FR2556220A1 - Nouveau lymphokine et anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine, leur production et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

PRODUCTION D'UN NOUVEAU LYMPHOKINE UTILISABLE CONTRE LES TUMEURS MALIGNES, ET DE SON ANTICORPS SPECIFIQUE MONOCLONAL. CE NOUVEAU LYMPHOKINE DESIGNE PAR LK 1, CARACTERISE PAR DES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DIFFERENTES DE CELLES DES LYMPHOKINES CONNUS, EST OBTENU A PARTIR DE CELLULES HUMAINES CAPABLES DE LE PRODUIRE, COMME LEUCOCYTES OU LYMPHOCYTES, QUE L'ON FAIT PROLIFERER AVANT DE LES SOUMETTRE A L'ACTION D'UN INDUCTEUR DE LK 1 TEL QUE VIRUS, ACIDE NUCLEIQUE, NUCLEOTIDE, MITOGENE, ENDOTOXINE, LIPOPOLYSACCHARIDES, SACCHARIDES ET SIMILAIRES. LK 1 PRESENTE L'AVANTAGE D'ETRE CYTOTOXIQUE SUR LES CELLULES DES TUMEURS MALIGNES, SANS EXERCER D'ACTION NOCIVE SUR LES TISSUS NORMAUX.

Description

La présente invention concerne un nouveau lympho-

kine, sa production et ses utilisations. Elle se rapporte

également à un anticorps monoclonal spécifique de ce lympho-

kine et à sa production.

La lymphotoxine (LT) et le facteur de nécrose des tumeurs (TNF) sont connus comme étant des lymphokines qui

endommagent les cellules tumorales. Par exemple, LT est dé-

crit par Aoki, Ryuichi et coll.,SHIN-MENEKIGAKU SOSHO,

Vol. 6, "Lymphokine" pp. 87-105 <1979), publié par Igaku-

Shoin, Tokyo, In Vitro Method in Cell-mediated Immunity, édité par B.R. Bloom & P.R. Glade, publié par Academic Press, Inc. (1971), et Cellular Immunology, Vol. 38, pp. 388-402 (1978); et TNF est décrit par E.A. Carswell et coil., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 72, N 9, pp3666-3670 (1975), et Lymphokines, Vol. 2, pp. 235-272 "Tumor Necrosis Factor",

édité par E. Pick, publié par Academic Press Inc. (1981).

H. Ohnishi et coll. décrivent un lymphokine glycoprotéini-

que dans le brevet japonais Kokai N 146 293/83.

C. Milstein passe en revue les détails des anticorps mono-

clonaux dans Scientific American, Vol. 243, N 4, pp.56-64

6980).

La présente invention concerne un nouveau lympho-

kine humain, ayant une activité cytotoxique sur les cellu-

les de tumeurs malignes, caractérisé par les propriétés phy-

sicochimiques suivantes, différentes de celles des lympho-

kines connus: a) Poids moléculaire = 20 000 + 2 000 daltons b) Point isoélectrique: pI = 5,6 + 0,2 c) Mobilité électrophorétique: (sur rondelle de PAGE) Rf = 0,29 + 0,02 d) Spectre d'absorption UV: une absorption maximale au

voisinage de 280 nm.

e) Solubilité dans les solvants:

Le produit est soluble dans l'eau, le sérum phy-

siologique et le tampon phosphate, il est peu soluble ou insoluble dans l'oxyde de

diéthyle, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.

f) Réactions colorées: Protéine-positive par le procédé de Lowry ou le procédé "microburette"

Sucre-positive par le procédé phénol-acide sul-

furique ou le procédé anthrone-acide sulfurique.

g) Activités biologiques: Cytotoxique sur cellule L 929 Inhibiteur de croissance sur cellule KB

Pratiquement dénué d'activité Interferon.

h) Stabilité en solution aqueuse: Stable jusqu'à 60 C lorsque mis à incuber à pH 7,2 pendant 30 minutes; Stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et

11, lorsque mis à incuber à 4 C pendant 16 heu-

res. i) Stabilité lors de la cryoconservation:

Stable à -10 C sur une période de 1 mois ou plus.

Cette invention concerne également la production et les uti-

lisations de ce nouveau produit, et se rapporte aussi à un anticorps monoclonal spécifique du nouveau lymphokine et à

sa production.

Ce nouveau lymphokine est ci-après désigné par la simple abréviation LK 1. Il est produit par exposition d'une cellule humaine productrice de ce corps, par exemple les leucocytes humains, les lymphocytes humains et leurs lignées

de cellules établies, à un inducteur de LK 1. Les lymphocy-

tes et leucocytes humains peuvent être isolés à partir de sang frais humain. Les lignées de cellules établies, humaines,

peuvent proliférer selon des modes opératoires in vitro clas-

siques, avant d'être utilisées.

En vue d'une pratique plus efficace selon l'invention, on réalise de préférence une prolifération cellulaire in vivo,

au cours de laquelle la lignée cellulaire humaine est trans-

plantée directement dans un animal à sang chaud, ou bien

est ensemencée dans une chambre de diffusion de type clas-

sique, par l'intermédiaire de laquelle le fluide corporel

nutritif d'un animal 4 sang chaud est apporté à cette li-

gnée. A l'opposé de la prolifération cellulaire in vitro, le mode opératoire in vivo, en plus du fait qu'il permet l'obtention d'un titre plus élevé en LK 1, ne nécessite que peu ou pas de milieu nutritif renfermant du sérum coûteux,

et moins de soins au cours de la prolifération cellulaire.

Plus particulièrement,dans le mode opératoire in vivo, uti-

lisant comme h8te un animal à sang chaud, la lignée cellu-

laire humaine peut proliférer facilement tout en utilisant le fluide corporel nutritif fourni par l'animal, en étant transplantée dans l'animal même, ou bien en étant placée dans une chambre de diffusion de type classique, équipée

pour recevoir le fluide corporel, cette chambre-étant elle-

même située dans ou sur l'animal. Dans chaque cas, les ani-

maux sont nourris de manière habituelle. En outre, le mode opératoire in vivo est caractérisé par les faits suivants: une prolifération cellulaire bien plus stable et rapide, une production cellulaire supérieure, et une production de LK 1 bien plus élevée par cellule, par rapport à ce que l'on

obtient par le mode opératoire in vitro.

Les lignées cellulaires humaines,utilisables se-

lon l'invention, sont les lignées capables de produire LK 1, pouvant être transplantées dans un animal à sang chaud, et y proliférant aisément. Conviennent par exemple des lignées cellulaires humaines énumérées dans Protein. Nucleic Acid et Enzyme. Vol. 20, N06, pp. 616-643 (1975). Conviennent plus particulièrement les lignées de lymphoblastoides humains, comme Namalwa (ATCC CRL 1432), comme décrit dans Journal of Clinical Microbiology, Vol. 1, pp. 116-117 (1975); BALL-1, TALL-1 et Nall-1, comme décrit par Mioshi, Nature, Vol. 267, pp.843-844 (1977); M14-7002 et B7101, comme décrit dans The Journal of Immunolo, Vol. 113, pp. 1334-1345 (1974); JBL,

EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552) et EBV-HO, comme dé-

crit dans The Tissue Culture, Vol. 6, N 13, pp.527-546

(1980); CCRF-SB {ATCC CCL 120); CCRF-CEM (ATCC CCL 119);

BALM-2; DND-41; ainsi que d'autres lignées de cellules éta-

blies, obtenues par transformation de monocytes ou de granu-

locytes normaux, au moyen de radiations,agents ou virus can-

cérigènes. La vitesse de prolifération et/ou la productivité de LK 1 par cellule de ces lignées cellulaires, peuvent être améliorées par un traitement de fusion cellulaire utilisant du polyéthylène glycol ou du virus de Sendai, ou par une

technique de recombinant de gène utilisant l'enzyme de nu-

cléase, enzyme de ligase, enzyme d'ADN polymérase, et simi-

laires. L'énumération des lignées cellulaires humaines, uti-

lisables, n'est pas limitative.

