JPS5857318A - 癌細胞障害性リンパ球の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は癌細胞障害性リンパ球（以下「キラーＴセル」
と称する）の製造法、史ＫＷ細には。

癌細胞由来糖鎖関連抗原（以下ｒＧＲＡＪと称する）を
もつ癌細胞に特異的に作用して、該癌細胞を破壊するキ
ラーＴセルの製造法に関する。

免疫担当細胞、特に細胞性免疫の主役であるＴ　ＩＪン
パ球は＃熾免疫の際異種細胞抗原にもとすく拒絶反応を
行うにもかかわらず、癌細胞に対してはこの免役抑制が
認められないかあるいは−い０健って％陥細胞龜破謝さ
れずに生体内で増殖し、ついには担癌宿土を死に至らし
める。

木兄明省は、癌＃Ｉ胞に対する宿主の免疫応答並ひ！Ｌ
１１ｖＩ治僚への応用について鋭意研究を行っていたと
ころ１分化した止＊細胞には飴められない癌細胞特異抗
原中に１個主に免疫原として作用し、癌細胞と特異的な
免役応答を成立させる免疫原性が懐めて尚いＧＲＡが存
在することを見出した。でして、このＧＲＡをリンパ球
に感作させると、ＧＲＡをもつ癌細胞に対し特異的に作
用するキラーＴセルが得られることを見出し、本発明を
完成した。

従って１本発明方法は、ＧＲＡをリンパ球に感作させて
キジーＴセルを製造する方法であり、本発明方法Ｉ／（
よって得られるキラーＴセルは、ＧＲＡを認識し、ＧＲ
Ａ分もつ癌゛細胞に作用してそ扛を破壊するだめ、癌の
治療及び予防ｒ（おいて極めて浚ｊした効米ｆ奏するも
のである。

本％明力法において使用されるＧＲＡに、ヒト又は動物
の培養＠ｊ細胞、移１１＃１ａ細胞、自然発生動細胞、
化学物質・ウィルス発生＄ｉ！！１ＩＩｉ８胞１手術組
諏山米８＃Ｉ胞吟のＧＲＡをもつ癌細胞より次の如くし
て得ることができる。すなわち、ます該癌細胞から細胞
膜成分を分離し、次いで末端ガラクトースと特異的に結
合するレクチンＣＪ、Ｂ、Ｃ，２５（１，８５１８−８
５２３（１９７５）：Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ、Ｃｏｒｍ＋、　６２．１４４
（１９７５）　：　Ｚ、　Ｉｍｎｕ　−ｎｉｔａｅｔａ
ｆｏｒｃｈ、１：（８，４２３−４３３（１９６９）；
　Ｂｒ−Ｊ−Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、　２ユ、　２２
８−２３６（１９４６）：Ｐｒｏｃ、Ｎａ−ｔｈ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７５．　Ｎｏ、　５．２
２１５−２２１９（１９７８）一 ：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ　３゜Ｉ’９６−２０
４（１９７４）　：Ｃａｒｂｏｈ−）’ｄｒａｔｅ　Ｒ
ｅ５ｅａｃｈ、　５１．　Ｈ）７−１１８（１９７６）
）、例えばビーナツツレクチン、ひまの実（Ｒｉｃｉｎ
ｕｓ　Ｃｏｍ−ｍｕｎｉｓ）レクチン等と処理して、該
レクチンに結合させて分離することにより容易に得るこ
とができる。

癌細胞膜成分の分離は、例えばホモジネート法、可溶化
剤を用いる可治化法等の公知の方法によってなし得る。

より有利には例えはガン細胞を生理食塩水又は適当な緩
衝准中でホモジネ−トシた恢、沈ｗｋ部分を運心分離等
により採取し、こＩＬを生理食塩水父社稜＠液中ＶＣ′
ｃｉＴ語化剤を用いて齢解し、上首部分ヶ遠心分離等に
より取り出すことにより実施できる。剛いられる可溶化
剤としては、−叡に細胞族を可溶化できることの知らｊ
している各機の界！［］油性剤例えば［ト　　リ　　ト
　　ン　Ｘ　　−１（１０Ｊ　　　（オロ　ッし　純　
桑　社　製　）　　。

