SU1412596A3 - Способ получени цитотоксических к раковым клеткам лимфоцитов и способ получени гликосв занного антигена - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к иммунологии и онкологии. Цель изобретени  повьшение противораковой активности лимфоцитов. Раковые клетки промьшают и обрабатывают буфером, содержащим . Тритон Х-100. Смесь подвергают ультрацентрифугированию. Супернатант .пропускают через колонку, заполненную иммобилизованным лектином. После промьшки колонки провод т элюирова- ние. Элюат диализуют и получают гли- косв занный антиген. Лимфоциты из селезенки мыши после обработки куль- туральной средой добавл ют к глико- св занному антигену и культивируют в течение 2 дней. Затем в течений 7 дней провод т культивирование в среде, содержащей фактор роста Т-клеток. Способ позвол ет повысить цитотокси- ческую активность лимфоцитов против раковых клеток до 38%. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл. СО

Description

1чЭ

сд

;о

Од

см

Изобретение относитс  к медицине, в частности к иммунологии и онкологии , и может быть использовано при. получении цитотоксических к раковым клеткам лимфоцитов и при получении гликосв занного антигена (GRA) дл  . сенсибилизации лимфоцитов, направленных против опухолевых клеток, содержащих гликосв занный антиген.

Цель изобретени  - повышение противораковой активности лимфоцитов.

Пример 1, Получение фактора роста Т-клеток (препарата TCGF).

Селезенку (4 кг)  понских обезь н

полученных от компании Japan Plyma- tes Со. Ltd, подвергают иссечению и дважды промывают культуральной средой RPMI-1640. Промытые клетки отфильтровывают с помощью ультрафильтра (размер пор равен 150 меш) и подвергают центрифугированию по методу удельно- весового центрифугировани  (удельный вес 1,076), в результате чего полу- чают 2л 2-10 на 1 мл лимфоцитов. Полу-; ченные таким образом лимфоциты про- ьшают три раза культуральной средой RPMI-164b и концентрацию лимфоцитов довод т до 5-10 на 1 мл путем использовани  той же среды, содержащей 10% PCS. Затем эту систему оставл ют в аппарате дл  ферментации в атмосфере углекислого газа при 37 С на период, равный 1 ч. Супернатант- ные (недосадочные) лимфоциты выдел ют и довод т концентрацию (число) лимфоцитов до 1-10 на 1 мл путем использовани  той же культуральной среды, содержащей 1% FCS, После этого туда добавл ют 1 мкг/мл индомета- цина и 0,2% РНА-Р (РИА - фитогемаг- глютинин) и лимфоциты культивируют в ферментационном аппарате в атмосфере углекислого газа при 37 С в течение 48 ч. Далее провод т операцию отделени  с помощью центрифугировани  (3000 об/мин), которое продолжают в течение 10 мин, полученную в итоге супернатантную жидкую фазу отдел ют и подвергают стерилизации посредством фильтровани  через ультрафильтр (диаметр пор равен 0,2 мк), в результате чего получают 2 л фактора роста Т-клеток (TCGF),

Источник TCGF представл ет собой супернатант смещанньк культур лимфоцитов периферической крови от 10 здоровьк доноров. Неприкрепившиес  лимфоциты, полученные из C.F, от

деленных адсорбцией .на пластмассовой поверхности при 37 С в течение 1 ч, суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 1% FCS (1,5-10 клеток/мл) и инкубируют с 0,2%-ным РНА-Р, индо- метацином (1 мг/мл) и линией В-кле- ток человека ,/ВТ-1) (1,5-10 клеток/мл ) , предварительно обработанных митомиц1 ном С (50 мг/мл). По прошествии 48 ч супернатант культуры собирают и используют в качестве источника TCGF.

ПЬлучение лимфоцитов периферичес0

5

0

5

0

5

0

5

50 мл крови, полученной от здорового взрослого человека или различных раковых больных посредством ге- паринизации, подвергают центрифугированию путем использовани  Фиколла (Ficoll Pack), в результате чего получают 5-10 лимфоцитов периферической крови человека.

