JP2837856B2 - リンフォカイン活性化キラー細胞及びその製造法 - Google Patents
リンフォカイン活性化キラー細胞及びその製造法Info
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- JP2837856B2 JP2837856B2 JP63283829A JP28382988A JP2837856B2 JP 2837856 B2 JP2837856 B2 JP 2837856B2 JP 63283829 A JP63283829 A JP 63283829A JP 28382988 A JP28382988 A JP 28382988A JP 2837856 B2 JP2837856 B2 JP 2837856B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、癌の免疫療法に使用されるリンフォカイン
活性化キラー細胞（以下LAK細胞という）及びその製造
法に関する。
活性化キラー細胞（以下LAK細胞という）及びその製造
法に関する。
（従来の技術） 腫瘍を拒絶する宿主免疫系の刺激に基づいて癌を治療
する免疫療法においては、担癌患者の免疫応答能が癌の
進行増大と共に低下し臨床的に十分な成果が得られてい
ない。
する免疫療法においては、担癌患者の免疫応答能が癌の
進行増大と共に低下し臨床的に十分な成果が得られてい
ない。
従って、最近、担癌患者の免疫が低下した状態でも効
果が期待できるという理由で、抗腫瘍活性を有する細胞
群を担癌患者から取り出しin vitroでリンフォカインで
活性化した後、これを担癌生体内に移入するリンパ球移
入療法（養子免疫療法ともいう）が提案され開発されて
いる。
果が期待できるという理由で、抗腫瘍活性を有する細胞
群を担癌患者から取り出しin vitroでリンフォカインで
活性化した後、これを担癌生体内に移入するリンパ球移
入療法（養子免疫療法ともいう）が提案され開発されて
いる。
例えば、Rosenbergらは、マウス脾細胞やヒトの末梢
血リンパ球をin vitroでインターロイキン−２（以下IL
−２という）とともに約３日間培養することにより、in
vitroでナチュラルキラー（NKという）活性に抵抗性の
ある新鮮腫瘍細胞の多くに対してキラー活性を示すが正
常細胞にはキラー活性を示さない抗腫瘍性細胞としてLA
K細胞を提案し〔「Cancer Treat.Reports」第68巻第233
〜255頁（1984年）〕これを使用した養子免疫療法を提
案している（特開昭62−116518号公報）。それによれ
ば、マウス、ヒトでの試験の結果、LAK細胞単独投与で
は抗腫瘍効果が認められない場合もある為、LAK細胞とI
L−２とを同時に投与する改良法によって患者に著しい
抗腫瘍効果が認められたことが報告されている。
血リンパ球をin vitroでインターロイキン−２（以下IL
−２という）とともに約３日間培養することにより、in
vitroでナチュラルキラー（NKという）活性に抵抗性の
ある新鮮腫瘍細胞の多くに対してキラー活性を示すが正
常細胞にはキラー活性を示さない抗腫瘍性細胞としてLA
K細胞を提案し〔「Cancer Treat.Reports」第68巻第233
〜255頁（1984年）〕これを使用した養子免疫療法を提
案している（特開昭62−116518号公報）。それによれ
ば、マウス、ヒトでの試験の結果、LAK細胞単独投与で
は抗腫瘍効果が認められない場合もある為、LAK細胞とI
L−２とを同時に投与する改良法によって患者に著しい
抗腫瘍効果が認められたことが報告されている。
（発明が解決しようとする課題） 前記のLAK細胞を用いる養子免疫療法が、癌の免疫療
法として一般的に広く用いられる為には、LAK細胞の抗
腫瘍性を更に高めることが要望されている。
法として一般的に広く用いられる為には、LAK細胞の抗
腫瘍性を更に高めることが要望されている。
（課題を解決するための手段，作用） このような現状に鑑み、本発明者らは養子免疫療法に
おいてLAK細胞の抗腫瘍作用を高めることを目的に鋭意
研究を重ねた結果、担癌哺乳動物にキチンのオリゴ糖で
あるＮ−アセチルキトオリゴ糖（以下、NACOSという）
を投与した後にＴ−リンパ球を取り出し、このＴ−リン
パ球を先ずNACOSの存在下で培養し、次いでIL−２の存
在下で培養することによって、意外にも優れた抗腫瘍作
用を有するLAK細胞が得られることを見出し、この知見
に基づいて本発明を完成するに至った。
おいてLAK細胞の抗腫瘍作用を高めることを目的に鋭意
研究を重ねた結果、担癌哺乳動物にキチンのオリゴ糖で
あるＮ−アセチルキトオリゴ糖（以下、NACOSという）
