FI77157C - Foerfarande foer framstaellning av glykobunden antigen och foerfarande foer framstaellning av foer kancerceller toxiska lymfocyter, som aer specifika mot denna antigen. - Google Patents

Description

1 77157

Menetelmä glykosidonnaisen antigeenin valmistamiseksi ja menetelmä tälle antigeenille spesifisten syöpäsoluille myrkyllisten lymfosyyttien valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää glykosidonnaisen antigeenin valmistamiseksi, joka on eristetty ihmis- tai eläinsyöpäsolumembraanin aineosasta ja joka liittyy lek-tiiniin, joka sitoutuu pääteasemassa olevan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin.

10 Antigeenistä käytetään tästedes lyhennettä "GRA". Keksintö koskee lisäksi menetelmää syöpäsoluille myrkyllisten lymfosyyttien valmistamiseksi, jotka ovat spesifisiä glykosidonnaisten antigeeniä vastaan, joka on eristetty ihmis- tai eläinsyöpäsolumembraanin aineosasta ja joka 15 liittyy lektiiniin, joka sitoutuu pääteasemassa olevaan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin.. Soluista käytetään tästedes lyhennettä "tappajasolut" ja ne toimivat syöpäsoluja vastaan, jotka sisältävät glykosidonnaista syöpäsoluista lähtöisin ole-20 vaa antigeeniä.

j On tunnettua, että immuunivasteen aikaansaavat so lut, erityisesti solujen välityksellä tapahtuvassa immuunivasteessa pääosassa olevat T-lymfosyytit, aiheuttavat vieraiden solujen antigeenien takia siirrännäisen hylki-25 mistä, mutta estävät hyvin rajoitetusti tai mitättömässä määrin syöpäsoluja. Siten syöpäsolut eivät tuhoudu, vaan jakautuvat in vivo aiheuttaen lopulta syöpää sairastavan kuoleman.

Kuitenkaan mekanismi, joka saa aikaan omien solu-30 jen erottamisen vieraista, ei ole täysin selvä ja on tehty erilaisia tutkimuksia tällaisen systeemin materiaali-pohjan luonteen selvittämiseksi. Esimerkiksi hiiren leu-kemiasolujen tai sikiön syöpäsolujen pintamerkkiaineita, joissa käytetään lektiinejä, kuten Dolichos biflorus 35 -agglutiniinia (DBA) ja maapähkinäagglutiniinia (PNA), 2 77157 kuvataan julkaisuissa Biochem. Biophys. Res. Conan. 89(2) (1979) 448-455, ibid. 96(4) (1980) 1547-1553, J. Biochem. 89 (1981) 473-481 ja Cell 18 (syyskuu 1979) 183-191.

Tähänastisen tiedon mukaan ei kuitenkaan ole tehty 5 mitään huomattavia yrityksiä valmistaa uusia lymfosyyttejä, jotka pystyvät toimimaan spesifisesti syöpäsoluja vastaan ja myös syövän vastaisina aineina, jotka käyttävät hyväkseen lymfosyyttien immuunivastetta.

Isännän immuunivastetta syöpäsoluille ja sen sovel-10 tamista syövän hoitoon koskevien laajojen tutkimustulosten tuloksena on nyt havaittu, että syöpäsoluille ominaisessa antigeenissä, jota ei esiinny erilaistuneissa normaa-lisoluissa, on GRA:a, joka toimii immunogeenina isännälle, ja jolla on hyvin voimakas immuniteettia aiheuttava 15 vaikutus, joka aiheutuu syöpäsoluja vastaan spesifisen immuunivasteen. Lisäksi on havaittu, että kun käytetään GRA:n lymfosyyttien herkistämiseen, voidaan saada tappajasoluja, jotka toimivat spesifisesti GRA:a sisältäviä syöpäsoluja vastaan tuhoten ne, ja joilla on siten erin-20 omainen vaikutus syövän hoidossa ja estämisessä.

Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle GRA:n valmistamiseksi on tunnusomaista, että ihmis- tai eläinsyö-päsolujen solumembraanin aineosat saadaan homogenoimalla tai liuottamalla, solumembraanin aineosat käsitellään lektiinillä, joka spesifisesti sitoutuu pääteasemassa ole-25 vaan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyliga-laktoosiamiiniin muodostaen lektiini-solumembraaniaine-osakompleksin ja eristetään lektiiniin sitoutunut glyko-sidonnainen antigeeni ja siitä glykosidonnainen antigeeni.

Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle tappaja-30 solujen valmistamiseksi on tunnusomaista, että ihmisen tai eläimen lymfosyyttejä herkistetään kasvattamalla niitä 1-10 vuorokautta tavanomaisessa ravintoalustassa, joka lisäksi sisältää 1-1000 ng/ml keksinnön mukaisesti valmistettua glykosidonnaista antigeeniä, laskettuna sokeri-35 määränä 1·10^ lymfosyyttiä kohti millilitrassa.

3 77157

Lyhyt selitys kuvioista

Kuvio 1 on mikrovalokuva Daudi-syöpäsoluista;

Kuvio 2 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-1-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 1 syöpäsoluille; 5 Kuvio 3 on mikrovalokuva KATO-III-syöpäsoluista;

Kuvio 4 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 3 syöpäsoluille;

Kuvio 5 on mikrovalokuva BT-l-syöpäsoluista;

Kuvio 6 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n 10 aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 5 syöpäsoluille;

Kuvio 7 on mikrovalokuva MKN-45-syöpäsoluista;

Kuvio 8 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 7 syöpäsoluille;

Kuvio 9 on mikrovalokuva MOLT-syöpäsoluista; 15 Kuvio 10 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 9 syöpäsoluille;

Kuvio 11 on mikrovalokuva BT-l:sta, joka on käsitelty ihmisen ääreisverenkierron herkistymättömien lymfosyyttien seoksella; 20 Kuviot 12 ja 13 ovat molemmat mikrovalokuvia, jot ka esittävät syöpää sairastavan hiiren, jolle on annettu GRA-M-l:K:a, syöpäsolukkoa;

Kuvio 14 on mikrovalokuva, joka esittää syövän tilaa syöpää sairastavassa hiiriryhmässä, jolle on an-25 nettu GRA-M-l:a;

Kuvio 15 on mikrovalokuva, joka esittää syövän tilaa syöpää sairastavassa hiiriryhmässä, jolle ei ole annettu GRA-M-l:a;

Kuvio 16 on mikrovalokuva, joka esittää syöpää 30 sairastavan hiiriryhmän, jolle ei ole annettu GRA-M-l:a, syöpäsolukkoa.

Kuvio 17 on mikrovalokuva ryhmän, jolle on annettu GRA-M-l:a, syöpäsolukosta;

Kuvio 18 esittää GRA:ri SDS-geelielektroforeesidia-35 grammia, jossa on käytetty C.B.B-menetelmän mukaista pro-teiinivärjäystä; 4 77157

Kuviot 19-21 esittävät GRA:n SDS-geelielektroforee-sidiagrammia, joka on värjätty PAS-menetelmän mukaisesti sokerivärjäyksellä;

Kuvio 22 on kaaviokuva, joka esittää tuloksia 5 GRA:n SDS-elektroforeesidiagrammista, jossa on käytetty C.B.B-menetelmän mukaista proteiinivärjäystä;

Kuvio 23 esittää käyrää, joka osoittaa kasvainten kasvunopeuden C3H/HE-hiirellä, jolle on siirrostettu X5563-immuunihiiren pernasoluja ja X5563-soluja.

10 Lymfosyyttien valmistuksessa käytettävä GRA voi daan saada GRA:a sisältävistä ihmisen tai eläinten syöpäsoluista, esimerkiksi viljellyistä syöpäsoluista, siirretyistä syöpäsoluista, spontaanisti esiintyvistä syöpäsoluista, kemiallisella aineella tai viruksilla indu-15 soiduista syöpäsoluista ja leikatuista kudoksista saaduista syöpäsoluista, seuraavalla menetelmällä.

Solumembraanin aineosat erotetaan syöpäsoluista, joita on kuvattu yllä ja käsitellään lektiinillä, joka liittyy spesifisesti pääteasemassa olevaan galaktoosiin 20 tai N-asetyyligalaktoosiamiiniin,jolloin GRA liittyy lek-tiiniin ja on helppo erottaa.

Soveltuvia esimerkkejä galaktoosiin sitoutuvista lektiineistä ovat maapähkinälektiini, Ricinus communis -lektiini ja soijapapu (Glycine max) -lektiini /les.

25 J.B.C. 250 (1975) 8518-8523; Biochem. Biophys. Res. Comm. 62 (1975) 144; Z. Immuniteatsforch 138 (1969) 423-433;

Br.J.Exp. Pathol. 27 (1946) 228-236; Proc. Nath. Acad.

Sei. USA 75(5) (1978) 2215-2219; Biochemistry 13 (1974) 196-204; ja Carbohydrate Research 51 (1976) 107-11S7.

30 Soveltuvia esimerkkejä N-asetyyligalaktoosiamiineihin sitoutuvista lektiineistä ovat Dolichos-papu (Dolichos biflorus) -agglutiniini, braid-appelsiinilektiini. Helix pomatia -lektiini, limanpapu (Phaseolus limensis) -lektiini, soijapapu (Glycine max) -lektiini ja Bauhinia-papu 35 (Bauhinia purpurea) -lektiini.

5 771 57

Syöpäsolumerabraanin aineosien erottaminen voidaan tehdä tunnetuilla menetelmillä, kuten homogenoimalla ja liuottamalla liuottavaa ainetta apuna käyttäen. On edullisempaa käyttää menetelmää, jossa syöpäsolut homogenoi-5 daan fysiologisessa suolaliuoksessa tai soveltuvassa puskurissa saostunut osa kerätään esimerkiksi erottamalla sentrifugoimalla ja liuotetaan fysiologiseen suolaliuokseen tai puskuriin liuottavaa ainetta apuna käyttäen ja supernatantti erotetaan esimerkiksi sentrifugoi-10 maila. Liuottaviin aineisiin, joita voidaan käyttää kuuluvat pinta-aktiiviset aineet, joiden tiedetään yleensä pystyvän liuottamaan solumembraania, kuten ei-ioniset pinta-aktiiviset aineet, esimerkiksi TRITON X-100 (valmistaja Wako Pure Chemical Industries Ltd., NP-40 (val-15 mistaja Shell Co., Ltd.), digitoniini ja urea ja anioni-set pinta-aktiiviset aineet, esimerkiksi natriumdodekyy-: lisulfonaatti (SDS).