Получение лимфоцитов из селезенки МЫШИ;

Селезенку породы СЗН (сам- цы, 6W) подвергают иссечению и дважды промьшают культуральной средой RPMI-1640, Затем ткань селезенки раз- . рыхл ют иглой шприца и пропускают через сито из нержавеющей стали (100 меш) с целью удалени  крупных, кус очков. Отфильтрованные таким образом клетки дважды промывают той же культуральной средой и подвергают центрифугированию при 1200 об/мин в течение 10 мин, в результате чего получают 4.10 лимфоцитов селезенки.

Гликосв занный ajiTHreH (GRA-1), содержащий белка 40 мкг/мл и сахара 7,5 мкг/мл5 разбавл ют в 1000 раз по сравнению с первоначальным объемом культуральной средой RPMI-T640, содержащей 15% FCS, с целью получени  сенсибилизационной культуральной

Ср1:,ДЫ.

Лимфоциты периферической крови человека (5-10/5 мл) прибавл ют к 5 мл сенсибилизационной культуральной среды, которую помещают в лабораторную чашку Петри, и культивируют при 37 С в течение 2 дней. Затем лимфоциты подвергают дальнейшей культивации в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 20% TCGF (фактор роста Т-клеток) и 15% FCS, еще в течение ,5 дней, в результате чего гюлучают 20 мл раствора клеток-киллеров

(GRA-1-K-T), содержащего 1x10 клеток-киллеров/мл ..

Пример 2. Лимфоциты из селезенки мьшш подвергают обработке культуральной средой RPM1-1640, содержащей 15% FCS, с целью доведени  числа лимфоцитов до 5-10 на 1 мл. Затем к этим лимфоцитам добавл ют

гликосв Занный антиген (GRA-M-I), со- Q GRA-5-K-T-2.

/

держащий 156 мкг белка и 94 мкг сахара , причем прибавление осуществл ют таким образом, чтобы конечное количество белка и сахара составл ло 1,5 мкг/мл и 0,.9 мкг/мл соответственно . 5-миллш1итровую порцию полученной смеси культивируют в лабораторной чашке дл  культивировани  клеток (6015 мм) при 37 С в течение 2 дней. При этом наблюдаетс  образование клонов (клонирование). Затем эту порцию культивируют в культуральной среде RPMI-1640, имеющей 15% FCS и содержащей 20% по объему препарата ,TCGF дополнительно в течение 7 дней до получени  50 мл раствора клеток- силлеров (GRA-M-I-K-T) , содержащего клеток-киллеров/мл.

Пример 3. Лимфоциты периферической крови (5 10) зд()рового донора инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 1 нг/мл (содержание белка) GRA-2 и 15% FCS при 37°С. На второй день к среде добавл ют TCGF человека до тех пор, пока концентраци  не достигнет 20%, и пр одолжают инкубирование еще в течение 2 дней дл  получени  киллерных клеток (GRA-2-K/T).

Пример 4. Препараты киллерных клеток GRA-8-K-T, ,GRA-3-A-K-T и GRA-3-C-K-T получают таким же способом , как в примере 1 с использованием GRA-8, GRA-3-A и GRA-3-C соответ- :ственно (содержание белков) 1000 нг/мл.

15

20

25

30

35

40

Пример 6. Лимфоциты периферической крови человека (5-10) инкубируют в 5 мл RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-1,при в течение 2 дней. На третий день лимфоциты перенос т в среду RPMI-1640, содержащую 10%- ную сыворотку от донора лимфоцитов и от О до 100 нг/мл (белковое содержание ) GRA- 1 , и продолжают инкубирование еще в течение 5 дней дл  получени  препаратов киллерных клеток.

Пример 7. Лимфоциты Периферической крови (PBL), вз тые у различных раковых больных после операции , сенсибилизируют GRA-3 с получением препаратов киллерных клеток, PBL (5-10 ), вз тые у больных, инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3, в течение 2 дней, а затем в среде RPMI-1640, содержащей 20% TCGF и 15% FCS, еще в течение 5 дней дл  получени  киллерных клеток.