ｒＮＰ−４０Ｊ（シェル社袈）、ジキトニン、尿＃！、
郷の非イオン性界歯】活性剤、ドデシル恢酸ナトリウム
（５ｌｕＳ）等の隘イオン界面活性剤等を例示できる。

壕だ上記により得られる＃Ｉ胞腺成分からのレクチンと
結合うるＧＲＡの分離は、該ＧＲＡの性餉を利用した通
冨の物理化学的又は生化学的＋Ｒにより何ない侍る。該
手段としてｉＪ例えはレクチンを含むカラム担体を利＃
３−ｆるアフィニティークロマトグラフィー、ＧＲＡ抗
体等を用いる免疫沈ｗ法、透析法、ケル漉過法、電気泳
動法、ポリエチレングリコールやアセトン等の抛伽白沈
ＩＲ剤會相いる物理的沈岐法等又は２叫を適宜組み合せ
た方法を例示できる。より有利にはレクチンを含むカラ
ム担体を利用したアフィニティークロマトグラフィーに
よるのがよく。

該カラム担体は、例えばレクチンを不溶化支持体上に固
定化することにより容易に収得できる。

ここでレクチンの不溶化支持体上への固定は。

従来公知の生体物質の固定化方法に従い行なうことがで
きる。こ扛らのうちでも臭化シアン活性化多糖体性、Ｎ
−ヒドロキシサクシミド゛エステル法等を使用する噸、
定住方法によるのが好適である。このうち臭化シアン活
性化多糖体性は、不溶性支持体を臭化シアンで処理し、
次いで得らｆＬる活性化物をレクチンと緩和朱件下にカ
ップリングさせ、レクチンを固定化する方法である。不
溶性支持体を臭化シアンで処理するに当っては１例えば
水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の塩基性化合
物を用いて、ｐ　Ｈ７，５〜１２に保ち室温下、水、ア
セトニトリルや０．１Ｍ炭酸水累ナトリウム板＠敵（ｐ
Ｈキ８．７　’）　。

Ｑ、　０１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨキ７．７）等のｐ　
Ｈ７，５〜１２の緩衝液婢の浴□媒中にて約ｌ〜１２分
間程嵐処理すれはよい。不溶性支持体に対する臭化シア
ンの便用蓋として１町通常おより叫１鴛とするのがよい
。ここで不溶性支持体としては。

生体物質一般に対する非特異的吸着が低く、高い多孔性
を肩し、Ｉｊｋ和条件下に生体物質を固定化し得る′＠
能基會有し、しかも化学的・物理的に十分安定な従来公
知の小結性支持体をいずれモ使用で睡る０例えばアミノ
エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ブロ
モアセチルセルロース、ｐ−アニリノセルロース等のセ
ルロース４Ｘ持体、セファデックス、ＣＭ−セファテッ
クス（ファルマシア社製）等の架橋デキストラン糸支持
体、セファロース２Ｂ％セファロース４Ｂ、セファロー
ス６Ｂ（ファルマシア社製）等のアガロース糸支持体尋
を挙けることができる。斯くシて得られる臭化シアン活
性化支持体をレクチンとカップリングさせるに際して扛
、レクチンに対して臭化シアン活性化支持体を３（）〜
ＨＯ＠’７７７１皺用い、過当な触媒１例えはＯ１モル
災ハ水素す）　ＩＪウム（０５モル塩化ナトリウム含七
％ｐＨ８，４）水浴進中、通常Ｏ〜４０℃程薇、好まし
くは２〜８℃にて約１０〜２０時−１反応させれはよい
。このようにしてレクチンを含むアフィニティークロマ
トグラフィー用担体が製造される。

