JPS59225119A - 熱変性抗原の製造法 - Google Patents

熱変性抗原の製造法

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JPS59225119A
JPS59225119A JP58100528A JP10052883A JPS59225119A JP S59225119 A JPS59225119 A JP S59225119A JP 58100528 A JP58100528 A JP 58100528A JP 10052883 A JP10052883 A JP 10052883A JP S59225119 A JPS59225119 A JP S59225119A
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JP
Japan
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gra
lectin
cell
cells
antigen
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JP58100528A
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English (en)
Inventor
Shoichi Adachi
正一 足立
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NIPPON KOUTAI KENKYUSHO KK
Original Assignee
NIPPON KOUTAI KENKYUSHO KK
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な癌細胞由来糖鎖関連抗原の熱変性抗原(
以下「熱変性抗原」と称する)、更に詳細には、癌細胞
由来糖鎖関連抗原(以下rG RAJと称する)をもつ
癌細胞に特異的に作用して、該癌細胞を破壊する癌細胞
障害性リンパ球(以下「ギラーセル」と称する)を容易
に誘導することができ、しかも液性免疫の惹起が少なく
、濃度依存性が少ない熱変性抗原の製造法に関する。
免疫項当細胞、特に細胞性免疫の主役である1977球
は移植免疫の際異種細胞抗原にもとすく拒絶反応を行5
f/こもかかわらず、癌細胞に対してはこの免疫抑制が
認められ/、cいかあるいは弱い。
従って、癌細胞は破壊されずに生体内で増殖し、ついに
は担癌宿主を死に至らしめる。
本発明者は、癌細胞に対する宿主の免疫応答並びに癌治
療への応用について鋭意研究を行っていたところ、分化
した正常細胞には認められない癌細胞特異抗原中に、宿
主に免疫原として作用し、癌細胞と特異的な免疫応答を
成立きせる免疫原性が極めて高いGRAが存在すること
、従ってこれが癌の治療及び予防に優れた効果を奏する
ことを見出し、先に特許出願した(特願昭56−156
413号、同57−111168号)。
一方、癌に対する免疫反応(J匣瘍拒絶)は細胞性免疫
が主体をなすもので、液性免疫すなわち癌関連抗原に対
する抗体は該抗原を遮蔽(mask ing )するこ
とにより、またそれ自体又は免疫複合体(Immune
 complex )を形成して免疫反応の阻止因子(
131ocking antibody )  として
作用することにょリ、更にまた抗原の分布を変化させる
(antigenicmodulation )ことに
より、生体の免疫監視機構の破綻をまねき、逆に1榎瘍
の成長を促進するように働き、宿主にとって不利に作用
する場合があることが知られている。
斯かる実情に8いて、本発明者は、担癌宿主の液性免疫
の惹起を抑制しく抗体産性能の低い)、かつ癌細胞に特
異的な強い細胞性免疫を成立させ得る癌細胞関連抗原を
得るべく更に研究を車ねた結果、前記GRAを加熱処理
して得られる熱変性抗原が上記条件を具備すると共に、
濃度依存性が少ないので、広い投与範囲において癌の治
療及び予防に使用できることを見出し、本発明を完成し
た。
すなわち、本発明は、癌411胞膜成分から、末端ガラ
クトース又は末端N−アセチルガラクトサミンと特異的
に結合する性質を有する癌細胞由来糖鎖関連抗原を単離