Siten saaduista solukalvokomponenteista voidaan erottaa lektiiniin sitoutumaan kykenevä GRA tavanomaisin 20 fysikaalisin, kemiallisin tai biokemiallisin menetelmin, - ; joissa käytetään hyväksi lektiinin ominaisuuksia. Esi merkkejä tällaisista menetelmistä ovat affiniteettikro-matografia, jossa käytetään hyväksi lektiiniä sisältävää kantajaa pylväässä, immuunisaostus, jossa käytetään 25 GRA-vasta-ainetta tai vastaavaa, dialyysi, geelisuodatus, elektroforeesi, fysikaalinen saostus käyttäen saostimena sokereita ja proteiineja saostavaa ainetta, esimerkiksi ' polyetyleeniglykolia ja asetonia sekä niiden yhdistelmät.

Edullisempi on affiniteettikromatografia, jossa 1/. 30 käytetään lektiinipitoista kantajaa pylväässä, joka kan- taja on helppo valmistaa sitomalla lektiiniä liukenemat-.| tomaan alustaan. Tällainen lektiinin kiinnittäminen voi- daan tehdä tunnetuin menetelmin, joita tavanomaisesti käytetään biologisten aineiden sitomiseen. Näistä mene-35 telmistä on edullista käyttää syaanibromidipolysakkaridi- 6 77157 menetelmää ja kiinnitysmenetelmää, jossa käytetään N-hydroksimeripihkahappoimidiestereitä. Syaanibromidiak-tivointi-polysakkaridimenetelmä on menetelmä, jossa liukenematon alusta käsitellään syaanibromidilla ja siten 5 saadulle aktivoidulle tuotteelle tehdään liittämisreak-tio lektiinin kanssa miedoissa olosuhteissa lektiinin kiinnittämiseksi. Käsiteltäessä liukenematonta alustaa syaanibromidilla, käytetään esimerkiksi emäksisiä yhdisteitä, kuten natriumhydroksidia ja natriumbikarbonaat-10 tia, pH:n säätämiseksi arvoon 7,5-12 ja alusta käsitellään liuottimessa, kuten vedessä, asetonitriilissä tai pH-arvoon 7,5-12 säädetyssä puskurissa, 0,1 M natrium-bikarbonaattipuskurissa (pH noin 8,7) ja 0,01 M fosfaattipuskurissa (pH noin 7,7), huoneen lämpötilassa 15 noin 1-12 minuuttia. Syaanibromidin määrän on tavallisesti edullista olla yhtä suuri kuin liukenemattoman alustan määrä.

Keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua liukenematonta alustaa, jolla on alhainen ei-spesi-20 finen adsorptiokyky kaikkien biologisten aineiden suhteen, korkea huokoisuusaste ja joka sisältää funktionaalisen ryhmän, joka pystyy sitomaan biologisia aineita lievissä olosuhteissa ja on kemiallisesti ja fysikaalisesti kyllin pysyvää. Käyttökelpoisiin liukenemattomiin 25 alustoihin kuuluvat selluloosasta, esimerkiksi amino- etyyliselluloosasta, karboksimetyyliselluloosasta, bromi-asetyyliselluloosasta ja p-aniliiniselluloosasta, valmistetut alustat, ristisidoksia sisältävästä dekstraa-nista, esimerkiksi Sephadexista ja CM-sephadexista (val-30 mistaja Farmacia Corp.), valmistetut alustat ja agaroo-sista, esimerkiksi Sepharose 2B:sta, Sepharose 4B:sta ja Sepharose 6B:sta (valmistaja Farmacia Corp.), valmistetut alustat.

Tehtäessä liittämisreaktio yllä mainitulla ta-35 valla saadun syaanibromidilla aktivoidun alustan ja lek- 7 77157 tiinin välillä syaanibromidilla aktivoitua alustaa käytetään 30-80-kertainen määrä lektiiniin nähden ja niiden annetaan reagoida soveltuvassa liuottimessa, kuten 0,1 M natriumbikarbonaatin vesiliuoksessa (joka sisältää 5 0,5 mol/1 natriumkloridia: pH 8,4) lämpötilassa 0-40°C, edullisesti 2-8°C, noin 10-20 tunnin ajan. Tällä tavalla voidaan valmistaa affiniteettikromatografiässä käytettävä lektiiniä sisältävä kantaja.

Kromatografiässä, jossa käytetään yllä mainitulla 10 tavalla valmistettua lektiinipitoista kantajaa, haluttu GRA liittyy kantajassa olevaan lektiiniin ja jää pylvääseen. Sen jälkeen pylvään läpi voidaan johtaa aineita, jotka pystyvät liittymään esimerkiksi lektiiniin, vaihtoreaktion aikaansaamiseksi tai vaihtoehtoisesti ko-15 lonnin läpi johdetaan desorboivaa ainetta (eluointiliuos-ta), esimerkiksi väkevöityä suolaliuosta, kaliumtiosya- naatin vesiliuosta tai nitraattipuskuria, jolloin ha- " luttu GRA irtoaa ja saadaan talteen.

Vaihtoreaktiossa, esimerkkejä aineista, jotka V” 20 pystyvät liittymään lektiiniin silloin, kun käytetään affiniteettikromatografiässä kantajaa, joka sisältää galaktoosia sitovaa lektiiniä, ovat aineet, jotka voivat liittyä pääteasemassa olevaan galaktoosiin sitoutuneeseen lektiiniin, esimerkiksi galaktoosi ja di- ja 25 oligosakkaridit, jotka sisältävät pääteasemassa olevan . . galaktoosiryhmän; esimerkkejä aineista, jotka pystyvät liittymään lektiiniin silloin, kun affiniteettikromato-grafiassa käytetään kantajaa, joka sisältää N-asetyyli-: galaktoosiamiinia sitovaa lektiiniä, ovat aineet, jotka : 30 pystyvät liittymään pääteasemassa olevaan N-asetyyli- galaktoosiamiiniin sitoutuneeseen lektiiniin, esimerkiksi N-asetyyligalaktoosiamiini ja di- ja oligosakkaridit, jotka sisältävät pääteasemassa olevan N-asetyyligalak-toosiamiinin.

35 Siten saatu GRA sisältää glykoproteiinia, joka 8 77157 sisältää pääteasemassa olevaa galaktoosia ja/tai N-asetyy-ligalaktoosiamiinia sekä glykolipidiä ja/tai sakkaridia.

Siten valmistettu GRA voidaan haluttaessa kylmä-kuivata sekä puhdistaa edelleen tavanomaisia erotusmene-5 telmiä käyttäen. GRA-valmisteet, jotka on eristetty galaktoosia sitovan lektiinin avulla voidaan esimerkiksi erottaa menetelmällä, jossa käytetään N-asetyyligalak-toosiamiinia sitovaa lektiiniä ja ne jotka on eristetty N-galaktoosiamiinia sitovan lektiinin avulla, voidaan 10 käsitellä erotusmenetelmällä, jossa käytetään galaktoosia sitovaa lektiiniä.

Tässä yhteydessä käytettävät lymfosyytit eivät ole ratkaisevia ja voidaan käyttää mitä tahansa imusoluja, jotka saadaan syöpää sairastavista ihmisistä tai 15 eläimistä. Esimerkkejä ovat ääreisverenkierrosta, luu-ytimestä, imusolmukkeista, pernasta, risoista ja kateen-korvasta saatavat lymfosyytit. Nämä lymfosyytit eristetään fysikaalisin tai kemiallisin menetelmin, pintakal-vomenetelmällä tai vastaavalla.

20 Lymfosyyttien herkistäminen GRA:11a tehdään kas vattamalla lymfosyyttejä viljelyalustassa, joka sisältää GRA:a, 1-10 vrk, edullisesti 2-7 vrk.

Lymfosyyttien herkistykseen käytettävänä viljely-alustana voidaan käyttää erilaisia tavallisia ravin-25 toalustoja, joita tavanomaisesti käytetään tällaisessa solujen viljelyyn. Edullisia esimerkkejä ovat RPMI-1640-alusta, Eagle MEM -kasvualusta jne., joihin on lisätty ihmisen seerumia, lehmän sikiön seerumia (FCS), vasikan seerumia, hevosen seerumia tai vastaavaa. Viljelmään li-30 sättävän GRA:n määrä on tavallisesti 1-1000 ng/ml ja edullisesti 1-500 ng/ml, laskettuna sokerin määränä ja lymfosyyttien määrän ollessa 1 x 10^/ml.

Kasvatus tehdään tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi pH 7,2:ssa ja noin 37°C:n lämpötilassa.

35 Keksinnön mukaisesti valmistetut tappasolut ovat 9 77157 suurinpiirtein normaaleja lymfosyyttejä ja niillä on GRA-spesifinen solujen vastainen vaikutus. Esimerkiksi GRA-l-KT:11a, joka on yksi keksinnön mukaisesti valmistetuista tappajasoluista, on ominaisuudet, jotka ovat ta-5 vallisia ihmisen ääreisverenkierron T-soluille ja sillä on solujen vastainen vaikutus, joka on spesifinen GRA:a sisältäville syöpäsoluille, mikä on osoitettu jäljempänä kuvattavassa esimerkissä.

Tyypillisiä esimerkkejä keksinnön mukaisesti valio mistetuista uusista tappajasoluista ovat GRA-l-KT ja GRA-M-l, jotka valmistetaan jäljempänä kuvattavissa esimerkeissä. Kaikkia keksinnön mukaisesti valmistettuja tappajasoluja on saatavana patentin hakijalta.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja tappajasoluja 15 voidaan monistaa rajattomasti yllä kuvatulla kasvualustalla, joka sisältää T-solujen kasvutekijää (TCGF, IL-2). Tässä tapauksessa tappajasolukloonin selektiivinen kasvatus voidaan tehdä tavanomaisella ultralaimennusmene-telmällä. Näitä tappajasoluja voidaan säilyttää pitkiä 20 aikoja esimerkiksi nestetypessä.