上６己レクチンを含むアフィニティークロマトグラフィ
ー用担体を利用したクロマトグラフィーによれば、目的
とするＧＲＡが上記担体中のレクチンと結合して力、ラ
ムに抽象される。次いで該カラムに１例えばガラクトー
ス、末端にガラクトースを有する二軸類、オリコサツカ
ライド勢のレクチンと結合する物質を通して交換反応を
行うか、または高＆ｌｊＬの塩、チオシアン酸カリウム
水浴液、硼酸皺価液尋の収着分離剤（浴出液）を通して
ＧＲＡを解離して収得する。

斯くして得ら７ＬるＧＲＡはカラクトース末端を有する
糖タンパク、糖ペプチド、＠Ｂ＝買及び（又は）糖類を
含むものである。

また、リンパ球は籍に制限はなく、正常あるいは也陥の
ヒト又ＦｉＩＮＪ物のリンパ球の何れをも使用でさ、具
体例としては、ヤリえは末梢血、骨髄、リンパ顧、胛−
１ｈ桃腺、胸腺等白米のものが牟けられる。ｃＪＬらの
リンパ球は、物理的、化学的方法あるいは表圓膜法吟に
よって率離さＩＬｓ本発木兄法ｔｉｃ惧し得る。

ＧＲＡンこよるリンパ球の感作は、ＧＲＡを含む培地中
で、リンパ球を１へ−１（ｌ［：ＩＵ、好ましくは２〜
７日間培誉するととｔ（よっ−〔行われる。

培地としては、この種の＃１ｉＩ胞墳資ＶＣ用いられて
いる一叡的な谷檀宋誉培地紮使用できるが。

例えはＲＰＭＩｌｈ４ｏ培地、イーグルＭＥＭ培地等（
（ヒト血？＃　、ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、仔ウシ皿悄
、ウマ血ｆＰ１等を力ｉえたものが好ましい。

絹地Ｖ（加えられるＧＲＡは、通常リンパ球ｌ×１（）
６個／−に対し１，１ｇ蓋としてｌ〜ｌ旧団社／−１待
Ｋｉ〜５００外Ｖ／−か灯ましいＣ場寮ｔＬ１冨法に従
って１例えはｐ　）１７．２付近で、：４７℃付近の温
度で行わ！しる。

ル［〈シて侍らｆＬるキラーＴセルｒｊ１、Ｔ＃Ｉ胞増
殖因子（ＴＣＧＦ　、　ＩＬ−１）　ｉ含む上ｇｅ　ｊ
＠ｍ−ｃ、その活性ヶ保持嘔せながら無制眠に増殖させ
ることができる、この場合、通常の限界希釈法により良
にキラーＴセルのクローニンの辿別培４＃を行ってもよ
い、キラーＴセルは、例えば液体窒素中に保存すれば、
長期間安定に保存することができる。

本発明方法で得られるキラーＴセルは、この種の血液製
剤に使用される担体と共に江射剤とするのが好ましい。

担体は籍に限定されないが、血液と等張であるもの、・
、特に生理穴塩水が好適である。製剤化に当っては、キ
ラーＴセルは生理穴塩水等で光分に抗沖して上記培地を
除去した後、担体中に浮遊させるのか好ましい。

当該＃！剤中のキラーＴセル＃Ｓ度は特に制限されない
か、一般には１０ｈ−１０凰”８７ｗｔが好ましい。’
ｆ７ｔキラーＴセｋ　１４１０　”　ｉｍｌ／　マウス
（腹腔内）投与で毒性は認められない。投与量は、疾患
の程度、年令、任別によって異なるが、通常１　ｏ５〜
ｔ　ｏ”１國／’９／日′に１〜数口に分けて投与する
のが好ましい。