PBL (5)10 ), собранные у больных раком груди по прошествии 21 дн  после операции, инкубируют в среде RPMI-16405 содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3 и 10%-н то сыворотку,, вз тую у пациентов, в течение 7 дней дл  сенсибилизации PBL и получени  препарата киллерных клеток (GRA-3-K-T-7).

Дл  вы влени  противораковой акПример 5. Мышам СЗН/Не (сайт jг тивности препарат GRA-M-I разбавл ют

ка, 8 недель) пересаживают внутрикож- но клетки Х5563 (Ю) того же штамма , и по истечению 7 дней опухоль извлекают хирургическим путем. Еще через 7 дней прививают клетки Х5563 (10) того же штамма, и мьши, устойчивые к прививкам, названы иммунными мышами.

Клетки селезенки иммунных мьш1ей и нормальных мышей СЗН/Не получают с помощью обычного метода.

Каждую партию клеток селезенки (5 10 /лунку) сенсибилизируют 40 нг/мл (содержание белка) ..

50

55

физиологическим солевым раствором так, чтобы количество сахара и белка составл ли соответственно 1,0 мкг/мл и 1,6 мкг/мл с целью получени  противоракового агента.

Злокачественную опухоль, развившуюс  у мьш1ки СЗН/Не в результате . спонтанно возникшего рака молочной железы, вырезают в стерильных услови х , разрезают на 5-мш1лиметровые кусочки кубической формы н трансплантируют (пересаживают) под кожу спины каждой из дес ти подопытиььч мьшгек СЗН/Не той же линии, что н мьтшка-до14125964

в среде RPMI-1640, содержащей 15% FCS, в течение 5 дней дл  получени  киллерньпс клеток.

с Препарат киллерных клеток, полученных из нормальных клеток селезенки , обозначаетс  GRA-M-5-K-T-I, а препарат, полученный из клеток селезенки иммунных мышей, обозначаетс 

5

0

5

0

5

0

Пример 6. Лимфоциты периферической крови человека (5-10) инкубируют в 5 мл RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-1,при в течение 2 дней. На третий день лимфоциты перенос т в среду RPMI-1640, содержащую 10%- ную сыворотку от донора лимфоцитов и от О до 100 нг/мл (белковое содержание ) GRA- 1 , и продолжают инкубирование еще в течение 5 дней дл  получени  препаратов киллерных клеток.

Пример 7. Лимфоциты Периферической крови (PBL), вз тые у различных раковых больных после операции , сенсибилизируют GRA-3 с получением препаратов киллерных клеток, PBL (5-10 ), вз тые у больных, инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3, в течение 2 дней, а затем в среде RPMI-1640, содержащей 20% TCGF и 15% FCS, еще в течение 5 дней дл  получени  киллерных клеток.

PBL (5)10 ), собранные у больных раком груди по прошествии 21 дн  после операции, инкубируют в среде RPMI-16405 содержащей 50 нг/мл (белковое содержание) GRA-3 и 10%-н то сыворотку,, вз тую у пациентов, в течение 7 дней дл  сенсибилизации PBL и получени  препарата киллерных клеток (GRA-3-K-T-7).

Дл  вы влени  противораковой ак0

5

физиологическим солевым раствором так, чтобы количество сахара и белка составл ли соответственно 1,0 мкг/мл и 1,6 мкг/мл с целью получени  противоракового агента.

Злокачественную опухоль, развившуюс  у мьш1ки СЗН/Не в результате . спонтанно возникшего рака молочной железы, вырезают в стерильных услови х , разрезают на 5-мш1лиметровые кусочки кубической формы н трансплантируют (пересаживают) под кожу спины каждой из дес ти подопытиььч мьшгек СЗН/Не той же линии, что н мьтшка-донор (группу подопытных животных составл ли самцы в возрасте 7 недель). Через 7 дней после трансплантации . констатируют приживление и разрастание (пролиферацию) опухоли у всех подопытных мышек. Каждой из п ти мы.- шек ввод т затем подкожно противораковый аг ент. Введение препарата осуществл ют в дозе 300 мкл в день с интервалами в два дн . Оставшихс  п терых мышек используют в качестве контрольных животных, не подвергшихс  лечению. Спуст  дес ть дней после первого введени  препарата у всех животных вырезают опухоль (оперативным путем) и замер ют средний вес опухоли в каждой группе животных. Одновременно производ т патогистоло- гическое исследование.

