FR2522267A1 - Glycoproteines a activite antitumorale, leur procede de preparation et leur application therapeutique - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST RELATIVE A DES GLYCOPROTEINES CB PRODUITES A PARTIR D'ANIMAUX A SANG CHAUD, QUI ONT UNE ACTIVITE ANTITUMORALE. CES SUBSTANCES SONT UTILISABLES COMME AGENT THERAPEUTIQUE.

Description

La présente invention est relative à de nouvelles glycoprotéines obtenues

part E-r'un extrait ou liquide

surnageant d'un milieu de culture de cellules réticulo-

endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud, à leur procédé de préparation ainsi qu'à des agents thérapeutiques pour tumeurs malignes qui contiennent, à titre de principe

actif, une ou plusieurs de ces glycoprotéines.

On ne connaît pas de thérapeutique parfaite pour agir sur les tumeurs et malgré le fait que de nombreux agents thérapeutiques anti-tumoraux aient été mis au point à ce jour par un certain nombre de chercheurs dans le monde, de nombreuses tentatives ont été éffectudes en clinique

pour utiliser de nouveaux agents thérapeutiques et traite-

ments à base d'associations de plusieurs agents.

Les agents thérapeutiques anti-tumoraux sont grossiè-

rement classés en deux catégories: les agents chimiothé-

rapeutiques et les agents immunothérapeutiques Comme les

agents chimiothérapeutiques, également connus comme subs-

tances cytotoxiques, manifestent leurs effets en supprimant non spécifiquement le développement cellulaire et, de ce

fait, sont toxiques non seulement pour les cellules tumo-

rales mais également pour les cellules normales, et pro-

voquent de graves réactions nuisibles comme la leucopénie,

la stérilité féminine, l'alopécie, le tératisme, les néo-

plasmes malins, etc il s'ensuit que la posologie est

strictement limitée D'autre part, comme les agents immuno-

thérapeutiques manifestent leur effet thérapeutique eninhi-

bant indirectement la croissance des tumeurs en agissant

sur les fonctions biophylactiques et non en inhibant di-

rectement la croissance des cellules tumorales, ils pré-

sentent, par comparaison avec les agents chimiothérapeuti-

ques, un bien moindre risque d'entraîner de graves réac-

tions nuisibles Toutefois, les malades présentant des tumeurs ne conservent souvent pas suffisamment de fonctions biophylactiques et, de ce fait, l'effet thérapeutique des

agents immunothérapeutiques n'est pas toujours aussi satis-

faisant que celui des agents chimiothérapeutiques.

La Demanderesse a pensé-que-es cellules réticulo-

endothéliales qui jouent un rôle important dans les fonc-

tions biophylactiques produisent une substance efficace pour le traitement des tumeurs, et ont cherché cette substance.

Plusieurs facteurs considérés comme des agents théra-

peutiques prometteurs pour les tumeurs, par exemple, la Lymphotoxine, le TNF (Tumor Necrosis Factor), l'Interférn,

etc ont été obtenus à partir de cellules réticulo-endo-

théliales, comme rapporté par Granger, G A et al, Cellu-

lar Immunology, Vol 38, 338-402 ( 1978), Carswell, E A.

et al, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol 72, 3666-

33670 ( 1975), et Isaacs, A et al, Proc Roy Soc Ser.

B, Vol 147, 268 ( 1975), respectivement En outre, la Demanderesse a récemment découvert un procédé simple pour isoler une quantité importante de "Carcino-Breaking Factor" (dit ci-après CBF) sous la forme d'un mélange contenant les agents précités: Lymphotoxine, TNF, etc, à partir d'une culture de lymphoblastes qu'on a fait croître chez des hamsters dont la réponse immune a été supprimée, et a

rapporté que ce CBF est efficace sur les tumeurs expéri-

mentales transplantées sur un animal (The Yomiuri, édition

du matin, 22 Novembre 1981).

Au cours des recherches effectuées sur le CBF, la

Demanderesse a découvert que des glycoprotéines qui diffè-

rent des facteurs cytotoxiques précités comme la Lymphoto-

xine, le TNF, ls CBF, etc sont présentes dans un extrait ou liquide surnageant d'un milieu de culture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud, et caractérisées par un effet cytotoxique très puissant et sélectif sur les cellules tumorales, et la Demanderesse a mis au point plusieurs modes opératoires permettant de

produire ces glycoprotéines sans difficultés.

La présente invention a pour buts: de fournir de nouvelles glycoprotéines ayant une activité antitumorale; de fournir des glycoprotéines ayant une activité anti-tumorale, qui sont récoltées à partir d'un extrait ou liquide surnageant d'un milieu de culture de cellules réticuloendothéliales, de lymphoblastes, de cellules leu- cémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud;

de fournir un procédé de préparation de glycoprotéi-

nes anti-tumorales, à partir d'un extrait ou liquide sur-

nageant d'un milieu de culture de cellules réticulo-endo-

théliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud; de fournir des agents thérapeutiques pour tumeurs,

qui contiennent, à titre de principe actif, une ou plusi-

eurs de ces glycoprotéines anti-tumorales.

Il s'ensuit que l'invention est relative à une glyco-

protéine ayant les propriétés suivantes: a) masse m Dléculaire: de 7 000 à 90 000 par électrophorèse sur gel SDS ou filtration sur gel Sephadex; b) réactions colorées: présente une couleur

indiquant des protéines dans la réaction de Lowry; présen-

te une couleur indiquant des liaisons peptide et des amino-

acides dans la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et présente une couleur indiquant

la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfu-

rique, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réaction

indole-acide sulfurique et dans la réaction tryptophane-

acide sulfurique; c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau,le chlorure de sodium aqueux et le tampon phosphate et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; d) la teneur en sucres est de 8 à 45 %, teneur dans laquelle de 6 à 28 % des sucres totaux sont des hexoses, de 1 à 11 % sont des hexosamines et de 1 à 6 % sont des acides sialiques; e) stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 40 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 600 C pendant 3 heures ou plus; et f) elle endommage sélectivement les cellules tumorales

sans sensiblement endommager les cellules normales.

la Fig 1 est un spectre IR de C Bx mesuré dans l'exem-

ple 10;

la Fig 2 est un spectree -'ae C Bxi mesuré dans l'exem-

ple 15; la Fig 3 est un spectre IR de C Bx 2 mesuré dans l'exem- ple 21;

la Fig 4 est un spectre IR de C Bx 3 mesuré dans l'exem-

ple 29.

Comme les glycoprotéines suivant l'invention peuvent

être divisées en quatre fractions présentant des différen-

ces de masse moléculaire et de teneur en sucre, ces gly-

coprotéines sont classées d'après la différence de masse

moléculaire, dans toute la présente description; une frac-

tion ayant une masse moléculaire de 12 000 à 17 000 est

dite Carcino-Breaker X (ci-après désignée C Bx), une frac-

tion ayant une masse moléculaire de 70 000 à 90 000 est dite C Bxl, une fraction ayant une masse moléculaire de 40.000 à 50 000 est dite CBX 2 et une fraction ayant une masse moléculaire de 7 000 à 9 000 est dite C Bx 3 Lorsqu'on considère l'ensemble des fractions CBX, CBX 1, CBX 2 et C Bx 3

on désigne l'ensemble d'une façon générale par "CB".

Les propriétés physiques, chimiques et biologiques

des glycoprotéines suivant l'invention sont décrites ci-

dessous de façon plus détaillée.

C Bx

a) Masse moléculaire: Lorsqu'elle est mesurée par fil-

tration sur gel en utilisant Sephadex G-100 (Pharmacia Co) et un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2) comme solvant, la masse moléculaire est de 12 000 à 17 000

b) Réactions colorées: Les résultats des tests effec-

tués sur solution aqueuse de CBX, pour les réactions colo-

rées, sont indiqués au tableau 1-1 La réaction de Lowry et la réaction à la ninhydrine sont effectuées suivant les modes opératoires décrits dans Seikagaku Jikken Koza, Vol. 1, Quantitative Method of Proteins, 1971 La réaction

phénol-acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfu-

rique, la réaction naphtol-acide sulfurique, la réaction indole-acide sulfurique et la réaction tryptophane-acide sulfurique sont effectuées suivant les modes opératoires décrits dans Seikagaku Jikken Koza, Vol 4, Quantitative

Method of Sugars, 1971 Et la réaction de Holff est effec-

tuée suivant le mode opératoire décrit dans Seikagaku Jikken Kofza, Vol 3, Quantitative Method of Lipids, 1971.

TABLEAU 1-1

Comme le montre le tableau 1-1, CBX présente des colo-

rations indiquant des protéines et des sucres, mais ne

présente pas de coloration indiquant des lipides.

c) Aspect et solubilité: Poudre blanche, soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et tampon phosphate,

et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chlorcforme.

d) Teneur en sucre: Suivant le protocole opératoire de Spiro (Spiro, H A, Methods in Enzymology, Vol 8, 3-26 ( 1966)), la teneur en sucre de CBX est de 27 à 33 %

se décomposant en 17 à 20 % d'hexoses, de 5 à 7 % d'hexosami-

nes et 5 à 6 % d'acides sialiques.

e) Point isoélectrique: Lorsqu'il est mesuré par électrofocalisation sur Ampholine, son point isoélectrique

est de 4,2 à 7,3.

f) Adsorbable sur Sephadex associé à Ulex europeus

agglutinine dans un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2).

g) Stable du point de vue masse moléculaire par fil-

tration sur gel et du point de vue activité cytotoxique sur cellules tumorales dans une solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et dans

une solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus.

Réaction colorée Coloration Indication Lowry Bleu Liaisons peptide Ninhydrine Bleu pourpre Aminoacides Phénol-acide sulfurique Marron Sucres Anthrone-acide sulfurique Bleu verdâtre Sucres -Naphtol-acide sulfurique Pourpre Sucres Indole-acide sulfuriqueMarron Sucres Tryptophane-acide sulfurique Marrn poupre Sucres Holff Incolore Pas de lipides h) Il endommage sélectivement les cellules tumorales

sans sensiblement endommager les cellules normales.

On a mesuré la cytotoxicité de CBX en cultivant 10 cellules tunorales ou normale S-cdns"f/Z'ml d'un milieu en présence de cette substance à 37 C pendant 48 heures dans une atmos- phère contenant 5 % de C 02 et 95 % d'air, et en comptant le nombre de cellules viables non colorées par le Trypan Blue, la cytotoxicité étant exprimée par la concentration

à laquelle l'augnentaticn du nombre des cellules est inhibée à 50 %.

lhe unité CB est définie cormmoe étant la quantité de la substance à laquelle la croissance de 105 cellules KB est inhibée de %.

i) Il induit une différenciation des cellules tumora-

les, c'est-à-dire qu'il permet d'obtenir le rapport de

cellules tumorales à cellules normales dans un test effec-

tué suivant le protocole opératoire de Hozumi et al (Hozu-

mi, et al, Cancer Research, Vol 40, 2919-2924 ( 1980))

utilisant des cellules de leucémie myélogène M-1.

C Bx 1

a) Masse moléculaire: Lorsqu'elle est mesurée par fil-

tration sur gel en utilisant Sephadex G-100 et un tampon

phosphate 0,01 M (p H 7,2) comme solvant, la masse molécu-

laire est de 70 000 à 90 000

b) Réactions colorées: Les résultats des tests effec-

tués sur solution aqueuse de C Bx 1 pour les réactions colo-

rées sont rapportés au tableau 1-2.

TABLEAU 1-2

Réactions colorées Coloration Indication Lowry Bleu Liaisons peptide Ninhydrine Bleu pourpre Aminoacides Phénol-acide sulfurique Marron Sucres Anthrone-acide sulfurique Bleu verdâtre Sucres t-Naphtol-acide sulfurique Pourpre Sucres Indole-acide sulfurique Marron Sucres Tryptophane-acide sulfurique Marron pourpre Sucres Holff Incolore Pas de lipides Comme le montre le tableau ci-dessus, C Bxi présente des colorations indiquant la présence de protéines et de sucres, mais ne présente pas de coloration indiquant la

présence de lipides.

c) Aspect et solubilité: Poudre blanche, soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate

et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme.

d) Teneur en sucre: Suivant le mode opératoire de

Spiro, la teneur en sucres de C Bxl est de 35 à 45 %, répar-

tis en 23 à 28 % d'hexoses, 8 à 11 % d'hexosamines et 4 à 6 %

d'acides sialiques.

e) Point isoélectrique: Lorsqu'il est mesuré par iso-

électrofocalisation sur Ampholine, son point isoélectrique

est de 4,3 à 6,2.

f) Adsorbable sur Sephadex associé à Ulex europeus

agglutinine dans un tampon pnosphate 0,01 M (p H 7,2).

g) Stable du point de vue masse moléculaire par fil-

tration sur gel, et du point de vue activité cytotoxique sur cellules tumorales dans une solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et dans une solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus. h) Il endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les cellules normales La cytotoxicité de C Bxl a été mesurée en faisant appel aux

modes opératoires décrits à propos de C Bx.

