FR2572936A1 - Nouveau lymphokine et anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine, leurs production et utilisations - Google Patents

Abstract

PRODUCTION D'UN NOUVEAU LYMPHOKINE UTILISABLE CONTRE LES TUMEURS MALIGNES, ET DE SON ANTICORPS SPECIFIQUE MONOCLONAL. CE NOUVEAU LYMPHOKINE, DESIGNE PAR LK2, CARACTERISE PAR DES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DIFFERENTES DE CELLES DES LYMPHOKINES CONNUS, EST OBTENU A PARTIR DE CELLULES HUMAINES CAPABLES DE LE PRODUIRE, COMME LEUCOCYTES OU LYMPHOCYTES, QUE L'ON FAIT PROLIFERER AVANT DE LES SOUMETTRE A L'ACTION D'UN INDUCTEUR DE LK2 TEL QUE INDUCTEUR D'INTERFERON-A OU -G. LK 2 PRESENTE L'AVANTAGE D'ETRE CYTOTOXIQUE SUR LES CELLULES DES TUMEURS MALIGNES, SANS EXERCER D'ACTION NOCIVE SUR LES TISSUS NORMAUX.

Description

La présente invention se rapporte à un nouveau lymphokine, à sa production

et à ses utilisations. Elle concerne également un anticorps monoclonal spécifique de ce

lymphokine et sa production.

La lymphotoxine (LT) et le facteur de nécrose tu- moral (TNF) sont connus comme étant des lymphokines qui

endommagent les cellules tumorales. Par exemple, LT est dé-

crit par: Aoki, Ryuichi et coll. dans SHIN-MENEKIGAKU,

Vol. 6, "Lymphokine", pp. 87-105 (1979), publié par Igaku-

Shoin, In Vitro Method in Cell-Mediated Immunity, édité par B.R. Bloom et P.R.Glade, publié par Academic Press, Inc. (1971), et Cellular Immunology, Vol. 38, pp.388-402 (1978); et TNF est décrit par E.A. Carswell et coll. dans Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, vol. 72, N 9, pp.3666-3670 (1975), et Lymphokines, vol.2, pp.235-272, "Tumor Necrosis Factor", édité par E. Pick,

publié par Academic Press, Inc. (1981).

Récemment, H. Ohnishi et coll. ont décrit un lym-

phokine antioncotique, glycoprotéinique dans le brevet

japonais Kokai n 146 293/83.

C. Milstein a passé en revue les anticorps mono-

clonaux dans Scientific American, Vol. 243, N 4, pp.56-64

(1980).

En chimiothérapie, on utilise généralement un ou plusieurs des produits suivants: agents d'alkylation, antagonistes métaboliques, antibiotiques antioncotiques

et alcaloides de plantes.

Toutefois, ces produits chimiothérapeutiques pré-

sentent les inconvénients suivants: ils peuvent provoquer chez les patients des effets secondaires excessifs, leur spectre tumoral est relativement étroit et insuffisant, et ils sont susceptibles d'induire des tumeurs résistant aux médicaments.

La présente invention permet d'éviter ces incon-

vénients de l'art antérieur grâce à la découverte d'un nou-

veau lymphokine doté d'une activité cytotoxique sur les

cellules des tumeurs malignes, et ayant des propriétés phy-

sico-chimiques entièrement différentes de celles des lym-

phokines connus.

Le nouveau lymphokine selon l'invention est ca- ractérisé par les propriétés physico-chimiques suivantes: (1) Poids moléculaire: 000 2 000 daltons (2) Point isoélectrique: pI = 6,2 - 0,3 (3) Mobilité électrophorétique: sur pastille de PAGE, Rf = 0,29 - 0,02 (4) Spectre d'absorption dans l'UV:

absorption maximale pour une longueur d'onde pro-

che de 280 nm.

(5) Solubilité dans les solvants: soluble dans l'eau, le serum physiologique et le tampon phosphate; difficilement soluble ou insoluble dans

l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.

(6) Réactions colorées: Protéine positive selon le procédé de Lowry, ou le procédé à la microburette; Saccharide positive selon le procédé phénolacide

sulfurique ou le procédé anthrone-acide sulfurique.

(7) Activités biologiques:

Cytotoxique sur cellule L 929, et sur cellule KB.

Pratiquement exempt d'activité interféron.

(8) Stabilité en solution aqueuse: Stable jusqu'à 60 C lorsqu'on met à incuber à pH 7,2 pendant 30 minutes

Stable dans l'intervalle de pH de 4 à 11 lors-

qu'on met à incuber à 4 C pendant 16 heures.

