JPH03501620A - 腫瘍壊死増強因子並びに製造及び使用の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 瘍壊　増強因　並びに製造　び　の　法この出願は、１９８８年７月１５日付出 願の米国特許出願第２１９．６５０号の一部継続出願であり、米国特許出願第２ １９．６５０号の内容は本明細書に参考として含まれる。

ここに説明する本発明は、ｔｈｅ　Ｐｕｂ！ｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃ ｅ。

Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　）Ｉｕｓ＋ａ ｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓがら番号第ＣＡ　４３９０２号、第１（Ｌ　３４６２５号 、第１（Ｌ　４２８３３号及び第１１Ｌ　４２５０７号の下に認可された研究の 過程で行なわれた０本発明に米国政府は一定の権利を有する。

１１匹１１ 本明細書では、様々な刊行物がアラビア数字によって参照しである。そのように 参照した刊行物の完全な表記は、本明細書末尾において請求の範囲の直前に示す 、参照刊行物の開示はその総てが、本発明が係わる分野の先行技術のより十分な 説明のため本明細書に参考として含まれる。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）　（１）であり、 このサイトカインは内皮を含めた様々な細胞標的に作用することが判明している （１）、内皮細胞は血管内腔面を構成するので、ＴＮＦが誘導する内皮細胞特性 変化は血管壁の基本的な血液適合性を変換し得る。これに関連して、内皮はＴＮ Ｆに対する特異的なレセプターを有することが判明しており、ＴＮＦとそれらの レセプターとの相互作用の結果として凝固特性の調節が挙げられる（２−３）、 即ち、内皮の凝固表現型が、血液の流動性を高めるｔｌ！１１１が優勢である静 止状態から前凝固経路（ｐｒｏｃｏａＨｕｌａｎｔ　ｐａｔｈｗａｙｓ）が増強 される揺動状態に変換される（３）。

このような変化は血餅の形成を惹起しがちであるが、ＴＮＦをマウスに１四重た り１〜１０μｇの用量で注入しても広範な血餅形成は観察されない、これに対し て、上記と同じＴＮＦ用量において、ｍｅｔｈＡ線維肉腫を持つマウスで腫瘍の 壊死は起こらず、腫瘍床全体にわたる血餅形成が見られる（４）。

そこで、腫瘍細胞由来物質がＴＮＦと共働作用して腫瘍を壊死させるかどうかを 調べる研究が行なわれた。そのような腫瘍細胞由来物質は、成る種の腫瘍がＴＮ Ｆに応答する一方、他の腫瘍はＴＮＦ結合部位が存在してもＴＮＦに応答しない 理由を説明し得るであろう、腫瘍を壊死させるそのような物質は、腫瘍を取り巻 く、及び腫瘍を形成する他の細胞要素に作用するのと同様血管壁にも作用し得る 。この物質はＴＮＦが誘発する出血性壊死を幾つかの機構を介して助長し得、そ れらの機構のうちの一つは、丁ＮＦまたは他のモノカインのような物質が実現す る内皮細胞の前凝固活性の向上を更に強化することによる。この研究では、腫瘍 細胞由来物質が、ＴＮＦが内皮において誘導する前凝固活性を向上させるかどう かも調べられた。

上記研究の結果、培養中のｍｅｔｈ　Ａ線維肉腫細胞が、ＴＮＦが内皮でのその 合成を誘導する主要な前凝固組織因子の産生を助長する腫瘍壊死増強因子（ＴＮ ＥＦ）を産生ずることが判明した。

１１へ」」 本発明は、精製した腫瘍壊死増強因子に係わる。好ましい一実施態様において、 本発明のポリペプチドは、非還元条件下では約４０，０００〜約５０，０００ダ ルトン、還元条件下では約６５，０００〜約７５，０００ダルトンの見掛けの分 子量を有すること、及び約６．８及び約７．２に等電点電気泳動ビークを有する ことを特徴とする０本発明の因子は更に、プロテアーゼにで処理すると活性を喪 失すること、ヘパリン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に親和性で、かつ ヘパリン−セファロースから約０．５ＭのＮａＣｌで溶離できること、逆相ＦＰ ＬＣ−ＰｒｏＲＰＣカラムに結合し得、かつ上昇メタノール勾配巾約５０％で、 結合した逆相ＦＰＬＣ−ＰｒｏＲＰＣカラムから溶離できること、５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル上で単一バンドとして移動し得ること、及びコンカナバリン ＾−セファロースに吸着することを特徴とする。

本発明はまた、精製した腫瘍壊死促進因子の、生物学的に活性である精製フラグ メントにも係わり、このフラグメントは約１０，０００〜約ａｏ、ｏｏｏダルト ンの見掛けの分子量を有すること、トリプシンまたは熱で処理すると活性を喪失 すること、ヘバリンウルトロゲル（Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）に親和 性で、かつヘパリンウルトロゲルから約０．５ＨのＮａＣＩで溶離できること、 Ｍｏｎｏ　Ｑカラムに結合し得ること、及び上昇塩勾配において約０．４ＭのＮ ａＣＩで、結合したＭｏｎｏ　Ｑカラムから溶離できることを特徴とする。

本発明は、細胞障害性薬剤の腫瘍阻害活性を向上させる有効量の腫瘍壊死増強因 子と、医薬上許容可能なキャリヤとを含有する医薬組成物にも係わる。

本発明は、精製した腫瘍壊死増強因子の生物学的に活性なフラグメントを、細胞 障害性薬剤の腫瘍阻害活性を向上させる有効量で含有し、かつ医薬上許容可能な キャリヤを含有する医薬組成物にも係わる。

図　の　゛　ｆｉ　日 第１図：腫瘍ｔらし神土の存　にＴＮＦに応“して　、される　細　組　の１ Ａ、：　図中に表記した稀釈比を有する、ｍｅｔｈ＾肉腫細胞からのならし培地 を、無血清培地（ｐＨ７，４の１０ｍＨＨＥＰＥＳと、２０μ８７ｍ１のトラン スフェリンと、１０μｇ／ｍｌのインシュリンと、１μｇ／−１のポリミキシン Ｂと、５１１μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンとを含有するＲＰＭＩ）中の内皮 細胞と共、にインキュベートした。培養物は、無血清培地のみ（記号”ｏ’″） か、ＴＮＦ（０，１ｎＨ）のみ（記号”ＴＮＦ”　）か、稀釈しないならし培地 のみ（記号“ＣＭ”）か、または表記稀釈比を有するならし培地と共に存在する ＴＮＦ（記号”ＴＮＦ＋ＣＭ”）を含有した。各添加は１０μｍの量で行ない、 無血清培地の量は１ｍｌであった。３７°Ｃで７時間インキュベートした後、単 層を洗浄し、新しい無血清培地（０，５ｍ１）を因子■ａ及び／またはＸと共に 添加した。

８分後、反応を停止させて因子Ｘａの形成を評価した。！！影を付した棒は、Ｔ ＮＦの存在下に腫瘍ならし培地（稀釈比１／２）に晒し、その後ヒト組織因子に 対する精製モノクローナル抗体（１０ＡＬｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１時間イン キュベートした培養物に対応する０次に、因子■ａ及びＸを添加した。精製した マウスＩｇＧ（１０Ｊｉｇ／ｍｌ及び１００μｇ／輸１）は、にのアッセイで測 定した内皮細胞凝固活性に影響を及ぼさなかった。黒く塗り潰した棒は、ＴＮＦ の存在下に腫瘍ならし培地（稀釈比１／２）と共にインキュベートして、因子Ｘ のみの存在下に凝固アッセイを行なった培養物に対応する。図示した結果は、３ 回の測定の平均値±ＳＥＮである。腫瘍ならし培地をＳ内皮細胞を含有しない因 子■ａ−ＸミーＸインキュベーションに直接添加した場合、因子Ｘａの生成は未 処理の対照と同じであった。

Ｂ；　（上段Ａに述べたようにして得た）腫瘍ならし培地（１（１）１）をセフ ァデックス６１５０カラム（０，９Ｘ　５５ｃ＋ｎ＞に掛け、ＩＯｍＨＨＥＰＥ Ｓ（ｐＨ７，４）、０．１Ｎ　ＮａＣｌで溶離して両分（１，３＋ｎｌ）を集め た。

図中に表記した番号のカラム画分のアリコートを１／４に稀釈してから、ＴＮＦ 　（０、１μＭ）の存在下に内皮細胞単層と共に３７℃で７時間インキュベート した０組織因子アッセイを上段な因子Ｘｉを示す（平均値±５ＥＮ）　、記号” ＴＮＦ”は、ＴＮＦ（０，１μＭ）及びカラム緩衝液のみと共にインキュベート した細胞を示す、カラム画分１〜９はこのアッセイでは不活性であった。ゲル濾 過カラムは、リボヌクレアーゼ（１３，７００）、キモリブシノーゲン＾（２５ ，０００）、オボアルブミン（４３，０００）及アルブミン（６７，０００）を 含む標準タンパク質を用いて較正み゛のヘパ１ン　ルトロ′ルＩＢＦ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ、５ａｖａ　ｅ　Ｍａｒ　１ａｎｄ　ロマト　−フイーの； 　このグラフ（左手）は、樹脂に吸着させたＴＮＥＦ活性がンバク質塊と共に０ ．５８　ＮａＣｌで溶離され、ＦＣＦ及び腫瘍細由来マイトジェンが見いだされ るような高い濃度では溶されなかったことを示す。

：　第２Ｂ図のこのグラフ（右手）に示した塩勾配溶離は、勾配の終点に向かっ てＴＮＦ活性が、カラムに掛けたタンク質の大部分から十分分離されて溶出した ことを表してる。

３図：ヘパ１ンウルトロ　ル　−ム）　したプールＦ　Ｐ　Ｌ　Ｃｇ　ｏマドグ ーフィーＭＯｎ。

ラムＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、Ｐｉｓｃａｔ、ａｗａ　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ 　でのクヱ上ノーと１土ニー 増加する塩の勾配に従って生起する溶離を適用したく溶は約０．４ＨのＮａＣｌ において起こった）、ここでも、ＴＮＥＦ活性が、カラムに掛けたタンパク質の 大部分から分離された。

第４図：ｍｅｔｈ＾ｆ　上Ｍｏｎｏ　Ｓ　び　ＦＰＬＣ肥ｉｋ寞のクロマトグー フィーに＋（るこ　に　るＴＮＥＦの　１ Ａ：　ｍｅｓｈ＾ならし培地を培養物から取り出し、硫安沈澱させ、透析し、Ｑ −セファロースに負の吸着を行なわせ、その（ｉＭｏｎｏ　Ｓでのクロマトグラ フィーを実施した。上昇塩勾配〈破線）でカラムからの溶離を行ない、その際勾 配終点における最高塩濃度は０．５Ｍであったゆ両分のタンパク質含量を、一部 精製した腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）を細胞と共に７時間インキュベートした 後に内皮培養物において誘導された組織因子活性に対してプロットする（ピーク 活性を有する両分の結果のみ示す）。

Ｂ＋ＭｏｎｏＳカラムから溶離した活性のプールを逆相ＰｒｏＲＰＣカラムに掛 け、上昇メタノール勾配で溶離した（勾配終点での最高メタノール濃度は１００ ％であった）、　２８０μｍでのＯＤを、上段Ａに述べたような内皮培養物にお いて誘導された組織因子活性に対してプロットする。第４八図及び第４Ｂ図に示 した組織因子活性は、２回の反復測定の平均値である。

ｉｉ二１１１１１ 本発明は、精製した腫瘍壊死増強因子に係わる。好ましい一実施態様において、 本発明の因子はポリペプチドであり、このポリペプチドは、非還元条件下では約 ４０，０００〜約５０．０００ダルトン、還元条件下テハ約６５，０００〜約７ ５．ＯＯ’Ｏダルトンの見掛けの分子量を有し、その際非還元性の５ＯＳ−ポリ アクリルアミドゲル上での見掛けの分子量は好ましくは約４４，０００ダルトン であり、還元性の５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上での見掛けの分子量は約７ ０，０００ダルトンであること、及び約６．８及び約７．２に等電点電気泳動ピ ークを有することを特徴とする。本発明の因子は更に、プロテアーゼにで処理す ると活性を喪失すること、ヘパリン−セファロースに親和性で、がっヘパリン− セファロースがら約０．５８のＮａＣｌで溶離できること、逆相ＦＰＬＣ−Ｐｒ ｏＲＰＣカラムに結合し得、かつ上昇メタノール勾配巾約５０％で、結合した逆 相ＦＰＬＣ−ＰｒｏＲＰＣカラムがら溶離できること、５ＯＳ−ポリアクリルア ミドゲル上で単一バンドとして移動し得ること、及びコンカナバリン＾−セファ ロースに吸着することを特徴とする。