CBX 2 a) Masse moléculaire: Lorsqu'elle est mesurée par

filtration sur gel en utilisant Sephadex G-100 et un tam-

pon phosphate 0,01 M (p H 7,2) comme solvant, la masse molé-

culaire est de 40 000 à 50 000.

b) Réactions colorées: Les résultats des tests effec-

tués sur C Bx 2 en solution aqueuse pour les réactions colo-

rées sont rapportés au tableau 1-3.

TABLEAU 1-3

Réactions colorées Colorations Indications Lowry Bleu Liaisons Ninhydrine Bleu pourpre Aminoacides i Phénol-acide sulfurique Marron Sucres Anthroneacide sulfurique Bleu verdâtre Sucres c-Naphtol-acide sulfurique Pourpre Sucres Indole-acide sulfurique Marron Sucres Tryptophane-acide sulfurique Marron pourpre Sucres Holff Incolore Pas de lipides Comme le montre le tableau ci-dessus, C Bx 2 présente des colorations indiquant la présence de protéines et de sucres, mais ne présente pas de coloration indiquant la

présence de lipides.

c) Aspect et solubilité: Poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate,

et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme.

d) Teneur en sucres: Suivant le protocole opératoire

de Spiro, la teneur en sucres de C Bx 2 est de 30 à 37 %, ré-

partis en 20 à 23 % d'hexoses, 6 à 8 % d'hexosamines et 4 à

6 % d'acides sialiques.

e) Point isoélectrique: Lorsqu'il est mesuré par iso-

électrofocalisation sur Ampholine, son point isoélectrique

est de 4,2 à 7,3.

f) Adsorbable sur Sephadex associé à Ulex europeus

agglutinine dans un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2).

g) Stable du point de vue masse moléculaire par fil-

tration sur gel et du point de vue activité cytotoxique sur cellules tumorales en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en

solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus.

h) Il endommage sélectivement les cellules tumorales

sans sensiblement endommager les cellules normales La cy-

totoxicité de C Bx 2 a été mesurée en faisant appel aux mo-

des opératoires décrits à propos de C Bx.

C Bx 3 a) Masse moléculaire: Lorsqu'elle est mesurée par électrophorèse sur gel SDS, la masse moléculaire est de

7 000 à 9 000.

b) Réactions colorées: Les résultats des tests de

réactions colorées sur C Bx 3 en solution aqueuse sont rap-

portés au tableau 1-4.

TABLEAU 1-4

Comme le montre le tableau ci-dessus, C Bx 3 présente des colorations indiquant la présence de protéines et de sucres, mais ne présente pas de coloration indiquant la

présence de lipides.

cl Aspect et solubilité: Poudre blanche, soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate,

et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme.

d) Teneur en sucres: Suivant le protocole opératoire

de Spiro, la teneur en sucres de C Bx 3 est de 8 à 15 %, ré-

partis en 6 à 10 % d'hexoses, 1 à 2 % d'hexosamines et 1 à

3 % d'acides sialiques.

e) Adsorbable sur carboxyméthylcellulose dans une chromatographie d'échange d'ions dans un tampon phosphate

0,05 % (p H 6,4) en utilisant de la carboxyméthylcellulose.

f) Stable du point de vue masse moléculaire par fil-

tration sur gel et du point de vue activité cytotoxique Réactions colorées Colorations Indications Lowry Bleu Liaisons peptide Ninhydrine Bleu pourpre Aminoacides Phénol-acide sulfurique Marron Sucres Anthrone- acide sulfurique Bleu verdâtre Sucres tk-Naphtol-acide sulfurique Pourpre Sucres Indole-acide sulfurique Marron Sucres Tryptophane-acide sulfurique Marron pourpre Sucres Holff Incolore Pas de lipides sur les cellules tumorales dans une solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11 à 4 Cpeffd'nt 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures

ou plus.

g) Il endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les cellules normales La cytotoxicité de CBX 3 a été mesurée en faisant appel aux

protocoles opératoires décrits à propos de CBX.

h) La séquence aminoacide de l'azote terminal de la

portion protéinique est Alanine-Alanine-.

Les glycoprotéines suivant l'invention ont des carac-

téristiques communes en ce qui concerne leurs réactions colorées, leur aspect, leur solubilité, leur stabilité, leur effet sur les cellules tumorales, etc, mais elles diffèrent les unes des autres des points de vue de leur

masse moléculaire et leur teneur en sucres, et c'est pour-

quoi les substances respectives peuvent être distinguées

les unes des autres.

Les glycoprotéines suivant l'invention se distinguent nettement de la Lymphotoxine, du TNF, leurs mélanges, c'est -à-dire CBF, ou Interféron (substances qui sont toutes obtenues à partir de cellules réticuloendothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes)

en ce qui concerne les caractéristiques suivantes et, ain-

si, sont de toute évidence des substances différentes.

Plus particulièrement, on sait que la Lymphotoxine existe sous la forme de trois types différents, suivant sa masse moléculaire, c'est-à-dire: kLymphotoxine ayant une masse moléculaire de 70 000 à 90 000, (Lymphotoxine ayant une masse moléculaire de 35 000 à 50 000, et Lymphotoxine ayant une masse moléculaire de 10 000 à 20 000 (Eds, Cohen

et al, Biology of the Lymphokinase, Academic Press, 1979).

Du point de vue masse moléculaire, C Bx ressemble à la -

Lymphotoxine, C Bx 1 à la k-Lymphotoxine et CBX 2 à la Lymphotoxine Toutefois, comme rapporté par Lucas et al (Lucas, Z J et al, J Immunology, Vol 109,1233 ( 1972), la Lymphotoxine est peu sélective du point de vue cytotoxicité et endommage aussi bien les cellules normales que les cellules

tumorales Au contraire, 'ef-fe-tytotoxique des glycopro-

téines suivant l'invention est sélectif vis-a-vis des cel-

lules tumorales, ce qui les distingue nettement de la Lym-

photoxine En outre, les glycoprotéines suivant l'inven-

tion diffèrent de la Lymphotoxine des points de vue adsor-

babilité et stabilité Plus particulièrement, alors que la Lymphotoxine préparée suivant le procédé de Granger et al

(Granger, G A et al, Cellular Immunology, Vol 38, 388-

402 ( 1978)) n'est pas ou-peu adsorbée sur Sephadex associé à Ulex europeus agglutinine dans un tampon phosphate 0,01 M les glycoprotéines suivant l'invention sont adsorbées sur cette substance Qui plus est, les glycoprotéines suivant l'invention sont stables en solutions aqueuses à p H 2,0, p H 7,0 et p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et sont

également stables à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus.

Au contraire, la Lymphotoxine perd 60 % ou plus de son ac-

tivité au bout de 4 heures à 56 C.

Le Tumor Necrosis Factor (TNF) présente un effet cytotoxique sélectif sur les cellules tumorales et a une masse moléculaire de 33 000 à 63 000 et une teneur en sucre de 0 % (Carswell, E A et al, Proc Natl Acad Sci U S A. Vol 72, 3666-3670 ( 1975)) ou a une masse moléculaire de 39.000 et une teneur en sucres de 40 % (The Nippon Keizai Shimbun, édition de la matinée, 23 août 1981), et les deux

diffèrent de C Bx, C Bxl et C Bx 3 du point de vue masse molé-

culaire, et de CBX 2 du point de vue teneur en sucres.

En outre, CBF, qui contient ces facteurs cytotoxiques en combinaison, a une masse moléculaire d'environ 35 000

(The Nippon Keizai Shimbun, édition de la matinée, 22 no-

vembre 1981) et diffère des glycoprotéines suivant l'inven-

tion du point de vue masse moléculaire.

Enfin, les glycoprotéines suivant l'invention diffè-

rent de l'Interféron en ce que les premières n'ont pas

d'activité antivirale.

On décrira maintenant les cellules utilisées pour

préparer les glycoproétines suivant l'invention.

Les cellules provenant d'animaux à sang chaud (homme, ou autres) utilisables suivant-bti'nvention peuvent être choisies parmi les cellules réticulo-endothéliales, les

lymphoblastes, les cellules leucémiques et les fibroblas-

tes, et peuvent être utilisées soit sous forme de culture

primaire, soit sous forme d'une lignée cellulaire établie.

Il est préférable et plus sûr d'utiliser des cellules d'origine humaine, car elles provoquent moins de réactions induites par l'antigénicité et autres réactions nuisibles du point de vue de l'utilisation de CB dans le traitement de maladies chez l'homme Comme cellulles de ce type,

on peut choisir n'importe quelies cellules parmi, par exem-

ple, les cellules BALL-1, les cellules TALL-1 et les cel-

lules NALL-1 rapportées par Miyoshi (Miyoshi, I, Nature, Vol 267, 843-844 ( 1977)), les cellules Namalwa décrites dans Journal of Clinical Microbiology (J Clin Microbiol,

Vol 1, 116-117 ( 1975)), les cellules M-7002 et les cellu-

les B-7101 décrites dans Journal of Immunology (Vol 113, 1334-1345 ( 1974) ), les cellules Flow 7000 (Flow Co), les cellules JBL, les cellules EBVSa, les cellules EBV-Wa et les cellules EBV-HO décrites dans "The tissue Culture" (Vol 6, 527-546, ( 1980)), des lignées cellulaires établies comme les cellules BALM 2, les cellules CCRF-SB (ATCC CCL

) etc ainsi que les lymphocytes et macrophages hu-

mains, et que les cellules d'une lignée cellulaire établie provenant de lymphocytes et macrophages humains traitées à l'aide de divers virus, médicaments, rayonnements, etc En ce qui concerne les cellules provenant d'animaux à sang chaud autres que l'homme, on peut choisir n'importe quelles cellules parmi, par exemple, les cellules de souris BALB/C 3 T 3 (Flow Co), les cellules leucémiques de souris comme les cellules L 1210 (J Natl Cancer Inst, Vol 13, 1328 ( 1953)) et les cellules P 388 (Scientific Proceesings, Pathologists & Bacteriologists, Vol 33, 603 ( 1957)), les clones M 3 du mélanome de la souris (Flow Co), les cellu Les tumorales de rat LLC-WRC 256 (Flow Co), les cellules RPMI 1846 du mélanome du hamster (Flow Co), et les lymphocytes,

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macrophages, etc Il est bien entendu que les cellules utilisables suivant l'inventio-ne sont pas limitées à

celles décrites ci-dessus.

On décrira maintenant le procédé de préparation des glycoprotéines (CB) suivant l'invention. Le procédé de préparation de CB faisant appel à des

* cellules provenant de l'homme ou animaux à sang chaud au-

tres que l'homme peut être choisi parmi les modes opéra-

toires connus pour la préparation de substances actives à l'aide de cellules, et-le produit peut être récolté

soit directement à partir des cellules, soit après cul-

ture des cellules, ou, si on souhaite obtenir une quantité importante de CB, ces cellules peuvent être exposées à un ou plusieurs inducteurs, Par exeale, les cellules provenant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres que l'homme peuvent

être mises en suspension dans un milieu approprié, direc-

tement exposé à un inducteur, pour obtenir CB qu'on peut

ensuite récolter à partir du milieu.

Comme inducteur pour CB, on peut, d'une façon généra-

le, choisir une ou plusieurs substances parmi les suivan-

tes: les lectines comme la photohémagglutinine, la conca-

navaline A, le mitogène du phylolaque (pokeweed), les ly-

popolysaccharides, les polysaccharides comme le phospho-

mannane, le phosphate de dextrane, les endotoxines, les constituants de cellules microbiennes, les bactéries, les virus, les acides nucléiques, les polynucléotides, etc En outre, pour les cellules sensibilisées par un antigène, l'antigène correspondant sert également d'inducteur pour CB. Le CB ainsi obtenu peut aisément être isolé par des modes de purification connus, par exemple par relargage, filtration, centrifugation, concentration, lyophilisation, etc Si on souhaite une purification plus poussée, on peut

procéder par adsorption et élution sur une résine échan-

geuse d'ions, filtration sur gel, électrophorèse ou chro-

matographie d'affinité en utilisant par exemple du Sephadex

associé à un anticorps ou à Ulex europeus agglutinine.

Si on veut obtenir CB en grosse quantité, on peut faire croître les cellules de L-a lignée cellulaire établie

dans l'organisme d'animaux à sang chaud, comme on va main-

tenant l'expliquer.

