JPS59225119A - 熱変性抗原の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な癌細胞由来糖鎖関連抗原の熱変性抗原（
以下「熱変性抗原」と称する）、更に詳細には、癌細胞
由来糖鎖関連抗原（以下ｒＧ　ＲＡＪと称する）をもつ
癌細胞に特異的に作用して、該癌細胞を破壊する癌細胞
障害性リンパ球（以下「ギラーセル」と称する）を容易
に誘導することができ、しかも液性免疫の惹起が少なく
、濃度依存性が少ない熱変性抗原の製造法に関する。

免疫項当細胞、特に細胞性免疫の主役である１９７７球
は移植免疫の際異種細胞抗原にもとすく拒絶反応を行５
ｆ／こもかかわらず、癌細胞に対してはこの免疫抑制が
認められ／、ｃいかあるいは弱い。

従って、癌細胞は破壊されずに生体内で増殖し、ついに
は担癌宿主を死に至らしめる。

本発明者は、癌細胞に対する宿主の免疫応答並びに癌治
療への応用について鋭意研究を行っていたところ、分化
した正常細胞には認められない癌細胞特異抗原中に、宿
主に免疫原として作用し、癌細胞と特異的な免疫応答を
成立きせる免疫原性が極めて高いＧＲＡが存在すること
、従ってこれが癌の治療及び予防に優れた効果を奏する
ことを見出し、先に特許出願した（特願昭５６−１５６
４１３号、同５７−１１１１６８号）。

一方、癌に対する免疫反応（Ｊ匣瘍拒絶）は細胞性免疫
が主体をなすもので、液性免疫すなわち癌関連抗原に対
する抗体は該抗原を遮蔽（ｍａｓｋ　ｉｎｇ　）するこ
とにより、またそれ自体又は免疫複合体（Ｉｍｍｕｎｅ
　ｃｏｍｐｌｅｘ　）を形成して免疫反応の阻止因子（
１３１ｏｃｋｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）　　として
作用することにょリ、更にまた抗原の分布を変化させる
（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　）ことに
より、生体の免疫監視機構の破綻をまねき、逆に１榎瘍
の成長を促進するように働き、宿主にとって不利に作用
する場合があることが知られている。

斯かる実情に８いて、本発明者は、担癌宿主の液性免疫
の惹起を抑制しく抗体産性能の低い）、かつ癌細胞に特
異的な強い細胞性免疫を成立させ得る癌細胞関連抗原を
得るべく更に研究を車ねた結果、前記ＧＲＡを加熱処理
して得られる熱変性抗原が上記条件を具備すると共に、
濃度依存性が少ないので、広い投与範囲において癌の治
療及び予防に使用できることを見出し、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明は、癌４１１胞膜成分から、末端ガラ
クトース又は末端Ｎ−アセチルガラクトサミンと特異的
に結合する性質を有する癌細胞由来糖鎖関連抗原を単離
し、次いでこれを加熱処理することにより癌細胞障害性
リンパ球誘導能を有する熱変性抗原（熱変性ＧＲＡ）を
製造する方法である、。

本発明の熱変性ＧＲＡは、ヒト又は動物の培養癌細胞、
移植癌細胞、自然発生ＷＪ細胞、化学物質・ウィルス発
生癌細胞、手術組織由来癌細胞等のＧＲＡをもつ癌細胞
より次の如くして得ることができる。すなわち、まず該
癌細胞から細胞膜成分を分離し、次いで末端ガラクトー
ス又は末端Ｎ−アセチルガラクトサミンと特異的に結合
するレクチンと処理して、該レクチンに結合させて分離
し、次いでこれを加熱処理に付すことにより容易に得る
ことができる。

上記末端ガラクトースと特異的に結合するレクチンとし
ては、例えばビーナツツレクチン、ひまの実（Ｒｉｃｉ
ｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ　）レクチン、ダイズレクチ
ン（ＳＢＡ）等を挙げることができるＣＪ、Ｂ、Ｃ。

２５０．８５１８−８５２３　　（１９７５）；　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ
、　６２．　１４４　（１９７５）　？　Ｚ、　Ｉｍｍ
ｕ−ｎｉｔａｅｔｓｆｏｒｃｈ　１３８．　４２３−４
３３　（１９６９）　；　Ｂｒ。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、　２７．　２２８−２
３６　　（１９４６）；Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｈ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　７５　、　Ａ５　、２２
１５−２２１９　　（１９７８）　；　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　１３．１９６−２０４（１９７４）　；
　　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ、旦１
，１０７−１１８　　（１９７６）：］。

また、末端Ｎ−アセチルガラクトサミンと特異的に結合
するレクチンとしては、例えばトリコスマメレクチン（
ＤＢＡ）、オサゲオレンジレクチン、ヒリツクスボマテ
イアレクチン、リママメレクチン、ダイズレクチン、バ
ウヒニアマメレクテン等を挙げることができる。

