DE3306297A1 - Neue glykoproteine, verfahren zu deren herstellung und therapeutische mittel, die solche glykoproteine enthalten, gegen tumore - Google Patents

Description

38 163 m/fg

MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., Ltd., Tokyo / Japan

Neue Glykoproteine, Verfahren zu deren Herstellung und therapeutische Mittel, die solche Glykoproteine enthalten, gegen Tumore

Die Erfindung betrifft neue Glykoproteine, Verfahren zu deren Herstellung und therapeutische Mittel, die solche Glykoproteine enthalten, gegen Tumore. Die Erfindung betrifft insbesondere neue Glykoproteine, die aus einem Extrakt oder einem überstand eines Kulturmediums von retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten warmblütiger Lebewesen bzw. Tiere erhalten werden, Verfahren zur Herstellung derselben und therapeutische Mittel gegen bösartige Tumore, wobei diese Mittel die genannten Glykoproteine einzeln oder in Kombination als einen Wirkstoff enthalten.

Bisher kennt man keine perfekte Tumortherapie; trotz der Tatsache, dass bis heute viele therapeutische Mittel gegen Tumore von einer Anzahl Forscher weltweit entwickelt worden sind, gibt es viele Versuche, neue therapeutische Mittel und

Multi-Agens-Kombinationsbehandlungen auf dem klinischen Sektor anzuwenden.

Die therapeutischen Tumonnittel können grob in zwei

10 Kategorien klassifiziert werden, den chemo-

therapeutischen Mitteln und den immunotherapeutischen Mitteln. Die chemotherapeutischen Mittel, die auch als cytotoxische Substanzen bekannt sind, führen die Wirkung durch eine nicht spezifische

15 Unterdrückung des Zellwachstums herbei und wirken

daher nicht nur auf die Tumorzellen, sondern auch auf normale Zellen toxisch, und sie zeigen nachteilige Nebenreaktionen, wie Leukocytenverminderung (Leukopenie), weibliche Sterilität, Alopezie,

20 Missgestaltung, bösartige Neoplasmen, etc.; aus

diesem Grunde bestellt eine strikte Beschränkung im Hinblick auf die Dosierung. Andererseits führen die immunotherapeutischen Mittel den therapeutischen Effekt durch indirekte Inhibierung des Tumorwachstums herbei, indem sie auf die biophylaktischen funktionen Einfluss haben, und nicht durch eine direkte Inhibierung des Wachstums der Tumorzellen; aus diesem Grunde besteht hier eirie weit geringere Gefahr für nachteilige Nebenreaktionen im Vergleich zu den che-

30 motherapeutischen Mitteln. Turnorpatienten weisen jedoch häufig nicht in ausreichendem Masse bio-

phylaktische Funktionen auf; aus diesem Grunde ist der therapeutische Effekt iminunotherapeutischer Mittel im Vergleich zu den chemotherapeutischen Mitteln nicht immer befriedigend.

Die Erfinder gingen von der Erkenntnis aus, dass die retikulo-endothelialen Zellen, die im Hinblick auf biophylaktische Funktionen eine wichtige Rolle spielen, eine Substanz produzieren, die bei der

Behandlung von Tumoren wirksam ist; die Erfinder haben nach dieser Substanz gesucht.

Mehrere Faktoren, die als vielversprechende therapeutische Mittel gegen Tumore angesehen werden,

15 z.B. Lymphotoxin, Tumor-Necrose-Faktor, Interferon, etc., wurden aus retikulo-endothelialen Zellen erhalten; siehe z.B. Granger, G.A., et al, Cellular . Immunology, Bd. 38, 338-402 (1978), Carswell, E.Λ. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 72, 3666-33670

(1975), und Issacs, A. et al., Proc. Roy. Soc. Ser. B., Bd. 147, 268 (1975). Im weiteren hciben die Erfinder vor kurzem ein einfaches Verfahren zur Isolierung einer grossen Menge an "Carcino-Breaking-Faktor" (im folgenden als CBF bezeichnet) gefunden, welcher ein Gemisch darstellt, das das vorstehend genannte Lymphotoxin, den Tumor-Necrosefaktor etc·, enthält. Die Isolierung erfolgte aus einer Kultur von Lymphoblasten, die in Hamster kultiviert wurden, deren Immunantwort unterdrückt worden war. Von den Erfindern wurde darüber berichtet, dass sich dieser CBF gegen experimentelle Tumore, die

einem Tier transplantiert wurden, als wirksam erweist (The Yomiuri, morning issue, November 22, 1981)

Im Verlaufe der Forschungsarbeiten an CBF haben die Erfinder gefunden, dass Glykoproteine, die sich von den vorstehend genannten cytotoxischen Faktoren, wie Lymphotoxin, Tumor-Necrosefaktor, CBF, etc., unterscheiden, in einem Extrakt oder einem Überstand eines Kulturmediums von retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblacten Warmblutiger Lebewesen bzw. Tiere vorliegen; diese Glykoproteine sind charakterisiert durch einen sehr starken und selektiven cytotoxischen Effekt gegen Tuinorzellen. Ausserdem wurden mehrere Verfahren zur Gewinnung derartiger Glykoproteine auf einfache Weise erararbeitet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Zurverfügungstellung neuer Glykoproteine, die eine 20 Anti-Tumoraktivität, besitzen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Zurverfügungstellung von Glykoproteinen mit Anti-Tumoraktivität, die aus einem Extrakt, oder einem überstand eines Kulturmediums von retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellon oder Fibroblasten warmblütiger Lebewesen bzw. Tiere geerntet bzw. gewonnen werden.

Eine weitere Aufgabe gemäss der Erfindung liegt, in der Zurverfügungstellung von Verfahren zur Gewinnung von Anti-Tumor-Glykoproteinen aus einem Extrakt oder einem Überstand eines Kulturmediums von retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezelle oder Fibroblasten warmblütiger Lebewesen bzw. Tiere.

Im weiteren sollen durch die Erfindung therapeutische Mittel gegen Tuinore zur Verfugung gestellt werden, wobei diese Mittel derartige Anti-Turnor-Glykoproteine einzeln oder in Kombination als einen aktiven Bestandteil enthalten.

Die vorstehende Aufgabe wird durch ein Glykoprotein gelöst, das durch folgende Eigenschaften charakterisiert ist:

a) Molekulargewicht: im Bereich von 7.000 bis 90.000, 20 bestimmt durch SD5-Gelelektrophore.se oder

Sephades-Gelfi1 tra tion;

b) Farbreaktionen: es bildet eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, es bil- det

eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und es bildet eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis von Zuckern;

c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 45 %, wobei 6 bis 28 % des Gesamtzuckers Hexosen, 1 bis

11 % Hexosamine und 1 bis 6 % Sialinsäuren (sialic acids) darstellen;
10

e) stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über 3 h oder länger; und

f) Selektive Zerstörung von Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

Fig. 1 zeigt das IR-Spektruin von CB„, bestimmt in Beispiel 10

Fig. 2 zeigt das IR-Spektrum von CB^₁, bestimmt in Beispiel 15

Fig. 3 zeigt das IR-Spektrum von CB.,^/ bestimmt in Beispiel 21

Fig. 4 zeigt das IR-Spektrum von CB„₃, bestimmt in Beispiel 29
30

Da die Glykoproteine gemäss der Erfindung in vier Fraktionen mit verschiedenen Molekulargewichten und Zuckergehalten eingeteilt werden können, werden die Glykoproteine in der vorliegenden Beschreibung aufgrund ihres Unterschiedes im Molekulargewicht klassifiziert; eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 12.000 bis 17.000 wird als "Carcino-Breaker X" bezeichnet (im folgenden als CB_V bezeichnet; dies trifft auch für die weiteren zu), eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 70.000 bis 90.000 wird als CB^₁ bezeichnet, eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 40.000 bis 50.000 als CB„2 ^un(3 eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von.7.000 bis 9.000 als CB_x3· In 15' dem Falle, wo sämtliche Fraktionen, nämlich CB_x, CB_X1. CB_X2 und CB_x3 allgemein angesprochen sind, wird als Allgemeinausdruck "CB" verwendet.

Die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften der erfindungsgemässen Glykoproteine werden nachfolgend im Detail beschrieben.

^CBX

a) Molekulargewicht: bei Bestimmung mit Hilfe der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G 100 (Pharmacia Co.) und 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) als Lösungsmittel, beträgt das Molekulargewicht 12.000 bis 17.000.

b) Farbreaktionen: die Ergebnisse der Versuche mit

wässriger CB_V-Lösung auf Farbreaktionen sind in λ

Tabelle 1-1 zusammengestellt. Die Lowry-Reaktion und die Ninhydrin-Reaktion wurden entsprechend den in

5 Seikagaku Jikken Koza, Bd. 1, Quantitative

Proteinmethoden, 1971, beschriebenen Verfahren
durchgeführt. Die Phenolschwefelsäure-Reaktion, die
Anthronschwefelsäure-Reaktion, die
Naphtholschwefelsäure-Reaktion, die Indol-

10 schwefelsäure-Reaktion und die Tryptophanschwe-

felsäure-Reaktion wurden entsprechend den Verfahren, wie sie in Seikagaku Jikken Koza, Bd. 4,
Quantitative Methoden für Zucker, 1971, beschrieben
sind, durchgeführt. Die Holff-Reaktion wurde

15 entsprechend den Verfahren, wie sie in Seikagaku Jikken Koza, Bd. 3, Quantitative Methoden für Lipide, 1971, beschrieben sind, durchgeführt.

Tabelle 1-1 20

Farbreaktion Färbung Nachweis

Lowry blau Peptidbindungen

Ninhydrin purpurblau Aminosäuren

Phenolöchwefeisäure braun Zucker

Anthronschwefelsäure grünlich blau Zucker

Ck-Naphtholschwefelsäure purpurfarben Zucker

Indolschwefelsäure braun Zucker

Tryptophanschwefelsäure purpur-braun Zucker

Holff farblos keine Lipide

Wie aus vorstehender Tabelle hervorgeht, ergibt CB_V .Farbreaktionen als Nachweis auf Proteine und zucker; es ergibt keine Färbung zum Nachweis auf Lipide.

c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform.

d) Zuckergehalt: gemäss der Methode von Spiro (Spiro, H.A., Methods in Enzymology, Bd. 8, 3-26 (1966)) beträgt der Zuckergehalt von CB_V 27 bis 33 %; die Zuckerzusammensetzung beträgt: 17 bis 20 % Hexosen, 5 bis 7 % Hexosamine und 5 bis 6 % Sialinsäuren.

e) Isoelektrischer Punkt: bei Bestimmung mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung an Ampholin liegt der "isoelektrische Punkt bei 4,2 bis 7,3.

f)Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2).

g) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht durch Gelfiltration und der cytotoxischen Aktivität gegen 25 Tumorzellen in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0

oder pH 11,0 bei 4°C 24 h oder langer und in wässriger Lösung von pH 7,0 bei 6.0⁰C 3 h oder langer.

h) Das genannte Glykoprotein zerstört selektiv Tumorzellen, ohne dass es normale Zellen in nennenswertem Masse schädigt.

Die Cytotoxizität von CB_x wurde bestimmt durch Kultivieren von 10 Tumorzellen oder normalen Zellen in 0,2 ml eines Mediums in Gegenwart dieser Substanz bei 37⁰C für 48 h in einer 5 % CO₀, 95 % Luftatmosphäre, und Auszählen der Anzahl lebensfähiger Zellen, die nicht mit Trypan-blau gefärbt wurden, und ausgedrückt als Konzentration, bei welcher die zahlenmässige Zunahme der Zellen zu 50 % inhibiert wurde. Eine Einheit CB wird als die Substanzmenge definiert, bei v/elcher das Wachstum von 10 -Zellen der KB-Zelle zu 50 % inhibiert wird.

i) Induktion einer Differenzierung von Tumorzellen, d.h. nach einem Test gemäss dem Verfahren von Hozumi et al (Hozumi, et al, Cancer Research, Bd. 40, 2919 2924 (1980)) werden die Tumorzellen, unter Anwendung von myelogenen Leukämiezellen M-I zu normalen Zellen umgewandelt.

a) Mole! ulargewicht: bei Bestimmung mit Hilfe der Gel filtration unter Verwendung von Sephadex G-100 und 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) als Lösungsmittel be-

25 trägt das Molekulargewicht 70.000 bis 90.000.

b) Farbreaktionen: die Ergebnisse der Versuche mit wässriger CB„-.-Lösung auf Farbreaktionen sind in Tabelle 1-2 zusanimengestellt.

Tabelle 1-2

Farbreaktion

Farbe

Nachweii

Lowry Ninhydrin Phenolschwefeisäure Anthronschwefelsäure C\r-Napht hol schwefel säure Indolschwefelsäure Tryptophanschwefelsäure Holff

blau

purpurblau

braun

grünlich blau

purpur

braun

purpur-braun

farblos

Peptidbindungen Aminosäuren

Zucker Zucker

Zucker Zucker

Zucker keine Lipide

Wie die vorstehende Tabelle zeigt, ergibt CB_x-, Farbreaktionen zum Nachweis auf Proteine und Zucker, je-20 doch keine Farbreaktion zum Nachweis von Lipiden.

c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-25 form.

d) Zuckergehalt: gemäss der Methode von Spiro beträgt der Zuckergehalt von CB_x-, 35 bis 45 %; die Zuckerzusammensetzung ist folgende: 23 bis 28% Hexosen, 8 bis 11 % Hexosamine und 4 bis 6 % Sialinsäuren.

e) Isoelektrischer Punkt: bei Bestimmung durch isoelektrische Fokussierung an Ampholin liegt der isoelektrische Punkt bei 4,3 bis 6,2.

f) Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2).

g) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht mittels Gelfiltration und der cytotoxischen Aktivität gegen Tumorzel3en in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C 24 h oder langer und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C 3 h oder langer.

h) Selektrive Zerstörung von Tumorzellen ohne wesentliehe nachteilige Beeinflussung normaler Zellen. Die Cytotoxizität von CB_x^ wurde nach den gleichen Verfahren, wie dies für CB,, beschrieben ist, bestimmt.

^CBX2 20

a) Molekulargewicht: bei Bestimmung mit Hilfe der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 und 0,01 η rhosphatpuffer (pH 7,2) als Lösungsmittel wurde das Molekulargewicht zu 40.000 bis 50.000 ermittelt.