参’ｉ　’ｆｌ１１１−　（ＧＲＡの局在）■　ｋ’１
１’ｃｍＲレクチン（ＰＮＡ−ＦＩＴＣ）の装造：ピー
ナ７Ｌ／クチ７　（ＰＮＡ、ＥＹ社Ｈ）　１０　ｍｇを
０．８５％Ｘ　ＮａＣｊの０．０１Ｍ−リｙｇｌｆｆ１
４１１衡液（ｐＨ７，２）　２　ｄＫ俗ＷＧす６６　ｒ
’ｌＴｃ　（シグマ社製）２ｑ會０，５Ｍ−皇戻緻塩駿
術漱（ｐＨ＝９．ｏ）ｉ−に溶解し、その０．５ｄを上
記ＰＮＡの駿淘液に加える。蔓温にて２時閾攪件波セフ
ァデックスＧ２５（１０ｆｆ１ｍＸ３００１ｍ　ｓ　フ
ァルマシア社表）にて分離しＭ４）Ｊのピークを珠取す
る。Ｅ／Ｐ比＝１．０ ■　谷樵嬌細胞のＧＲＡ燭仕： ％徨ヒト層書Ｍｈ＃Ｉ胞ＩＸＩＵ’ｉ−を０，８５％Ｎ
ａＣｊの０．０５Ｍ−）リス塩＊椴爾液（ｐＨ＝７．２
）にて３回遠心法にて洗浄後、上記■で傅友Ｐ凶Ａ−Ｆ
ＩＴＣ（２００μｔ／−）を１００μを麟加し、＊ｒａ
にて３０分間靜厘反応させる。

反応終了後０．８５％ＮａＣｔの０．（ＩＩＭ−リ：ｙ
ｉ！ｌ！塩収衝准（ｐＨ＝７．２）にて、３回洗浄後、
細胞をカラススライド上にのせ、螢光顕徽鏡下に検鏡を
ｈなう。

結果は第１表のとおりである。尚供試癌細胞は（ＩＩＪ
ｊＬも公知のものであり、新潟大字医学部第一病理から
入手した。

以下余白 第　１　表 径考例２（ＧＲＡの調製） ■　不溶化レクチン（ＰＮＡ−セファロース）の製造； ＣＮＢｒ−ａ性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製
）３２を１ｍＭ−ＨＣＬで充分ＶＣ洗浄後０、１　Ｍ−
炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝８５）２　ｆｌ　（ｌ　ｖ
ｔｉ（懸濁し、ＰＮＡ２（ｌ　Ｗを言むＱ、　１１１Ｍ
−リン酸塩緩衝液（ｐ）Ｌ＝７．７）５−を加え、２５
℃で時々？＃拌ｌ−なから２時間反応させてＰＮＡ−セ
ファロースヲ得ル。

■　ＧＲＡの調製： （イ）　ＢＴ−１（パーキラ）　ＩＪンバ腫）細胞１３
Ｘ１０８　　個を生理食塩水で３回洗浄し、２　つ６　
［ト　リ　ト　ンＸ−１（１（Ｉ　　Ｊ　　（オ（」ｙ
し一七薬社製）０．８５％ＮａＣｔ、２ｍＭ　ＣａＣｌ
２．　２ｍＭ−ＭｇＣ１２の　ＯＣ１Ｉ　Ｍ　　−ト　
リ　ス堪＃に緩（−けＡ表（ｐＨ＝７．４）３（１−を
加え、４℃で１５分ｊ口Ｊ攪拌する。ヤの後ｌＯα（ｌ
　ｉｌ　（Ｉ　Ｘ　？で２時間組遠心した。超遠心上清
２８ｔｎｔのうち。