Selon le cas, on peut utiliesr un ou plusieurs membres de ces lignées cellulaires en combinaison, jusqu'à l'induction

de KL 1 qui est décrite ci-après. Des lymphocytes et leuco-

cytes humains, préparés par exemple à partir de sang frais humain, peuvent être aussi utilisés en combinaison avec ces

lignées cellulaires.

Les animaux à sang chaud,utilisables selon l'in-

vention, comprennent ceux dans lesquels peuvent proliférer ces lignées cellulaires humaines. Conviennent par exemple les volailles comme poulet et pigeon, ou des mammifères

comme chien, chat, singe, lapin, chèvre, porc, cheval, va-

che, cobaye, rat, rat nu, hamster, souris ou souris nue.

Comme la transplantation de ces cellules humaines dans les animaux a pour résultat de faire nattre une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser ces animaux au stade le plus jeune possible, par exemple sobs forme d'oeuf, d'embryon, de foetus, ou d'animal nouveau-né ou en bas-âge,

afin de réduire autant que possible cette immunoréaction. A-

vant la transplantation, l'animal peut être irradié avec des rayons-X ou gamma, environ 200-600 rem, ou recevoir une injection convenable d'antiserum ou d'immunosuppresseur,

afin de réduire l'immunoréaction au niveau le plus bas pos-

sible. Les animaux immunodéficients, comme souris et rat nus, conviennent comme hôte animal: n'importe laquelle des lignées cellulaires humaines, citées plus haut, peut être transplantée dans ces animaux sans traitement préalable, et

y proliférer avec moins de danger d'y provoquer une immuno-

réaction indésirable puisqu'ils présentent moins d'immunoré-

action, même à l'état adulte.

On peut obtenir une stabilisation de la prolifé-

ration cellulaire et/ou une augmentation de la production de LK 1, par transplantations successives, utilisant des animaux à sang chaud semblables ou différents: par exemple, on peut atteindre ces objectifs en transplantant d'abord

une lignée cellulaire humaine à un hamster, o elle prolifè-

re, puis en transplantant ces cellules ayant proliféré

dans une souris nue. Dans ce cas, la seconde transplanta-

tion peut s'effectuer avec un animal à sang chaud de même classe ou ordre, aussi bien qu'avec ceux de même genre ou

espèce.

On peut transplanter les cellules humaines en tout

site de l'animal, pourvu que ces cellules puissent y proli-

férer, par exemple dans la cavité allantolque, ou par voie

intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

Au lieu de les transplanter chez l'animal, on peut, afin de les faire proliférer facilement,placer les cellules

humaines mentionnées plus haut dans une chambre de diffu-

sion de type classique, de formes et de dimensions variées, munie de moyens convenables pour empêcher la contamination

de la chambre par les cellules de l'animal, tout en fournis-

sant aux cellules humaines le fluide corporel nutritif de

l'animal, par exemple membrane filtrante, ultrafiltre ou fi-

bre creuse d'une dimension nominale de pore de l'ordre de

7 -10-5 m; insérer, par exemple par voie intrapéritoné-

ale,cette chambre dans l'animal; et laisser les cellules humaines s'y développer grâce à l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal. En outre, la chambre de diffusion peut être conçue et placée sur l'animal de façon que le fluide

nutritif puisse circuler librement dans la chambre. La cul-

ture dans cette chambre peut être observée au cours de la prolifération cellulaire, par une fenêtre(s) latérale, trans-

parente, prévue sur la paroi(s) de la chambre, et/ou la cham-

bre elle-même peut être remplacée par intervalles par une chambre fraîche, à la fois pour poursuivre la prolifération cellulaire sur la période d'espace de vie de l'animal sans le sacrifier, et pour augmenter beaucoup plus la production

cellulaire par animal. Comme en raison de l'absence de con-

tact direct entre les cellules humaines et celles de l'ani-

mal, ces chambres de diffusion suscitent beaucoup moins d'immunoréactions indésirables, on peut aisément utiliser tout animal à sang chaud sans traitement préalable destiné

à réduire 1' immuno-réaction, et les cellules humaines via-

bles, ayant proliféré, peuvent y être facilement recueil-

lies. L'alimentation de l'animal peut s'effectuer de

manière habituelle, et il n'y a pas de précautions spécia-

les à prendre, même après la transplantation. La période né-

cessaire pour l'obtention de la prolifération cellulaire ma-

ximale est généralement comprise entre 1 à 10 semaines. Le nombre de cellules humaines, ainsi obtenues par animal, est de l'ordre de 107 à 1012 ou plus. Plus particulièrement, conformément à l'invention, le nombre de cellules humaines transplantées est multiplié par 102 à 107 ou plus, ce qui représente 10 à 10o6 fois, ou plus, ce que l'on obtient par ensemencement et prolifération des cellules humaines sur un

milieu de culture nutritif in vitro. Cela est très favora-

ble en vue de la production de LK 1.

Tout procédé est possible selon la présente in-

vention, dans la mesure o il permet d'induire la production

de LK 1 dans les cellules humaines ayant proliféré. Celles-

ci peuvent être exposées à l'action d'un inducteur de LK 1, a556a2,

dans l'animal utilisé comme hôte pour la prolifération cel-

lulaire. Par exemple, une cellule humaine ayant proliféré

dans un ascite en suspension, ou une cellule tumorale, for-

mée par exemple par voie sous-cutanée, est directement ex-

posée in vivo à l'action d'un inducteur de LK 1, et le LK 1 accumulé est recueilli à partir de l'ascite, du sérum et/ou de la tumeur, puis est purifié. Ou bien, la cellule humaine ayant proliféré peut être recueillie à partir de l'animal avant d'être exposée in vitro à l'action d'un inducteur de

LK 1. Par exemple, la cellule humaine ayant proliféré, ob-

tenue par récolte à partir de la suspension d'ascite, ou par extraction et désagrégation de la masse tumorale formée par exemple par voie souscutanée, est mise en suspension dans un milieu de culture nutritif, préalablement chauffé à environ 20 -40 C, afin de donner une densité cellulaire de l'ordre de 105-10o8 cellules/ml, et est exposée in vitro à

l'action d'un inducteur de LK 1, avant que le LK 1 accumu-

lé ne soit recueilli à partir de la culture. Lorsqu'on uti-

lise une chambre de diffusion de type classique, l'exposi-

tion à l'inducteur de LK 1 de la cellule humaine ayant pro-

liféré, s'effectue dans la chambre, ou après sa récolte.

La cellule humaine, ainsi obtenue, peut être cul-

tivée in vitro pendant 1 à 4 jours supplémentaires, afin de

régler sa durée de génération, avant l'induction de LK 1.

La production de LK 1 par animal peut être encore augmentée

grâce à l'utilisation d'un ou de plusieurs des procédés sui-

vants. 1) Procédé au cours duquel la cellule humaine, ayant proliféré, est exposée à l'action d'un inducteur de LK 1

dans l'animal préalablement utilisé comme hôte pour la prolifé-

ration cellulaire, puis elle est recueillie à partir de cer-

tains sites de l'animal, ou de son corps entier, et est ex-

posée in vitro à l'action d'un inducteur de LK 1.

2) Procédé au cours duquel la cellule humaine est expo-

sée à maintes reprises à l'action d'un inducteur de LK 1.

