primeiro sinal é devido à ligação da célula T ao antigénio da célula. Um segundo, um sinal co-estimulador é enviado pela membrana molecular “adicional” ou pelos mensageiros solúveis do antigénio da célula à célula T correspondente. Estes mensageiros intracelulares solúveis regulam a amplitude e a duração da resposta imunitária, e a eles é dado o termo genérico de, citocinese. Os citocines incluem o grupo anteriormente referido como os linfócitos, monócitos, interlócitos e interferão (Essential Immunology, 7a edição, Publicações Blackwell Scientific, Oxford, Grã-Bretanha, 1991, pags. 140-150). Se o antigénio da célula não emitir um segundo sinal, a célula T fica então paralisada, isto é, incapaz de produzir uma resposta imunitária ao antigénio. Certos tipos de antigénios de células, por exemplo, células T em descanso, são incapazes de emitir um segundo sinal. Consequentemente, na ausência de citocine exógeno ou de outro segundo sinal, tal como células T em descanso, cuja função como antigénio da célula é de reduzir uma resposta imunitária ao antigénio presente e enviar ao antigénio paralisias imunológicas específicas da célula T, cuja membrana receptora tem sido utilizada.

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Outra função das células T é a regulação de uma resposta imunitária através do reconhecimento pelo sistema imunitário do receptor de superfície da célula T. Assim, vários estudos, sugeriram que a capacidade do sistema imunitário de identificar o receptor de um clone de célula T anormal tal como o antigénio toma possível a vacinação de um paciente contra a clonagem patogénica das células T. O linfoma cutâneo da célula T (LCCT) é um exemplo de uma perturbação do sistema imunitário que é causado por uma expansão massiva de um único clone de células T anormais. A fotoquiomoterapia (“photopheresis”) para o tratamento do linfoma cutâneo da célula T tem sido descrito em ( Edelson, R., “Light-activated Drugs”, Scientifíc American 256 (8): 68-75 (1988); Edelson, R., “Photopheresis: A Clinically Relevant Immunobioligic Response Modifier”, Annals of N.Y. Academy of Sciences 636: 154-164 (1991). O tratamento consiste em isolar as células T do paciente, submetendo-as a radiações de um agente fotoactivador (8-MOP) e reinfundir as células T danificadas. O agente 8-MOP é activado pela luz ultravioleta para formar uma molécula temporária, capaz de modificar o ADN celular. Esta terapia segundo informações resulta numa destruição selectiva dos clones malignos das células T.

Acredita-se que a exposição dos clones malignos ao agente 8-MOP e aos raios ultravioleta , seguidos por nova irradiação, as células danificadas do paciente, licitam uma resposta especifica às células T anormais que é mediada pelos receptores de superfície da célula T, ou seja, as células danificadas do clone maligno tinham de facto, preparado o sistema imunitário para destruir especificamente o clone. Basicamente, a fotoquimioterapia “vacina” os pacientes com LCCT contra o seu próprio cancro. A fotoquimioterapia tem também sido utilizada para o tratamento de vários distúrbios auto-imunitários, incluindo pênfigo vulgaris e esclerose sistemática (Rook, A., “Photopherisis in the Treatment of Autoimmune Disease: Experience with Pemphigus Vulgaris and Systematic Sclerosis”, Annals of N.Y Academy of Science 636: 209-216 (1991) e artrite reumatóide (Malawista, S., et al., “Photopherisis for Rheumatoid Arthritis”, Annals of N.Y. Academy of Science 636: 217-226 (1991). A patente U.S. 4.838.842, divulgada em Edelson et al. (Edelson 852) caracteriza um método que modifica a resposta do sistema imunitário de um mamífero a um antigénio. O método Edelson 852 consiste; (a) em entrar em contacto com o sistema imunitário da cobaia com um antigénio específico durante o período de tempo adequado para estimular artificialmente o sistema imunitário, (b) recolher uma amostra de uma célula de sangue de antigénio estimulado da cobaia, (c) tratar a amostra recolhida com a finalidade de modificar as células do antigénio estimulado, e (d) repor a amostra tratada na 3 cobaia. Entrar em contacto com o sistema imunitário da cobaia, introduzir-lhe o antigénio específico, injectando-o por exemplo, directamente na corrente sanguínea, no sistema linfático ou nos órgãos linfóides. Em Edelson 852 é divulgo também que pode ser possível tomar as células incapazes de reconhecer um antigénio, recolhendo uma amostra da célula do sangue da cobaia, tratando-a como acima descrito, repondo-a na cobaia e entrando depois em contacto com o sistema imunitário através de um antigénio específico. A patente U.S. 5.147.289, divulgada para Edelson (Edelson 289), caracteriza métodos não específicos para aumentar a resposta do sistema imunitário de um mamífero a um antigénio. O método compreende (A) o aumento da resposta do sistema imunitário, (a) recolhendo amostras com leucócito do mamífero, (b) tratando a recolha dos leucócitos de forma a alterar as células, (c) repondo os leucócitos tratados no mamífero e (B) entrando em contacto artificialmente com o sistema imunitário do mamífero, através do antigénio durante um período de tempo adequado a fim de estimular uma resposta do sistema imunitário.

No que respeita às patentes Edelson 852 e 289, a recolha de leucócitos pode ser alterada, desactivando por exemplo, as células através de fisioquimioterapia, expondo-as a temperaturas altas ou baixas, a valores altos ou baixos de pH, a pressões altas ou baixas, a soluções hipotónicas, a agentes quimioterapêuticos ou a uma variedade de outras condições desactivadoras. A fotoquimioterapia tem também sido utilizada para prevenir a rejeição de transplantes, injectando em ratos um preparo que contem células fotoinactivadoras executoras T (“ANIMAL”), (Perez, M. et al., “Inhibition of Antiskin Allograft Immunity Induced by Infusions with Photoinactivated Effector T Lymphocytes (PET Cells); “The Congenic Model”, Transplantation 5J_: 1283-1289 (1991). Para preparar as células do ANIMAL, os clones da célula T mediando a rejeição do transplante de pele, foram expandidos in vivo e fotoinactivados utilizando 8-MOP. Perez et al. relata que este procedimento resulta na transferência adoptiva da tolerância da pele, como demonstrado pelo prolongamento do transplante sobrevivente nos recipientes das células do ANIMAL.

Um estudo preliminar para avaliar o potencial terapêutico da quimioterapia em sete pacientes com Sida tem sido relatado em (Bisaccia, E. et al., “Viral-Specific Immunization in AIDS-Related Complex by Photopherisis”, Annals of N.Y. Academy of Science 636:321-330 (1991). Uma vantagem da quimioterapia no tratamento de um paciente com imunodefíciência, tal como pacientes com Sida, é que ao contrário de tratamentos com droga antiviral, a fotoquimioterapia evita a exposição dos elementos do tecido do sistema 4

imunitário à terapia, minimizando assim os danos do sistema de processamento do antigénio.

Tem sido demonstrado que a fotoquimioterapia produz um benefício clínico generalizado numa variedade de perturbações imunitárias que são caracterizadas por um distúrbio na regulação da célula T. Além de produzir um efeito imunitário contra clones de células T autoreactivos, a fotoquimioterapia pode também resultar na indução de mensageiros extracelulares solúveis, por exemplo, o factor de tumor de necrose, o qual tem um efeito auxiliar terapêutico para um número de distúrbios.

As terapias acima descritas têm em comum a capacidade de vacinar contra uma actividade específica da célula T, sem isolar ou identificar o(s) clone(s) responsáveis pela actividade. Nenhuma das referências e/ou patentes citadas divulgam um método para a regulação específica de uma resposta do sistema imunitário. Portanto, há ainda uma necessidade de métodos e compostos farmacêuticos para regular precisamente a resposta do sistema imunitário a um antigénio específico. Tais métodos permitiriam a estimulação de um sistema imunitário competente ou incompetente e permitiria a estimulação de um sistema imunitário numa cobaia debilmente estimulada com antigénio. Estes métodos e compostos iriam de preferência permitir a estimulação do sistema imunitário sob a forma de revacinação imunitária.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona métodos e compostos farmacêuticos específicos para modificar uma resposta imunitária a um antigénio. A invenção proporciona métodos e compostos para imunizar activamente os pacientes contra células malignas ou linfócitos responsáveis pelas perturbações imunitárias.