１４ｄ　　を　Ｏｌ　％　ト　リ　ト　ン　Ｘ　　−１
（ｌ　　ｆ）　　、　　Ｑ、８５％　ＮａＣｔ、　２ｍ
Ｍ−ＣａＣｔｚ、　２ｍＭ−ＭｇＣＬｚのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ＝７．４）で平慟化したＰＮＡ−アカロー
スビーズ（丸書社製）のアフィニティクロマト（φ０．
５　Ｘ　１　ｃｍ　）　Ｋ付す０同板備液で洗浄後、　
０．１　Ｍ−ラクトース、０８５％ＮａＣｔ、　２ｍＭ
　ＣａＣｌ２．２ｍＭ−ＭｇＣＣ２，０，１％　ト　リ
　ト　ン　Ｘ　　−１（１（ｌ　　の０．０１Ｍ　−ト
　リ　ス　−塩百走起（イーｉ６欠　（ｐＨ＝７．４）
　　で浴出し％浴出部？　０．８５％Ｎ　ａ　Ｃ１、２
ｍＭ−Ｍｇ　ＣＬ　２゜２ｍｋｓ　　　ＣａＣＣ２の　
Ｏ，（ｌ　　ｌ　　Ｍ　　−）　　リ　ス　−　＊除紋
＊敵で４８時間透析してＧＲＡ浴Ｗ１７艷倚る。

このもののタンパク振及び糖量をＦｏｌ　ｉｎ　−’Ｌ
ａｗｒｙ法及びフェノールｔｔ＃に法で測定した結果、
タンパク１−は６４４μｙ、ｓｔはｌ　２０　＃　ｆで
あった。以下これをｒＧＲＡ−１ｊと称する。

（ロ）　　０３Ｈマウス乳癌細胞Ｉ　Ｘ　１（１１０個
を生理食ちμ　水　で　　３　回　６℃Ｐ＋ｋ　セＬ、
　　　　２　　　タｂ　　ト　　リ　　ト　　ン　Ｘ　
　−１（１（１，０、８５％　ＮａＣ６，２ｍＭ−Ｃａ
Ｃ１２，２ｍＭ−ＭＭＣＬｚの０．　ｆｌ　ｌ　Ｍ　−
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）３　（１幅を加え
、４℃で１３０分１０」攪拌する。ぞの佐１　（ｌ　Ｑ
　（１（１（ｌ　Ｘ　ｆで２時間超遠心し、での上Ｙｐ
ｔ’ｒ−０，８５％ＮａＣｔ、２ｍ〜ｊ−ＣａＣｔ２．
２ｍＭ−Ｍ　ｇ　Ｃ１２のＱ、　＋１１　Ｍ　−トリス
−塩酸緩爾敵（ｐＨ＝７．４）で１晩透析する。この透
析内液をＩｒｒｒｎｅｒｓｉｂｌｅ　−ｃ　ｘ　ｕｌｔ
ｒａｆｉｌｔｅｒｓ　（ミリポア社製）で３ｇ／に濃罰
白し、このうちの１−をＱ、１）０５つ６　ト　リ　ト
　ン　Ｘ−１（１（１，Ｑｌ（５％　ＮａＣｔ、　　２
ｍａｔ−ＣａＣ＋２　　、　　２ｍＭ−ＭｇＣ＋２の　
ト　リ　ス　−　＠亡−ヒ緩＠液（ｐＨ＝７．４）で平
衡化ｌ−だ前記番吉例２−■のＰＮＡ−セファロースの
アフィニディクロマト（φ０．５　Ｘ　２　ｃｍ　）　
ＶＣ付す。隣」緩衝液で元号に洗浄後、０．１　Ｍ−ラ
クトース、０８５％ＮａＣ６，２ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、　
２ｍＭ−ＭｇＣ４ｚＯ，（１＋１　５　　％　　　ト　
　リ　　ト　　ン　Ｘ　　−１（１（ｌ　　の　Ｑ、　
　（ｌ　　　ｌ　　　Ｍ　　−トリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．４）で浴出し。