3) Procédé selon lequel la chambre de diffusion, in-

crustée dans l'animal ou reliée à lui, est remplacée par

intervalles par une chambre franche.

L'inducteur de LK 1, utilisable conformément à l'invention, peut être un inducteur classique d' (-inter- feron (inducteur IFN- () tel que virus, acide nucléique et nucléotide; ou un inducteur classique de Y -interferon

(inducteur IFN -), comme phytohémagglutinine, concanava-

lin A, phytolaque mitogène, lipopolysaccharide, endotoxine, polysaccharide et bactérie. Les antigènes agissent comme

inducteurs de LK 1 sur des cellules sensibilisées par eux.

La production de LK 1 peut être encore augmentée par l'uti-

lisation combinée des inducteurs IFN-0 et IFN-. Il se

confirme qu'une telle combinaison induit une production si-

multanée d'interféron humain spécifique (HuIFN). Cela s'a-

vère très avantageux lors d'une production à l'échelle in-

dustrielle, simultanée et à faible coût de deux des sub-

stances les plus biologiquement actives, c'est-à-dire HuIFN et LK 1 de valeur inestimable, ainsi qu'au point de vue

d'une utilisation bien plus efficace des cellules humaines.

Le LK 1, ainsi obtenu, peut être récupéré par un ou plusieurs modes de purification et/ou séparation, par

exemple relargage, dialyse, filtration, centrifugation, con-

centration, et/ou lyophilisation. Lorsqu'on souhaite obtenir une préparation de LK 1 beaucoup plus pure, un produit de la

plus haute pureté peut être préparé par le mode préparatoi-

re décrit plus haut, en combinaison avec d'autres modes opé-

ratoires classiques, comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, fractionnement au point isoélectrique, électrophorèse, chromatographie par échange

d'ions, chromatographie liquide à performance élevée, chro-

matographie sur colonne, et/ou chromatographie par affinité.

Les anticorps monoclonaux immobilisés, obtenus par liaison d'un anticorps anti-LK 1 monoclonal, qui est décrit ci-après, sur un support approprié insoluble dans

2556Z20

l'eau, par exemple Sepharose activé par BrCN, un produit de

Pharmacia Fine Chemical AB (Suède) sont avantageusement uti-

lisables pour une purification plus rapide et plus facile

de LK 1.

Il se confirme que le LK 1 obtenu présente les propriétés physicochimiques (a) à (i) indiquées plus haut

aux pages 1-2.

Il se confirme aussi que LK 1 n'exerce pas de cy-

tolyse poussée sur les cellules humaines normales, mais

réalise une cytolyse remarquable sur certaines cellules tu-

morales humaines, ainsi que sur la lignée fibroblastolde de la souris, L 929, en tuant ces cellules. Ainsi, on peut utiliser avantageusement LK 1, par exemple sous forme de composition, comme agent prophylactique et/ou thérapeutique pour les maladies sensibles à LK 1, comme tumeurs malignes, plus particulièrement certaines tumeurs malignes humaines

dont le traitement est jugé très difficile.

Le procédé de production d'un anticorps monoclonal,

selon la présente invention, comprend les stades de: immuni-

sation d'un animal à sang chaud avec le LK, ainsi obtenu, comme antigène; collecte à partir du corps de l'animal

des cellules productrices d'anticorps; fusion de ces cel-

lules avec des cellules de myélome; sélection d'un clone

capable de produire un anticorps spécifique de LK 1 à par-

tir des cellules d'hybridome résultant; prolifération du clone; et production par les cellules ayant proliféré de

l'anticorps monoclonal spécifique de LK 1.

L'immunisation peut être obtenue par injection, par exemple par voie intraveineuse, intrapéritonéale, ou sous-cutanée, d'une solution, émulsion ou suspension aqueuse

LK 1, en tant qu'antigène, à un animal à sang chaud conve-

nable, par exemple poulet, pigeon, chien, chat, singe, chè-

vre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, ou souris, suivie de l'alimentation pendant 3 jours ou plus, de l'animal, afin d'induire la production d'anticorps. On peut également utiliser comme antigène un produit conjugué de LK 1 et d'un saccharide, comme décrit dans la publication

de brevet japonais N 23 847/83. L'antigène peut être in-

jecté en une dose unique, ou éventuellement en 2 ou plu-

sieurs dosages à des intervalles de l'ordre de 3 à 30 jours. Les cellules spléniques de l'animal immunisé, dans

lequel la production d'anticorps a été induite, sont fusion-

nées avec des cellules de myélome d'espèce semblable ou dif-

férente, au moyen d'un mode opératoire convenable,par exem-

ple ceux qui sont reportés par G. Kohler et coll. dans Natu-

re, Vol. 256, pp. 495-497 (1975) et Eur. J. Immunol., Vol. 6, pp.511-519 (1976). Les cellules hybrides ainsi obtenues sont

alors choisies et clonées, après quoi les clones sont culti-

vés in vitro ou in vivo, puis on recueille à partir de la

culture résultante les anticorps monoclonaux hautement spé-

cifiques, accumulés. Plus particulièrement, le mode opéra-

toire in vivo est de beaucoup préférable au mode in vitro, car le premier permet d'atteindre une prolifération bien

plus élevée du clone, et une production plus forte de l'an-

ticorps monoclonal, sans utilisation de sérum coûteux. Au

cours du mode opératoire in vivo, le clone prolifère en uti-

lisant le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud,

d'espèce semblable ou différente de celle qui a été utili-

sée lors -de l'immunisation, soit en le transplantant direc-

tement dans l'animal, soit en l'ensemençant dans une chambre

de diffusion de type classique conçue pour recevoir le flui-

de corporel nutritif de cet animal, et l'anticorps monoclo-

nal accumulé est recueilli à partir de fluides corporels

comme ascite et sang. Autre possibilité, le clone,après pro-

lifération in vivo, peut être cultivé sur un milieu de cul-

ture dénué de sérum pendant 1 à 5 jours supplémentaires, a-

vant que l'on recueille l'anticorps monoclonal accumulé à

partir de la culture résultante.

Les anticorps monoclonaux ainsi obtenus peuvent

être facilement récupérés, avec un ou plusieurs modes de sé-

paration et/ou de purification, comme relargage, dialyse, filtration, centrifugation et/ou lyophilisation. Lorsqu'on souhaite une purification plus poussée, on peut obtenir une préparation très pure en combinant les modes opératoires ci-dessus avec d'autres modes opératoires classiques comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration

sur gel, fractionnement au point isoélectrique, électropho-

rèse, chromatographie avec échange d'ions, chromatographie liquide à haute performance, chromatographie sur colonne,

et/ou chromatographie par affinité. Le rendement de récupé-

ration de l'anticorps monoclonal peut être avantageusement amélioré grâce à l'utilisation d'un gel de LK 1 immobilisé,

obtenu par liaison de LK 1 très pur sur un support insolu-

ble dans l'eau, convenable, par exemple Sepharose activé

par BrCN.

L'anticorps monoclonal,obtenu conformément à l'invention, est avantageusement utilisable comme coordinat

pour la chromatographie par affinité orientée vers la produc-

tion de LE 1, aussi bien que pour le diagnostic de différen-

tes maladies humaines, en raison de sa spécificité envers LK 1, qui a une activité cytotoxique vis-à-vis des tumeurs malignes.