Les lignées cellulaires établies provenant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres que l'homme, peuvent

être n'importe quelles cellules choisies parmi les cellu-

les réticulo-endothéliales, les lymphoblastes, les cellules leucémiques et les fibroblastes, et, de préférence, les lignées cellulaires d'origine humaine sont souhaitables et sûres car elles provoquent moins de réactions induites par

antigénicité et autres réactions nuisibles du point de vue.

de l'utilisation de CB dans le traitement des maladies de l'homme Comme lignées cellulaires de ce type, on peut

utiliser n'importe quelles lignées cellulaires, comme pré-

cédemment indiqué, par exemple: des cellules BALL-1, des cellules TALL-1, des cellules NALL-1, des cellules Namalwa, des cellules M-7002, des cellules B-7101, des cellules Flow 7000, des cellules BALB/C 3 T 3, des cellules L 1210, des cellules P 388, des lymphocytes, des macrophages, etc Lorsqu'on veut faire croître ces cellules dans un organisme d'animal à sang chaud, on peut effectuer la transplantation de ces cellules directement ou, comme décrit ci-dessous, indirectement en inoculant une chambre à l'aide de ces cellules et en plaçant la chambre dans l'organisme Les animaux à sang chaud chez lesquels ces cellules sont transplantées peuvent être d'espèce identique

ou différente, tant que la lignée cellulaire établie, pro-

venant de l'homme ou autres animaux à sang chaud peut s'y développer Par exemple, on peut utiliser des volatiles comme les poulets, les pigeons, et des mammifères commeles chiens, les chats, les singes, les chèvres, lesporcs, les chevaux, les bovins, les lapins, les cobayes, les rats,les hamsters, les souris ordinaires, les souris dénudées,

Lorsqu'on transplante sur un de ces animaux des cellu-

les cultivées provenant d'un animal d'espèce différente, i

peut se produire des réactions immunologiques indésirables.

C'est pourquoi il est souhaitable, afin de minimali-

ser la possibilité de votr-se-irpouire des réactions immu-

nologiques, d'utiliser des animaux à l'état le plus imma-

ture possible, par exemple sous forme d'oeufs, de foetus, d'embryons, ou d' onatals, ou d'animaux nouveaux-nés. En outre, les réactions immunologiques peuvent également

être supprimées par des traitements préalables, par exem-

ple en exposant ces animaux à des rayons X de 200 à 600

REM, ou en leur injectant des agents immunosuppresseurs.

Lorsque l'animal à utiliser comme hôte est une souris dénudée de la même espèce que celle des cellules à

transplanter, les réactions immunologiques sont faibles et.

c'est pourquoi ces cellules peuvent être transplantées chez

l'hôte et croître rapidement sans aucun traitement préala-

ble, et il s'ensuit que l'utilisation de ces cellules con-

vient tout particulièrement.

On peut également assurer une croissance constante

des cellules et accroître la quantité de CB produite à par-

tir de celles-ci,en transplantant des cellules d'un animal à sang chaud sur un autre animal à sang chaud, par exemple en transplantant des cellules provenant de sujets humains ou d'animaux à sang chaud autres que l'hommesur des hamsters afin d'assurer leur croissance, puis en retransplantant ces cellules sur des souris dénudées Dans ces cas, la transplantation peut être effectuée entre une même classe ou division ainsi qu'entre une même espèce ou un même genre. Le site sur lequel les cellules d'homme ou d'animaux à sang chaud autres que l'homme doivent être transplantées peut être n'importe quel site sur lequel les cellules transplantées peuvent croitre comme, par exemple, la cavité allantolque, les veines, la cavité abdominale, le tissu sous-cutané.

Au lieu de directement transplanter et de faire croi-

tre des lignées cellulaires établies,provenant d'animaux à

sang chaud comme l'homme ou autres que l'homme, dans l'or-

ganisme d'animaux à sang chaud, n'importe lesquelles des

lignées cellulaires établies précitées peuvent être inocu-

lées et croître dans une chambre de diffusion classique de forme et dimensions variables qui est placée, par exemple, dans la cavité péritonéale de l'organisme d'animaux à sang chaud La chambre de diffusion est conçue de façon à per-

mettre la croissance desdites cellules en facilitant l'ab-

sorption des fluides organiques de l'animal comme éléments nutritifs, la chambre étant également pourvue de membranes filtrantes poreuses, par exemple une membrane filtrante dont les pores ont une dimension d'environ 10-7 à 10 3 m, un dispositif d'ultrafiltration ou des fibres creuses, qui empêche la migration des cellules hors de la chambre et

permet aux humeurs de l'organisme, servant d'éléments nutri-

tifs, de pénétrer dans la chambre.

Si nécessaire, la chambre de diffusion peut être con-

çue et placée, par exemple, sur la surface du corps de l'animal, de façon à faire communiquer le fluide nutritif de la chambre avec les humeurs organiques de l'animal et les faire circuler, de telle sorte que la croissance des cellules inoculées dans ladite chambre puisse être observée par une fenêtre d'observation La chambre de diffusion

peut également être conçue de façon à pouvoir être débran-

chée de l'organisme de l'animal et, ainsi, permettre de faire croître des cellules pendant toute la durée de vie de l'animal, accroissant par là le rendement en cellules

par animal.

La méthode faisant appel à l'utilisation de ces cham-

bres de diffusion a d'autres avantages; c'est-à-dire que,

comme les cellules des lignées cellulaires établies prove-

nant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres ne sont pas mises en contact direct avec les cellules animales,ces cellules peuvent aisément être récoltées et, du fait de la

moindre possibilité de provoquer des réactions immunologi-

ques indésirables, divers animaux à sang chaud peuvent être

utilisés sans qu'il soit nécessaire de traiter préalable-

ment les animaux afin de supprimer les réactions immunolo-

giques.

Les animaux chez lesquels les cellules ont été trans-

plantées peuvent être nourris entretenus de la façon habi-

tuelle pour l'animal, aucune précaution spéciale n'étant

nécessaire même après la transplantation, ce qui est éga-

lement commode.

Le laps de temps nécessaire à la croissance des cel-

lules des lignées cellulaires établies provenant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres animaux est, d'une façon générale, de 1 à 10 semaines Le nombre de cellules ainsi obtenu s'est avéré être d'environ 107 à 1012 cellules

ou plus par animal.

En d'autres termes, le procédé suivant l'invention pour la préparation de CB est extrêmement avantageux, car les lignées cellulaires établies provenant d'animaux à sang chaud sont multipliées par d'environ 102 à 107 ou plus par rapport au nombre de cellules directement inoculées à

l'animal, ou d'environ 10 à 108 fois ou plus de la multi-

plication obtenue lorsque les cellules sont cultivées dans

un milieu nutritif.

La production de CB à partir des cellules qu'on a fait croître à partir d'une lignée cellulaire établie,provenant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres, peut être effectuée de diverses manières On peut également

les récolter directement à partir de l'organisme dans le-

quel on a fait croître ces cellules Par exemple, on peut récolter CB directement à partir des cellules obtenues en

faisant croître les cellules transplantées,provenant d'ani-

maux à sang chaud comme l'homme ou autres, en suspension dans de l'ascite, ou en les faisant croître dans le tissu

sous-cutané.

On peut également procéder à la préparation de CB en utilisant un inducteur après avoir fait croître les lignées cellulaires établiesprovenant d'animaux à sang chaud comme l'honme

ou autres, dans l'organisme d'un animal, en utilisant l'in-

ducteur soit directement in vivo soit in vitro après avoir

retiré les cellules de l'organisme Par exemple, les cel-

lules d'une lignée cellulaire établie provenant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres, qu'on a fait croître

dans de l'ascite à partir delaquelle elles ont été récol-

tées, ou les cellules isolées et dissociées d'une tumeur

sous-cutanée comprenant les cellules d'une lignée cellu-

laire établie provenant d'animaux à sang chaud comme l'hom- me ou autres, peuvent être mises en suspension dans un milieu nutritif maintenu à une température d'environ 20 à C, de façon à obtenir une concentration cellulaire d'environ 105 à 108 cellules par ml, puis exposées à un inducteur de CB, induisant ainsi la production de CB qu'on

peut ensuite récolter.

En outre, lorsqu'on fait croître dans une chambre de diffusion les cellules d'une lignée cellulaire établie provenant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres, les cellules peuvent être directement récoltées à partir de la chambre, ou peuvent être récoltées une fois qu'elles ont été retirées de la chambre, soit directement, soit

même après exposition à un ou plusieurs inducteurs.

De plus, le rendement en CB par animal peut être en-

core amélioré en faisant appel, par exemple, à un procédé

suivant lequel les cellules d'une lignée cellulaire éta-

blie provenant d'animaux à sang chaud comme l'homme ou autres, qu'on a fait croître dans l'organisme d'un autre animal, sont exposées à un inducteur afin d'induire la production de CB in situ, puis les cellules obtenues,

qui ont récoltées sur un site particulier ou dans la tota-

lité du même organisme animal, sont exposées à un inducteur

afin d'induire la production de CB; un procédé suivant le-

quel les cellules utilisées sont à nouveau exposées à un inducteur afin d'induire la production de CB; un procédé

suivant lequel une chambre de diffusion placée dans ou com-

muniquant avec l'organisme animal est remplacée par une nouvelle chambre afin d'accroître le nombre des cellules obtenues; etc Pour induire la production de CB, on peut utiliser n'importe quel inducteur pour CB décrit ci-dessus, et le CB ainsi obtenu peut être fractionné respectivement en CBX, C Bxl, CBX 2 et CBX 3 ayant les masses moléculaires précisées, en faisant appel aux modes de+spration et de purification

connus décrits ci-dessus.

On décrira maintenant l'efficacité, la toxicité, le mode d'utilisation et la posologie du CB ainsi obtenu. Essai 1 Sélectivité de l'effet cytotoxique

On utilise des séries de 105 cellules deslignées cel-

lulaires tumorales suivantes: cellules KB (cancer du naso-

pharynx), cellules MX-1 {cancer du sein, fournies par Dr.

Shigeru Tsukagoshi, Cancer Institute), cellules H Ep-2 (can-

cer de la gorge) et cellules HEL (hépatome, Flow Co)

ainsi que des lignées cellulaires normales suivantes: cel-

lules intestinales 4-07, cellules cardiaques de Girardi, cellules hépatiques Chang, cellules Vero (rein de singe) et cellules MDCK (rein de chién)(Flow Co) qui ont toutes

été respectivement précultivées pendant 24 heures, et ain-

si que des séries de 105 cellules de cellules P 388 et

L 1210 (leucémie, fournies par Dr Shigeru Tsukagoshi, Can-

cer Institute), qui ont été utilisées immédiatement, et

on cultive chaque série dans 1 ml de milieu de Eagle con-

tenant 10 % de sérum de veau et chaque substance à tester à 37 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air Puis on compte le nombre de cellules

viables non colorées par le Bleu Trypan, sous un micros-

cope optique, et on calcule la concentration de la subs-

tance testée à laquelle 50 % des cellules sont tuées, par rapport au témoin auquel on attribue la valeur 100 On utilise comme substances à tester C Bx obtenu à l'exemple 10, C Bxl obtenu à l'exemple 16, C Bx 2 obtenu à l'exemple 20, CBX 3 obtenu à l'eemple 26 ou 29, un mélange de CBX et de CBX 1, un mlang ce e CBX, CBX 1, CB 2 et C Bx 3, un mélange de CBX 2 et de C Bx 3, les -,B et -Lynotoxines obtenues par un procédé connu (Granger et ai, Cellular Inwnnology, Vol 38, 388-402 ( 1978)), CBF séparé de CBX à l'exemple 1 et la Mitomycine C Uhe unité des Lynhotoxines et de CBF est expri e par un indice classique basé sur la cytotoxicité sur oellules L de souris (Eds Bloom,B R & Grade P R "In Vitro Methods

in Cell-mediated Immunity", Academic Press, 1979) Les ré-

sultats obtenus sont rapportés aux tableaux 2-1 à 2-4.