浴出部を０．８５１　ＮａＣｔ、２ｍＭ−ＣａＣ＋２．
２ｍＭ−ＭｇＣ１２の０．　ｏ　Ｉ　Ｍ、　−）リスー
塩酸緩＠液（ｐＨ＝７．４１（−て４８時間透材上てＧ
ＲＡ浴准２ｍｌを侮る。このもののタンパク１ｔＵ１５
ｔｉμ？、糖ｉ−は９４　μｆｆあったｏこｊＬ−１ζ
− を以下ｒ　ＧＲＡ−Ｍ−Ｉ　Ｊと称する〇参考例３　（
ＴＣＧＦの調製） 日本サル〔日本ブライメイラ社より入手〕４−〇Ｎ−を
徊出し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（フローラボラトリー
社製）　Ｖ（て２回洗浄する。

メツシュ（ミリポア社製、ｌ　５　ｆ１メツシュ）ＩＣ
で細胞を濾過し、比血遠心法（比重ｔ、ｏ７６）ＶＣよ
り２　Ｘ　１（＋９／　ｍ７！のリンパ＃２ｔを得る。

このリンパ球をＲ１’ＭＩ　−１６４０培地で３１洗浄
し、ＦＣＳＩｎ％の上記培地で５　Ｘ　ＨｌフイＶゴＶ
ｃ調整し、戻酸カス培誉器中で、３７℃にて１時間静置
する。上清リンパ球を回収し。

Ｆ　Ｃ８１％の上記培地でＩ　Ｘ　ｌ（１’個／　ｆｒ
ＬＩ！Ｋ　ａｈｉ整する。インドメサシン（シグマａ＆
り１μＶ／ｓｄ、　ＰＨＡ−Ｐ　（ディフコ社製）０２
％を添加し、炭酸カス培誉器中で３７℃にて４８時…」
１＠養する。遠心分＠、　（３（１（１１１Ｘ　ｙ　、
　１　（１分）し、上溝を回収し、ミリポアフィルタ−
（０２μｍ、ミリポア社１１８り　Ｗて濾過滅菌してＴ
ＣＧＦ２ｔを得る。

診零例４（リンパ球の調製） ■　ヒト末梢血リンパ球 匪康な取入上りヘハＩＪン採血１〜で柑た血液５ｔ＋−
？ｌフィコールバック」（ファルマシアジャパン社製）
で遠心分離し、末梢血リンパ球５　Ｘ　１ｉ）７個を得
る○ （２）　マウス肺臓リンパ球 Ｃ３Ｈ／　Ｈｅ　マウス（♂、６Ｗ）の牌Ｐ＃を摘出し
。

ＲＰＩｖｌｌ−１６４ｏ培地にて、２回洗浄する。注射
針にてはぐした後ステンレスメツシュ（１０。

号）にて濾過１〜、大きい砕片を除く。−過しｔｃｍ胞
を上記培地にて２回洗印後＋２（１（ＩＸｒｌ　（１分
間遠心して４　Ｘ　０１７個の牌リンパ球を得る。

実施例１ ε吉例２−■＝（イ）で侍たＧＲＡ−１（タンパクに４
０μり／ｍｌ、糖蓋７．５μ２／−）を最終Ｌ（１０（
１倍ｒｔｃな、６１’）しＣＦ　ＣＳ　ｌ　５　％（７
，）ＲＰＭＩ　−１６４（ｌ培地で希釈して感作培地と
する。

こ（／？感作培地５−のシャーレＶＣ診考例４−■で倚
たヒト末梢血リンパ球５　Ｘ　］（１１６個１５を加え
、３７℃で２日間培養する。これをε吉例３で侍たＴＣ
ＧＦ２０チ、ＦＣ８１５％含有、　ＲＰＭＩ−１６４（
ｌ培地で史に５日曲培誉して、１Ｘｌｉ）’個／−１の
キラーＴセル２（）−を倫る。以下こｆＬ分子ＧＲＡ−
１−に−ＴＪと称する。