Les titres de LK 1 sont déterminés grâce à l'uti-

sation de cellules KB, ou de cellules L 929, prises comme

cellules cibles: lorsqu'on utilise les cellules KB, l'ac-

tivité d'inhibition de la croissance sur ces cellules est déterminée selon le procédé décrit dans Cancer Chemotherapy Reports, partie 3, vol. 3, N 2, septembre (1972), avec une légère modification; lorsqu'on utilise les cellules L 929,

l'activité cytotoxique sur ces cellules en présence d' Acti-

nomycine D est déterminée par le procédé décrit dans Lympho-

* kines, Vol. 2, pp. 245-249, "Tumor Necrosis Factor", édité par E. Pick, publié par Academic Press, Inc. (1981), avec

une légère modification. Dans la présente description, sauf

indication contraire, on utilise le dernier procédé avec

cellules L 929.

Les titres de HuIFN sont déterminés par le procé-

dé classique de réduction sur plaque, utilisant des cellu-

les FL d'origine amniotique humaine, décrit dans Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol.20, N 6, pp.616-643 (1975). Les titres d'hémagglutination sont déterminés selon le procédé reporté par S.E. Salk, The Journal of

Immunology, Vol. 49, pp. 87-98 (1944) avec une légère mo-

dification. Les expérimentations suivantes illustrent plus en

détails la présente invention.

EXPERIMENTATION A-1

Préparation de LK 1 particulièrement purifié

On injecte à des hamsters nouveau-nés, un antisérum classi-

que préparé à partir de lapin afin d'affaiblir leur immuno-

réaction, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoldes humains, BALL-1, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. Les masses tumorales, formées sous la peau, sont extraites, hachées et désagrégées dans du sérum physiologique. La suspension de cellules ainsi obtenue est alors rincée avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,2)

additionné de sérum, et on remet en suspension dans une pré-

paration fraîche du même milieu de culture, afin d'avoir une densité cellulaire de l'ordre de 2x106 cellules/ml. On ajoute à cette suspension du virus de Sendai (environ 400 titres d'hémagglutination/ml), et l'on met à incuber à 37 C pendant 24 heures pour induire la production de LK 1. La culture est alors centrifugée vers 4 C et 1 000 g, et le précipité résultant est enlevé. La partie surnageante ainsi

obtenue est dialysée contre du sérum physiologique renfer-

mant 0,01 M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 20 heures, et est traitée avec une membrane filtrante. On fait alors passer le filtrat au travers d'une colonne d'un anticorps

anti-HuIFN immobilisé, et l'on collecte la fraction non ad-

sorbée. A partir de cette fraction on récupère une fraction active, au moyen de chromatoconcentration, on la concentre et la lyophilise pour obtenir une poudre dotée d'activité LK 1. L'activité spécifique de cette poudre est de l'ordre de 106 unités/mg de protéine. Le rendement en LK 1 est de l'ordre

de 3 x 107 unités par hamster.

EXPERIMENTATION A-2

Préparation d'anticorps anti-LK 1 Une préparation de LK 1, obtenue par le procédé décrit dans

l'Expérimentation A-1, est dissoute dans du sérum physiolo-

gique afin d'avoir une concentration de l'ordre de 0,05 % de protéine en poids/volume, et on ajoute à cette solution le même volume d'adjuvant complet de Freund. Des souris sont immunisées par injection sous-cutanée de portions de 0,2 ml du mélange ainsi obtenu, avec rappel 7 jours après la

première injection. Après induction de la production d'an-

ticorps anti-LK 1 dans les cellules productrices d'anti-

corps des animaux, on extrait les rates de ces derniers, les

hache, les désagrège, et les met en suspension conjointe-

ment avec une lignée cellulaire de myélome de souris, P3-

X63-Ag8, en provenance de Flow Laboratories Inc. USA, dans du milieu essentiel minimal de Eagle dépourvu de sérum (pH 7,2) renfermant 50% poids/volume de polyéthylène glycol 1000, préchauffé à 37 C, afin d'obtenir des densités cellulairse respectives de 104 cellules/ml, puis on laisse reposer 5 minutes le mélange résultant. Ce mélange est ensuite dilué

fois dans une préparation franche du même milieu de cul-

ture, et les cellules d'hybridome capables de se développer

sur le milieu renfermant hypoxanthine, aminoptérine et thy-

midine, sont recueillies selon le procédé reporté par R.L.

Davidson et P.S. Gerald dans Somatic Cell Genetics,Vol. 2, Nó2, pp.17517 (1976) pour cloner les cellules d'hybridome capables de produire l'anticorps anti-LK 1. On transplante dans des souris par voie intrapéritonéale, les cellules d'hybridome clonées à la dose d'environ 106 cellules par

souris, on les alimente pendant 2 semaines avant de les sa-

crifier. Les fluides corporels des animaux, ço.me fluide as-

citique et sang, sont recueillis, centrifugés et relargués avec du sulfate d'ammonium, puis on collecte les fractions déposées pour des saturations de 30-50%. Ces fractions sont dialysées, et soumises à une chromatographie par affinité utilisant un gel d'anticorps anti-LK 1 immobilisé, obtenu par réaction d'un spécimen de LK 1, préparé par le procédé décrit dans l'Expérimentation A-1, avec du Sepharose activé par BrCN, à température ambiante, pour obtenir une fraction d'anticorps anti- LK 1, qui est ensuite dialysée, concentrée

et lyophilisée en une poudre. Cette poudre présente une neu-

tralisation immunologiquement spécifique de l'activité cyto-

toxique de LK 1.

La stabilité de l'anticorps monoclonal en solution aqueuse est étudiée par détermination des activités neutralisantes résiduelles, apres mise en incubation dans les conditions

prescrites: lorsqu'on opère à pH 7,2 et à différentes tem- pératures pendant 30 minutes, à 60C, il reste au moins 80%

de l'activité, mais à 70 C il y a perte de plus de 90%. A-

près mise en incubation à 4 C et différents pH pendant 16

heures,-l'activité reste stable dans l'intervalle de pH com-

pris entre 4 et 11, mais à pH 2 la perte d'activité est d'au

moins 90%.

Lorsqu'on étudie les propriétés de l'anticorps monoclonal se-

lon l'invention, on constate qu'il ne résiste pas au mercap-

to-2 éthanol, et provoque une réaction spécifique antigène-

anticorps avec l'anti-corps immunoglobuline M anti-souris.

Ainsi, le présent anticorps monoclonal se classe-t-il dans le groupe des anticorps immunoglobuline M.

EXPERIMENTATION A-3

Préparation et propriétés physicochimiques de LK 1 très pur Un spécimen de LK 1 partiellement purifié, obtenu par le procédé décrit dans l'expérimentation A-1, est soumis à

une chromatographie par affinité au moyen d'un gel d'anti-

corps monoclornal immobilisé, préparé par le procédé décrit dans l'expérimentation A-2, et l'on recueille des fractions

de LK 1 qui sont ensuite dialysées, concentrées et lyophi-

lisées. Le résultat est une préparation très pure de LK 1 ayant une

activité spécifique de l'ordre de 109 unités/mg de protéine.

Le dosage de LK 1 de cette préparation, utilisant des cel-

lules KB, donne approximativement la même activité spécifi-

que.

Les propriétés physicochimiques de LK 1 sont étudiées à par-

tir de cette préparation.

1) Poids moléculaire: Le poids moléculaire de LK 1 est déterminé par les procédés électrophorétiques utilisant du gel de SDS-polyacrylamide, décrits par K. Weber et M. Osborn, J. Biol. Chem., Vol. 244, p. 4 406 (1969), avec une légère modification. Les colonnes de gel à 10% d'acrylamide sont chargées avec des portions d'environ 10 Fg de la préparation, en présence de 0,1% de SDS, et l'on met sous charge de 8 mA par colonne pendant 4 heures, afin de réaliser l'électrophorèse. Après extraction et dosage ultérieur de LK 1 des fractions actives, le poids

moléculaire de LK 1 est de 20 000 + 2 000 daltons.