を投与した後にＴ−リンパ球を取り出し、このＴ−リン
パ球を先ずNACOSの存在下で培養し、次いでIL−２の存
在下で培養することによって、意外にも優れた抗腫瘍作
用を有するLAK細胞が得られることを見出し、この知見
に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１の発明は、Ｎ−アセチルキト
オリゴ糖（NACOS）を投与した担癌哺乳動物から取り出
したＴ−リンパ球をＮ−アセチルキトオリゴ糖（NACO
S）の存在下で培養し、次いでインターロイキン−２（I
L−２）の存在下で培養することによって得たことを特
徴とするリンフォカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）
である。
オリゴ糖（NACOS）を投与した担癌哺乳動物から取り出
したＴ−リンパ球をＮ−アセチルキトオリゴ糖（NACO
S）の存在下で培養し、次いでインターロイキン−２（I
L−２）の存在下で培養することによって得たことを特
徴とするリンフォカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）
である。
また本発明の第２の発明は、Ｎ−アセチルキトオリゴ
糖（NACOS）を投与した担癌哺乳動物から取り出したＴ
−リンパ球をＮ−アセチルキトオリゴ糖（NACOS）の存
在下で培養し、次いでインターロイキン−２（IL−２）
の存在下で培養することを特徴とするリンフォカイン活
性化キラー細胞（LAK細胞）の製造法である。
糖（NACOS）を投与した担癌哺乳動物から取り出したＴ
−リンパ球をＮ−アセチルキトオリゴ糖（NACOS）の存
在下で培養し、次いでインターロイキン−２（IL−２）
の存在下で培養することを特徴とするリンフォカイン活
性化キラー細胞（LAK細胞）の製造法である。
本発明で使用するNACOSはキチンの加水分解によって
得られるものであり、具体的にはジ−Ｎ−アセチルキト
ビオース（以下、NACOS−２という）、トリ−Ｎ−アセ
チルキトトリオース（以下、NACOS−３という）、テト
ラ−Ｎ−アセチルキトテトラオース（以下、NACOS−４
という）、ペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオース（以
下、NACOS−５という）、ヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘ
キサオース（以下、NACOS−６という）及びヘプタ−Ｎ
−アセチルキトヘプタオース（以下、NACOS−７とい
う）が挙げられる。
得られるものであり、具体的にはジ−Ｎ−アセチルキト
ビオース（以下、NACOS−２という）、トリ−Ｎ−アセ
チルキトトリオース（以下、NACOS−３という）、テト
ラ−Ｎ−アセチルキトテトラオース（以下、NACOS−４
という）、ペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオース（以
下、NACOS−５という）、ヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘ
キサオース（以下、NACOS−６という）及びヘプタ−Ｎ
−アセチルキトヘプタオース（以下、NACOS−７とい
う）が挙げられる。
また、発明で使用するIL−２はナチュラル型IL−２、
遺伝子組換えIL−２（以下、rIL−２という）及びそれ
らの生物学的機能上の等価物が挙げられる。これらは市
販のものも使用できる。
遺伝子組換えIL−２（以下、rIL−２という）及びそれ
らの生物学的機能上の等価物が挙げられる。これらは市
販のものも使用できる。
NACOSを担癌哺乳動物に投与しＴ−リンパ球を得るに
は、例えばマウスの場合には、癌細胞例えばMeth−Ａを
１×105個を移植して１〜３週間後（すなわち癌を生着
させ増殖させた後）NACOSを１〜100mg/kg体重の投与量
で投与した後、投与４日目に脾臓を摘出し、脾臓をスラ
イドガラスでほぐし、イーグルの最小必須培地（以下、
MEMという）に懸濁させ、これをナイロン繊維カラム法
でＴ−リンパ球を分離することによって得ることができ
る。また、ヒトの場合には担癌患者にNACOSを0.01〜500
mg/kg体重の投与量で投与した後、投与４〜７日目にそ
の静脈血を取り出し、フィコール（Ficoll）−ハイペー
ク（Hypaque）密度勾配法を用いて分離することによっ
て得ることができる。取り出したＴ−リンパ球は遠心
（1,500rpm,10min）洗浄を行なって10％ウシ胎児血清
（以下、FBSという）含有RPMI−1640培地中に再懸濁さ
せる。
