00
rsD Изобретение относитс к области ветеринарии, в частности, к способам производства вакцин против лейкозных заболеваний крупного рогатого скота. В насто щее врем известен способ получени вакцин против лейкозных заболеваний у различных животных. В качестве примера можно указать способ получени вакцины дл иммунизации птиц против лимфоидного лейкоза и эритробластоза путем получени смеси живых клеток и измельченных : тканей, инфицированных этим вирусом в фармацевтической жидкости, при этом концентраци смеси такова, что в 10-2000000 мл жидкости содержитс 1 г смеси. В качестве исходного материала используют ткань почки, селезенки или печени больного животного . Известна также вакцина против лей коза кошек, получаема из клеток: культуры, инфицированной вирусом лей коза кошки. Вакцина состоит из клеток , .зараженных вирусом лейкоза кошки или из инактивированных частиц вируса лейкоза кошки, выделенныхиз клеток культуры. Однако вакцины, полученные известным способом, неэффективны дл пр дупреждени лейкоза крупного рогато го скота. Кроме того, вакцины, полу ченные известными способами, содержат нуклеиновые кислоты как вирусно го, так и клеточного происхождени , которые опасны как источник опухолевой информации с потенциальной во можностью индуцировани опухолевого заболевани . Как недостаток известных способо следует отметить, что дп получени . иммунизирующего материала требуетс забивание животного - донора. Целью насто щего изобретени вл етс повьшение иммуногенных свойс вакцины. В качестве вирусосодержащих клеток используют лейкоциты пер ферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, при этом отделенные клетки и вирусный матери ал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихс в них нуклеиновых кислот и после дующим вьщелением белковых фракций р 25 и gP 70, используемых в качестве иммунизирукзщего агента. Пример 1. Из периферической крови методом гемолитического тока 52 эритроцитов с последующим восстановлением изотопичностираствора выдел ют лейкоциты. После чего производ т засев в культуральную среду следующего состава: ина|:тивированна бычь сыворотка - 10%, 0,5-лактагумин - 20%, среда Игла - 70% из расчета 5-10 клеток на 1 мл среды. После 72 ч. „культивировани отдел ют культуральную среду, при этом осаждают лейкоциты центрифугированием при 1600-1800 об/мин в течение 20 мин. Лейкоцитарные клетки разрушают в буфере А (неионный детергент тритон X 100) до 1%-ной конечной концентрации , затем производ т обработку магнитной мешалкой в течение 1 ч при температуре , центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение 1ч. Супернатант подвергают диализу в течение, 12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отдел антигенбелковзто фракцию. Антиген подвергают лиофильной сушке. Полученный материал ввод т в предлопаточньй лимфоузел тел там в возрасте 1-3 мес ца с полным адьювантом Фройнда в соотношении 1: Г. Доза иммуногена определ лась по белку,количественное определение которого проводилось по методу Лоури (журнал Biological Chemistry, v. 193, № 1, стр. 265, 1951). Иммунизацию провод т трехкратно с интервалом 10-12 дней. Втора , треть и четверта иммунизаци без адьюванта Фройнда. Через 4 недели после четвертого введени препарата в периферической крови иммунизироч ванных тел т констатированы реципитирующие антитела к вирусным белкам Р70 и Р25 в титрах 1:16-1:32. Напр женность иммунитета составл ет 6 мес цев. Пр и м ер 2. Культуральную жидкость после отделени лейкоцитов осветл ют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, затем провод т дифференциальное центрифугирование при 30000 об/мин в течение 1,5 ч. Осадок ресуспендируют в буферном растворе THE, растирают в поттере Даунса и осветл ют при 6000 об/мин, Йолученньй вирусный материал обрабатывают тритоном X до конечной концентрации 0,04% и подвергают многократному криолизу. 38 Полученньш продукт деструкции вирусного препарата совместно .