実施例２ ＃　＊　？ｌＪ　４−（２）で侍だマウス肺臓リンパ球
をＦＣ８１５％のＲＰｆＶＩＩ　−１６４（ｌ培地テ５
×１ｃ）６／１ａｔＫ調製し、前記−吉例２−■−（ロ
）で得たＧＲＡ−Ｍ−１を最終＃厩タンパクｉｉｉ　１
．５μ２／耐、糖ｋＯ，９μｍ／−となるように加えて
。

そ（７）５＋ｄ１３７℃Ｋ　テ２　Ｂ間シャーＬ／（６
（ＩＸ６（）−、ファルコン社）ＶＣで培寮スる。クロ
ーン形成を確認し、更にＴＣＧＦ　（日本抗体研究所社
製）　２　（１％％を含むＦＣ８Ｉ５チのＲＰＭＩ−１
６４０培ｊｔｋＫ　１−１８ｒｄ１ｍ養Ｌ　テｌ　ｘ　
［１６／　ｔｎｔ（７）キラーＴセル５（）−を得る。

以下こＩしをｒＧＲＡ−ＩＶＩ−１−に−ＴＪと称する
。

区Ｍ９！ｕ 実施例１で侍たＧＲＡ−１−に−Ｔのｌμｔをマイクロ
プレート（ファルコン社Ｈ）　ｖｃのせ室＆１５分間ｍ
ｔｋする。１ｃＲｒ（Ｆｃ　Ｓ　（キブコ社製）４μｔ
を加え％室温３（）分間静圓する。■×１＋１’個／　
ｍ　Ｋ調整したノイラミニダーセ処理ヒツジ赤血球（５
ＲＢＣＮ）　　の０８５％ＮａＣｔ加（１，１１１Ｍ　
　−リ　　ン　酸　箋費　脅〔液　　（ｐ　　Ｈ＝７．
２）５　　　μを全加え、６　（１（ｌ　ｒｐｍで５分
曲プレートを遠心する。プレートを反転し、未反応の５
ＲＢＣＮを除＠染色准（ブリリアント・タレッシルブル
ー。

メルク社製）を加え、リンパ球を染色してロゼツト形成
陽性を調べた。その結果、９８チ以上がロゼツト形成陽
性（′■゛−セル）を示した。

試験例２ ％異的紛細胞陣簀活性 （イ）標的ヒト癌細胞として参考例第１表の細胞の中で
ＧＲＡ陽性率の異なる下も己の５細胞株を用いた。

標的癌細胞屋 １、ＢＴ−１（バーキットリンパ腫） ２、　　Ｄａｕｄｉ　　　（） ３、　　ＫＡｌ”０−…　（冑癌） ４　　ＭＫＮ−４５（＃　　） ５、　　ＭＯＬＴ　（Ｔｍｍ注性白血病標的楠細ｙＭ５
Ｘ　１１１’個／ウェルをマイクロプレート（ファルコ
ン社製）Ｋ　ｌ（（１Ｏｒｐｍ＋１５分間遠心してに噛
する。次いで実施例１で得たＧＲＡ−１−に−’Ｌ’４
　Ｘ　ＨＩＪ固／ウェルを靜かに添加して１時間インキ
ユベートスる。

陣吾枯１！＋をプラーク形成の度合で下記により判雉し
た。

丹ニー晋后性が者しく餡められる。

＋：〃　　　を認める。

士：　　Ｎ　　かわすかｒ（脳めらｒしる。

−：　　ｌ　　が認めらｆＬない。

回、コントロールとして前記実施例１においてＧＲＡｉ
由いない以外龜全く同様Ｖζして得た未感作ヒト末梢血
リンパ琢を用いて行なった。結果５ｒ第２六にボす。

第２表より本発明方法により＆！造さ１しるキラーＴセ
ルのＧＲＡ特異的な強い細胞障害活性が明らかである。

第２表 （ロ）前記（イ）と同じ標的癌細胞３．２　Ｘ　ｌ（１
’個に対し−ｃＧＲＡ−１−に−Ｔ　Ｈｘ　ｔｏ５個（
ｗＪ胞比５；ｌ）の計４　Ｘ　１０’個の細胞を、ＦＣ
８１５チのＲＰＭＩ−１６４＋１培地で混合培養する。