は、例えばマウスの場合には、癌細胞例えばMeth−Ａを
１×105個を移植して１〜３週間後（すなわち癌を生着
させ増殖させた後）NACOSを１〜100mg/kg体重の投与量
で投与した後、投与４日目に脾臓を摘出し、脾臓をスラ
イドガラスでほぐし、イーグルの最小必須培地（以下、
MEMという）に懸濁させ、これをナイロン繊維カラム法
でＴ−リンパ球を分離することによって得ることができ
る。また、ヒトの場合には担癌患者にNACOSを0.01〜500
mg/kg体重の投与量で投与した後、投与４〜７日目にそ
の静脈血を取り出し、フィコール（Ficoll）−ハイペー
ク（Hypaque）密度勾配法を用いて分離することによっ
て得ることができる。取り出したＴ−リンパ球は遠心
（1,500rpm,10min）洗浄を行なって10％ウシ胎児血清
（以下、FBSという）含有RPMI−1640培地中に再懸濁さ
せる。
取り出したＴ−リンパ球のNACOS存在下での培養は、
前記のＴ−リンパ球の培地懸濁液のＴ−リンパ球１×10
8個/ml培地を24穴マイクロプレートに移し、10％FBS含
有RPMI−1640培地に溶解したNACOSをＴ−リンパ球１×1
08当り0.1〜15mg添加して約３〜７％好ましくは５％のC
O2の存在下に約35〜39℃好ましくは37℃で０〜48時間培
養することによって行なう。
前記のＴ−リンパ球の培地懸濁液のＴ−リンパ球１×10
8個/ml培地を24穴マイクロプレートに移し、10％FBS含
有RPMI−1640培地に溶解したNACOSをＴ−リンパ球１×1
08当り0.1〜15mg添加して約３〜７％好ましくは５％のC
O2の存在下に約35〜39℃好ましくは37℃で０〜48時間培
養することによって行なう。
次いで、Ｔ−リンパ球のIL−２存在下での培養は、前
記のようにして得られたＴ−リンパ球培養液に、すぐに
10％FBS含有RPMI−1640培地に溶解したIL−２例えばrIL
−２をＴ−リンパ球１×108個当り１〜100単位になるよ
うに添加し、約３〜７％好ましくは５％のCO2の存在下
に約35〜39℃好ましくは37℃で約２〜７日間培養するこ
とによって行なう。
記のようにして得られたＴ−リンパ球培養液に、すぐに
10％FBS含有RPMI−1640培地に溶解したIL−２例えばrIL
−２をＴ−リンパ球１×108個当り１〜100単位になるよ
うに添加し、約３〜７％好ましくは５％のCO2の存在下
に約35〜39℃好ましくは37℃で約２〜７日間培養するこ
とによって行なう。
培養終了後、得られた培養液を、新鮮なRPMI−1640培
地を洗浄液として用い遠心（1,500rpmで10分間）洗浄を
２回繰返すことによって目的とするLAK細胞を得ること
ができる。得られたLAK細胞は生理食塩水に懸濁させ担
癌生体内に投与する。保存する必要がある場合には、得
られたLAK細胞を血清含有RPMI−1640培地に入れて保存
する。
地を洗浄液として用い遠心（1,500rpmで10分間）洗浄を
２回繰返すことによって目的とするLAK細胞を得ること
ができる。得られたLAK細胞は生理食塩水に懸濁させ担
癌生体内に投与する。保存する必要がある場合には、得
られたLAK細胞を血清含有RPMI−1640培地に入れて保存
する。
本発明の方法によって調製されたLAK細胞は、従来の
方法すなわち担癌哺乳動物により取り出したＴ−リンパ
球をIL−２の存在下で培養することによって誘導された
LAK細胞に比べ優れた抗腫瘍作用を有する。
方法すなわち担癌哺乳動物により取り出したＴ−リンパ
球をIL−２の存在下で培養することによって誘導された
LAK細胞に比べ優れた抗腫瘍作用を有する。
本発明においては、担癌哺乳動物にNACOSを投与した
後にＴ−リンパ球を取り出すこと及びNACOSを投与した
担癌哺乳動物から取り出したＴ−リンパ球をNACOSの存
在下に培養した後にIL−２の存在下で培養することが重
要であり、担癌哺乳動物にNACOSを投与せずに取り出し
たＴ−リンパ球をIL−２の存在下で培養した場合（比較
例２）、担癌哺乳動物にNACOSを投与せずに取り出した
Ｔ−リンパ球をNACOSの存在下で培養した後、IL−２の
存在下で培養した場合（比較例３）には期待する効果が
得られない。
後にＴ−リンパ球を取り出すこと及びNACOSを投与した
担癌哺乳動物から取り出したＴ−リンパ球をNACOSの存
在下に培養した後にIL−２の存在下で培養することが重
要であり、担癌哺乳動物にNACOSを投与せずに取り出し
たＴ−リンパ球をIL−２の存在下で培養した場合（比較
例２）、担癌哺乳動物にNACOSを投与せずに取り出した
Ｔ−リンパ球をNACOSの存在下で培養した後、IL−２の
存在下で培養した場合（比較例３）には期待する効果が
得られない。