De acordo com um dos aspectos da invenção, é proporcionado um método para formar um antigénio associado ao antigénio da célula. O método consiste no tratamento de um preparo que contem um antigénio da célula para aumentar a manifestação através da célula, de um maior complexo de histocompatibilidade molecular e reagir ao antigénio da célula, tratado na parte exterior do corpo, para formar um antigénio associado. Numa estrutura preferencial, os antigénio são células T as quais tem sido tratadas para aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular classe I de histocompatibilidade, e os antigénios são peptídeos. Os antigénios peptídeos são associados a um tumor maligno sólido, a um distúrbio de imunodeficiência ou a um distúrbio de hipersensibilidade . 5

Um método preferencial para aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular, é sujeitar o preparo que contem o antigénio da célula a uma temperatura ambiente. São também fornecidos métodos alternativos de tratamento ao antigénio.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para criar um preparo farmacêutico para administração num mamífero. O método consiste na colocação do antigénio associado, acima descrito, ou componentes do mesmo, num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas.

De acordo, ainda com outro aspecto da invenção, é proporcionado um método especifico para modificar a resposta do sistema imunitário de um mamífero a um antigénio. O método consiste em administrar o preparo farmacêutico, acima descrito, ao mamífero. Numa estrutura preferencial, os antigénios das células são isolados num recipiente humano, são tratados e repostos no paciente sob a forma de antigénio associado. Facultativamente, o preparo farmacêutico é armazenado em alíquotas que contêm uma quantidade de antigénios associados dos antigénios das células, suficiente para estimular a resposta imunitária do paciente. A selecção de uma quantidade de células necessárias para estimular a resposta imunitária do paciente, está nas capacidades dos peritos na matéria sem terem de recorrer à experimentação. A quantidade de células é, em parte, dependente da idade do paciente bem como do seu peso e do seu perfil médico. De preferência, a quantidade de células classificadas vão de um mínimo de cerca de 25.000 a um máximo de cerca de 200 x 106, o antigénio da célula é suficiente para estimular a resposta imunitária do paciente (Bem-Nun, A., et al., “Vaccination against autoimmune encephalomyelitis with T lymphocyte line cells reactive against myelin basic protein”, Nature 292: 60-61 (1981); Holoshitz, J., et al., “Lines of T lymphocytes induce or vaccinate against autoimmune arthritis”, Science 219: 56-58 (1983); Lider, O., et al., “anti-idiotypic network by T cell vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis”, Science 239: 181-183 (1988); Khavari, P., et al., “Specific vaccination against photoinactivated cloned T cells”, Abstract Clin. Res. 36: 662A (1988); and Edelson, R., et al. “Treatment of cutaneous T cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy”, N. Engl. J. Med. 316: 297-303 (1987). O tratamento do antigénio da célula para aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular, consiste na irradiação do antigénio através de um agente fotoactivador. Em alguns casos, o agente fotoactivador pode ser administrado via oral no paciente antes do momento do aumento. 6

De acordo ainda com outro aspecto da invenção, é fornecido um composto farmacêutico com a finalidade de modificar uma resposta do sistema imunitário a um antigénio. O composto consiste num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas e uma pluralidade de antigénios das células, tendo cada célula na sua superfície o maior complexo de moléculas de histocompatibilidade associadas a um antigénio. Numa estrutura preferencial, a pluralidade do maior complexo de moléculas de histocompatibilidade representa uma população relativamente homogénea. O antigénio da célula da presente invenção possui uma elevada concentração da maior histocompatibilidade de moléculas, quando comparado ao processo natural correspondente do antigénio da célula. O preparo contem uma quantidade de antigénios das células suficiente para modificar a resposta do sistema imunitário do paciente. A selecção de uma quantidade necessária para modificar a resposta imunitária do paciente está dentro das capacidades dos peritos na matéria sem terem a necessidade de recorrer à experimentação. A quantidade de células é, em parte, dependente da idade do paciente, do seu peso e do perfil médico. De preferência, a quantidade de células vão de um mínimo de cerca de 25.000 a um máximo de cerca de 200 x 106, o antigénio é suficiente para estimular a resposta imunitária do paciente. ( Ben-Nun, A., et al., supra., Holoshitz, J., et al., supra.; Lider, O., et al., N. Engl. J. Med. 316, supra.

Estes e outros aspectos da invenção bem como várias vantagens e utilidades serão mais aparentes, com a referência à descrição detalhada das estruturas preferenciais e na presença dos desenhos anexados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1, ilustra o perfil HPLC dos fragmentos oligopeptídeos produzidos segundo a divisão quimotripsina de lisozima após o tratamento com 8-MOPeUVA. A Figura 2, demonstra o efeito do 8-MOP e do UVA nas células RMA sobreviventes, como determinado pela rejeição de tripano azul; A Figura 3, demonstra o decurso do tempo (horas após o tratamento) para aumentar a classe I Db de moléculas MHC nas células RMA, tratadas com 100 Λ ng/ml 8- MOP e 1 J/cm de UVA para um composto das experiências; e A Figura 4, demonstra o decurso do tempo (horas após o tratamento) para aumentar a classe I Kb de moléculas MHC em células RMA, tratadas com 100 ng/ml 8-MOP e 1 J/cm de UVA para um composto das experiências. 7

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um método para formar um antigénio associado, consiste, (a) em tratar um preparo contendo um antigénio da célula para aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade e (b) fazendo reagir o antigénio da célula tratada, através de um antigénio no exterior do corpo com a finalidade de formar o antigénio associado.

Como aqui usado o termo antigénio inclui peptídeos, nucleoproteínas, nucleoácidos, polissacarídeos e analógicos, destas moléculas. O termo analógico inclui os antigénios acima identificados os quais têm sido modificados, por agentes químicos ou por divisão enzimática, por moléculas sintéticas contendo parte ou a totalidade dos antigénios acima identificados, bem como moléculas híbridas, por exemplo, moléculas contendo porções de pelo menos dois antigénios diferentes. Os analógicos são preparados utilizando métodos de síntese químicos ou bioquímicos, empregando por exemplo técnicas de clonagem, de acordo com métodos comuns na prática da ciência. Geralmente, um antigénio é uma qualquer molécula, a qual possa potencialmente fazer o sistema imunitário responder. Desta maneira, o termo antigénio inclui antigénios autólogos, por exemplo, antigénios associados de tecido circulatório com perturbações imunitárias ou antigénios cancerosos que estão presentes nas células autológos cancerosas, mas não são expressas num estado não-neoplasma, bem como os antigénios exógenos.

Os antigénios incluem proteínas e/ou peptídeos associados a uma reacção alérgica (por exemplo, veneno, penicilina), a um estado patológico, a uma perturbação imunológica ou de hipersensibilidade. As perturbações características de imunodeficiência incluem, o síndroma de (SIDA) adquirido, alguns tipos de cancro, a imunodeficiência típica de velhice, e a imunodeficiência seguida de uma terapia imunosupressiva. A hipersensibilidade é totalmente definida para incluir uma reacção de tipo retardado, perturbação imunitária, alergia, perturbação infecciosa, rejeição de transplantes, e reacção transplante contra hóspede. Mais especifícamente, perturbações imunitárias típicas incluem artrites reumatóides, pênfigo vulgaris, esclerose sistemática e lúpus eritematoso sistemático. A Sida está relacionada a antigénios incluí o núcleo da proteína p24, o invólucro da proteína gpl20, gp41, gp55, e gp66/31 (Bisaccia, E. Et al., supra.).