25

b) Farbreaktionen: Die Ergebnisse der Versuche mit wässriger CB^-Lösung auf Farbreaktionen sind in Tabelle 1-3 zusammengestellt:

Tabelle 1-3

Farbreaktion

Farbe

Nachweis

Lowry Ninhydrin Phenolschwefelsäure Anthronschwefelsäure gis -Naphthol schwefel saure Indolschwefelsäure Tryptophanschwefelsäure Holff

blau

purpurblau

braun

grünlich blau

purpurfarben

braun

purpur-braun

farblos

Peptidbindungen

Aminosäuren

Zucker

Zucker

Zucker

Zucker

Zucker

keine Lipide

Wie die vorstehende Tabelle zeigt ergibt 0Β_χ2 Farbreaktionen zum Nachweis von Proteinen und Zuckern, jedoch keine Farbreaktion zum Nachweis von Lipiden.

c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässriger Natriumchloridlösung und Phosphatpuffer, schwach löclich in Benzol, Hexan und Chloroform.

d) Zuckergehalt: nach der Methode von Spiro wurde der Zuckergehalt von CB^₂ zu 30 bis 37 % ermittelt, wobei sich dieser wie folgt zusammensetzt: 20 bis 23 % Hexosen, 6 bis 8 % Hexosamine und 4 bis 6 % Sialinsäuren.

e) Isoelektrischer Punkt: bei Bestimmung durch Isoelektrofokussierung an Ampholin liegt der isoelektrische Punkt bei 4,2 bis 7,3.

f) Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 1,2).

g) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht mittels Gelfiltration und der cytot'oxischen Aktivität gegen Tumorzellen in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder langer und in wässriger Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder langer.

h) Es schädigt bzw. zerstört selektiv Tumorzellen ohne dabei normale Zellen nennenswert zu schädigen. Die Cytotoxizität von CB„„ wurde nach den für CB_V beschriebenen Verfahren bestimmt.

20 CB_X3

^a) nolekulargewicht: bei Bestimmung durch SDS-GeI-Elektrophorese beträgt das Molekulargewicht 7.000 bis 9.000.

b) Farbreaktionen: die Ergebnisse der Versuche mit wässriger CB_V_-Lösurig auf Farbreaktionen sind in Tabelle 1-4 zusammengestellt.

Tabelle 1-4

Farbreaktion

Farbe

Nachweii

Lowry Ninhydrin PhenolSchwefelsäure Anthronschwefelsäure φNaphtholschwefelsäure Indolschwefelsäure Tryptophanschwefelsäure HoIf f

blau

purpur-blau

braun

grünlich blau

purpurfarben

braun

purpur-braun

farblos

Peptidbindungen

Aminosäuren Zucker

Zucker Zucker

Zucker Zucker keine Lipide

Wie die vorstehende Tabelle zeigt, ergibt CB„₃ Farbreaktionen zum Nachweis von Proteinen und Zuckern, jedoch keine Farbreaktion zum Nachweis von Lipiden.

c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform.

d) Zuckergehalt: nach der Methode von Spiro wurde der Zuckergehalt von CB_vr> mit 8 bis 15 % ermittelt, wobei sich dieser wie folgt zusarnmensetz: 6 bis 10 % Hexosen, 1 bis 2 % Hexosamine und 1 bis 3 % Sialinsäuren.

e) Absorbierbar an Carboxymethylcellulose bei einer Ionenaustauschchromatografie in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4) unter Verwendung von Carboxymethylcellulose.

f) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht mittels Gelfiltration und der cytotoxischen Aktivität gegen Tumoi:zGllen in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder länger.

g) Ec schädigt selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Beschädigung normaler Zellen. Die Cytotoxizität von CB„-, wurde nach den für CB_V beschriebenen Verfahren bestimmt.

h) Die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteinanteiles ist Alanin-Alanin-.

Die Glykoproteine gemäss der Erfindung besitzen gemeinsame Charakteristika in ihren Farbreaktionen, ihrem Aussehen, ihrer Löslichkeit, Stabilität, ihrer Wirkung auf Tumor zellen, etc., sie unterscheiden sich jedoch voneinander im Hinblick auf das Molekularge- ■ wicht und den Zuckergehalt; auf diese Weise können die jeweiligen Substanzen voneinander unterschieden werden

Die Glykoproteine gemäss der Erfindung unterscheiden sich deutlich von Lymphotoxin, dem Tumor-Necrose-Faktor, einem Gemisch derselben, nämlich CBF, oder Interferon, wobei alle diese aus retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezel]en oder Fibroblasten erhalten werden, im Hinblick auf die folgenden Merkmale; die Glykoproteine gemäss der Erfindung stellen somit deutlich unterschiedliche Substanzen dar.

Es ist bekannt, dass Lyrnphotoxin in drei verschiedenen Typen vorliegt, die sich durch das Molekulargewicht unterscheiden, nämlich t/C-Lympbotoxin mit einem Molekulargewicht von 70.000 bis 90.000, ß-Lymphotoxin mit einem Molekulargewicht von 35.000 bis 50.000 und Q"-Lymphotoxin mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 20.000 (Cohen et al., (Herausgeber) Biology of the Lyinphokinase, Academic Press, 1979). Im Hinblick auf. das Molekulargewicht ähneln CB_V dem O'^J -Lymphotoxin,

^GBxi ^dem ds -Lymphotoxin und CB _ dem β -Lymphotoxin. wie jedoch von Lucas et al (Lucas, Z.J. et al., J. Immunology, Bd. 109, 1233 (1972)) berichtet wird, besitzt Lymphotoxin im Hinblick auf seine cytotoxische Wirkung wenig Selektivität; es führt zu einer Schädigung sowohl von normalen als auch von Tumorzellen, im Gegensatz dazu ist die cytotoxische Wirkung der erfindungsgernässen Glykoproteine gegenüber Tumorzellen selektiv, und sie unterscheiden sich damit deutlich von Lymphotoxin. Ausserdem unterscheiden sich die erfindungsgernässen Glykoproteine von Lymphotoxin in bezug auf Absorbierbarkcit und Stabilität. Genauer gesagt bedeutet dies folgendes: während das nach dem Verfahren von Granger et al (Granger, G./u et al, Cellular Immunology, Bd. 38, 388-402 (1978)) hergestellte Lymphotoxin nicht oder nur schwach an Ulcx-europeus-Agglutinkonjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer absorbiert wird, werden die erfindungsgomässen Glykoproteine an dasselbe absorbiert. Ausserdem sind die Glykoproteine gemäss der Erfindung in wässriger Lösung von pll 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4⁰C über 24 h oder langer, und auch bei pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder langer stabil. Im Gegensatz dazu verliert Lymphotoxin 60 % oder mehr seiner Aktivität, wenn man es 4 h lang auf 56°C hält.

Der Tumor-Necrose-Faktor zeigt eine selektive cytotoxische wirkung auf Tumorzellen, er besitzt ein Molekulargewicht von 33.000 bis 36.000 und einen Zuckergehalt von 0 % (Carswell, E.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 72, 3666-3670 (1975)) und er weist ein Molekulargewicht von 39.000 und einen Zuckergehalt von 40 % (The Nippon Keizai Shimbun, Morgenausgabe, August 23, 1981) auf; beide unterscheiden sich von CB„, CB_yl und CB_yVim Hinblick auf das Molekulargewicht und von CB_x2 i™ Hinblick auf den Zuckergehalt.

CBF, welches diese cytotoxischen Faktoren in Kombination enthält, besitzt ein Molekulargewicht von ca. 35.000 (The Nippon Keizai Shimbun, Morgenausgabe, November 22, 1981) und unterscheidet sich von den erfindungsgemässen Glykoproteinen im Hinblick auf das Molekulargewicht .

Schliesslich unterscheiden sich die Glykoproteine gemäss der Erfindung auch von Interferon, indem erstere kein*'· antivirale Aktivität besitzen.

Im folgenden werden die Zellen zur Herstellung bzw. Gewinnung der Glykoproteine gemäss der Erfindung erläutert .

Die Zellen zur Verwendung gemäss der Erfindung, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen warmblütigen Lebewesen stammen, können beliebig retikulo-endotheliale Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen und Fibroblasten darstellen, und sie können in

einer Primärkultur oder in einer etablierten (established) Zellinie angewendet werden. Vorzugsweise werden Zellen menschlichen Ursprungs eingesetzt; dieselben ergeben eine höhere Sicherheit, da sie in geringerem Masse zu antigen-induzierten Reaktionen und anderen nachteiligen Reaktionen im Hinblick auf die Verwendung von CB bei der Behandlung menschlicher Erkrankungen führen. Es können hierfür beliebige Zellen ausgewählt werden, wie z.B. BALL-1-Zellen, TALL-1-Zellen und NALL-1-Zellen, wie sie von Miyoshi beschrieben werden(Miyoshi, I., Nature, Bd. 267, 843-844 (1977)), Namalwa-Zellen, wie sie in "Journal of Clinical Microbiology" beschrieben werden (J.elin. Microbiol. Bd. If 116 - 117 (1975)), M-7002-Zellen und B-7101-Zellen, wie sie in "Journal of Immunology" beschrieben werden (Bd. 113, 1334-1345 (1974)), Flow-7000-Zellen (Flow Co.), JBL-Zellen, EBF-Sa-Zellen, EBV~Wa-~Zellen und EBV-HO-Zellcn, wie sie in "The Tissue Culture" (Bd. 6, 527 - 546 (1980)) beschrieben werden, eine etablierte Zellinie, wie z.B. BALM-2-Zellen, CCRF-SB-Zellen (ATCC CCL 120), etc., und menschliche Lymphocyten und Macrophagen,wie auch Zellen einer etablierten Zellinie von menschlichen Lymphocyten und Macrophagen, die mit verschiedenen Viren, Arzneimitteln, Bestrahlungen, etc. behandelt worden sind.

Als Zellen, die von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, können beliebige Zellen gewählt werden, so z.B. Maus-BALB/C 3T3-Zellen (Flow Co.), Maus-Leukämie-Zellen, wie Ll210~Zcllen (J. Natl.

Cancer Inst., Bd. 13, 1328 (1953)) und P388--Zellen

(Scientific Proceedings, Pathologists & Bacteriologists, Bd. 33, G03 (1957)), Maus-Melanom-Klon M-3 (Flow Co.)/ Ratten-Tumor LLC-WRC 256 (Flow Co.)/ Hamster-Melanom-RPMI-1846-Zellen (Flow Co.) und Lymphocyten, Macrophagen, etc.. Es versteht sich, dass die gemäss der Erfindung verwendeten Zellen nicht auf die vorstehend angegebenen Beispiele beschränkt sind.

Das Verfahren zur Herstellung der Glykoproteine (CB) gemäss der Erfindung wird im folgenden näher erläutert.

Das Verfahren zur Herstellung von CB mit Hilfe von Zellen, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, kann aus bekannten Verfahren zur Herstellung aktiver

Substanzen mit Hilfe von Zellen ausgewählt werden; die Gewinnung bzw. das Ernten kann entweder direkt aus den Zellen erfolgen oder nachdem die Zellen kultiviert worden sind, oder - falls eine grössere Menge an CB gewünscht wird - werden diese Zellen einem oder mehreren Induktoren ausgesetzt. Z.B. können die Zellen, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, in einem geeigneten Medium suspendiert und direkt dem Induktor *»>-· 25 ausgesetzt, werden, um CB zu produzieren, welches dann aus dem Medium geerntet wird.

Als Induktor für CB werden gewöhnlich ein oder mehrere Substanzen aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Lectine, wie Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Kermesbeere-Mitogen (pokeweed mitogen), lipopolysaccharide, Polysaccharide, wie Phosphomannan, Dextranphosphat, En-

dotoxine, mikrobielle Zellkomponenten, Bakterien, Viren, Nucleinsäuren, Polynucleotide etc:. Für die antigen-sensibilisierten Zellen dient ausserdem das korrespondierende Antigen auch als ein Induktor (inducer) für CB.

Das auf diese Weise produzierte CB kann nach bekannten Reinigungsverfahren auf einfache Weise isoliert werden, wie z.B. durch Aussalzen, Dialyse, Filtration, Zentrifugation, Konzentrierung. Lyophilisierung, etc.. Sofern eine bessere Reinigung gewünscht wird, kann diese durch Adsorption und Elution an einem Ionenaustauschharz, durch Gelfiltration, Elektrophorese oder Äffinitätschromatografie unter Verwendung von z.B. Antikörperoder Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex erzielt werden.

Wenn CB in einer grossen Menge erhalten werden soll, können die Zellen der etablierten Zellinie im Körper warmblütiger Lebewesen bzw. Tiere gezüchtet werden, wie dies nachfolgend erläutert wird.

Die etablierten Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, können beliebige retikulo-endotheliale Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen und Fibroblaste darstellen, vorzugsweise werden Zellinien menschlichen Ursprungs eingesetzt, da diese weniger dazu neigen, durch Antigenizität induzierte Reaktionen oder andere nachteilige Reaktionen bei der Verwendung von CB zur Behandlung menschlicher Erkrankungen hervorzurufen. Es können hierfür beliebige Zellinien verwendet werden,

wie dies vorstehend beschrieben wird, z.B. BALL-1-Zellen, TALL-1-Zellen, NALL-1-Zellen, Namalwa-Zellen, M-7002-Zellen, B-7101-Zellen, Flow-7000-Zellen, BALB/C 3T3-Zellen, Ll210-Zellen P388-Zellen, Lymphocyten, Macrophagen, etc..

Wenn diese Zellen im Körper warmblütiger Tiere gezüchtet werden sollen, kann die Transplantation derartiger Zellen direkt durchgeführt werden oder - wie dies nachfolgend beschrieben wird - indirekt durch Inokulieren einer Kammer mit den genannten Zellen und Placieren der Kammer im Körper. Die warmblütigen Tiere, in welche derartige Zellen transplantiert werden, können der gleichen oder einer anderen Spezies angehören, sofern die etablierte Zellinie, die menschlichen Ursprungs ist. oder von einem nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, in derselben zu wachsen vermag. Z.B. können verwendet werden: Geflügel, wie Hühner, Tauben, und Säugetiere, wie Hunde, Katzen, Af-

20 fen, Ziegen, Schweine, Pferde, Rinder, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Hamster, übliche Mäuse, Nacktmäuse (nude mouse).