本発明で得られたLAK細胞を癌の免疫療法に使用する
場合には、LAK細胞を薬学的に受容される担体、例えば
生理食塩水、５％正常ヒト血清アルブミンを含有する生
理食塩水、ハンクス（Hanks）平衡塩類溶液等に懸濁す
ることにより癌患者に投与し得る組成物に調製して使用
される。
場合には、LAK細胞を薬学的に受容される担体、例えば
生理食塩水、５％正常ヒト血清アルブミンを含有する生
理食塩水、ハンクス（Hanks）平衡塩類溶液等に懸濁す
ることにより癌患者に投与し得る組成物に調製して使用
される。
（実施例） 以下の実施例により本発明を更に詳しく説明する。
実施例１ LAK細胞の製造 （ａ） ５週令のBALB/C雄性マウスの鼠蹊部皮下にMeth
−Ａ腫瘍細胞５×105個を移植し、腫瘍細胞移植後14日
目にNACOS−６を有効成分とする注射液を有効成分10mg/
kgマウスの投与量でマウス静脈内に投与した。投与後４
日目にマウスは腋下を切断し脱血して殺し、その脾臓を
無菌的に取り出しスライドガラスで潰しMEM中に懸濁す
る。
−Ａ腫瘍細胞５×105個を移植し、腫瘍細胞移植後14日
目にNACOS−６を有効成分とする注射液を有効成分10mg/
kgマウスの投与量でマウス静脈内に投与した。投与後４
日目にマウスは腋下を切断し脱血して殺し、その脾臓を
無菌的に取り出しスライドガラスで潰しMEM中に懸濁す
る。
（ｂ） 10mlのガラスシリンジに0.8gのナイロンウール
（ロイコパックロイコサイトフィルター（LeukoPak Leu
kocyte filter）、トラベノール ラボラトリーズ（Tra
venol Laboratories）製）を詰めMEMで洗浄した後、１
〜2mlのMEMに懸濁した１×1010個の脾臓細胞を滴下し、
その後、カラムを５％炭酸ガス湿潤雰囲気下中37℃で60
分間インキュベートする。Ｔ−リンパ球は予め暖めてお
いた10％FBS含有MEM5mlで流し溶出する。得られたＴ−
リンパ球は10％FBS含有RPMI−1640培地を用い、1,500rp
mで約10分間遠心することにより洗浄した後、10％FBS含
有RPMI−1640培地中に再懸濁する。
（ロイコパックロイコサイトフィルター（LeukoPak Leu
kocyte filter）、トラベノール ラボラトリーズ（Tra
venol Laboratories）製）を詰めMEMで洗浄した後、１
〜2mlのMEMに懸濁した１×1010個の脾臓細胞を滴下し、
その後、カラムを５％炭酸ガス湿潤雰囲気下中37℃で60
分間インキュベートする。Ｔ−リンパ球は予め暖めてお
いた10％FBS含有MEM5mlで流し溶出する。得られたＴ−
リンパ球は10％FBS含有RPMI−1640培地を用い、1,500rp
mで約10分間遠心することにより洗浄した後、10％FBS含
有RPMI−1640培地中に再懸濁する。
（ｃ） 24穴マイクロプレート中で、Ｔ−リンパ球（１
×108個/ml培地）に10％FBS含有RPMI−1640培地中のNAC
OS−６が最終濃度1mg/ml培地になるように加え、５％炭
酸ガス湿潤雰囲気下で37℃で24時間インキュベートす
る。インキュベート終了後、すぐに10％FBS含有RPMI−1
640培地中のリコビナントIL−２（rIL−２）を最終濃度
50単位/ml培地になるように加え、５％炭酸ガス湿潤雰
囲気下で37℃で48時間インキュベートする。インキュベ
ート終了後、培養液を新鮮なRPMI−1640培地を用い1500
rpmで10分間遠心することにより２回洗浄する。得られ
たＴ−リンパ球を生理食塩水に再懸濁し保存する。この
ようにして本発明のLAK細胞が調製された。
×108個/ml培地）に10％FBS含有RPMI−1640培地中のNAC
OS−６が最終濃度1mg/ml培地になるように加え、５％炭
酸ガス湿潤雰囲気下で37℃で24時間インキュベートす
る。インキュベート終了後、すぐに10％FBS含有RPMI−1
640培地中のリコビナントIL−２（rIL−２）を最終濃度
50単位/ml培地になるように加え、５％炭酸ガス湿潤雰
囲気下で37℃で48時間インキュベートする。インキュベ
ート終了後、培養液を新鮮なRPMI−1640培地を用い1500
rpmで10分間遠心することにより２回洗浄する。得られ
たＴ−リンパ球を生理食塩水に再懸濁し保存する。この
ようにして本発明のLAK細胞が調製された。
比較例 １ 実施例 １（ａ）においてNACOS−６の代わりに生理
食塩水及び（ｃ）においてNACOS−６とrIL−２の代わり
に10％FBS含有RPMI−1640培地を使用することのほか
は、実施例 １に記載の手順を実質的に繰り返しＴ−リ
ンパ球を得た。
食塩水及び（ｃ）においてNACOS−６とrIL−２の代わり