本発明はまた、精製した腫瘍壊死増強因子の、生物学的に活性である精製フラグ メントにも係わり、このフラグメントは約１０，０００〜約３０，０００ダルト ン、好ましくは約２０，０００ダルトンの見掛けの分子量を有すること、トリプ シンまたは熱で処理すると活性を喪失すること、ヘバリンウルトロゲルに親和性 で、かつヘパリンウルトロゲルから約０．５ＨのＮａＣＩで溶離できること、Ｍ ｏｎｏ　Ｑカラムに結合し得ること、及び上昇塩勾配において約０．４ＨのＮａ ＣＩで、結合した・Ｍｏｎｏ　Ｑカラムから溶離できることを特徴とする。

精製した腫瘍壊死増強因子は好ましくは、例えばヒト、ラットまたはマウスなど の動物に由来する。ヘバリンウルトロゲルは、ヘパリンとＵｌｔｒｏｇｅｌ＾４ 即ち４％アガロースとを、炭素原子６個のスペーサーアームを用いてエビクロロ ヒドリンで結合することによって得られる。ヘパリンウルトロゲルはＩＢＦ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｃｏ、、　Ｓａｖａｇｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄがら 入手可能である。　Ｍｏｎｏ　Ｑ（商標〉カラムは、Ｍｏｎｏ　Ｑ（商標）、即 ちタンパク質のクロマトグラフィー分離のためにきわめて狭い粒径分布を有する 単分散親水性ポリマービーズを予め装填したイオン交換カラムである（ｐＨ２〜 １２）、　Ｍｏｎｏ　Ｑ（商標）カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｐ ｉｓｃａｔａｗｍｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙがら入手可能である。Ｃｏｎ＾− セファロースは、コンカナバリン＾をセファロースに結合、することによって得 ることがる。Ｃｏｎ　八−セファロースはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｐ ｉｓｃａｔａ−、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙから入手可能である。ヘパリン−セフア ースは、ヘパリンをセファロースに結合することによつ）ることができる。ヘパ リン−セファロースはＰｈａｒａ＋ａ−Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　 ＮｅＩＩＪｅｒｓｅｙから入手可能である。

、ＲＰＣは逆相カラムであり、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ。

ｒ　Ｊｅｒｓｅｙから入手可能である。

仁発明は、腫瘍壊死増強因子をコードする精製したＤＮＡ子、ｃＤＮＡ分子また は単離したゲノムＤＮＡ分子、及び生物的に活性な腫瘍壊死増強因子フラグメン トをコードする、製したＤＮＮＡ子、ｃＤＮ八分子分子は単離したゲノムＤ１１ 八分子も係わる。上記のようなりＮＡは当業者には、公知方法をいて直ちに取得 でき、即ち例えばオリゴヌクレオチドプーブを調製し、このプローブをＤＮＡの 取得に用いること可能であり、その際プローブは腫瘍壊死増強因子のアミ酸配列 に基づいて調製するが、このアミノ酸配列は自動＾配列決定法のような慣用方法 で直ちに決定することがきる。

本発明は、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強する有量の腫瘍壊死増強因子と 、医薬上許容可能なキャリヤとを含有する医薬組成物を提供する１本発明はまた 、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強する有効量の、生物学的に活性な腫瘍壊 死増強因子フラグメントと、医薬上許容可能なキャリヤとを含有する医薬組成物 も提供する。医薬上許容可能なキャリヤには、水及び他の慣用キャリヤ、即ち例 えばマンニトールのような糖の水溶液が包含される。

本発明は、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強する有効量の腫瘍壊死増強因子 と、医薬上許容可能なキャリヤとを含有し、更に腫瘍の増殖を阻止す′る有効量 の腫瘍壊死因子をも含有する医薬組成物も提供する。

本発明は、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強する有効量の、生物学的に活性 な腫瘍壊死増殖因子フラグメントと、医薬上許容可能なキャリヤとを含有し、更 に腫瘍の増殖を阻止する有効量の腫瘍壊死因子をも含有する医薬組成物も提供す る。

本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法、特に腫瘍細胞の増殖を血管系内で限 局的に阻止する方法も提供し、この方法は、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増 強する有効量の腫瘍壊死増強因子の存在下に腫瘍細胞を腫瘍阻止有効量の細胞障 害性薬剤と接触させることを含む、−具体例として、細胞障害性薬剤は腫瘍阻止 活性を有するポリペプチド組織因子であり、好ましくは腫瘍壊死因子である。

本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法、特に腫瘍細胞の増殖を血管系内で限 局的に阻止する方法であって、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強する有効量 の、生物学的に活性な腫瘍壊死増強因子フラグメン１〜の存在下に腫瘍細胞を腫 瘍阻止有効量の細胞障害性薬剤と接触させることを含む方法も提供する。−具体 例として、細胞障害性薬剤は腫瘍阻止活性を有するポリペプチド組織因子、即ち 例えば腫瘍壊死因子である。

本発明は、腫瘍細胞を有効量の医薬組成物と接触させることを含む腫瘍細胞増殖 阻止方法も提供し、その際医薬組成物は細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強す る有効量の腫瘍壊死増強因子と、医薬上許容可能なキャリヤとを含有する。

本発明は、腫瘍細胞を有効量の医薬組成物と接触させることを含む腫瘍細胞増殖 阻止方法であって、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強する有効量の、生物学 的に活性な腫瘍壊死増強因子フラグメントと、医薬上許容可能なキャリヤとを含 有する医薬組成物を用いる方法も提供する。

本発明は、腫瘍を有する被験者の治療方法であって、細胞障害性薬剤（ｃｙｔｏ ｔｏｘｉｃ　ａｇｅｎｔ、）の腫瘍阻止活性を増強するのに有効な量の腫瘍壊死 増強因子と医薬上許容し得るキャリヤーとを含み腫瘍壊死を起こす効果を示す医 薬組成物を、被験者に適量投与することからなる方法も提供する。

本発明は、腫瘍を有する被験者の治療方法であつＹ、細胞障害性薬剤の腫瘍阻止 活性を増強するのに有効な量の腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントと 医薬上許容し得るキャリヤーとを含み腫瘍壊死を起こす効果を示す薬剤組成物を 、被験者に適量投与することからなる方法も提供する。

本発明は腫瘍壊死増強因子の製造方法にも係わる。この方法は、腫瘍細胞から前 記因子を取り出し、取り出した因子を精製することからなる。

本発明は腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントの製造方法も提供する。

この方法は、腫瘍細胞から前記フラグメントを取り出し、取り出したフラグメン トを精製することからなる。

本発明はまた、腫瘍壊死増強因子が産生されるような条件で適当な宿主内に腫瘍 壊死増強因子をコードする精製分子を発現させ、産生された因子を取り出し、取 り出〉因子を精製することからなる、腫瘍壊死増強因子の製汀法も提供する０本 発明は更に、腫瘍壊死増強因子の生ｒ的活性フラグメントが産生されるような条 件で適当なｔ内に腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントを一ドする精製 ＤＮＡ分子を発現させ、産生されたフラグメトを取り出し、取り出したフラグメ ントを精製することらなる、腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメント製造 方法も提供する。適当な宿主としては、細菌、例えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｅ ｏｌｉ（大腸菌）、哺乳動物細胞及びイースト胞が挙げられる。このような宿主 内でＤＮＡを発現させる法、並びにこれらの宿主内で産生された腫瘍壊死増強図 のようなポリペプチドを取り出し、取り出した因子を精する方法は当業者には良 く知られている。

以下に実験の詳細説明及び実験に関する考察を記述して、発明をより明らかにす る。但し、これらの項目は本発明理解を助けるためのものであって、本発明の範 囲を限定ることはないと理解されたい。

ｔ＝ｉｕｔＫ朋− 且ｌＬＬえ 第１の実験ニア主　び七１．−白九　六ｍｅｔｈ＾肉腫に対するＴＮＦの効果を ｉｎ　ｖｉｖｏで調べるために、Ｂａ１ｂ／ｃマウスにｍｅｔｈ＾肉腫細胞（Ｍ ｅｍｏｒｉａｌ　５ｌｏａｎ−Ｋｅｔ、Ｌｅ−ｒｉｎｇＣａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔ ｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、のＤｒ、　Ｈｏｆｆｍａｎ及びＤｒ。

Ｏｌｄから入手したもの（７）、１０ｓ細胞／動物）を皮肉注射した。

７〜１０日後、腫瘍が直径約１ｃｍの大きさになった時点で、マウスの尾の静脈 にＴＮＦを単独で（３１１８／動物）注射するか、又はＴＮＦをヒトフィブリノ ーゲンの存在下（１００ｕｇ／動物）もしくは＋２１１フイブリノーゲンの存在 下（７，５，ｇ／動物）で注射した６組換えヒトＴＮＦ（１０＠Ｕ／顛ｇ）はＢ ＡＳＦ　（Ｆ　、Ｒ、Ｇ　、　）から大量に入手した。この製剤（ｐｒｅｐａｒ ａｔ　１ｏｎ）は５ＯＳ−ＰＡ（：Ｅ上で均質であり、前述のリンフォトキシン とは別のものであった（８）。

ＴＮＦを前述のごとく熱で不活性化した（８）。Ｄｒ、Ｊ、阿ｅｉｔ、ｚ（Ｈａ ｍｉｔｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　０ｎｔａｒｉｏ、　Ｃａｎａｄａ）に よって提供された精製度の高いヒトフィブリノーゲンをラクトペルオキシダーゼ 法（９）によって放射性標識しく１５０ｍｕＣｉ／煽ｇ）、また還元５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥ上、このフィブリノーゲンはα鎖、β鎖及びγ鎖に対応する強度の異なる ３つのバンドとして移動した。

ＴＮＦ注入後の所定の時間に、腫瘍中の放射性フィブリン沈着／蓄積を下記の方 法で評価した。形悪学的研究を行うべく、マウスに麻酔をかけて、全身拍動心臓 潅流固定（ｍｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ　ｂｅａｔｉｎｇ　ｈｅａｒｔ　ｐｅｒｆｕｓ ｉｏｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ）（９（１＋−１１０ｍ１ＩＩ／Ｈｇ）にかけた。１ ′■−フィブリノーゲンの注入の後で組織の一部を取り出し、計量し且つガンマ 計数器で試料の計数を行うことによって、マウス組紐への放射能の取込みを測定 した。腫瘍組織を切り取り、メスで細かくきざみ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００＜ ２％）及びプロテアーゼインヒビター（１，５ｍＭのＰＭＳＦ、０．３ｍＭのロ イペプチン、２０ｐｇ／＋ｃ　ｌの大豆トリプシンインヒビター、５０００／ｍ ｌのＴｒａｓｙｌｏｌ）を含むバッファで抽出した。抽出物を等容量のウサギ抗 マウスＩｇＧイムノビーズ（ｉｍｍｕｎｏ−ｂｅａｄｓ）（Ｂｉｏｒａｃｌ、Ｒ ｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃ＾）と３７℃で２時間反応させて、マウスイムノグロブリン を除去した。対照実験として、微量の放射性ヨウ素標識マウス１ｇＧを組織抽出 物に加えた場試料バッファ（１０）に加えた。３分間沸騰させた後で前記混合物 を遠心分離しく１０．ＯＯＯＲＰＭ、５分間）、上清を５ＯＳ−ＰＡＧＥ（１０ ％）及びウェスターン・プロッティングにかけた。いずれの場合も、処理した腫 瘍組織の量は同じであり、ゲルのレーン当たりのタンパク質総負荷量もほぼ同じ であった。