Данные свидетельствуют о том, что в результате лечени  произошло уменьшение размеров опухоли на 86,3%.

Результаты патогистологического - исследовани ,

У мьшек контрольной группы тело опухоли приобрело форму птичьего гнезда, тип ткани был подобен медулл рному каналикул рному раку (раку спинно-мозгового канала), причем размножение опухолевых клеток наблюдалось по всей ткани. В группе мьш1ек, которым вводили противораковый агент раковые клетки вызывали разжижитель- ный некроз в местах, где образовалис раковые клетки. При этом,происходила кальцификаци  и фибрикаци  (образование волокон), оставл   лишь очень ограниченное количество раковых клеток . Таким образом, в этом эксперименте наблюдалось отчетливое противоопухолевое действие противоракового агента изобретени .

Препарат GRA-I-K-T (1 мкл) поместили на микропластинку и оставили при комнатной температуре на 15 мин. Затем туда добавили 4 мкл FCS и смесь оставили сто ть при комнатной температуре в течение 30 мин. Обработанные ферментом нейраминидазой красные кров ные клетки (эритроциты) овцы (SRBCN) довели до концентрации 1 х X 10 клеток/мл и добавили 5 мкл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего 0,85% NaCl, после чего пластинку подвергли процедуре разделени  с помощью центрифугировани  при скорости 600 об/мин в течение 5 мин. Затем пластинку перевернули

0

5

и непрореагировавши эритроциты SRBCN удалили. Дл  прокрашивани  лимфоцитов систему обрабатывали раствором красител  Брилль нт Крезил Блю и затем исследовали степень развити  положительной реакции розеткообразо- вани  (розеткообразующей позитивности ) . В результате было обнаружено, что по крайней мере 98% клеток про вл ет розеткообразующую позитивность (Т-клетки).

Про вление специфической киллер- ной активности в отношении раковых клеток.

Использовали следующие п ть клеточных штаммов, имеющих различные отношени  позитивности GRA (GRA Ро- sitivivity ratios). Эти клеточные штаммы использовали в качестве мишеней раковых клеток человека. Раковые клетки-мишени: ВТ-1 (лимфома Буркитта) Dandi (лимфома Буркитта) КАТО-111 (рак желудка) ЖN-45 (рак желудка) MOLT (Т-клеточна  лейкеми ) На микррпластинку нанесли с помощью процедуры центрифугировани  при- , скорости 800 об/мин в течение 5 мин слой из 5-10 на источник мишеневых , раковых клеток. Затем туда осторожно добавили 4-10 на источник клеток- киллеров GRA-1-К-Т полученных по примеру 1, и систему инкубировали в течение 1ч.

Киллерную.активность определ ли в соответствии со степенью образовани  зон гемолиза (п тен или бл шек- -plaque-forraacion) и оценивали ее с помощью следующей системы оценок:

++ наблюдалась значительна  киллер на  активность;

1 наблюдалась выраженна  киллер- на  активность;

± наблюдалась слабо выраженна  киллерна  активность;

- киллерной активности не наблюдалось .

В контрольной группе были использованы несенсибилизированные лимфоциты периферической крови человека, которые получали тем же способом за исключением того, что в этом случае 5 не использовали GRA.

Данные показывают, что Т-клетки- киллеры, полученные по предлагаемому способу, обладают сильной GRA-cne0

5

0

5

0

цифической ингибирующей активностью в отношении раковых клеток.

Пример 8 (сравнительный). В качестве специфических антигенов дл  использовани  в предлагаемом способе вместо GRA были использованы сами раковые клетки (per se).

Лимфоциты, сенсибилизированные раковыми клетками, бьти получены аналогично примеру 1, с той только разницей , что вместо GRA были использованы раковые клетки ВТ-1, Dandi, КАТО-111 или MKN-45 в дозе ЫО клеток на лабораторную чгашку.