2) Point isoélectrique

Une électroconcentration à 25 W de la préparation, de 2 heu-

res, utilisant "AMPHOLINE PAGPLATE", un gel fabriqué pour l'électroconcentration par LKB-Produkter AB, Suède, donne

un point isoélectrique pI de 5,6 + 0,2.

3) Mobilité électrophorétique: Selon le procédé décrit par B.J. Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 121, page 404 (1964), légèrement modifié, on charge sur des colonnes de gel d'acrylamide à 10%, des fractions

d'environ 10 Fg de la préparation, on soumet à une électro-

phorèse à pH 8,3 et 3 mA par colonne pendant 2 heures, on

extrait et on dose l'activité de LK 1 pour obtenir une mobi-

lité électrophorétique Rf de 0,29 + 0,02.

4) Spectre d'absorption UV: Après analyse du spectre UV de la préparation à l'aide d'un spectromètre UV-250, fabriqué par Shimadzu Seisakusho KK, Japon, on observe une absorption maximale au voisinage de 280 nm. ) Solubilité dans les solvants: Le produit est soluble dans l'eau, le sérum physiologique et la solution tampon phosphate; faiblement ou pas soluble

dans l'oxyde de diéthyle, l'acétate d'éthyle et le chloro-

forme.

6) Réaction colorée: Elle est protéine-positive par le procédé de Lowry et celui

de microburet; sucre-positive par le procédé au phénol-

acide sulfurique et celui à l'anthrone-acide sulfurique.

7) Activité biologique: On observe une activité cytotoxique sur les cellules L 929 et une activité d'inhibition de croissance sur les cellules

KB. On ne remarque pas d'activité HuIFN marquée.

8) Stabilité en solution aqueuse: a) Stabilité à la chaleur: On met à incuber à pH 7,2, pendant 30 minutes, et à différentes températures, des fractions d'environ 1 x

unités/ml de la préparation, et l'on détermine les ac-

tivités cytotoxiques résiduelles. On constate que LK 1 est

stable jusqu'à 60 C.

b) Stabilité au pH: Des fractions de 0,1 ml de la préparation (1 x 106 unités/ml) sont additionnées avec 1 ml de solution

tampon de différentes valeurs de pH, c'est-à-dire de tam-

pon de Mcllvaine à pH 2 à 7; tampon phosphate, pH 7 à 8; tampon glycineNaOH, pH 8 à 11, et l'on met à incuber à 4 C pendant 16 Heures. Puis on ajuste à pH 7,2 avec du tampon phosphate 0,05 M, 0,1 ml du mélange incubé, et l'on détermine l'activité résiduelle. On constate que LK 1 est

stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et 11.

c) Stabilité à la DISPASE:

A environ 1 x 10 unités/ml de la prépara-

tion, on ajoute de la "DISPASE"V, une protéase de microorga-

nisme Bacillus, commercialisée par Godo Shusei Co., Ltd, Japon, de manière à donner une activité enzymatique de 100 unités/ml, et l'on fait incuber ce mélange à pH 7,2 et à 37 C pendant 2 heures. Au cours de l'incubation, on prélève

périodiquement de petites portions du mélange et on les ad-

ditionne d'albumine de serum de veau de manière à avoir une concentration de 1% en poids/volume, afin d'arrêter la réaction enzymatique. Lors du dosage des activités LK 1 dans

les échantillons, on constate que LK 1 est sensible au trai-

tement par la dispase et perd son activité à mesure que se

déroule la réaction enzymatique.

9) Stabilité à la cryoconservation: La préparation de LK 1 est entreposée en solution aqueuse à -10 C et pH 7,2 pendant 1 mois, est dégelée et dosée. On

ne constate pas de diminution d'activité.

Il ressort de ce qui précède que LK 1 a des pro-

priétés physico-chimiques différentes de celles des lympho-

kines connues comme LT, TNF ou IFN. De même, l'anticorps monoclonal selon l'invention est nouveau, car il présente

une neutralisation immunologiquement spécifique de l'acti-

vité cytotoxique du nouveau lymphokine LK 1.

EXPERIMENTATION B-1

Inhibition de la croissance des tumeurs malignes

L'effet inhibiteur de croissance, exercé par LK 1 sur plu-

sieurs cellules humaines, a été étudié en utilisant les préparations de ce produit obtenues par le procédé décrit

dans les expérimentations A-1 et A-3.

106 cellules de l'une des lignées humaines, énumérées dans le tableau 1, sont mises en suspension dans 1 ml de milieu nutritif classique additionné de sérum foetal de veau; on

cultive pendant 1 jour, y ajoute 0,1 ml de serum physiologi-

que renfermant 50 ou 500 unités de préparation de LK 1, pré-

S6220 parée par le procédé décrit dans l'expérimentation A-1 ou A-3, et met à incuber A 37 C pendant 2 jours. Lorsque la culture est achevée, les cellules viables sont colorées avec du rouge neutre, un type d'agent colorant, selon le procédé décrit dans Applied Microbiology, Vol. 22, No 4, pp.671-677 (1971), et l'agent colorant est élué au moyen d'une solution d'éthanol acidifié. Ensuite, le nombre de cellules viables est déterminé par mesure de la capacité

d'absorption de l'éluat, pour une longueur d'onde de 540 nm.

On utilise comme témoin 0,1 ml de sérum physiologique exempt

de LK 1.

Le pourcentage d'inhibition de croissance est calculé grâce à l'équation suivante: Inhibition de croissance (%) Capacité d'absorption avec LK 1 = (1 -) x 100 Capacité d'absorption du témoin Les résultats sont indiqués dans le tableau I à la page suivante.

A. N

\ \\' Es =

TABLEAU 1

Nom de la lignée Source de la lignée LK 1 provenant de LK 1 provenant de cellulaire cellulaire l'expérimentation A-1 l'expérimentation A-3 ___ 50 unités 500 unités 50 unités 500 unités HIEpi2* Carcinome épidermoide I Ep X* du Larynx 32 41 48 70 PC-8* Carcinome du poumon 28 39 57 81 MKN 7* Carcinome gastrique 37 44 61 76 HLE* Carcinome du foie 31 40 54 72 HeLa* Carcinome épitheloide du col de l'utérus 26 36 45 69 L-132** Poumon embryonnaire 4 -2 1 -3 Foie de Chang** Foie 2 -4 -5 1 Coeur de Giradi** Coeur -3. 2 -1 -3 Nota: *) Lignées de cellules humaines provenant de tumeurs malignes;

**) Cellules provenant de tissus normaux.

o' o>

2556220Z

Ainsi qu'on peut le constater dans ce tableau, il se confir-

me que LK 1 n'affecte guère les cellules normales, mais

qu'il inhibe fortement la croissance de différentes cellu-

les de tumeurs malignes. Il se confirme également que l'ac-

tion d'un LK 1 partiellement purifié (A-1) est bien compara-

ble à celle du produit très purifie (A-3).

EXPERIMENTATION B-2

Un groupe de souris BALB/c reçoivent un transplant de cellu-

les Meth A, provenant de sarcome de souris. A partir du di-

xième jour après la transplantation, on injecte,par voie sous-cutanée aux souris, du sérum physiologique renfermant une préparation de LK 1, obtenu par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3, à raison de 100 ou 1 000 unités/kg

et par jour, pendant 15 jours. Ces souris sont ensuite sacri-

fiées, et les masses tumorales formées chez les animaux sont mesurées.

Les résultats figurent dans le tableau II.