し、次いでこれを加熱処理することにより癌細胞障害性
リンパ球誘導能を有する熱変性抗原(熱変性GRA)を
製造する方法である、。
本発明の熱変性GRAは、ヒト又は動物の培養癌細胞、
移植癌細胞、自然発生WJ細胞、化学物質・ウィルス発
生癌細胞、手術組織由来癌細胞等のGRAをもつ癌細胞
より次の如くして得ることができる。すなわち、まず該
癌細胞から細胞膜成分を分離し、次いで末端ガラクトー
ス又は末端N−アセチルガラクトサミンと特異的に結合
するレクチンと処理して、該レクチンに結合させて分離
し、次いでこれを加熱処理に付すことにより容易に得る
ことができる。
上記末端ガラクトースと特異的に結合するレクチンとし
ては、例えばビーナツツレクチン、ひまの実(Rici
nus Communis )レクチン、ダイズレクチ
ン(SBA)等を挙げることができるCJ、B、C。
250.8518−8523  (1975);  B
iochem、Bio−phys Res、 Comm
、 62. 144 (1975) ? Z、 Imm
u−nitaetsforch 138. 423−4
33 (1969) ; Br。
J、 Exp、 Pathol、 27. 228−2
36  (1946);Proc、 Nath、 Ac
ad、 Sci、 USA+ 75 、 A5 、22
15−2219  (1978) ;  Bioche
mistry 13.196−204(1974) ;
  Carbohydrate Re5each、旦1
,107−118  (1976):]。
また、末端N−アセチルガラクトサミンと特異的に結合
するレクチンとしては、例えばトリコスマメレクチン(
DBA)、オサゲオレンジレクチン、ヒリツクスボマテ
イアレクチン、リママメレクチン、ダイズレクチン、バ
ウヒニアマメレクテン等を挙げることができる。
癌細胞膜成分の分離は、例えばホモジネート法、可溶化
剤を用いる可溶化法等の公知の方法によってなし得る1
、より有利には例えば癌細胞を生理食塩水又は適当な緩
衝液中でホモジネートした後、沈殿部分を遠心分離等に
より採取し、これを生理食塩水又は緩衝液中に可溶化剤
を用いて溶解し、上7g部分を遠心分離等により取り出
すことにより実施できる。用いられる可溶化剤としては
、一般に細胞膜を可溶化できることの知られている各種
の界面活性剤例えば[トリトンX−100J(和光紬薬
社製)、rNP−40J(シェル社製)、ジキトニン、
尿°素等の非イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS )等の陰イオン界面活性剤等を例示でき
る。
また上記により得られる細胞膜成分からのレクチンと結
合するGRAの分離は、該GRAの性質を利用した通常
の物理化学的又は生化学的手段により行ない得る。該手
段としては例えばレクチンを含むカラム担体を利用する
アフィニティークロマトグラフィー、GRA抗体等を用
いる免疫沈殿法、透析法、ゲル濾過法、電気泳動法、ポ
リエチレングリコールやアセトン等の糖蛋白沈殿剤を用
(・る物理的沈殿法等又は之等を適宜組み合せた方法を
例示できる。より有利にはレクチンを含むカラム担体を
利用したアフィニティークロマトグラフィーによるのが
よく、該カラム担体は市販のものを、あるいは例えばレ
クチンを不溶化支持体上に固定化することにより容易に
収得できる。ここでレクチンの不溶化支持体上への固定
は、従来公知の生体物質の固定化方法に従い行なうこと
ができる。これらのうちでも臭化シアン活性化多糖体法
、N−ヒドロキシサクシミドエステル法等を使用する固
定方法によるのが好適である。このうち臭化シアン活性
化多糖体法は、不溶性支持体を臭化シアンで処理し、次
いで得られる活性化物をレクチンと緩和条件下にカップ
リングさせ、レクチンを固定化する方法である。不溶性
支持体を臭化シアンで処理するに当っては、例えば水酸
化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の塩基性化合物を
用いてpH7,5〜12に保ち室温下水、アセトニトリ
ルや0.1M炭酸水素す) IJウム緩衝液(pHヰ8
.7)、0.01Mリン酸緩衝液(pH4F7.7)等
のpH7,5〜12の緩衝液等の溶媒中にて約1〜12