Os antigénios associados com um estado patológico, por exemplo, peptídeos derivados de um tumor maligno sólido, são isolados através de uma intervenção cirúrgica removendo a totalidade ou parte do tumor e extraindo os antigénios associados. Além de, a cultura de tecido sobrenadante da suspensão das células malignas e plasma dos pacientes com malignidade, pode servir como fonte de antigénios associados de tumores. Os antigénios característicos de 8 cancro inclui antigénios de tumor tais como os descritos por P. Boon em “Toward a Genetic Analysis of Tumor Rejection Antigens”, Adv. Câncer Res. 58: 177-210 (1992). Como divulgado por Boon, supra., os antigénios de tumor característicos ( incluindo as respectivas sequências de aminoácidos para as formas normais e mutadas do antigénio, respectivamente) inclui: P91A (Sequência N°l) (isoleucina- serina- trionina- glutamina- asparagina- argina-argina- alina- leucina- ácido aspártico- valina- alina; (Sequência N°2) isoleucina-serina- trionina- glutamina- asparagina- histidina-argina- alina- leucina- ácido aspártico- valina- alina); P35B (Sequência N°3) (glicina- prolina- histidina-serina- serina- asparagina- fenilolina- glicina- tirosina; (Sequência N°4) glicina-prolina- histidina- serina- asparagina- asparagina- fenilolina- glicina- tirosina); PI98 (Sequência N°5) (lisina- tirosina- glutamina- alina- valina- trionina- alina-trionina- leucina- ácido glutânico- ácido glutânico; (Sequência N°6) lisina-tirosina- glutamina- alina- valina- trionina- trionina- trionina- leucina- ácido glutânico- ácido glutânico); e PIA (Sequência N°7) (ácido glutânico- isoleucina-leucina- prolina- leucina- glicina- tripsófano- leucina- valina- fenilolina- alina-valina- valina; (Sequência N°8) ácido glutânico- isoleucina- leucina- prolina-leucina- glicina- tripsófano- leucina- alina- fenilolina- alina- valina- valina). Não há necessidade de purificar os peptídeos derivados das células malignas dos pacientes, antes de os usar de acordo com o método da invenção. Pode ser desejável, no entanto, fazê-lo de modo a aumentar a concentração do antigénio na superfície do antigénio de acordo com os métodos da invenção. Além disso, se os antigénios peptídeos são purificados e ordenados, podem em certos casos então serem preparados sinteticamente. O termo antigénio inclui também antigénios associados com uma perturbação de hipersensibilidade, e em particular, os antigénios associados com uma perturbação de hipersensibilidade mediada pela expansão do clone de células T anormais circulatórias. Numa estrutura preferível, o antigénio é derivado de uma célula T receptora típica de clonagem. A presente invenção proporciona desta forma um método para aumentar uma reacção imunitária específica do clone a qual elimina ou impede a proliferação de uma população anormal de células T.

Os antigénios das células são colocados num preparo que é isolado de, por exemplo, sangue, fluido linfático, medula, tecido orgânico linfático ou culturas de células linfáticas. De preferência, o antigénio das células são células normais, isto é, de origem humana ou sintéticas. O termo “células mutantes”, refere-se a células com mutações afectando o mecanismo intracelular para carregar peptídeos intracelulares nas fendas de junção da recém Classe I de moléculas sintetizadas. Nas estruturas preferíveis, os antigénios das células normais de origem humana são leucócitos, de preferência células T. Estas 9 células podem ser isoladas das amostras do fluido humano, por exemplo sangue periférico, de acordo com os procedimentos padrão bem conhecidos na ciência. A expressão “antigénio das células” refere-se a uma classe de células capazes de transferir antigénio a células do sistema imunitário e de reconhecer antigénio quando este está associado com um maior complexo molecular. O antigénio das células media uma resposta imunitária a um antigénio específico preparando o antigénio numa forma que seja capaz de associar com um maior complexo de histocompatibilidade molecular na superfície do antigénio da célula. O antigénio das células são de tão diversos tipos de células, como macrófagos, células T e células sintéticas (“artificiais”). Numa estrutura, a célula artificial é uma vesícula, por exemplo, liposoma, tendo um lípido com uma membrana de duas camadas semelhante ao lípido de duas camadas de uma célula de existência natural. O liposoma inclui um complexo de histocompatibilidade molecular associado ao lípido de duas camadas. Estes diversos tipos de células têm em comum a capacidade de disponibilizar o antigénio sob uma forma que seja reconhecido pelos receptores de uma célula T específica.

As células T incluem células T auxiliares e células T citotóxicas. Cada clone de célula T possui um receptor de superfície diferente o qual reconhece o antigénio unicamente quando este está associado a um maior complexo de histocompatibilidade molecular na superfície do antigénio da célula. As células T que são activadas pela combinação com um antigénio e expandidas por uma proliferação de natureza clonal em executor e célula de memória as quais proporcionam uma imunidade especifica ao antigénio (Essential Immunology, supra, pp. 28-31). As células T citotóxicas ligam o antigénio que está associado ao maior complexo de histocompatibilidade de moléculas classe I. As células T auxiliares reconhecem e ligam o antigénio associado com o maior complexo de histocompatibilidade de moléculas classe II. O termo de “maior complexo de histocompatibilidade” refere-se a uma molécula num antigénio da célula que possui a capacidade de se associar antigénio para formar um antigénio associado ao antigénio da célula. A identificação do antigénio associado pela célula T é mediada pelo receptor de superfície da célula T. Numa estrutura preferencial, o maior complexo de histocompatibilidade molecular é de classe I ou de classe II. A classe I de moléculas, composta por uma grande cadeia e ligada por uma molécula não convalente beta-2-microglobulina, inclui uma fenda ou fresta para receber o antigénio. Por consequência, o antigénio tem um tamanho e dimensão que permite a sua entrada na fresta. O tamanho e dimensão da fresta é conhecido pelos peritos na matéria ( F. Latron, “A Criticai Role for Conserved Residues in the Cleft of KLA-A2 in the Presentation of a Nonapeptide to T- 10 cells”, Science 257: 964-967 (1992)). De preferência, o antigénio ajusta-se no interior da fresta, mas é ainda acessível a uma célula T capaz de reconhecer o antigénio quando está associado com a classe I de moléculas. Numa estrutura ideal, o antigénio é um peptídeo tendo entre oito a dez aminoácidos, dois dos quais são resíduos hidrófobos para reter o peptídeo na fresta. O peptídeo pode por exemplo, ser derivado de um tumor, de um tecido de uma proteína virai ou de uma proteína bacteriana. São divulgados vários métodos para aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular. O método mais simples para aumentar consiste na redução da temperatura, ou seja, refrigerar o preparado que contem o antigénio aproximadamente à temperatura ambiente, entre cerca de 21°C a 28°C. De preferência, a temperatura do preparado é reduzida para entre 21°Ca22°C.

Crê-se que a redução da temperatura resulta numa manifestação aumentada do maior complexo de histocompatibilidade molecular classe I prevenindo a instabilidade das moléculas “vazias” classe I, as quais são termodinamicamente instáveis a temperaturas fisiológicas. O termo “manifestação aumentada” aqui usada, refere-se a uma célula que carrega na sua superfície o maior complexo de histocompatibilidade de moléculas vazias que seria carregado na superfície de uma célula de origem natural. O termo “vazia” aqui usado, refere-se a uma classe I de moléculas a qual não é associada a um antigénio. Essencialmente, toda a classe I de moléculas presente na superfície da célula a temperaturas fisiológicas carregam pequenos peptídeos nas suas fendas. No entanto, a uma temperatura ambiente (21-28°C), a classe I de moléculas “vazias” são estáveis e disponíveis para ligar os peptídeos extracelular apropriados.

Contudo um outro método para aumentar a manifestação do maior complexo molecular de histocompatibilidade, e em particular, para aumentar a manifestação do maior complexo de moléculas vazias de histocompatibilidade, para pôr em contacto o preparo com um citocine. O termo citocine inclui as moléculas anteriormente referidas como linfócitos, monócitos, interlócitos e interferãos (Essential Immunology, supra., pp. 140-150) e inclui, por exemplo, interferão gama, necrose de tumor de factor alfa e factor estimulante de colónia de granulócito monócito, bem como de moléculas da família dos interlócitos. Os citocines são utilizados para aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular em alguns antigénios das células, por exemplo, os monócitos. 11

Todavia um outro método para aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular, consiste em sujeitar o preparo à fotoquimioterapia, ou seja, irradiando o preparo na presença de um agente fotoactivador. Crê-se que a fotoquimioterapia interrompe a sequência de reacções bioquímicas das células responsáveis pela preparação intracelular do antigénio numa forma que se ajuste no interior da fresta definida pelo maior complexo de histocompatibilidade molecular. Como resultado da fotoquimioterapia, o maior complexo de histocompatibilidade molecular na superfície do antigénio da célula não são saturados com antigénio.