Wenn in einem dieser Tiere eine Transplantation mit kultivierten Zellen, die von einem Tier einer anderen Spezies stammen, erfolgt, besteht die Möglichkeit des Auftretens unerwünschter immunologischer Reaktionen. Aus diesem Grunde werden Tiere in ihrem untersten Reifezustand bevorzugt verwendet, z.B. Eier, Foeten, Embryos, oder onatale oder infantile Tiere, so dass die Möglichkeit immunologischer Reaktionen auf ein Minimum reduziert wird. Ausserdem können die immunologischen Reaktionen durch Vorbehandlungen unterdrückt

werden, z.B. indem diese Tiere Röntgenstrahlen von 200 bis 600 REM ausgesetzt werden, oder indem man sie mit iinmunosuppressiven Mitteln injiziert.

Wenn das als Wirt zu verwendende Tier eine Nacktmaus darstellt oder von der gleichen Spezies wie die zu transplantierenden Zellen ist, sind die immunologischen Reaktionen schwach; deshalb können derartige Zellen in dieselben transplantiert und schnell ohne

10 Vorbehandlung gezüchtet werden. Aus diesem Grunde ist die Verwendung derartiger Zellen besonders vorteilhaft.

In alternativer Weise kann das konstante Zellwachstum sichergestellt und die Menge des von den Zellen produ-

15 zierten CB erhöht werden, indem man Zellen von einem warmblütigen Tier in ein anderes warmblütiges Tier transplantiert, z.B. durch Transplantation von Zellen, die-menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, in Hamster zum

Wachstum, und anschliessender Retransplantierung der genannten Zellen in Nackt-fläuse. In solchen Fällen kann die Transplantation zwischen derselben Klasse oder Abteilung wie auch zwischen derselben Spezies oder Gattung durchgeführt werden.

Die Stelle, in welche die Zellen, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, transplantiert werden, kann jede beliebige Stelle darstellen, an welcher die transplan-

tierten Zellen wachsen; so können z.B. die allantoische Höhle, eine Vene, die Bauchhöhle, das subkutane Gewebe frei gewählt werden.

Anstelle der direkten Transplantation und des züchtens etablierter Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, im Körper warmblütiger Tiere, kann jede beliebige der vorstehend genannten etablierten Zellinien inokuliert und in einer üblichen Diffusionskammer verschiedener Gestalt und Grosse gezüchtet werden, wobei letztere z.B. in der Peritonealhöhle des Körpers warmblütier Tiere placiert wird. Die Diffusionskammer ist so konstruiert, dass sie das Wachstum der genannten Zellen ermöglicht, indem die Aufnahme von Körperflüssigkeit des Tieres als Nährstoffe leicht möglich wird; die Kammer ist ausserdem mit porösen Filtermembranen ausgerüstet, z.B. einem Membranfilter mit einer Porengrösse von ca. 10 bis 10~ m, einem Ultrafilter oder einer Hohlfaser, welche das Herauswandern der Zellen aus der Kammer verhindern und den Eintritt der Körperflüssigkeit als Nährstoffquelle in die Kammer erlauben.

Sofern dies erforderlich ist, kann die Diffusionskammer entsprechend konstruiert und z.B. auf der Oberfläche des Tierkörpers placiert werden, so dass die Nährstotfflüssigkeit in der Kammer mit der Körperflüssigkeit des Tieres in Verbindung steht und zirkuliert; auf diese Weise kann das Wachstum der in die genannte Kammer inokulierten Zellen durch ein Sichtfenster beobachtet werden. Die Diffusionskammer kann auch in der Weise konstruiert werden, dass sie vom Tierkörper getrennt werden kann und es somit möglich ist, die Zellen über die gesamte Lebensspanne des Tieres zu züchten und auf diese Weise die Ausbeute an Zellen pro Tier zu erhöhen.

Das Verfahren unter Verwendung dieser Diffusionskammern weist weitere Vorteile auf: da die Zellen der
etablierten Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen

5 stammen, nicht direkt in Kontakt mit den Tierzellen

gebracht werden, können diese Zellen auf einfache Weise geerntet werden; aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit, des Auftretens unerwünschter immunologischer Reaktionen kann man verschiedene warmblütige Tiere oh-

10 ne Vorbehandlung derselben zur Immunosuppression verwenden.

Die Tiere, in welche die Zellen transplantiert worden sind, können in der für das Tier üblichen Weise gefüttert und gehalten werden; selbst nach der Transplantation sind keine besonderen Massnahmen erforderlich;
dies stellt einen besonderen Vorteil dar.

Der für das Wachstum der Zellen der etablierten Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nichtmenschlichen, warmblütigen Tieren stammen, erforderliche Zeitraum beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Wochen.
Die Anzahl der auf diese Weise erhaltenen Zellen wurde zu ca. 10
bestimmt.

7 3 2
zu ca. 10 bis 10 Zellen und darüber pro Tier

Dies bedeutet, dass das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von CB extrem vorteilhaft ist, da die etablierten Zellinien, die von warmblütigen Tieren

2 7

30 stammen, um ca. das 10 - bis 10 -fache oder darüber in bezug auf die dem Tier direkt inokulierten Zellen vervielfacht werden, oder ca. 10- bis

10 -fach oder darüber der Vervielfachung im Vergleich mit Zellen, die in einem Nährstoffmedium kultiviert wurden.

Die Produktion von CB aus gezüchteten Zellen einer etablierten Zellinie, die menschlichen Ursprungs ist oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Die Zellen können auch direkt aus dem Körper, in welchem sie gezüchtet wurden, geerntet werden. Z.B. kann CB direkt aus den Zellen, die durch Züchten transplantierter Zellen etablierter Zellinien, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, in Aszit.es als, Suspension geerntet werden oder indem man diese subkutan züchtet.

in alternativer Weise kann die Herstellung von CB unter Verwendung eines Iduktors nach dem züchten der

15 etablierten Zellinien, die von menschlichen oder

nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, im Körper eines Tieres erfolgen, indem man den Induktor entweder direkt in vivo oder in vitro, nachdem man die Zellen aus dem Körper genommen hat, anwendet. Z.B.

können die Zellen einer etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, und in Aszites gezüchtet und daraus geerntet wurden, oder solche Zellen, die aus einem subkutanen Tumor isoliert und dissoziiert worden sind, und die Zellen einer·etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, umfassen in einem Nährstoffmedium bei ca. 20 bis 4ü°C suspendiert werden, unter Bildung einer Zellkonzentration von ca. 10

30 bis 10 Zellen pro ml, und dann einem CB-Induktor

ausgesetzt werden, wodurch die Produktion von CB, das dann geerntet wird, induziert wird.

Wenn ausserdem die Zellen einer etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, in einer Diffusionskammer gezüchtet werden, so können die Zellen direkt aus der Kammer geerntet werden, oder sie können nach deren Entfernen aus der Kammer entweder direkt oder nach Einwirkung eines oder mehrerer Induktoren geerntet werden.

fm weiteren kann die Ausbeute an CB pro Tier noch weiter erhöht werden, indem man z.B. eine Methode anwendet, wonach die Zellen einer etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, die im Körper eines anderen Tieres gezüchtet worden sind, einem Induktor aussetzt werden, um die Produktion von CB in situ zu induzieren, und daraufhin die gezüchteten Zellen, die an einer bestimmten Stelle oder aus dem gesamten Tierkörper geerntet worden sind, einem Induktor zur Induzierung der Produktion von CB aussetzt, einem Verfahren, wonach die verwendeten Zellen wiederum einem Induktor zur Induzierung der CB~Produktion ausgesetzt werden, einem Verfahren, wonach eine Diffusionskammer, die in den oder in Verbindung mit dem Tierkörper placiert

25 wurde, durch eine neue ausgetauscht wird, um die Anzahl der erhaltenen Zellen zu erhöhen, etc..

Zur Induzierung der CB-Prdouktion kann jeder beliebige der vorstehend beschriebenen CB-Induktoren eingesetzt werden; das auf diese Weise produzierte CB kann jeweils in CB„, CB ,, CB_X2 und CB_x3, die die spezifizierten Molekulargewichte aufweisen, unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Trennungs- und Reinigungsverfahren fraktioniert werden.

Im folgenden wird die Wirksamkeit, Toxizität, das Anwendungsverfahren und die Dosierung des auf diese Wei se erhaltenen CB beschrieben.

Selekt ivität des cytotoxischen Effektes

5
Proben von 10 Zellen einer jeden der Tumorzelli-

nien, einschliesslich KB-Zellen (Nasen-Rachenraum-Krebs), MX-l-Zellen (Brustkrebs, erhalten von Dr. Shigeru Tsui-.agoshi, Krebsinstitut), HEp-2-Zellen (Rachenkrebs) und HEL-Zellen (Hepatom, Flow Co.) und normalt, η Zellinien, einschliesslich Darm-407-Zellen, Girardi --Herzzellen, Chang Leber-Zellen, Vero-Zellen (Affenniere) und MDCK-Zellen (Hundenicre) (Plow Co.), die sämtliche jeweils 24 h vorkultiviert worden waren, und Κ)'"* Zellen von jeweils P388- und L1210-Zellen (Leukämie, erhalten von Dr. Shigeru Tsukagoshi, Krebs-Institut), die unmittelbar verwendet wurden, wurden jC'U'.-i 1 r. in 1 vnl Eagle--*lcdium, welches 10 % Kälberserurn enthielt, mit jeder Testsubstanz bei 37°C 48 h lang in 5 % CO₂, 9 5 % Luftatmosphäre, kultiviert. Daraufhin wurde die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die nicht mit Trypanblciu angefärbt wurden, unter dem Lichtmikroskop ausgezählt und die Konzentration der Testsubstari/i, bei welcher 50% dor Zellen abgetötet wurden, in bezug auf die Kontrolle, die als 100 angenommen wurde, berechnet. Als Testsubstanzen wurden CB_V (erhalten

30 in Beinpiel 10), CB„·, (erhalten in Beispiel 16), CB_X2 (erhalten in Beispiel 2Ö), CB_x3 (erhalten in Beispiel 26 oder 29), Gemisch von CB_V und CB_v1 ,

Gemisch von CB_x, CB^₁, 0Β_χ2 und £Β_χ3, Gemisch von CB_X2 und CB„₃, d,-,B- und/'-Lymphotoxine, die nach einer bekannten Methode erhalten wurden (Granger, G.A. et al, Cellular Immunology, Bd. 38, 388-402 5 (1978)), CBF, das von CB_V in Beispiel 1 abgetrennt

wurde, und Mitomycin C verwendet. Eine Einheit der Lymphotoxine und CBF wird nach einem konventionellen Index ausgedrückt, der auf der Cytotoxizität auf
Maus-L-Zellen (Bloom, B.R. & Grade, P.R. "In Vitro Methods in Cell-mediated Immunity", Academic Press,

1979) basiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2-1 bis 2-4 zusammengestellt.

Tabelle 2-1

Konzentration für 50 % Inhibierung des Wachstums

Zellen- Spezies CB_x /"-Lympho- CBF Mitomycin
name Einheit/ml toxin Einheit/ml /ug/ml

Einheit/ml

	KB	human	1,0	16	-	18	34
Tumor- zellen	HEp-2 HEL	human human	1,6 1,1	5,6	-	24 33	17 26
	MX-I	human	1,9	-	3,5	32
	L1210	Maus	3,0	80,0	-	43
	P388	Maus	3,3	-	-	36
	Darm 407	human	1.000	8,0	20.000	32
	Girar- di-Herz	human	1.000	-	20.000	45
normale Zellen	Chang Leber	human	1.000	-	20.000	19
	Vero	Affe	650	-	52
	MDCK	Hund	520	-	41

CO CO CD

ί 4 < . t f

Anmerkung: "-" bedeutet, das Experiment wurde nicht durchgeführt.

Tabelle 2-2

Konzentration für 50 % Inhibierung des Wachstums

CO CO O

Zellennaine

Spezies

Einheit/ml Einheit/ml

iO-Lympho- ß-Lympho- CBF ' Mitomycin·^ toxin toxin Einheit/ml /ug/ml
Einheit/ml Einheit/ml

	KB	human	1,0	1,0	19	21	18	-	34	1
Tumor zellen	HEp-2 HEL	human human	1,5 1,3	1,4 1,5	4,8	7,2	24 33	20.000	17 26	I
	MX-I	human	1,8	1,6	-	-	3,5	20.000	32
	Ll 210	Maus	3,2	3,4	-	-	-	20.000	43	• » »
	P388	Maus	3,2	3,2	-	-	-	36	• * 1 » * » m · *
	Darm 407	human	1.000	1.000	76,0	92,0	32	» ♦ 9 * I I » ■ > » S k t » * ♦ 1 « > J f Λ 9 »
	Girar- di-Herz	human	1.000	1.000	-	-	19
normale Zellen	Chang Leber Vero	human Affe	1.000 630	1.000 640	9,6	8,8	19 52
	MDCK	Hund	550	530	-	-	41

Anmerkung: "-" bedeutet, das Experiment wurde nicht durchgeführt.