分間程度処理すればよい。不溶性支持体に対する臭化シ
アンの使用量としては通常およそ等重量とするのがよい
。ここで不溶性支持体としてし得る官能基を有し、しか
も化学的・物理的に十分安定な従来公知の不溶性支持体
をいずれも使用できる。例えばアミノエチルセルロース
、カルボキシメチルセルロース、ブロモアセチルセルロ
ース、p−アニリノセルロース等のセルロース系支持体
、セファデックス、CM−セファデックス(ファルマシ
ア社製)等の架橋デキストラン系支持体、セファロース
2B、セファロース4B、セファロース6B(ファルマ
シア社製)等のアガロース系支持体等を挙げることがで
きる。斯くして得られる臭化シアン活性化支持体をレク
チンとカンプリングさせるに際しては、レクチンに対し
て臭化シアン活性化支持体を30〜80倍重遣用い、適
当な溶媒、例えば0.1モル炭酸水素ナトリウム(0,
5モル塩化ナトリウム含有、射i 8.4 )水溶液中
、通常O〜40℃程度、好ましくは2〜8゛′Cにて約
10〜20時間反応させItばよい。このようにしてレ
クチンを含むアフィニティークロマトグラフィー用担体
が製造される。
上記レクチンを含むアフィニティークロマトグラフィー
用担体を利用したクロマトグラフィーによれば、目的と
するGRAが上記担体中のレクチンと結合してカラムに
捕集される。次いで該カラムに例えばレクチンと結合す
る物質を通して交換反応を行うか、又は高濃度の塩、チ
オシアン酸カリウム水溶液、硼酸緩衝液等の吸着分離剤
(溶出液)を通してGRAを解離して収得する。
上記交換反応においてレクチンと結合する物質としては
ガラクトース結合性レクチンを指体として用いた場合に
は、例えばガラクトース、末端にガラクトースを有する
三糖類又はオリゴサツカライド等のガラクトース結合性
レクチンと結合する物質を例示でき、又、N−アセチル
ガラクトサミン結合性レクチンを相体として用いた場合
には、例えばN−アセチルガラクトサミン、末端にN−
アセチルガラクトサミンを有する三糖類又はオリゴサツ
カライド等のN−アセチルガラクトサミン結合性レクチ
ンと結合する物質を例示できる。
斯くして得られるGRAは、ガラクトース及び/又はN
−アセチルガラクトサミン末端を有する糖タンパクを含
むものである。かくして製造されるGRAは、必要なら
ば凍結乾燥してもよ(、通常の分離手段によって更に精
製することもでき、例えばガラクトース結合性レクチン
を用いて分離したGRAを、次いでN−アセチルガラク
トサミン結合性レクチンを用いて分離する方法、又はN
−アセチルガラクトサミン結合性レクチンを用いて分離
したGRAを、次いでガラクトース結合性レクチンを用
いて分離する方法等を例示できる。
斯(して得られたGRAの加熱変性は、糖鎖には変性を
起さず、蛋白を変性するような通常の加熱条件によって
行われる。例えばGRAを水、生理食塩水、リン酸緩衝
液等の溶媒中、60〜120℃程度、好ましくは約90
〜110℃で、5〜60分程度、好ましくは10〜20
分間加熱することによって行われる。
斯くして得られる本発明の熱変性抗原は、ガラクトース
及び/又はN−アセチルガラクトサミンの末端糖構造と
熱変性された蛋白とからなる糖蛋白であり、これをリン
パ球に感作させることによりキラーセルを得ることがで
きる。
キラーセルの製造において、リンパ球は特に制限はなく
、正常あるいは担癌のヒト又は動物のすンバ球の何れを
も使用でき、具体例としては、例えば末梢血、骨髄、リ
ンパ節、膵臓、扁桃腺、胸腺等由来のものが挙げられる
。これらのリンパ球は、物理的、化学的方法あるいは表
面膜法等の常法によって単離され、キラーセルの誘導方
法に供し得る。
本発明の熱変性抗原によるリンパ球の感作は、熱変性抗
原を含む培地中で、リンパ球を通常、数時間〜10日間
、好ましくは1〜5日間程度培養することによって行わ
れるっ 培地としては、この種の細胞培養に用いられている一般
的な各種栄養培地を使用できるが、例えばRPMI 1
640培地、イーグルMEM培地等にヒト血清、ウシ胎
児血清(Fe2)、仔ウシ血清、ウマ血清等を加えたも
のが好ましい。培地に加えられる熱変性抗原は、通常リ
ンパ球1×10°個/mlに対し、糖量として1〜20
00 nP/ ml、特に50〜500 n7/mA!