Além disso, crê-se que a morte programada das células, através de fotoquimioterapia ou por outros meios, podem conduzir à libertação de miríade de oligopeptídeos e/ou de proteínas dessas mesmas células. Estes peptídeos/proteínas anteriormente invisíveis podem entrar e associarem-se com o maior complexo de histocompatibilidade de moléculas vazias das células sobreviventes para formarem uma espécie artificial de antigénios associados, os quais poderão ser depois testados pela sua capacidade de conferir ao recipiente uma resposta imunitária benéfica.

Como aqui utilizado, a fotoquimioterapia refere-se à exposição de um preparo de antigénios de células a uma radiação na presença de um agente fotoactivador. Se o agente fotoactivável é um psoríaco (descrito abaixo), a radiação é preferencialmente de irradiação ultravioleta, mas pode ser de luz visível (Gasparro, F., et al., “The Excitation of 8-methoxypsoralens with visible light. Reversed Phase HPLC Quantitation of Monoadducts and Crosslinks” (in press)). Os procedimentos da fotoquimioterapia são caracterizados na Patente U.S. 5.147.289. A fotoquimioterapia pode ser realizada numa corrente contínua ou em série, como descrita na patente de Edelson 289. Em poucas palavras, a fotoquimioterapia contínua consiste na formação de um preparo de células numa corrente na parte exterior do corpo, fazendo-a correr através de uma câmara de tratamento transparente à radiação ultravioleta, e irradiando a corrente na câmara com uma radiação ultravioleta na presença do agente fotoactivador. O momento da irradiação ocorre na presença de um agente fotoactivador. De acordo com um aspecto da invenção, o preparo do antigénio das células contêm fluído na parte exterior do corpo no qual o agente fotoactivador está presente. De acordo ainda com uma outra estrutura, o agente fotoactivador está presente no interior ou na superfície do antigénio da célula. Desta maneira, o agente fotoactivável pode ser administrado ao paciente, antes de recolher o material do antigénio do paciente para tratamento. 12 O agente fotoactivável pode ser qualquer agente o qual possua um afinidade com um componente importante do antigénio e o qual que com a união ao componente, aumenta e/ou estabiliza a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular. Temos como agentes fotoactiváveis típicos os psoríacos, as porfírias, os pirénios, naftalenocianina, uma cortisona fotoactivada, anticorpos fotoactivados especialmente reactivos ao antigénio da célula, e anticorpos monoclonais os quais têm sido unidos a moléculas porfírias.

Os psoríacos são a classe preferida de agentes fotoactivadores. A interacção dos psoríacos com o ADN, componentes de proteína e lípido das células T têm sido descritas em (“T Cell Molecular Targets for Psoralens”, Annals of N.Y. Academy of Science 636: 196-208 (1991), Malane, M. e Gasparro, F. Após a administração oral os psoríacos do aparelho digestivo, atingindo os níveis máximos no sangue e em outros tecidos, em uma a quatro horas e são excretados quase por completo em 24 horas. Estes agentes podem também ser acrescentados directamente no preparo na parte exterior do corpo da célula. As moléculas do psoríaco ficam imóveis até à irradiação da luz ultravioleta e são transitoriamente activadas a um estado excitado após a irradiação. Estas moléculas transitoriamente activadas são capazes de fotomodificar o ADN e criar outra espécie reactiva, por exemplo, oxigénio singulete, os quais são capazes de modificar outros componentes celulares. Outros agentes, por exemplo, mitomicina C e compostos de platina, danificam o ADN pelo elemento de ligação transversal abandonado do nucleoácido. No entanto, tais agentes permanecem num estado activo quando devolvidos ao paciente, desta maneira não são tão eficazes quanto os psoríacos para tratamento das células.

Os psoríacos preferidos incluem 8-metóxipsoríacos (8-MOP), 4-aminometilo-4,5, 8-trimetilopsoríacos (AMT), 5-metilopsoríacos (5-MOP) e trimetilopsoríacos (TMP). O 8-MOP é tanto uma droga anti-cancerígena como, um modulador de uma resposta imunitária e um protótipo para o desenvolvimento para uma classe de drogas que são fotoactiváveis. O AMT é uma água solúvel sintético analógica do 8-MOP. Esta e outras águas solúveis sintético analógicas ao 8-MOP são caracterizadas em Berger et al., “The Medicai and Biological Effects of Light”, Annals of N.Y. Academy of Science 453: 80-90 (1985). Alguns investigadores informaram que o 5-MOP não é tão eficaz quanto o 8-MOP no tratamento de psoríase (Calzavara-Pinton, et al., Exptl. Dermatol. 1: 46-51 (1992)). O TMP é largamente usado para tratamento de pacientes vitiligos resultando na repigmentação de zonas da pele com falta de pigmentação. 13

Os anticorpos monoclonais os quais reconhecem o 8-MOP-ADN fotoadutivos em células irradiadas podem ser utilizados para determinar a quantidade ideal de irradiação ultravioleta ou de luz visível para alcançar a inactividade ideal da célula T ( ver Yang et al., “8-MOP DNA Photoadducts in Patients Treated with 8-MOP and UVA”, J. Invest. Dermatol. 92:59-63 (1989). A activação de genes seleccionados durante a morte programada das células conduz à síntese dos núcleos e proteidos os quais participam por último na destruição da célula.

As condições para a administração oral de 8-MOP são caracterizadas na patente U.S. 5.147.289. A exposição da parte exterior do corpo a um agente fotoactivável proporciona diversas vantagens sobre a dosagem da administração oral. Os níveis de dosagem são mais facilmente controlados e mantidos in vitro. Além do mais, agentes administrados na parte exterior do corpo podem ser associados a portadores de drogas que iriam de outra forma ser demasiado tóxicos para administração oral. Tais portadores podem ser utilizados para atingir o agente numa célula específica. Por exemplo, a insulina tem sido utilizada para carregar muitas moléculas fotoreactivas, por exemplo, fluoresceína e psoríaco, em linfócitos T activados e anticorpos monoclonais têm sido usados para distribuir liposomas com pirénio fotoreactivo incorporado na sua membrana para alcançar as células T (ver Berger, C., et al., “Comparison of Synthetic Psoralen Derivatives and 8-MOP in the Inhibition of Lymphocyte Proliferation”, Annals of N.Y. Academy of Science 453: 80-90 (1985). Tal portador mediado distribuidor de droga fotoactivável pode ser utilizado de acordo com a presente invenção para distribuir uma droga fotoactivável directamente no antigénio da célula. A invenção proporciona de igual modo um método para fabricar um preparo farmacêutico para administração em mamíferos. O antigénio tratado das células ( com uma manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular aumentada) são activados com antigénio na parte exterior do corpo para formar um antigénio associado. O antigénio pode ser colocado num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas antes do tratamento das células para aumentar a manifestação, e antes da reacção das células tratadas com antigénio na parte exterior do corpo ou seguido da formação do antigénio associado. De preferência, o antigénio é activad na presença de uma concentração de microglobulina beta-2 que irá aumentar a associação do maior complexo de histocompatibilidade molecular com um antigénio exógeno. A concentração de microglobulina beta-2 é maior que a concentração de microglobulina beta-2 que iria ser encontrado em in vivo. A selecção da concentração de microglobulina beta-2 necessária para aumentara associação do antigénio com o maior complexo de histocompatibilidade molecular está dentro 14

da prática usual da ciência. Geralmente, uma quantidade de microglobulina beta-2 é acrescentada para proporcionar uma concentração indo de cerca de 2 a cerca de 10 microgramas/m (Rock et al., PNAS (USA) 87: 7517-7521 (1990). A invenção proporciona mais à frente um método para modificar especificamente a resposta do sistema imunitário de um mamífero a um antigénio. O método envolve a administração do composto farmacêutico acima descrito a um mamífero. Numa estrutura preferencial, o antigénio associado são armazenados em alíquotas contendo uma quantidade de antigénio associado suficiente para estimular a resposta imunitária do mamífero. Como descrito acima, a determinação da quantidade de células necessárias para estimular a resposta imunitária do paciente está dentro da prática comum da ciência. De preferência, uma quantidade de células indo de um mínimo de cerca da 25.000 a um máximo de cerca de 200 x 106 de antigénio é suficiente para estimular a resposta imunitária do paciente. A quantidade de células usadas irá, em parte, ser dependente se o antigénio das células são eficientes,- por exemplo, células B ou monócitos- ou ineficientes, - por exemplo, células T. De acordo com um aspecto da invenção, um agente fotoactivável é administrado a um paciente humano antes de isolar o antigénio das células do paciente. O antigénio associado é colocado de novo no paciente de acordo com qualquer modo apropriado de administração conhecido na ciência, por exemplo, por injecção na corrente sanguínea ou o sistema imunitário do paciente.