ウェスターン・プロッティングした後、ニトロセルロース膜をヒトフィブリンに 特異的なモノクローナル抗体と反応させ（１１）、その後前述のごと＜　（１３ ）Ｊｏｈｎｓｏｎらの一般的方法（１２）により１２５■−アフィニティ精製ヤ ギ抗マウスＩｇＧと反応させた５次いでプロットを乾燥し、Ｃｒｏｎｅｘ増感板 （（ｌｕｐｏｎｔＣｏ、］ｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）の存在下でＫｏｄａｋ　 Ｘ−ＯｍａＬ（ＸＡＲ５）フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、、Ｒ ｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に感光させた。先の研究では、フィブリン含有試料の ５ＤＳ−ＰＡ（：Ｅ及びウェスターン・プロッティングにより、この抗体がＨｒ 約５９，０００のポリペプチドを認識することが判明している（１４）。これら の研究では、マウスにヒトフィブリノーゲンを注入して腫瘍床中のフィブリンを 可視化した。なぜなら、これらの条件下では、対照実験のネズミフィプリンより もヒトフィブリンの方が、フィブリン特異的モノクローナル抗体に対してがなり 大きい免疫反応性を示すと思われたからである。マウスイムノグロブリンの重鎮 及び軽鎖に対応するバンドが可視化されなかったことから、抗マウスＩｇＧイム ノビーズを用いる前記方法でのマウスイムノグロブリン除去は効果的であること が判明した。

実験の一部では、ワルファリン誘導体３−（αアセトニルベンジル）−４−ヒド ロキシクマリン（０，７Ｂ／ｌ）を添加した水をマウスに３日閲飲ませてから、 ＴＮＦ注入を行った（ｍｅｔｈ＾細胞を注入してから約７日後）、腫瘍はワルフ ァリン処理した動物でも対照動物でも同じ大きさに成長した。凝血抑止処理した 動物を用いて実験を行う前に、マウス血漿のＸ因子のアッセイを行った（１５） 、　Ｘ因子レベルが１％未満の動物のみを使用した。

第２の実験：　ＴＮＥＦの　“白、・′　ツー１乙ヒへ、１１　ｕ、１ を立　・・セイ ヒト腰帯静脈由来の内皮細胞をＴｈｏｒｎｔｏｎ（１７）によって改良されたＪ ａｆｆｅの方法（１６）で調製した。実験は、９．６ｃｍ’ウェル内で密集状態 に達した細胞に関して２４時間以内に行った（１〜５）、細胞は、前述のごとき ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗原（１８）の存在とトロンボモジュリン（ ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）活性（１９）とに基づき、内皮として特定され た。　Ｄｒ、ＦＩｏｆｆｍａｎ及びＤｒ、　Ｏｌｄによって提供されたｍｅｔｈ ＾肉腫細胞（７）を、ウシ胎児血清１０％を含むＲＭＰＩ　１６４０中で増殖さ せた０ｍｅｔｈ＾細胞を無血清培地（１０ｍＨのＨＥＰＥＳ（ｐｔ１７．４＞と 、２０１■ｇ／ｍｌのトランスフェリンと、１０ｕｇ／ｍｌのインシュリンと、 ｌｐｇ／ｍｌのポリミキシンＢと、５＋ｎｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンとを含 むＲＭＰＩ）中に４８時間置くことによって、ｍｅｔｈ＾細胞がらならし培地を 得た。健康なりａｌｂ／ｃマウスの皮膚線維芽細胞を皮膚／皮下組繊の組織片培 養によって得た。これらの線維芽細胞を維持し、ｍｅｔｈ　Ａ細胞について説明 したようなならし培地の調製に使用した。

内皮細胞単層の組織因子活性のアッセイを、精製ヒトＶｌｌａ因子（８ｎＭ）（ Ｄｒ、Ｒ，Ｂａｃｈ、Ｍｏｕｎｔ　５ｉｎａｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ 。

Ｎ、Ｙ、、ＮＹから入手）及びＸ因子（１，５ｕＭ）を用いて、無血清培地中２ ３°Ｃで行った。８分後に前記反応混合物から試１”ｌ（０，２ｍ１）を採取し 、発色性基質ベンズ−ＩＬｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（ ２０）の加水分解をモニターすることによってＸａ因子の活性をアッセイした。

ヒト組織因子凝固活性を抑止するモノクローナル抗体はＤｒ、Ｒ，Ｂａｃｈがら 提供された。

腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）の生物学的活性フラグメントは下記の方法で製造 し得る： Ａ、ｍｅｔｈ＾肉腫細胞を培養するために、組織移植片を用意した。付着細胞を １０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＸ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で密集するまで 増殖させ、次いでトリプシンーＥＤＴ＾（（：１ｂｃｏ）を用いて１：３の比に 分割した１次いで細胞を、カルシウム−マグネシウムを含まないハンクスの平衡 塩類溶液（ハンクス液）で３回洗浄し、無血清培地（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐ Ｈ７，４）と２０ｕｇ／ｍｌのポリミキシンＢと５ｎ＋Ｈ／ｍｌのウシ血清アル ブミンとを含むＲＰＭＩ　１６４０）中に４８時間装いた。その後、このならし 培地を取り出して内皮細胞培養物と共に下記のようにインキュベートした。

Ｂ、ヒト膀帯靜脈内皮細胞の気密的埼養物（標準的方法（５）で増殖させた１０ ６細胞／ウエル）をカルシウム−マグネシウム非含有ハンクス液で洗浄し、無血 清培地を加えた（ｌｎｌ／ウェル）０次いで、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の添加を 全く行わない（０）か、ＴＮＦのみ（０，１ＢＭ）を加える（ＴＮＦ）か、腫瘍 ならし培地のみを１７２希釈度で加える（ＣＭ）か、又はＴＮＦ（０，１０Ｈ） を所定の希釈度（１／２．１／１０．１／２０）のならし培地の存在下で３７℃ で７時間かけて加える（ＴＮＦ±ＣＭ）操作を行った。いずれの場合も最終量は １ｍｌにした０次いで単層を洗浄し、無血清培地（０，５ｍ１）を精製しｌ−Ｖ ｌ１ｇ因子（８ｎＨ）及びＸ因子（１，５，Ｍ）と共に２３℃で加えて、組織因 子活性（１３）のアッセイを行った。

８分後に反応混合物から試料（０，２１１ｉｌ）を採取し、発色性基質ベンズ− Ｔｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾ｒｓ−ｐ−ニトロアニリド（０，０５ｎＮ）加水分 解をモニターすることによってＸａ因子の活性をアッセイした（１３）　、第１ 八図に示した結果は、３回の測定の平均及びＳＥＸである。Ｘａ因子の生成は、 腫瘍ならし培地をＶｌｉ＾−Ｘ因子インキュベーション混合物に直接加えた時に は、生理食塩水対照と同じであった。

Ｃ９前記Ａ、の方法で調製した腫瘍ならし培地１ｍｌを５ｅｐｈａ−ｄｅｘ　Ｇ １５０カラム（０，９ｘ５５ｃｍ）に掛け、１０＋ｎＨのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７， ４，）と０．１１４ＯＮａＣＩとの混合物で溶離し、フラクション（１，３…１ ）を採集した。前記カラムフラクションのアリロー１へを１７４の希釈度で内皮 細胞単層と共にＴＮＦ（０，１ＢＭ）の存在下３７°Ｃで７時間インキュベート ・シた１組織因子アッセイを前記Ｂ、の方法で行ったところ、第１Ｂ図（平均± ５ＥＮ）に示すようにＸａ因子が７分で形成されていた。第１ＢＵでは、ＴＮＦ が“ＴＮＦ”のみ（０，１ＢＭ）と共にインキュベートした細胞を示し、“Ｂ″ がカラムバッファのみと共にインキュベートした細胞を示し、””ＴＮＦ＋８” がＴＮＦ（０，１ｎＨ）及びカラムバッファと共にインキュベートした細胞を示 す。最初のカラムフラクションはこのアッセイでは不活性であった。ゲル濾過カ ラムを、リボヌクレアーゼ（分子、ｉ（Ｈ讐）＝　１３，７００ダルトン）、キ モ−トリプシノーゲン＾（２５，０００）、オボアルブミン（４３，０００）及 びアルブミン（６７，０００＞を含む標準タンパク質を用いて較正した。

腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）の生物学的活性フラグメントの特性を下記の方法 で調べた： ＴＮＦの不在下で１ｅｔｈＡ線維肉腫細胞から分泌される腫瘍壊死増強因子を含 むｍｅｔｈ＾線維肉腫ならし培地に培養内皮細胞をさらすとく第１Ａ図）、前凝 １Ｍ　（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性が少し増加した。この活性は、Ｖｌｌ ａ因子依存性のＸａ因子形成に基づいて組織因子として同定された。ＴＮＦは内 皮細胞組織因子活性の増加を直接誘導した。ｎｅｔ、ｈＡ線維肉腫ならし培地を ＴＮＦと共に内皮細胞培養物に加えると、前凝固反応が用量に依存して増加した 。幾つかの異なるＴＮＦ濃度で同様の組織因子活性の増強が観察された。腫瘍な らし培地を熱処理するとその活性が抑止され（表１）、また実験は総てポリミキ シンの存在下で行ったために（ポリミキシンＢの省略は効果がなかった）、国体 内毒素の混在は観察された増強効果の評価から除外される。また、腫瘍ならし培 地では、γ−インターフェロン、インターロイキン１又はＴＮＦの活性は検出で きなかった（４）、これらのデータは、インターロイキン１又はγ−イン、ター フェロンとは異なる腫瘍細胞産生物が、ＴＮＦに応答して内皮細胞前凝固活性の 誘導を増強させるごとができることを示している。別の実験では、この活性がＴ （：Ｆ（α及びβ）、Ｆ［：Ｆ（酸性及び塩基性）並びにＩＩ−Ｇとは異なるこ とが判明した。

ＴＮＦに応答して内皮細胞組織図子の誘導を増強した…ｅｔｈ八線維へ腫培養物 の上澄み液中の活性の更に別の特徴を実験結果として表１及び第１Ｂ図に示す。

これらの結果が示すように、前記活性は透析が不可能であり、熱及びトリプシン に対して感受性を示し、且つゲルー過クロマトグラフィーにかけると分子量範囲 １ｏ、ｏｏｏ〜３０，０００ダルトンに対応する幅の広いピークとして溶離され る（第１Ｂ図）。

第２図はｍｅｔｈＡ線維肉腫培養物の上澄み液くこの上澄み液は無タンパク質培 地中に採集された）のヘパリンＵｌｔｒｏｇｅｌ（ＩＢＦ　Ｃｏ、）クロマトグ ラフィーの結果を示Ｉ７ている。第２八区の左方パネルは、樹脂にＴＮＥＦ活性 が吸着した後、その活性は０．５Ｍ　１ｔａｃＩでタンパク質塊と共に溶離し、 　’　Ｆｌ；Ｆ及び腫瘍細胞誘導マイトジェンが見出される高い塩濃度では溶離 しないことを示している。第２Ｂ図の右方パネルの塩勾配溶離は、塩勾配の終点 に向かうＴＮＦ活性の溶離がカラムに掛けた大部分のタンパク質から十分に分離 されたことを示している。ヘパリンＵｌｔｒｏｇｅｌカラムから溶離されたプー ルをＦＰＬＣ（ｆａｓｌｐｒｅｓｓｕｒｅ　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ｒａｐｈｙ）Ｍｏｎｏ　Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、、Ｐｉｓｃａ ｔａｕ＋ａｙ、Ｎｅｕ　Ｊｅｒｓｅｙ）でのクロマトグラフィーにかけると、Ｔ ＮＥＦ活性が樹脂に吸着された。この活性は増加塩勾配を掛けた時に溶離された く溶離は約０．４８　ＮａＣｌで生じた）（第３図）。このときも、ＴＮＥＦ活 性はカラムに掛けたタンパク質塊から分離された。従って、この場合のＴＮＥＦ は、ヘパリン旧ｔｒｏｗｅｌに対する親和性が低い分子量１０．０００〜３０， ０００ダルトンの、トリプシン及び熱感受性ポリペプチドに起因する因子である 。この活性はインターロイキン１、γ−インターフェロン、菌体内毒素、腫瘍壊 死因子、形質転換成長因子（α及びβ）、インターロイキンＧ、線維芽細胞成長 因子及び条内皮細胞マイトジェンとは別のものである。

従って、前記した結果をまとめると、腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメ ントは、分子量が約１０，０００〜３０．０００ダルトンであり且つヘパリン旧 ｔｒｏｇｅｌに対する親和性が低いという特性も有するトリプシン及び熱感受性 ポリペプチドフラグメントということになる。