癌細胞膜成分の分離は、例えばホモジネート法、可溶化
剤を用いる可溶化法等の公知の方法によってなし得る１
、より有利には例えば癌細胞を生理食塩水又は適当な緩
衝液中でホモジネートした後、沈殿部分を遠心分離等に
より採取し、これを生理食塩水又は緩衝液中に可溶化剤
を用いて溶解し、上７ｇ部分を遠心分離等により取り出
すことにより実施できる。用いられる可溶化剤としては
、一般に細胞膜を可溶化できることの知られている各種
の界面活性剤例えば［トリトンＸ−１００Ｊ（和光紬薬
社製）、ｒＮＰ−４０Ｊ（シェル社製）、ジキトニン、
尿°素等の非イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ　）等の陰イオン界面活性剤等を例示でき
る。

また上記により得られる細胞膜成分からのレクチンと結
合するＧＲＡの分離は、該ＧＲＡの性質を利用した通常
の物理化学的又は生化学的手段により行ない得る。該手
段としては例えばレクチンを含むカラム担体を利用する
アフィニティークロマトグラフィー、ＧＲＡ抗体等を用
いる免疫沈殿法、透析法、ゲル濾過法、電気泳動法、ポ
リエチレングリコールやアセトン等の糖蛋白沈殿剤を用
（・る物理的沈殿法等又は之等を適宜組み合せた方法を
例示できる。より有利にはレクチンを含むカラム担体を
利用したアフィニティークロマトグラフィーによるのが
よく、該カラム担体は市販のものを、あるいは例えばレ
クチンを不溶化支持体上に固定化することにより容易に
収得できる。ここでレクチンの不溶化支持体上への固定
は、従来公知の生体物質の固定化方法に従い行なうこと
ができる。これらのうちでも臭化シアン活性化多糖体法
、Ｎ−ヒドロキシサクシミドエステル法等を使用する固
定方法によるのが好適である。このうち臭化シアン活性
化多糖体法は、不溶性支持体を臭化シアンで処理し、次
いで得られる活性化物をレクチンと緩和条件下にカップ
リングさせ、レクチンを固定化する方法である。不溶性
支持体を臭化シアンで処理するに当っては、例えば水酸
化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の塩基性化合物を
用いてｐＨ７，５〜１２に保ち室温下水、アセトニトリ
ルや０．１Ｍ炭酸水素す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨヰ８
．７）、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４Ｆ７．７）等
のｐＨ７，５〜１２の緩衝液等の溶媒中にて約１〜１２
分間程度処理すればよい。不溶性支持体に対する臭化シ
アンの使用量としては通常およそ等重量とするのがよい
。ここで不溶性支持体としてし得る官能基を有し、しか
も化学的・物理的に十分安定な従来公知の不溶性支持体
をいずれも使用できる。例えばアミノエチルセルロース
、カルボキシメチルセルロース、ブロモアセチルセルロ
ース、ｐ−アニリノセルロース等のセルロース系支持体
、セファデックス、ＣＭ−セファデックス（ファルマシ
ア社製）等の架橋デキストラン系支持体、セファロース
２Ｂ、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ（ファルマ
シア社製）等のアガロース系支持体等を挙げることがで
きる。斯くして得られる臭化シアン活性化支持体をレク
チンとカンプリングさせるに際しては、レクチンに対し
て臭化シアン活性化支持体を３０〜８０倍重遣用い、適
当な溶媒、例えば０．１モル炭酸水素ナトリウム（０，
５モル塩化ナトリウム含有、射ｉ　８．４　）水溶液中
、通常Ｏ〜４０℃程度、好ましくは２〜８゛′Ｃにて約
１０〜２０時間反応させＩｔばよい。このようにしてレ
クチンを含むアフィニティークロマトグラフィー用担体
が製造される。

上記レクチンを含むアフィニティークロマトグラフィー
用担体を利用したクロマトグラフィーによれば、目的と
するＧＲＡが上記担体中のレクチンと結合してカラムに
捕集される。次いで該カラムに例えばレクチンと結合す
る物質を通して交換反応を行うか、又は高濃度の塩、チ
オシアン酸カリウム水溶液、硼酸緩衝液等の吸着分離剤
（溶出液）を通してＧＲＡを解離して収得する。

上記交換反応においてレクチンと結合する物質としては
ガラクトース結合性レクチンを指体として用いた場合に
は、例えばガラクトース、末端にガラクトースを有する
三糖類又はオリゴサツカライド等のガラクトース結合性
レクチンと結合する物質を例示でき、又、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン結合性レクチンを相体として用いた場合
には、例えばＮ−アセチルガラクトサミン、末端にＮ−
アセチルガラクトサミンを有する三糖類又はオリゴサツ
カライド等のＮ−アセチルガラクトサミン結合性レクチ
ンと結合する物質を例示できる。