TABLEAU 2-1

Concentration pour une inhibition de % de la croissance

Nom des Espèce CBX &-Lympho CBF Mitomy-

cellules toxine cine C (unités/ml) (unités/ml) (unités/ml) ("g/ml) KB Homme 1,0 16 18 34 Cel H Ep-2 Homme 1,6 5,6 24 17 lules ue HEL Homme 1,1 33 26

tulmo-

rales MX-1 Homme 1,9 3,5 32 L 1210 Souris 3,0 43 P 388 Souris 3,3 36 Intestin 407 Homme > 1 000 80,0 > 20 000 32 Girardi Coeur Homme > 1 000> 20 000 45 Cel Chang Homme > 1 000 8,0 > 20 000 19 lules foie nor Vero Singe 650 52 males MDCK Chien 520 41 Note: "-" signifie que l'essai n'a pas été effectué

TABLEAU 2-2

Concentration pour une inhibition de 50 % de la croissance C Bx 2 (uniités/ml)

d-Lympho-

toxine (unités/ml)

e-Lympho-

toxine lunités/ml) CBF (unitds/ml) KB Homme 1,0 1,0 19 21 18 34 H Ep-2 Homme 1,5 1,4 4,8 7,2 24 17 HEL Homme 1,3 1,5 33 26 CellulesMX-1 Homme 1, 8 1,6 3,5 32 tumtorales tumorales L 1210 Souris 3,2 3,4 _ 43 P 388 Souris 36 Intestin 407 Homme > 1 000 > 1 000 76,0 92,0 > 20 000 32 Girardi Cellules coeur Homme > 1 000 > 1 000 > 20 000 19 normales Chang foie Homme > 1 000 > 1 000 9,6 8,8 Ä 20 000 19 Vero Singe 630 640 _ 52 MDCK Chien 550 530 41 Note: "-" signifie que l'essai n'a pas été effectué Nom des cellules Espèce C Bx 1

Mitomy-

cine C (ug/ml) b" r\, ro' - l(unités/ml) Notes: el)C Bx 3 obtenu à l'exemple 26 02) C Bx 3 obtenu à l'exemple 29

TABLEAU 2-3

Concentration pour une inhibi-

tion de 50 % de la croissance Nom des Espèce C Bx 3 CBX 3 Mitomy cellules cine C (unités/ml) (unités/ml) (pg/ml) KB Homme 1,0 1,0 35 H Ep-2 Homme 1, 5 1,7 18 Cel- l Culs HEL Homme 1,3 1,4 25 lules tumo MX-1 Homme 1,8 1,7 30 rales L 1210 Souris 3,1 2,9 44 P 388 Souris 3,4 3,5 37 Intestin 407 Homme > 1 000 > 1 000 35 Girardi coeur Homme > 1 000 > 1 000 44 Chang. Cel foie Homme > 1 000 > 1 000 21 lules Vero Singe 620 580 50 nor- males MDCK Chien 510 540 44 Culture primaire Rat 870 910 61 Foie de rat Notes: * 1) * 2) * 3) Mélange Mélange Mélange de C Bx et C Bx 1 de CBX, C Bxl, CBX 2 et CBX 3 de C Bx 2 et CBX 3

Comme il découle des résultats ci-dessus, CB, similai-

re à CBF, a sélectivement endommagé les cellules tumorales

pratiquement sans endommager les cellules normales -Toute-

fois, l'intensité de l'effet cytotoxique sur les tumeurs respectives est différente entre CB et CBF Au contraire,

la i et la O-Lymphotoxine ainsi que la Mitomycine C pré-

sentent une cytotoxicité non sélective vis-à-vis des cel-

lules normales et des cellules tumorales.

TABLEAU 2-4,,L,, ,

Concentfation pour une inhibition de 50 % de la croissance _ Noms des Al) B'2) Cê 3) cellules Espèce (unités/ml) (unités/ml) (unités/ml) KB Homme 1, 0 1,0 1,0 H Ep-2 Homme 1,5 1,4 1,6 Cellules BEL Homme 1,6 1,7 1,9 tumorales MX-1 Homme 1,8 1,7 1,6 L 1210 Souris 3,0 3,2 3,0 __ __ _P 388 Souris 3,1 3,4 3,2 Intestin 407 Homme; 1 000 > 1 000 > 1 000 Girardi Cellules coeur Homme > 1 000 > 1 000 > 1 000 normales Chang foie Homme > 1 000 > 1 000 > 1 000 Vero Singe 610 590 580 MDCK Chien 580 610 600 Essai 2 Influence sur des souris sur lesquelles on a effectué une transplantation de Sarcome 1800 ou de Tuneur d'Ehrlich Sur des souris mâles (souche dd Y) pesant de 25 à 30 g on transplante par voie intrapéritonéale 3 x 106 cellules par animal de Sarcome 180 ou de tumeurascitique d'Ehrlich et on observe le nombre de jours de survie A des groupes

de 5 souris, on administre tous les jours, par voie intra-

veineuse, entre le jour suivant la transplantation et la mort des animaux, C Bx obtenu à l'exemple 6, C Bxl obtenu à l'exemple 15, C Bx 2 obtenu à l'exemple 20 et C Bx 3 obtenu à l'exemple 26 ou 29 Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage du nombre moyen de jours de survie par rapport au groupe de référence, et sont indiqués aux tableaux 3-1

à 3-3.

Tableau 3-1

Tumeur Substance Dose Nombre testée journalière moyen de jours de survie (%) CBX 1,2 unité /kg 111 Sarcome 4 unités/kg 131 de la 12 unités/kg 164 souris Mitomycine C 0,5 mg/kg 140 Cyclophosphamide 20 mg/kg 172 C Bx 1,2 unité /kg 141 Tumeur 4 unités/kg 159 ascitique ascitique 12 unités/kg 187 d'Ehrlich Mitomycine C 0,5 mg/kg 168 Cyclophosphamide 20 mg/kg

Tableau 3-2

Nombre Tumeur Substance -ose moyen de testée journalière jours de s_ urvie (%) _C Bxl 1 unité /kg 113 3 unités/kg 133 Sarcome 10 unités/kg 160 de la CB 2 1 unité /kg 110 souris X 2 3 unités/kg 135 unitês/kg 159 Mitomycine C 0,5 mg/kg 138 Cyclophosphamide 20 mg/kg 170 C Bxi 1 unité /kg 139 3 unités/kg 164 Tumeur 10 unités/kg 187 ascitique C Bx 2 1 unité /kg 135 d'Ehrlich 3 unités/kg 161 unités/kg 189 Mitomycine C 0,5 mg/kg 164 Cyclophosphamide 20 mg/kg 206

Tableau 3-3

Nombre Tumeur Substance Dose moyen de testée journalière jours de _____ _ __ ____ _ ___ survie (%) CBX 3 1 unité /kg 110 3 unités/kg 129 Sarcome 2) 10 unités/kg 157 de la CB 2) 1 unité /kg 108 souris X 3 3 unités/kg 131 unités/kg 150 Mitomycine C 0,5 mg/kg 142 CBX 3 '1) 1 unité /kg 139 3 unités/kg 155 Tumeur 10 unités/kg 181 ascitique CB 32) 1 unité /kg 132 d'Ehrlich X 3 3 unités/kg 157 unités/kg 179 Mitomycine C 0,5 mg/kg 166 Notes: 01 e) CBX 3 obtenu à l'exemple 26 02) CBX 3 obtenu à l'exemple 29 s Il découle nettement des résultats ci-dessus que CB présente un effet anti-tumoral significatif aussi bien sur des souris chez lesquelles on a transplanté des cellules de Sarcome 180 que sur des souris chez lesquelles on a transplanté des cellules de tumeur d'Ehrlich. Essai 3 Influence sur les jours de survie de souris leucémiques Sur des souris mâles de souche BDF 1 de 20 à 25 g on transplante par voie intrapéritonéale 105 cellules par animal de leucémie L 1210 de la souris ou 106 cellules par animal de leucémie P 388 de la souris, et on observe le nombre de jours de survie CBX obtenu à l'exemple 10, CBX, obtenu à l'exemple 16, CBX 2 obtenu à l'exemple 20 et CBX 3 obtenu à l'exemple 26 ou 29 sont administrés par voie intrapéritonéale à des groupes de 5 souris, soit chaque jour à partir du jour suivant la transplantation jusqu'à la mort (pour CBX, CBX, et CBX 2), soit une seule fois le jour suivant la transplantation (pour CBX 3) Les résultats sont exprimés en pourcentage du nombre moyen de jours de survie par rapport au groupe témoin, et sont indiqués aux

tableaux 4-1 4-3.

TABLEAU 4-1

Nombre Substance Dose moyen de Tumeur testée journalière jours de survie (%) CBX 0,4 unité /kg 105 Leucémie 1,2 unité /kg 123 L 1210 de 4 unités/kg 151 la souris Mitomycine C 0,5 mg/kg 128 Cyclophosphamide 20 mg/kg 172 CB 0,4 unité /kg 113 Leucémie X 1,2 unité /kg 128 P 388 de 4 unités/kg 144 la souris Mitomycine C 0,5 mg/kg 133 Cyclophosphamide 20 mg/kg 147

TABLEAU 4-2

Nombre Substance _ _D ne moyen de Tumeur testée journalière jours de survie (%) C Bxi 3 unités/kg 108 CX 1 10 unités/kg 122 unités/kg 149 Leucémie CB 2 1 unité /kg 110 L 1210 de X 3 unités/kg 121 la souris 10 unités/kg 151 Mitomycine C 0,5 mg/kg 136 Cyclophosphamide 20 mg/kg C Bx 1 unité /kg 110 Xl 3 unités/kg 126 unités/kg 147 Leucémie C Bx 2 0,3 unité /kg 109 P 388 de 1 unité /kg 125 la souris 3 unités/kg 151 Mitomycine C 0, 5 mg/kg 130 Cyclophosphamide

TABLEAU 4-3

Nombre Substance Dose moyen de Tumeur testée journalière jours de ____ ____ ________ survie (%) CB 1) 10 unités/kg 109 X 3 30 unités/kg 120 unités/kg 149 Leucémie C X 3 10 unités/kg 111 L 1210 de 30 unités/kg 121 la souris 100 unités/kg Mitomycine C 5,0 mg/kg 132 Leucémie P 388 de la souris C Bx 3 î CB X 3 e 2) Cx 3 Mitomycine C Notes: 1 el) C Bx 3 obtenu à * 2) C Bx 3 obtenu à ,0 unités/kg unités/kg unités/kg unités/kg unités/kg unités/kg mg/kg

l'exemple 26

l'exemple 29

Il découle nettement des résultats ci-dessus que CB présente un effet anti-tumoral significatif aussi bien chez les souris porteuses de leucémie L 1210 que chez celles

porteuses de leucémie P 388.

Essai 4 Influence sur le nombre de jours de survie de souris porteuses de carcinome du poumon Des souris mâles de souche DBF 1 de 20 à 25 g subissent une transplantation intramusculaire, dans la cuisse droite de 2 x 10 cellules de carcinome de Lewis du poumon, et on observe le nombre de jours de survie CBX obtenu à l'exemple 7, C Bxl obtenu à l'ekemple 17, C Bx 2 obtenu à l'exemple 22 et CBX 3 obtenu à l'exemple 26 ou 29 sont administrés par voie intraveineuse à des groupes de 6

souris, chaque jour à partir du jour suivant la transplan-

tation, jusqu'à leur mort Les résultats sont exprimés en pourcentage du nombre moyen de jours de survie par rapport

au groupe témoin, et sont indiqués aux tableaux 5-1 et 5-2.

TABLEAU 5-1

Nombre Substance testée Dose moyen de journalière jours de survie (%) CBX 1,2 unité /kg 104 4 unités/kg 112 12 unités/kg 146 Mitomycine C 0,5 mg/kg 121 Cyclophosphamide 20 mg/kg 163

TABLEAU 5-2

Substance testée Nombre moyen de journalière jours de survie (%) C Bxl I 1 unité /kg 107 1 3 unités/kg 113 unités/kg 145 C Bx 2 1 unité /kg 109 3 unités/kg 121 unités/kg 143 CBX 3 l) 1 unité /kg 115 3 unités/kg 143 unités/kg 157 C Bx 32 > 1 unité/kg 111 3 unités/kg 136 unités/kg 159 Mitomycine C 0,5 mg/kg 120 Cyclophosphamide 20 mg/kg 164 Notes: el) CBX 3 obtenu à l'exemple 26 e 2) CBX 3 obtenu à l'exemple 29 Essai 5 Influence sur la survie de souris porteuses de mélanome Sur des souris mâles de souche BDF 1 de 20 à 25 g on

transplante par voie sous-cutanée, dans le dos, 106 cellu-

les par animal de mélanome B 16 de la souris, et on note le nombre de jours-de survie C Bx obtenu à l'exemple 10 et C Bx 3 obtenu à l'exemple 26 ou 29 sont administrés par voie intraveineuse à des groupes de 7 souris, chaque jour, à partir du jour suivant la transplantation jusqu'à leur mort Les résultats sont exprimés en pourcentage du nombre moyen de jours de survie par rapport au groupe témoin et

sont indiqués aux tableaux 6-1 et 6-2.

TABLEAU 6-1

Substance testée Dose Nombre moyen de journalière jours de survie (%) C Bx 1,2 unité /kg 112 4 unités/kg 135 12 unités/kg 180 Mitomycine C 0,5 mg/kg 138 Cyclophosphamide 20 mg/kg 158

TABLEAU 6-2

Substance testée Dose Nombre moyen de 4 journalière jours de survie (%) CB o 1) 1 unité /kg 110 CX 3 3 unités/kg 131 unités/kg 178 CB 02) 1 unité /kg 116 X 3 3 unités/kg 129 unités/kg 176 Mitomycine C 0,5 mg/kg 140 Notes: e 1) CBX 3 obtenu à l'exemple 26 o 2) CBX 3 obtenu à l'exemple 29 Il découle nettement des résultats ci-dessus que CB

présente un effet anti-tumoral évident sur les souris por-

teuses de mélanome B 16 de la souris.

Essai 6 Influence sur la métastase pulmonaire du cancer Sur des souris males de souche BDF 1 de 20 à 30 g réparties en groupes de 6 animaux chacun, on transplante par voie sous-cutanée, dans le dos, des segments carrés de 2 mm de côté de cancer de Lewis du poumon CBX obtenu à l'exemple 6, C Bxl obtenu à l'exemple 15, CBX 2 obtenu à l'exemple 20 et le CBF obtenu sont administrés une fois par jour, pendant les 12 jours à partir du 9 ème jour après la transplantation, par voie intraveineuse Au 21 ème jour suivant la transplantation, on isole et pèse la masse de tumeur primitive, et on calcule le nombre de nodules de métastase dans les poumons, suivant le protocole opératoire de Wexler, H (J Natl Cancer Institute, Vol 36, 641 ( 1966)) Les résultats obtenus sont rapportés aux tableaux

7-1 et 7-2.