Tabelle 2-3

Tumorzellen

normale

Zellen

Konzentration für 50 % Inhibierung des Viachstums

Zellen- Spezies C3_X3^ftl) ^CBX3*^^; Mitomycin C name Einheit/ml Sinheit/ml /ug/ml

E Ep-2

numan

human

human

human

Maus

Maus

1,5

1,3

ι,ε

3,1

3,4

1,0 1,7 1,4 1,7 2,9 3,5

Darm
407

Girar-

di-Herz

Chang
Leber

Vero
MDCK

Primär
Kultur

Ratten
Leber

human
human
human

Affe
Hund
Ratte

1.000

1.000
1.000

620
510
870

1.000 1.000 1.000

580 540 910

35 18 25 30 44 37

35 44 21

50

44 61

CO CO CD

cn ro

CD

cn
to

C (C

ί ί *

Anmerkung: *1) CB_X3 (erhalten in Beispiel 26)

Tabelle 2-4

Kon2entration für 50 % Inhibierung des Wachstums

	Zellen name	Spezies	A*D Einheit/ml	B*2) Einheit/ml	C*3) Einheit/ml
	KB	human	1,0	1,0	1,0
Tumor zellen	HEp-2 HEL	human human	1,5 1,6	1,4 1,7	1,6 1,9
	MX-I	human	1,8	1,7	1,6
	L1210	Maus	3,0	3,2	3,0
	P388	Maus	3,1	3,4	3,2
	Darm 407	human	1.000	1.000	1.000
	Girar- di-Herz	human	1.000	1.000	1.000
norinale Zellen	Chang Leber	human	1.000	1.000	1.000
	Vero	Affe	610	590	580
	MDCK	Hund	580	610	600

Anmerkung: *1) Gemisch von CBx und CBjq *2) Gemisch von CB_x, CBxj,. CB_X2 und CB_X3 *3) Gemisch von CB_X2 und CB_X3

OJ OJ O

cn

CO

u>

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, schädigt CB ähnlich dem CBF die Tumorzellen selektiv ohne irgendeine nennenswerte Schädigung der Normalzellen. Die Intensität der cytotoxischen

Wirkung auf die jeweiligen Tumore war zwischen CB und CBF verschieden. Im Gegensatz dazu zeigten sowohl - und ß-Lymphotoxin und Mitomycin C eine nicht selektive Cytotoxizität gegenüber Normalzellen und Tumorzellen.

Experiment 2

Einfluss auf Mäuse, in welche Sarcoma 180 or Ehrlich-Tumor transplantiert wurde.

Männliche Mäuse (ddY-Stamm) mit einem Gewicht von 25 bis 30 g wurden intraperitoneal einer Transplantation mit 3 χ 10 ^ Zellen Sarcoma 180 oder Ehrlich-Aszites-Tumor pro Tier unterzogen und die Uberlebenstage

20 beobachtet. CB,, (erhalten in Beispiel 6), CB_v1

Λ Al

(erhalten in Beispiel 15), CB^ (erhalten in Beispiel 20) und CB_X3 (erhalten in Beispiel 26 oder 29) wurden intravenös an zwei Gruppen von 5 Mäusen täglich, einen Tag nach der Transplantation ab bis

zum Tode, verabreicht. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in % der durchschnittlichen Überlebenstage im Vergleich zur Kontrollgruppe und werden in den Tabellen 3-1 bis 3-3 wiedergegeben.

Tabelle 3-1

Tumor

Testsubstanz

tägliche Dosis

durchschnittl. Uberlebenstage

Mau s-	CBx	1,2	Einh./kg	111
Sarcoma		4	Einh./kg	131
180		12	Einh./kg	164
	Mitomycin C	0,5	mg/kg	140
	Cyclophosphamid	20	mg/kg	172
Ehrlich-	CBx	1.2	Einh./kg	141
Aszites-		4	Einh./kg	159
Tumor		12	Einh./kg	187
	Mitomycin C	0,5	mg/kg	168
	Cyclophosphamid	20	mg/kg	212

Tabelle 3-2

Tumor

Test substanz

tägliche Dosis

durchschnittl. Überlebenstage

Maus-	CBX1	1	Einh./kg	113
Sarcoma		3	Einh./kg	133
180		10	Einh./kg	160
	CBX2	1	Einh./kg	110
		3	Einh./kg	135
		10	Einh./kg	159
	Mitomycin C	o,	5 mg/kg	138
	Cyclophosphamid	20	mg/kg	170
Ehrlich-	CBX1	1	Einh./kg	139
Aszitos-		3	Einh./kg	164
Tumor		10	Einh./kg	187
	CR	1	Einh./kg	135
		3	Einh./kg	161
		10	Einh./kg	189
	Mitomycin C	0,	5 mg/kg	164
	Cyclophosphamid	20	mg/kg	206

Tabelle 3-3

Tumor

Test substanz

tägliche Dosis

durchschnittl. Uberlebenstage

Maus-	CB *1)	1	Einh./kg	110
Sarcoma		3	Einh./kg	129
180		10	Einh./kg	157
	CB 3 *2)	1	Einh./kg	108
		3	Einh./kg	131
		10	Einh./kg	150
	Mitomycin C	o,	5 mg/kg	142
Ehrlich-	CB *1)	1	Einh./kg	139
Aszites-		3	Einh./kg	155
Tumor		10	Einh./kg	181
	GBX3 *2)	1	Einh./kg	132
		3	Einh./kg	157
		10	Einh./kg	179
	Mitomycin C	o,	5 mg/kg	166

Anmerkungen: *1) ΟΒ_χ3 (erhalten in Beispiel 26) *2) CB_x3 (erhalten in Beispiel 29)

- G8 ~

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, besitzt CB eine signifikante Anti-Tumorwirkung sowohl auf Mäuse, denen jeweils Sarcoma 180 und Ehrlich-Tumor transplantiert wurde.

Experiment 3

Einfluss auf die Uberlebenstage von leukämischen Mäusen

10 Männlichen Mäusen vom BDF₁-Stamm mit einem Gewicht

5
von 20 bis 25 g wurden 10 Maus-Leukämie-Ll210-Zellen oder 10 Maus~Leukämie-P388-Zellen pro Tier transplantiert und daraufhin die Uberlebenstage ermittelt. CB_x (erhalten in Beispiel 10), CB_xl (erhalten in Beispiel 16), CB_x2 (erhalten in Beispiel 20) und CBv₃ (erhalten in Beispiel 26 oder 29) wurden intraperitoneal an Gruppen von 5 Mäusen verabreicht und zwar täglich, beginnend einen Tag nach der Transplantation bis zum Tode (für CB_V, CB_v1 und CB_v0)

Λ AJ. λ/

oder einmal an dem auf die Transplantation folgenden Tag (für CB ..) . Die Ergebnisse werden ausgedrückt in

Λ J

% der durchschnittlichen Lebenstaye in bezug auf die Kontrollgruppe; die erhaltenen Daten sind in den Tabellen 4-3 zusammengestellt.
25

Tabelle 4-1

Tumor

Testsubstanz

tägliche Dosis

durchschnittl. Uberlebenstage

Maus-	CBx	0,4 Einh./kg	105
Leukämie-		1,2 Einh./kg	123
L1210		4 Einh./kg	151
	Mitomycin C	0,5 mg/kg	128
	Cyclophosphamid	20 mg/kg	172
Maus	CBx	0,4 Einh./kg	113
Leukämie-		1,2 Einh./kg	128
P388		4 Einh./kg	144
	Mitomycin C	0,5 mg/kg	133
	Cyclophosphamid	20 mg/kg	147

Tabelle 4-2

Tumor	t Testsubstanz	tägliche Dosis	durchschnittl.
			Überlebenstage
Maus-	CBxi	3 Einh./kg	108
Leukämie-		10 Einh./kg	122
L1210		30 Einh./kg	149
	CBX2	1 Einh./kg	110
		3 Einh./kg	121
		10 Einh./kg	151
	Mitomycin C	0,5 mg/kg	136
	Cyclophosphamid	20 mg/kg	149
Maus	CB	1 Einh./kg	110
Leukämie-		3 Einh./kg	126
P3 88		10 Einh./kg	147
	CBX2	0,3 Einh./kg	109
		1 Einh./kg	125
		3 Einh./kg	151
	Mitomycin C	0,5 mg/kg	130
	Cyclophosphamid	20 mg/kg	145

* β

- 71 -

Tabelle 4-3

Tumor	Testsubstanz	tägliche Dosis	durchschnitt!.
			Überlebenstage
Maus-	CB *1)	10 Einh./kg	109
Leukämie-		30 Einh./kg	120
L1210		100 Einh./kg	149
	OR *0 \	10 Einh./kg	111
		30 Einh./kg	121
		100 Einh./kg	146
	Mitomycin C	5,0 mg/kg	132
Maus	CBX3 *1)	10 Einh./kg	122
Leukämie-		30 Einh./kg	145
P388		1OO Einh./kg	176
	CBX3 *2)	10 Einh./kg	120
		30 Einh./kg	14 8
		100 Einh./kg	171
	Mitomycin C	5,0 mg/kg	141

Anmerkung: *l) CB_x3 (erhalten in Beispiel 26) *2) CB_X3 (erhalten in Beispiel 29)

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, besitzt CB eine signifikante Anti-Tumorwirkung auf die mit Tumor befallenen Mäuse, nämlich sowohl auf Maus-Leukämie-L1210 als auch -P388.

• ♦ · · C ·

- 72 -

Experiment 4

Einfluss auf die Uberlebenstage von mit Lungencarcinom befallenen Mäusen:

Männlichen Mäusen vom BDF-,-stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25 g wurden intramuskulär in die rechte Hüfte 2 χ 10 Zellen des Lewis-Lungencarcinorns transplantiert und die Uberlebenstage ermittelt. CB (erhalten in Beispiel 7), ΟΒ_χ1 (erhalten in Beispiel 17), CB_VO (erhalten in Beispiel 22) und CB_V_ (erhalten in Beispiel 26 oder 29) wurden intravenös an Gruppen von 6 Mäusen verabraeicht und zwar täglich, beginnend einen Tag nach der Transplantation bis zum Tode. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in % der durchschnittlichen Überlebenstage in bezug auf die Kont'iollgruppe; die erhaltenen Daten werden in Tabelle 5-1 bis 5-2 wiedergegeben.

Tabelle 5-1

Te nt sub.--: tan z

^CB

30 Mitomycin C

Cyclophosphamid

tägliche Dosis	Einh./kg	durchschnittl.
	Einh./kg	Uberlebenstage
1.2	Einh./kg	104
4	mg/kg	112
12	mg/ kg	146
0,5	121
20	163

Tabelle 5-2

Testsubstanz tägliche Dosis

durchschnittl. Überlebenstage

CB

Xl

CB

X2

Mitomycin C Cyclophosphamid

1	Einh./kg	107
3	Einh./kg	113
10	Einh./kg	145
1	Einh./kg	109
3	Einh./kg	121
10	Einh./kg	143
1	Einh./kg	115
3	Einh./kg	143
10	Einh./kg	157
1	Einh./kg	111
3	Einh./kg	136
10	Einh./kg	159
0,5	mg/kg	120
20	mg/kg	164

Anmerkung: *1) ΟΒ_χ3 (erhalten in Beispiel 26) *2) CB_x3 (erhalten in Beispiel 29)

Experiment 5

Einfluss auf die Überlebenstage von mit Melanom befallenen Mäusen:

In männliche Mäuse vom BDF-j^-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25 g wurden pro Tier subkutan in den Rücken 10 Zellen Maus-Melanom B 16 transplantiert, und die Überlebenstage ermittelt. CB_x (erhalten in Beispiel

10) und CB_VO (erhalten in Beispiel 26 oder 29) wurden intravenös an Gruppen von 7 Mäusen verabreicht, und zwar täglich, beginnend einen Tag nach der Transplantation bis zum Tode. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in % der durchschnittlichen Überlebenstage in bezug auf die Kontrollgruppe; die Daten sind in den Tabellen 6-1 bis 6-2 zusammengestellt.

Tabelle 6-1

20	Test substanz	tägl	iche Dosis	durchschnittl.
				Überlebenstage
25	CBx	1.2	Einh./kg	122
		4	Einh./kg	135
		12	Einh./kg	180
	Mitomycin C	0,5	mg/kg	138
30	Cyclophosphamid	20	mg/kg	158

Tabelle 6-2

Testsubstanz

tägliche Dosis

durchschnittl. Ubeirlebenstage

*2)

Mitomycin C

1 Einh./kg

3 Einh./kg

Einh./kg 1 Einh./kg

3 Einh./kg Einh./kg 0,5 mg/kg

131 178

129 176 140

Anmerkung: *1) ΟΒ_χ3 (erhalten in Beispiel 26) *2) CB_x3 (erhalten in Beispiel 29)

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, besitzt CB einen deutlichen Anti-Tumorefilekt auf die mit Maus-Melanom B16 befallenen Mäuse.

Experiment 6

Einfluss auf die Metastase von Lungenkrebs:

Männlichen Mäusen vom BDF-i-Stamm mit einem Gewicht 30 von 20 bis 30 g (jeweils 6 Tiere in jeder Gruppe)

• # * Mt U i

- 76 -

wurden subkutan in deren Rücken 2 rnm grosse quadratische Segmente Lewis-Lunkenkrebs 'transplantiert. CB_V
(erhalten in Beispiel 6), ^CBxi (erhalten in Beispiel
15), CB_X2 (erhalten in Beispiel 20) und CBP wurden

intravenös einmal täglich, 12 Tage lang, beginnend am 9. Tag nach der Transplantation verabreicht. Am 21.
Tag nach der Transplantation wurde die Masse des Primärtumors isoliert und ausgewogen, und die Anzahl der metastatisierten Knoten in der Lunge nach der Methode von V\iexler, H. (J. Natl. Cancer Institute, Bd. 36, (1966)) ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7-1 und 7-2 zusammengestellt.

Experiment Testsubstanz

Tabelle 7-1

tägl. Dosis Tumor Gewicht Anzahl der metasta·

(g) ' tisierten Knoten in der Lunge

Kontrolle	4 Einheit/kg
CBx	40 Einheit/kg
	20 mg/kg
Cyclophosphainid
Kontrolle	4 Einheit/kg
CBx	40 Einheit/kg
	4 Einheit/kg
CBF	40 Einheit/kg

9,6 + 1,9 29*2 +. 7,3

5,1 + 1,6* 6,8 + 3,2* 3,0 + 0,3** 0,4 + 0,4** 3,0 + 0,7** 0,4 + 0,2**

7,3 ± 0,3 29,2 4· 1,4

4.1 + 1,2* 6,7 + 2,1*

2,3 ± 0,2** 0,5 +_ 0,2**

6,6 +_ 0,6 22,0 + 5,0

4.2 + 0,4* 21,4 + 4,5

CO OJ O CD KJ CD

Tabelle 7-2

Testsubstanz

Kontrolle

tägl. Dosis Einheit/kg

Tumor Gewicht

(g)

Cyclophosphamid

3 30

3 30

30 20 Anzahl der metastatisierten Knoten
in der Lunge

7.8 + 0,5

4.3 ± 1,3*

2.4 +_ 0,3**

4.9 + 1,3* 2,1 +_ 0,5** 6,8 +_ 0,6 4,3 , + 0,5*

3.5 + 0,6**

29,6 + 1

7,3 - 2,0*

0,5 + 0,3**

7,1 + 1,9*

0,7 + 0,3**

23,0 + 5,2

22,4 + 4,4

0,6 + 0,3**

Anmerkung: Die Ergebnisse in den Tabellen sind ausgedrückt als (durchschnittlicher Wert) +_ (Standardfehler) * Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 5 % oder darunter. ** Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 1 % oder darunter.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen deutlich, dass .10 CBv sehr erfolgreich primären Lungenkrebs und dessen Metastasen unterdrückt,, wohingegen CBF nahezu keine Wirkung auf Lungenmetastasen zeigt.