斯くして得られるＧＲＡは、ガラクトース及び／又はＮ
−アセチルガラクトサミン末端を有する糖タンパクを含
むものである。かくして製造されるＧＲＡは、必要なら
ば凍結乾燥してもよ（、通常の分離手段によって更に精
製することもでき、例えばガラクトース結合性レクチン
を用いて分離したＧＲＡを、次いでＮ−アセチルガラク
トサミン結合性レクチンを用いて分離する方法、又はＮ
−アセチルガラクトサミン結合性レクチンを用いて分離
したＧＲＡを、次いでガラクトース結合性レクチンを用
いて分離する方法等を例示できる。

斯（して得られたＧＲＡの加熱変性は、糖鎖には変性を
起さず、蛋白を変性するような通常の加熱条件によって
行われる。例えばＧＲＡを水、生理食塩水、リン酸緩衝
液等の溶媒中、６０〜１２０℃程度、好ましくは約９０
〜１１０℃で、５〜６０分程度、好ましくは１０〜２０
分間加熱することによって行われる。

斯くして得られる本発明の熱変性抗原は、ガラクトース
及び／又はＮ−アセチルガラクトサミンの末端糖構造と
熱変性された蛋白とからなる糖蛋白であり、これをリン
パ球に感作させることによりキラーセルを得ることがで
きる。

キラーセルの製造において、リンパ球は特に制限はなく
、正常あるいは担癌のヒト又は動物のすンバ球の何れを
も使用でき、具体例としては、例えば末梢血、骨髄、リ
ンパ節、膵臓、扁桃腺、胸腺等由来のものが挙げられる
。これらのリンパ球は、物理的、化学的方法あるいは表
面膜法等の常法によって単離され、キラーセルの誘導方
法に供し得る。

本発明の熱変性抗原によるリンパ球の感作は、熱変性抗
原を含む培地中で、リンパ球を通常、数時間〜１０日間
、好ましくは１〜５日間程度培養することによって行わ
れるっ 培地としては、この種の細胞培養に用いられている一般
的な各種栄養培地を使用できるが、例えばＲＰＭＩ　１
６４０培地、イーグルＭＥＭ培地等にヒト血清、ウシ胎
児血清（Ｆｅ２）、仔ウシ血清、ウマ血清等を加えたも
のが好ましい。培地に加えられる熱変性抗原は、通常リ
ンパ球１×１０°個／ｍｌに対し、糖量として１〜２０
００　ｎＰ／　ｍｌ、特に５０〜５００　ｎ７／ｍＡ！
が好ましい。

培養は常法に従って、例えばｐＨ７，２付近で、３７℃
付近の温度で行われる。

斯（して得られるキラーセルは、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣ
ＧＦ　、　ＩＬ−ｎ　）を含む上記培地で、無制限に増
殖させることができる。この場合、通常の限界希釈法に
より更にキラーセルのクローニンの選別培養を行っても
よい。キラーセルは、例えば液体窒素中に保存すれば、
長期間安定に保存することができる。

斯くして製造されるキラーセルは、実質的に正常リンパ
球でありＧＲＡに特異的な細胞障害活性を有することに
おいて特定される。これらのキラーセルは自ら分譲可能
な状態に保持しである。

上記の如くして得られる本発明の熱変性抗原は抗癌剤と
して有用であり、この熱変性抗原はそれ単独を有効成分
とすることも、また他の抗菌剤、制癌剤と併用すること
もできる。本発明の熱変性抗原を有効成分とする抗癌剤
は、主薬であ名熱変抗原を効果的に含有した状態であれ
ば、いかなる形態でもよいが通常は、液状溶液、懸濁液
又は乳濁液等として静脈、皮下又は筋肉内に投与される
。

これらはまた使用前に適当な担体の添加によって液状に
なし得る乾燥品として提供することもできる。このよう
な液状製剤はメチルセルロースのような懸濁剤、レシチ
ンのような乳化剤、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエー
トのような防腐剤又はそれ自体でヒトや動物の免疫機能
に悪影響を与えないような安定剤、緩衝剤等を含有しう
る。水性担体としては生理食塩水、非水性担体としては
ゴマ油等の植物油、パラフィン等の鉱物油、スクヮレン
等の動植物油又はグロビレングリコール等が使用できる
。更にまた、斯る液剤は、免疫促進のだめに適当なアジ
ュバントを含有させることもできる。アジュバントとし
ては、例えば、フロイント（Ｆ’ｒｅｕｎｄ　）の完全
アジュバント、さらには動物用のサポニン、ヒト用の水
酸化アルミニウム等を挙げることができる。

該抗癌剤は、癌患者に１回又は長期に亘って複数回投与
してその治療を行うことも、また癌に罹患のおそれのあ
るものに投与して、防御を行うこともできる。

本発明の熱変性抗原のＬＤ？ＩＯ（マウス腹腔内）は糖
１４として５００ｍｐ／ｋｇ以上と毒性が低いので、広
範囲の址において投与できる。従って、抗癌剤中の熱変
性抗原の濃度は特に制限されないが、一般には糖量とし
−てｏ、ｏ　ｏ　ｉ〜１００μｆ／ｒｎｌが好ましい。