Também dentro do âmbito da invenção são os compostos farmacêuticos que modificam uma resposta imunitária a um antigénio. O composto consiste numa pluralidade de antigénios associados colocados num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas. A pluralidade de antigénios associados diferem na ocorrência natural correspondente das células em diversos sentidos. O antigénio da invenção representa uma população de células relativamente homogénea. Isto acontece principalmente porque o antigénio é na sua forma final quando é activado com o antigénio das células, isto é, o antigénio não é mais tarde preparado pelo antigénio das células antes da associação com o maior complexo de histocompatibilidade molecular na superfície do antigénio da célula. O antigénio associado ao antigénio das células da presente invenção é mais além diferenciável da ocorrência natural correspondente das células, nisso as células anteriores possuem uma concentração elevada do maior complexo de histocompatibilidade molecular por cada base de célula. Consequentemente, o antigénio da célula da invenção apresenta vantajosamente um aumento do. número de antigénios moleculares similares à resposta imunitária do paciente. De preferência, o antigénio é autólogos, por exemplo, um antigénio de tecido circulatório ou um antigénio associado de um tumor a um peptídeo que não está num estado não neoplástico. Em alguns casos, onde a tolerância imunológica a um antigénio exógeno (como uma droga alergénica ou alérgenos ambientais, por exemplo, secreção irritante de urtiga) é desejável que o antigénio exógeno possa 15 ser utilizado. Similarmente, onde um antigénio contra-reactivo artificial é altamente estimulador da imunização contra um “próprio” antigénio, os tais antigénios artificiais podem ser incluídos. Opcionalmente, o composto farmacêutico contém uma concentração de microglobulina beta-2 maior do que seria encontrado in vivo. A selecção da concentração de microglobulina beta-2 necessária para aumentar a associação do antigénio com o maior complexo de histocompatibilidade molecular está dentro da prática comum da ciência. A concentração comum da microglobulina beta-2 está num limite de cerca de 2 para cerca de 10 ug/ml (Rock et al., supra.). A microglobulina beta-2 está incluída no preparo farmacêutico para facilitar a associação do antigénio com o maior complexo de histocompatibilidade molecular.

Exemplos A presente invenção proporciona métodos e compostos farmacêuticos com a finalidade de modificar a resposta imunitária de um mamífero a um antigénio específico. Não há necessidade que o antigénio seja isolado antes do uso de acordo com o método da invenção. Portanto, o antigénio pode, por exemplo, ser um peptídeo contendo extracto derivado de uma cultura de tecido fluído de um tumor. Em alternativa, o antigénio pode ser um peptídeo sintético correspondendo a um receptor de superfície típico de clonagem bem definido para um clone anormal de células T. Os exemplos seguintes ilustram utilidades representativas da presente invenção.

Exemplo 1. Caracterização dos fotoadutivos 8-MOP: A fotoreactivadade dos psoríacos em relação aos aminoácidos tem sido examinado por diversos ivestigadores, no entanto, o psoríaco aminoácido fotoadutivo não tem sido previamente caracterizado. A análise de proteínas nos aminoácidos expostas a psoríacos activados através de raios ultravioleta indica que os abjectivos da fotomodificação (mas não necessariamente fotoadição) são os aminoácidos aromáticos: tirosina, tripsófano, histidina e fenilolina, bem como mettionina. A. Fotomodificação de lisozima. (1) Fotomodificação directa da lisozima:

Lisozima (0,4 mg/ml) e 8-MOP (0,04 mg/ml) incluindo vestígios de ( [3 H] 8-MOP) foram expostos aos UVA (3,6 mw/cm2; filtrados com uma janela de vidro para remover os UVB). Foram retiradas as alíquotas passados 15, 30, 60 e 120 minutos. Foram expostos aos UVA e exaustivamente dialisados utilizando água destilada num microdialisador (BRL, Bethesda, MD). Foi analizada uma alíquota por cada amostra através de uma análise de cintilação liquida para 16 determinar a extensão de convalência da fotoligação do (8-MOP). Os resultados são apresentados no seguinte quadro:

Minutos de exposição aos UVA sinais de 8-MOP/sinais de Lisozima 0 0 30 0,90 60 2,04 120 1,86 (2) Efeito da Fotoligação do Psoríaco na lisozima no Processo Enzimático: A fotomodificação 8-MOP da lisozima resultou num processo enzimático alterado através de quimotripsina. As amostras de lisozima fotomodificada acima descritas foram hidrolisadas enzimaticamente utilizando tripsina e/ou quimotripsina (Yale Protein Center). A tripsina reconhece um número limitado de segmentações e portanto, é mais específica que a quimotripsina. A quimotripsina reconhece especificamente segmentações as quais incluem resíduos de tripsina e de tripsófano. Desta forma, era esperado que o psoríaco de fotomodificação da lisozima iria reduzir o número de fracções de quimotripsina como resultado da fotoadição de psoríaco nestes aminoácidos (TYR, TRP).

Os resultados HPLC (figura 1: Topo = B-MOP/UVA tratado; Fundo = não tratado) demonstraram que o tratamento de lisozima com 8-MOP e UVA alteraram o padrão dos fragmentos de oligopeptídeo produzido seguindo o tratamento das amostras de lisozima com quimotripsina. Os oligonucleótidos são indicados com um asterisco (*) na figura. B. Fotomodificação de um Pinto albumina A fotoligação do 8-MOP aos aminoácidos da albumina foi demonstrado seguindo a excitação com luz visível (419 nm). Aproximadamente 0,1 % dos fotoadutivos foram observados por aminoácidos. A albumina (0,4 mg/ml) e 8-MOP (0,04 mg/ml) contendo vestígios de [3 H] 8-MOP) foram expostos a uma radiação visível de (419 nm) por 60 minutos, e daí em diante dialisado exaustivamente com água destilada num microdializador (BRL, Bethesda, MD). Uma alíquota de amostra foi analisada através da análise de cintilação líquida. A extensão de convalência fotounindo 8-MOP ao albumina é aproximadamente 0,039 8-MOP moléculas/albumina por molécula. 17

C. Fotomodificação directa de um aminoácido oligopeptídeo 8 (VIH peptídeo T).

Um aminoácido oligopeptídeo oito (D-ala-ser-thr-thr-thr-asn-tyr-thr-NH2, (peptídeo amido -T preventivo de VIH) foi seleccionado para fotomodificação porque continha uma única tirosina que podia servir como alvo para a fotomodificação de 8-MOP. O peptídeo T VIH (0,4 mg/ml) e 8-MOP (0,04 mg/ml) contendo vestígios de [3H]8-MOP) foram expostos aos UVA (3,5 mW/cm2; filtrado com uma janela de vidro para remover os UVB). As alíquotas foram retirados após 15 e 30 minutos. A exposição aos UVA, dializou exaustivamente utilizando água destilada como acima descrito, e analisou por cintilometria líquida. A extensão da convalência de fotoligação de 8-MOP foi determinada como sendo a seguinte:

Minutos de exposição aos UVA 8-MOP adutivos/ peptídeos HIV 15 0,028 30 0,041

Os alíquotas dos peptídeos HIV tratados foram também analisados por uma fase invertida de HPLC (Vydac C4 fase analítica invertida coluna 4,6 x 250 mm). VIHp não modificado foi dissolvido aproximadamente 16 minutos. Utilizando uma declinação de cianeto de metilo (ACN) e 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) (0-60% sobre um período de 30min). VIHp fotomodificado com 8-MOP dissolve-se a cerca de 17 min, como determinado por análise de cintilação líquida das fracções recolhidas durante a fase invertida de análise, os oligopeptídeos dissolvidos foram parcialmente caracterizados utilizando uma série de detectores para sondar diodos (Spectra-Physics). A absorção dos raios ultravioleta de 200-360 nm foi controlada e acumulada por um microcomputador de interface IBM PS2/Modelo 60. A análise de dados cromatográficos pode ser utilizada para proporcionar um espectro total dos UV de qualquer ponto máximo no cromatograma. Oligopeptídeos não modificados (contendo um aminoácido aromático) demonstraram uma “proteína” típica com um ressalto característico aos 280 nm e um comprimento de onda curto no ponto máximo elevando-se da união de absorção do peptídeo. Os oligopeptídeos que contém metade de azido demonstrado uma banda adicional de UV perto dos 320 nm e portanto, foram facilmente localizados no cromatograma HPLC. No entanto, não foram usados no exemplo descrito acima, psoríacos, iriam se utilizados manifestar um componente de absorção de comprimento de onda maior. 18