TABLEAU II

Traitement Dosage par jour Masse tumorale (unités/kg) (g) Témoin 10 5,6+0, 7

3,4+0,4*

LK 1

1000 2,9+0,3*

Nota: *) indique les résultats statistiquement significa-

tifs par rapport au témoin de valeur 5%.

EXPERIMENTATION B-3

Des groupes de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés dans la région dorsale, de petits fragments de

tissu de cancer du sein humain.

Lorsque la croissance des masses tumorales atteint environ

mm3 dans le corps des animaux, on injecte par voie intra-

veineuse du sérum physiologique renfermant une préparation

de LK 1, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimenta-

tion A-1 ou A-3, une fois par jour à raison de 100 ou de 1 000 unités/kg, pendant 20 jours. Puis on sacrifie les

animaux et les tumeurs résultantes sont pesées.

Les résultats figurent dans le Tableau III.

_TABLEAU III

Traitement Dosage par jour Masse tumorale (unitép/kg) (g) Témoin 0 10,5+1, 1

7,2+0,8*.

LK 1 de l'expérimentation A-1 1000 6,9+0,5*

6,4+0,6*

LK 1 de l'expérimentation A-3 1000 5,8+0,7*

Nota: *) indique les résultats statistiquement significa-

tifs par rapport au témoin de valeur 5%.

EXPERIMENTATION B-4

Un essai de toxicité aiguë, au cours duquel on administre à un groupe de souris agées de 20 jours une préparation de LK 1, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation

A-3, confirme que la toxicité de la préparation est extrê-

mement faible, c'est-à-dire que DL50 est égale ou supérieu-

re à 109 unités, par injectionintraperitonéale.

Ainsi qu'il ressort des expérimentations ci-

dessus, le LK 1 selon la présente invention s'avère très efficace pour inhiber la croissance des tumeurs malignes in vitro aussi bien qu'in vivo. En outre, l'administration de LK 1 est sans risque eu égard au fait qu'un dosage élevé n'affecte pratiquement pas les cellules normales, alors qu'un faible dosage agit remarquablement sur les cellules tumorales. Le dosage efficace du présent LK 1 se situe généralement dans l'intervalle de 5 à 500 000 000 unités/jour pour un

adulte; plus particulièrement, pour l'administration lo-

cale, par exemple sous forme de collyre ou d'injection lo-

cale, le dosage se situe entre 5 et 10 000 000 unités/jour; pour l'administration percutanée ou permucosale, par exem- ple sous forme d'onguent ou de suppositoire, entre 10 et 000 000 unités/jour; pour l'administration systémique, par exemple par injection intraveineuse ou intramusculaire,

entre 50 et 100 000 000 unités/jour; et pour l'administra-

tion orale, entre 500 et 500 000 000 unités/jour, mais ces dosages sont très variables selon les symptômes du patient

et les indications.

Bien que LK 1 puisse être préparé sous forme de médicament de manière habituelle après mélange avec support, base et/ou véhicule convenable, la teneur en LK 1 doit être d'au moins 5 unités/g, eu égard à la toxicité, au dosage actif et

à l'inocuité.

La forme et le conditionnement des agents prophylactiques et/ou thérapeutiques, pour les maladies sensibles à LK 1,

peuvent être librement choisies: par exemple, pour l'admi-

nistration orale, ils peuvent être façonnés en préparations

pour usage entérique, par exemple capsule, comprimé ou pou-

dre; pour l'administration rectale, suppositoire; pour injection, ils peuvent être par exemple préparés sous forme de produit lyophilisé qui est dissous, avant l'usage, avec de l'eau distillée pour donner une solution injectable; ils peuvent également se présenter sous forme d'onguent, de

collyre ou de "collunarium".

Lors du traitement d'un patient à tumeur maligne, par exem-

ple, on peut traiter in vitro un fragment de tissu tumoral

provenant de ce patient, avec LK 1 afin d'augmenter l'immuno-

génicité de ce fragment, que l'on administre au patient afin d'obtenir un traitement beaucoup plus efficace de la tumeur maligne.

Les exemples A, B et C illustrent respectivement la produç-

S6220 tion de LK 1, des compositions pharmaceutiques renfermant

LK 1 et l'anticorps monoclonal spécifique de LK 1.

EXEMPLE A-1

Une lignée humaine de lymphoblastoYdes, BALL-1, est ense-

mencée sur un milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,4) ad- ditionné de 20% de sérum foetal de veau, et est cultivée in

vitro, en suspension à 379C, de manière habituelle. Les cel-

lules humaines ayant proliféré sont alors rincées avec du milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,4)exempt de sérum, et sont remises en suspension dans une préparation fraîche

du même milieu de culture, de façon a avoir une densité cel-

lulaire de 1 x 107 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée de virus de Sendai à la dose d'environ 1000 titres d'hémagglutination/ml, et l'on met à incuber à 38 C pendant 1 jour afin d'induire la production de LK 1. Après centrifugation de la culture résultante à 4 C et 1000 x g, environ, la partie surnageante est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01M de tampon phosphate (pH 7, 2)

pendant 15 heures, et l'on traite avec une membrane filtran-

te. On fait ensuite passer le filtrat au travers d'une co-

lonne d'anticorps anti-LK 1, comme dans l'expérimentation A-1, et la fraction non adsorbée est purifiée comme dans l'expérimentation A-3, au moyen d'une chromatographie par affinité utilisant une colonne de gel d'anticorps anti-LK 1, puis l'on concentre afin d'obtenir un concentréayant une

activité spécifique LK 1 d'environ 109 unités/mg de protéi-

ne.

Le rendement est de l'ordre de 2 x 106 unités/litre de sus-

pension de cellules induites.

EXEMPLE A-2

On injecte à des hamsters nouveau-nés un antisérum classi-

que, préparé à partir de lapin, afin d'affaiblir leur immu-

noréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une li-

gnée de lymphoblastoides humains, BALL-1, et on les nourrit

pendant 3 semaines de manière habituelle. Les masses tumora-

les, environ 15 g chaque, formées sous la peau des animaux,

sont extraites, hachées, et désagrégées dans du sérum phy-

siologique. Après rinçage avec du milieu RPMI 1640 exempt

de sérum (pH 7,2) les cellules ayant proliféré sont remi-

ses en suspension dans une préparation fraîche du même mi- lieu de culture, afin d'obtenir une densité cellulaire de

l'ordre de 5 x 106 cellules/ml. Cette suspension cellulai-

re est additionnée du virus de Sendai et d'endotoxine de

E. Coli, à raison respectivement de 1000 titres d'hémag-

glutination/ml et de 10 gg/ml, environ, et l'on met à in-

cuber à 37 C pendant 1 jour, pour induire la production de LK 1. Apres centrifugation de la culture a 4 C et 1000 x g, environ, pour éliminer le sédiment, la partie surnageante est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01 M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 21 heures, et est

traitée avec une membrane filtrante. Le filtrat est puri-

fié avec une colonne d'anticorps, comme dans l'exemple A-1, et la solution d'éluat est concentrée et lyophilisée pour donner une poudre ayant une activité spécifique LK 1 de

l'ordre de 109 unités/mg de protéine.

Le rendement est voisin de 4 x 107 unités.

EXEMPLE A-3

On transplante dans des souris nues adultes, par voie intra-

péritonéale, une lignée de lymphoblastoides humains, TALL-1, on les alimente de manière habituelle pendant 5 semaines,

leur injecte par voie intrapéritonéale du virus de la ma-

ladie de Newcastle (environ 3 000 titres d'hémagglutination

par souris nue) qui a été au préalable pratiquement inacti-

vé par irradiation aux UV, et les sacrifie 24 heures après

cette injection, puis on recueille leurs fluides asciti-

ques. Ces fluides sont purifiés, concentrés et lyophilisés comme dans l'exemple A-2, pour donner une poudre possédant

l'activité LK 1.