При использовании полученных таким образом лимфоцитов проводили исследование их цитотоксической актив- ности по той же методике. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Как видно из табл. .1, приготовленные лимфоциты не обладали какой-либо итотоксической активностью по отноению к раковым клеткам-мишен м.,

5

Специфическое высвобождение Сг

(Высвобождение при испытании) - ССамопроизвольное высвобождение) (Максимальное высвобождение) - (Самопроизвольное высвобождение)

Максимальное высвобождение обозначает радиоактивность, при которой все клетки лизированы.

При использойании в качестве мишени клеток КАТО-Щ, меченых Сг, наблюдалось специфическое высвобождение Сг, равное 14,3% (Е/Т 20/1)

Пример 9. Получение GRA.

Иммобилизованный лектин (PNA-Se- pharose) получают следующим образом, 3 г CNBr-активированной Сефарозы 4В тщательно промывают 1 мм раствором сол ной кислоты и суспендируют в 200 $ш 0,1 М раствора бикарбоната натри  (рН 8,5). Затем к полученной суспензии прибавл ют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 8,5), содержащего 20 мг арахисового лектина (PNA) и смесь оставл ют реагировать в услови х периодического перемешивани  при на период, равный 2ч, с целью получени  иммобилизованного препарата лектина (PNA-Sepharose).

Аналогично, за исключением того, что вместо PNA использовали DBA (агглютинин бобов Долихас), получили DBA-Сефарозу.

Получение GRA.

Раковые клетки ВТ-1 (лимфомы Бур- китта, 1,3-10 клеток) промывают

0

0

Цитотоксичность каждого из препаратов киллерньгх клеток определ ли с помощью теста на высвобождение Сг. А именно, 50juCi радиоактивного Сг (Японска  Ассоциаци  Изотопов) добавл ли к КАТО-111 (2-10) и клетки инкубировали при в течение 1 ч в среде RPMI-1640, промывали при центрифугирований с получением клеток мишеней , меченный Сг.К клеткам-мишен м (1 -10 ) добавл ли киллерные клетки (эффекторные клетки, 2-10 ) таким образом, чтобы Е/Т 20/1, смесь инкубировали при 37 С в течение 4 ч в среде RPMI-1640. Супернатант собирали с помощью центрифугировани , определ ли его радикальность в жидкостном счетчике-сцинцилл торе.

Специфическое высвобождение Сг (%), соответствующее цитолитической активности эффекторных клеток, вычисл ли по следующей формуле:

0

5

0

5

0

5

3 раза физиологическим солевым раствором и прибавл ют 30 мл 0,01 М буфера трис-сол на  кислота (рН 7,4), содержащего 2% эмульгатора Тритоп Х-100 ; 0,85% NaCl, 2 мМ СаС и 2 мМ хлористого магни . Полученную смесь перемешивают при 4 с в течение 15 мин и затем подвергают ультрацентрифугированию при 100000 g. Из 28 мл полученной таким образом надосадоч- ной жидкости (супернатанта) 14-мидли- литровую порцию пропускают через колонку (диаметром 0,5 см и длиной

1см) дл  аффинной хроматографии, набитую сферическими гранулами иммобилизованного на агарозе лектина (PNA-Sepharose), которую уравновешивают трис-сол нокислым буфером (рН7,4),- содержащим 0,1% Тритона Х-100, 0,85% NaCl, 2 мМ 2 мМ МаС. После промывки колонки тем же буфером ее элюируют 0,01 М трис-сол нокислым буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М лактозы, 0,85% NaCl, 2 мМ CaCl,

2мМ MgCl и 0,1% Тритона Х-100. Элюированную таким образом порцию диализуют против 0,01 М трис-сол но- кислого буфера, содержащего 0,85% NaCl, 2 мМ CaClj, у 2 мМ MgCl , в течение 48 ч, в результате чего получа914

ют 17 мл раствора GRA, Количество белка и количество сахара (углеводов) в этом растворе GRA измер ют по мег тоду Фолина-Лоури (концентраци  белка ) и по методу, основанному на использовании системы фенолсерна  кис.- лота (концентраци  сахара). При этом было найдено, что в растворе GRA содержание белка составило 644 мкг, а содержание сахара - 120 мкг соответ- ственно. Этот препарат (раствор GRA) будет именоватьс  GRA-1.