TABLEAU 7-1

Essai Substance Dose is de la Nombre de nodu-i

testée journalière tumeur (g) les de métasta-

se dans le poumon 1 Témoin 9,6 + 1,9 29,2 + 7,3 CBX 4 unités/kg 5,1 + 1,6 6,8 + 3,2 unités/kg 3,0 + 0,3 ee 0,4 + 0,4 Cyclophos phamide 20 mg/kg 3,4 + 0,7 O 0,4 + 0,2 e 2 Témoin 7,3 + 0,3 29,2 + 1,4 CBX 4 unités/kg 4,1 + 1,2 6,7 + 2,1 unités/kg 12,3 + 0,2 0,5 + 0,2 O CBF 4 unités/kg 16,6 + 0,6 22,0 + 5,0 unités/kg 14,2 + 0,4 21,4 + 4,5

TABLEAU 7-2

Substance Dose Poids de la Nombre de nodu-

testée journalière tumeur (g) les de métasta-

se dans le pounmon Témoin 7,8 + 0,5 29,6 + 1,0 C Bx 1 3 unités/kg 4,3 + 1, 3 7,3 + 2,0 unités/kg 2,4 + 0,3 O 0,5 + 0,30 C Bx 2 3 unités/kg 4,9 + 1,3 7,1 + 1,9 unités/kg 2,1 + 0,5 0,7 + 0,30 CBF 3 unités/kg 6,8 + 0,6 23,0 + 5,2 unités/kg 4,3 + 0,5 22,4 + 4,4

Cyclophos-

phamide 20 unités/kg 3,5 _ 0,6 0,6 + 0,3

Notes: Les résultats des tableaux sont exprimés en (moyen-

ne)+(écart type) I Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau de signification égal ou inférieur à 5 % es Statistiquement différent du groupe témoin à un

niveau de signification égal ou inférieur à 1 %.

I 1 ressort nettement des résultats ci-dessus que CBX sup-

prime avec grand succès le cancer primaire du poumon et

ses métastases pulmonaires, tandis que CBF n'a pratique-

ment pas d'effet sur les métastases pulmonaires.

Essai 7 Effet d'induction de la différenciation des cellules tumorales Conformément au protocole opératoire de Hozumi, M et al (Cancer Research, Vol 40, 2919-2924 ( 1980)), 5 x 105 cellules de leucémie myélogène aig Ue M-1 (fournies par Dr Motoo Hozumi, Saitama Cancer Center) sont mises en suspension dans 1 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et contenant également des aminoacides et

des vitamines en des proportions doubles des niveaux habi-

tuels, qui a été additionné de chaque substance à tester,

et sont cultivées à 370 C pendant 48 heures dans une atmos-

phère contenant 5 % de C 02 et 95 % d'air Ensuite, les cel-

lules sont remises en suspension dans un milieu contenant 0,2 % de

particules de latex de polystyrène (Dow Chemical Co), sont in-

cubées à 370 C pendant 4 heures, après quoi le nombre de cellules ayant phagocyté les particules et le nombre de cellules totales sont comptés sous un microscope optique et le taux de différenciation est calculé d'après le rapport de-ces cellules Les résultats obtenus sont indiqués au

tableau 8.

TABLEAU_ 8 _

CBX a pour effet d'induire la différenciation.

Essai 8 Test relatif à l'effet pyrogène Conformément au protocole opératoire décrit dans la

Pharmacopée japonaise, CBX obtenu à l'exemple 3 est admi-

nistré par voie intraveineuse à des lapins blancs à une dose de 100 unités par animal Les résultats des mesures de la température rectale effectuées jusqu'à 3 heures plus Substance à Concentration Taux de tester différenciation (%) Témoin 1 C Bx 0,004 unité/ml 8 0,04 unité/ml il 0,4 unité/ml 18 Dexaméthasone 20,0 ng/ml 25 tard à l'aide d'un thermomètre de type thermocouple sont rapportés au tableau 9 ___

TABLEAU 9

Lapin Poids Température rectale avant et après (kg) injection de CBX ( C) Avant 1 heure 2 heures 3 heures injection après après après

A 2,0 38,90 38,70 38,80 38,80

B 2,0 38,90 38,90 38,97 38,97

C 2,0 39,25 39,25 39,22 39,30

Essai 9 Influence sur souris porteuses de cancer du sein Sur des groupes de 6 souris dénudées de souche BAIB/C, de 20 à g on transplante par voie sous-cutanée, dans le dos, des segments carrés de 2 mm de côté de cancer du sein

humain MX-1 C Bx 3 obtenu à l'exemple 26 ou 29 est adminis-

tré par voie intraveineuse aux souris pendant 14 jours, à partir du 14 ème jour après la transplantation Le 15 ème jour après la première administration, on mesure le volume

de la tumeur primaire Les résultats obtenus sont rappor-

tés au tableau 10.

TABLEAU 10

Substance Dose Volume de la tumeur 1) testée journalière (cm 3) Témoin 9, 7 + 2,2

CB 32)

CBX 3 O 1 unité /kg 7,6 + 1,3 3 unités/kg 4,3 + 1,30 unités/kg 2,2 + 0,9 ee CB 3 X 3 1 unité /kg 7,3 + 1,2 3 unttés/kg 4,6 + 1,4 unités/kg 2,0 + 1, 0 Mitomycine C 0,5 mg/kg 4,4 + 1,1 Notes) e 1) 02) 03) (Valeur moyenne)+ (écart CBX 3 obtenu à l'exemple C Bx 3 obtenu à l'exemple type) d Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau de signification égal ou inférieur a 5 % e Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau de signification égal ou inférieur

a 1 %.

Essai 10 Influence sur tumeur induite par le méthylcholanthrène Du 3méthylcholanthrène dissous dans de l'huile d'olive est injecté par voie sous-cutanée, latéralement, dans l'abdonmen de groupes de 8 souris de souche dd Y pesant 20 à 25 g, à raison de 0,5 mg par souris C Bx 3 obtenu à l'exemple 26 ou 29 est administré par voie intraveineuse aux souris, une fois par jour pendant 21 jours à partir du 60 ème jour environ après l'injection de 3-methylcholanthrène On mesure le volume de la tumeur le 21ème jour suivant la première administration de CBX 3 Les résultats obtenus

*sont rapportés au tableau 11.

TABLEAU 11

Notes: 01 el) (Valeur moyenne)+(écart type) e 2) CBX 3 obtenu à l'exemple 26 e 3) CBX 3 obtenu à l'exemple 29 e Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau de signification égal ou inférieur à 5 % se Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau de signification égal ou inférieur à 1 % Il découle des résultats ci-dessus que C Bx 3 présente de toute évidence un effet anti-tumoral sur la tumeur spontanée. Substance testée Dose journalière Volume de la tumeurl) (cn 3) Témoin 10, 5 + 2,3 CB x 2)> 1 unité /kg 8,5 1,4 3 unités/kg 5,4 1,40 unités/kg 2, 5 0,7 ee CB 3) 1 unité /kg 8,9 i 1,5 X 3 3 unités/kg 5,1 1,3 unités/kg 2,2 + 0,80 Mitomycine C 0,5 mg/kg 6,6 i 1,3 D Essai 11 Test de toxicité (administratjo unique)

A des souris males de souche BDF 1 de 20 à 25 g, ré-

parties en groupes de 10 animaux chacun, on administre CB par voie intraveineuse et on note la mortalité des animaux pendant 7 jours Résultat: les 10 animaux ont tous survécu sans présenter de variation de poids corporel et d'état général, même après administration de 10 000 unités/kg de

CBX, C Bx, ou C Bx 2, ou 100 000 unités/kg de CBX 3.

Essai 12 Test de toxicité (administration continue pendant 30 jours)

A des souris mâles de souche BDF 1 de 20 à 25 g, ré-

parties en groupes de 10 animaux chacun, on administre CB par voie intraveineuse pendant 30 jours, et on observe le nombre d'animaux morts, ainsi que les variations du poids corporel et de l'état général Les animaux sont pesés

entre 9 et 10 heures du matin, et l'examen de l'état géné-

ral est effectué le 10 ème, le 20 ème et le 30 ème jour, conformément au protocole opératoire d'Arvien (Science, Vol 36, 123 ( 1962)) Résultat: pendant ces 30 jours, la mortalité est nulle lorsqu'on administre 1 000 unités/kg/ jour de CBX, CBX, ou CBX 2, ou 10 000 unités/kg/jour de CBX 3, et le courbe de gain de poids est plus ou moins la même que celle du groupe témoin En outre, l'état général

s'avère être normal, comme celui du groupe témoin.

Il découle des essais décrits ci-dessus que CB sup-

prime sélectivement la croissance des cellules tumorales

et, en outre, il y a non seulement une suppression remar-

quable des métastases cancéreuses, mais également une très grande efficacité d'action sur diverses tumeurs avec encore une grande sécurité, même à des doses supérieures

à la dose à laquelle se manifesterait l'effet pharmaceu-

tique Il s'ensuit que CB est très précieux pour le trai-

tement de diverses tumeurs comme le cancer de l'estomac, le cancer du poumon, l'hépatome, le cancer du colon, le cancer du sein, le cancer de l'utérus, la leucémie, etc CB peut être administré sous la forme de préparations classiques, par exemple d'injections, de gouttes pour les yeux, de gouttes nasales, d'inhalations, de préparations topiques, de préparations administrables par voie orale, rectale, vaginale, etc La posologie de CB chez l'adulte n'est pas particulièrement limitée du fait de sa grande sécurité d'emploi, mais, d'une façon générale, elle est de 0, 5 à 500 000 unités et de préférence de 0,5 à 5 000 unités pour l'application par voie topique, de 20 à 100 000

unités pour l'administration par voie générale (par exem-

ple par injection intraveineuse, injection intramusculai-

re, etc) et de 50 à 500 000 unités pour l'administration par voie orale, la dose journalière pouvant être ajustée de façon appropriée, suivant le mode d'utilisation et la gravité de la maladie La préparation peut contenir CBX,

CBX,, CBX 2 et CBX 3 seuls ou en mélanges en toute propor-

tions souhaitées.

CB peut être présenté sous forme de préparations

pharmaceutiques, par tout mode opératoire classique utili-

sant des véhicules, bases, excipients, etc pharmaceuti-

quement acceptables De préférence, pour l'administration par voie orale, on utilise des préparations entériques (par exemple des capsules, des comprimés, des poudres,etc >

CB peut également être présenté sous la forme de prépara-

tions administrables par voie rectale (suppositoires),

d'injections (par exemple d'injections aqueuses), de pré-

parations reconstituables de poudre lyophilisée à dissou-

dre dans de l'eau distillée pour injection au moment de

l'utilisation, et de préparations topiques comme des pom-

mades, des lotions, etc En outre, on peut utiliser CB pour la préparation de gouttes pour les yeux, de gouttes

nasales, ou d'inhalations.

Comme exemples de véhicules et excipients solides utilisables avantageusement suivant l'invention, on citera des excipients courants comme le lactose, le mannitol, l'amidon de mais et la fécule de pomme de terre; des liants comme la cellulose cristalline, des dérivés cellulosiques, la gomme arabique, l'amidon de mais et la gélatine; des agents de désintégration-commen-'-amidon de mais, la fécule

de pomme de terre et la carbohydroxyméthylcellulose calci-

que; ainsi que des lubrifiants comme le talc et le stéara-

te de magnésium Comme exemples de véhicules liquides utilisables avantageusement suivant l'invention, on citera l'eau distillée pour injection, le sérum physiologique,

les huiles végétales pour injection, ainsi que des gly-

cols comme le propylène glycol et le polyéthylèneglycol.

Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à

titre d'illustration de l'invention.

Exemple 1

Des lymphocytes humains ( 2 x 10 cellules) sont mis en suspension dans 4 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau, et on les cultive à 37 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air Puis, on dialyse le liquide surnageant du milieu de culture contre un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2), et une fraction relarguée à l'aide de sulfate d'ammonium ( 40-80 %)

est obtenue à partir du dialysat On redialyse cette frac-

tion contre ledit tampon phosphate, puis on la soumet à

une filtration sur gel en utilisant Sephadex G-100 (Phar-

macia Co) On recueille une fraction ayant une masse mo-

léculaire de 12 000 à 17 000, désignée fraction C Bx brute, tandis que la fraction éluée antérieurement est désignée fraction CBF brute On adsorbe la fraction CBX brute sur Sephadex associé à Ulex europeus agglutinine (Maruzen Oil

Co.), on élue à l'aide d'un tampon phosphate 0,01 M conte-

nant du fucose ( 0,5 M) Après élimination du fucose par dialyse, on adsorbe à nouveau C Bx sur le Sephadex associé à Ulex europeus agglutinine, puis on élue par la méthode des gradients en utilisant un tampon phosphate (p H 7,2), obtenant ainsi du CBX purifié; On obtient au total 0,02

mg de CBX L'activité totale du C Bx obtenu est de 150 uni-

tés telle que déterminée par la méthode décrite ci-dessus.