が好ましい。
培養は常法に従って、例えばpH7,2付近で、37℃
付近の温度で行われる。
斯(して得られるキラーセルは、T細胞増殖因子(TC
GF 、 IL−n )を含む上記培地で、無制限に増
殖させることができる。この場合、通常の限界希釈法に
より更にキラーセルのクローニンの選別培養を行っても
よい。キラーセルは、例えば液体窒素中に保存すれば、
長期間安定に保存することができる。
斯くして製造されるキラーセルは、実質的に正常リンパ
球でありGRAに特異的な細胞障害活性を有することに
おいて特定される。これらのキラーセルは自ら分譲可能
な状態に保持しである。
上記の如くして得られる本発明の熱変性抗原は抗癌剤と
して有用であり、この熱変性抗原はそれ単独を有効成分
とすることも、また他の抗菌剤、制癌剤と併用すること
もできる。本発明の熱変性抗原を有効成分とする抗癌剤
は、主薬であ名熱変抗原を効果的に含有した状態であれ
ば、いかなる形態でもよいが通常は、液状溶液、懸濁液
又は乳濁液等として静脈、皮下又は筋肉内に投与される
これらはまた使用前に適当な担体の添加によって液状に
なし得る乾燥品として提供することもできる。このよう
な液状製剤はメチルセルロースのような懸濁剤、レシチ
ンのような乳化剤、メチル−p−ヒドロキシベンゾエー
トのような防腐剤又はそれ自体でヒトや動物の免疫機能
に悪影響を与えないような安定剤、緩衝剤等を含有しう
る。水性担体としては生理食塩水、非水性担体としては
ゴマ油等の植物油、パラフィン等の鉱物油、スクヮレン
等の動植物油又はグロビレングリコール等が使用できる
。更にまた、斯る液剤は、免疫促進のだめに適当なアジ
ュバントを含有させることもできる。アジュバントとし
ては、例えば、フロイント(F’reund )の完全
アジュバント、さらには動物用のサポニン、ヒト用の水
酸化アルミニウム等を挙げることができる。
該抗癌剤は、癌患者に1回又は長期に亘って複数回投与
してその治療を行うことも、また癌に罹患のおそれのあ
るものに投与して、防御を行うこともできる。
本発明の熱変性抗原のLD?IO(マウス腹腔内)は糖
14として500mp/kg以上と毒性が低いので、広
範囲の址において投与できる。従って、抗癌剤中の熱変
性抗原の濃度は特に制限されないが、一般には糖量とし
−てo、o o i〜100μf/rnlが好ましい。
投与量は、疾患の程IW、年令、性別によって異なるが
、通常糖量として0001〜1000μ?/跋/日を1
〜数回に分けて投与するのが好ましい。
また、上記の如(して得られるキラーセルも抗癌剤とし
て有用であり該抗癌剤は、この錘の血液製剤に使用され
る担体と共に注射剤とするのが好ましい。担体は特に限
定されないが、血液と等張であるもの、特に生理食塩水
が好適である。製剤化に当っては、キラーセルは生理食
塩水等で充分に洗浄して上記培地を除去した後、担体中
に浮遊させるのが好ましい。
当該製剤中のキラーセル濃度に特に制限されないが、一
般には105〜10’個/ mlが好ましいっまたキラ
ーセルは108個/マウス(腹腔内)投与で毒性は認め
られない。投与量は、疾患の程度、年令、性別によって
異なるが、通常105〜10121固/kg/日を1〜
数回に分けて投与するのが好ましい。
次に、実施例、参考例、試験例及び比較例を挙げて示す
が、不発明はこれらに限定されるものではない。
参考例1  (GRAの局在) ■ FITC標識レクチン(I)NA−FITC)の製
造: ピーナツツレクチン(PNA 、gY社jJ4)10m
gを0.85 % NaCl3の0.01M−リン酸塩
緩衝液(1)l(=7.2 ) 2m1K溶解する。F
ITC(シグマ社製)21ηを0.51vI−重炭酸塩
緩衝液(pi■= 9.0 )1 ml ニ溶解し、七
の0.5 mlを一ヒ記PNA(D緩衝液に〃11える
1、室温にて2時間撹拌必セファデックスG25(10
11濡×300羽、ファルマシア社製)にて分離し最初
のピークを]呆取する。F/P比−0 ■ FI′l’C標=+riVり−J−7(D BA−
1i’ITc ) ノ製造: LI B A (E Y社製)を使用して、上記のと同
様にしてI) B A −1i’ITcを得る。F/P
比=0.9■ 各種癌細胞・のGRA局在; 各種癌細胞I X 106個を0.85%N aC13
の0.05M −トIJス塩酸緩衝液(pH=7.2)
にて3回遠心法にて洗浄後、上記ので得だPNA−FI
TC又は上記■で得た1) B A −FITC又はS
 B A −FITC(EY社製)(200μか−)を
100μ召添加し室温にて30分間Tm 置反応させる
。反応終了後0.85%NaCAの0.01M−リン酸
塩緩衝液(叶■=7.2)にて3回洗浄後、細胞をガラ
ススライド上にのせ、螢光顕微鏡下に検鏡を行はう。
結果は第1表のとおりである。、同供試癌細胞は倒れも
公知のものであり、新潟大学医学部l刊−病理から人手
し/こ。
以  下  余  白 第1表 ■ 各種癌細胞(手術片)のGRA局在:癌患者の手術
片より得た癌組織をステンレスメツシュ(Φ150)に
通し、細胞浮遊液を得、これを2 mM Ca(J2.