Клетки рака молочной железы (ММТ) мьши СЗН/Не (1 ю клеток) промывают 3 раза физиологическим солевым раствором , после чего обрабатывают их 30 мл 0,01 М трис-сол нокислого буфера (рН 7,4), содержащего 2% Тритона Х-100, 0,85% NaCl, 2 мМ CaClj и 2 мМ хлорида магни . Полученную смесь перемешивают при 4°С в течение 30 мини После этого смесь центрифугируют на ультрацентрифуге при 100000 g в течение 2 ч и полученный супернатант диа- лизуют в течение ночи против О,1 М трис-сол нокислого буфера (рН 7,4)i содержащего 0,85% NaCl, 2 мМ CaCl и 2 мМ MgCl. Диализованную таким образом жидкость сконцентрируют до объема, равного 3 мл, и 1-миллилит- ровую порцию этого раствора пропускают через колонку (диаметром 0;5 и длиной 2 см) дл  аффинной хроматографии , заполненную-тем же иммобилизованным на Сефарозе лектином (PNA - Sepharose) , уравновешенную трис -сол - нокислым буфером (рН 7,4), содержащим 0,005% Тритона Х-100 0,85% NaCl, 2 мМ CaCl, и 2 мМ MgGl.. После тщательной промывки колонки тем же буфером ее элюировали 0,01 М трис-сол нокислым буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М лактозы, 0,85% NaCl, 2 мМ CaClj,, 2 мМ MgCl и 0,005% Тритона Х-100, и полученный таким образом элюат диализуют в течение 48 ч против 0,01 М трис-сол нокислого буфера (рН 7,4), содержащего 0,85% NaCl, 2 мМ СаС и 2 мМ MgClj,, в результате чего получают 2 мл раствора GRA. В полученном таким образом растворе GRA содержалось 156 мкг белка и 94 мкг сахара. Этот препарат будет именоватьс  GM-M-I.

Примерно 120 г (влажного веса) КАТО-111 гомогенизируют в 100 мл PBS с помощью размельчител  Варинга. После центрифугировани  при 100000 g

259610

в течение 1 ч таблеуку раствор ют в 100 мл 2%-ного Тритона Х-100 в 0,01 М буфере трис-НС1 (рН 7,6), соf . держащем 0,15 М MaCl. После центрифугировани  при.100000 g в течение 1 ч собирают супернатант и нанос т его на колонку PNA-Сефарозы 4В (0,8 х X 15 см), уравновешенную 0,015%-ным

0 Тритоном Х-100 в 0,01 М трис-НС1

(рН 7,6), содержащем 0,15 М NaCl. После промывани  50 мл буфера GRA элюи- руют буфером, содержащим 0,1 М лактозы . Элюированный GRA диализуют про15 тив 0,85% NaCl, концентрируют с помощью Сефадекс Pharmacia Со. и.хран т при -20 С до использовани .

Обнаружили, что содержание белка и сахара, определенное таким же спо20 собом, составл ло 2,0 мг и 0,8 мг соответственно. Этот препарат будет называтьс  GRA-2.

Аналогично получали другие пробы GRA (табл. 2).

25 Аналогично, кроме того, использовали клеточную линию (MKN-45; около 29 г) вместо КАТО-Щ, вместо PNA- Сефарозы 4В использовали DBA-Сефаро- зУа проводили злюирование с помощькГ

30 N-ацетилгалактозамина, получали препарат GRA, содержание белка в котором составл ло 0,03 мг, а содержание сахару составл ло 0,01 мг. Это препарат GRA-8.-.