Experiment 7

Wirkung auf die Induzierung der Differenzierung von Tumorzellen:

Nach der Methode von Bozurni, M. et al (Cancer

Research, Bd. 40, 2919-2924 (1980)) wurden 5 χ 10 akute myelogene Leukämie-Zellen M--1 (erhalten von Dr. Hooto Hozumi, saitama Krebszentrum) in 1 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälber serum und ausserdern Aminosäu-

ren und Vitamine in der doppelten Menge als üblich

enthielt, suspendiert; dazu wurde jeweils die Testsubstanz gegeben, und bei 37°C 48 h in einer 5% CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurden die Zellen in einem Medium, welches 0,2 % Polystyrol-Latex-

teilchen (dow Chemical Co.) enthielt, resuspendiert, bei 37°C 4 h lang inkubiert und dann die Anzahl der Zellen, welche die Partikel phagozytosierten, und

- 80 -

die Anzahl der Gesamtzellen unter dem Lichtmikroskop bestimmt und die Differenzierungsrate aus dem Verhältnis dieser Zellen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8

Testsubstanz ' Konzentration Differenzierungsrate " (%)

Kontrolle 1

Cß_x 0,004 Einh./rnl 8

0,04 Einh./ml 11

0,4 Einh./ml 18

Dexamethason 20,0 ng/ml 25

CBy zeigte eine Wirkung zur Induzierung der Diffe renzierung.

ⁿ *■

25 Pyrogentest:

Nach der in "Japanese Pharmacopeia" beschriebenen Methode wurde CB_V (erhalten in Beispiel 3) intravenös an weisse Kaninchen in einer Dosis von 100 Einheiten pro Tier verabreicht. Die Ergebnisse der Messungen der Rekl al temperatur bis zu 3 h danach unter Verwendung eines Thermometers vom Typ eines Thermoelementes, sind in Tabelle 9 zusammengestellt:

η s ·

- 81 -

Tabelle 9

Kanin- Gew. Rektal-Temperatur vor und nach CB_x-Injektion chen (kg) (⁰C)

	2	,0	Vor	Inj.	1	h später	2	h später	3 h	später
A	2	,0	38,	90	38	,70	38	,80	38,	80
B	2	,0	38,	90	38	,90	38	,97	38,	97
C		39,	25	39	,25	39	.22	39,	30

Experiment 9

Einfluss auf an Brustkrebs erkrankten Mäusen:

Nacktrnausen vom BALB/C-Stamrn mit einen! Gewicht von 20 bis 25 g (6 Tiere in jeder Gruppe) wurden in den Rücken 2 mm grosse quadratische Segmente an menschlichem Brustkrebs MX-I subkutan trnnsplantiert. CB_Xo (erhalten in Beispiel 26 oder 2S) v;urde intravenös 14 Tage lang, beginnend am 14. Tag nach der Transplantation, an die Mäuse verabreicht, /^m 15. Tag nach der ersten Verabreichung wurde das Volumen des Primärtumors gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengestellt:

Tabelle

Testsubstanz

tägliche Dosis Tumorvolumen

(cm³)

Kontrolle

CB

_X3

*2)

Mitomycin C

1 Einh./kg 3 Einh./kg 10 Einh./kg 1 Einh./kg 3 Einh./kg

10 Einh./kg 0,5 mg/kg

9,7 + 2,2 7,6 + 1,3

4,3 + 1,3*

2.2 + 0,9**

7.3 + 1,2 4,6 + 1,4* 2,0 + 1,0**

4.4 + 1,1*

Anmerkungj

*1) (Durchschnittlicher Viert) + (Standardfehler)

*2) CB_X3, erhalten in Beispiel 26,

*3) CB ₃, erhalten in Beispiel 29,

* ßtai ί at i>^-!ch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikarizwert von 5 % oder darunter.

** statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 1 % odc-r darunter.

Experiment 10

30 Einfluss auf Methylcholanthren-induzierten Tumor:

3-Methylcholanthren, aufgelöst· in Olivenöl, wurde subkutan in den seitlichen Abdomen von Mäusen (ddY-Stamm) mit einem Gewicht von 20 bis 25 g (8 Tiere in jeder

Gruppe) in einer Dosis von 0,5 mg ρκο Maus injiziert. ^CBX3 (^{ernalfcen in} Beispiel 26 oder 29) wurde den Mäusen einmal täglich, 21 Tage lang, beginnend ca. am 60. Tag nach der 3-Methylcholanthren-lnjektion verab-5 reicht. Am 21. Tag nach der ersten CB_x^-Verabreichung wurde das Volumen des Tumors gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengestellt.

Tabelle 11 '

Testsubstanz Tägliche Dosis Tumorvolumen *1)

(cm³)

Kontrolle 10,5 + 2,3

CB_X3 *2) 1 Einh./kg 8,5 + 1,4

3 Einz./kg 5,4 + 1,4*

10 Einh./kg 2.5 ± 0,7**

CB_X3 *3) 1 Einh./kg 8,9 + 1,5

' 3 Einh./kg 5,1 ± 1,3*

10 Einh./kg 2,2 + 0,8**

Mitomycin C 0,5 rng/kg 6,6 +_ 1,3*

Anmerkung:

*1) (Durchschnittlicher Viert) + (Standardfehler) *2) CB_X3, erhalten in Beispiel 26, *3) GB_X3, erhalten in Beispiel 29,

30 * statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 5 % oder darunter, ** statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 1 % oder darunter.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen deutlich, dass ^CBX3 ^e s i 121.

CB- eine Antitumoirwirkung auf spontanen Tumor be-

Experiment 11 Toxizitätstest (Einzelverabreichung)

Männlichen Mäusen vom BDF., -Stamm mit einem Gewicht von 20-25 g (10 Tiere in jeder Gruppe) wurde intravenös CB verabreicht und die Anzahl der toten Tiere im Verlaufe von 7 Tagen ermittelt. Es zeigte sich, daß sämtliche der 10 Tiere überlebten, ohne daß sie irgendwelche Veränderung im Körpergewicht und im Allgemeinzustand zeigten, selbst wenn 10.000 Einheiten/kg an CBy, CB..- oder ^CBx2' °<äex' 100.000 Einheiten/kg an CB_x^ verabreicht wurden.

Experiment 12 Toxizitätstest (kontinuierliche Verabreichung über 30 Tage)

Männlichen Mäusen vom BDF₁-Stamm mit einem Gewicht von -20-25 g (10 Tiere in jeder Gruppe) wurde intravenös CB über 30 Tage verabreicht; die Anzahl der toten Tiere, die Veränderung des Körpergewichts und des Ällgemeinzustandes wurden beobachtet. Dcis Körx^ergev/i cht wurde zwischen 9.00 Uhr und 10.00 Uhr vormittags bestimmt, die Beobachtung des Allgemeinzustandes (general conditions) wurde am 10., 20. und 30. Tag nach der Methode von Arvieri (Science, Band 36, 123 (1962)) vorgenornmeai. Es zeigte sich, daß in diesen 30 Tagen bei Verabreichung von 1.000 Einheiteri/kg/Tag an CB_Y, CB_V1 oder CB,_r„, oder 10.000 Einheiten/kg/Tag an CB ~ kein totes Tier vorgefunden wurde, und die Kurve der Gewichtszunahme mehr oder weniger die gleiche war, wie für die Kontrollgruppe. Außerdem wurde der Allgemeinzustand als normal, ebenso wie in der Kontrollgruppe, festgestellt.

Die vorstehenden Experimente zeigen,daß CB selektiv das Wachstum der Tumorzellen unterdrückt, und daß es nicht 35

* V

4 * ♦ ♦

- 86 -

nur deutlich die Krebsmetastase unterdrückt, sondern sich auch gegen mehrere Tumore als extrem wirksam und in der Anwendung als sehr sicher erweist, selbst bei Dosen, die über der Dosis liegen, bei der die pharmazeutische Wirkung manifest würde- Somit ist CB außerordentlich nützlich zur Therapie verschiedener Tumore, wie Magenkrebs, Lungenkrebs, Hepatom, Colonkrebs, Brustkrebs, Uteruskrebs, Leukämie etc.

CB* kann in Form üblicher Präparationen verabreicht werden, wie z.B. als Injektionen, Augentropfen, Nasentropfen, Inhallierungr-mittel, topischen Präparationen, oralen Präparat! onen, rektalen Präparationen, vaginalen Präparationen etc. Die tägliche therapeutische Dosis an CB für einen Erwächsernen ist aufgrund der hohen Sicherheit nicht besonders beschränkt, liegt jedoch im allgemeinen bei 0,5 bis 500.000 Einheiten, vorzugsweise 0,5 bis 5.000 Einheiten für topischa Apx3likation, 20 bis 100.000 Einheiten für systemische Verabreichung, wie intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion etc., und 50 bis 500.000 Einheiten für die orale Verabreichung; die jeweilige Dosis kann in Abhängigkeit der

AnwenduinjsmethodG oder der Ernsthaftigkeit der Erkrankung in geeigneter Weise angepaßt werden. Die Präparation kann jeweils CB_V, CB ., CB_V„ und CB^.-, allein oder in Kombination miteinander in jedem beliebigen gewünschten Verhältnis enthalten.

CB kann nach üblichen Methoden zu pharmazeutischen Präparationen formuliert werden, wobei pharmazeutisch annehmbare Träger, Basen, Exzipionten, etc. verwendet werden. Vorzu~ ziehen ist eine Verwenduug als orale Präparation, wie z.B. als enterische Präparationen, z.B. Kapseln, Tabletten, Pulver etc., rekale Präparationen, wie Rekalsuppositorien, Injektionen, wie z.B. wässrige Injektionen, rekonstituierbare Präparationen von lyophilisiertem Pulver zur Auflösung in destilliertem Wasser unmittelbar vor der Verwendung zur

Injektion und topische Präparationen, wie Salben, Lotionen etc. Außerdem kann eine Formulierung als Augentropfen, Nasentropfen oder Inhallationsmittel vorgenommen werden.

Beispiele fester Träger und Exzipienten, die sich besonders eignen, umfassen übliche Exzipienten, wie Laktose, Mannit, Maisstärke und Kartoffelstärke, Bindemittel, wie kristalline Cellulose, Cellulosederivate, Gummiarabikum, Maisstärke und Gelatine; Disintegratoren, wie Maisstärke, Kartoffelstärke und Calciumcarbohydiroxymethylcellulose; und Schmiermittel, wie Talk und Magnesiumstearat. Beispiele flüssiger Träger, die besonders geeignet sind, umfassen destilliertes Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung, pflanzliche Öle zur Injektion und Glykole, wie

15 Propylenglykol und Polyethylenglykol.

Im folgenden werden hierzu Beispiele gegeben, die jedoch die Erfindung nicht beschränken sollen.

20 Beispiel 1

1 0
Rumanlymphozyten (2 χ 10 ZeI]en) wurden; in 4.000 ml Sagle--Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37⁰C in einer 5% CO₂, 95 % Lufbatmosphäre kulti-

25 viert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums

gegen 0.01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialyciert, und eine . Fraktion, die mit 40-80 % Ammoniumsulfat ausgesalzt wurde, von diesem Dialysat erhalten. Diese Fraktion wurde erneut gegen den genannten Phosphatpuffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 {Pharmacia Company) unterzogen. Eine Fraktion rn.it einem Molekulargewicht von 12.000 - 17.000 wurde aufgefangen, die als rohe CBy-Fraktion bezeichnet wird, während die vorher eluierte Fraktion als rohe CBF-Fraktion bezeichnet wird. Die rohe

35 CB^-Fraktion wurde an Ulex-europeus-Agglutinin (Maruzen

Oil Co.)-konjugiertem Sephadex adsorbiert, mit 0,01 M Phosx>hatpuffor, der 0,5 M Fucose enthielt, eluiert. Nach Entfernen der Fucose durch Dialyse wurde CB_V erneut an Ulex europeus-Agglutinin-.konjugiertem Sephadex adsorbiert, worauf sich eine Elution mittels der Gradientenmethode unter Verwendung von Phosphatpuffer (pH 7,2) anschloß. Dabei wurde gereinigtes CB_V eluiert. Im Gesamten wurden

0,02 mg CB_V erhalten. Die Gesamtaktivität des erhaltenen x

CB betrug 150 Einheiten, bestimmt durch die vorstehend an gegebene Methode. Somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB 7.500 Einheiten/mg.

Rinder-Lymphozyten (2 χ 10 Zellen) wurden in 1.000 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und Ab h bei 37°C in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren gemäß Beispiel 1 zur Reinigung von CB unterworfen, wobei 0,01 mg CB erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_V betrug 20 Einheiten, somit betrug die spezifische Aktivität das gereinigten CB_V

2.000 Einheiten/mg.

Beispiel 3

Maus-Lamphozyten (5 χ 10 Zellen) wurden in 5.000 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37⁰C in einer 5% CO₂, 95% Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren gemäß Beispiel T zur Reinigung von CB_V unterworfen, und 0,12 mg CB_V erhalten. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB betrug 400 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB_V 3.333 Einheiten/mg.

35

Beispiel 4

BALL-1-Zellen (menschliche Zellinie, 1 χ 10 Zellen), die vorkultiviert waren, wurden in2.000 ml Eagle-Medium,

welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37⁰C in einer 5% CO₂, 95 % Lüftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB„ unterworfen, wobei 0,7 mg CB_V erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_V betrug 4.000 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB 5.714 Einheiten/mg.

Beispiel 5

Plow 7.000-Zellen (menschliche Fibroblastenlinie, 3 χ 10⁹ Zellen), die durch Zellkultur gezüchtet worden waren, wurden in 600 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälbersertim enthielt, suspendiert und 48 h bei 37°C in einer 5% COj/ 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB_V unterworfen, wobei 0,005 mer CB,, erhalten wurden.