に10％FBS含有RPMI−1640培地を使用することのほか
は、実施例 １に記載の手順を実質的に繰り返しＴ−リ
ンパ球を得た。
比較例 ２ 実施例 １（ａ）においてNACOS−６の代わりに生理
食塩水及び（ｃ）においてNACOS−６の代わりに10％FBS
含有RPMI−1640培地を使用することのほかは、実施例
１に記載の手順を実質的に繰り返しLAK細胞を得た。
食塩水及び（ｃ）においてNACOS−６の代わりに10％FBS
含有RPMI−1640培地を使用することのほかは、実施例
１に記載の手順を実質的に繰り返しLAK細胞を得た。
比較例 ３ 実施例 １（ａ）においてNACOS−６に代わりに生理
食塩水を使用することのほかは、実施例 １に記載の手
順を実質的に繰り返しLAK細胞を得た。
食塩水を使用することのほかは、実施例 １に記載の手
順を実質的に繰り返しLAK細胞を得た。
実施例 ２ 抗腫瘍活性試験 BALB/c雄マウス（１群８匹）の鼠蹊部皮下へMeth−Ａ
腫瘍細胞５×105個を移植し、腫瘍細胞移植後14日目
に、生理食塩水中に再懸濁させた実施例１比較例１〜３
のLAK細胞又はＴ−リンパ球0.2mlを１×107個／マウス
の投与量で１回マウスの尾静脈内に投与した。腫瘍移植
後30日目に腫瘍を取り出して腫瘍重量を測定し、腫瘍生
育阻止率を求めた。得られた結果を次表に示す。
腫瘍細胞５×105個を移植し、腫瘍細胞移植後14日目
に、生理食塩水中に再懸濁させた実施例１比較例１〜３
のLAK細胞又はＴ−リンパ球0.2mlを１×107個／マウス
の投与量で１回マウスの尾静脈内に投与した。腫瘍移植
後30日目に腫瘍を取り出して腫瘍重量を測定し、腫瘍生
育阻止率を求めた。得られた結果を次表に示す。
Claims (2)
- 【請求項１】Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を投与した担癌
哺乳動物から取り出したＴ−リンパ球をＮ−アセチルキ
トオリゴ糖の存在下で培養し、次いでインターロイキン
−２の存在下で培養することによって得たことを特徴と
するリンフォカイン活性化キラー細胞。 - 【請求項２】Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を投与した担癌
哺乳動物から取り出したＴ−リンパ球をＮ−アセチルキ
トオリゴ糖の存在下で培養し、次いでインターロイキン
−２の存在下で培養することを特徴とするリンフォカイ
ン活性化キラー細胞の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63283829A JP2837856B2 (ja) | 1988-11-11 | 1988-11-11 | リンフォカイン活性化キラー細胞及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63283829A JP2837856B2 (ja) | 1988-11-11 | 1988-11-11 | リンフォカイン活性化キラー細胞及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02131572A JPH02131572A (ja) | 1990-05-21 |
| JP2837856B2 true JP2837856B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=17670697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63283829A Expired - Lifetime JP2837856B2 (ja) | 1988-11-11 | 1988-11-11 | リンフォカイン活性化キラー細胞及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2837856B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0152100B1 (ko) * | 1991-07-04 | 1998-10-01 | 시게루 미즈노 | 분화항원 표현형상 또는 기능상 분화, 성숙한 t세포를 제조하는 방법 |
-
1988
- 1988-11-11 JP JP63283829A patent/JP2837856B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02131572A (ja) | 1990-05-21 |
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