投与量は、疾患の程ＩＷ、年令、性別によって異なるが
、通常糖量として０００１〜１０００μ？／跋／日を１
〜数回に分けて投与するのが好ましい。

また、上記の如（して得られるキラーセルも抗癌剤とし
て有用であり該抗癌剤は、この錘の血液製剤に使用され
る担体と共に注射剤とするのが好ましい。担体は特に限
定されないが、血液と等張であるもの、特に生理食塩水
が好適である。製剤化に当っては、キラーセルは生理食
塩水等で充分に洗浄して上記培地を除去した後、担体中
に浮遊させるのが好ましい。

当該製剤中のキラーセル濃度に特に制限されないが、一
般には１０５〜１０’個／　ｍｌが好ましいっまたキラ
ーセルは１０８個／マウス（腹腔内）投与で毒性は認め
られない。投与量は、疾患の程度、年令、性別によって
異なるが、通常１０５〜１０１２１固／ｋｇ／日を１〜
数回に分けて投与するのが好ましい。

次に、実施例、参考例、試験例及び比較例を挙げて示す
が、不発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１　　（ＧＲＡの局在） ■　ＦＩＴＣ標識レクチン（Ｉ）ＮＡ−ＦＩＴＣ）の製
造： ピーナツツレクチン（ＰＮＡ　、ｇＹ社ｊＪ４）１０ｍ
ｇを０．８５　％　ＮａＣｌ３の０．０１Ｍ−リン酸塩
緩衝液（１）ｌ（＝７．２　）　２ｍ１Ｋ溶解する。Ｆ
ＩＴＣ（シグマ社製）２１ηを０．５１ｖＩ−重炭酸塩
緩衝液（ｐｉ■＝　９．０　）１　ｍｌ　ニ溶解し、七
の０．５　ｍｌを一ヒ記ＰＮＡ（Ｄ緩衝液に〃１１える
１、室温にて２時間撹拌必セファデックスＧ２５（１０
１１濡×３００羽、ファルマシア社製）にて分離し最初
のピークを］呆取する。Ｆ／Ｐ比−０ ■　ＦＩ′ｌ’Ｃ標＝＋ｒｉＶり−Ｊ−７（Ｄ　ＢＡ−
１ｉ’ＩＴｃ　）　ノ製造： ＬＩ　Ｂ　Ａ　（Ｅ　Ｙ社製）を使用して、上記のと同
様にしてＩ）　Ｂ　Ａ　−１ｉ’ＩＴｃを得る。Ｆ／Ｐ
比＝０．９■　各種癌細胞・のＧＲＡ局在； 各種癌細胞Ｉ　Ｘ　１０６個を０．８５％Ｎ　ａＣ１３
の０．０５Ｍ　−トＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
にて３回遠心法にて洗浄後、上記ので得だＰＮＡ−ＦＩ
ＴＣ又は上記■で得た１）　Ｂ　Ａ　−ＦＩＴＣ又はＳ
　Ｂ　Ａ　−ＦＩＴＣ（ＥＹ社製）（２００μか−）を
１００μ召添加し室温にて３０分間Ｔｍ　置反応させる
。反応終了後０．８５％ＮａＣＡの０．０１Ｍ−リン酸
塩緩衝液（叶■＝７．２）にて３回洗浄後、細胞をガラ
ススライド上にのせ、螢光顕微鏡下に検鏡を行はう。

結果は第１表のとおりである。、同供試癌細胞は倒れも
公知のものであり、新潟大学医学部ｌ刊−病理から人手
し／こ。

以　　下　　余　　白 第１表 ■　各種癌細胞（手術片）のＧＲＡ局在：癌患者の手術
片より得た癌組織をステンレスメツシュ（Φ１５０）に
通し、細胞浮遊液を得、これを２　ｍＭ　Ｃａ（Ｊ２．
２　ｍＭ　ＭｇＣ−ｇ２及び０．８５％ＮａＣ４の０．
ＯＩＭ’）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）にて２回
洗浄する。この５　Ｘ　１０’個を上記緩衝液１００μ
形に浮遊し、Ｐ　Ｎ　Ａ　−ＦＩＴＣ又はＤＢＡ−ＦＩ
ＴＣ（２００μ？／ｄ　）を１００μ石添加し、室温に
て２０分間インキュベートする。反応終了後０．８５　
’１６　Ｎａ（Ｊの０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ）Ｉ
＝７．２）（以下ｒＰＢｓＪとする）にて３回洗浄後、
細胞をガラススライド上にのせ、螢光顕微鏡下に検鏡を
行った。結果を下記第２表に示す。尚、癌患者の手術片
は、いずれも関西医科大学より得た。第２表中、Ｇ　Ｒ
Ａの局在は以下に示す。

＋；細胞表面にＩＲＡが表現されている。

−；細胞表面にＧＲＡが表現されていない。

以下余白 第２表 参考例２ ■　不溶化レクチン（ＰＮＡ−セファロース）の製造： ＣＮＢｒ　−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）３Ｐを１　ｍＭ　−ＨＣＡで充分に洗浄後、０．１
Ｍ−炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝　ｓ、ｓ　）　２００
ゴに懸濁し、ＰＮＡ２０１１１９を含む０．ＯＩＭ−リ
ン酸塩緩衝液（ｐｎ＝　７．７　）　　５ｍｌを加え、
２５℃で時々攪拌しながら２時間反応させてＰＮＡ−セ
ファロースを得る。