GRA:a voidaan käyttää yksinään aktiivisena aineosana ja lisäksi yhdistettynä muihin antibakteerisiin ja syöpää estäviin aineisiin. GRA:a atkiivisena aineosanaan sisältävät, syöpää estävät aineet voivat olla missä ta-25 hansa muodossa, kunhan ne ovat sellaisina valmisteina, V- että GRA:a on vaikuttava määrä. Aine annetaan tavalli- sesti laskimon sisäisesti, ihon alle, ihon sisään tai - lihakseen liuoksena, suspensiona tai emulsiona. Se voi olla lisäksi kuivana tuotteena, joka voidaan tehdä nes-30 temäiseksi lisäämällä siihen soveltuvaa kantajaa ennen käyttöä. Nämä nestemäiset aineet voivat sisältää suspen-doivaa ainetta, esimerkiksi metyyliselluloosaa, emulgaat-toria, esimerkiksi lesitiiniä, säilytysaineita, esimerkiksi metyyli-p-hydroksibentsoaattia, stabilisaattoria, 35 jolla ei ole sellaisenaan haitallisia vaikutuksia ihmisten 10 771 57 ja eläimien immuunijärjestelmään, puskuria ja vastaavia lisäaineita.

Käyttökelpoisiin vesipitoisiin kantajiin kuuluu fysiologinen suolaliuos ja käyttökelpoisia vedettömiä 5 kantajia ovat kasviöljyt, esimerkiksi seesamöljy, mineraaliöljyt, esimerkiksi parafiiniöljy, eläinöljyt, esimerkiksi skvaleeni sekä propyleeniglykoli. Lisäksi voidaan lisätä immunologisen tehostamisen aikaansaamiseksi soveltuvia apuaineita. Apuaineita, joita voidaan käyt-10 tää ovat mm. Freund's complete adjuvants, saponiini eläimille ja alumiinihydroksidi ihmiselle.

Syövän vastaista ainetta voidaan antaa kerran tai toistuvasti pitkän ajan kuluessa syöpäpotilaalle taudin hoitamiseksi tai henkilölle, joka on vaarassa sairas-15 tua syöpään, syövän estämiseksi.

Koska GRA:n LD^^-arvo (hiiri, vatsakalvon sisäisesti) on vähintään 500 mg/kg sokerin määränä laskettuna on, syövän vastaisen aineen myrkyllisyys pieni ja annostus voi siksi vaihdella suuresti. Vaikka GRA-pitoisuus 20 syövän vastaisessa aineessa ei ole ratkaiseva, on tavallisesti edullista käyttää pitoisuutta 0,001-100 pg/ml sokerin määränä laskettuna. Mitä tulee syövän vastaisen aineen annostukseen, on tavallisesti edullista antaa ainetta 0,001-100 pg/kg/vrk, yhdellä kertaa tai useana 25 annoksena, vaikkakin annostus vaihtelee riippuen sairauden laajuudesta ja potilaan iästä ja sukupuolesta.

Syövän vastainen aine, joka on valmistettu siten, että se sisältää tappajasoluja aktiivisena aineosanaan, käytetään edullisesti injektioliuoksena yhdessä täl-30 laisten lääkkeiden valmistukseen käytettävien kantajien kanssa. Tässä yhteydessä käytettävät kantajat eivät ole ratkaisevia, mutta isotoniset kantajat ovat edullisia. Fysiologinen suolaliuos on erityisen edullinen. Valmistettaessa ainetta on edullista pestä tappajasoluja 35 riittävästi fysiologisella suolaliuoksella tai vastaaval- 11 77157 la yllä kuvatun viljelyalustan poistamiseksi ja liettää ne sitten kantajaan.

Tappajasolujen pitoisuus aineessa ei ole tarkoin 5 9 rajoitettu, mutta se on edullisesti 10 -10 millilit-5 rassa. Kun tappajasoluja annetaan vatsakalvon sisäi- g sesti annoksena 10 /hiiri, ei havaita minkäänlaista myrkkyvaikutusta. Vaikka keksinnön mukaisesti valmistetetun syövän vastaisen aineen annostus vaihtelee taudin asteesta ja potilaan iästä ja sukupuolesta riippuen, on taval- 5 12 10 lisesti edullista antaa ainetta annoksena 10 -10 /kg/vrk joko yhtenä tai useampana annoksena.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä yksityiskohtaisemmin.

Referenssiesimerkki 1 15 GRA:n sijainti (1)-A FITC:lla merkityn lektiinin (PNA-FITC) valmistus 10 mg maapähkinälektiiniä (PNA, valmistaja EY Co.) liuotettiin 0,01 M fosfaattipuskuriin (2 ml), joka si-20 sälsi 0,85 % NaCl (pH = 7,2). 0,5 M vetykarbonaattipus-kuriin (1 ml) (pH = 9,0) liuotettiin 2 mg FITCsa (valmistaja Sigma Laboratories Inc.) ja tuloksena olevasta liuoksesta lisättiin 0,5 ml yllä valmistettuun PNA-pus-.. kuriin. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa kaksi ;; 25 tuntia ja erotettiin sitten Sephadex G25 -pylväässä ·'*' (10 x 300 mm, geelin valmistaja Farmacia Corp.). Kerät- tiin alkupiikki. FITC/PNA-suhde = 1,0.

(1)-B FITCrlla merkityn lektiinin (DBA-FITC) valmistus 30 Valmistettiin (1)-A:ssa kuvatulla tavalla DBA- FITC käyttäen EY Corp.rn valmistamaa DBA:a. FITC/DBA-suhde = 0,9.

(1)-C Soijapapuagglutiniinia FITC (FITC-SBA) myy EY Co. FITC/SBA-suhde = 1,4.

12 771 57 (2) GRA:n sijainti erilaisissa syöpäsoluissa g (a) Ihraisen viljeltyjä syöpäsoluja (1 x 10 ) pestiin kolmesti 0,05 M tris-suolahappopuskurilla, joka sisälsi 0,85 % NaCl (pH = 7,2), sentrifugointimenetelmällä ja sitten 5 niihin lisättiin 100 yul (1):n mukaisesti valmistettuja PNA-FITC, DBA-FITC tai SBA-FITC (200 ^uq/ml). Tuloksena olevan seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, jotta aineet reagoisivat. Kun reaktio oli lopussa, reaktioseosta pestiin kolmesti 0,01 M fosfaattipuskurilla, 10 joka sisälsi 0,85 % NaCl (pH =7,2) ja sen jälkeen solut laitettiin lasilevylle ja tutkittiin fluoresenssimikroskoo-pilla.

Hiiret X5563 ja MH134 käsiteltiin ja tutkittiin samalla tavalla kuin yllä.

15 Tulokset ovat taulukossa 1. Käytetyt syöpäsolut ovat kaikki tunnettuja ja ne on saatu First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University:sta.

Taulukko 1

Syöpäsolut GRA-positiivisia 20 (%)

PNA DBA SBA

Raji (Burkitt'in imukudoskasvain) 98,3 1,4

Dauji -"- 93,1 5,2 BT-1 - " - 50,1 0 25 P-12 (T-solu-imukudoskasvain) 44,3 6,7 MOLT (T-solu-leukemia) 0,6 4,8

Fujimaki (B-solu-imukudoskasvain) 19,1 5,3

Oda (IgD-luuydinkasvain) 0,6 10,0 QG-56 (keuhkosyöpä, suomuinen) 70,4 2,0 30 PC-1 - " - 78,4 0,4 PC-3 (keuhkosyöpä, rauhassyöpä) 77,1 0 QG-90 (keuhkosyöpä, pienisolu-) 68,0 0 PC-13 (keuhkosyöpä, suurisolu-) 17,0 0 MK-2 (vatsasyöpä, heikko erilaistu- 35 minen) 63,7 0,1 KATO-III (vatsasyöpä, signet ring -syöpä) 57,3 0 13 771 57

Taulukko 1 (jatkoa)

Syöpäsolut GRA-positiivisia (%)

PNA DBA SBA

5 MKN-45 (vatsasyöpä, heikko erilaistuminen ) 1,040,3 MKN-1 (vatsasyöpä, suomuinen rauhas- syöpä) 4,6 0,4 MKN-28 (vatsasyöpä) 0,4 0,1 10 MKN-74 " 0,5 0 MGH-Ul (virtsarakkosyöpä) 37,4 0 KU-2 " 4,5 21,4 T-24 " 14,6 0 NBT-2 " 13,1 1,0 15 NRC-12 (munuaissyöpä) 23,9 0 KU-1 " 3,3 0,6

Kuramochi (munasarjasyöpä) 80,0 0 NB-1 (varhaishermosolukasvain) 50,9 1,7 *: YT-nu " 3,6 0,5 " 20 TGW-nu-l " 4,10 TGW-nu-ll " 2,0 1,0 GOTO " 0,5 0 ITO (sikiön syöpä) 96,9 12,3 NEC-8 - " - 44,6 0 25 SCH (suonikalvosyöpä, vatsa) 14,6 3,1 GCH (suonikalvosyöpä, kohtu) 5,4 0 YN-1 (poikkijuovaislihaskasvain) 5,7 1,7

Hiiri X5563 (plasmasolukasvain plasmacytoma) 92,0 0 90,6 : 30 Hiiri MH134 (maksakasvain, hepatoma) 18,6 0 6,4 .... (b) Syöpäpotilaiden pahanlaatuisia kudoksia johdet tiin ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan (# 150) läpi yksisolususpension aikaansaamiseksi. Kun solut oli pesty kahdesti 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka oli 5 35 2 mM CaCl2:n suhteen ja sisälsi 0,85 % NaCl, 5 x 10 solua suspendoitiin puskuriin (100 ^ul) . 100 jil FOTC-PNA tai FITC-DBA (200 jig/ml) lisättiin solususpensioon ja 14 771 5 7 seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Kun solut oli pesty kolmesti kylmällä PBS:lla, ne tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla.

Tulokset ovat taulukossa 2. Syöpäpotilaiden pahan-5 laatuiset kudokset on saatu Kansai Medical University:stä. Taulukko 2

Nro Syöpäpotilaan kudos GRA

PNA DBA

1 Vatsasyöpä + + 10 2 + + 3 - 4 " + 5 " + + 6 + 15 7 Rintasyöpä + 8 " + - 9 " + 10 + + 11 Paksusuolisyöpä + + 20 12 " + 13 Ruokatorvisyöpä + 14 Maksakasvain - +

Huomaa: Merkki"+” osoittaa, että GRA:a esiintyy solun pinnalla .