Exemplo 2. Formação de um Antigénio Associado aos Antigénio das Células: A. Tratamento de Leucócitos Mononucleares para Aumentar a Manifestação do Maior Complexo de Histocompatibilidade molecular:

Os leucócitos mononucleares, contendo um antigénio das células, são recolhidos de um paciente através de um procedimento de leucoquimioterapia. A recolha dos leucócitos é exposta a 8-MOP numa concentração entre de cerca 1 ng/ml a cerca 10.000 ng/ml e a raios ultravioleta A ou a luz visível para activar a droga fotoactivável a uma temperatura de cerca de 20°C a 28°C. Opcionalmente, os leucócitos tratados são postos em contacto com agentes conhecidos por aumentar a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade de moléculas classe I, por exemplo, interferãos gama ou necrose de tumor de factor alfa. B. Reacção dos Antigénios das Células ao Antigénio para formar um

Antigénio Associado: É permitido aos leucócitos tratados, reagir a peptídeos derivados de qualquer uma das seguintes origens: Células cancerígenas em cultura sobrenadante de autólogos, extractos químicos de células cancerígenas recentes, células T autoreactivas, ou tecidos alvo de células T autoreactivas. Os antigénios associados resultantes, são colocados num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas e injectados no paciente para induzir uma resposta do sistema imunitário.

Exemplo 3. Pós Exposição à Vacinação para Reduzir uma Resposta Imunitária - Tratamento de Artrite Reumatóide: A vacinação convencional baseia-se na inoculação de um paciente com uma antigénio, por exemplo, uma forma inócua de um agente infeccioso, para estabelecer uma primeira resposta imunitária. São criados dois tipos de células base durante uma primeira resposta imunitária: células executoras para células mediadoras de imunidade e células de memória. Cada tipo destas células tem origem nos linfócitos que são reactivos com o antigénio usado para a primeira imunização. A exposição subsequente ao antigénio, depressa estimula o nível das células de memória, produzindo deste modo níveis altos de anticorpos específicos para o antigénio ( Essential Immunology, supra., p. 27). 19

Após a exposição à vacinação para o tratamento de hipersensibilidade, por exemplo, uma perturbação autoimunitária e uma reacção de rejeição de transplante associada com rejeição de tecido, baseia-se nos princípios básicos da vacinação convencional. No entanto, em contraste com procedimentos de uso consagrado, a vacinação ocorre após a exposição do sistema imunitário do paciente ao antigénio.

Pacientes que sofrem de artrite reumatóide possuem no seu sangue células T que são reactivas a um componente de proteína nas articulações do paciente. São empregues duas estratégias alternativas para tratar uma doença como a artrite reumatóide: (A) energia clonal para paralisar a resposta do sistema imunitário do paciente e (B) indução da resposta do sistema imunitário do paciente contra as células T as quais originam a doença. (A) energia clonal para paralizar a resposta do sistema imunitário do paciente a uma população existente de células executoras indesejáveis: O(s) autoantigénio(s) relevantes são obtidos, por exemplo, através de síntese (se o autoantigénio tiver sido previamente caracterizado) ou através da preparação de um extracto biológico derivado de um tecido ou de origem celular que se acredite que contenha o autoantigénio, por exemplo, um extracto de uma biópsia sinovial. Um preparo que contenha o(s) autoantigénio(s) relevante(s) contra o qual a resposta imunitária anormal é dirigida, é reagida com os antigénios das células do paciente que têm sido tratadas para demonstrar o aumento da manifestação da classe I de moléculas vazias. Os antigénios das células são caracterizados quanto à sua falta de capacidade de enviar o(s) (segundo) sinal/sinais co-estimuladores necessários para a célula T mediar a resposta imunitária. Deste modo, os antigénios das células são seleccionados aos quais falta por natureza a capacidade de enviar o segundo sinal, por exemplo, células T normais, ou antigénios das células que inicialmente tiveram a capacidade de enviar o segundo sinal são privados dessa capacidade através, do tratamento com agentes de fixação, exposição a irradiação UVB, ou exposição a 8-MOP na presença de irradiação UVA.

Como resultado da imunização do paciente com o antigénio associado, o paciente produz células T citotóxicas, estas células citotóxicas reconhecem os antigénios das células contendo proteína derivada do peptídeo antigénio associado com o maior complexo de histocompatibilidade de moléculas classe I. No entanto, devido aos antigénios das células são incapazes de enviar o segundo sinal necessário para uma resposta imunitária, assim as células T citotóxicas do paciente são paralisadas, isto é, energia clonal, é substituída uma resposta autoimunitária dirigida as articulações do paciente. 20

(B) Indução de um Anti-idiotipo Supressor de Resposta:

Uma estratégia alternativa para tratar uma doença como a artrite reumatóide é induzir a resposta imunitária do paciente contra as células T que originam a doença, provavelmente devido à capacidade das células T de reconhecer um autoantigénio nas articulações do paciente, ou seja, induzir um supressor de resposta anti-idiotipo.

De acordo com esta estratégia de tratamento, um preparo contendo peptídeos ou proteínas correspondendo aos receptores anormais do paciente, isto é, autoreactivo, células T são preparadas. As células T receptoras de peptídeos reagem com antigénios das células ex vivo e repostas ao paciente. Em contraste com a estratégia acima descrita dirigida para induzir energia clonal, esta estratégia alternativa emprega antigénios das células os quais possuem a capacidade de enviar sinais co-estimuladores. Assim, após a reinfiisão dos antigénios associados dos antigénios das células, a resposta imunitária do paciente é induzida contra os clones anormais das células T.

Exemplo 4. Pós exposição à Vacinação para Reduzir uma Resposta Imunitária - Prevenção da Rejeição do Transplante: A rejeição do transplante ocorre quando o sistema imunitário do paciente ataca antigénicos determinantes, por exemplo, peptídeos, presentes em células doadas. Tal rejeição é ultrapassada pela tolerância do paciente a estes antigénios peptídeos antes da transplantação. Um recipiente projectado de um tecido transplantado, por exemplo, um transplante renal, é tolerado ao tecido doado de uma maneira análoga ao acima descrito respeitando o tratamento da artrite reumatóide. Os antigénios das células do paciente são tratados para maximizar a manifestação da classe I de moléculas e são incubados com as células dos tecidos doados, por exemplo, células de sangue periféricas, que têm sido desenvolvidas in vitro. Os peptídeos antigénicos das células doadas associadas com a classe I de moléculas, formando antigénios associados. Os antigénios das células são tratados de forma a privá-los dos seus sinais co-estimuladores através, por exemplo, do tratamento com agentes de fixação, exposição a irradiação UVB, ou tratamento com 8-MOP na presença de irradiação UVA. Antes da transplantação, estes antigénios das células são colocados num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas e são injectados no paciente, tolerando deste modo essas células potencialmente capazes de responder a antigénios doados. Quando o rim doado é transplantado, o sistema imunitário do paciente não produz uma resposta imunitária porque o paciente foi previamente preparado para tolerar a presença de peptídeos antigénicos doados. 21

Exemplo 5. Pós exposição à Vacinação para Reduzir uma Resposta Imunitária - Prevenção a Dermatites de Contacto Alérgico:

Dermatites de contacto ocorrem quando uma substância química entra em contacto directo com a pele, causando uma resposta inflamatória com vários graus de dano na pele e variando de sintomas, incluindo comichão. Dermatites de contacto alérgico (DCA) é uma célula T mediadora, de tipo retardado de reacção hipersensível que ocorre na pele de indivíduos susceptíveis como resultado de uma sensibilização imunológicas específica (imunização) e depois reexposição a alérgenos aplicados localmente. Estes alérgenos são tipicamente de peso molecular pequeno, substâncias altamente reactivas quimicamente que são capazes de combinar com proteínas hóspedes para formar antigénios completos os quais possam ser reconhecidos pelas células T. O amplo alcance dos químicos capazes de induzir DCA está bem documentada em (Fisher, A. A., Contact Dermatitis, 2a Edição, Filadélfia: Lea & Febiger, 1973.)