表　１ 腫瘍ならし培地中でＴＮＦに応答して内皮細胞組織因子を増強する活性の特徴＊ 透析リチンテート（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）　７１±８トリプシン　２１±３ ＣＭ無添加　２３±２ ＊　ｍｅｔｈ　Ａ肉腫細胞から得た腫瘍ならし培地を処理しないでおく（なし） か又は下記のいずれかの処理にかけな：　ｉｏｏ℃で１０分の熱処理、ｐＨ２， ０に５分暴露する酸処理、ｐＨ９，０に５分暴露する塩基処理、透析（分子量カ ットオフ３，０００〜４．０００）、又は３７℃で１時間のトリプシン５０μｇ による処理（トリプシンはジイソプロピルフルオロホスフェートとのインキュベ ーションの終了時には不活性化した；１ｍＭジイソプロピルフルオロホスフェー トだけでは組織因子の誘導には効果がなかった）。これらの各処理の後で、なら し培地を１＝４の希釈度で内皮細胞培養物に加え、ＴＮＦ　（０、１ｎＭ）の存 在下３７°Ｃで７時間インキュベートした。組織因子アッセイを前述の方法で行 うと、Ｘａ因子が７分で形成されていた。ｒｃＭ無添加」はならし培地を加えな かったという意味である（ＴＮＦのみを０．１ｎＭ使用した）。ならし培地もＴ ＮＦも加えない場合には、Ｘａ因子の形成が５ｐｍｏｌ／ｌＱｌ／ウェル未満で あった。表１には３回の測定の平均±ＳＥＮを示した。

第３の実験：腫瘍壊・増強因　の精１ 、Ｐ　びアッセイ Ｔｈｈｏｒｎｔｏｎら（１７）によって改良されたＪａｆｆｅ（１６）の方法を 用いて、ヒト膀帯靜脈由来の内皮細胞を製造した。実験は、密集状態に達した細 胞に関して２４時間以内に実施し、培養物の特性を前述の方法で調べた。Ｄｒ、 Ｈｏｆｆｍａｎ及びＤｒ、０１ｄ（Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅ ｒｉｎｇＣａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ）（７）によって提供されたｌｌ１ｅｔｈ ＾細胞を１０％の子牛血清を含むＲＰ）ＩＩ　１６４０中で増殖させた。ｍｅｔ ｈ　Ａ細胞を無血清培地（ｐＨ７，４のＨＥＰＥＳを１０拍Ｎ含むＲＰＨＩ　１ ６４０）中に３７℃１２時間置くことによって、ｍｅｔｈ　Ａ、ｊｌ！］胞から ならし培地を得た。正常ＢＡＬＢ／ｃマウス皮膚線維芽細胞及びウシ血管線維芽 細胞を夫々皮膚及び大動脈組織の組織片培養物から製造した。

腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）を無血清培地（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐｌ（＝ ７．４）とｌｕｇ／ｍｌのポリミキシンＢと５ｍｇ／ｍ　Ｉの脂肪酸非含有ウシ 血清アルブミンとを含むＭｅｄｉｕｍ　１９９）中で培養物と共に、ＴＮＦの存 在下／不在下で所定時間インキュベートすることによって、内皮培養物における 組織因子の誘導を評価した。

組織因子活性を２段階凝固アッセイによって測定し、限定数のアッセイでは更に 、発色性基質ベンズ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−へｒｇ−ｐ−ニトロアニリドの 加水分解をモニターして、精製Ｖｌｌａ因子（８ｎＭ）及びＸ因子（１，５，Ｍ ）の存在下でのＸａ因子の形成を調べることによっても測定した。これらのアッ セイは両方とも既に説明済みである（２１）。２段階凝固アッセイ（８０％ホス ファチジルコリン）を用いてホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン小胞 （２０：８０）中に再構成されたｌｐＨの精製ヒト組織因子に観察されるのと同 じ量の組織因子活性を誘導するｍｅｔｈΔ因子の量にＩＵＯ値を与えることによ って、組織因子活性単位を任意に定義した。これらのアッセイでは、腫瘍壊死増 強因子（ＴＮＥＦ）を内皮のみと共に、又はＴＮＦを存在させて３７℃で７時間 インキュベートした。アッセイは、ゴム製ポリスマンを用いて皿から掬い取った 懸濁状の細胞全体くトリパンブルー色素排除法に基づく細胞生存率は〉９０％で あった）を用いるか、又は指示があれば無傷の単層を用いて行った。精製組換え ＴＮＦ（１０’Ｕ／ｍｌ）はＩ（ｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ（Ｎｕｔｌｅｙ 、ＮＪ）のＤｒ、Ｌｏｍｅｄｉｃｏから入手した。内皮培養物の組織因子抗原の 含量を測定した（Ｄｒ、Ｊｉｍ　Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ。

５ｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉ ｏｎ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃ八が行ったＥＬＩＳＡアッセイを使用）。グアニジ ニウムチオシアネート法を用いる細胞からの全ＲＮＡの抽出（２２）と、１．２ ％アガロースゲル上でのＲＮＡの電気泳動分別（２３）と、ニトロセルロースへ の移動とによって、組織因子ｎ＋ＲＮＡのレベルを決定するためにノーザン・プ ロットを実施した。トロンボモジュリンのｃｌ）Ｎ＾グローブ（Ｄｒ、Ｅ、５ａ ｄｌｅｒＪａｓｈυ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏから入０手）を、ランダムヘキ サマー標識（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅｉｍ　ｒａｎｄｏｌＩｌｐ ｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｋｉｔ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ 、ＩＮ）によって標識した。このｅＤＮ＾プローブとｍｅｔｈ　Ａ因子で処理し た正常ＲＮＡとのハイブリッド形成を前述の方法（２３）により４２℃で行った 。

腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）のリボ多糖含量を調べ（Ｏｒ７Ｃｅｒａｍｉ、Ｒ ｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ　［Ｉｎ１ｖｅｒｓｉｔ、ｙ、ＮＹ、ＮＹが行ったリムル スアメーバ細胞（Ｌｉｎｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ）アッセイを使用）、 インターロイキン−１活性のアッセイ（Ｄｒ、Ｋ１１ｌｉａｎ、ｔｌｏｒｆｍａ ｎＬａＲｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪが行った１）１０アツセイを使用）、イ ンターロイキン−６活性のアッセイ（Ｄｒ、Ｍａｙ、Ｒｏｃｋｅｆｅｌ！ｅｒ　 Ｌｌｎｉ−ｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ、ＮＹが行ったＢ細胞増殖アッセイを使用）、 ＴＮＦ活性のアッセイ（Ｈｒ、ＤｉＰｉｒｒｏ、５ＹＮＮＹ　ａｔ　Ｂｕｆｆａ ｌｏ、Ｂｕｆｆａｌｏ。

ＮＹが行ったＬ９２９アッセイを使用）、並びにマイトジェン活性のアッセイ（ Ｄｒ、Ｗｉｔｔｅ、Ｃｏｌｕｍｂｉａυｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ、ＮＹが行っ た３Ｔ３マイトジェン形成アッセイを使用）を行った。ネズミインターロイキン １αに対する抗体はＤｒ、Ｌｏｍｅｄｉｃｏ（Ｉｌｏｆｆ−ｍａｎｎ〜ＬａＲｏ ｃｈｅ）から入手し、ネズミＴＮＦαに対する抗体はＧｅｎｚｙｍｅ（Ｂｏｓｔ ｏｎ、Ｍａｓｓ、）から購入した。

腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）は下記の方法で製造し得る：前述のごとく製造し たｍｅＬｈ＾ならし培地を培養物から取り出し、滅菌ｐ過にかけ（０，２１＋ｍ ）、オクチル−β−グル′コシド（Ｍ終濃度０．１％）及びプロテアーゼインヒ ビター（ベンズアミジン５ｍＨ，ＰＭＳＦ　０．２ｍＭ）を加えた後、硫酸アン モニウム沈澱（８０％飽和）を行った。次いで、硫酸アンモニウム沈澱べＩ／プ ツトＴｒｉｓ（２０ｍｔ（；ｐＨ７，３＞／オクチルーβ−グルコシド（０，１ ％）に溶解し、同じバッファに対して徹底的に透析した。被透析液（ｒｅｔｅｎ ｔａｔ、ｅ）を、オクチル−β−グルコシド及びプロテアーゼインヒビター（既 述）を含むＴｒｉｓ（２０ｍ！４；ｐ１７．３）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅカラム（２，５ｘ　２０ｃｍ；Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗ ａｙ、ＮＪ）に掛け、同一バッファ中０．ＩＮのＮａＣｌて・段階的に溶離した 。活性フラクションをプールし、オクチル−β−グルコシド（０，１％）含有リ ン酸バッファ（２５にｐＨ６，８）に対して透析し、４Ｍの尿素を含む同一バッ ファで平衡化したＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｓカラム（）ＩＲＩＯ／２０；Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）にｔＸけな。、二のカラムを上昇塩勾配（０〜０．５Ｍ　ＮａＣ１） で溶離し、活性フラクションをプールし、ｐＨをトリフルオロ酢酸で２．２に調 整し、試料をＦＰＬＣＰｒｏＲＰＣ（ＲＲ５／１０　；Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ） にかけた、このカラムを、トリフルオロ酢酸（０，１％）の存在下で、メタノー ル濃度を直線勾配で増加させながら溶離し、活性フラクションをプールし、５Ｏ Ｓ（０，１％）の存在下で透析し、凍結乾燥によって濃縮した０次いで試料をＬ ａｅｌｌｉ試料バッファに溶解し、分離用（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＳＯＳ− ＰＡ（：Ｅ（！２．５％）を行った。

電気泳動のあとは、タンパク質を銀染色により可視化するか（Ｂｉｏｒａｄ　ｋ ｉｔ、Ｒｉｃｈｍｏｎｃｌ、Ｃ＾）、又はｒｓｃｏ試料濃縮器（Ｌｉｎｃｏｌｎ 、Ｎｅｂｒａｓｋａ）によってタンパク質を電気溶離した。

単離バンドを可視化すべく、試料のアリコートを凍結乾燥し、再び１２．５％５ ＯＳ−ＰＡＧＥにかけ、染色した（Ｂｉｏｒａｄ　Ｋｉｔ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｃｌ　、　Ｃ＾）、活性を測定すべく、乾燥凍結後に試料をアセ トン−トリエチルアミン−水（９，５：０．５：０．５）で３回洗浄することに よってＳＤＳを除去した。アッセイに先だって、試料をＴｒｉｓ（２０＋Ｎ；ｐ Ｈ７，３）／オクチルーβ−グルコシド（０，１％）に再溶解し、Ｄｅｔｏｘｉ −ＦＩｅｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄｊｌｌ、）でのクロマトグ ラフィーにかけ、前述のごとく内皮培養物と共にインキュベートした。　Ｂｉｏ ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃ＾）のキットを用いてタンパク質濃度を測定した 。腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）（２Ｂ）をプロテアーゼＫ（０，４ｎＢ；Ｓｉ ｇｍａ）により３７℃で２時開処理し、希釈し、次いで内皮培養物に加えて組織 因子の誘導を調べた。対照培養物はプロテアーゼにのみど共にインキュベートし たが、内皮組織因子の誘導は全く見られなかった。

腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）は、別の腫瘍系からも形成し得る。この腫瘍壊死 物質は、組織因子のＴＮＦ誘導発現に加えて、血管壁を包囲する腫瘍の別の特性 にも作用し得る。

腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）はまた、ｍ　ｅ　ｔ、　ｈ＾肉腫の免疫原性の決 定にも関与し得、且つ腫瘍血管系の潜在的なフィブリン溶解能にも影響を与え得 る。

結　果 正常マウス及び腫瘍担持マウスに高濃度、即ち動物当り３０ｐ＆以上のＴＮＦを 注射すると、該動物の殆どは多数の器官、特に肺及び肝臓に血栓を生じて死亡し た。これはこのような濃度でのＴＮＦの激しい毒性を教示する従来の研究（２４ −２５）に一致する。１０巧／動物のＴＮＦ濃度での全身毒性及び血栓形成はそ れほど著しいものではなかった。３巧／動物では、殆どの動物が正常な脈管構造 における全般的な傷害なしに生存したが、腫瘍において出血性の変化（ｈｅｍｏ ｒｒｈａｇｉｃ　ｃｈａｎｇｅ）が見られ、これはこのような低い投与量のＴＮ Ｆ投与が、他の組織における広範な血栓出血現象（ｔｈｒｏｍｂｏｈｅｍｏｒ＋ ｈａｇｉｃ　ｐｈｅｒｏｍｅｎａ）なしにｍｅｔｈＡ肉腫（ｍｅｔｂ　Ａ　ｓａ ｒｃｏｍａ）の血管床（ｖａｓｃｕｌａ＋　ｔｕｄ）における止血異常（ｈｅｍ ｏｓｔａｊｉｃ　ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）を引起したことを示している。