25 Merkki osoittaa, että GRA:a ei esiinny solun pinnalla.

Referenssiesimerkki 2 GRA:n valmistus (1)-A Kiinnitetyn lektiinin valmistus (PNA-Sepharose) 30 Kolme g CNBr-aktivoitua Sepharose 4B:a (valmistaja

Farmacia Corp.) pestiin hyvin 1 mM HCl:lla ja suspendoitiin 0,1 M natriumbikarbonaattiin (pH = 8,5, 200 ml). Sitten lisättiin 5 ml 0,01 M fosfaattipuskuria (pH = 8,5), joka sisälsi 20 mg PNA:a ja annettiin reagoida 25°C:ssa kaksi tun-35 tia välillä sekoittaen PNA-Sepharosen valmistamiseksi.

(1)-B Samalla tavalla kuin (1)-A:ssa, mutta käyttäen PNA:n sijasta DBA:a, valmistettiin DBA-Sepharose.

15 771 57 (2) GRA:n valmistus (a) BT-1 (Burkittin imukudoskasvain) -solut (1,3 x g 10 ) pestiin kolmesti fysiologisella suolaliuoksella ja niihin lisättiin 30 ml 0,01 M tris-HCl-puskuria (pH = 7,4), 5 joka sisälsi 2 % "TRITON X-100":a (valmistaja Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 0,85 % NaCl ja 2 mM CaCl2 ja 2 mM MgCl2. Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 15 minuuttia ja sitten sille tehtiin ultrasentrifugointierotus (100 000 x g). Siten saadusta supernatantista (28 ml) laskettiin 10 14 ml:n annos affiniteettikromatografiakolonnin läpi (hal kaisija 0,5 cm pituus 1 cm), joka oli täytetty PNA-aga-roosihelmillä (valmistaja Maruzen Co., Ltd.), jotka oli tasapainotettu tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,1 % TRITON X-lOOsa, 0,85 % NaCl 2 mM CaCl2 ja 2 mM 15 MgCl2· Kun helmet oli pesty samalla puskurilla kuin mitä edellä käytettiin, eluoitiin 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,85 % NaCl ja oli 0,1 M laktoosin, 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen sekä sisälsi 0,1 % TRITON X-100:a. Siten eluoitunut osa dialysoitiin 20 0,01 M tris-HCl-puskurilla, joka sisälsi 0,85 % NaCl ja 011 2 mM MgCl2:n ja 2 mM CaCl2:n suhteen, 48 tuntia, jolloin saatiin 17 ml GRA-liuosta. GRA-liuoksesta mitattiin proteiinin ja sokerin määrät Folin-Lowry-menetelmällä ja fenolirikkihappo-menetelmällä vastaavasti ja niiden havait- 25 tiin olevan 644 jig ja 120 pg vastaavasti. Tästä liuokses- V. ta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-1".

(b) C3H/He-hiiren rintasyöpä (MMT) -soluja (1x10^) pestiin kolmesti fysiologisella suolaliuoksella ja niihin lisättiin 30 ml 0,01 M tris-HCl-puskuria (pH = 7,4), joka 30 sisälsi 2 % TRITON X-100:a, 0,85 % NaCl ja oli 2 mM CACl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen. Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 30 minuuttia. Sen jälkeen seos erotettiin ultrasentrifugoimal-la (100 000 x g) kaksi tuntia ja supernatanttia dialysoitiin yön yli 0,1 M tris-HCl-puskurilla, joka sisälsi 0,85 % 35 NaCl ja oli 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen. Siten dialysoitu liuos väkevöitiin 3 ml:ksi ja 1 ml:n annos 16 771 57 johdettiin läpi affiniteettikromatografiakolonnin (halkaisija 0,5 cm, pituus 2 cm), joka oli täytetty PNA-Sepharosel-la (samaa kuin edellä), joka oli tasapainotettu tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,005 % TRITON X-100:a, 5 0,85 % NaCl ja oli 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen.

Kun kolonni oli pesty kunnolla edellä mainitulla puskurilla, se eluoitiin 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,85 % NaCl ja 0,005 % TRITON X-100:a ja oli 0,1 M laktoosin, 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen ja siten 10 saatua eluoitunutta osaa dialysoitiin 48 tuntia 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,85 % NaCl ja oli 2 mM CaCljin ja 2 mM MgCl2:n suhteen, jolloin saatiin 2 ml GRA-liuosta.

Siten saadussa GRA-liuoksessa proteiinin määrä oli 15 156 ^,ug ja sokerin määrä 94 ^ug. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-M-l".

(c) Noin 120 g (märkäpaino) KATO-III:a homogenoitiin 100 ml:ssa PBS:a Waring-sekoittimella. Kun oli sentrifugoi-tu yksi tunti (100 000 g), pelletti liuotettiin 0,01 M tris-20 HCl-puskuriin (100 ml), joka sisälsi 2 % TRITON X-100:a ja oli 0,15 M NaCl:n suhteen (pH = 7,6). Supernatantti erotettiin sentrifugoimalla (100 000 g) yksi tunti ja laitettiin kolonniin, joka oli täytetty PNA-Sepharose 4B:lla (0,8 x 15 cm), joka oli tasapainotettu 0,01 M tris-HCl-puskurilla 25 8pH = 7,6), joka sisälsi 0,015 % TRITON X-100:a ja oli 0,15 M NaCl:n suhteen. Kun kolonni oli pesty 50 mltlla puskuria, GRA eluoitiin puskurilla, joka oli 0,1 M laktoosin suhteen. Eluoitua GRA:a dialysoitiin 0,85-%:illa NaCl-liuoksella, väkevöitiin Sephadex:lla (Pharmacia Co.) ja 30 säilytettiin -20°C:ssa ennen käyttöä.

Proteiinin ja sokerin määrät määritettiin, kuten (a):ssa ja niiden havaittiin olevan 2,0 mg ja 0,8 mg vastaavasti. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-2".

35 (d) Samalla tavalla kuin (c):ssa valmistettiin seu- raavat GRA-näytteet.

17 771 57

Taulukko 3

GRA-näyte Materiaali GRA

Lähde Määrä (g) Proteiini- Sokeripi- pitoisuus toisuus (mg) (mg) 5 GRA-3 BT-1 33 0,5 0,09 GRA-4 Rintasyöpä 5 0,24 0,5 (leikattu) GRA-5 QG-56 24 0,6 0,38 GRA-6 QG-90 26 1,0 0,54 10 GRA-7 Raji 29 0,78 0,45 GRA-M-2 MMT 200 11,3 28,4 GRA-M-3 LLC 14,4 0,06 0,07 GRA-M-4 MH-134 85 0,65 0,35 GRA-M-5 X-5563 25 0,56 0,23 : 15 (e) Samalla tavalla kuin yllä (c) :ssa, mutta käyttäen KATO-III:n sijasta MKN-45:a (noin 29 g) ja PNA-Sepharose 4B:n sijasta (1)-B:ssa valmistettua DBA-Sepharosea, ja eluoiden N-asetyyligalaktoosiamiinilla, saatiin GRA-valmis-te, jonka proteiinipitoisuus oli 0,03 mg ja sokeripitoisuus 20 0,01 mg. Tästä näytteestä käytetään tästedes lyhennettä "GRA-8".

(f) Edellä valmistettu (d) GRA-3 (5 ml) laitettiin DBA-Sepharose-kolonniin ja eluoitiin tris-HCl-puskurilla (0,015 % TRITON X-100, 2 mM MgCl2, CaCl2, 0,85 % NaCl), 25 jolloin saatiin 4 ml fraktioita 1-12. Fraktioita 1-3 mer-kitään lyhenteellä "GRA-3-A" ja fraktioita 4-12 lyhenteel-: : : lä "GRA-3-B". Sitten kolonnia eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi kuitenkin N-asetyyligalaktoosiamiinia (0,1 M), jolloin saatiin fraktiot, joita merkitään lyhenteellä 30 "GRA-3-C".

(g) SDS-geelielektroforeesi

Kullekin yllä mainituista GRA-valmisteista tehtiin elektroforeesi menetelmällä, jota kuvataan julkaisussa Fairbanks et ai., Biochemistry 10 (1971) 2606.

35 Saadut tulokset ovat kuvioissa 18-22.

18 771 57

Kuvioissa 18-19 numerot 1-5 merkitsevät seuraavaa.

1 = standardi; 2 = GRA-M-3; 3 = GRA-7; 4 = GRA-1; ja 5 = GRA-2.

Kuviossa 20 numerot 1-4 merkitsevät seuraavaa. 1 = 5 standardi; 2 = GRA-M-2; 3 = GRA-6; 4 = GRA-5.

Kuviossa 21 numerot 1-3 merkitsevät seuraavaa. 1 = GRA-M-4; 2 = GRA-M-5; 3 = standardi.

Kuviossa 22 numerot 1-4 merkitsevät seuraavaa. 1 = GRA-3; 2 = GRA-3-A; 3 = GRA-3-B; 4 = GRA-3-C.

10 Kuvio 18 esittää GRA:a, jolle on tehty proteiini- värjäys C.B.B.-menetelmällä /Fairbanks et ai., Biochemistry 10 (1971) 2606/.

Kuviot 19-21 esittävät GRA:a, jolle on tehty sokeri-värjäys PAS-menetelmällä /R.M. Zacharius et ai., Anal.

15 Biochem. 30 (1962) 148/.

Kuviossa 22 on kaaviokuva C.B.B.-menetelmällä tehdyn värjäyksen tuloksista.

Standardeina käytettiin alla lueteltuja aineita, jotka saatiin Biorad. Lab. Calif. USA:sta.

20 200 K dalton; myosiini 116 " /J-galaktosidaasi 92,5 " fosforylaasi

66,2 " BSA

45 " ovalbumiini 25 21,5 " soijapaputrypsiini-inhibiittori

Referenssiesimerkki 3 TCGF:n valmistus (a) Japaninapinan (saatu Japan Plymates Co., Ltd.:sta) perna (4 kg) leikattiin irti ja pestiin kahdesti RPMI-1640- 30 kasvatusalustalla (valmistaja Flow Laboratory Co., Ltd.).