■　上記■において、ＰＮＡの替わりにＤＢＡを使用し
て同様の操作によりＤＢＡ−セファロースを得る。

参考例３　　Ｇｉ七Ａの製造 ■　ＢＴ−１（バーキットリンパＩＭｒ　）細胞１．３
×１０８個を生理食塩水で３回洗浄し、２　％　ｒ　）
　！Ｊ　）７Ｘ−１００ｊ（ＪＣ光純薬社製）、０．８
５％ＮａＣｌ３．２　ｍＭ　−ＣａＣ４，２ｍＭ　−Ｍ
ｇＣ４の０．０１Ｍ−トリス塩酸緩衝液（＋）Ｈ＝７．
４）３０プを加え、４℃で１５分間攪拌する。その後１
００，０００Ｘ％で２時間超遠心した。。超遠心上清２
８Ｉｎｌのうち、１４ｍ１　を　０．１％）　　リ　ト
　ンＸ−１００、０，８５％　　ＮａＣ−ｇ、２　ｍＭ
　−ＣａＣｌ３２．２　ｍＭ　−ＭｇＣＡｔのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）　で平衡化したＰＮＡ−ア
ガｏ　−スヒ−ス（丸善社製）のアフイニティクロマト
（φ０．５　Ｘ　１　ｃｍ　）に付す。同緩衝液で洗浄
後、０．１Ｍ−２クトース、０．８５　ｆｏ　ＮａＣ−
ｅ、２ｍＭ−ＣａＣ＆　　、　　２　　ｍＭ　　−Ｍｇ
（］４３２　　、　０．　１　　％　　）　　リ　ト　
７　ｊＣ−１００の０．０１Ｍ−１リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ＝７．４）で溶出し、溶出部を０．８５　％Ｎａ（
Ｊ、　２ｍＭ−ＭｇＣｙン２　、　２　　ｍＭ　　−Ｃ
ａＣ−ｇ　２　の　０．０１Ｍ−）　　リ　ス　−塩酸
緩衝液で４８時間透析してＧＲＡ溶液溶液１傅 ＬＯ〜ｖｒｙ法及びフェノール硫酸法で測定した結果タ
ンパク量は６４４μ２、糖量は１２０μＪであった。以
下これをｒＧＲＡ−ＩＪと称する。

■　Ｃ３Ｈマウス乳癌細胞（　Ｍｔｖ［’　）　１　ｘ
　１０”イＩＭを生理食１富水で３回洗浄後、２％トリ
トンＸ　−　１００。

０、　８　５　％　ＮａＣ．、ｇ、２　ｍＭ　−　Ｃａ
ＣＡｔ、２　ｍＭ　−　ＭｇＣ−４ａ２００、０１Ｍ−
トリス−塩酸緩衝液（　ｐＨ＝　７．　４　）３０ｒｎ
ｌを加え、４℃で３０分間攪拌する。その後１００．０
００　ｘ　ｙ−で２時間超遠心し、その上清を０．８５
ｆｂ　ＮａＣＡ　２　ｍｔＶ　−Ｃａ（Ｊ、、２　ｍＭ
　　ＬＶＩｇＣ＆の０．０１Ｍ−）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ＝７．４）で１晩透析すル。コノ透析内液を）ｍｍ
ｅｒｓｉｂｌｅ　−ＣＸ　ｕｌ　ｔｒａ−ｆｉｌｔｅｒ
ｓ　（ミリボア社製）で３　ｍｌに濃縮し、このうち１
−を０．００５％トリトンＸ−１００，０，８５Ｔｏ　
ＮａＣ６，２ｍｌ■−ＣａＣ４，２ｍＭ　　ＭｇＣ４の
トリス−塩酸緩衝液（ｐｌ（＝７．４）で平衡化した前
記参考列２−■のＰＮＡ−セファロースのアフイニテイ
クロマト（φ０．５　Ｘ　２　ｃｍ　）に付す。同緩衝
液で充分に洗浄後、０．ＩＭ−ラクトース、０，８５チ
Ｎａ（Ｊ、２　ｍＭ　−ＣａＣ４，２ｒｎＭ　−Ｍｇｃ
、ａ２．０．００５チドリトンｘ−ｉｏｏの０．ＯＩＭ
−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝　７．４　）で溶出し、
溶出部を０，８５＊　ＮａＣＡ、２　ｍｒ、ＩＩ　−Ｃ
ａＣｌ３２．２　ｍＭ　−ＭｇＣらの０．０１Ｍ−）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐｌ（＝７．４）’にて４８時間透析
してＧＲＡ溶液溶液２全ｌる。このもののタンパク量は
１５６μＪ、糖騎は９４μ２であった。これを以下ｒＧ
ＲＡ−Ｍ−Ｉ　Ｊと称する。