Tem sido bem documentado que se as células imunitárias T são expostas ao antigénio das células (APC) o qual expressa o antigénio especifico/complexo MHC reconhecido pelas células T receptoras, mas que falham ao expressar o segundo sinal apropriado (isto é, citocines co-estimuladores apropriados ou moléculas de superfície de células), depois não só as células T imunitárias irão falhar a resposta à proliferação e libertar citocines pró-inflamatórias, mas irão tomar-se imóveis, por um período substancial de tempo (talvez semanas) tais células T irão também ser incapazes de responder de uma forma totalmente competente APCs expressando ambos o antigénio apropriado/MHC (Io sinal) mas também os co-estimuladores apropriados (2o) sinais (Jenkins, Marc K., Immunology Today 13:69-73, 1992). Outros estudos têm demonstrado que a exposição de outra maneira competente, antigénio pulsado APCs a radiação B ultravioleta não só toma tais células incapazes de estimular alguns subconjuntos de células T imunitárias, também tomaria as células T imóveis como resultado da exposição aos UVB Apcs tratados (Gerometta, J. S., Takashima, A., Simon, J., Edelbaum, D., Beergstresser, P., Mueller, D., e Cruz, Jr., P.D., “UVB radiation inactivates a co-stimulatory factor expressed on the surface of Langerhans cells, thus rendering them capable of inducing colnal anergy in CD4+ cells,” J. Invest. Dermatol. 96: 626 (abstract), 1991. Finalmente, um relatório bastante recente (Η. P. Van Iperen and G.M.J. beijeersbergen Van Henegouwen, “Na animal model for extracorporeal photochemotherapy based on contact hypersensitivity,” J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 15: 361-366, 1992) tem fornecido provas num modelo animal de dermatite de contacto alérgico que a vacinação imunitária em ratos com 8-MOP e UVA, tratados com células de nódulo linfa de doadores imunizados (os nódulos linfa contém ambos células T imunitárias e antigénios pulsados APCs) resulta na rápida (dentro de uma semana) perda da imunidade ao alérgeno, desta forma aplicações subsequentes do alérgeno na pele dos ratos tratados resulta numa evidência 22

mínima de dermatite de contacto alérgico. A rapidez de indução sugere que o mecanismo de apatia imunológica operativa em animais tratados é energia clonal (uma possibilidade não considerada pelos autores).

De acordo, os alíquotas de células de sangue periféricas (incluindo antigénio das células) são recolhidas dos indivíduos alérgicos, expostos ao alérgeno, e tratado de forma (por exemplo, exposição a 8-MOP na presença de radiação UVA) que os tome incapazes distribuir o segundo sinal co-estimulador às células T estimuladoras. Estes antigénios associados aos antigénios das células são depois colocados num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas e reintroduzidos no paciente.

Deve ser entendido que o precedente é meramente uma descrição detalhada de certas estruturas preferências. Portanto deve ser aparente aos peritos na ciência que várias modificações e equivalentes podem ser feitas sem sair do espírito ou âmbito da invenção.

Exemplo 6. 8-MOP/UVA Indução da Classe I de Moléculas Vazias MHC na Superfície da Célula: Associação da Classe I de Moléculas Vazias MHC com Peptídeos Exógenos. ESBOÇO EXPERIMENTAL:

Perspectiva geral: células RMA (Ljunggren et al., Nature 346: 476-480 (1990)) foram examinadas através de citofluometria para a manifestação da Classe I de moléculas vazias seguindo o tratamento com 8-MOP/UVA para determinar se 8-MOP/UVA separa o transporte dos complexos de peptídeos associados da classe I MHC à superfície da célula. As células fototratadas foram expostas a temperaturas que aumentam especificamente o aparecimento da classe I de moléculas vazias MHC (a cerca de 28°C), seguindo a fotoinactivação, a classe I de moléculas vazias foram quantificadas acrescentando quer de três peptídeos (Sequência I.D. N0**. 9, 10 e 11), cada um deles foi reconhecido como capaz de unir e estabilizar moléculas MHC. Sequência I.D. N4*. 9 e 10 são dois tipos específicos de fragmentos nucleoproteicos de influenza e a sequência I.D. n° 3 é SFI RGT KVS PRG KLST. Para determinar se as células tratadas libertam oligopeptídeos para unir à classe I, a classe I de moléculas vazias foram também quantificadas inicialmente seguido do tratamento. 23 Células. Células murídeas RMA que contêm apenas uma pequena classe I de moléculas vazias e de células RMA-S, uma linha de célula mutante, na qual a classe I de moléculas vazias tem sido demonstrada ser estável à temperatura ambiente mas transitória à temperatura do corpo foram proporcionados por P. Cresswell (Yale Immunobiology).

Tratamento 8-MOP/UVA. Células RMA interrompidas em PBS foram expostas a doses terapêuticas de 8-MOP (20-300 ng/ml) e UVA (1-10 J/cm2) em ordem para determinar a sensibilidade específica destas células ao fototratamento. A viabilidade foi analisada através da exclusão do tripano azul imediatamente após o tratamento.

Imunoquímicos. Anticorpos monoclonais com reactividades específicas em relação à classe I MHC (Kb, Y3 hibridoma murídeo ATCC N°. HB176 e Db, 28148S hibridoma murídeo ATCC N°. HB27) foram obtidos de ATCC (Rockville MD). O vírus de influenza de oligopeptídeos nucleoproteicos (NP365-380 e NP45-360) foram preparados no Centro Keck Protein. A ligação Kb 16mer (Sequência I.D. N°. 10 tendo a sequência SFIRGTKVSPRGKLST) e a ligação ideal Db 9mer (Sequência I.D. N°. 9 tendo a sequência AENENMETM) foram dissolvidos em IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s médium, GIBCO, Grand Island Nova Iorque) média em PBS a 50uM e armazenado a 4°C. A 16-mer (Sequência I.D. n°. 11) foi preparada da mesma forma.

Análise FACS da classe I de moléculas MHC. Células MHC-S serviram como controlo positivo para a manifestação da Classe I de moléculas MHC. As células eram cultivadas 5% em IMDM, 10% em soro fetal com um suplemento de 1% de antibióticos (GIBCO). As células foram retiradas da incubação (37°C, 5% C02), cultivada em balões de vidro (106/ml) com tampas bem fechadas. Para determinar a alteração/estabilidade térmica da classe I de moléculas, as células foram incubadas num banho de água ajustável durante 48 horas a uma dada temperatura. Para análises citofluométricas, 2x106 das células foram incubadas em gelo com 10% de soro humano tipo AB (GIBCO), depois com 0,15 ml anti-classe I de anticorpos monoclonais de cultura de tecido sobrenadante durante 30 min. Em gelo, lavado duas vezes com PBS, e depois incubado com 0,15 ml de fluoresceína isocianeto (FITC)- conjugado com imunoglobulina de cabra anti-rato (Sigma, St Louis MO) em gelo durante 30min., lavado duas vezes com PBS, fixado em 1% de formol e analisado com um classificador de células FACS. Para estabilizar a classe I de moléculas MHC, fragmentos de nucleoproteicos de influenza (Sequência I.D. NoS .9, 10 ou 11) foram acrescentados (50 uM). 24 RESULTADOS: A Figura 1 demonstra os efeitos de 8-MOP (10-300ng/ml) e UVA (1 J/cm ) nas características de crescimento das células RMA (como determinado pela exclusão do tripano azul). As células que não foram expostas ao 8-MOP ou ao UVA são designadas nas figuras como “no tx” (ou seja, sem tratamento). A viabilidade das células as quais foram expostas aos UVA mas que não foram expostas ao 8-MOP são designadas “1 J/cm” na figura. O dano da célula dependente do aumento das doses, demonstrou como o crescimento da inibição, foi observado com o aumento das doses de 8-Mop usado em combinação com 1 J/cm2. O aumento das doses são indicados na figura (isto é, as designações de 10, 30, 100 e 300 referem-se à concentração de 8-MOP em ng/ml).