Solut suodatettiin Mesh-seulalla (valmistaja Milipore Inc., 150 mesh) ja niille tehtiin ominaispainosentrifugointi (ominaispaino 1,076), jolloin saatiin 2 1 lymfosyyttejä (2 x g 10 /ml). Siten saadut lymfosyytit pestiin kolmesti RPMI-35 1640-kasvatusalustalla ja lymfosyyttien lukumäärä säädettiin 7 5 x 10 :ksi millilitrassa käyttäen samaa alustaa kuin edellä, joka sisälsi 10 % FCS. Sen annettiin sitten seistä 19 771 57 hiilidioksidifermentaattorissa 37°C:ssa yksi tunti. Super-natanttina olevat lymfosyytit kerättiin ja lymfosyyttien lukumäärä säädettiin 1 x 10 :ksi millilitrassa käyttäen samaa kasvatusalustaa kuin edellä, joka sisälsi 1 % FCS.

5 Sen jälkeen lisättiin 1 ^ug/ml indometasiinia (valmistaja Sigma Laboratories, Inc.) ja 0,2 % PHA-P (valmistaja Difco Co.) ja soluja viljeltiin hiilidioksidifermentaattorissa 37°C:ssa 48 tuntia. Sentrifugoitiin (3 000 rpm) 10 minuuttia, supernatantti kerättiin ja steriloitiin suodattamalla 10 Millipore-suodattimella (valmistaja Millipore Inc., 0,2 ^um), jolloin saatiin 2 litraa TCGF:a.

(b) TCGF-lähteenä olivat sekakasvatetut ääreisverenkierron lymfosyytit, jotka olivat peräisin 10 terveeltä luovuttajalta.

15 Adsorboitumattomat lymfosyytit, jotka valmistettiin j C.F. /Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co,)J -erotetuis ta lymfosyyteistä adsorboimalla muovipinnalle 37°C:ssa yksi tunti, suspendoitiin RPMI-kasvatusalustaan, joka * * g sisälsi 1 % FCS:a (1,5 x 10 solua/ml) ja inkuboitiin 20 PHA-P:n (0,2 %), indometasiinin (1 ^ug/ml) ja mitomysiini C:llä (50 /Ug/ml) esikäsitellyn ihmisen B-soluvalmisteen / 5 (BT-1) (1,5 x 10 solua/ml) läsnäollessa. Viljelmän super na tantti kerättiin 48 tunnin kuluttua ja sitä käytettiin TCGF-lähteenä /H.Inoue et ai., Scand. J. Immunol. 12 (1980) 25 149-154/.

Referenssiesimerkki 4 Lymfosyyttien valmistus (1) Ihmisen ääreisverenkierron lymfosyytit Verinäytteille (50 ml), jotka oli saatu terveeltä 30 aikuiselta tai useilta syöpäpotilailta heparinisoimalla, tehtiin erotus sentrifugoimalla käyttäen Ficol Pack:ia (valmistaja Farmacia Japan Co., Ltd.), jolloin saatiin 7 5 x 10 ääreisverenkierron lymfosyytteja.

(2) Hiiren pernan lymfosyytit 35 C3H/He-hiiren (uros, kuusi viikkoa) perna leikattiin irti ja pestiin kahdesti RPMI-1640-viljelyalustalla.

Pernaa pehmennettiin sitten ruiskutusneulalla ja puristettiin 20 „ 771 57 ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan (100 mesh) läpi suurten palojen poistamiseksi. Siten suodatetut solut pestiin kahdesti samalla kasvatusväliaineella ja erotettiin sentrifugoimalla (1 200 rpm) 10 minuuttia, jolloin 7 5 saatiin 4 x 10 pernan lymfosyyttejä.

Esimerkki 1

Referenssiesimerkissä 2 ((2)-(a)) valmistettu GRA-1 (proteiinin määrä 40 ^ug/ml; sokerin määrä 7,5 ^ug/ml) laimennettiin 1 000-kertaiseksi alkutilavuuteen nähden RPMI- 10 1640-viljelyalustalla, joka sisälsi 15 % FCSsa, herkis- tyskasvatusalustan valmistamiseksi.

Ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyttejä (5 x 10*V 5 ml), jotka oli saatu referenssiesimerkin 4 ((D) mukaisesti, lisättiin herkityskasvatusalustaan (5 ml), joka 15 oli valmistettu yllä kuvatulla tavalla ja joka oli laitettu laboratoriomaljalle ja kasvatettiin 37°C:ssa 2 vrk. Niitä kasvatettiin edelleen RPMI-1640-viljelyalustalla, joka sisälsi 20 % TCGF ja 15 % FCS ja joka oli valmistettu referenssiesimerkin 3 mukaisesti, vielä viisi vrk, jolloin saa-20 tiin 20 ml tappajasoluliuosta, joka sisälsi 1 x 10^ tappajasolua millilitrassa. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-1-K-T".

Esimerkki 2

Referenssiesimerkin 4 ((2)) mukaisesti valmistetut g 25 hiiren pernan lymfosyytit laimennettiin solulukuun 5 x 10 /ml käyttäen RPMI-1640-viljelyalustaa, joka sisälsi 15 % FCS. Sitten lisättiin referenssiesimerkin 2 ((2)-(b)) mukaisesti valmistettua GRA-M-1:a siten, että proteiinin ja sokerin lopulliset määrät olivat 1,5 yug/ml ja 0,9 ^,ug/ml 30 vastaavasti. 5 ml:n erää saadusta seoksesta kasvatettiin laboratoriomaljalla (60 x 15 mm, valmistaja Falcon Co.) 37°C:ssa kaksi vrk. Havaittiin kloonautumista. Erää kasvatettiin edelleen RPMI-1640-kasvatusalustalla, jossa oli 15 % FCS:a, joka sisälsi 20 tilavuus-% TCGF:a (valmistaja 35 Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.) neljä vrk, jolloin saatiin 50 ml tappajasoluliuosta, joka sisälsi 1 x 21 77157 10^ tappajasolua millilitrassa. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-M,L-K-T".

Esimerkki 3 Ääreisverenkierron lymfosyyttejä (5 x 106), jotka 5 oli saatu terveeltä luovuttajalta, inkuboitiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 50 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-2:a ja 15 % FCS:a 37uC:ssa. Toisena päivänä lisättiin yllä kuvattua ihmisen TCGF:a alustaan siten, että pitoisuudeksi tuli 20 % ja inkubointia jatkettiin vielä kol-10 me vrk tappajasolujen aikaansaamiseksi. Tätä tuotetta merkitään tästedes lyhenteellä "GRA-2-K-T".

Esimerkki 4

Tappajasoluvalmisteet GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T ja GRA-C-K-T valmistettiin esimerkin 1 mukaisesti käyttäen 15 GRA-8:a, GRA-3-A:a ja GRA-3-C:a vastaavasti (proteiinipi-[ f [ toisuus 50 ng/ml) ja referenssiesimerkin 3-(b) mukaisesti valmistettua TCGF:a.

Esimerkki 5 C3H/He-hiiriin (naaraita, kahdeksan viikkoa) istutet-20 tiin ihon sisäisesti X5563-soluja (10), jotka oli saatu samasta kannasta ja seitsemän päivän kuluttua kasvaimet poistettiin leikkaamalla. Tästä seitsemän päivän kuluttua inokuloitiin saman kannan X5563-soluja (10^) ja hiiret, jotka olivat resistenssejä inokulaatiolle, nimettiin immuu-25 nihiiriksi.

Immuunihiirien ja C3H/He-normaalihiirien pernasolut preparoitiin tavanomaisesti.

Kukin pernasoluerä (5 x 10^/annos) herkistettiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 15 % FCS:a, olevalla 30 GRA-M-5:lla (proteiinipitoisuus 40 mg/ml) viisi vrk, jolloin saatiin tappajasoluja.

Normaaleista pernasoluista saatua tappajasoluvaImis-tetta kutsutaan tästedes lyhenteellä "GRA-M-5-K-T-1" ja im-muunipernasoluista saatua lyhenteellä "GRA-M-5-K-T-2".

35 Esimerkki 6

Ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyttejä (5 x 10^) inkuboitiin RPMI-1640-alustassa (5 ml), joka sisälsi 22 771 57 50 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-1:a 37°C:ssa kaksi vrk. Kolmantena päivänä lymfosyytit siirrostettiin RPMI-1640-alustaan, joka sisälsi lymfosyyttien luovuttajan seerumia (10 %) ja 0-100 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-1:a ja 5 inkubointia jatkettiin vielä viisi vrk, jolloin saatiin taulukon 4 mukaiset tappajasoluvalmisteet.

Taulukko 4 GRA-pitoisuus (ng/ml)

Aloituspäivä Päivä 3 Tappajasolu 10 50 0 GRA-l-K-T-1 50 1,6 GRA-l-K-T-2 50 3,2 GRA-l-K-T-3 50 6 GRA-l-K-T-4 50 12,5 GRA-l-K-T-5 15 50 25 GRA-l-K-T-6 50 50 GRA-l-K-T-7 50 100 GRA-1-K-T-8

Esimerkki 7 (a) Ääreisverenkierron lymfosyyttejä (PBL), jotka 20 oli saatu useilta syöpäpotilailta leikkauksen jälkeen, herkistettiin GRA-3:lla tappajasolujen valmistamiseksi. Potilailta saatua PBL:a (5 x 10**) inkuboitiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 50 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-3:a kaksi vrk ja sitten vielä viisi vrk RPMI-1640-vä-25 liaineessa, joka sisälsi 20 % TCGF:a ja 15 % FCS:a, jolloin saatiin taulukon 5 mukaisia tappajasoluja.

Taulukko 5 Ääreisverenkierron lymfosyytit Syöpä P-GRA D-GRA Päivää leik- Tappajasolu 30 kauksesta

Mahasyöpä + + 14 GRA-3-K-T-1 " + + 35 GRA-3-K-T-2

Rintasyöpä + - 21 GRA-3-K-T-3 " + 7 GRA-3-K-T-4 35 + - 35 GRA-3-K-T-5

Mahasyöpä + 21 GRA-3-K-T-6 23 7 7 1 57

Yllä olevassa taulukossa P-GRA ja D-GRA ilmoittavat GRA:n sijainnin pahanlaatuisessa solukossa (kasvaimet irrotettu leikkaamalla), joka on saatu potilailta, joista kerättiin PBL referenssiesimerkin 1, 2-(b) mukaisesti. P-GRA 5 ja D-GRA ovat tuloksia, jotka saatiin käyttäen FITC-PNA:a ja FlTC-DBA:a vastaavasti. Leikkauksen jälkeiset päivät ilmoittavat aikaa, jona PBL kerättiin leikkauksen jälkeen.