2 mM MgC−g2及び0.85%NaC4の0.
OIM’)リス−塩酸緩衝液(pH=7.4)にて2回
洗浄する。この5 X 10’個を上記緩衝液100μ
形に浮遊し、P N A −FITC又はDBA−FI
TC(200μ?/d )を100μ石添加し、室温に
て20分間インキュベートする。反応終了後0.85 
’16 Na(Jの0.01Mリン酸塩緩衝液(p)I
=7.2)(以下rPBsJとする)にて3回洗浄後、
細胞をガラススライド上にのせ、螢光顕微鏡下に検鏡を
行った。結果を下記第2表に示す。尚、癌患者の手術片
は、いずれも関西医科大学より得た。第2表中、G R
Aの局在は以下に示す。
+;細胞表面にIRAが表現されている。
−;細胞表面にGRAが表現されていない。
以下余白 第2表 参考例2 ■ 不溶化レクチン(PNA−セファロース)の製造: CNBr −活性化セファロース4B(ファルマシア社
製)3Pを1 mM −HCAで充分に洗浄後、0.1
M−炭酸水素ナトリウム(pH= s、s ) 200
ゴに懸濁し、PNA201119を含む0.OIM−リ
ン酸塩緩衝液(pn= 7.7 )  5mlを加え、
25℃で時々攪拌しながら2時間反応させてPNA−セ
ファロースを得る。
■ 上記■において、PNAの替わりにDBAを使用し
て同様の操作によりDBA−セファロースを得る。
参考例3  Gi七Aの製造 ■ BT−1(バーキットリンパIMr )細胞1.3
×108個を生理食塩水で3回洗浄し、2 % r )
 !J )7X−100j(JC光純薬社製)、0.8
5%NaCl3.2 mM −CaC4,2mM −M
gC4の0.01M−トリス塩酸緩衝液(+)H=7.
4)30プを加え、4℃で15分間攪拌する。その後1
00,000X%で2時間超遠心した。。超遠心上清2
8Inlのうち、14m1 を 0.1%)  リ ト
 ンX−100、0,85%  NaC−g、2 mM
 −CaCl32.2 mM −MgCAtのトリス−
塩酸緩衝液(pH=7.4) で平衡化したPNA−ア
ガo −スヒ−ス(丸善社製)のアフイニティクロマト
(φ0.5 X 1 cm )に付す。同緩衝液で洗浄
後、0.1M−2クトース、0.85 fo NaC−
e、2mM−CaC&  、  2  mM  −Mg
(]432  、 0. 1  %  )  リ ト 
7 jC−100の0.01M−1リス−塩酸緩衝液(
pH=7.4)で溶出し、溶出部を0.85 %Na(
J、 2mM−MgCyン2 、 2  mM  −C
aC−g 2 の 0.01M−)  リ ス −塩酸
緩衝液で48時間透析してGRA溶液溶液1傅 LO〜vry法及びフェノール硫酸法で測定した結果タ
ンパク量は644μ2、糖量は120μJであった。以
下これをrGRA−IJと称する。
■ C3Hマウス乳癌細胞( Mtv[’ ) 1 x
 10”イIMを生理食1富水で3回洗浄後、2%トリ
トンX − 100。
0、 8 5 % NaC.、g、2 mM − Ca
CAt、2 mM − MgC−4a200、01M−
トリス−塩酸緩衝液( pH= 7. 4 )30rn
lを加え、4℃で30分間攪拌する。その後100.0
00 x y−で2時間超遠心し、その上清を0.85
fb NaCA 2 mtV −Ca(J、、2 mM
  LVIgC&の0.01M−)リス−塩酸緩衝液(
pH=7.4)で1晩透析すル。コノ透析内液を)mm
ersible −CX ul tra−filter
s (ミリボア社製)で3 mlに濃縮し、このうち1
−を0.005%トリトンX−100,0,85To 
NaC6,2ml■−CaC4,2mM  MgC4の
トリス−塩酸緩衝液(pl(=7.4)で平衡化した前
記参考列2−■のPNA−セファロースのアフイニテイ
クロマト(φ0.5 X 2 cm )に付す。同緩衝
液で充分に洗浄後、0.IM−ラクトース、0,85チ
Na(J、2 mM −CaC4,2rnM −Mgc
、a2.0.005チドリトンx−iooの0.OIM
−)リス−塩酸緩衝液(pH= 7.4 )で溶出し、
溶出部を0,85* NaCA、2 mr、II −C
aCl32.2 mM −MgCらの0.01M−)リ
ス−塩酸緩衝液(pl(=7.4)’にて48時間透析