Λ 'A

Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_V war 10 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB_x 2.000 Einheiten/mg.
25

Beispiel 6

Menschliche Lymphozyten (2 χ 10 Zellen) wurden in 4.000 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phytohämagglutinin (EUfco Co.) bis zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml, 48 h bei 37⁰C in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB_V unterzogen, wobei 1,0 mg CB., erhalten

X Λ

wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_V war 10.000

Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität dos gc~

reinigten CB_V 10.000 Einheiten/mg. Beispiel 7

Flow 7.000-Zellen (menschliche Pxbroblastenlinie, 3 χ 10 Zellen) wurden in 600 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälber serum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phytohämagglutinin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml, 48 h bei 37°C in einer 5% CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB unterzogen, wobei 60 \ιη CB_v erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_V war 480 Einheiten; somit betrug die spezifi

sehe Aktivität des gereinigten CB.. 8.000 Einheiten/mg.

9 TALL-1 -Zellen (menschliche Zellinie, 9 χ 10 ) ,w.elche durch Ze. 1.1 Kultur gezüchtet worden waren, wurden in 800 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert; nach Zugabe von Phytohämagglutinin bis zu einer Endkonzentration von 50 |j.g/ml wurden diese 48 h bei 37⁰C in einer 5 % CO-,, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB„ unterzogen, wobei 0,8 mg CB_V erhalten wurden. Die Gesautaktivität des erhaltenen CB_V war 7,500 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB_V 9.375 Einheiten /mg.

Beispio 1__9_

Ausgewachsene Mäuse wurden durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen von ca. 4 00 REM vorbehandelt, um deren Immunantwort zu unterdrücken, und dann .dieselben subkutan TALL-1-en (menschlichen Ursprungs) transplantiert. Daraufhin

wurden die Mäuse 3 Wochen lang gefüttert. Die Masse des subkutan gebildeten Tumors, der ca. 10 g wog, wurde isoliert, fein vermählen und in physiologischer Kochsalzlösung, wel~ ehe Trypsin enthielt, dissoziiert; daraufhin wurden die dispergierten Zellen gesammelt. Diese Zellen wurden entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt, um CB_V zu erhalten. Die Ausbeute an CB_V betrug ca. 190 Einheiten pro Maus.

10 Beispiel 10

BALL-1-Zellen (menschliche Zellinie, 9 χ 10 Zellen) wurden in 1.800 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von 9 χ 10 pfu (Plaque-bildende Einhexten) von Sendai-Virus (HVJ) 48 h bei 37⁰C in einer 5 % GO,, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB_V unterzogen, wobei 720 |j.g CB_V crhalten wurden. Die Gesamt aktivität des erhaltenen CB„ war

20 7.920 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB„ 11.000 Kinheiten/mg.

Das vorstehend erhaltene CB wurde in physiologischer Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst, und die optische Rotation der Lösung bei 598 mn (Na-D-Linie) bei 26,5-28,5°C mit Hilfe ein,:.'.3 Polari;aeters (Nihon Bun3?o DIP-18T) unter Verwendung einer Mikrozelle mit 10 mm Lichtweg bestimmt. Die optische Rotation von physiologischer Kochsalelösung als Kontrolle wurde dabei mit 0 angenommen.

30 CB zeigte Levo-Rotation.

CB_x (10 p.g) ,welches wie vorstehend erhalten wurde, wurde zu einer Mikrotablette mit Kaliumbromidpulver verarbeitet, um das IR-Spektrum von CB_V aufzunehmen. Die integrierte Mes~ sung (GOmal) wurde mittels Fourier-Transform-Tnfrarot-Sxjektrometer fX-6201 (Analect Instruments Co.) ausgeführt. Das Ergebnis wird in Fig. 1 wiedergegeben.

* H Hf **··»■*

Beispiel 11

In ausgewachsene Nacktmäuse wurden subkutan BALL-1-Zellen (menschlichen Ursprungs) transplantiert, und die Mäuse 3 Wochen lang gefüttert. Die sich subkutan bildende Tumormasse (Gewicht jeweils ca. 10 g) wurde isoliert, fein vermählen und dann in physiologischer Kochsalzlösung, welche Trypsin enthielt, dissoziiert; daraufhin wurden die dispergierten Zellen gesammelt. Diese Zellen wurden mit Eagle-Medium, welches 5 % Humanserum enthielt, ge-

9 waschen; im folgenden wurden 2 χ 10 Zellen davon in 2.000 ml denselben Mediums suspendiert und 48 h bei 37⁰C in einer 5 % CCu, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 unterzogen, um CB zu erhalten. Die Ausbeute an CB_V betrug ca. 200 Einheiten pro Nacktmaus.

JBL-Zellen (menschliche Zellinie) wurden in physiologischer* Kochsalzlösung suspendiert; die Suspension wurde daraufhin in einer zylindrischen Diffusionskammer aus Plastik mit einem Fassungsvermögen von ca. 10 ml und ausgestattet mit einem Membranfilter mit einer .Porengröße VUi) ca. 0,5 Mikron, plaziert. Dii-se Kammer wurde in die Periton^alhöhle einer ausgewachsene·: Ratte eingesetzt. Die Ratte wurde 4 Wochen lang gefüttert, dann wurde die Kam* mer aus derselben entfernt.

Die Zellkonzentration der auf diese Weise erhaltenen Human-

q
Zellen wurde zu ca. 5x10 Zellen pro ml ermittelt; dies

3
stellt ca, die 10 -fache Menge oder mehr dar, wie sie

durch Kultivierung in vitro in einem Nährstoffmedium in einer 5% CO₂/ 95 % Luftatmosphäre erhalten wird. 35

33M2S7

1 O

Insgesamt wurden 1 χ 10 JBL~Zellen, die nach der vorstehenden Methode erhalten wurden,in 4.000 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37°C in einer 5 % CO₀, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 unterzogen, um CB zu erhalten. Die Ausbeute an CEL betrug ca. 350 Einheiten pro Ratte.

Beispiel 13

10 -

In. ausgewachsene Nacktmäuse wurden subkutan BALL-1-Zellen (menschlichen Ursprungs) transplantiert; die Mäuse wurden daraufhin 5 Wochen lang gefüttert. Im folgenden wurde jede Maus intraperitoneal mit 1 mg Phytohämagglotinin in-•15 jiziert, und 24 h nach der Injektion getötet; der Aszite.s wurde gesammelt. Der Aszites wurde bei 4⁰C und 1.000 g zentrifugiert; der erhaltene Überstand wurde gegen physiologische Kolzsalzlösung, welche 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) enthielt, 15 h lang dialysiert. Die Lösung wurde im weiteren einer Ultrafiltration mit einem Membranfilter unterzogen und das Filtrat konzentriert, wobei eine CB -haltige Lösung erhalten wurde. Die CB -Menge betrug ca. 800 0 Einheiten pro Nacktmaus.

25 Beispiel 14

NALL-1-Zellen (menschliche Zellinie) wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und in eine zylindrische Plastik-Diffusions-Kammer mit einem Fassungsvermögen von ca. 10 ml, ausgestattet mit einem Membranfilter einer Porengröße von ca. 0,5 Mikron, gegossen; diese Kammer wurde in die Peritonealhöhle einer ausgewachsenen Ratte eingesetzt. Diese Ratte wurde 4 Wochen lang gefüttert; dann wurde die Kammer entfernt. Die auf diese Weise gezüchteten Zellen wurden mit Eagle-Medium, welches 5 % Human-Serum enthielt, gewaschen und in dem gleichen Medium bei einer

- 94 -

Zellkonzentration von ca. 5x10 Zellen pro ml resuspendiert. Der Suspension wurden ca. 200 μg/ml Phytohämagglutinin zugegeben; das Gemisch wurde 2 Tage lang bei 37⁰C inkubiert, um die Produktion von CB.. zu induzieren. Das auf diese Weise produzierte CB_V wurde - wie im Beispiel 1 beschrieben - gereinigt und konzentriert, und im weiteren lyophilisiert, um ein CB-^-Pulver zu erhalten. Die Ausbeute an CB_V betrug ca. 15.000 Einheiten pro Ratte.

Beispiel 15

Nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurden menschliche Lymphozyten kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um eine gereinigte Fraktion mit einem Molekulargewicht von 70.000 bis 90.000 zu erhalten. Diese Fraktion wurde als CB₁ bezeichnet. Die Gesamtaktivität der 0,1 mg an gereinigtem CB _Λ betrug 5.000 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität

20 des gereinigten CB_vi 50.000 Einheiten/mg.

Die optische Roi.cit.lon des vorstehend erhaltenen CB_V., vmrde beistimmt, wie dies in Beispiel 10 beschrieben ist. CB_v- zeigte dextro-Rotation.
25

Äußerem wurde eine IR-Messung des erhaltenen CB ₁ durchgeführt, wie dies im Beispiel 10 beschrieben ist. Das Ergebnis ist in Fig. 2 wiedergegeben.

Nach den in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren wurden BALL-I-Zoll on kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um gereinigtes CB^.. zu erhalten. Die Gesarataktivität der 100 μg an gereinigtem CB_V1 betrug 4.200 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität den gereinigten CB_V1 42.000 Einheiten/mg.

Λ I

- 95

Beispiel 17

Nach den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren wurden Flow 7000—Zellen kultiviert, und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um 10 ng an gereinigtem CB^₁ zu erhalten. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB-... war 250 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB_V1 25.000 Einheiten/mg.

10 Beispiel 18

Nach den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden Rinder lymphozyten kultiviert, und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterwerfen, wobei 0,002 mg an gereinigtem CB_vi erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_V1 war 14 Einheiten; somit betrug die spezi-

Λ I

fische Aktivität dos gereinigten CB . 7.000 Einheiten/mg.

Beispiel 19

Nach den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden BALL-1-Zellen kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 0,2 mg gereinigtes CB . erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB . war 2.3G0 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB^, 11.500 Einheit -.x/mg.

Beispiel 20

30 Nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurden

menschliche Lymphosyten kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um eine gereinigte Fraktion mit einem Molekulargewicht von 40.000 - 50.000 zu erhalten. Diese Fraktion wurde als CB_X2 bezeichnet. Die Gesamtaktivität der 0,25 mg an gereinigtem CB_X2 war 5.200 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB.,.,, 20.80 0 Einheiten/mcf.

Λ.Λ.

- 96 -

Beispiel 21

Nach den in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren wurden BäLL-1-Zellen kultiviert und der Oberstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 75 \x.g gereinigtes CB_v0 erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_VO war 10.000 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB „ 133.333 Einheiten/mg.

Die optische Rotation des erhaltenen CB..- wurde bestimmt, wie dies im Beispiel 10 beschrieben ist. CB_x- zeigte dextro-Rotation.

Die IR-Bestimmung des erhaltenen CB ~ wurde, wie im Beispiel 10 beschrieben, ausgeführt. Das Ergebnis ist in Fig. 3 wiedergegeben.

Be isp_iel__2 2_

Nach den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren wurden Flow 7000-Zollen kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 20 μg an gereinigtem CB ₀ erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB.,,. war 500 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivi-

25 tat des gereinigton CB_VO 25.000 Einheiten/mg.

Beispiel 2_3_

Nach den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden Rinder-Lymphozyten kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 0,001 mg an gereinigtem CB_VO erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB , war 40 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB ₂ 40.000 Einheiten/mg. 35

Beispiel 24

Nach den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden BALL-1-Zellen kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 0,25 mg an gereinigtem , ^CBx2 ^erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB 2 war 2.900 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB„₂ 11.600 Einheiten/mg.

10 Beispiel 25

Menschliche Lymphozyten (2 χ 10¹⁰ Zellen) ν ,irden in 4000 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phythämagglutinin in einer Konzentration von 50 ug/ml wurde die Suspension 48 h bei 37°C in einer 5% CC>2/ 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert, und eine durch Aussalzung mit 40 bis 80 % Ammoniumsulfat erhaltene. Fraktion aus diesem Dialysat erhalten. Diese Fraktion wurde gegen den genannten Phosphat-puffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G--100 unterworfen, wobei eine; Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7.000 - 9.000 erhalten wurde; diese Fraktion wurde als Rohi'raktion CB.,., bezeichnet.

Die Rohfraktion CB wurde an Phythäinagglutin-konjugierter Sephalose adsorbiert, mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), welcher 0,5 M N-Acetyl-D-galactosamin enthielt, eluiert. Nach Entfernen des N-Aeetyl-D-galacLoaeunins durch Dialyse wurde die erhaltene Lösung auf Carboxymethylcellulose, welche mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4) equilibiert war, aufgebracht, im folgenden mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4), welcher 0,5 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Auf diese Weise wurden 0,1 mg CB - erhalten. Die Gesamt-aktivität

35 des erhaltenen CB_x^ betrug 5.000 Einheiten.

Beispiel 26

Neugeborene Hamster wurden einer Vorbehandlung durch Injektion von Antiserum, welches aus Kaninchen nach einem üblichen Verfahren gewonnen wurde, unterzogen, um deren Immunantwort so weit wie möglich zu reduzieren. Daraufhin wurden in dieselben BALL-1-Zellen subkutan transplantiert; die Hamster wurden dann 3 Wochen lang gefüttert. Die subkutan gebildete Tumormasse, die ca. 15 j wog, wurde isoliert, feinvermahlen und in physiologischer Kochsalzlösung dissoziiert. Nach dem Waschen dieser Zellen mit Serum-

11
freiem Eagle-Medium wurden 1x10 Zellen in 150 1 Eagle-Medi\:m, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von 9 χ 10 pfu Sendai-Virus (HVJ) 48 h bei 37⁰C in einer 5 % CO₀, 95 % Luftatmosphäre kultiviert.