C'est ainsi que l'activité spécifique du C Bx purifié est de

7.500 unités/mg.

Exemple 2

On met des lymphocytes de bovins ( 2 x 109 cellules) en suspension dans 1000 ml de milieu de Eagle contenant

% de sérum de veau et on cultive à 370 C pendant 48 heu-

res dans une atmosphère contenant 5 % de Co 2 et 95 % d'air.

On soumet ensuite le liquide surnageant du milieu de cul-

ture aux opérations décrites à l'exemple 1 a-fin de purifier CBX et on obtient 0,01 mg de CBX L'activité totale du CBX obtenu est de 20 unités; l'activité spécifique du CBX

purifié est ainsi de 2 000 unités/mg.

Exemple 3

On met des lymphocytes de souris ( 5 x 1010 cellules) en suspension dans 5 000 ml de milieu de Eagle oentenant 10 % de sérum de veau et on cultive à 370 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de C 02 et 95 % d'air On soumet ensuite le liquide surnageant du milieu de culture aux opérations décrites à l'exemple 1 afin de purifier CBX, et on obtient 0, 12 mg de CBX L'activité totale du CBX obtenu est de 400 unités, l'activité spécifique du CBX purifié

étant ainsi de 3 333 unités/mg.

Exemple 4

On met des cellules BALL-1 (lignée cellulaire humaine,

1 x 10 cellules), qui ont été pré-cultivées, en suspen-

sion dans 2 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau, et on cultive à 370 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air On soumet ensuite le liquide surnageant du milieu de culture aux opérations décrites à l'exemple 1, afin de purifier CBX, et on obtient 0,7 mg de CBX L'activité totale du CBX obtenu est de 4 000 unités, l'activité spécifique du CBX purifié

étant ainsi de 5 714 unités/mg.

Exemple 5

On met descellules Flow 7000 (lignée de fibroblastes

humaine, 3 x 10 cellules), qu'on a fait croître par cul-

ture cellulaire, en suspension dans 600 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau, et on cultive à 370 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air On soumet ensuite le liquide surnageant du milieu de culture aux opération-seécrites à l'exemple 1,

afin de purifier C Bx, et on obtient 0,005 mg de CBX.

L'activité totale du C Bx obtenu est de 10 unités, l'activi-

té spécifique du C Bx purifié étant ainsi de 2 000 unités/ mg.

Exemple 6

On met des lymphocytes humains ( 2 x 1010 cellules) en suspension dans 4 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après addition de phytohémagglutinine (Difco Co) à une concentration finale de 50 pg/ml, on

cultive à 37 C pendant 48 heures, dans une atmosphère con-

tenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air On soumet ensuite le liqlide surnageant du milieu de culture aux opérations décrites à l'exemple 1, afin de purifier CBX, et on obtient 1,0 mg de CBX L'activité totale du C Bx obtenu est de 10 000 unités, l'activité spécifique du CBX purifié étant ainsi de

10.000 unités/mg.

Exemple 7

On met des cellules Flow 7000 (lignée de fibroblastes humains, 3 x 109 cellules) en suspension dans 600 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après addition de phytohémagglutinine à une concentration finale de 50 pg/ml, on cultive à 37 C pendant 48 heures dans une

atmosphère contenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air On soumet en-

suite le liquide surnageant du milieu de culture aux opé-

rations décrites à l'exemple 1, afin de purifier CBX, et on obtient 60 pg de C Bx L'activité totale du C Bx obtenu est de 480 unités, l'activité spécifique du C Bx purifié

étant ainsi de 8 000 unités/mg.

Exemple 8

On met des cellules TALL-1 {lignée cellulaire humaine,

9 x 109 cellules) qu'on a fait croître par culture cellu-

laire, en suspension dans 800 ml de milieu de Eagle conte-

nant 10 % de sérum de veau et, après addition de phyto-

hémagglutinine à une concentration finale de 50 pg/ml, on

cultive à 37 C pendant 48 heures dans une atmosphère conte-

nant 5 % de CO 2 et 95 % d'air On soumet ensuite le liquide surnageant du milieu de culture aux opérations décrites à l'exemple 1, afin de purifier C Bx, et on obtient 0,8 mg de CBX L'activité totale du C Bx obtenu est de 7 500 unités, l'activité spécifique du C Bx purifié étant ainsi de

9.375 unités/mg.

Exemple 9

On soumet des souris adultes à un traitement préala-

ble en les irradiant avec des rayons-X d'environ 400 REM afin de supprimer leur réponse immune, puis on les soumet à une transplantation sous-cutanée de cellules TALL-1 (origine humaine) On alimente ensuite les souris pendant 3 semaines On isole la masse tumorale formée dans letissu sous-cutané, pesant environ 10 g, on la broie et on la dissocie dans du sérum physiologique contenant de la trypsine, et on recueille les cellules dispersées On

traite ces cellules suivant le mode opératoire de l'exem-

ple 1, afin d'obtenir CBX Le rendement en CBX est d'envi-

ron 190 unités par souris.

Exemple 10

On met des cellules BALL-1 (lignée cellulaire humaine, 9 x 109 cellules) en suspension dans 1 800 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après addition de 9 x 106 pfu (unités formatrices de plaque) de virus Sendai (HVJ), on cultive à 37 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air On soumet ensuite le liguide surnageant du milieu de culture aux opérations décrites à l'exemple 1, afin de purifier C Bx, et on obtient 720 pg de C Bx L'activité totale du CBX obtenu est de 7 920 unités, l'activité spécifique du CBX

purifié étant ainsi de 11 000 unités/mg.

CBX obtenu ci-dessus est dissous dans une solution saline physiologique à une concentration de 1 mg Anlf et le pouvoir

rotatoire spécifique de la solution à 598 nm (Na-ligne D) a été-

mesuré comme étant de 26,5 à 28,5 à l'aide d'un polarimètre (Nihon Bunko DIP-181) en utilisant une microcellule de 10 mm sur le trajet lumineux Le pouvoir rotatoire spécifique de la solution saline physiologique utilisée comme témoin, a été posé

comme étant de O C Bx est lévogyre.

CBX ( 10/pl) obtenu ci-dessus est mis sous forme d'une pas-

tille avec de la poudre de bromure de potassium pour déterminer le spectre IR de CBX, La me sue-'Wltgrée( 60 fois) a été effectuée par un spectrophtomètre à infrarouge par transformation de Fourier (Analect Instruments Co) Le résultat est donné à la Fig 1.

Exemple Il

On soumet des souris dénudées à une transplantation sous-cutanée de cellules BALL-1 (d'origine humaine), puis on les alimente pendant 3 semaines On isole ensuite les

masses tumorales résultantes, formées dans le tissu sous-

cutané, pesant environ 1;g chacune, on les broie, puis on les dissocie dans du sérum physiologique contenant de la

trypsine, et on recueille ensuite les cellules dispersées.

On lave ces cellules à l'aide de milieu de Eagle contenant 5 % de sérum humain, puis on met 2 x 109 de ces cellules en suspension dans 2 000 ml du même milieu et on cultive à 370 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 %

de C 02 et 95 % d'air On soumet ensuite le liquide surna-

geant du milieu de culture aux opérations décrites à l'ex-

emple 1, afin d'obtenir CBX Le rendement en CBX est d'en-

viron 200 unités par souris nue.

Exemple 12

On met des cellules JBL (lignée cellulaire humaine)

en suspension dans du sérum physiologique, puis on intro-

duit la suspension dans une chambre de diffusion cylindri-

que en matière plastique ayant une capacité d'environ 10 ml, qu'on munit d'un filtre à membrane à pores d'environ 0,5 micron, et on place cette chambre dans la cavité péritonéale d'un rat adulte On alimente le rat pendant 4

semaines, puis on retire la chambre.

La concentration cellulaire en cellules humaines ain-

si obtenue est d'environ 5 x 109 cellules par ml, ce qui représente environ 103 fois ou plus que le résultat obtenu par culture in vitro dans un milieu nutritif dans une

atmosphère contenant 5 % de C 02 et 95 % d'air.

On met au total 1 x 1010 des cellules JBL,obtenues par le mode opératoire décrit ci-dessus,en suspension dans 4.000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et on cultive à 370 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2 et 95 % d'air On soumet ensuite le

liquide surnageant du milieu de culture aux opérations dé-

crites à l'exemple 1, afin d'obtenir CBX Le rendement en

CBX est d'environ 350 unités par rat.

Exemple 13

On soumet des souris dénudées adultes à une trans-

plantation sous-cutanée de cellules BALL-1 (d'origine hu-

maine), puis on les alimente pendant 5 semaines On soumet ensuite chaque souris à une injection intrapéritonéale de 1 mg de phytohémagglutinine, on sacrifie les animaux 24

heures après l'injection, et on recueille le liquide d'as-

cite qu'on centrifuge à 40 C et 1 000 G On dialyse le liquide surnageant obtenu contre du sérum physiologique contenant un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2), pendant 15

heures On soumet ensuite la solution à une ultrafiltra-

tion en utilisant un filtre à membrane et on concentre le filtrat, obtenant ainsi une solution contenant CBX La quantité de CBX est d'environ 8 000 unités par souris dénudées.

Exemple 14

On met des cellules NALL-1 (lignée cellulaire humaine) en suspension dans du sérum physiologique et on verse

dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plas-

tique ayant une capacité de 10 ml environ qu'on munit d'un filtre à membrane ayant des pores de 0,5 micron environ, et on introduit cette chambre dans la cavité péritonéale d'un rat adulte On alimente ce rat pendant 4 semaines, puis on retire la chambre On lave les cellules qu'on a ainsi fait croître,à l'aide de milieu de Eagle contenant 5 % de sérum humain, et on remet en suspension dans le même milieu, à une concentration cellulaire d'environ 5 x 106 cellules par ml On additionne la suspension d'environ 200 ug/ml de phytohémagglutinine et on fait incuber le mélange à 370 C pendant 2 jours-, afin d'induire la production de CBX CBX ainsi produit est purifié et concentré

comme décrit à l'exemple 1 et on le lyophili-

se, obtenant ainsi CBX sous forme pulvérulente Le rende-

ment en CBX est d'environ 15 000 unités par rat.

Exemple 15

En opérant comme décrit à l'exemple 6, on cultive des lymphocytes humains et on purifie le liquide surnageant du milieu de culture afin d'obtenir une fraction purifiée ayant une masse moléculaire de 70 000 à 90 000 On désigne cette fraction CBX, L'activitútttale du 0,1 mg de CB Xi purifié est de 5 000 unités, l'activité spécifique du

CBX 1 purifié étant ainsi de 50 003 unités/mg.

Le pouvoir rotatoire spécifique de C Bxi obtenu ci-dessus est

mesuré comme indiqué à l'exemple I O CB X est dextrogyre.

La détermination du spectre IR de C Bx obtenu ci-dessus a été obtenue comme décrit à l'exemple 10 Le spectre est donné à

la Fig 2.

Exemple 16

En opérant comme décrit à l'exemple 10, on cultive des cellules BALL-1, et on purifie le liquide surnageant

du milieu de culture afin d'obtenir un CBX, purifié L'ac-

tivité totale des 1 QD pg de CBXî purifié obtenus est de 4.200 unités, l'activité spécifique du CBX 1 purifié étant

ainsi de 42 000 unités/mg.

Exemple 17

En opérant comme décrit à l'exemple 7, on cultive des cellules Flow 7000, et on purifie le liquide surnageant du milieu de culture, obtenant ainsi 10,ug de C Bxi purifié L'activité totale du CBX 1 obtenu est de 250 unités, l'activité spécifique du CBX, purifié étant ainsi de

25 000 unités/mg.

Exemple 18

En opérant comme décrit à l'exemple 2, on cultive des lymphocytes de bovins et on purifie le liquide surnageant

du milieu de culture, obtenant ainsi 0,002 mg de CBX 1 pu-

rifié L'activité totale du C Bxi obtenu est de 14 unités, l'activité spécifique du CBX, purifié étant ainsi de

7.000 unités/mg.

Exemple 19

En opérant comme décrit à l'exemple 4, on cultive des cellules BALL-1, et on purifie le liquide surnageant du

milieu de culture, obtenant ainsi 0,2 mg de CBXî purifié.

L'activité totale du CBX 1 obtenu est de 2 300 unités, l'activité spécifique du CBX, purifié étant ainsi de

11.500 unités/mg.

Exemple 20

En opérant comme décrit à l'exemple 6, on cultive des lymphocytes humains, et on purifie le liquide surnageant du milieu de culture, obtenant ainsi une fraction purifiée ayant une masse moléculaire de 40 000 à 50 000 On désigne cette fraction C Bx 2 L'activité totale du 0,25 mg obtenu est de 5 200 unités, l'activité spécifique du C Bx 2 purifié

étant ainsi de 20 800 unités/mg.