с полным адьювантом Фройнда ввод т в шейный лимфоузел в следующих дозах по белку: 1- иммунизаци - 20 мг/мл, 2- 30 мг/мл, 3- - 50 мг/мл. Схема иммунизации аналогична примеру 1. Титр антител к вирусным белкам через 3-4 недели равен 1:8-1:16, Примерз Вьщел ют белковые фракции Р25 и gP70 следующим методом Вирусный материал, полученный в примере 2, очищают дважды в градиенте сахарозы 15-60%, обрабатывают тритоном X 100 до концентрации 0,005% и помещают в термостат при З7с на 1 ч Полученный материал осветл ют при 30000 об/мин в течение 90 мин, под|вергают диализу против фосфатного бу ферного раствора в течение суток при +4°С, вновь осветл ют при 6000 об/ми в течение 10 мин, Супернатант подвер гают фракционированию на аппарате изоэлектрофокусировки. Собранные бел ковые положительные фракции в реакци ИД в агаре объедин ют, рН зоны 7,27 ,5 (пик 7,4), Затем полученньш мате риал подвергают диализу против 0,01 мл фосфатного буфера при +4 С в течение суток со сменой буфера. Материал концентрируют акрилексом очищают на колонке ифадекс Д-100,. Выделенные белковые фракции совместно с полным адьювантом Фройнда ввод в предлопаточный лимфоузел в следую- 35 щих дозах по белку: 1- иммунизаци 10 мг/белок, 2- - 15 мг/мл, 3- 25 мг/мл. Схема иммунизации аналоги на примеру 1, Титр антител через 3-4 недели после 3-ей иммунизации равен 1:321:64 , Пример 4, Из периферической крови больного лейкозом крупного рогатогО скота животного вьщел ют кле ки, как описано в примере 1. Полученные нативные клетки разрушают в буфере А (Неионный детергент тритон X 100) до 1% конечной концентрации. Затем производ т обработку на магнитной мешалке в течение часа при температуре , центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение часа . Супернатант подвергают диализу в течение 12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отдел белковые фракции Р25 и gP70 антиген , который подвергают лиофильной сушке. Полученный материал ввод т в надлопаточный лимфоузел тел там в возрасте 1-3 мес ца с полным адьювантом Фрейнда по ёелку: 1- иммунизаци - i 25 мг/мл, 2- иммунизаци - 37,5 мг/мл, 3- - 60 мг/мл. Схема иммунизации аналогична примеру 1, Титр антител к вирусным белкам 3-ей иммунизации через 4-5 недель равен 1:16-1:32. Пример 5,, Культуральную жидкость 72-х часовой культуры лейкоцитов , полученных от больных животных сливали, осветл ли при 5000 об/мин. в течение 10 мин, затем при 12000 об/мин в течение 30 мин, Надосадочную жидкость собирали и центрифугировали при 30000 об/мин (950000 g) на центрифуге VAC-601 в угловом роторе мл в течение 1,5 ч. Полученный осадок ресуспендировали в малом объеме буфера TNE, содержащего 0,01 М Трис-НС1; М NaCl; 0,001 М ЭДТА рН - 7,4, гомогенизировали в стекл нном гомогенизаторе , Гомогенат центрифугировали при 8000-9000 об/мин в течение 30 мин, Надосадочную жидкость подвергали очистке, пропуска материал через слой 20% раствора сахарозы при 30000 об/мин в горизонтальном роторацентрифуги VAC-601 в течение 1 ч,Осадок после данного этапа очистки снова суспендировали в буфере TNE, гомогенизировали в стекл нном гомогенизаторе и подвергали очистке в линейном градиенте концентраций сахаро- зы. Градиент готовили при помощи градиентообразовател из 15% и 60% растворов сахарозы,,. На приготовленный градиент наслаивали вирусную суспензию , очищенную через слой 20% раствора сахарозы. Центрифугировали в горизонтальном роторе мл центрифуги VAC-601 при 3000 об/мин в те;чение 4-х ч. Градиент после центрифугированн фракционировали и фракции собирали при помощи перистальтического насоса КБ или автоматической системы регистрации Uvicord и фрак-, ционного коллектора установки Colo- . га (ЬКВ-Швеци ), Фракции с плотностью 1 , 16-1 , 18 г/мл собирали, переосаждали при,30000 об/мин (95000 g) в центрифуге VAC-601 в течение 1 ч, Собранные осадки ресуспендировали в TNE буфере, разливали во флаконы или ампулы и хранили,при (срок хранени 6-8 мес цев), 5 Пример 6. Антигенные экстрак а)Клетки 72-х часовой культуры .