Der überstand des Kulturmediums wurde gegen 0.01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert und eine bei 40 - 80 % Ammoniumsulfat ausgesalzte Fraktion aus diesem Dialysat erhalten. Diefie Fraktion wurde wiederum gegen den genannten Puffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadcx C-100 unterzogen, wobei eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 9000 erhalten wurde, die als CB_vO-Rohfrakt:ion bezeichnet wird. Diese Rohfraktion CB..-, wurde an Concanavalin A--konjugierter Sephalose adsorbiert, danr. mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), welcher 0,5 Mcx-Methyl-D-mannosid enthielt, eluiert. Nach Entfernen deij α Mathyl-D-manr.osids durch Dialyse wuDrde die Lösung auf Carboxymethylcellnloöe, welche mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,0) equilibriert war«aufgebracht; daran schloß sich eine Elulion mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,8) an. Die

Gesamtaktivität der erhaltenen 0,2 mg CB„₃ war 12.000 Einheiten; der isoelektrische Punkt lag bei 6,3 bis 7.8.

- 99 -

Beispiel· 27

1 O

Fiow 7000-Zellen (3 χ 10 Zellen) wurden in 1,0 1 Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phythämagglutinin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug/ml 48 h bei 37°C in einer 5 % CO₂ 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Der Überstand des Kulturmediums wurde den Verfahren von Beispiel 26 zur Reinigung von CB _. unterworfen, wobei 0,1 mg des gereinigten £b„₃ erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB_X3 betrug 3.100 Einheiten.

Beispiel 28

Rinder-Lymphozyten (5 χ 10 Zellen) wurden in 10 1 Eagle Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und 48 h bei 37⁰C in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 26 zur Reinigung von ^CBx3 unterworfen, wobei 0,1 mg des gereinigten CB_x-, erhalten wurden. Die Gesamtaktivitüt des erhaltenen CB .-. betrug 1.700 Einheiten.

Beispiel 29

BALL-1-Zellen (5 ;< 10¹¹ Zellen), die durch Zellkultur gezüchtet worden waren, wurden in 100 1 Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37°C in einer 5 % CO₂, 95 % Luf tattnosphäre kultiviert.

Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums gegen 0,01 M Phosphatpufler (pH 7,2) diaiysiert und eine bei 40-80 % Ammoniumsulfat aufgesalzte Fraktion erhalten. Diese Fraktion wurde wiederum gegen den genannten Phosphatpuffer diaiysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-I00 unterworfen, wobei eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7000-9000 erhalten wurde. Diese Fraktion wurde an Phytohäiaagglutinin-konjugi^rter Sephalose

adsorbiert, dann mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), welcher 0,5 M N-Acetyl-D-galactosamin enthielt, eluiert. Nach Entfernen des N-Acetyl-D-galactosamins durch Dialyse wurde die dialysierte Lösung auf Carboxymethylcellulose,welche mit 0,05 M Tris-Puffer (pH 8,0) equilibriert war, aufgetragen; daran schloß sich eine Elution mit 0,05 M Tris-Puffer (pH 8,0), welcher 0,5 M Natriumchlorid enthielt, an. Auf diese Weise wurden 0,1 mg an gereinigtem CB_VQ erhalten.

Die Gesamtaktivität an CB_V,, betrug 8.200 Einheiten. Der .

Aj

10 isoelektrische Punkt war 8,0-9,2.

Die optische Dotation des erhaltenen CB_X3 wurde, wie im Beispiel 10 beschrieben, bestimmt. CB ₃ zeigte keine optische Rotation.
15

Die IR-Messung des erhaltenen CB_V_. wurde _r wie im Beispiel beschrieben, ausgeführt. Das Ergebnis ist in Fig. 4 wiedergegeh c-i.

20 Beifi^jic'^__'rLp (wässrige Injektionen)

cn

X 100.000 Einheiten

Natriumchlorid · 9 g

destilliertes Wasser zur Injektion bis auf 1000 ml

CB_V und Natriumchlorid wurden ausgewogen und miteinander vermischt, darm in 500 ml destilliertem Wasser zur Injektion aufgelöst, das Gesamtvolumen auf 1000 ml mit destilliertem Wasser zur Injektion aufgefüllt. Diese wässrige Lösung wurde unter Sterilbedingungen, mit Hilfe eines Membranfilters filtriert, und jeweils 2 ml des Pil trat« in sterilisierte Glasbehälter gefüllt und unter Herstellung wässriger Injektionen versiegelt.

Beispiele 31-33

Ähnliche Verfahren, wie dies für Beispiel 30 beschrieben wird, wurden für CB_V1, CB_VO und CB_V_ jeweils zur Hersfcellung wässriger Injektionen durchgeführt.

Beispiel- 34 (lyophilisierte Injektionen)

CB_V 100.000 Einheiten

10 20 % Human-Serum-Albumin 10 ml

Natriumchlorid 9 g

destilliertes Wasser zur Injektion bis auf 1000 ml

CB_V und Natriumchlorid wurden ausgewogen und miteinander vermischt, dann in einer Lösung aufgelöst, die erhalten wur-.de durch Zugabe einer bestimmten Menge an Humanalbumin zu 500 ml destilliertem Wasser zur Injektion; das Gesamtvolumen wurde mit destilliertem Wasser zur Injektion auf 1000 ml aufgefüllt. Diese Lösung V7ui.de unter Sterilbedingungen mit einem Membranfilter filtriert, und jeweils 2 ml des Filtrats in sterilisierte Glasbehälter gegeben, lyophilisiert, und unter Herstellung eines lyophilisierten Pulvers zur. Injektion versiegelt.

25 Beispiele 35-37

Ähnliche Verfahren, wie dies für Beispiel 34 beschrieben wird, wurden jeweils für CB_x-, CB „ und CD„₃ zur Herstellung lyophilisierter Pulver zur Injektion durchgeführt. 30

Beispiel 38 (Augentropfen)

CB_V 100.000 Einheiten

Natriumchlorid 5g

35 Chlorobutanol 5g

destilliertes Wasser zur Injektion bis auf 1000 ml

Die vorstehenden Bestandteile wurden aufgewogen und in 950 ml destilliertem Wasser zur Injektion aufgelöst. Das Gesamtvolumen wurde auf 1000 ml aufgefüllt, und die Lösung unter Sterilbedingungen mit Hilfe eines Membranfilters zur Herstellung einer Augentropfen-Präparatiom filtriert.

)ielG 39-41

Ähnliche Verfahren, wie dies in Beispiel 38 beschrieben wird, wurden jeweils für CB . , CB _ ^un(3· ^CB _X3 ^zur Herstellung von Augentropfen-Präparationen durchgeführt.

Be if? ρ IeI 42 (Suppo s i tor ien) 15

CB 100.000 Einheiten

X Polyethylenglykol 1500 250 g

Polyethylenglykol· 4000 ca»750 g

1000 g 20

Die vorstehenden Bestandteile wurden ausgewogen und die ganzp ■".■ Mengen an CB und Polyethylenglykol 1500 und 500 g Polycthylonglykol 400 gründlich miteinander vermischt.; daraufhin wurde das restliche Polyethylenglykol 4000 bis

zu einem Gesamtgewicht von 1000 g, im weiteren gründlich vermischt und zu 5000 mg Rektalsuppositorien nach der SchmelzruGthode aufgearbeitet.

BelspieIe 43-45 30

Ähnliche Verfahren, wie sie in Beispiel 42 beschrieben sind, wurden jeweils für CB _Λ , CB ₀ und CB ₀ zur Herstellung von Rektalsuppositorien durchgeführt.

er·· ··

- 103 Beispiel 46 (Nasentropfen)

CB_V 100.000 Einheiten

Natriumchlorid 5 g

Chlorobutanol 5 g

destilliertes Wasser bis auf 1000 ml

Die vorstehenden Bestandteile wurden ausgewogen und in 950 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die erhaltene ιοί Ο sung wurde auf ein Gesamtvolumen von 1000 ml mit destilliertem Wasser unter Herstellung einer Lösung für Nasentropfen aufgefüllt.

Beispiele 47-49
15

Ähnliche Verfahren, wie dies in Beispiel 46 beschrieben

wird, wurden jeweils für CB₁, ^CBx2 ^im<3- ^CBx^ ^{zur IIorstel}~. lung einer Lösung für Nasentropfen durchgeführt.

Beispiel 50 (enterische, beschichtete Tabletten)

CB„ 1.000.000 Einheiten

Lactose 64 g

Kartoffelstärke ca. 30 g

Polyvinylalkohc1 3 g

ear^i i 3 g

100 g

Die vorstehenden Bestandteile wurden jeweils aufgewogen, die Gesamtmengen an CB_V und Lactose und ca. die halbe Menge an Kartoffelstärke vermischt, dann die restliche Kartof felstärke zu dem Gemisch zugegeben bis z:u einem Gesamtgewicht von 94 g, und das Gemisch bis zur Homogenität

vermischt. Zu dem erhaltenen Gemisch wurde eine wässrige 35

- 104 -

Polyvinylalkohollösung zugegeben und Granalien mit Hilfe der Naß~Pelletisierungs-Methode hergestellt. Die Granalien wurden getrocknet, mit Magnesiumsteairat vermischt und zu 200 mg Tabletten komprimiert. Die Tabletten wurden mit Methylcellulor-ephthalat unter Herstellung eines enterischen Dragees beschichtet.

Be3 spiele 51-53

Ähnliche Verfahren, wie dies in Beispiel 50 beschrieben wird, wurden jeweils für CB ., CB _ und CB _ unter Herstellung enter■' eher beschichteter Tabletten durchgeführt.

Beispiel 54 (Salbe) 15

CD_y 100.000 Einheiten

flüssiges Paraffin 10 g

Vaseline ca. 1.000 g

1. 000 g Dio vorstehenden Bestandteile wurden jeweils ausgewogen, dann wurdvi CB_v mit dem flüssigen Paraffin gründlich durchgeknoteL, 500 g Vaseline zugegeben und wiederum gründlich verr.:ischL. Zu dem Gemisch wurde allmählich die restliche _, Vascilino bis zu einem Gesamtgewicht von 1000 g zugegeben, und daL' Gemisch unter Herstellung einer Salbe gründlich veJL mi£■ c¹!¹"..

ähnliche Verfuhren, wie dies in Beispiel 54 beschrieben wird, wurden jeweils für CB_x ., CB ~ und CB ₃ unter Herstel lung einor Salbe durchgeführt.

Leerseite

Claims (1)

1. 38 163 m/fg

   Mochida Chemical Co., Tokyo / Japan

   Neue Glykoproteine, Verfahren zu deren Hernteilung und therapeutische Mittel, die solche Glykoproteine enthalten, gegen Tumore

   Patentansprüche

   1. Glycoprotein (CB) in im wesentlichen gereinigter Form, welches von Zellen eines warmblütigen Lebewesens bzw» Tieres gebildet wird, eine Antitumorwirkung besitzt und die folgenden Eigenschaften aufweist: 5

   a) Molekulargewicht: im Bereich von 7.000 bis 90.000, bestimmt durch Sephadex-Gel-Filtration oder SDS-GeI-Elektrophorese;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsaure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptopnanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und I.tfnl ichkeit: weicsea Pulver, löi.:lic:h in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuf~ fer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 45 %, wobei 6 bis 28 % des Gesamtzuckers Hexosen, 1 bis

   11 % Hexosamine und 1 bis 6 % Sialinsäuren (sialic acid) darstellen;
   5

   e) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über

   3 h oder länger; und 10

   f) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen *"*' ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

   2. Glykoprotein (CB_x) in im wesentlichen gereinigter Form gemäss Anspruch 1, das eine Antitumorwirkung besitzt und die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 12.000 bis 17.000;

   20 b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der

   Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reation und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 27 bis

   33 %, wobei 17 bis 20 % des Gesamtzuckers Hexosen, bis 7 % Hexosamine und 5 bis 6 % Sialinsäuren darstellen;
   5

   e) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder langer und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3h oder langer;

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen, ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen; und

   20 i) Differenzierung: es induziert eine Differenzierung von Tumorzellen.

   3. Glycoprotein (CB_x-,) in im wesentlichen gereinigter Form gemäss Anspruch 1, das eine Antitumorwir-25 kung besitzt und die folgenden Eigenschaften aufweist;

   a) Molekulargewicht: 70.000 bis 90.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit

   Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-

   10 form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 35 bis

   45 %, wobei 23 bis 28 % des Gesaratzuckers als Hexosen, 8 bis 11 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;

   e) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2;

   f) Abaorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder langer und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über 3 h oder langer; und

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

   4. Glykoprotein (CB^₂) in im wesentlichen gereinigter Form gemäss Anspruch 1, welches eine Antitumorwirkung besitzt und die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 30 bis

   37 %, wobei 20 bis 23 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 6 bis 8 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;

   e) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an ülex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) ;

   g) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4⁰C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 6Ü°C über 3 h oder länger; und

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Beschädigung normaler Zellen. 35

   5. Glykopicotein (0Β_χ3) in einer im wesentlichen gereinigten Form gemäss Anspruch l_f das eine Antitumorwirkung besitzt und die folgenden Eigenschaften aufweist:
   5

   a) Molekulargewicht: 7.000 bis 9.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwe-

   15 felsäure-Reaktion als Nachweis auf zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-

   20 form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 15 %, wobei 6,bis 10 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 1 bis 2 % als Hexosamine und 1 bis 3 % als Sialinsäuren

   25 vorliegen;

   e) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Carboxymethylcellulose bei Ionenaustausch-Chromatografie in 0,05 M Phosphatpuffe (pH 6,4) unter Verwendung von Carboxy-

   30 methylcellulose;

   f) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C über 24 h oder langer, und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder langer;
   5

   g) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen; und

   h) die Aminosäuresequenz des N-terminalen Endes des Proteinanteils ist Alanin-Alanin-.

   6. Glykoproteine gemäss Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass diese jeweils die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebenen

   15 Eigenschaften aufweisen und erhältlich sind durch Züchten von Ursprungszellen, die von warmblütigen Lebewesen stammen, Extraktion und Isolierung einer im wesentlichen gereinigten Form dieser Glykoproteine aus diesen Ursprungszellen oder einem überstand

   derselben unter Anwendung einer Kombination von an sich bekannten Reinigungsverfahren.