(9) Stabilité à la cryoconservation:

Stable à -10 C sur une durée le 1 mois ou plus.

Font également partie de l'invention la produc-

tion et les utilisations de ce lymphokine, ainsi que l'an-

ticorps monoclonal spécifique de ce lymphokine, et sa pro-

duction. Ci-après, ce lymphokine sera simplement désigné

par l'abréviation "LK 2".

LK 2 est produit par l'exposition d'une cellule

humaine productrice de LK 2,par exemple leucocyte ou lym-

phocyte humains, ainsi que leurs lignées de cellules éta-

blies, à l'action d'un inducteur de LK 2. Les lymphocytes et leucocytes humains peuvent être isolés à partir de sang humain frais. On peut faire proliférer les lignées de cellules humaines établies par des procédés classiques

in vitro.

Afin de rendre dans la pratique la présente in-

vention plus efficace, il est souhaitable d'utiliser une

prolifération de cellules in vivo, en-transplantant direc-

tement cette lignée de cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud, ou bien en l'ensemençant dans

une chambre de diffusion de type classique, o on lui four-

nit le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud.

Contrairement à la prolifération cellulaire in vitro, le mode opératoire in vivo nécessite peu ou pas de milieu nutritif renfermant du serum coûteux, demande moins de soins au cours de la prolifération cellulaire, et les cellules humaines ayant proliféré présentent une activité

LK 2 bien supérieure.

En outre, dans le mode opératoire in vivo la li-

gnée de cellules humaines peut aisément proliférer par uti-

lisation du fluide corporel nutritif fourni par un animal à sang chaud, en transplantant cette lignée dans l'animal,

ou en la plaçant dans une chambre de diffusion de type clas-

sique, conçue pour recevoir le fluide corporel et située dans ou sur l'animal. Dans tousles cas l'animal est nourri

de manière habituelle.

De plus, le mode opératoire in vivo est caracté-

risé en ce qu'on a une prolifération cellulaire plus rapide et plus stable, une production cellulaire supérieure, et une production bien plus forte de LK 2 par cellule, que

dans le cas d'un mode opératoire in vitro.

Les lignées cellulaires utilisables selon l'in-

vention sont celles qui sont productrices de LK-2, peuvent être transplantées dans un animal à sang chaud, et peuvent y proliférer aisément. Conviennent par exemple des lignées cellulaires humaines énumérées dans Protein, Nucleic Acid

and Enzyme, Vol. 2,pp.616-643 (1975). Conviennent spécifi-

quement des lignées de lymphoblastoïdes humains, comme Na-

malwa- (ATCC CRL 1432) décrit dans Journal of Clinical Micro-

biology, Vol. 1, pp.116-117 (1975); BALL-1, TALL-1 et

NALL-1, décrits par I.Miyoshi dans Nature, Vol.267, pp.844-

(1977); M-7002 et B-7101, décrits dans The Journal of Im-

munology, Vol. 113, pp. 1 334 - 1 345 (1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552) et EBV-HO, décrits dans The Tissue Culture, Vol. 6, N 13, pp.527-546 (1980); CCRF-SB

(ATCC CCL 120); CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM 2; DND-41;

et d'autres lignées de cellules établies, obtenues par trans-

formation de granulocytes ou monocytes humains normaux au

moyen de virus d'agent ou de radiation carcinogène.

Le taux de prolifération et/ou la productivité en LK 2 par cellule, de ces lignées cellulaires, peuvent

être améliorés par la technique de fusion cellulaire utili-

sant du polyéthylène glycol ou du virus de Sendai, ou par la technique de recombinant de gène,utilisant l'enzyme nucléase, l'enzyme ligase, l'enzyme ADN polymérase, etc. L'énumération des lignées cellulaires humaines utilisables,

ci-dessus, ne limite en aucune façon le cadre de l'inven-

tion. On peut utiliser en combinaison un ou plusieurs mem-

bres de ces lignées, hns les étapes allant jusqu'à l'induc-

tion de LK 2 qui est décrite ci-après. Si nécessaire, des

leucocytes ou lymphocytes humains, qui peuvent être prépa-

rés à partir de sang humair frais -peuvent être utilisés

en combinaison avec l'une de ces lignées cellulaires humai-

nes.