■　ＫＡＴＯ−１１［細胞、約１２０グ〜（湿重所）ケ
Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｉ　００　ｍｌ中、粉砕機（Ｗａｒｉｎｇ
　ｂｌｅｎｄｅｒ　；日本精機社製）を１史用してホモ
ジナイズする。改心外＃（１００，０００Ｐ　Ｘ　１時
間）した沈〈査を、２チドリトンＸ　−１００，０，１
５ＭＮａＣＪの０．０１Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ＝
７．６　）　　１００ｒｎｌに加え、攪拌する。遠心分
離（１００，０００’ｉ−ｘ　を時間）しだ上・を青を
　、　　０．　０　１．　５　　％　ト　リ　）７Ｘ−
１００，０，１５ＭＮａＣ／？の０．ＯＩＭ）リスーＪ
−１４酸緩衝液（ｐＨ＝７．６）平衡化したｌ）　Ｎ　
Ａ−セファロースのアフイニテイクロマト（φ０．８　
Ｘ　１５　ｃｍ　）に付す。同緩衝液５０ｍ６で洗浄後
、０．１Ｍラクトースを含む同緩衝液で溶出し、これを
０．８５４　ＮａＣＡ水溶液にて透析してＧＲＡ溶液を
得る。これはセファデックス（ファルマシア社製）にて
礎編後−２０℃に保存した。蛋白ｋ　２．　ＯＫψ、糖
ｉｔ　Ｏ，ｓ　ｍｇこれを「ＧｇＡ−２」とする。

■　上記■と同様にして下記第３表のＧＲＡを夫々得た
。

第　　３　　表 ■　上記■において、ＫＡ’Ｌ’Ｏ−Ｈに変えてＩｓ’
ｉ　Ｋ　Ｎ−４５を約２９１、Ｐ　Ｎ　Ａ−セファロー
スカラムに変えてＤ　Ｂ　Ａ−セファロースカラムを使
用して、ラクトースの変わりにＮ−アセチルガラクトサ
ミ／で溶出した以外は同様の操作により、Ｇ　ＲＡを得
る。蛋白量０．０３　ｍｇ糖はｏ、ｏｉｍｇ。これを［
ＧＲＡ−８Ｊとする。

■　上記■で得たＧＲＡ−３の５ｍ７！をＤＢＡ−セフ
ァロースカラムに付し、０．０１５％トリトンＸ〜１０
０．２　ｍＭ　ＭｇＣ４，２ｍＭ　ＣａＣ−１３ｔ、０
．８５％ＮａＣｌ３の０．０１Ｍ）！ｊス・塩酸緩衝液
で溶出して４ゴずつのフラクションを得る。次いで０．
１　Ｍ　Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む上記緩衝液
で溶出してＧＲＡ溶液を得る。これをＧＲＡ−３−Ｃと
する。また上記フックジョン屋１〜３をＧＲＡ−３−Ａ
、フラクションＡ４〜１２をＧＲＡ−３−Ｂとする。

試験例１ 前記参考例３で得た各ＧＲＡのＳＤＳゲル電気泳動をＦ
ａｉｒｂａｎｋｓ等の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　Ｖｏｌ。

１０、ｐ　２６０６　、（１９７１）　）に準じて行っ
た。結果を第１〜５図に示す。

同、図中、各番号は夫々以下に示すとおりである。

第１及び第２図中 １・壷・スタンダード ２・・・ＧＲＡ−Ｍ−３ ３・・・ＧＲＡ　　−７ ４・・・Ｇ　ＲＡ　　−１ ５・・・ＧＲＡ−２ 第３図中 １・・・スタンダード ２・・・ＧＲＡ−Ｍ−２ ３・・・Ｇ　ＲＡ　−６ ４・・・ＧＲＡ−５ 第４図中 １・・・ＧＲＡ−Ｍ−４ ２・・・ＧＲＡ−Ｍ−５ ３・・・スタンダード 第５図中　。

１・・・Ｇ　ｉｔ　Ａ　　−３ ２・・・ＧＲＡ−３−Ａ ３・・・Ｇ　ＲＡ　−３−Ｂ ４・・・ＧＲＡ−３−Ｃ 同、第１図及び第５図はＣ，Ｂ、　Ｂ、法（ｇｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｖｏｌ、　１０　、　ｐ　２６０６、（１９７１）　Ｉ
Ｋよす蛋白の染色反応により、°又第２〜４図はｐａｓ
法（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　Ｖｏｌ、　３０、１４８　　（
１９６２））による糖の染色反応により検出した結果を
図式化した図面を示す。また、各図においてスタンダー
ドはいずれもＢｉｏｒａｄ　Ｌａｂ、社（’Ｕ、Ｓ、Ａ
、）の下記標準物質を使用した。

２００（Ｋダルトン）；ミオシン １１６　　　　　　　　；β−グルコシダーゼ９２．５
　　　　　　　　　；フォスフォリラーゼ６６．２　　
　　　　　　１ＢｓＡ ４５　　　　　　　；オブアルプミン。