(b) PBL:a (5 x 106), joka oli kerätty rintasyöpäpotilailta 21 vrk:n kuluttua leikkauksesta, inkuboitiin RPMI- 10 1640-alustässä, joka sisälsi 50 ng/ml (proteiinipitoi suus) GRA-3:a ja potilaan seerumia (10 %), seitsemän vrk, jolloin saatiin tappajasoluvalmiste. Tätä kutsutaan tästedes lyhenteellä "GRA-3-K-T-7".

Esimerkki 8

O

15 Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu GRA-l-K-T (10 ) :: laimennettiin fysiologisella suolaliuoksella (10 ml) ruis- :- kutettavan liuoksen aikaansaamiseksi.

: : Esimerkki 9 (i) Referenssiesimerkin 2 ((2)—(b)) mukaisesti val- : 20 mistettu GRA-M-1 laimennettiin fysiologisella suolaliuok sella siten, että sokeri- ja proteiinipitoisuuksiksi saatiin 1,0 ^,ug/ml ja 1,6 ^ug/ml vastaavasti, jolloin saatiin syövän vastainen aine nro 1.

(ii) C3H/He-hiirillä spontaanisti esiintyvästä rin-25 tasyöpäkasvaimesta leikattiin steriilisti 5 mm:n kuutio- maisia paloja ja ne siirrettiin selkänähän alle kymmenelle C3H/He-hiirelle, jotka olivat samaa kantaa kuin yllä ole-vat (seitsemän viikon ikäisiä uroksia) . Seitsemän päivän kuluttua istutuksesta varmistettiin kasvaimen kiinnittymi-30 nen ja jakautuminen. Viidelle hiiristä annettiin kullekin ihon alle syövän vastaista ainetta nro 1, joka oli valmis-tettu (i) :n mukaisesti, 300 ^ul/päivä kahden päivän väliajoin. Toista viiden hiiren joukkoa käytettiin käsittelemättömänä vertailuryhmänä. 10 päivän kuluttua ensimmäisestä 35 aineen antokerrasta kasvaimet poistettiin leikkaamalla ja niiden keskimääräinen paino mitattiin. Samanaikaisesti tehtiin patohistologinen tutkimus.

24 7 7 1 57

Kasvaimen tilavuus: 3 Lääkettä saanut ryhmä 22,3 mm (kuvio 14) 3

Kontrolliryhmä 162,7 mm (kuvio 15) Tämä merkitsee sitä, että kasvaimen koossa oli 86,3 %:n 5 pieneneminen.

Patohistologinen tutkimus:

Vertailuryhmässä (kuvio 16) muodostui linnunpesämäi-siä syöpäkasvaimia, kudostyyppi oli ydinkanavasyövän kaltainen ja kasvainsolujen jakautumista oli havaittavissa 10 kaikkialla kudoksessa. Toisaalta lääkettä saaneessa ryhmässä (kuvio 17) syöpäsolut aiheuttivat muodostumiskohdilleen nestemäisen kuolion ja esiintyi kovettumista ja sidekudoksen muodostumista ja jäljelle jäi vain hyvin rajoittunut määrä syöpäsoluja. Siten oli havaittavissa, että keksinnön 15 mukaisesti valmistetun syövän vastaisella aineella on kasvainten vastaisia ominaisuuksia.

Koe-esimerkki 1

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu GRA-l-K-T (1 ^ul) laitettiin mikrolevylle (valmistaja Falcon Corp.) ja annet-20 tiin seistä huoneen lämpötilassa 15 minuuttia. Sitten lisättiin 4 |il FCS:a (valmistaja Falcon Corp.) ja seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Lisättiin neuraminidaasilla käsiteltyjä lampaan punasoluja N 9 (SRBC ), joiden määrä oli säädetty 1x10 :ksi millilitras- 25 sa ja 5 jal 0,01 M fosfaattipuskuria (pH = 7,2), johon oli lisätty 0,85 % NaCl ja levylle tehtiin erotus sentri- fugoimalla nopeudella 600 rpm viisi minuuttia. Sitten levy

N

käännettiin ja reagoimaton SRBC poistettiin. Lisättiin värjäysliuosta (Brilliant Cresyl Blue, valmistaja Merck & 30 Co.) lymfosyyttien värjäämiseksi ja tutkittiin rusetin muodostusta. Tuloksena havaittiin, että vähintään 98 % soluista on rusetin muodostuspositiivisia (T-soluja).

Koe-esimerkki 2

Spesifinen syöpäsolujen tappamisaktiivisuus 35 (a) Taulukon 1 mukaisista soluista kohteina toimi vina ihmisen syöpäsoluina käytettiin seuraavaa viittä solu-kantaa, joilla on erilainen GRA-positiivisuus.

25 77157

Kohteena olevat syöpäsolut: nro 1 BT-1 (Burkittin imukudoskasvain) nro 2 Daudi (Burkittin imukudoskasvain) nro 3 Kato-III (vatsasyöpä) 5 nro 4 MKN-45 (vatsasyöpä) nro 5 MOLT (T-solu-leukemia)

Mikrolevylle (valmistaja Falcon Corp.) laminoitiin 4 kohteena olevia syöpäsoluja 5 x 10 syvennystä kohden sentri-fugoimalla nopeudella 800 rpm viisi minuuttia. Sitten li- 3 10 sättiin syvennystä kohden 4 x 10 esimerkin 1 mukaista GRA- 1-K-T:a varovasti ja inkuboitiin yksi tunti.

Tappamisaktiivisuus määritettiin täplien muodostu-misasteen perusteella seuraavaa asteikkoa käyttäen: ++ Selvästi havaittava tappamisaktiivisuus 15 + Havaittavissa oleva tappamisaktiivisuus ± Heikosti havaittava tappamisaktiivisuus - Tappamisaktiivisuutta ei havaittavissa Vertailuryhmänä käytettiin herkistämättömiä ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyttejä, jotka oli preparoitu esi-* 20 merkin 1 mukaisesti, mutta käyttämättä GRA:a. Tulokset ovat taulukossa 6.

Taulukossa 6 ilmenee, että keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla tappaja-T-soluilla on voimakas GRA-spesifinen sytotoksinen vaikutus.

25 Taulukko 6

Kohde-syöpäsolu GRA-positii- Täplien muodostus ... visuus (%) .-X GRA-l-K- DAUDI (kuv. 1) 93,1 ++ (kuv. 2) T-ryhmä KATO-III (kuv. 3) 57,3 + (kuv. 4) 30 BT-1 (kuv. 5) 50,1 ++ (kuv. 6) MKN-45 (kuv. 7) 1,0 ± (kuv. 8) MOLT (kuv. 9) 0,6 - (kuv. 10)

Vertailu- BT-1 50,1 - (kuv. 11) ryhmä 35 (b) Samoja kohde-syöpäsoluja kuin käytettiin (a):ssa, (3,2 - 10^) sekoitettiin GRA-1-K-T:een (8 x 10^) (solusuh-de: 5/1) ja saatua soluseosta (kokonaislukumäärä: 4 x 10^) 26 7 7 1 57 kasvatettiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 15 % FCS:a. Tunnin kuluttua laskettiin jäljellä olevien solujen lukumäärä ja prosentuaalinen sytotoksisuus seuraavalla kaavalla.

solujen lukumäärä c . . . . kasvatuksen jälkeen v lnn.

5 sytotoksisuus (%) = (1 - soiujen lukumäärä x 100) ennen kasvatusta (4 x 106)

Tulokset ovat taulukossa 7.

Taulukko 7 10 Solujen lukumäärä

Kohdesolu Ennen Viljelyn Sytotoksisuus (%) viljelyä jälkeen

Daudi 4 x 10® 2,0x10® 28 KATO-III 4 x 106 3,7 x 106 7,5 15 BT-1 4 x 106 3,2 x 106 20 MKN-45 4 x 106 3,9 x 106 2,5 MOLT 4 x 10® 4,2 x 10® -5 (c) Meneteltiin kuten (b):ssa, mutta sekoitussuhde GRA-l-K-T/kohde-syöpäsolut muutettiin 5/3:ksi. Tulokset 20 ovat taulukossa 8.

Taulukko 8

Solujen lukumäärä

Kohdesolu Ennen Viljelyn Sytotoksisuus (%) viljelyä jälkeen 25 Daudi 4 x 10® 3,6 x 105 91 KATO-III 4 x 10® 3,6 x 10® 24 BT-1 4 x 10® 1,4 x 10® 65 MKN-45 4 x 10® 3,7 x 10® 7,2 MOLT 4 x 10® 4,1 x 10® -3

30 Yllä olevassa kokeessa havaitaan, että GRA-l-K-T

sitoutuu hyvin aktiivisesti Daudi'in, KATO-IIIreen ja BT-1reen, mutta vain heikosti MKN-45reen ja MOLTreen. Koe-esimerkki 3

Spontaanisti esiintyvää rintasyöpää sairastaville 35 C3H/He-hiirille annettiin ihon alle esimerkin 2 mukaista GRA-M-l-K-T:a annoksena 3 x 10®/0,3 ml/hiiri kolmesti vii- 27 7 7 1 57 kossa joka toinen päivä. Kymmenen päivän kuluttua pesäke irrotettiin ja tutkittiin.

Kuten kuviosta 12 ilmenee, tapahtui lymfosyyttien imeytymistä syöpäsoluihin ja oli havaittavissa kasvaimen 5 pinta-alan pienenemistä. Kuviosta 13 havaitaan, että kasvaimen alueella tapahtui kovettumista ja siten on havaittavissa, että keksinnön mukaisilla tappajasoluilla on kasvainten vastainen vaikutus.

Vertailuesimerkki 1 10 Tässä esimerkissä käytettiin syöpäsoluja per se spesifisinä antigeeneinä GRA:n sijasta keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Syöpäsoluherkistettyjä lymfosyyttejä saatiin esimerkin 1 mukaisesti, paitsi että käytettiin GRA:n sijasta 15 BT-l:a, Daudi'a, KAT0-II:a tai MKN-45:a määrinä 1 x 10^/ ; laboratoriomalja.