Локализаци  (местонахождение) GRA. Получение FITC-меченого лектина (PNA-FITC). 10 мг арахирового. лектина раствор ют в 2 мл 0,01 М фосфатного буфера, содержащего 0,85% NaCl

4Q (рН 7,2). В 1 мл 0,5 М бикарбонатно- го буф.ера (рН 9,0) раствор ют 2 мг FITC, О,5-миллилитровую порцию полученного раствора прибавл ют к ранее приготовленному раствору арахисового .g лектина в фосфатном буфере. Далее эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего нанос т на колонку с Сефадексом G-25. (стандартна  колонка диаметром 10 мм и длиной 300 мм) и подвергают разделению собира  фракцию, соответствующую начальному пику. Отношение FITC/PNA 1,0.

Получение лектина, меченого FITC

35

50

55

(DBA-FITC) аналогично. DBA-FITC получали с использованием DBA. FITC/DBA 0,9.

Агглютинин соевых бобов - FITC (FITC-SBA) соотношение FITC/SBA 1,4.

1 I

Локализаци  GRA в различных раковых клетках.

Раковые клетки культуры ткани человека (1-10 ) промывают 3 раза 0,05 буферным раствором трис-сол на  кислота , содержащим 0,85% хлорида натри  (рН 7,2), использу  дл  этого прцедуру центрифугировани , после чего прибавл ют к ним 100 мкл FITC-мечено го лектина (PNa-FITG, DBA-FITC или SBA-FITC 200 мкг/мл, приготовленного как описано.

Полученную смесь оставл ют сто ть при комнатной температуре в течение 30 мин дл  протекани  реакции. После Завершени  реакции указанную реакционную смесь трижды промывают 0,01 М фосфатным буфером, содержащим 0,85% NaCl (рН 7,2), после чего промытые клетки помещают на стекл нную пластинку и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.

Злокачественные ткани, вз тые у раковых больных, пропускают через сетку из нержавеющей стали ( # 150) дл  получени  суспензии единичньЕХ клеток. После двукратного промывани  .буфером 0,01 М трис-HCI (рН 7,4), содержащим 2 мМ CaCl, 2 мМ MgClg ,и 0,85% NaCl 510 клеток, повторно суспендируют в 100 мл буфера. 100 мл FITC-PNA или FITC-SBA (200 мг/мл) добавл ют к этой клеточной суспензии и смесь выдерживают при комнатной температуре 20. мин После трехкратного промьшани  холодным PBS клетки наблюдают лод флуоресцентным микроскопом .

Таким образом, предлагаемый спосо позвол ет повысить цитотоксическую активность лимфоцитов против раковых клетюк за счет использовани  GRA, полученного из компонентов раковых клеток, при этом активность лимфоцитов возрастает до 38% цитотоксичнос- ти и более.

ВТ-1

у Рак груди

QG-56

33

5 24

р

мула

12 и 3 о б р

е т е н и  

5

0

Claims (3)

1.Способ получени  цитотоксичес- ких к раковым клеткам лимфоцитов, включающий сенсибилизацию лимфоцитов противораковым антигеном, отличающийс  тем, что, с целью повышени  противораковой активности лимфоцитов, в качестве противоракового антигена используют гликосв зан- ньй антиген в количестве 1-1000 нг/мл. на (1-5)-10 лимфоцитов и сенсибилизируют лимфоциты в течение 2-7 сут.

2.Способ получени  гликосв занно- го антигена путем гомогенизации или солюбилизации раковых клеток человека или мощи,, отличающийс  тем, что, с целью повышени  противораковой активности лимфоцитов, дополнительно компоненты клеточных мембран обрабатьтают лектином с последующим выделением лектина и гликосв - занного антигена.

3. Способ по п. 2, о ю щ и и с   тем, что в

т л и ч а- качестве лек30

тина используют арахисовый лецитин и агглютинин из бобов Долихос.

Т а б л и ц а 1

Клетки- мищени

Раковые клетки, использовав- щиес  дл  сенсибилизации Лимфоцитов

ВТ-1 Dandi КАТО-11 1MKN-45

о

45

I

у

ВТ-1 Dandi КАТО-111 MKN-45

Таблица 2

0,9 0,5 0,38

Извлеченный хирургическим путем.