Os efeitos de 8-MOP (100 ng/ml) e dos UVA (1 J/cm2) na manifestação da classe I e na união específica de oligopeptídeos (Sequência I.D. N°. 9) foi determinado à classe I de moléculas RMA. A Figura 3 representa um conjunto de compostos de experiências demonstrando no decurso do tempo para aumentar a classe I de moléculas MHC Db em células RMA tratadas com 100 ng/ml 8-MOP e 1 J/cm2 UVA. Nestas séries de experiências, as células tratadas com 8-MOP/UVA foram comparadas com células expostas somente a UVA (1 J/cm2). A Figura 4 demonstra o decurso do tempo para a inibição da classe I de moléculas MHC Kb em células RMA tratadas com 300 ng/ml 8-MOP e lJ/cm2 UVA. A análise FACS foi utilizada para calcular a extensão da manifestação da classe I usando anticorpos específicos ATCC para a classe I de moléculas Db e Kb. A mudança significativa do canal fluorescente (Δ% MCF) foi calculado por ter diferença no sinal para células incubadas com e sem a classe I de oligopeptídeos (Sequência I.D. N°. 10, isto é., AENENMETM). As Figuras 3 e 4 ilustram que o ponto ideal (ou seja, o maior aumento da manifestação na classe I de moléculas) foi detectado num espaço de 10 horas de tratamento com 8-MOP/UVA. Um conjunto adicional de controlo de células não tratadas ( designadas “No Tx” na figura) também foi analisado. O tempo ideal para a indução da manifestação da classe I é determinada pela realização de estudos cinéticos mais detalhados, por exemplo, analisando as células a intervalos mais frequentes e a diferentes condições de temperatura seguido do tratamento com 8-MOP/UVA.

Os antigénios são seleccionados pela sua capacidade de associar classe I de moléculas vazias utilizando o método FACS acima descrito. Assim, a análise FACS serve como teste de protocolo para a selecção das condições ideais para induzir a manifestação da classe I de moléculas vazias, bem como para testar o protocolo para a selecção de antigénios que são capazes de unir e de estabilizar a classe I de moléculas vazias. Desta forma, vários peptídeos, e as concentrações 25 ideais para cada, são testadas pela sua capacidade de estabilizar a classe de moléculas vazias. É apresentado a seguir a lista de sequência, seguida das reivindicações.

LISTA DE SEQUÊNCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Universidade de Yale (B) MORADA: 451 College Street (C) CIDADE: New Haven (D) ESTADO: Connecticut (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 06520 (G) TELEFONE: 203-432-7240 (H) TELEFAX: 203-432-7245 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Modulação Específica do Sistema

Imunitário (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 11 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Wolf, Greenfield & Sacks, P.C. (B) RUA: 600 Atlantic Ave. (C) CIDADE: Boston (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 02210 (v) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR: (A) TIPO MÉDIO: Floppy disk (B) COMPUTADOR: IBM PC Compatible

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) APLICAÇÃO ACTUAL DA INFORMAÇÃO: (A) NÚMERO DA APLICAÇÃO: Não disponível (B) DATA DO FICHEIRO: Arquivado em Herewith (vii) APLICAÇÃO ANTERIOR DA INFORMAÇÃO: (A) NÚMERO DA APLICAÇÃO: US 07/977.672 (B) DATA DO FICHEIRO: 18/11/92 26 (viii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NOME: Elizabeth R. Plumer (B) NÚMERO DO REGISTO: 36.637

(C) REFERÊNCIA/REGISTO DO PROCESSO: Y0060/7001WO (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 617-720-3500 (B) TELEFAX: 617-720-2441 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 1: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:l:

Ile Ser Thr Gin Asn Arg Arg Ala Leu Asp Vai Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 2: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (iv) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato 27

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N°: 2: Ile Ser Thr Gin Asn His Arg Ala Leu Asp Vai Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 3: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3: Gly Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr 1 5 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 4: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4: Gly Pro His Ser Asn Asn Phe Gly Tyr 1 5 28 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 5: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5: Lys Tyr Gin Ala Vai Thr Ala Thr Leu Glu Glu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 6: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA ID N°: 6: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6: Lys Tyr Gin Ala Vai Thr Thr Thr Leu Glu Glu 1 5 10

29

(2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 7: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 7: Glu Ile Leu Pro Leu Gly Trp Leu Vai Phe Ala Vai Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 8: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: rato (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8: Glu Ile Leu Pro Leu Gly Trp Leu Ala Phe Ala Vai Vai 1 5 10 30

(2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 9: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ΑΝΤΙ- SENSO: não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 9: Ala Glu Asn Glu Asn Met Glu Thr Met 1 5 (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 10: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ANTI-SENSO: não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 10:

Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Vai Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr 15 10 15 ’ (2) INFORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°: 11: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: aminoácido (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo 31 (iii) HIPOTÉTICO: não (iv) ΑΝΤΙ-SENSO: não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N°: 11:

Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Vai Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr 15 10 15

Lisboa, 7 de Setembro de 2000.

Pela Requerente O Agente Oficial

Adjunto do Agente 0|iciel de Propriedode Industriei

R. D. Joêo V, 9-2° dt.°-1250 LISBOA 32

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. O método para formar um antigénio peptídeo autólogos associado a um leucócito, consiste nos seguintes procedimentos: (a) irradiando um preparado que contem uma pluralidade de leucócitos normais na presença de um agente fotoactivável a uma temperatura abaixo da temperatura fisiológica para aumentar através do leucócito normal a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular; e (b) fazendo reagir o leucócito tratado com o aumento da manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular através de um peptídeo autólogos com um antigénio na parte exterior do corpo para formar o antigénio peptídeo associado a um leucócito.
2. 2. No método da reivindicação 1, o leucócito normal é de origem humana.
3. 3. No método da reivindicação 1, o maior complexo de histocompatibilidade molecular é de classe I, ou de classell.
4. 4. No método da reivindicação 1, o preparado é sujeito a temperaturas entre cerca dos 20°C e dos 28°C, de preferência a uma temperatura entre os 21°C e os 22°C.
5. 5. No método da reivindicação 1, o agente fotoactivável é um psoríaco.
6. 6. No método da reivindicação 5, o psoríaco é seleccionado de entre: 8-metoxipsoríaco, amino-metilo-trimetilo-psoríaco, 2-metoxipsoríaco e psoríaco trimetilo.
7. 7. No método da reivindicação 6, o psoríaco é um 8-metoxipsoríaco.
8. 8/0 método da reivindicação 1, consiste em fazer entrar em contacto um citocine com o preparado.
9. 9. No método da reivindicação 1, o antigénio peptídeo autólogos é um antigénio de tecido circulatório.
10. 10. No método da reivindicação 1, o antigénio peptídeo está associado a um tumor maligno sólido, a uma perturbação de imunodeficiência, a uma perturbação de hipersensibilidade, ou a uma perturbação autoimunitária. 1
11. 11. O método da reivindicação 1, consiste no processo de adição de uma quantidade de microglobulina beta-2 ao leucócito irradiado quando este é reactivo ao antigénio peptídeo autólogos.
12. 12. O composto farmacêutico para modificar uma resposta do sistema imunitário a um antigénio peptídeo autólogos, consiste: num preparado contendo uma pluralidade de antigénios peptídeos autólogos associados a leucócitos normais e a microglobulina beta-2, o preparo contem uma quantidade de leucócitos suficiente para modificar uma resposta do sistema imunitário e uma quantidade de microglobulina beta-2 maior do que a concentração de microglobulina beta-2 que iria ser encontrada in vivo; e num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas.
13. 13. O composto farmacêutico para modificar uma resposta do sistema imunitário a um antigénio peptídeo autólogos, consiste; num preparo contendo uma pluralidade de leucócitos normais tendo aumentado a manifestação do maior complexo de histocompatibilidade molecular e um antigénio peptídeo autólogos associado com o maior complexo de histocompatibilidade molecular, o preparo contem uma quantidade de leucócitos normais suficiente para modificar uma resposta do sistema imunitário; e num portador aceitável segundo as regras farmacêuticas.
14. 14. O composto farmacêutico inclui uma pluralidade de antigénios peptídeo autólogos associados a leucócitos, preparado pelo método conforme reivindicado em quaisquer uma das reivindicações 1 à 11. Lisboa, 7 de Setembro de 2000. Pela Requerente O Agente Oficial

    Adjunto do Agente Oficial de Propriedade Industrial R. D João V, 9-2® dt.°-1250 LISBOA 2