Exemple 21

En opérant comme décrit à l'exemple 10, on cultive des cellules BALL-1, et on purifie le liquide surnageant du

milieu de culture, obtenant ainsi 75 Fg de C Bx 2 purifié.

L'activité totale du CBX 2 obtenu est de 10 000 unités, l'activité spécifique du CBX 2 purifié étant ainsi de

133 333 unités/mg.

Le pouvoir rotatoire spécifique de C Bx 2 obtenu ci-dessus est

mesuré comme indiqué à l'exemple 10 C Bx est dextrogyre.

La détermination du spectre IR de C Bx 2 obtenu ci-dessus a été obtenue comme décrit à l'exemple 10 Le spectre est donné à

la Fig 3.

Exemple 22

En opérant comme décrit à l'exemple 7, on cultive des cellules Flow 7000, et on purifie le liquide surnageant du

milieu de culture, obtenant ainsi 20 pg de C Bx 2 purifié.

L'activité totale du C Bx 2 obtenu est de 500 unités, l'ac-

tivité spécifique du CBX 2 purifié étant ainsi de 25 000 unités/mg.

Exemple 23

En opérant comme décrit à l'exemple 2, on cultive des lymphocytes de bovins, et on purifie le liquide surnageant du milieu de culture, obtenant ainsi 0,001 mg de CBX 2 purifié L'activité totale du CBX 2 obtenu est de 40 unités, l'activité spécifique du C Bx 2 purifié étant ainsi de

40.000 unités/mg.

Exemple 24

En opérant comme décrit à l'exemple 4, on cultive des cellules BALL-1, et on purifie le liquide surnageant du

milieu de culture, obtenant ainsi 0,25 mg de C Bx 2 purifié.

L'activité totale du CBX 2 obtenu est de 2 900 unités, l'activité spécifique du CBX 2 purifié étant ainsi de

11.600 unités/mg.

Exemple 25

On met des lymphocytes humains ( 2 x 1010 cellules) en suspension dans 4000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après addition de phytohémagglutinine à une concentration de 50 ug/ml, on cultive la suspension à 37 C pendant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 %

de C 02 et 95 % d'air On dialyse ensuite le liquide surna-

geant du milieu de culture contre un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2) et, à partir-du dialysat, on obtient une fraction

par relargage à l'aide de sulfate d'ammonium à 40-80 %.

On dialyse à nouveau cette fraction contre ledit tampon phosphate, puis on la soumet à une filtration sur gel en utilisant du Sephadex G-100, obtenant ainsi une fraction

ayant une masse moléculaire de 7 000 à 9 000 qui est dési-

gnée fraction CBX 3 brute.

On adsorbe la fraction C Bx 3 brute sur Sephalose asso-

ciée à de la phytohémagglutinine, et on élue à l'aide de

tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2) contenant de la N-acétyl-

D-galactosamine ( 0,5 M) Après élimination de la N-acétyl-

D-galactosamine par dialyse, on fait passer la solution résultante sur carboxyméthylcellulose équilibrée à l'aide d'un tampon phosphate 0,05 M (p H 6,4), puis on élue à l'aide de tampon phosphate 0,05 M (p H 6,4) contenant du chlorure de sodium ( 0,5 M) On obtient ainsi 0,1 mg de

CBX 3 L'activité totale du CBX 3 obtenu est de 5 000 unités.

Exemple 26

On soumet des hamsters nouveaux-nés à un traitement préalable par injection d'anti-sérum préparé sur des lapins de façon classique, afin de réduire leurs réponses immunes

autant que possible, et on les soumet ensuite à une trans-

plantation sous-cutanée de cellules BALL-1, puis on les

alimente pendant 3 semaines On isole les masses des tu-

meurs formées dans le tissu sous-cutané, pesant environ

g, on les broie et on les dissocie dans du sérum physio-

logique Après lavage des cellules obtenues à l'aide de milieu de Eagle exempt de sérum, on met 1 x 101 l de ces cellules en suspension dans 150 litres de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après addition de

9 x 106 pfu de virus Sendai (HVJ), on cultive à 37 C pen-

dant 48 heures dans une atmosphère contenant 5 % de CO 2 et % d'air On dialyse le liquide surnageant du milieu de culture contre un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2) et, à partir du dialysat, on obtient une fraction par relargage

à l'aide de sulfate d'ammonium à 40-80 % On dialyse à nou-

veau cette fraction contre le même tampon phosphate, puis on la soumet à une filtration sur gel en utilisant du Sephadex G-100, obtenant ainsi une fraction ayant une masse

moléculaire de 7 000 à 9 000, désignée fraction C Bx 3 brute.

On adsorbe cette fraction C Bx 3 brute sur Sephalose associée

à contanavaline A, et on élue à l'aide d'un tampon phos-

phate 0,01 M (p H 7,2) contenant du U-méthyl-D-mannoside ( 0,5 M) Apres avoir éliminé le t-méthyl-D-mannoside par

dialyse, on fait passer la solution sur carboxyméthylcel-

lulose équilibrée à l'aide d'un tampon phosphate 0,05 M (p H 6,0), puis on élue à l'aide d'un tampon phosphate 0,05 M (p H 7,8) L'activité totale des 0,2 ml de C Bx 3 obtenus est de 12 000 unités, et son point isoélectrique est de

6,3 à 7,8.

Exemple 27

On met des cellules Flow 7000 ( 3 x 1010 cellules) en suspension dans 1,0 litre de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après addition de phytohémagglutinine à une concentration finale de 50 pg/ml, on cultive à 37 C pendant 48 heures, dans une atmosphère contenant 5 % de C 02 et 95 % d'air On soumet le liquide surnageant du milieu de culture aux opérations décrites à l'exemple 26, afin de purifier le C Bx 3, et on obtient 0,1 mg de CBX 3 L'activité

totale du CBX 3 obtenu est de 3 100 unités.

Exemple 28

On met des lymphocytes de bovins ( 5 x 1010 cellules) en suspension dans 10 litres de milieu de Eagle contenant

% de sérum de veau, et on cultive à 37 C pendant 48 heu-

res, dans une atmosphère contenant 5 % de C 02 et 95 % d'air.

On soumet ensuite le liquide surnageant du milieu de cul-

ture aux opérations décrites à l'exemple 26 afin de purifier CBX 3, et on obtient 0,1 mg-de= f Bf 3 purifié L'activité

totale du CBX 3 purifié est de 1 700 unités.

Exemple 29

* On met des cellules BALL-1 ( 5 x 101 l cellules), qu'on a fait croître par culture cellulaire, en suspension dans litres de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau, et on cultive à 37 C pendant 48 heures, dans une atmosphère contenant 5 % de C 02 et 95 % d'air On dialyse le liquide surnageant du milieu de culture contre un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2), et on obtient une fraction, par relargage à l'aide de sulfate d'ammonium à 40-80 % On dia lyse à nouveau cette fraction contre ledit tampon phosphate puis on la soumet à-une filtration sur gel en utilisant du Sephadex G-100, obtenant ainsi une fraction ayant une

masse moléculaire de 7 000 à 9 000 On adsorbe cette frac-

tion sur Sephalose associée à de la phytohémagglutinine, et on élue à l'aide d'un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2) contenant de la N-acétyl-Dgalactosamine ( 0,5 M) Apres élimination de la N-acétyl-D-galactosamine par dialyse, on fait passer la solution dialysée sur de la carboxyméthyl cellulose équilibrée à l'aide de tampon Tris 0,05 M (p H 8,0), puis on élue à l'aide de tampon Tris 0,05 M (p H 8,0) contenant du chlorure de sodium ( 0,5 M), obtenant ainsi 0,1 mg de C Bx 3 purifié L'activité totale du CBX 3 obtenu est de 8 200 unités, et son point isoélectrique est de

8,0 à 9,2.

Le pouvoir rotatoire spécifique de CBX 3 obtenu ci-dessus

est mesuré comme décrit à l'exemple 10 CBX 3 n'a aucun pou-

voir rotatoire.

Le spectre IR de CBX 3 obtenu ci-dessus est détermine

comme à l'exemple 10 Le spectre est fourni à la Fig 4.

Exemple 30 (Injections aqueuses) C Bx 100 000 unités Chlorure de sodium 9 g Eau distillée pour injection, q s pour faire 1 000 ml On pèse et mélange le CBX et le chlorure de sodium, on dis-

sout dans 500 ml d'eau distillée pour injection, et on amène le volume total à 1 000 ml à l'aide d'eau distillée pour injection On filtre cette solution aqueuse en milieu stérile, en utilisant un filtre à membrane, et on intro-

duit 2 ml de filtrat dans une série de récipients stérili-

sés en verre qu'on scelle, afin d'obtenir des injections aqueuses. Exemples 31 à 33 On procède comme décrit à l'exemple 30, pour préparer des injections aqueuses, contenant respectivement CBX 1, CBX 2 et C Bx 3 Exemple 34 (Injections lyophilisées) CBX 100 000 unités Albumine de sérum humain à 20 % 10 ml Chlorure de sodium 9 g Eau distillée pour injection, q.s pour faire 1 000 ml On pèse et mélange le CBX et le chlorure de sodium, puis on dissout dans une solution obtenue en ajoutant la quantité prédéterminée de l'albumine humaine à 500 ml

d'eau distillée pour injection, et on amène le volume to-

tal à 1 000 ml à l'aide d'eau distillée pour injection On filtre cette solution en milieu stérile, à l'aide d'un filtre à membrane, et on introduit des portions aliquotes de 2 ml de filtrat dans des récipients stérilisés, en

verre, on lyophilise et on scelle, afin d'obtenir une pou-

dre lyophilisée pour injection.

Exemples 35 à 37 On opère comme décrit à l'exemple 34 pour préparer des poudres lyophilisées pour injection, respectivement

à partir de CBXI, CBX 2 et CBX 3.

Exemple 38 (Gouttes pour les yeux) C Bx 100 000 unités Chlorure de sodium 5 g Chlorobutanol 5 g Eau distillée pour injection q.s pour faire 1 000 ml On pèse les ingrédients ci-dessus et on les dissout dans 950 ml d'eau distillée pour injection On amène le volume

total à 1 000 ml, et on filtre la solution en milieu sté-

rile, en utilisant une membrane à filtre, afin d'obtenir

une préparation utilisabhl Qqon agouttes pour les yeux.

Exemples 39 à 41 On opère comme décrit à l'exemple 38 pour préparer des préparations utilisables en gouttes pour les yeux

contenant, respectivement, C Bx, C Bx 2 et CBX 3.

Exemple 42 (Suppositoires) C Bx 100 000 unités Polyethylène glycol 1500 250 g Polyéthylène glycol 4000 environ 750 g 1.000 g

On pèse les ingrédients ci-dessus et on mélange soigneu-

sement toutle C Bx et le polyéthylène glycol 1500 avec 500 g du polyéthylène 4000, après quoi on ajoute le restant du polyéthylène glycol 4000 afin d'obtenir un poids total de 1.000 g, on mélange soigneusement et on présente sous la forme de suppositoires de 5 000 mg, utilisables par voie

rectale, en procédant par fusion.

Exemples 43 à 45 On procède comme décrit à l'exemple 42 pour préparer

des suppositoires (pour voie rectale) contenant respecti-

vement CB Xl, CBX 2 et CBX 3.

Exemple 46 (Gouttes nasales) C Bx 100 000 unités Chlorure de sodium 5 g Chlorobutanol 5 g Eau distillée, q s pour faire 1 000 ml On pèse les ingrédients ci-dessus, et on les dissout

dans 950 ml d'eau distillée On amène la solution résul-

tante à un volume total de 1 000 ml à l'aide d'eau distil-

lée, afin de préparer une solution pour gouttes nasales.

Exemples 47 à 49 On opère comme décrit à l'exemple 46, pour préparer

des solutions pour gouttes nasales contenant, respective-

ment, CBX 1, CBX 2 et CBX 3.

Exemple 50 (Comprimés à enrobage entérique) C Bx 100 000 unités Lactose 64 g Fécule de pomme de terre env 30 g Alcool polyvinylique 3 g Stearate de magnésium 3 g On pèse respectivement les ingrédients ci-dessus;on mélange la quantité totale de C Bx et de lactose, ainsi qu'environ

la moitié de la fécule de pomme de terre; puis on addi-

tionne le mélange du restant de la fécule de pomme de ter-

re de façon à obtenir un poids total de 94 g, et on agite le mélange jusqu'à ce qu'il soit homogène Au mélange

résultant on ajoute une solution aqueuse d'alcool polyvi-

nylique, et on prépare des granulés en faisant appel au

procédé de granulation par voie humide On sèche les gra-

nulés, on les mélange avec le stearate de magnésium, et on

les comprime en comprimés de 200 mg On enrobe les compri-

més avec du phtalate de méthyl cellulose, afin d'obtenir

des comprimés à enrobage entérique.

Exemples 51 à 53 On opère comme décrit à l'exemple 50 afin de préparer

des comprimés à enrobage entérique contenant, respective-

ment, CBX 1, CBX 2 et C Bx 3.