: ·; Näiden lymfosyyttien sytotoksinen aktiivisuus tut- kittiin koe-esimerkin 2 ((a)) mukaisesti. Tulokset ovat taulukossa 9.

20 Taulukossa 9 on havaittavissa, että yllä mainitulla tavalla valmistetuilla lymfosyyteillä ei ole minkäänlaista sytotoksista vaikutusta.

Taulukko 9

Lymfosyyttien herkistämisessä 25 käytettävät solut

Kohdesolu BT-1 Daudi KATO-III MKN-45 . BT-1 -

Daudi - KATO-III - 30 MKN-45 -

Koe-esimerkki 4

Koe-esimerkin 2-(b) mukaisesti määritettiin esimerkin 4 mukaisesti valmistettujen GRA-8-K-T:n, GRA-3-A-K-T:n ja GRA-3-C-K-T:n syöpäsoluja tappava vaikutus. Tulokset 35 ovat taulukossa 10.

Taulukko 10 28 771 57

Sytotoksisuus (%)

Kohdesolu GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GRA-3-C-K-T

KATO-III 8,0 5,0 5,0 5 BT-1 4,3 5,0 4,0 MKN-45 20 5,0 20 MOLT 000 (a) Kunkin esimerkin 6 mukaisesti saadun tappajasi 10 soiuvalmisteen sytotoksisuus määritettiin Cr-vapautus-kokeella /J. Immunol. 122 (1979) 2527-2533/. S.O. 50 ,uCi radioaktiivista Cr:a (Japan Isotope Association) lisättiin KATO-III:een (2 x 10^) ja soluja inkuboitiin 37°C:ssa yksi tunti RPMI-1640-alustassa ja pestiin sen jälkeen

e -I

15 sentrifugoimalla, jolloin saatiin Cr-merkittyjä kohde- g soluja. Tappajasolut (vaikuttajasolut) (2 x 10 ) lisättiin c kohdesoluihin (1 x 10 ) (siten vaikuttajasolu/kohdesolu-suhde = 20/1) ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa neljä tuntia RPMI-1640-alustassa. Supernatantti kerättiin sentrifu-ZU goimalla ja sen radioaktiivisuus määritettiin nestetuike-laskimella.

Ominais-^Cr-vapautus (%) , joka vastaa vaikuttaja-solujen sytotoksista aktiivisuutta, laskettiin seuraavalla yhtälöllä.

51 25 Ominais- Cr-vapautus (%) (vapautus kokeessa) - (spontaani vapautus) χ (maksimivapautus) - (spontaani vapautus) (Maksimivapautus on radioaktiivisuus silloin, kun kaikki so-30 lut hajoavat.)

Tulokset ovat taulukossa 11.

51

Taulukko 11 77157 29

Tappajasolu Ominais- Cr- vapautus (%) GRA-l-K-T-1 13 5 GRA-l-K-T-2 25 GRA-l-K-T-3 22 GRA-l-K-T-4 20 GRA-l-K-T-5 22 GRA-l-K-T-6 25 10 GRA-l-K-T-7 27 GRA-l-K-T-8 32

Taulukon 11 antamista tuloksista on havaittavissa, että TCGF:lla ja FCS:lla ei ole vaikutusta tappajasolujen induktioon.

15 (b) Esimerkin 3 mukaisesti saadun GRA-2-K-T:n sytotok- - 51 : sisuus määritettiin Cr-vapautuskokeella samalla tavalla kuin (a) :ssa yllä. Havaittiin ominais-^Cr-vapautus 14,3 % • · 51 käytettäessä kohdesoluina Cr-merkittyjä KATO-III:a (vai kutta jasolu/kohdesolusuhde = 20/1).

20 Koe-eslmerkki 6 (a) Käyttäen KATO-III (vaikuttajasolu/kohdesolu-suh-de = 20/1) kohdesoluna määritettiin esimerkin 7-(a) mukaisesti saatujen tappajasolujen sytotoksisuus samalla tavalla kuin koe-esimerkissä 2-(b).

25 Tulokset ovat taulukossa 12.

Taulukko 12

Tappajasoluja Sytotoksisuus (%) GRA-3-K-T-1 38,0 GRA-3-K-T-2 18,2 30 GRA-3-K-T-3 20,9 GRA-3-K-T-4 23,2 GRA-3-K-T-5 24,5 GRA-3-K-T-6 20,2 (b) Esimerkin 7-(b) mukaisesti saadun GRA-3-K-T-7:n 35 sytotoksisuus määritettiin käyttäen ^Cr-KATO-III :a (vaikutta jasolu/kohdesolu-suhde = 20/1) kohdesoluna samalla ta- 51 valla kuin koe-esimerkissä 5. Tappajasolun ominais- Cr-vapautus oli 25,5 %.

77157 30

Koe-esimerkki 7

Esimerkin 5 mukaisesti saatujen tappajasolujen syto- toksisuus määritettiin ~^Cr-vapautuskokeella samalla ta- 51 valla kuin koe-esimerkissä 5. Kohdesoluna käytettiin -Cr-5 merkittyä X5563-solua. GRA-M-5:n sijasta käytettiin ver- tailunäytteenä lymfosyyttejä, jotka oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 5, mutta tekemällä pernasolujen herkis-tys mitomysiini C-käsitellyillä X5563-soluilla (1 x 10^/ syvennys) /5 x 10^/ml X5563-soluja käsiteltiin mitomysiini 10 C:lla (50 ^ug/ml) 60 minuuttia/.

Saadut tulokset ovat taulukossa 13.

Taulukko 13 51

Ominais- Cr-vapautus (%)

Tappajasolu E/T ratio 15 40:1 20:1 10:1 GRA-M-5-K-T-1 12,7 6,3 5,7 GRA-M-5-K-T-2 18,4 20,6 13,7

Vertailu 0,0 0,0 0,0

Koe-esimerkki 8 (H-2-tutkimus) 20 Referenssiesimerkin 2 mukaisesti saaduista GRA-M-1, GRA-M-3 ja GRA-M-4 tehtiin laimennussarja PBS:ään (0,85 % NaCl) näytteiden valmistamiseksi.

Anti-H-2-seerumi (National Institute of Geneteic Reserach) ja yllä mainittu näyte sekoitettiin ja inkuboi-25 tiin 4°C:ssa kaksi tuntia ja lisättiin käytettyä anti-H-2-seerumia vastaava kohdesolu. Kohdesoluna käytettiin perna-solua tai immusolmukesolua, jotka oli saatu BIO (H-2°) ja ]r

Bl0*Br (h-2 ) -hiiristä tavanomaisella menetelmällä. Kun solut oli pesty PBS:llä, lisättiin täydennysainetta (ka-30 niini) soluihin ja niitä inkuboitiin 37°C:ssa yksi tunti ja värjättiin 0,2 % trypaanisininen-PBS:llä prosentuaalisen sytotoksisuuden määrittämiseksi GRA:n poissaollessa.

GRA:n aiheuttama estovaikutus määritettiin taulukon 14 mukaisille systeemeille.

31 77157

Taulukko 14 GRA Anti-H-2-seerumi, pitoisuus Kohdesolut GRA-M-l D-23 (anti-H-2Kk), X80 B10BR (H-2k)-pernaso- tai lut 5 D-23 (anti-H-2Dk), X300 GRA-M-3 D-33 (anti-H-2Kb)f X600 BIO (H-2b)-pernasolut tai D-2 (anti-H-2Db), X80 GRA-M-4 D-23 X80 B10‘BR (h-2k)-imusol- 10 tai mukesolut D-32 X300

Tulokset ovat taulukossa 15.

Taulukko 15

Sytotoksisuus (%) 15 GRA Anti-H-2- Näytteen laimennus seerumi X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 O x I - - 13 14 12 13 14 13 14 13 14 13 D-23 - 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14 D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 20 li - - 19 15 14 12 15 12 11 12 13 14 D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15 D-2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17 III D-23 100 100 100 100 - - - - - 100 10 D-32 99 99 99 99 - - - - - 99 10 :.V 25 Huom: GRA I: GRA-M-l GRA II: GRA-M-3 GRA III: GRA-M-4 "x": sytotoksisuus (%) pelkällä komplementilla 30 Taulukon 15 esittämistä tuloksista on havaittavissa, että GRA-M-l:lta, GRA-M-3:lta ja GRA-M-4:lta puuttuu H-2. Koe-eslmerkki 9 C57BL/6-hiirille siirrettiin ihon alle LLC:a (2 x 10^), joka oli peräisin samasta kannasta ja kuuden päivän 35 kuluttua annettiin ihon alle referenssiesimerkin 2-(d) mukaista GRA-M-3:a 1 ng (proteiini). Sen jälkeen annettiin samanlainen annos neljänä päivänä kerran päivässä. Viimeistä 32 771 5 7 antokertaa seuraavana päivänä kasvainsolut irrotettiin ja punnittiin. Vertailuryhmänä käytettiin hiiriä, joille annettiin fysiologista suolaliuosta. Kummassakin koeryhmässä oli viisi eläintä.

5 Tuloksena havaittiin kasvaimen keskimääräisen koon olevan vertailuryhmässä noin 500 mg. Ryhmässä, jolle annettiin GRA-M-3:a, kolmella eläimellä kasvain oli kadonnut ja kahdella kasvaimen keskipaino oli noin 100 mg.

Koe-esimerkki 10 10 C57BL/6-hiiret immunisoitiin antamalla ihon alle 1 ng (proteiini) referenssiesimerkin 2-(d) mukaisesti saatua GRA-M-3:a kerran päivässä kolmen päivän ajan ja viidentenä päivänä eläimistä kerättiin pernasolut vaikuttaja-solujen saamiseksi. Valmistettiin seos vaikuttajasoluista 15 ja kohdesoluina toimivista Lewis'in keuhkosyöpäsoluista (LLC) vaikuttajasolu/kohdesolu-suhteen ollessa 50:1 ja osa 5 siitä (1 x 10 ) siirrettiin saman kannan hiireen ja tehtiin Winn-koe . Immunol. 86 (1961) 228-2397·

Saadut tulokset ovat taulukossa 16.