ＴＮＦ　Ｃ３１１９／動物）の注射後の腫瘍脈管構造におけるフィブリンの析出 を　１２５１フイブリノーゲンの存在下の腫瘍における放射能の蓄積を測定する ことにより観察した。生理食塩水を注射した対照のｍｅｊｂＡ肉腫におけるのと 比較してＴＮＦを共に注射した動物の腫瘍床は１０倍以上の放射能を蓄積した。

これに対して、他の器官のＴＮＦ注射後の放射能取り込みの増加はほんのわずか であった。ＴＮＦを熱処理するとその細胞ＴＮＦ受容体への結合が妨げられるが （８）、この熱処理は腫瘍床への放射能の沈着の増加をも妨げ、これはＴＮＦが 活性物質であることを示している。フィブリン形成による凝固機構の活性化が腫 瘍における放射能の蓄積の原因であるということは、抗凝固動物からの腫瘍にお ける放射能の取込みが低いということにより示されているといえる。この仮説に 一致して、ＴＮＦ注射後の腫瘍抽出物のウェスタンプロットはフィブリン特異性 モノクローナル抗体と強（反応した。動物を３（α−アセトニルベンジル）−４ −ヒドロキシクマリンで処理するとこのバンドはかなり緩和され、（そのままの ＴＮＦの代りに）熱処理ＴＮＦを注射すると、フィブリン特異性エピトープに対 応するバンドの出現が妨げられた。

これ等のデータは、腫瘍床にフィブリンを析出させる凝固機構の活性化はＴＮＦ 注射に応答して起ることを示しており、フィブリンはＴＮＦ注射後の腫瘍血管床 で可視化し得る。生理食塩水のみを注射した動物においては、腫瘍の開存性血管 にフィブリンは見られなかったが、内皮表面に密着した血管内空間内ではフィブ リンが視認できた。

フィブリンは通常の形態学的特徴により同定され（２６）、特徴的な超構造の周 期性は２１．０９ｎｍであった。走査電子顕微鏡によれば、フィブリンストラン ドは内腔内皮細胞表面のそばにあり、対照動物では決して見られない場所であっ た。フィブリンの析出は腫瘍床の血管に限られていた。これ等の初期の時期にお いては血小板及び白血球細胞の血管壁への付着は起らず、血小板血栓は牌臓ある いはその他の器官において見られなかった。

これは、恐らく内皮により開始された腫瘍脈管構造内での凝固の局所的な活性化 の発生と一致する。ＴＮＦ注射の２時間後、顕著なフィブリン成分による閉塞性 血栓が腫瘍全体に観察された。これ等の血栓の出現に付随して、平行して行った Ｅｖａｎブルーを用いて血液流を可視化する実験では非血流域（ｕｎｐｅ＋ｆｕ ｓａｄＢｅａ）が示された。さらに早い時期、即ちＴＮＦ注射の１時間後では、 １〜２時間後には大きな領域、即ち腫瘍の８０％まで至るのに対して非血流域は 限られており死滅には至らなかった。

腫瘍血管内の血栓の存在は、内皮細胞止血性における前凝固へのシフト（ｐｒｏ ｃｏａｇｕｌａｎｊ　５ｈｉｆｔ）を示すｉｎ　ｖｉ＋ｒｏにおける研究（１− ６）　との潜在的な関°連を示すものである。

ＴＮＦは凝血に好適なような内皮細胞凝固性の変化を誘発し得るということを示 す従来の研究（１−６）に基けば、ＴＮＦの注射の後のフィブリン形成による凝 固の活性化は予測されないことではなかった。しかし、フィブリン析出が腫瘍血 管床に局所化されることは予想されないことであった。ＴＮＦに応答して局所的 な凝血形成をもたらし得る１つのメカニズムは、腫瘍床において強化されている 何等かの血管壁依存過程である。腫瘍血管床におけるフィブリン析出の拡散性及 びその内皮細胞表面との密接な関連は、腫瘍−内皮細胞相互作用が存在し得ると いう仮説を支持するものであった。これを試験するため、無血清条件で発生した 培養ｍｅｊｂＡ肉腫細胞の上清（固有の前凝固活性を有していない）を内皮細胞 単層と共にインキュベートし、組織因子即ち凝固の中心的な開始剤（２７）の誘 導、を調べた。培養した内皮を腫瘍条件化培地に単独で暴露すると前凝固活性の 増加はあったとしても小さく、恐らく有意でないといえるものであった。最大に 近い（ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ）投与量（Ｉ］、　ｉｎＭ）のＴＮＦは、これまで に報告されているように　（４−５）、内皮細胞凝固性の上昇を誘起した。内皮 細胞培養に、ＴＮＦと共に腫瘍ならし培地の希釈物を添加すると、前凝固応答を 投与量に比例する形で著しく上昇させた。前凝固活性は、第Ｘ因子活性化の第■ ａ因子依存性と抗組織因子抗体の阻害効果に基いて、組織因子として同定した。

腫瘍ならし培地による組織因子活性の同様な増強がいくつかのＴＮＦ濃度におい て観察された。実験は内皮をＴＮＦと腫瘍ならし培地に７時間、即ち最大の前凝 固応答が生成するのに充分な時間暴露することを含む。内皮細胞単層の強化され た組織因子活性は先ず比較的早い時期に見られた。

ｍｅｔｈＡ細胞に由来する培地の効果とは異なって、非形質転換Ｂａ１ｂ／ｃ　 （ｍｅｊｈＡ肉腫は同じ株に由来する）フィブロブラストによりならした培地は 、ＴＮＦの存在・非存在に拘らず、内皮細胞凝固活性に対して何の効果も示さな かった。

内皮のＴＮＦに対する前凝固応答を上昇させるｍｅｔｈＡ由来活性の予備的特性 化によれば、それは透析不可能（分子量カットオフ３５００）で、熱感受性（１ ００℃で１０分間）で、トリプシン感受性（５０μｓで４時間、３７°Ｃ）であ ることが判明している。

５ｅｐｈａｄｅｘ　ＧＩ５０でのゲル濾過によれば、約１０．０００〜３０．０ ００の分子量範囲に対応する広い活性ピークが示された。腫瘍ならし培地のＴＮ Ｆ増強効果の原因となる因子の実体は明らかではないが、熱処理に対する感受性 及び全ての培地にポリミキシンが存在すること（ポリミキシンを除去することは 実際に結果に影響を与えなかった。）から見て、内毒素による汚染が観察された 内皮細胞ＴＮＦ応答における変化の原因になっているとは考えにくい。本実験に おいては、腫瘍ならし培地中に、インターロイキン１、フィブロプラスト成長因 子、ＴＮＦ、ガンマインターフェロン、あるいは形質転換成長α因子の活性は検 出されなかった。ＴＧＦβは、研究した咄乳動物組織及び細胞系の殆どに見出さ れているので（３４−３６）　、ＴＧＦβ、あるいはＴＧＦβ２がＴＮＦに対す る内皮細胞凝固活性を増強する能力を有しているのかどうかを決定することは重 要なことであった。これ等の研究においては、精製材料の人手のしやすさ及び異 なる種（ネズミ、ブタ及びヒ）・）からのＴＧＦ間の相当な配列の相同性からヒ ト及びブタＴＧＦβが使用されている（３４−３６）。ＴＧＦβ、及びＴＧＦβ ２（５００ｐＭまでの濃度）のいずれもがＴＮＦの存在下で内皮細胞凝固活性を 増強せず、ｍｃｔｈＡ培養物上清中の活性はＴＧＦβとは異なることを示してい る。

これまでの研究によりｍｅｌｈＡ細胞からの培養上清がＴＮＦにより誘起された 内皮組織因子活性を増強させ得ることが示されている（３７）。このことから、 無血清ｍＣｔｂＡならし培地から出発し、内皮組織因子活性の誘導をアッセイシ ステムとして使用して、原因分子を同定する精製方法を設計した。培養物上清を 硫酸アンモニウム沈殿（８０％飽和）により濃縮し、次に透析を行った（表２） 。透析物をＱ−３ｅｐｈａ＋ｏｓｅ　（ｐＨ７，３）に吸着させ、全タンパクの 〜９０％を除去し、上清を透析してＭｏｎｏ　Ｓカラムにかけた（第４Ａ図及び 第４Ｂ図）。内皮組織因子を増強した活性を同定し、フラクションを集めて透析 し、逆相ＦＰＬＣカラム（Ｐ　ｒｏＲ，Ｐ　Ｃ）にかけた。上昇メタノール勾配 を使用し、〜５０％でＰ　ｒｏＲＰ　Ｃから活性を溶出した。Ｐ　ｒｏＲＰ　Ｃ から溶出された物質の銀染色ＳＤＳゲルは依然として複雑なパターンを示したが 、該ゲルを電気溶出すると、内皮組織因子を誘導した活性はＭｒ〜４４．　ＨＯ Ｄａの部分の単一の領域に局所化され、これはゲル上の弱いバンドに対応した。

これにより、逆相クロマトグラフィーからのプールを使用して調製スケールの５ ＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く電気溶出を行った。このゲルから溶出された物質 を別の５ＤＳ−ゲルに再度かけると、Ｍｒ〜４４．０００Ｄａ　（非還元）及び Ｍ　ｒ　〜７０．０００　Ｄａ　（還元）に単一のバンドとして移動し、ゲルの 対応する部分に生物学的活性が検出された（還元ゲルからのサシプルで活性を得 るためには大ざっばな透析が必要であった。恐ら（、再度の折りたたみとジスル フィド結合の形成が起るのであると考えられる。）。ゲル溶出物質はかなり熱抵 抗性（９８°０１１０分）であったが、プロテアーゼに処理により不活性化され た（同時に、ゲル上のＭｒ〜４４．［ＯＤａのバンドが消失し、消化が起ったの であろうことを示している。）　。ＨＰＬＣゲル濾過により分子量〜４５　５０ ．１１００　Ｄａに対応する主要な活性ピークが示され、腫瘍壊死増強因子（Ｔ ＮＥＦ）は培養物上清に恐らく単量体として存在しているのであろうことを示し ている（データは示していない。）。この単離方法におけるステップを合わせる と（表２）、約５０００倍の全精製が得られ、１リツターのならし培地から１０ ｎｇが得られた。

表　２ 腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）”の精製ｍ！ｊｈＡならし培地　７９ｍｇ　１３ 　０．１６　１００％　１硫酸アンモニウム沈殿　７２■　１２　０．１７　９ ２％　ＩＦａｓｔ　Ｑ　１１ｍｇ　８．５　１．１　６５％　６Ｍｏｎｏ８　２ ｍｇ　３．２　１６　２５％　１５ＰｒｏＲＰＣ２０趨１．４　７０　１１％　 ４＊出発材料は１ｊ２のｍｅｌｈＡならし無血清培地。

千単位は以下のように定義した＝１単位は、リン脂質ベシクル（材料及び方法の 項目を参照）中に再構成した１ｐｇの精製組織因子に相当する腫瘍壊死増強因子 （ＴＮＥＦ）により内皮細胞中に誘導された組織因子活性の量。

さらに腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）の性質を特性化するため、いくつかの方法 を用いた。ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーでは、０．５Ｍ　ＮａＣ ｆ１により吸着した腫瘍壊死増強因子（Ｔ　Ｎ　Ｅ　Ｆ）活性が完全に溶出され （即ち、フィブロブラスト成長因子及び腫瘍由来血管形成因子の群よりもかなり 低いイオン強度で溶出される。）、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｌ＋ｉｃｆ ｏｃｕｓｓｉｎｇ　）ではｐ）１６．８及び７．２に対応する２つの主要な活性 ピークが示された。活性はコンカナバリンＡ　−５ｅｐｈａ＋ｏ＋ｅにも吸着さ れ、それが糖タンパクであることを示している。ＴＮＦ（Ｌ９２９）についての バイオアッセイ及び抗ネズミＴＮＦα抗体を用いた実験により、因子はＴＮＦと は異ることが判った。インターロイキン１　（ＤＩＯアッセイ及び抗−ネズミイ ンターロイキン１−αを使用。）、インターロイキン６、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞 についてのミトゲニック活性（これは血小板由来成長因子及び／又は何等かのそ の他の成長因子の存在を反映する。）についての同様の実験も陰性であった。試 験的な研究によれば、内皮前凝固活性の誘導について腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥ Ｆ）と比較した場合、悪性細胞種の一種の生成物である形質転換成長β因子、及 び上皮成長因子のいずれもが同様の活性を示さないことが示された。