してGRA溶液溶液2全lる。このもののタンパク量は
156μJ、糖騎は94μ2であった。これを以下rG
RA−M−I Jと称する。
■ KATO−11[細胞、約120グ〜(湿重所)ケ
P B S i 00 ml中、粉砕機(Waring
 blender ;日本精機社製)を1史用してホモ
ジナイズする。改心外#(100,000P X 1時
間)した沈〈査を、2チドリトンX −100,0,1
5MNaCJの0.01M)リス・塩酸緩衝液(pH=
7.6 )  100rnlに加え、攪拌する。遠心分
離(100,000’i−x を時間)しだ上・を青を
 、  0. 0 1. 5  % ト リ )7X−
100,0,15MNaC/?の0.OIM)リスーJ
−14酸緩衝液(pH=7.6)平衡化したl) N 
A−セファロースのアフイニテイクロマト(φ0.8 
X 15 cm )に付す。同緩衝液50m6で洗浄後
、0.1Mラクトースを含む同緩衝液で溶出し、これを
0.854 NaCA水溶液にて透析してGRA溶液を
得る。これはセファデックス(ファルマシア社製)にて
礎編後−20℃に保存した。蛋白k 2. OKψ、糖
it O,s mgこれを「GgA−2」とする。
■ 上記■と同様にして下記第3表のGRAを夫々得た
第  3  表 ■ 上記■において、KA’L’O−Hに変えてIs’
i K N−45を約291、P N A−セファロー
スカラムに変えてD B A−セファロースカラムを使
用して、ラクトースの変わりにN−アセチルガラクトサ
ミ/で溶出した以外は同様の操作により、G RAを得
る。蛋白量0.03 mg糖はo、oimg。これを[
GRA−8Jとする。
■ 上記■で得たGRA−3の5m7!をDBA−セフ
ァロースカラムに付し、0.015%トリトンX〜10
0.2 mM MgC4,2mM CaC−13t、0
.85%NaCl3の0.01M)!jス・塩酸緩衝液
で溶出して4ゴずつのフラクションを得る。次いで0.
1 M N−アセチルガラクトサミンを含む上記緩衝液
で溶出してGRA溶液を得る。これをGRA−3−Cと
する。また上記フックジョン屋1〜3をGRA−3−A
、フラクションA4〜12をGRA−3−Bとする。
試験例1 前記参考例3で得た各GRAのSDSゲル電気泳動をF
airbanks等の方法(Biochemistry
、 Vol。
10、p 2606 、(1971) )に準じて行っ
た。結果を第1〜5図に示す。
同、図中、各番号は夫々以下に示すとおりである。
第1及び第2図中 1・壷・スタンダード 2・・・GRA−M−3 3・・・GRA  −7 4・・・G RA  −1 5・・・GRA−2 第3図中 1・・・スタンダード 2・・・GRA−M−2 3・・・G RA −6 4・・・GRA−5 第4図中 1・・・GRA−M−4 2・・・GRA−M−5 3・・・スタンダード 第5図中 。
1・・・G it A  −3 2・・・GRA−3−A 3・・・G RA −3−B 4・・・GRA−3−C 同、第1図及び第5図はC,B、 B、法(gioch
emistry。
Vol、 10 、 p 2606、(1971) I
Kよす蛋白の染色反応により、°又第2〜4図はpas
法(Anal。
Biochem、 、 Vol、 30、148  (
1962))による糖の染色反応により検出した結果を
図式化した図面を示す。また、各図においてスタンダー
ドはいずれもBiorad Lab、社(’U、S、A
、)の下記標準物質を使用した。
200(Kダルトン);ミオシン 116        ;β−グルコシダーゼ92.5
         ;フォスフォリラーゼ66.2  
      1BsA 45       ;オブアルプミン。
21.5  −#     iソイビーントリプシンイ
ンヒビター実施例1 前記参考例3で得だG RA −■l −3の100μ
m・蛋白量の生理食塩水溶液を湯浴中、100℃で10
分間加熱して熱変性抗原を得た。これを[GRA−M−
3−HJと称する、これは10μf蛋白量/d濃度にて
4℃にて保存した。
実施例2〜8 GRA−M−3のかわりに、前記参考例3で得た各GR
Aを用いて、上記実施例1と同様にして、下記第4表の