20 Taulukko 16

Vaikutta- Kasvaimen kasvunopeus (%) Kuolleita/ jasolut Päivä Päivä Päivä Päivä Päivä ryhmä 20.

15 17 18 19 20 päivänä A 5,7 5,5 5,7 3,1 1,4 0/10 25 B 21,4 39,5 37,1 55,4 76,8 4/10 C 39,3 65,1 61,7 98,1 96,4 4/10

Huom: Ryhmä A on GRA-M-3-immuunihiiren pernasoluja.

Ryhmä B on normaalin hiiren pernasoluja.

Ryhmä C on pernasoluja, jotka on saatu hiirestä, joi- g 30 le on siirretty LLC:a (1 x 10), 10 päivää siirron jälkeen.

Kasvainten kasvunopeus laskettiin seuraavalla kaavalla .

TA - TN

Kasvainten kasvunopeus (%) = -^- x 100

35 N

jossa TA on polkuanturan paksuus sivusta mitattuna silloin, kun kasvain on siirretty ja TN on normaalin polkuanturan paksuus.

33 771 5 7

Koe-esimerkki 11 C3H/He-hiiri immunisoitiin antamalla 4,5 g (proteiini) GRA-M-4:a (referenssiesimerkki 2-(d)) ja 0,1 ml Freund's Complete Adjuvant'ia risti-häntäluun alueelle. Kahden vii-5 kon kuluttua imusolmukesolut kerättiin tavanomaisesti ja niitä käytettiin vastesoluina määritettäessä GRA-M-4:n aiheuttamaa nopeaa vastetta.

Tätä tarkoitusta varten vastesoluja (4 x 10^) inku-boitiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 15 % FCS:a 10 GRA-M-4:n läsnäollessa viisi vrk. Inkubointijakson 18 vii- 3 3 meisen tunnin aikana lisättiin 1 Ci H-tymidiiniä ( H-TdR) alustaan ja sen imeytyminen soluihin laskettiin.

Tulokset ovat taulukossa 17.

Taulukko 17 • 15 GRA-M-4 Pitoisuus 3H-TdR-imeytyminen S.I.

(ng/ml) (keski-cpm + S.E.)

Vertailu 0 5,302 ί 1,761 0,5 7,903 + 1,290 1,5 : 1 10,076 ± 936 1,9 20 Koe 5 10,686 ± 429 2,0 20 10,615 ± 1,270 2,0 40 8,565 ± 1,419 1,6

Huom: "S.I." on stimulointikerroin koe/vertailu. Koe-esimerkki 12 25 C3H/He-normaalihiiren, esimerkin 5 mukaisesti saatu jen X5563-immuunihiiren ja MH134-immuunihiiren sekä koe-esimerkin 11 mukaisesti saatujen GRA-M-4-immuunihiiren ja GRA-M-5-immuunihiiren viivästynyt hypersensitiivisyys (DTH)-vaste määritettiin polkuanturakokeella (FPR). S.o. GRA-30 tai MMC-käsiteltyjä kasvainsoluja laitettiin takajalan pol-kuanturan ihoon ja polkuanturan paisuminen määritettiin 24 tunnin käsittelyn jälkeen. DTH-vasteen aste laskettiin vähentämällä ennen käsittelyä esiintynyt paisuminen käsit- _2 telyn jälkeisestä (lo mm).

35 Saadut tulokset ovat taulukoissa 18-22.

Taulukko 18 34 771 57 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm)

Ryhmä Normaalihiiri MH134-immuunihiiri 1 2,8 13,6 5 2 12,4 32,0 3 3,6 3,6 4 3,2 22,0 5 6,8 27,6

Huom: Ryhmä 1; normaaleja pernasoluja 1 x 10^/20 ^,ul alus-10 taa (Hank'in liuos)

Ryhmä 2; MH134-soluja 1 x 10^/20 ^ul alustaa Ryhmä 3; 20 ^ul alustaa

Ryhmä 4; GRA-M-4, 0,8 g (proteiini)/20^,ul alustaa Ryhmä 5; GRA-M-4, 0,4 g (proteiini)/20^,ul alustaa 15 Taulukko 19 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm)

Ryhmä Normaalihiiri X5563-immuunihiiri MH132-immuunihiiri 1 5,4 4,3 1,1 2 0,9 - 24,3 20 3 2,0 16,9

Huom: Ryhmä 1; 20 ^ul alustaa (Hanki1in liuos)

Ryhmä 2; GRA-M-4, 4 ^ug (proteiini)/20 ^ul alustaa

Ryhmä 3; GRA-M-5, 4 ^,ug (proteiini)/20 ^ul alustaa

Taulukko 20 _2 25 Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm)

Ryhmä Normaalihiiri GRA-M-4, Immuunihiiri 1 1,7 -0,3 2 5,1 24,6

Huom: Ryhmä 1; 20 ^ul alustaa (Hank1in liuos) 30 Ryhmä 2; GRA-M-4, 4 ^,ug (proteiini)/20 ^ul väliainetta

Taulukko 21 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm) Ryhmä Normaalihiiri GRA-M-4, Immuunihiiri 1 -1,8 0,6 35 2 6,3 20,0 3 6,8 6,3 35 771 57

Huom: Ryhmä 1; 20 jil alustaa (Hank'in liuosta)

Ryhmä 2; GRA-M-4, 4 ^uq (proteiini)/20 ^ul alustaa Ryhmä 3; fraktiota, joka kulki PNA-kolonnin läpi samanaikaisesti GRA-M-4:n kanssa (tästedes 5 "C.P."), 4 ^,ug (proteiini)/20 ^ul alustaa

Taulukko 22 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm) Ryhmä Normaalihiiri GRA-M-4, Immuunihiiri 1 2,4 -1,0 10 2 2,6 17,7 3 2,4 1,8 4 5,5 18,9

Huom: Ryhmä 1; 20 jil alustaa (Hank* in liuosta)

Ryhmä 2; GRA-M-4, 3,8 ^,ug (proteiini)/20 ^ul alustaa 15 Ryhmä 3; mainittua "C.P.":a, 3,8 yug (proteiini)/20 ^ul : alustaa

Ryhmä 4; 3,8 ^ug (proteiini) GRA-M-4 ja 3,8 ^ug (proteiini) "C.P.":a/20 ^ul alustaa Referenssikoe 20 X5563-hiiret saatiin samalla tavalla kuin esimerkis sä 5 . Tämän immuunihiiren pernasoluja käytettiin vaikutta- 7 jasoluina ja vaikuttajasolut (10 ) ja kohdesolut (X5563, 10^) siirrettiin yhdessä saman kannan hiireen. Tehtiin Winn-koe koe-esimerkin 10 mukaisesti.

25 Tulokset ovat kuviossa 23, jossa abskissa on päiviä ja oordinaatta kasvaimen keskim. koko (cm ) ί S.E. ja jossa merkinnät tarkoittavat seuraavaa: •-·: Ryhmä, johon ei lisätty vaikuttajasoluja.

o-o: Ryhmä, johon lisättiin käsittelemättömiä vaikuttaja- 30 soluja.

Δ-Δ: Ryhmä, johon lisättiin kanin komplementilla käsiteltyjä vaikuttajasoluja.

x-x: Ryhmä, johon lisättiin anti-Thy 1:11a (New England

Nuclear Co., USA) ja kanin komplementilla käsi-35 teltyjä vaikuttajasoluja.

O-O: Ryhmä, johon lisättiin anti-Lyt 1:11a (New England

Nuclear Co., USA) ja kanin komplementilla käsiteltyjä vaikuttajasoluja.

36 7 7 1 57 -: Ryhmä, johon lisättiin anti-Lyt 2:11a (New England

Nuclear Co., USA) ja kanin komplementilla käsiteltyjä vaikuttajasoluja.

Kuvion 23 esittämistä tuloksista ilmenee, että Lyt-1-5 tyypin T-solut ovat tärkeässä asemassa in vivo vaikuttaja- solujen toimintamekanismissa kasvainten suhteen immunisoitaessa.

Lisäksi on tunnettua, että DTH-vaste välittyy Lyt-1-solujen kautta /J.Exp. Med. 143 (1976) 1534-39/.

Claims (7)

37 771 5 7

1. Menetelmä glykosidonnaisen antigeenin valmistamiseksi, joka on eristetty ihmis- tai eläinsyöpäsolumem- 5 braanin aineosasta ja joka liittyy lektiiniin, joka sitoutuu pääteasemassa olevaan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin# tunnet-t u siitä, että ihmis- tai eläinsyöpäsolujen solumembraa-nin aineosat saadaan homogenoimalla tai liuottamalla, so-10 lumembraanin aineosat käsitellään lektiinillä, joka spesifisesti sitoutuu pääteasemassa olevaan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin muodostaenlektiini-solumembraaniaineosakompleksin ja eristetään lektiiniin sitoutunut glykosidonnainen antigeeni : 15 ja siitä glykosidonnainen antigeeni.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, : : tunnettu siitä, että syöpäsolun membraanin aine- osa on ihmisen syöpäsolun membraanin aineosa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että lektiini on maapähkinälektii-ni.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lektiini on Dolichos-papu-agglutiniini.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykosidonnaista antigeeniä eristetään ihmisen syöpäsolun membraanin aineosasta ensin ensimmäisellä lektiinillä, joka liittyy spesifisesti pääteasemassa olevaan galaktoosiin ja sitten toisella lek-30 tiinillä, joka liittyy spesifisesti pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen lektiini on maa-pähkinälektiini ja toinen lektiini on Dolichos-papu-agglu-35 tiniini. 38 771 5 7

7. Menetelmä syöpäsoluille myrkyllisten lymfosyyttien valmistamiseksi, jotka ovat spesifisiä glykosidonnais-ta antigeeniä vastaan, joka on eristetty ihmis- tai eläin-syöpäsolumembraanin aineosasta ja joka liittyy lektiiniin, 5 joka sitoutuu pääteasemassa olevaan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin, tunnettu siitä, että ihmisen tai eläimen lymfosyyttejä herkistetään kasvattamalla niitä 1-10 vuorokautta tavanomaisessa ravintoalustassa, joka lisäksi sisältää Ι-ΙΟ 1000 ng/ml jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisella menetelmällä valmistettua glykosidonnaista antigeeniä, laskettuna sokerimääränä 1·106 lymfosyyttiä kohti millilit-rassa. 77157