Le rendement est de l'ordre de 4 x 106 unités/souris nue.

EXEMPLE A-4

Des souris adultes sont irradiées avec environ 400 rem de

rayons-X afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y trans-

plante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoides humains, Mono1, et on les alimente de manière habituelle

pendant 3 semaines. Les masses tumorales, environ 10 g cha-

* que, formées sous la peau des animaux, sont extraites et dé-

sagrégées comme dans l'exemple A-2. Les cellules humaines

ainsi obtenues sont mises en suspension comme dans l'exem-

ple A-2, après quoi la suspension cellulaire résultante est additionnée de virus de Sendai et de concanavaline A, aux doses respectives de 500 titres d'hémagglutination/ml et de 0,8 gg/ml, et l'on met à incuber à 37 C pendant 1 jour

pour induire la production de LK 1. Cette culture est ensui-

te purifiée, concentrée et lyophilisée comme dans l'exemple

A-2, pour donner une poudre possédant une activité LK 1.

Le rendement est de l'ordre de 2,4 x 107 unités/souris.

EXEMPLE A-5

On transplante dans des hamsters nouveau-nés, une lignée de lymphoblastoldes humains, Namalwa (ATCC CRL 1432), comme

dans l'exemple A-2, et on les alimente de manière habituel-

le pendant 4 semaines. Les masses tumorales, environ 20g chaque, formées sous la peau des animaux, sont extraites et désagrégées pour donner une suspension cellulaire ayant une densité de l'ordre de 3 x 106 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée de virus de Sendal à raison de 1 000 titres d'hémagglutination/ml, et l'on met à incuber à

36 C pendant 2 jours pour induire la production de LK 1.

Cette culture est purifiée et concentrée comme dans l'exem-

ple A-1, pour donner un concentré possédant l'activité LK 1.

Le rendement est de l'ordre de 2,6 x 107 unités/hamster.

EXEMPLE A-6

Une lignée de lymphoblastoldes humains, NALL-1, est miseen suspension dans du sérum physiologique, et est placée dans une chambre de diffusion cylindrique de 10 ml environ, en matière plastique, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de pore nominale d'environ 0,5g. Cette chambre est incluse par voie intrapéritonéale dans un rat adulte, et

l'animal est nourri de manière habituelle pendant 4 semai-

nes. Après enlèvement de la chambre, on constate que la den-

sité cellulaire dans celle-ci est de l'ordre de 5 x 108 cel- lules/ml, ce qui est environ 102 fois, ou plus, supérieur à ce que l'on obtient dans le cas d'une prolifération in

vitro dans un incubateur à C02 utilisant un milieu de cul-

ture nutritif. Ces cellules humaines sont mises en suspen-

sion dans un milieu de culture semblable à celui de l'exem-

ple A-2, on y ajoute du virus de la maladie de Newcastle (environ 500 titres d'hémagglutination/ml) préalablement

inactivé par irradiation aux UV, et de la phytohémaggluti-

nine (environ 50 gg/ml), et l'on met à incuber à 37 C pen-

dant un jour pour induire la production de LK 1. Cette cul-

ture est ensuite purifiée, concentrée et lyophilisée comme

dans l'exemple A-2 pour donner une poudre possédant l'acti-

vité LK 1.

Le rendement est de l'ordre de 1 x 107 unités/rat.

EXEMPLE A-7

Une lignée de lymphoblastoldes humains, CCRF-CEM (ATCC CCL 119), est ensemencée dans les cavités allantorques d'oeufs embryonnés qui ont été mis à incuber à 37 C pendant 5 jours,

et ces oeufs sont remis à incuber à la même température pen-

dant une semaine supplémentaire. Les cellules humaines ayant proliféré sont recueillies à partir des oeufs, et mises en suspension comme dans l'exemple A-1 de manière à donner une densité cellulaire de 5 x 106 cellules/ml. Cette suspension

cellulaire est alors additionnée de virus de Sendal (envi-

ron 500 titres d'hémagglutination/ml), et mise à incuber

à 37 C pendant un jour, pour induire la production de LK 1.

La culture résultante est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2, pour donner une poudre possédant l'activité LK 1. Le rendement est de l'ordre de 8 x 105 unités pour 10 oeufs embryonnés. EXEMPLE B-1 Injection 500 000 unités de specimen de LK 1, préparés dans l'exemple A-2, sont dissous dans 200 ml de serum physiologique, et on filtre dans des conditions stériles à l'aide d'une membrane filtrante. Des portions de 2 ml de ce filtrat sont réparties dans des fioles de verre stérilisées, sont lyophilisées et on scelle ces fioles pour obtenir un produit injectable en poudre. Ce produit est avantageusement utilisable pour le traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon, du carcinome du

foie, et de la leucémie.

EXEMPLE B-2

Onguent Le spécimen de LK 1, préparé dans l'exemple A-3, est pétri

avec une quantité minimale de paraffine liquide, jusqu'à ho-

mogénéité. Ce-mélange est alors additionné de vaseline blan-

che de manière habituelle, pour obtenir un onguent ayant

une teneur en LK 1 de 20 000 unités/g.

Cet onguent est avantageusement utilisable pour le traite-

ment du carcinome de la peau, du cancer du sein et du lym-

phome.

EXEMPLE B-3

Collyre

Un mélange de 800 ml d'eau distillée, 5 ml de (-phénylétha-

nol et 20 000 000 unités de spécimen de LK 1, préparé dans l'exemple A-4, est mélangé avec du chlorure de sodium dans une quantité supplémentaire d'eau distillée, afin d'obtenir

1 000 ml de solution isotonique.

Cette solution est avantageusement utilisable comme collyre

pour le traitement du rétinoblastome.

EXEMPLE B-4

Comprimés entériques enrobés On prépare des comprimés entériques enrobés selon un procédé classique, à partir d'un mélange d'amidon, de maltose et de spécimen de LK 1, préparé dans l'exemple A-7, de manière à avoir une teneur en LK 1 de 200 000 unités par comprimé

(100 mg), puis on enrobe les comprimés avec de l'ester phta-

lique de méthyl cellulose. Ces comprimés sont avantageuse-

ment utilisables pour le traitement du carcinome du colon

et du carcinome du foie.

EXEMPLE C-1

Des souris sont immunisées comme dans l'expérimentation A-2, à ceci près que l'on utilise comme antigène un LK 1 très pur,

obtenu par le procédé décrit dans l'expérimentation A-1. En-

suite des cellules de rate de ces animaux sont mises en sus-

pension avec une lignée de myélome de souris,P3-NS-l/l-Ag4-l, un produit de Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Japon, dans une solution saline renfermant 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4, et 2 mM de CaCl2, de manière à avoir des densités cellulaires respectives de 104 cellules/ml. On ajoute à cette suspension cellulaire une solution saline

fraîche de même composition, mais renfermant en plus du vi-

rus Sendai, préalablement inactivé par une irradiation aux UV, avec refroidissement à la glace, et on laisse reposer ce mélange pendant 5 minutes. Puis on le dilue environ 20

fois dans du milieu RPMI 1640 à 37 C, et les cellules d'hy-

bridome capables de produire l'anticorps anti LK 1, sont

clonées comme dans l'expérimentation A-2. Les cellules d'hy-

bridome clonées sont transplantées par voie intrapéritonéa-

le dans des hamsters âgés de 7 jours (environ 107 cellules par hamster) dont l'immunoréaction a été affaiblie par des modes opératoires classiques, et l'on récupère l'anticorps

monoclonal à partir des corps des animaux comme dans l'ex-

périmentation A-2.