熱変性抗原を得た。
第 4 表 参考例4 (リンパ球の調製) ■ ヒト末梢血リンパ球(ヒトPBL)健康な成人及び
種々の癌患者よりヘノクリン採血して得り、1ffl 
液50 ml! f 「フィコールレノ2ツク」(ファ
ルマシアジアバン社製)で遠心分離し、末梢血リンパ球
5XIO7個を得る。
■ マウス11♀臓リンパ球 C57BL/6マウス(占6W)のlI卑臓を摘出し、
RPMI  −’ 1640  培地にて2回洗浄する
。注射針にてほぐした後ステンレスメツシュ(Ioo号
)にて許過し、大きい砕片を除(。濾過しだ細胞を上記
培地にて2回洗浄後、1200X?10分間遠心して4
×107個の牌リンパ球を得る。
参考例5 ■ 前記参考例4−■で得だマウス膵臓リンパ球を、1
5%、、Fe2のRPMI −1640培地にて、2×
106/mlに調製し、これに前記実施例1で得たG 
RA −M −3−Hを最終5.25.50.100.
250゜500及び1000n7蛋白量/祷となるよう
に加え、37℃にて、炭酸ガスインキュベーター内で、
24時間培養後、上記培地にて2回洗浄してキラーセル
を得る。これは、上記培地にて2x10’/mI!に調
製した。
■ 上記ので得たキラーセルの癌細胞障イ活性をSin
gle cell cytotoxic assay 
〔The Journal ofImrnunolog
y Vol、 128 A 6 、 p 2514−2
521(1982))に従って測定したつすなわ゛ら、
標的細胞としてLLC細胞を用い、洗浄後、この5X1
0’個及び上記キラーセル2.5X10’個(E/T=
5)を10 % FCS(QRPMI −1640培地
0.2mlに混合して、室温下に5分インキュベート後
、11000rp で5分間遠心し、これに1%アガロ
ースを最終0.5%となる様に加える。予め、1チアガ
ロースをのせたシャーレに、上記細胞をのせ、かるく混
合し、37℃にて1時間インキュベートする。
0.2%トリバンプルーの0.5 mを加え、10分間
放置後、生食にて2回洗浄後、倒立位相差顕微鏡下に、
キラーセルが結合し、かつ死滅している標的細胞数(A
)を計測、キラーセルの癌細胞障害活性を下記式により
算定した。
結果を第6図に示す。図中、タテ軸は障害活性を、ヨコ
軸はキラーセルの誘導に際して使用したGRA−M−3
−Hの蛋白量(#度)を示す。同■において、GRA−
M−3−Hを使用しないで同様に操作して得たリンパ球
を用いて測定した結果を対照として示した。。対照の障
害活性は10.7%。
第6図に示す如く、本発明の熱変性抗原は、細胞性免疫
の形成(キラーセルの誘導)に際し、濃度依存性が少な
く、広い範囲で有効であり、かつ強い効果を有すること
が判る。
参考例6 ■ 実施例1で得たG RA −hVI −3−Hを生
理食塩水で蛋白量100 nf/mlとなる様に調製し
た。
これを抗癌剤&1とする。
■ C57BL/6マウス(チャールスリバー、8゜5
W)に同系由来のLLC++411胞lXl0’個を尾
静脈より注入し、注入後3日目、6日目、又は9日目よ
り上記抗癌剤煮1の1rILl/マウス−日を3日間連
続尾静脈より投与した。LLC細胞細胞注入2凌 の肺着床の有無及び肺重量の測定を行った,3対照とし
て、抗癌剤無投与群及び正常マウスを用いた、結果を下
記第5表に示す。該表より、本発明の熱変性抗原の投与
により、腫瘍拒絶ないしはJ産湯増殖の抑制が明らかに
確認された。
第5表 参考例7 ■ 癌患者(肺の小細胞癌,3.67オ)より、前記参
考例4−■と同様にして得た末梢血リンパ球を、15%
FC8含有RPMI − 1640培地にて2×106
/r/Llに調製し、これに前記実施例6で得たGRA
−6−Hを最終1 0 0 nf蛋白量/Idとなる様
に加え、37℃にて炭酸ガスインキュベーター内で24
時間培養後、上記培地にて2回洗浄してキラーセルを得
る。これは、上記培地にて、2X10’/d濃度に調製
した。
■ 上記キラーセルの癌細胞障害活性を標的細胞として
患者と同型肺癌の小細胞肺癌の培養株であるQG90を
用いて試験した。即ち、QG90を96穴平底マイクロ
プレートで培養し、モルイヤーにまで増殖した細胞を標
的細胞とする。これに上記キラーセルの100μkを静