さらに、腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）の試料をＤｅｌｏｘｉゲルカラム上でク ロマトグラフにかけ、存在し得る汚染リボ多糖を除去しくＬｉｍｕｌｕｓ変形細 胞アッセイでは検出可能なリボ多糖はなかった。）、ポリミキシンＢの存在下に 腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）を内皮と共にインキュベートした。これ等の結果 は、上記したその他のデータと併せて、リボ多糖汚染物が腫瘍壊死増強因子（Ｔ ＮＥＦ）の存在下の内皮前凝固活性の誘導の原因となっているということは殆ど ありそうにないことを示している。

精製した腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）はそれ自体前凝固活性を示さないが、内 皮培養物と共にインキュベートすると、組織因子合成の誘導が観察された。関数 的な研究により時間及び投与量依存性の組織因子誘導が示された。組織因子活性 は３〜４時間まで顕著であるが、２４時間まで減衰せず、ＴＮＦあるいはインタ ーロイキン１により誘導される上皮組織因子のより急速な減衰とは異なっている 。腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）による組織因子前凝固活性の生成は、内皮培養 物にシクロへキシミドを添加することによって阻害され、１／２最大効果は約１ 〜５１ｇ／ｍｌで生起する。組織因子活性の上昇は組織因子抗原の増加を伴う。

低濃度のＴＮＦを腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）を伴う培養物と共にインキュベ ートすると、いずれかの物質単独で観察されたのよりも高いレベルへの組織因子 誘導の増強が観察された。

考　察 血栓症は罹病及び死亡の主な原因であるが、限局性の血管的血餅形成の病因に関 与する機構はほとんど特性化されていない。

血液の血漿因子及び細胞性要素と内皮下細胞成分との接触後のうっ白斑、急激な 血栓形成の研究に由来する血管的血餅形成モデル（２９）は、内皮細胞の露出が 重要な開始段階であるという血栓症の臨床像を提示している。本明細書中で提示 される結果は、ＴＮＦ即ち内因的に産生される宿主反応メディエータが、生きて いる内皮単層の存在下で、ｍｅｊｈＡ肉腫を持つマウスの腫瘍血管系内に血管的 血餅形成を選択的に誘導し得ることを示し、並びに限局性の他の血栓症モデルを 描き示している。ＴＮＦの注入後、腫瘍内に放射性ヨウ素標識フィブリノーゲン ／フィブリンが蓄積した。腫瘍血管床内の明白なフィブリン沈着は、血餅形成を 伴う凝固活性が明らかに関与していることを示している。この仮説を支持するも のとして、クマジン（ｃｏｕｍａｄｉｎ）、即ちビタミンに依存性凝固タンパク 質のカルボキシル化を妨げ、これによって膜表面と該タンパク質との効果的な相 互作用をダウンレギュレートする抗凝血薬（３０）は、腫瘍床内での放射標識物 の蓄積及びフィブリン特異性エピトープの出現をかなり減少させた。さらにまた 、閉塞性血栓の証拠となるフィブリン沈着の血管内局在が、ＴＮＦ注入後２時間 以内に研究した全ての動物で認められた。一方、腫瘍床内への取り込みとその大 きさで比較し得る、終始一貫した１２５１−フィブリノーゲン／フィブリンの限 局的取り込み及び血栓形成は、腫瘍マウス又は健康マウスの正常な血管系では全 く見られなかった。このことは、ＴＮＦのトロンボゲン形成作用が腫瘍血管床を 攻撃対象にすることを示している。

これらの研究から生じる中心的な疑問は、宿主及び腫瘍介在過程が規則正しく注 入されたＴＮＦの作用を限局的に増強させ得る可能な機構と関連している。サイ トカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）／血管由来の物質及び／又は例えば腫瘍床内の 血流変化のような他の因子の生成が明らかに関与し得る。提示した実験は、ＴＮ Ｆに対する内皮の凝固反応を増強する異なるメディエータを腫瘍細胞が生成する ことを示唆している。ＴＮＦは、凝固活性を有利にする内皮細胞凝固特性へのシ フトを誘導することが分かったので（１−６）、特定の血管床内でこの作用を局 所的に増強することは強力なトロンボゲン形成刺激を付与することを可能にする だろう。腫瘍因子がＴＮＦに対する内皮反応を調節する機構は依然として不明で ある。腫瘍ならし培地に晒した後の、内皮上のＴＮＦ結合部位の親和性とその数 を調べた予備的研究からは、１２５１−ＴＮＦの結合パラメータの変化は実証さ れなかった。このことは、ＴＮＦに対する内皮細胞反応性に及はす腫瘍細胞産生 物の作用がリガンドーリセプター相互作用に遠位的に仲介することを示唆してい る。

（サイトカイン注入の３０分以内に開始される）急激に生じる、限局的に誘導さ れる血餅形成は、腫瘍内での限局性ＴＮＦ作用の唯一の例である。ＴＮＦ注入後 ４〜８時間までの間に、腫瘍血管は白血球細胞で充填される。その後、腫瘍細胞 内での周知の毒性的な形態学的変化及び出血性壊死も起こる（２４．３１）。

例えば内皮への白血球の付着（３２）のような、これらの限局的変化のいくつか はまた、腫瘍微小環境内での、ＴＮＦによって誘導される前凝固反応を増強する もののような因子の作用のために、腫瘍床内で選択的に増強され得る。腫瘍床内 の初期凝固活性と腫瘍壊死との間の関係は不明であるけれども、これらの研究で 使用ｊ７た同じクマジン化合物で凝血抑止されたマウスを用いた予備的研究は、 対照マウスと比較して凝血抑止マウスでは腫瘍重量が５０％だけ減少１．たこと に基づいて、腫瘍が弱体化し壊死することを示した。このような情況において、 腫瘍床内でのフィブリン、即ち十分に認知されている炎症性反応の刺激物（３３ ）の選択的沈着は、それに続く白血球浸潤を促進する要因となることが可能であ る。種々の抗凝固薬と腫瘍を用いた研究が、この組織に対する識見を得るために さらに必要となろう。

本明細書中に提示された研究は、腫瘍血管系における内皮血餅形成がＴＮＦに対 するｍｅｊｈＡ肉腫の初期反応の一部であることを示している。。血餅形成の腫 瘍床への限局性は、内皮血栓形成を強調する機構を調べるための潜在的に重要な モデルを提供する。

腫瘍微小環境は、宿主及び腫瘍誘導因子が腫瘍床中に集中する結果として生じる 。本明細書に記載の研究から、ｍｃｔｈＡ腫瘍細胞が、内皮組織因子を誘導し且 つＴＮＦに対する前凝固反応を増強するポリペプチド即ち腫瘍壊死増強因子（Ｔ ＮＥＦ）を産生ずることが実証された。腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）は、（Ｔ ＮＦ及びインターロイキン−１のような）内皮組織因子活性を誘導することが分 かっている他のサイトカインと異なるようであり、並びに腫瘍床内で観察される 血管機能の変化に寄与する腫瘍微小環境の潜在的に重要な成分である。このよう な情況において、腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）が低濃度のＴＮＦに応答して内 皮組織因子の誘導を増強すること（８）を実証する研究は、治療剤としての、限 局的に産生されたメディエータの相互作用を考慮することか重要であることを強 調している。腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）とＴＮＦとの相互作用に関する機構 は依然として不明であるが、予備的な放射性リガンド結合研究は、ｍｅｔｈＡ因 子がＴＮＦに対する内皮の親和性を増大させること及び、腫瘍壊死増強因子（Ｔ ＮＥＦ）の存在下でのＴＮＦ誘導内皮組織因子産生の明白な増強に関する可能な 基礎を提供することを示した。本明細書に提示した研究は、マウス腫瘍壊死増強 因子（ＴＮＥＦ）の最初の特性化を示すものである。

さらに、腫瘍性及び正常細胞／組織内での腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）の分布 並びに効果を立証する研究が必要であろう。

初期の研究から、形質転換されていないマウス及びウシ線維芽細胞には腫瘍壊死 増強因子（ＴＮＥＦ）活性が存在ｊ、ないが、（ＳＡ−１マウス腫瘍細胞系及び ＦＯ−１ヒト黒色腫細胞系を含む）ＴＮＦ感受性の数種の腫瘍から発見され、ま た部分的に精製し得ることが示唆される。これに対し、Ｇ＋ａｙ癌研究所で最近 確認された、ＴＮＦに抵抗性のあるマウス腫瘍中には、腫瘍壊死増強因子（ＴＮ ＥＦ）活性は見出されなかった。ＴＮＦによって仲介される腫瘍血管系の乱れ（ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）に及ぼす腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）の作用に関 するいかなる結論も引出すことは早すぎるが、これらの発見は、この腫瘍誘導メ ディエータ及び他の腫瘍誘導メディエータに関する別の研究が腫瘍床内の比類な い血管特性を強調する機構に対し洞察を与えるだろうということを示している。

要　約 最近の研究は、ＴＮＦが、内皮細胞の凝固特性を調節することにより凝固機構の 活性化を促進させることができることを示し、た。本明細書中で、本発明者らは 、ｍｅｌｈＡ線維肉腫を持つマウスへの低濃度ＴＮＦ　（３Ｒ／動物）の注入が 内皮細胞表面と密接に関係した閉塞性向管内血栓形成を伴う限局性フィブリン沈 着に導くことを立証する。１２５Ｉ−フィブリノーゲンを用いた研究から、ＴＮ Ｆ注入後２時間以内に腫瘍中にＩＯ倍増強された放射活性の蓄積が示された。５ ＤＳ−ＰＡＧＥに掛けて、フィブリン特異性モノクローナル抗体で視覚化された 腫瘍抽出物のウェスタン・プロットは、ＴＮＦ注入後腫瘍内にフィブリンが形成 することを示した。電子顕微鏡による研究は、特徴的な２１ｎｍの周期性を基本 構造とする、内皮細胞表面に付着性であると思われるフィブリン線維を実証した 。別の微細構造研究は、ＴＮＦ注入後３０分以内にはじめて明らかになるフィブ リン形成が、腫瘍血管床に限定される、即ち健康なマウスの血管内では２時間以 内には起こらない、閉塞性血栓に導くこと、並びにＥｖａｎｓブルーを用いた研 究から得られた腫瘍分散（ｔｕｍｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）が８０％減少すること と結び付くことを示した。内皮細胞前凝固活性のＴＮＦ誘導に関する従来研究を 考慮して、腫瘍細胞産生物がこのサイトカインに対する内皮反応を誘起するとい う仮説をテストした。固有の前凝固活性を持たない、無血清条件下で得られた培 養ｍｅｌｈＡ線維肉腫の上清は、最大に近い濃度のＴＮＦに応答して内皮中で組 織因子誘導をかなり増強した。腫瘍ならし培地中のこのような因子は、インター ロイキン−１，線維芽細胞成長因子、インターフェロン、ＴＮＦ、エンドトキシ ン、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βと区別され得るように思われる。これらの研究は 、血栓症が病態生理学的メディエータ即ちＴＮＦによって開始される並びに、腫 瘍血管床に血餅形成を向けさせる該微小環境内の機構を調べるための機会を提供 する新規の限局性血餅形成モデルを描き示している。