Tout comme l'anticorps monoclonal préparé dans l'expérimen-

tation A-2, le produit présente une neutralisation immuno-

logiquement spécifique de l'activité cytotoxique de LK 1.

La stabilité de l'anticorps monoclonal en solution aqueuse

est étudiée par dosage des activités neutralisantes rési-

duelles après mise à incuber dans les conditions prescri-

tes. Lors d'une incubation à pH 7,2 et différentes tempéra-

tures pendant 30 minutes, 80% ou plus de l'activité est con-

servée à 600C, mais 90% ou plus est perdue à 70 C. Après incubation à 4 C et différentes valeurs de pH pendant 16 heures, l'activité reste stable dans un intervalle de pH

compris entre 2 et 11.

Lors de l'étude de plusieurs propriétés de l'anticorps mono-

clonal, on constate que l'anticorps monoclonal selon l'in-

vention résiste au mercapto-2 éthanol, et suscite une réac-

tion spécifique antigène-anticorps avec un anticorps anti-

immunoglobuline de souris. Ainsi, l'anticorps monoclonal

selon l'invention se classe-t-il dans le groupe des anti-

corps de l'immunoglobuline.

EXEMPLE C-2

Un anticorps anti LK 1 monoclonal est préparé comme dans l'exemple C-1, à ceci près que l'on remplace P3-NS-1/1-Ag4-1 par une lignée de myélome de souris, SP2/O-Ag14, provenant

de Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Japon.

Lors de l'étude de la neutralisation immunologiquement spé-

cifique par l'anticorps monoclonal de l'activité cytotoxique

de LK 1, on obtient des résultats semblables à ceux de l'e-

xemple C-1. Ainsi, l'anticorps monoclonal se situe-t-il dans la classe des anticorps d'immunoglobuline G.

Il est bien entendu que la description détaillée

et les exemples particuliers indiquant des formes de réali-

sation préférées de l'invention ne sont donnés qu'à titre

d'illustration; différents changements et modifications pos-

sibles apparaîtront à l'homme de l'art en partant de cette

description détaillée, sans sortir du cadre de l'invention.

Claims (13)

Revendications

1. Lymphokine humain (LK 1), ayant une activité cyto-

toxique sur les cellules de tumeurs malignes, caractérisé par les propriétés physicochimiques suivantes: a) Poids moléculaire = 20 000 + 2 000 daltons b) Point isoélectrique: pI = 5,6 + 0,2 c) Mobilité électrophorétique: (sur rondelle de PAGE) Rf = 0,29 + 0,02 d) Spectre d'absorption UV: une absorption maximale au

voisinage de 280 nm.

e) Solubilité dans les solvants:

Le produit est soluble dans l'eau, le sérum physio-

logique et le tampon phosphate, il est peu soluble ou insoluble dans l'oxyde de

diéthyle, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.

f) Réactions colorées: Protéine-positive par le procédé de Lowry ou le procédé "microburette"

Sucre-positive par le procédé phénol-acide sulfu-

rique ou le procédé anthrone-acide sulfurique.

g) Activités biologiques: Cytotoxique sur cellule L 929 Inhibiteur de croissance sur cellule KB

Pratiquement dénué d'activité Interferon.

h) Stabilité en solution aqueuse: Stable jusqu'à 60 C lorsque mis à incuber à pH 7,2 pendant 30 minutes; Stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et

11, lorsque mis à incuber à 4 C pendant 16 heures.

i) Stabilité lors de la cryoconservation:

Stable à -10 C sur une période de 1 mois ou plus.

2. Procédé pour la production de lymphokine humain (LK 1), caractérisé par les stades de: exposition d'une cellule humaine capable de produire

LK 1, de préférence après prolifération, à l'action d'un in-

ducteur de LK 1, dans des conditions permettant l'accumula-

tion de quantités marquées de ce produit, et récupération du LK 1 ainsi obtenu,

la prolifération étant réalisée in vitro ou in vivo.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire LK 1, sont obtenues in vivo, par leur transplantation dans un animal à sang chaud, que l'on alimente, afin de permettre à ces cellules d'utiliser le fluide corporel nutritif de l'animal pour leur prolifération, suivie d'une extraction et

de la désagrégation de la tumeur qui s'est formée dans l'a-

nimal.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire LK 1 sont

obtenues in vivo, par mise en suspension de cellules humai-

nes dans une chambre de diffusion, dans laquelle leur est apporté le fluide corporel nutritif d'un animal à sang

chaud, la chambre de diffusion étant incrustée dans, ou pla-

cée sur l'animal de façon à permettre l'apport de son fluide

corporel nutritif dans la chambre, et l'animal étant alimen-

té pour permettre aux cellules humaines d'utiliser ce fluide pour leur prolifération, suivie de la récolte des cellules

ayant proliféré, à partir de cette chambre.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce

que l'animal est immunodéficient et que ses réactions immu-

nologiques sont supprimées.

6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la chambre de diffusion est munie d'une ou de plusieurs membranes filtrantes, fibres creuses ou ultrafiltres, ayant

une dimension de pore nominale de 10-7 à 10-5 m.

7. Procédé selon une des revendications 2 à 6, carac-

térisé en ce que les cellules humaines, capables de produire LK 1, sont des lymphocytes ou des leucocytes humains, en particulier des lymphoblastoldes, notamment ceux des lignées suivantes: Namalwa (ATCC CRL 1432),BALL-1, TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, MOLT-3 (ATCC

CRL 1552), CCRF-SB (ATCC CCL 120), CCRF-CEM (ATCC CCL 119),

BALM-2, DND-41, et Mono-1.

8. Procédé selon une des revendications 2 à 7, caracté-

risé en ce que l'inducteur de LK 1 est choisi dans les grou-

pes suivants: virus, acide nucléique, nucléotide, mitogène, endotoxine, lipopolysaccharides, saccharides, ainsi que

leurs mélanges.

9. Procédé suivant une des revendications 2 à 8, ca-

ractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une solu-

tion renfermant LK 1 et une quantité marquée d'impuretés, avec une colonne d'un anticorps anti-LK 1 immobilisé, afin

de réaliser une chromatographie par affinité, puis à re-

cueillir la fraction active de LK 1 résultante.

10. Composition pharmaceutique à action antitumorale,

caractérisée en ce qu'elle renferme, outre un support phar-

maceutiquement acceptable, une quantité efficace de LK 1 selon la revendication 1, de préférence au moins 5 unités de

ce produit par gramme.

11. Application de LK 1, selon la revendication 1,carac-

té risée en ce qu'elle consiste à immuniser un animal à

sang chaud avec LK 1 comme antigène, à recueillir les cellu-

les productrices d'anticorps à partir de cet animal, à fu-

sionner ces cellules avec des cellules de myelome, à choisir

un clone capable de produire à partir des cellules d'hybri-

dome résultant des anticorps anti LK-1, à faire proliférer ce clone et à laisser les cellules ayant proliféré produire

un anticorps monoclonal spécifique de LK 1.

12. Application selon la revendication 11, caractérisée en ce que la cellule productrice est une cellule splénique,

en particulier de souris.

13. Application selon la revendication 11 ou 12, carac-

térisée en ce que le stade de fusion comprend la mise en sus-

pension des cellules productrices d'anticorps avec des cel-

lules de myélome, dans une solution saline renfermant une

quantité efficace d'un agent inducteur de la fusion, en par-

ticulier du virus de Sendai ou du polyéthylène glycol, sui-

vie d'un repos de durée suffisante pour que la fusion se réa-

lise.