かに滴下し、1時間インキュベートした。上清を除さ、
5%エオシン溶液5μ!を加え、3分間放置して染色後
、1。
チFC8加RPMI − 1640培地にて5回洗浄し
た後、検鏡下にウェル当りの鈍痛細胞数を測定した。
結果金弟7図に示す。図中タテ軸は鈍痛細胞数を示す。
向■においてGRA−6−Hを使用しないで同様に操作
して得7’j ’)ンパ球を用いたものを対照とした。
第7図から1本発明の熱変性抗原はキラーセルの誘導活
性が極めて高いことが判る。
参考例8 ヒトに最も近い霊長類である日本ザルを用い、本発明の
熱変性抗原の生体内における細胞性免疫の形成(キラー
セルの誘導)能を試験した1)すなわち、日本ザル(日
不ブライメイン社)にGRA−6−Hの200 nf/
 蛋白量/匹を皮肉投与し、その3 、6 、24 、
48及び72時間後にサルの下腿静脈より、血液5ml
!をヘパリン扉口で採血する。次いで比重分離液S I
VI F (JIMRO製)を用いて、リンパ球を比重
分離し、RPii4I−1640培地にて夫々2×lO
6/wLlに、WN leして、該リンパ球の癌細胞障
害活性生を測定した。該活性試験は、前記参考例7−■
と同様にして得た標的細胞(QG90)を使用し、同様
にして上記各リンパ球液の200μ石を滴下し、37℃
にて炭酸ガスインキュベーター内で90分間培養後、エ
オシン染色を行ない死細胞数を測定した。結果をド記第
6表に示す。第6表において、死細胞数はウェル当りの
平均±SDで示した。尚経過時間0時間は、上記におい
てGRA−6−1(の投与直前に採取したリンパ球を用
いたコントロールを示す。
第  6  表 第6表より、生体内において、本発明の熱変性抗原の感
作により、強い細胞性免疫が形成されることが判る。
【図面の簡単な説明】
第1図及び第2図はG RA −IA −3、G RA
 −7、GRA−1及びGRA−2のSDSゲル屯気涼
気泳動す図面、第3図はGILA−M−2、GRA−6
及びGRA−5のSDSゲル屯気涼気泳動す図面、第4
図はGRA−M−4及びG RA −M −5のSDS
ゲル成気涼気泳動す図面、第5図はGRA−3、GRA
−3−A、GRA−3−B及びGRA−3−CのSDS
ゲル礪気涼気泳動す図面、第6図は本発明のGRA−M
−3−tfのリンパ球への感作濃度と癌細胞障害活性と
の関係を示す図面、第7図は本発明のGRA−f3−H
をリンパ球に感作させて得られるキラーセルの、1lv
i細胞障害活性を示す図面である。 以上 第1図         第2図 12345   12:345 第3図 1 2 3  4 第4図

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1、癌細胞膜成分から、末端ガラクトース又は末端N−
    アセチルガラクトサミンと特異的に結合する性質を有す
    る癌細胞由来糖鎖関連抗原を単離し、次いでこれを加熱
    処理することを特徴とする癌細胞障害性リンパ球誘導能
    を有する熱変性抗原の製造法。
JP58100528A 1982-10-08 1983-06-06 熱変性抗原の製造法 Pending JPS59225119A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59167598A (ja) * 1983-02-28 1984-09-21 イーライ・リリー・アンド・カンパニー C−20−およびc−23−修飾マクロライド誘導体類
JPS6078918A (ja) * 1983-10-07 1985-05-04 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 熱変性抗原の製造方法

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JPS6078918A (ja) * 1983-10-07 1985-05-04 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 熱変性抗原の製造方法

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