Exemple 54 (Pommade) C Bx 100 000 unités Paraffine liquide 10 g Vaseline env 1 000 g 1.000 g On pèse respectivement les ingrédients ci-dessus,puis on malaxe soigneusement le CBX avec la paraffine liquide,

on ajoute 500 g de la Vaseline, et on mélange soigneuse-

ment On additionne progressivement le mélange du restant de la Vaseline, afin d'obtenir un poids total de 1 000 g, et on mélange soigneusement le mélange afin de préparer

une pommade.

Exemples 55 à 57 On opère comme décrit à l'exemple 54 pour préparer

des pommades contenant, respectivement, CB Xl, CBX 2 et CBX 3.

Claims (15)

REVENDICATIONS

1 Une forme pratiquement purifiée d'une glycoprotéi-

ne (CB) produite par des-celllues-d'animaux à sang chaud, ayant un effet antitumoral, et présentant les propriétés suivantes: (a) masse moléculaire: d'environ 7 000 à 90 000, par filtration sur gel Sephadex ou électrophorèse sur gel SDS;

(b) réactions colorées: présente une coloration indi-

quant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'amino acides dans la réaction à la ninhydrine après

hydrolyse à l'aide d'acide chlorhydrique, et une colora-

tion indiquant la présence de sucres dans la réaction

phénol-acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfu-

rique, la réaction kndole-acide sulfurique et la réaction tryptophaneacide sulfurique; c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; d) teneur en sucres: la teneur en sucresest de 8 à %, teneur dans laquelle de 6 à 28 % des sucres totaux sont des hexoses, de 1 à 11 % sont des hexosamines et de 1 à 6 % sont des acides siali 5 ues; e) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H

7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solu-

tion aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; et f) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules

tumorales sans sensiblement endommager les cellules norma-

les.

2 Une forme pratiquement purifiée d'une glycoprotéi-

ne (C Bx) suivant la revendication 1, ayant un effet anti-

tumoral, et présentant les propriétés suivantes: (a) masse moléculaire: de 12 000 à 17 000:

(b) réactions colorées: présente une coloration indi-

quant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'aminoacides dans la réaction à la ninhydrine après

hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une coloration indi-

quant la présence de sucres dns la réaction phénol-acide

sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réac-

tion indole-acide sulfurique et la réaction tryptophane_ acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de 27 à 33 %, teneur dans laquelle de 17 à 20 % des sucres totaux sont des hexoses, de 5 à 7 % sont des hexosamines et de 5 à 6 % sont des acides sialiques; (e) point isoélectrique: de 4,2 à 7,3; (f) adsorbabilité: adsorbable sur Sephadex associé à Ulex europeus agglutinine dans un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); (g) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus;

(h) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellu-

les tumorales sans sensiblement endommager les cellules normales; et (i) différenciation: induit une différenciation entre

les cellules tumorales.

3 Une forme pratiquement purifiée d'une glycoprotéi-

ne (C Bxl) suivant la revendication 1, ayant un effet anti-

tumoral et présentant les propriétés suivantes: (a): masse moléculaire: de 70 000 à 90 000;

(b) réactions colorées: présente une coloration indi-

quant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'aminoacides dans la réaction à la ninhydrine après

hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une coloration indi-

quant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide

sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réac-

tion indole-acide sulfurique et la réaction tryptophane-

acide sulfurique; (c) aspect et s Qlubi J 4 té poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de à 45 %, teneur dans laquelle de 23 à 28 % des sucres totaux sont des hexoses, de 8 à 11 % sont des hexosamines et de 4 à 6 % sont des acides sialiques; (e) point isoélectrique: de 4,3 à 6,2; (f) adsorbabilité: adsorbable sur Sephadex associé à Ulex europeus agglutinine dans un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); (g) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; (h) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les

cellules normales.

4 Une forme pratiquement purifiée d'une glyco-

protéine (C Bx 2)suivant la revendication 1, ayant un effet antitumoral et présentant les propriétés suivantes: (a): masse moléculaire: de 40 000 à 50 000; (b) réactions colorées: présente une coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'aminoacides dans la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une coloration

indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-

acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique,

la réaction indole-acide sulfurique et la réaction trypto-

phane-acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres; la teneur en sucres est de 30 à 37 %, teneur dans laquelle de 20 à 23 % des sucres totaux sont des hexoses, de 6 à 8 % sont des hexosamines et de 4 à 6 % sont des acides sialiques; (e) point isoélectrique de 4,2 à 7,3; (f) adsorbabilité: adsorbable sur Sephadex

associé à Ulex europeus agglutinine dans un tampon phos-

phate 0,O 1 M (p H 7,2); (g) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; et (h) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les

cellules normales.

Une forme pratiquement purifiée d'une glyco- protéine (C Bx 3) suivant la revendication 1, ayant un effet anti-tumoral et présentant les propriétés suivantes: (a): masse moléculaire: de 7 000 à 9 000;

(b): réactions colorées: présente une colo-

ration indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'aminoacides dans la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une coloration indiquant la présence de sucres dans

la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction anthrone-

acide sulfurique, la réaction indole-acide sulfurique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de 8 à 15 %, la teneur dans laquelle de 6 à 10 % des sucres totaux sont des hexoses, de 1 à 2 % sont des hexosamines et de 1 à 3 % sont des acides sialiques;

(e) adsorbabilité: adsorbable sur carboxy-

méthylcellulose en chromatographie d'échange d'ions dans dans un tampon phosphate O,05 M (p H 6,4), en utilisant de la carboxyméthylcelju 1 ose (f) stabilité t stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; (g) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les cellules normales; et (h) la séquence des aminoacides sur l'azote

terminal de la portion protéinique est Alanine-Alanine.

6 Procédé de préparation d'une glycoprotéine (CB) ayant notamment un effet antitumoral, consistant à cultiver une source de cellules provenant d'animaux à sang chaud, et à extraire de ladite source de cellules ou d'un liquide surnageant cultivé de celle-ci une forme pratiquement purifiée d'une glycoprotéine présentant les propriétés suivantes: (a) masse moléculaire: d'environ 7 000 à 90 000, par filtration sur gel Sephadex ou électrophorèse sur gel SDS; (b) réactions colorées: présente une coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'amino acides dans la réaction à la ninhydrine

après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une colo-

ration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réaction indoleacide sulfurique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate et peu-soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de 8 à 45 %, teneur dans laquelle de 6 à 28 % des sucres totaux sont des hexoses, de 1 à 11 % sont des hexosamines et de 1 à 6 % sont des acides sialiques; e) stabilité; stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 Qu p H 11,Q à 40 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; et f) cytotoxicité; endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les

cellules normales.

7 Procédé suivant la revendication 6, caracté-

risé en ce que la glycoprotéine (C Bx) présente les propriétés suivantes (a) masse moléculaire: de 12 000 à 17 000: (b) réactions colorées: présente une coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'aminoacides dans la réaction à la ninhydrine

après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une colo-

ration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réaction indoleacide sulfurique et la réaction trytophane acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de 27 à 33 %, teneur dans laquelle de 17 à 20 % des sucres totaux sont des hexoses, de 5 à 7 % sont des hexosamines et de 5 à 6 % sont des acides sialiques; (e) point isoélectrique: de 4,2 à 7,3; (f) adsorbabilité: adsorbable sur Sephadex associé à Ulex europeus agglutinine dans un tampon phosphate 0,O 1 M (p H 7,2); (g) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2,0 p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; (h) çytotoxicité; endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les cellules normales,; et

(i) différenciation: induit une différen-

ciation entre les cellules tumorales.

8 Procédé suivant la revendication 6, caracté-

risé en ce que la glycoprotéine (C Bxl) présente: (a) masse moléculaire: de 70 000 à 90 000; (b) réactions colorées: présente une coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'aminoacides dans la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une coloration

indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-

acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réaction indole-acide sulfurique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de 35 à 45 %, teneur dans laquelle de 23 à 28 % des sucres totaux sont des hexoses, de 8 à 11 % sont des hexosamines et de 4 à 6 % sont des acides sialiques; (e) point isoélectrique: de 4,3 à 6,2; (f) adsorbabilité: adsorbable sur Sephadex associé à Ulex europeus agglutinine dans un tampon phosphate 0,O 1 M (p H 7,2); (g) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; (h) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les

cellules normales.

9 Procédé suivant la revendication 6, carac-

térisé en ce que la glycoprotéine (C Bx 2) présente les propriétés suivantes % (a); masse moléculaire: de 40,000 à 50 000; (b) réactions colorées; présente une coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry,;une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'aminoacides dans la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une coloration

indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-

acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique,

la réaction indole-acide sulfurique et la réaction tryp-

tophane-acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de 30 à 37 %, teneur dans laquelle de 20 à 23 % des

sucres totaux sont des hexoses, de 6 à 8 % sont des hexo-

samines et de 4 à 6 % sont des acides sialiques; (e) point isoélectrique: de 4,2 à 7,3; (f) adsorbabilité: adsorbable sur Sephadex

associé à Ulex europeus agglutinine dans un tampon phos-

phate 0,01 M (p H 7,2); (g) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2, 0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; (h) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les

cellules normales.

Procédé suivant la revendication 6, caracté-

risé en ce que la glycoprotéine (C Bx 3) présente les propriétés suivantes: (a): masse moléculaire: de 7 000 à 9 000; (b) réactionscolorées: présente une coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, une coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d'ffinoacides dans la réaction à la ninhydrine

après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, et une colora-

tion indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réaction indoleacide sulfurique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; (c) aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; (d) teneur en sucres: la teneur en sucres est de 8 à 15 % teneur dans laquelle de 6 à 10 % des sucres totaux sont des hexoses, de 1 à 2 % sont des hexosamines et de 1 à 3 % sont des acides sialiques;

(e) adsorbabilité: adsorbable sur carboxyméthylcel-

lulose en chromatographie d'échange d'ions dans un

tampon phosphate 0,05 M (p H 6,4) utilisant de la carbo-

xyméthylcellulose; (f) stabilité: stable en solution aqueuse à p H 2,0 ph 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant 24 heures ou plus, et en solution aqueuse à p H 7,0 à 60 C pendant 3 heures ou plus; (g) cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tumorales sans sensiblement endommager les cellules normales; et

(h) la séquence des aminoacides sur l'azote ter-

minal de la portion protéinique est Alanine-Alanine.

11 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que les sources de cellules sont choisies parmi les cellules réticulo-endothéliales, les lymphoblastes, les cellules leucémiques et les fibroblastes, lesquelles sources de cellules peuvent être des cellules non établies

ou des lignées cellulaires établies.

12 Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les lignées cellulaires établies sont choisies parmi BALL-1, TALL-1, NALL-1, Namalwa, M-7002, B-7101, Flow 7000, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, BALM 2 et CCRF-SB,

qui sont toutes d'origine humaine.

13 Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les lignées cellulaires établies sont choisies parmi: les cellules BALB/C 3 T 3 de la souris, les cellules L 1210 de leucémie de la souris, P 388, le clone M-3 du mélanome de la souris, les cellules tumorales LLC-WRC 256 du rat, et les cellules RPMI 1846 du mélanome du rat, qui proviennent toutes d'animaux à sang chaud autres que l'homme. 14 Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules non établies sont choisies parmi

les macrophages humains et les lymphocytes humains.

Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules non établies sont choisies parmi

les lymphocytes et macrophages d'animaux à sang chaud au-

tres que l'homme.

16 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on transplante directement des cellules d'une

lignée cellulaire établie, provenant de l'homme ou d'ani-

maux à sang chaud autres que l'homme, dans l'organisme d'animaux à sang chaud d'espèce identique ou différente et on extrait la glycoprotéine des tumeurs formées par les cellules transplantées, soit directement, soitaprès

culture de la tumeur suivie de croissance in vitro.

17 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on introduit des chambres de diffusion, qui ont été inoculées à l'aide de sources de cellules provenant d'une lignée cellulaire établie d'origine humaine ou

d'animaux à sang chaud autres que l'homme, dans l'organis-

me d'animaux à sang chaud afin qu'elles soient alimentées

par un fluide organique desdits animaux, on cultive les-

dites sources de cellules et on extrait la glycoprotéine

a partir des sources de cellules cultivées, soit directe-

ment, soit après culture suivie de croissance in vitro.

18 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé

en ce que les sources de cellules sont exposées à l'ac-

tion d'un ou plusieurs inducteurs.

19 Agent thérapeutique antitumoral, caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, une quantité

antitumorale efficace d'au moins une glycoprotéine choi-

sie parmi les glycoprotéines C Bx, C Bx 1, C Bx 2 et C Bx 3 ayant un effet antitumoral, selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, éventuellement en association avec un

véhicule ou excipient thérapeutiquement acceptable.

Agent suivant la revendication 19, caractérisé en ce que l'ingrédient actif est un mélange d'au moins deux glycoprotéines choisies parmi les glycoprotéines C Bx,

C Bxl, CBX 2 et C Bx 3, en toute proportion souhaitée.