   7. Verfahren zur Herstellung bzw. Gewinnung eines Glykoproteins (CB), welches eine Antitumorwirkung be-

   sitzt, gekennzeichnet durch das

   Züchten von Zellen (Ursprungszellen), welche dieses Glykoprotein enthalten und von warmblütigen Lebewesen bzw. Tieren stammen, und Extraktion einer im wesentlichen gereinigten Form eines Glykoproteins aus die-

   30 sen Ursprungszellen oder einem kultivierten überstand derselben, wobei das Glykoprotein folgende Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: im Bereich von 7.000 bis 90.000, bestimmt durch sephadex-Gel-Filtration oder SDS-GeI-Elektrophorese;

   5 _b, Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der

   _Lowry-Reaktion als Nachweis a_Uf Proteine, eine Farbun, bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäu-

   re-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der lnaolech.efel.Sure-Re.ktlon und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich „ in «asser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuf-

   fer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloreform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 45 %, wobei 6 bis 28 % des Gesamtzuckers Hessen 1 bis

   11 % Hexosamine und 1 bis 6 % Sialinsauren darstellen.·

   _e) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, PH 7,0 cder PH 11,0 bei 4°C über 24 h oder langer und L ein« wässrigen Lösung von pH 7,0 bie 60°C über

   3 h oder langer; und

   £, cytotonizität: es zerstört selektiv Tumcrzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

   ₈. verfahren gemäss Anspruch «'^^^ _Glykoprotein

   Ä^^au£weist:

   a) Molekulargewicht: 12.000 bis 17.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit

   Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäur_e-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der
   Indolschwefelsäure-Reation und der Tryptophanschwe-

   felsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-

   form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 27 bis

   33 %, wobei 17 bis 20 % des Gesamtzuckers Hexosen, bis 7 % Hexosamine und 5 bis 6 % Sialinsäuren darstellen;

   e) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeüs-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) ;

   g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder länger;

   § · W ·· ti

   -lO-

   li) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen; und

   i) Differenzierung: es induziert eine Differenzierung von Tumorzellen.

   9. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Glykoprotein (CB_V,) die folgenden Eigenschaften aufweist: 10

   a) Molekulargewicht: 70.000 bis 90.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Fär-

   15 bung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit

   Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Antrhonschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwe-

   20 felsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-

   25 form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 35 bis

   45 %, wobei 23 bis 28 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 8 bis 11 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;

   e) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   5 g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder langer und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder langer; und

   10 h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler zellen.

   10. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykoprotein (^CBx2^ ^*^e folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   - 12 -

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 30 bis 37 %, wobei 20 bis 23 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 6 bis 8 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;
   5

   e) isoelektrischer Punkt: 4_f2 bis 7,3;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über 3h oder länger; und

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Beschädigung normaler Zellern.

   11. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Glykoprotein (CB_vo) die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 7.000 bis 9.000; 25

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   - 13 -

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 15 %, wobei 6 bis 10 % des Gesarntzuckers als Hexosen, 1 bis 2 % als Hexosamine und 1 bis 3 % als Sialinsäuren vorliegen;

   10

   e) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Carboxymethylcellulose bei Ionenaustausch-Chromatografie in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4) unter Verwendung von Carboxymethylcellulose;

   15

   f) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger, und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder länger;

   20

   g) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen; und

   h) die Aminosäuresequenz des N-terminalen Endes des Proteinanteils ist Alanin-Alanin-.

   12. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ursprungszellen aus der Gruppe der reticulo-endothelialen ZeI-len, Lymphoblasten, Leukämie-Zellen und Fibroblasten ausgewählt werden, wobei die Ursprungszellen nichtetablierte (non-estabalished) Zellen oder Zellen etablierter (established) Zellinien darstellen.

   13. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass die etablierten Zellinien aus der Gruppe bestehend aus BALL-I, TALL-I, NALL-I, Namalwa, M-7002, B-7101, Flow 7000, JBL, EBV-SA, EBV-VJa, EBV-HO, BALM2 Und CCRF-SB, die ' sämtliche menschlichen Ursprungs sind,' ausgewählt werden.

   14. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch

   gekennzeichnet, dass die etablierten Zellinien aus der Gruppe, bestehend aus Maus-BALB/C 3T3, Maus-Leukämie-Zellen L1210, P388, Maus-Melanom-Klon M-3, Ratten-Tumor LLC-WRC 56 und Hamster-Melanom RPMI 1846, die sämtliche nichtmenschlichen Ursprungs sind und von einem warmblütigen Tier stammen, ausgewählt werden.

   15. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass die nicht-etablierten Zellen aus der Gruppe bestehend aus human-Macrophagen und human-Lymphocyten ausgewählt werden.

   16. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass die nicht-etablierten Zellen aus der Gruppe der Lymphocyten und Macrophagen, die nicht menschlichen Ursprungs sind und von einem warmblütigen Tier stammen, ausgewählt werden.

   17. Verfahren gemäss Anspruch 6, gekennzeichnet durch direkte Transplantation von Zellen einer etablierten Zellinie, die menschlichen

   Ursprungs ist, oder von einem nicht-menschlichen warmblütigen Lebewesen stammt, in den Körper warmblütiger Tiere derselben oder einer unterschiedlichen Species, und Extraktion des genannten Glykoproteins aus den durch die transplantierten Zellen gebildeten Tumoren entweder auf direktem Weg oder nachdem der Tumor kultiviert (cultured) und in vitro weiter gezüchtet (grown) worden ist.

   18. Verfahren gemäss Anspruch 6, gekennzeichnet durch Placieren von Diffusionskammern, die mit Ursprungszellen einer etablierten Zelllinie, die menschlichen Ursprungs ist, oder von einem nicht-menschlichen warmblütigen Lebewesen stammt, inokuliert worden sind, in warmblütigen Tieren, so dass diese einen Zustrom einer Körperflüssigkeit des genannten Tieres erhalten, Züchten der genannten Urspungszellen und Extrahieren des genannten Glykoproteins aus den gezüchteten Ursprungszellen, entweder auf direktem Weg oder nachdem diese kultiviert und im weiteren in vitro gezüchtet worden sind.

   19. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass die Ursprungszel-

   25 len der Einwirkung einer oder mehrerer Induktoren ausgesetzt werden.

   20. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykoproteine

   30 ^CBx' ^CBxi' ^CBx2 ^{und CB}X3 ^{aus den Zellen bzw}·

   einem überstand durch an sich bekannte Reinigungsmethoden, wie Aussalzen, Dialyse, Filtration, zentrifugation, Konzentrierung und Lyophilisation isoliert werden.

   21. Verfahren gemäss Anspruch 6 und 19, dadurch gekennzeichnet , dass die weitere Isolierung durch Adsorption und Elution mittels Ionenaustauschchroinatografie, Gelfiltration, Elektrophorese oder Affinitä'tschromatografie weiter isoliert werden.

   22. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , dass die Isolierung der genannt on Glykoproteine mit. Hilfe von Antikörperoder Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex erfolgt.

   23. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch

   gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren gcinäsü Anspruch 6 hergestellt worden ist.

   24. Glykoprotein mit Antiturnorwirkung, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Ver-

   20 fahren gemäsG Anspruch 7 hergestellt worden ist.

   25. Glykoprotein mit Ant ituinorwir kung , dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 8 hergestellt worden ist.

   2G. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 9 hergestellt worden ist.

   30 27. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch

   gekennzeichnet. , dass os nach dem Verfahren gemäss Anspruch 10 hergestellt worden ist.

   I» * «t t*

   - 17 -

   28. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Ver fahren gemäss Anspruch 11 hergestellt worden ist.

   29. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Ver fahren gemäss Anspruch 12 hergestellt worden ist.

   30. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch

   gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 13 hergestellt worden ist.

   31. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 14 hergestellt worden ist.

   32. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 15 hergestellt worden ist.

   33. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dein Verfahren gemäss Anspruch 16 hergestellt worden ist.

   34. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 17 hergestellt worden ist.

   35. Glykoprotein mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 18 hergestellt worden ist.

   - 18

   36. Therpeutisches Mittel gegen Tumore, dadurch gekennzeichnet , dass es als Wirkstoff eine im Hinblick auf die Antitumorwirkung ausreichende Menge von mindestens einem der Glykoproteine ^CBx' ^CBxi' ^CBx2 ^{und CB}X3 ^entn^^lt' ^{die e}ine Antitumorwirkung besitzen und die folgenden Eigenschaften aufweisen:

   a) Molekulargewicht: im Bereich von 7.000 bis 90.000, bestimmt durch Sephadex-Gel-Filtration oder SDS-GeI-Elektrophorese;

   b) Farbreaktionen: Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf

   20 zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chioro-

   25 form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 45 %, wobei 6 bis 28 % des Gesamtzuckers Hexosen, 1 bis

   11 % Hexosamine und 1 bis 6 % Sialinsäuren darstellen; 30

   e) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über

   3 h oder länger; und
   35

   f) Cytotoxizität: selektive Zerstörung von Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

   37. Mittel gemäss Anspruch 32, dadurch

   5 gekennzeichnet, dass das Glykoprotein (CB_V) die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 12.000 bis 17.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reation und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich 20 in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer', und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 27 bis

   33 %, wobei 17 bis 20 % des Gesamtzuckers Hexosen, bis 7 % Hexosamine und 5 bis 6 % Sialinsäuren darstellen;

   e) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3; 30

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertern Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   - 20 -

   g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder langer und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über 3 h oder langer;
   5

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen; und

   i) Differenzierung: es induziert eine Differenzierung von Tumorzellen.

   38. Mittel gemäss Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet , dass das Glykoprotein (CB_x-,) die folgenden Eigenschaften aufweist: 15

   a) Molekulargewicht: 70.000 bis 90.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der· Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-

   30 form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 35 bis

   45 %, wobei 23 bis 28 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 8 bis 11 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;
   5

   e) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder länger; und

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

   39. Mittel gemäss Anspruch 32, dadurch

   gekennzeichnet , dass das Glykoprotein (CB_X2) ^die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000; 25

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Amino-

   30 säuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäurereaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 30 bis

   37 %, wobei 20 bis 23 % des Gesamtzuckers als Hexosen, .6 bis 8 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;
   10

   e) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphat-

   puffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder langer und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über

   3h oder langer; und·

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumor zellen ohne wesentliche Beschädigung normaler Zellen.

   40. Mittel gemäss Anspruch 32, dadurch

   gekennzeichnet , dass das Glykoprotein (CBy₃) die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 7.000 bis 9.000; 30

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine

   Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei·der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der 5 Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuf-

   10 fer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 15 %, wobei 6 bis 10 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 1 bis

   2 % als Hexosamine und 1 bis 3 % als Sialinsäuren vorliegen;

   e) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Carboxymethylcellulose bei Ionenaustausch-Chromatografie in 0,05 M

   20 Phosphatpuffer (pH 6,4) unter Verwendung von Carboxymethylcellulose;

   f) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder

   25 länger, und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder länger;

   g) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen; und

   h) die Aminosäuresequenz des N-terminalen Endes des Proteinanteils ist Alanin-Alanin-.

   41. Mittel gemäss Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet , dass der Wirkstoff ein Gemisch aus mindestens zwei Substanzen der Gruppe bestehend aus 0Β_χ, CB_x^. CB^₂ ^{und CB}x3 ^{in der}

   5 gewünschten Kombination umfasst.

   42. Therapeutisches Mittel gegen Tumore, welches .einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und als Wirkstoff eine im Hinblick auf die Antitumorwirkung aus-

   ,· 10 reichende Menge von mindestens einem der Glykoproteine CB_x, CB_X1, ΟΒ_χ2 und CB_x3, welche eine Antitumorwirkung besitzen und die nachfolgenden Eigenschaften aufweisen, umfasst:

   a) Molekulargewicht: im Bereich von 7.000 bis 90.000, bestimmt durch Sephadex-Gel-Filtration oder SDS-GeI-Elektrophorese;

   b) Farbreaktionen: Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidb.indungen und Aminosäuren, und Färbung bei der Phenolschwufelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 45 %, wobei 6 bis 28 % des Gesamtzuckers Hexosen, 1 bis 11 % Hexosamine und 1 bis 6 % Sialinsäuren darstellen;

   e) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder länger; und

   f) Cytotoxizität: selektive Schädigung von Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

   43. Mittel gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykoprotein (^cby) äi^Q folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 12.000 bis 17.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reation und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuf-

   . fer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro form;

   ~ 26 -

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 27 bis

   33 %, wobei 17 bis 20 % des Gesamtzuckers Hexosen, bis 7 % Hexosamine und 5 bis 6 % Sialinsäuren darstellen;
   5

   e) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Losung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder länger;

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen; und

   i) Differenzierung: es induziert eine Differenzierung von Tumoirzellen.

   44. Mittel gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , dass daa Glykoprotein (CB_x-.) die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 70.000 bis 90.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit

   Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwe-5 felsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich In Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-

   form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 35 bis

   45 %, wobei 23 bis 28 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 8 bis 11 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sia-15 linsäuren vorliegen;

   e) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder

   länger und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder läng.er; und

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen
   ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.
   30

   45. Mittel gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , dass das Glykoprotein (CB_x2) die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Fär-

   5 bung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit

   Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwe-

   10 felsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloro-

   15 form;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 30 bis

   37 %, wobei 20 bis 23 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 6 bis 8 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;

   e) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

   f) Absorbierbarkeit: absorbierbar an ülex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

   g) Stabilität: stabil in wässriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4°C über 24 h oder länger und

   30 in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 h oder langer; und

   h) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Beschädigung normaler Zellen.

   46. Mittel gemäss Anspruch 38, dadurch

   5 gekennzeichnet, dass das Glykoprotein (CB_X3) die folgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht: 7.000 bis 9.000;

   b) Farbreaktionen: es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren, und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäu-' re-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

   c) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

   d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 15 %, 25· wobei 6 bis 10 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 1 bis 2 % als Hexosamine und 1 bis 3 % als Sialinsäuren vorliegen;

   e) Absorbierbarkeit: absorbierbar an Carboxymethyl-30 cellulose bei Ionenaustausch-Chromatografie in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4) unter Verwendung von Carboxymethylcellulose;

   f) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei A⁰C über 24 h oder länger, und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über 3 h oder länger;

   g) Cytotoxizität: es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen; und

   h) die Aminosäuresequenz des N-terminalen Endes des Proteinanteils ist Alanin-Alanin-.

   47. Mittel gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , dass der VJirkstoff ein Gemisch aus mindestens zwei Substanzen der Gruppe bestehend aus CB_x, CB^₁, 0Β_χ2 und 0Β_χ3 in der

   entsprechenden gewünschten Kombination umfasst.