１時閲恢に炊存細胞数をカウントし障害率を下記式によ
り算定した。

結果を第３表に示すＣ 第３表 （ハ）、（ロ）においてＧＲＡ−１−に−Ｔと標的癌細
胞の比率を５：３ＶＣ−ｊる以外は同様にして陣′＠率
を求めた。結果を第４表に示す。

々↓・１表 試験例３ Ｃａｎ　／　Ｈｅ　　自然発生乳癌の担癌マウスに実施
例２で得たＧＲＡ−Ｍ−１−に−Ｔの３　Ｘ　１０’１
０．３ｗＬｔ／匹を経皮１Ｖこ３回／Ｗ隔日投与した。

１１１日１に病巣を摘出し以下の病理ｆ９を見を得た。

第１２図に示す様に、１！Ｉ胞内にリンパ球が侵詞し、
腫瘍部の破壊が見らｆＬ、又％第１３図からは腫瘍部の
石灰化も児らｆＬ、本発明のキラーＴセルの抗腫瘍性が
明らかＶこ誌わらｔした。

本発明方法におけるＧｋＡの使用に賛えて癌＃Ｉｋ自体
を特異抗原として用いた場合全以下に不’ｔ。

前記実施例１Ｖ（おいてＧＲＡの賛わりＫＢＴ−Ｉ　ｓ
　Ｄａｕｄｉ　％ＫＡＴＯ−１及びＭＫＮ−４５をｌ×
ｌｏ’（＆１１１／シャーレ用いる以外は全く同様にし
て癌細胞感作リンパ球を得た。

このリンパ球の細胞障害活性を前記試験例２−（イ）と
同様にして調べた。結釆を第５表に示す。

第５衣より得らｆｌたリンパ球には乍く細胞障害活性が
餡められなかった。

第５表

【図面の簡単な説明】

第１図はＤａｕｄｉ癌細胞の写真、第２図に同癌細胞の
ＧＲＡ−１−に−ＴＦ（よるプラーク形成を示す与＾、
第３図はＫＡＴＯ−ｌｉｔ癌細胞の写真、第４図は同癌
細胞のＧＬ（Ａ−１−に−ＴＩＣよるプラーク形成を示
す写真、第５図＆１ＢＴ−Ｉ癌細胞の写真、第６図は同
癌細胞のＧＲＡ−Ｌ−に−Ｔによるプラーク形成を示す
写真、第７図はＭＫＮ−４５痛細胞の写真、第８図は四
部細胞のＧＲＡ−１−に−中によるプラーク形成を不す
写真、第９図はＭＯＬＴ経細胞の写真、第１０図は同癌
細胞のｃｔｔＡ−ｌ−に−’ｒによるプラーク形成を示
す写真、第１１図は未感作ヒト末梢血リンパ球の混合物
で処理１７たＢ　’ｌ”　−Ｉ＆細胞の与臭、第１２図
及び第１３凶は担癌マウスＶｃＧＲＡ−Ｍ　−１−Ｋ−
’１’ｆ＆与し、タトキの勉細胞組織の写真である。 以上 第１図 第２図 〆Ｊ！　：ｊ曲 ６４　　、”１ 第５図 １！＋　（５図 第７１７．［ ＋’Ｑ　８図 第９図 第１０図 第１１図 第１２図 第１３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　癌細胞由来糖鎖関連抗原をリンパ球に感作させる
   ことを特徴とする癌細胞障害性リンパ球の製造法。 ２　糖鎮関遵抗原が、末端ガラクトースと特異的ｒ（結
   合するレクチンと結合する癌細胞膜成分である特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。