従来の研究は、ＴＮＦに対する血管反応の初期成分が、内皮表面と密接に関係し 且つ腫瘍血流の減少に導く、腫瘍性病変部に限局される血管的血餅形成を含むこ とを示した。このことが、モデル系としてマウスｍｅｔｈＡ線維肉腫を用いて、 内皮前凝固活性及びＴＮＦに対する細胞応答を増強する腫瘍誘導メディエータを 同定させる契機となった。非還元５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で約４４． ０００ダルトンの見掛けの分子量を有し且つ還元５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル上で約７０．ＯＨダルトンの分子量を有する熱安定性プロテアーゼに感受性ポ リペプチドを、Ｑ−３！ｐｈｘｒｏｓｐ法、　Ｍｏｎｏ　Ｓ法、逆相法及び５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ法を連続的に使用することにより、ｍｅｊｈＡ細胞の無血清培養物 上清から約５０００倍に精製した。免疫学的特徴、生物学的活性及び他の分子特 性に基づいて、腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）が他のサイトカイン及び成長因子 と異なるように思われる。このタンパク質は組織因子遺伝子の転写、及び内皮に よる前凝固活性の発現（約１ｎｇ／ｍｌで５０％活性効果）を誘導した。さらに また、腫瘍壊死増強因子（ＴＮＥＦ）をブレインキュベートし、その後でＴＮＦ に晒すと、それに応答して組織因子誘導が増強された。これらのデータは、°血 管壁の止血作用特性を変えることができ並びに、宿主反応メディエータ及び他の 物質に対する腫瘍血管系の反応性を潜在的に調節することができる潜在的に比類 ない分子をｍｅｌｈＡ腫瘍が作り出すことを示している。

下記の文献は明細書中に引用されたものである：Ｌ　Ｂａｕｔｌｅｒ、　Ｂ、、 　ａｎｄ　Ｃｅｒａｍｉ、　Ａ、　１９８６．　Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ　ａｎｄｔ ｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ａｓ　ｔｖｏ　５ｉｄａｓ　ｏｆ 　ｔｈｅ　ｓａｍｅｂｉｏｌｏｇ±ｃａｌ　ｃｏｉｎ、　ＮａセｕｒＱ　３２： ５８４２、　Ｏｌｄ、　Ｌ、　１９８６．　Ｔｕｍｏｒｎ＠ｃｒｏｓｉｓ　ｆａ ｃｔｏｒ、５ｃｉｅｎｃｅ２：３０：６３０゜ ３、　Ｔｒａｃ＠ｙ、　ｘ、、　Ｂｅｕｔｌａｙ、　Ｂ、、　Ｌｏｗｒｙ、　Ｓ 、、　Ｍｅｒｒｙｗｅａセｈｅｒ。

Ｊ、、Ｗｏｌｐｅ、Ｓ、、Ｍｉｌｓａｒｘ、工、、Ｈａｒｉｒｉ、Ｒ，、Ｆａｈ ｅｙ。

Ｔ、、　Ｚａｎｔｅｌｌａ、入。、　入１ｂａｒｔ、Ｊ、、　５ｈｉｒｅｓ、Ｇ 、　ａｎｄＣａｒａｍｉ、　Ａ、　１９８７．　５ｈｏｃｋ　ａｎｄ　ｔｉｓｓ ｕｅ　１ｎｊｕｒｙ　１ｎｄｕｃｅｄｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａ ｎ　ｃａｃｈｅｃしｉｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：４７０゜４、　Ｎａｗｒｏ ｔＪｈ、　Ｐ、　ａｎｄ　５ｔｅｒｎ、　０．　１９８６．　Ｍｏｄｕｌａセｉ ｏｎ　ｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｈａｍｏｓｔａｔｉｃ　ｐｒｏ ｐａｒｔｉａｓ　ｂｙ　ＴＮＦ。

正、胎工、迄づ、１６４゛ニア０゜ ５、　Ｂａｖｉｌａｃｑｕａ、　Ｍ、、　Ｐｏｂｅｒ、　Ｊ、、　Ｍａｊａａｕ 、　Ｇ、、　Ｆｉｅｒｓ、　Ｗ、。

Ｃｏｔｒａｎ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｃ１ｍ１πｏｎｓ、　Ｍ、　１９８６．　Ｒａ ｃｏｍｂｉｎａｎｔτＮＦ　１ｎｄｕｃａｓ　ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ　ａｃ ｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ。

？ΣΔ旦−工見旦Δ、ｌ　８３：４５３コ。

６、　Ｌａ、Ｊ。、　ａｎｄ　Ｖｉｌｃａｋ、　Ｊ。１９１Ｂ７．　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓａ：ＴＮＦ　ａｎｄ　工Ｌ−４：　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓ　ｗｉｔｈ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｏｖ＠ｒｌａｐｐｉｎｇ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ、Ｌａｂ、工ｎｖｅｓｔ５６：２３４゜ ７、　Ｏｌｄ、　Ｌ、、　ＢａｎａｃｅｒｒａｆｐＢ、、　Ｃ１ａｒｋａ、　Ｄ 、、　ＣａｒｓｗｅｌＬ、　Ｅ。

ａｎｄ　５ｔｏｃｋａｒｔ、　！、　１９６１．　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅｒａ ｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ 　ｒｅａｃｔｉｏｎｔｏ　ｎａｏｐｌａｓｉａ＋ＣａｎＣｅｒＲｅｓ、　２１： １２８１゜８、　Ｎａｗｒｏｔｈ、　Ｐ、、Ｂａｎｋ、　工、、Ｈａｎｄｌｅｙ 、　Ｄ、、Ｃａ５ｓｉｌ：１ｅｎｓ。

Ｊ、、　Ｃｈｅｓｓ、Ｌ、ａｎｄ　５ｔｅｒｎ、０．　１９８６．　Ｔｕｐｏｒ 　ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ　１ｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎｄｏｔ ｈａｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｏ　１ｎｄｕｃｅ　ｒｅｌｅａ ｓｅ　ｏｆ　工Ｌ−１＋、ｑ、　Ｅｘｏ、　困、　１６３：１ｊ６３゜９、　Ｄ ａｖｉｄ、Ｇ、ａｎｄ　Ｒｅ１ｓｆａｌｄ、Ｒ，、１９７４，Ｐｒｏｔｅｉｎｉ ｏｄｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　５ｏｌｉｄ　５ｔａｔｅ　１ａｃｔｏｐｅｒｏ ｘｉｄａｓｅ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３：１０１４゜ １０、　Ｌａｅｉｗ、Ｌｉ、Ｕ、１９７０．　Ｃｌａａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｌｕｒｉｎｇ　ｔｈａ　ａｓｓｅｍｂｌｙ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇａ　Ｔ、Ｎａｔｕｒ ｅ　２２７：６８０＋ＩＬ　Ｈｕｉ、　ＩＫ−、Ｈａｂｅｒ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｍ ａｔｓｕｅｃｌａ、　Ｇ、　１９８３゜Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄ ｉａｓ　ｔｏ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｆｉｂｒｉｎ−１ｉｋｅｐｅｐｔｉｄ ｅ　ｂｉｎｄ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｉｎ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｆｉｂｒｉ ｎｏｇｅｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：１１２９゜ １２、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄ、、Ｇａｕｔｓｃｈ、Ｓ、’、ＳｐｏｒＬｓｍａｎ 、Ｊ、ａｎｄＥｌｄ＠ｒ、Ｊ、１９８４．　工ｍｐｒｏｖ＠ｄ　ｔａｃｈｎｉｑ ｕｅ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｎｏｎ−ｆａｔ　ｄｒｙ　ｍ１ｌｋ　ｆｏｒ　ａｎａ ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄｎｕｃｌａｉｃ　ａｃｉｃｉｓ　 ｔｒａｎｓｆ＠ｒｒｅｄ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ。

Ｇｅｎ、入ｎａ１．Ｔｅｃｈ、ｌ：３゜１３、５ｔｅｒｎ、Ｄ、、Ｂｒａｔｔ、 Ｊ、Ｈａｒｒｉｓ、Ｋ、ａｎｄ　Ｎａｗｒｏｔｈ、Ｐ。

１９１３６、Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏ七ｈａｌｉａｌ　ｃ ｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　ｐａｔｈｗ ａｙ：　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄｒｅｌａａｓａ　ｏｆ　ｐｒｏｔ ａｉｎ　Ｓ、　Ｊ。Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０２：１．９７１゜１４、　、Ｃ ｈｅｎ、　Ｆ’、、　Ｈａｂｅｒ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｅｄａ、　Ｇ 、　１９８７゜Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅ ｎ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｉｎａｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　辷ｈａｔ　ｃｏｎｔａｉｎ ｓ　ｔｈａ　β−ｃｈａｉｎ　（１−７）ｅｐｉｔｏｐｅ、５１１ｎ、Ｒｅｓ。

３５：４２２八。

１５、　Ｂａｊａｊ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｍａｎｎ、　Ｋ。　１９７コ、　Ｓｉｍ ｕｌｔａｎｅｏｕｓｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎａ　ｐｒｏｔ ｈｒｏｍｂｉｎ　ａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ　Ｘ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ　２４８ニア７２９゜’１６．　Ｊａｆｆａ、　Ｅ、　 Ｃｕ１ｔｕｒａ　ａｎｄ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｅ　ｌａｒｇｅｖ ｅｓｓｅｌ　ａｎｄｏｔｈａｌｉａｌ　ｃａｌｌｇ、　工ｎ　Ｅ、Ｊａｆｆａ、 ｅｄ、。

Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｔｈａｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、、Ｅ、Ｊａｆｆａ、 ｅｄｉｔｏｒ。

Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　１−１３゜１７、　Ｔ ｈｏｒｎｔｏｎ、Ｓ、、Ｍｕａｌｌａｒ、Ｓ、ａｎｄ　Ｌａｖｉｎｅ、Ｅ、１９ ８３゜Ｈｕｍａｎ　ｅｎｄｏｔｈａｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ：　ｕｓｅ　ｏｆ　ｎ ａｐａｒｉｎ　ｉｎｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｌｏｎｇ−辷ａｒｍ　５ｅｒｉａ ｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ＋１８、　Ｊａｆｆａ、Ｅ、、Ｈｏｙａｒ、Ｌ、ａ ｎｄ　Ｎａｃｈｍａｎ、Ｒ，１９７３゜５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｈ ａｍｏｐｈｉｌｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｙｃｕｌｔｕｒａｄ　 ｈｕｍａｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　’ｃｅｌｌｓ、　ｑ、Ｃ１１ｎ。

工ｎｖｅｓｔ、　５２：２７５７゜ １９、　Ｅｇｍ口ｎ、　Ｃ，１，９８４，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ，Ｐｒｏａ、　１ （ｅｍｏｓｔａｓｉｓＴｈｒｏｍｂ、７：２５゜ ２０、　Ｖａｎ　Ｄｉｅｉｊａｎ、　Ｇ、、　Ｔａｒｓ、　Ｇ、、　Ｒｏｓｉｎ ｇ、　、：ｒ、　ａｎｄ　Ｈｅｍ）ｃａｒ。

Ｈ，１９８１゜　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ工ＩＩ　ｉｎ　ｔ ｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｘ、　、ｑ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、　２５６：３４３３゜２１、　Ｎａｗｒｏｔｈ、　Ｐ、、　５ｔｅｒ ｎ、ｏ、、Ｋ１５ｉｅｌ、　Ｗ、、ａｎｄ　Ｂａｃｈ、Ｒ。

１９８５’、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ｒｅｑｕｉｒａｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｔｉｓ ｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ　ｂｏ ｖｉｎａ　ａｏｒｔｉｃ　ｅｎｄｏｔｈａｌｉａｌｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔ ｕｒａ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、４０：６７７−６９１゜２２、Ｃｈｉ ｒｇｗａｎ、、：ｒ、、Ｐｒｚｂｙｌａ、入、、ＭｃＤｏｎａｌｄ、Ｒ，、ａｎ ｄＲｕｔｔｅｒ、Ｗ、１９７．９．　工Ｓ口１ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌａｉｃ　ａｃｉｄ　ｆｒｏｍ　５ ｏｕｒｃｅｓ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　１ｎｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔ　１８：５２９４−５２９９゜２３゜　Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、Ｇ 、ａｎｄ　入ｉｔ、Ｆ。　１９８５．　Ｄｅｖａｌｏｐｍｅｎ辷ａｌｌｙｃｏｎ ｔｒｏｌｌｅｄ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　ｏｆｕｎｒｅａｒｒａｎｇｅｄ　ＶＨｇｅｎｅ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ、　Ｃ ｅ１ｌ　４０：２７１−２８１゜２４、　Ｂｅｕｔｌｅｒ、Ｂ、、Ｍｉｌｓａｒ ｋ、工、、ａｎｄ　Ｃｅｒａｍｉ、入、１９８５゜Ｃａｃｈａｃｔｉｎ／τＮＦ ：　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄｍｅｔａｂｏ ｌｉｃ　ｆａｔｅ　ｉｎ　ｖｉｖｏ。　シ。　９１　工ｍｍｕｎｏ１．　：Ｌコ ５：３９７２゜２５、　入５ｈａｒ、入、、Ｍｕｌａ、Ｊ、、Ｒｅ１ｃｈｅｒｔ 、Ｃ，、５ｈｉｌｏｎｉ、Ｅ。