２１．５　　−＃　　　　　ｉソイビーントリプシンイ
ンヒビター実施例１ 前記参考例３で得だＧ　ＲＡ　−■ｌ　−３の１００μ
ｍ・蛋白量の生理食塩水溶液を湯浴中、１００℃で１０
分間加熱して熱変性抗原を得た。これを［ＧＲＡ−Ｍ−
３−ＨＪと称する、これは１０μｆ蛋白量／ｄ濃度にて
４℃にて保存した。

実施例２〜８ ＧＲＡ−Ｍ−３のかわりに、前記参考例３で得た各ＧＲ
Ａを用いて、上記実施例１と同様にして、下記第４表の
熱変性抗原を得た。

第　４　表 参考例４　（リンパ球の調製） ■　ヒト末梢血リンパ球（ヒトＰＢＬ）健康な成人及び
種々の癌患者よりヘノクリン採血して得り、１ｆｆｌ　
液５０　ｍｌ！　ｆ　「フィコールレノ２ツク」（ファ
ルマシアジアバン社製）で遠心分離し、末梢血リンパ球
５ＸＩＯ７個を得る。

■　マウス１１♀臓リンパ球 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（占６Ｗ）のｌＩ卑臓を摘出し、
ＲＰＭＩ　　−’　１６４０　　培地にて２回洗浄する
。注射針にてほぐした後ステンレスメツシュ（Ｉｏｏ号
）にて許過し、大きい砕片を除（。濾過しだ細胞を上記
培地にて２回洗浄後、１２００Ｘ？１０分間遠心して４
×１０７個の牌リンパ球を得る。

参考例５ ■　前記参考例４−■で得だマウス膵臓リンパ球を、１
５％、、Ｆｅ２のＲＰＭＩ　−１６４０培地にて、２×
１０６／ｍｌに調製し、これに前記実施例１で得たＧ　
ＲＡ　−Ｍ　−３−Ｈを最終５．２５．５０．１００．
２５０゜５００及び１０００ｎ７蛋白量／祷となるよう
に加え、３７℃にて、炭酸ガスインキュベーター内で、
２４時間培養後、上記培地にて２回洗浄してキラーセル
を得る。これは、上記培地にて２ｘ１０’／ｍＩ！に調
製した。

■　上記ので得たキラーセルの癌細胞障イ活性をＳｉｎ
ｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｓｓａｙ　
〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｒｎｕｎｏｌｏｇ
ｙ　Ｖｏｌ、　１２８　Ａ　６　、　ｐ　２５１４−２
５２１（１９８２））に従って測定したつすなわ゛ら、
標的細胞としてＬＬＣ細胞を用い、洗浄後、この５Ｘ１
０’個及び上記キラーセル２．５Ｘ１０’個（Ｅ／Ｔ＝
５）を１０　％　ＦＣＳ（ＱＲＰＭＩ　−１６４０培地
０．２ｍｌに混合して、室温下に５分インキュベート後
、１１０００ｒｐ　で５分間遠心し、これに１％アガロ
ースを最終０．５％となる様に加える。予め、１チアガ
ロースをのせたシャーレに、上記細胞をのせ、かるく混
合し、３７℃にて１時間インキュベートする。

０．２％トリバンプルーの０．５　ｍを加え、１０分間
放置後、生食にて２回洗浄後、倒立位相差顕微鏡下に、
キラーセルが結合し、かつ死滅している標的細胞数（Ａ
）を計測、キラーセルの癌細胞障害活性を下記式により
算定した。

結果を第６図に示す。図中、タテ軸は障害活性を、ヨコ
軸はキラーセルの誘導に際して使用したＧＲＡ−Ｍ−３
−Ｈの蛋白量（＃度）を示す。同■において、ＧＲＡ−
Ｍ−３−Ｈを使用しないで同様に操作して得たリンパ球
を用いて測定した結果を対照として示した。。対照の障
害活性は１０．７％。

第６図に示す如く、本発明の熱変性抗原は、細胞性免疫
の形成（キラーセルの誘導）に際し、濃度依存性が少な
く、広い範囲で有効であり、かつ強い効果を有すること
が判る。

参考例６ ■　実施例１で得たＧ　ＲＡ　−ｈＶＩ　−３−Ｈを生
理食塩水で蛋白量１００　ｎｆ／ｍｌとなる様に調製し
た。

これを抗癌剤＆１とする。

■　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールスリバー、８゜５
Ｗ）に同系由来のＬＬＣ＋＋４１１胞ｌＸｌ０’個を尾
静脈より注入し、注入後３日目、６日目、又は９日目よ
り上記抗癌剤煮１の１ｒＩＬｌ／マウス−日を３日間連
続尾静脈より投与した。ＬＬＣ細胞細胞注入２凌 の肺着床の有無及び肺重量の測定を行った，３対照とし
て、抗癌剤無投与群及び正常マウスを用いた、結果を下
記第５表に示す。該表より、本発明の熱変性抗原の投与
により、腫瘍拒絶ないしはＪ産湯増殖の抑制が明らかに
確認された。