лейкоцитов, полученных от больньпс лимфолейкозом коров были собраны, отцентрифугированы при 1200 об/мин в течение 20 мин, отмыты три раза 0,85% раствором NaCl с последующим осаждением при 1200 об/мин в течение 20 мин. Клетки дизировали, ресуспен диру их в буфере А, содержащем 0,02 М Трис-НС1; 0,3 М КС1, 0,01 К азида Na, и 1% тритона Х-100; рН-7,8. Суспензи встр хиваетс на холоде (+4) в течение 1 ч, осветл етс центрифугированием при 24000 g (/V 20000 об/мин) в течение 45 мин (+4). Надосадочную жидкость собирали ,, диализировали против дистиллированной воды (1:2000) в течение суток . Экстракты после диализа вновь осветл ли при 24000 g - 45 мин (+4С б)антигенные экстракты из очищенного и концентрированного вируса БЛВ. Вирус, очищенный двум циклами дифференциальногоцентрифугировани и центрифугировани в градиенте плот ности сахарозы 15-60%, ресуспендировали в THE буфере, содержащем 0,01 М Трис-НС1, 0,1 М NaCl, 0,001 М ЭДТА; рН - 7,4. Вирус разрушали добавлением к сус - - - пензии тритона Х-100 в концентрации 0,5% инкубировали смесь с тритоном;в течение 1 ч при . После инкубации смесь центрифугировали при 30000 об/мин в течение 1,5 ч. Осадки после центрифугировани отбрасыва ли, надосадочную жидкость диализовали против воды (1:400) за ночь при +4 С с двум сменами воды. Материал , повторно осветл ли центрифугирование . :,„„ ,.„ при bOOOoб/ шн в течение 10 мин. П р и М е р 7. Антигенные экстрак ты клеток, и вируса (описано выще)- на носили в колонку LKB (по мл) дл , изоэлектрофокусировани . Услови йзоэлектрофокусировани .: амфолины l%j диапазон рН 3-10; начальные параметры: V - 300 В; I - 8 мА; W 2 ,4 Вт; конечные параметры: V - 300 I - 0,8 мА; W - 0,24 Вт; врем фокусировани - 48 ч. Собирали фракции с колонки по 40 капель с одновременным измерением рН и А (оптической плотности) Все собранные фракции тестировали в иммунодиффузии. Собирали фракции , положительно реагирующие с сывороткой крупного рогатого скота, специфичной к р-25 БЛВ. Положительно реагировали фракции в зоне рН 7,3-7,5, пик активности - в точке рН 7,4. Положительные фракции собраны, отдиализованы против 0,01 М фосфатного буфера. Следующий этап очистки проводили на колонке с сефадексом Г-100 (1,5 хЮО см с вод ным охлаждением) .Сефадекс -Г-100 предварительно многократно отмывали от мелких частиц и уравновешивали буфером, содержащим 0,05 М Трис-НС1, рН - 7,8; 0,3 МKCli 0,01% тритона Х-100. Фракции колонки провер ли в иммунодиффузии со специфической сывороткой . Собирали положительно реагирующие фракции. Очищенный таким образом белОк в полиакриламидном геле при электрофорезе дает полосу в зоне с молекул рным весом 25000 дальтон . П р и М е р 8. Вьщеление двойного антигена. Вирус концентрируют из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры сульфатом аммони , Дл этого: к культуральной жидкости добавл ют сухой сульфат аммони из расчета 30 г/100 мл среды; ох , о„ лаждают при 4 С в течение ночи; центрифугируют при 1000 об/мин 1 ч и надосадочную жидкость сливают; осадок ресуспендируют в дистиллированной воде 1:10 объема; охлаждают ночь и центрифугируют при 1000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость оставл ют , осадок отбрасывают; надосадочную едкость диализуют против фосфатно-солевого буфера; после диализа - 7 жидкость концентрируют ультрафильтрат цией (Amicon - аппарат, мембраны Ш10 ) в 100 раз по отнощению к исходному объему; после концентрировани материал центрифугируют при 30000 g и течение 1 ч. Супернатант собирали. Он содержит оба антигена - Р-24 и гликопротеин . Таким образом,, разработан способ получени эффективной и безопасной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота при котором животное донор остаетс живым. В результате применени данной вакцины получены
7 .8200158
высокие титры антител до l:32-lV6A, иновых кислот, вл юпщмис источниа также устойчивый напр женный имму-, ком опухолевой информации потенциальнитет . Кроме того, данный способ по- но опасной в системе индуцировани звол ет получать вакцину без нукле- опухолей.