ａｎｄ　Ｒｏｓａｎｂｅｒｇ、　Ｓ、　１９８７．　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔ ｈｅ　ａｎｔｘ−ｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ｓｙｓｔａｍｉｃａｌ ｌｙ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ｒＴＮＦｉｎ　ｖｉｖｏ、Ｊ、ｏｆ　工ｍｍ ｕｎｏｌ　ｌコ８：９６３＋２ｇ、　Ｂａ１ｅ、Ｍ、ａｎｄ　Ｍｏ５ｈｅｒ、Ｄ 、１９８６．　Σｆｆａｃｔｓ　ｏｆｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｏｆ　ｆ ｉｂｒｉｎ　ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｘｏｎ　ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ　２６１．：８６２゜２７、　Ｎａｍａｒｓｏｎ、　Ｙ、　 ａｎｄ　Ｂａｃｈ、　Ｒ，１９８２，Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒｒｅｖｉｓｉ ｔｅｄ、旦■３．　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　Ｔｈｒｏｍｂ。６：２３７゜２Ｂ、 　Ｒｕｆｆ、Ｍ、ａｎｄ　Ｇｉｆｆｏｒｄ、Ｇ、１９８０．　Ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ａｎｄｐｈｙｓｉｃｏｃｈａｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ＴＮＦ。

工ｍｍｕｎ口１．１２５：１６７１゜ ２９、　Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ｓ、、　Ｒａｍｚｉ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｋｕｍａｒ 、　Ｖ、　１９ａ４゜Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、　工ｎ　Ｈｅａｌｉｎｇ　ａｎｄ 　Ｒｉｐａｒｉ、ａｄｓ、。

Ｐａｔｈｏｌｏｉｃ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓａ、　５ａｕｎｄａｒｓ 　Ｃｏ、。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ｐｐ、　９１−９２゜３０、５ｕｔｔｉｅ、　、 ７．　ａｄ、、Ｖｉｔａｍｉｎ　にＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｖｉｔａｍ ｉｎＫ−Ｄｅ　ｅｎｄｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａ ｒｋ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｂａｌｔｉｍｏｒａ、ＭＤ。

コＬ　Ｃａｒｓｗａｌｌ、　Ｅ、　Ｏｌｄ、　Ｌ、、　Ｋａｓｓ＠ｌ、　Ｒ，、 Ｇｒａｅｎ、　Ｓ、。

Ｆｉｏｒｅ、　Ｎ、ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｂ、１９７ｇ、Ａｎ　ｅｎ ｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｅｒｕｍ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｈａｔ　ｃａ ｕｓａｓ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｏｆｔｕｍｏｒｓ、　ＰＮＡ旦−ヱ凹旦Δ上　７ ２：３６６６゜３２、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、、Ｗｈｅｅｌａｒ、Ｅ、、Ｐ ｏｂｅｒ、、：ｒ、、Ｆｉａｒｓ。

Ｗ、、　Ｍａｎｄｒｉｃｋ、　Ｒ，、Ｃｏｎｔｒａｎ、　Ｍ、、　Ｇｉｍｂｒｏ ｎｅ、　Ｈ，１９８７゜Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄａｎ ｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆｌａｕｋｏｃｙｔａ　ａｄｈｅｓｉｏｎ、工ｎ 　Ｍｏｖａｔ、Ｈ，ｅｄ、　ｋ忌交■ａ］＞ｉ　ｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ 　５ｅｃｒｕｅｌａｅ、Ｓ、Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａ５ａｌ。

ｐ、７９゜ ３コ−Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｓ、、Ｒａｍｚｉ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｋｕｍａｒ、Ｖ、１ ，９８４．　工ｎＨｅａｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｒｅｐａｒｉ、　ａｄｓ、、　Ｐａ ｔｈｏｌｏ　ｉｃ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆＤｉｓｅａｓｅ、　５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃ ｏ、、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ｐｐ、　７ロー７７゜３４、　５ｐｏｒ ｎ、　Ｍ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　入、、　Ｗａｋａｆｉｅｌｄ、、Ｌ、　ａｎ ｄ　ｄａＣｒｏｍｂｕｇｇｈｅ、　１９８７．　Ｓｏｍｅ　ｒｅｃｅｎｔ　ａｄ ｖａ’ｎｃｅ′ｓ　ｉｎ　ｔｈｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｙ 　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｖｔｈｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ、Ｊ 、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５：１０３９−１０４５゜３５、Ｃｈａｉｆａｔｚ 、Ｓ、、Ｗｅａｔｈａｒｂｅｅ、Ｊ、、Ｔｓａｎｇ、Ｍ、。

Ａｎｄａｒｓｏｎ、Ｊ、、Ｍｏ１ｅ、Ｊ、、Ｌｕｃａｓ、Ｒ，ａｎｄ　Ｍａｓｓ ａｇｕｅ。

Ｊ、１９８７．　Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔ ｏｒ−ｂｅｔａｓｙｓｔｅｍ、ａ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｃ ｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖａｌｉｇａｎｄｓ　ａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｃ ａ１ｌ　４８：４０９−４１５゜３６、　Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ、１．９８７． 　ＴｈａＴＧＦ−ｂｅｔａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈａｎｄ　ｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔｉａセｉｏｎ’ｆａｃｔｏｒｓ、　Ｃｅ１ｌ　４９：４３７−４３ ８゜３７、　Ｎａｗｒｏｔｈ、Ｐ、、Ｈａｎｄｌｅｙ、Ｄ、、Ｍａｔｓｕｅｄａ 、Ｇ、、ＤｅＷａａｌ。

Ｒ，、Ｂｌａｈｍ、Ｈ，、ａｎｄ　５ｔｅｒｎ、Ｄ、１９Ｅ１８．　Ｊ、Ｅｘａ 、Ｍｅｄ。

１６８：６３７−６４７゜ 浄書（内容に変更なし） ′第１Ａ図 メ２Ａｌ！ ＦＰＬＣＭＯＮＯＱ 第４Ａｌ呂 拓叩１ 手続補正書動式） 平成２年１２月２８日−爾１

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．精製腫瘍壊死増強因子。
2. ２．非還元条件下で約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの見掛けの分子量 によって、及び還元条件下で約６５，０００〜約７５，０００ダルトンの見掛け の分子量によって、並びに約６．８及び約７．２に等電点電気泳動ピークを有す ることによって特徴付けられるポリペプチドからなる請求項１記載の精製腫瘍壊 死増強因子。
3. ３．プロテアーゼＫで処理すると活性喪失することによって、ヘパリン−Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅに親和性で、且つヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから該因子を約０ ．５ＭＮａＣｌで溶出させることができることによって、逆相ＦＰＬＣ−Ｐｒｏ ＲＰＣカラムに結合することができることによって、及び該因子を結合する逆相 ＦＰＬＣ−ＰｒｏＲＰＣカラムから、上昇メタノールグラジエント中約５０％で 溶出させることができることによって、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で単 一バンドとして移動することができることによって、並びにコンカナバリンＡ− Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの吸着によってさらに特徴付けられる請求項２記載の精製 腫瘍壊死増強因子。
4. ４．非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上約４４，０００ダルトンの見掛け の分子量及び還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上約７０，０００ダルトンの 見掛けの分子量によって特徴付けられる請求項２記載の精製腫瘍壊死増強因子。
5. ５．約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの見掛けの分子量によって、トリ プシン又は熱で処理すると活性喪失することによって、ヘパリン・ウルトロゲル に親和性で、且つヘパリン・ウルトロゲルからフラグメントを約０．５ＭＮａＣ ｌで溶出させることができることによって、ＭｏｎｏＱカラムに結合することが できることによって、及び該フラグメントを結合するＭｏｎｏＱカラムから、上 昇塩グラジエント中約０．４ＭＮａＣｌで溶出させることができることによって 特徴付けられる、請求項２に記載の精製腫瘍壊死増強因子の精製された生物学的 活性フラグメント。
6. ６．約２０，０００ダルトンの見掛けの分子量によって特徴付けられる請求項５ 記載の精製された生物学的活性フラグメント。
7. ７．請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍壊死増強因子をコードする精製Ｄ ＮＡ分子。
8. ８．請求項５又は６に記載の、腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントを コードする精製ＤＮＡ分子。
9. ９．請求項７記載のｃＤＮＡ分子。
10. １０．請求項８記載のｃＤＮＡ分子。
11. １１．請求項７記載の単離されたゲノムＤＮＡ分子。
12. １２．請求項８記載の単離されたゲノムＤＮＡ分子。
13. １３．細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強するのに有効な量の、請求項１〜４ のいずれか一項に記載の腫瘍壊死増強因子と医薬上許容可能なキャリアとを包含 する医薬組成物。
14. １４．細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強するのに有効な量の、請求項５又は ６に記載の腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントと医薬上許容可能なキ ャリアとを包含する医薬組成物。
15. １５．腫瘍成長を阻止するのに有効な量の腫瘍壊死因子をさらに含む請求項１３ 記載の医薬組成物。
16. １６．腫瘍成長を阻止するのに有効な量の腫瘍壊死因子をさらに含む請求項１４ 記載の医薬組成物。
17. １７．細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強するのに有効な量の、請求項１〜４ いのずれか一項に記載の腫瘍壊死増強因子の存在中で、腫瘍阻止有効量の細胞障 害性薬剤と腫瘍細胞とを接触させることからなる、腫瘍細胞の増殖を胆止する方 法。
18. １８．細胞障害性薬剤の腫瘍阻止活性を増強するのに有効な量の、請求項５又は ６に記載の腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントの存在中で、腫瘍阻止 有効量の細胞障害性薬剤と腫瘍細胞とを接触させることからなる、腫瘍細胞の増 殖を阻止する方法。
19. １９．細胞障害性薬剤が腫瘍阻止活性を有するポリペプチド組織因子である請求 項１７記載の方法。
20. ２０．ポリペプチド組織因子が腫瘍壊死因子である請求項１９記載の方法。
21. ２１．細胞障害性薬剤が腫瘍阻止活性を有するポリペプチド組織因子である請求 項１８記載の方法。
22. ２２．ポリペプチド組織因子が腫瘍壊死因子である請求項２１記載の方法。
23. ２３．腫瘍細胞増殖阻止を血管系内に限局する請求項１７記載の方法。
24. ２４．腫瘍細胞増殖阻止を血管系内に限局する請求項１８記載の方法。
25. ２５．請求項１３に記載の組成物の有効量と腫瘍細胞とを接触させることからな る、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法。
26. ２６．請求項１４に記載の組成物の有効量と腫瘍細胞とを接触させることからな る、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法。
27. ２７．腫瘍を壊死させるのに有効な量の請求項１３又は１５に記載の医薬組成物 を被験者に投与することからなる、腫瘍を持つ被験者を治療する方法。
28. ２８．腫瘍を壊死させるのに有効な量の請求項１４又は１６に記載の医薬組成物 を被験者に投与することからなる、腫瘍を持つ被験者を治療する方法。
29. ２９．腫瘍細胞から腫瘍壊死増強因子を取り出すこと、及びこのようにして取り 出した該因子を精製することからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫 瘍壊死増強因子を製造する方法。
30. ３０．腫瘍細胞から腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントを取り出すこ と、及びこのようにして取り出した該フラグメントを精製することからなる、請 求項５又は６に記載の腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントを製造する 方法。
31. ３１．腫瘍壊死増強因子を産生するように適切な宿主内で請求項７に記載のＤＮ Ａを発現させること、このようにして産生した該因子を取り出すこと、及びこの ようにして取り出した該因子を精製することからなる、請求頂１〜４のいずれか 一項に記載の腫瘍壊死増強因子を製造する方法。
32. ３２．腫瘍壊死増強因子の生物学的活性フラグメントを産生するように適切な宿 主内で請求項８に記載のＤＮＡを発現させること、このようにして産生した該フ ラグメントを取り出すこと、及びこのようにして取り出した該フラグメントを精 製することからなる、請求項５又は６に記載の腫瘍壊死増強因子の生物学的活性 フラグメントを製造する方法。