第５表 参考例７ ■　癌患者（肺の小細胞癌，３．６７オ）より、前記参
考例４−■と同様にして得た末梢血リンパ球を、１５％
ＦＣ８含有ＲＰＭＩ　−　１６４０培地にて２×１０６
／ｒ／Ｌｌに調製し、これに前記実施例６で得たＧＲＡ
−６−Ｈを最終１　０　０　ｎｆ蛋白量／Ｉｄとなる様
に加え、３７℃にて炭酸ガスインキュベーター内で２４
時間培養後、上記培地にて２回洗浄してキラーセルを得
る。これは、上記培地にて、２Ｘ１０’／ｄ濃度に調製
した。

■　上記キラーセルの癌細胞障害活性を標的細胞として
患者と同型肺癌の小細胞肺癌の培養株であるＱＧ９０を
用いて試験した。即ち、ＱＧ９０を９６穴平底マイクロ
プレートで培養し、モルイヤーにまで増殖した細胞を標
的細胞とする。これに上記キラーセルの１００μｋを静
かに滴下し、１時間インキュベートした。上清を除さ、
５％エオシン溶液５μ！を加え、３分間放置して染色後
、１。

チＦＣ８加ＲＰＭＩ　−　１６４０培地にて５回洗浄し
た後、検鏡下にウェル当りの鈍痛細胞数を測定した。

結果金弟７図に示す。図中タテ軸は鈍痛細胞数を示す。

向■においてＧＲＡ−６−Ｈを使用しないで同様に操作
して得７’ｊ　’）ンパ球を用いたものを対照とした。

第７図から１本発明の熱変性抗原はキラーセルの誘導活
性が極めて高いことが判る。

参考例８ ヒトに最も近い霊長類である日本ザルを用い、本発明の
熱変性抗原の生体内における細胞性免疫の形成（キラー
セルの誘導）能を試験した１）すなわち、日本ザル（日
不ブライメイン社）にＧＲＡ−６−Ｈの２００　ｎｆ／
　蛋白量／匹を皮肉投与し、その３　、６　、２４　、
４８及び７２時間後にサルの下腿静脈より、血液５ｍｌ
！をヘパリン扉口で採血する。次いで比重分離液Ｓ　Ｉ
ＶＩ　Ｆ　（ＪＩＭＲＯ製）を用いて、リンパ球を比重
分離し、ＲＰｉｉ４Ｉ−１６４０培地にて夫々２×ｌＯ
６／ｗＬｌに、ＷＮ　ｌｅして、該リンパ球の癌細胞障
害活性生を測定した。該活性試験は、前記参考例７−■
と同様にして得た標的細胞（ＱＧ９０）を使用し、同様
にして上記各リンパ球液の２００μ石を滴下し、３７℃
にて炭酸ガスインキュベーター内で９０分間培養後、エ
オシン染色を行ない死細胞数を測定した。結果をド記第
６表に示す。第６表において、死細胞数はウェル当りの
平均±ＳＤで示した。尚経過時間０時間は、上記におい
てＧＲＡ−６−１（の投与直前に採取したリンパ球を用
いたコントロールを示す。

第　　６　　表 第６表より、生体内において、本発明の熱変性抗原の感
作により、強い細胞性免疫が形成されることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はＧ　ＲＡ　−ＩＡ　−３、Ｇ　ＲＡ
　−７、ＧＲＡ−１及びＧＲＡ−２のＳＤＳゲル屯気涼
気泳動す図面、第３図はＧＩＬＡ−Ｍ−２、ＧＲＡ−６
及びＧＲＡ−５のＳＤＳゲル屯気涼気泳動す図面、第４
図はＧＲＡ−Ｍ−４及びＧ　ＲＡ　−Ｍ　−５のＳＤＳ
ゲル成気涼気泳動す図面、第５図はＧＲＡ−３、ＧＲＡ
−３−Ａ、ＧＲＡ−３−Ｂ及びＧＲＡ−３−ＣのＳＤＳ
ゲル礪気涼気泳動す図面、第６図は本発明のＧＲＡ−Ｍ
−３−ｔｆのリンパ球への感作濃度と癌細胞障害活性と
の関係を示す図面、第７図は本発明のＧＲＡ−ｆ３−Ｈ
をリンパ球に感作させて得られるキラーセルの、１ｌｖ
ｉ細胞障害活性を示す図面である。 以上 第１図　　　　　　　　　第２図 １２３４５　　　１２：３４５ 第３図 １　２　３　　４ 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、癌細胞膜成分から、末端ガラクトース又は末端Ｎ−
   アセチルガラクトサミンと特異的に結合する性質を有す
   る癌細胞由来糖鎖関連抗原を単離し、次いでこれを加熱
   処理することを特徴とする癌細胞障害性リンパ球誘導能
   を有する熱変性抗原の製造法。