L'animal à sang chaud utilisable selon l'inven-

tion peut être tout animal dans lequel la cellule humaine

peut proliférer. Conviennent par exemple les volailles com-

me poulet et pigeon; des mammifères comme chien, chat, singe, lapin, chèvre, porc, cheval, vache, cobaye, rat,

rat nu, hamster, souris, souris nue, et similaires.

Comme la transplantation de cellules humaines à l'animal provoque une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser un animal à sang chaud au stade le plus jeune possible, par exemple oeuf, embryon ou foetus, ou animal nouveau-né ou en bas-âge, afin de réduire autant

que possible cette immunoreaction.

Avant la transplantation, l'animal peut être irradié avec un rayonnement X ou -, environ 200 à 600 rem, ou peut recevoir une injection d'un antiserum ou d'un immuno-suppresseur, afin de réduire l'immunoréaction au

niveau le plus bas possible.

Lorsqu'on utilise comme hôte un animal immunodé-

ficient comme rat nu ou souris nue, on peut transplanter

dans ces animaux, sans traitement préalable, toutes les li-

gnées cellulaires humaines mentionnées précédemment, et les

faire proliférer facilement avec moins de danger de provo-

quer une immunoréaction indésirable, car ces animaux pré-

sentent moins d'immunoréaction, même à l'état adulte.

On peut stabiliser la prolifération cellulaire et/ou augmenterla production de LK 2, par une succession de transplantations utilisant des animaux à sang chaud

semblables ou différents. Ces objectifs peuvent être at-

teints, par exemple en transplantant d'abord une lignée cellulaire humaine à un hamster, à l'y faire proliférer, puis à transplanter ces cellules humaines proliférées à

une souris nue. Dans ce cas, les transplantations succes-

sives peuvent s'effectuer avec un animal à sang chaud de

même classe ou ordre, aussi bien qu'avec ceux de même es-

pèce ou genre.

2572936'

Les cellules humaines peuvent être transplantées

en tout site de l'animal, dans la mesure o elles prolifè-

rent dans ce site: par exemple dans la cavité allantorque,

ou par voie intraveineuse, intramusculaire ou souscutanée.

Ou bien on fait proliférer les cellules humaines en les plaçant dans une chambre de diffusion classique de

forme et de dimension variables, munie de moyens convena-

bles pour empêcher la contamination par les cellules de l'animal, mais pour fournir aux cellules humaines le fluide

corporel nutritif de l'animal, par exemple membrane fil-

trante, ultrafiltre ou fibre creuse ayant une dimension de pore de l'ordre de 10-7 à 10-5 m; on incorpore par

exemple par voie intrapéritonéale cette chambre dans l'ani-

mal, et on laisse les cellules humaines proliférer dans la chambre grâce à l'apport du fluide corporel nutritif de

l'animal. De plus, la chambre de diffusion peut être pré-

vue pour être placée, par exemple, sur l'animal, de manière que le fluide nutritif puisse circuler librement autravers de la chambre. On peut observer la culture dans la chambre au cours de la prolifération cellulaire, par une fenêtre latérale transparente située sur les parois de la chambre, et/ou la chambre en soi peut être remplacée par intervalles

par une chambre fraîche, à la fois pour poursuivre la proli-

fération cellulaire sur la période de vie de l'animal sans le sacrifier, et pour augmenter beaucoup plus la production

cellulaire par animal. Comme du fait de l'absence de con-

tact direct entre les cellules humaines et les cellules ani-

males, cette chambre de diffusion entraîne beaucoup moins d'immunoréaction indésirable, on peut utiliser tout animal

à sang chaud facilement, sans traitement préalable pour ré-

duire l'immunoréaction, et l'on peut recueillir aisément à

partir de la chambre de diffusion les cellules humaines vi-

vantes ayant proliféré.

L'alimentation de l'animal peut s'effectuer de manière habituelle et aucune précaution particulière n'est

requise, même après la transplantation. La période nécessai-

re pour obtenir une prolifération cellulaire maximale est généralement de 1 à 10 semaines. Le nombre de cellules humaines ainsi obtenues est proche de 107 à 1012 cellules,

ou plus, par animal. Plus particulièrement, selon l'inven-

tion, les cellules humaines transplantées voient leur nom- bre multiplié par 102 à 107, ou plus, ce qui est 10 à 10o6 fois supérieur, ou même plus, à ce que l'on obtient par ensemencement et prolifération des cellules humaines sur un milieu de culture nutritif, in vitro. Cela est très

avantageux pour la production de LK 2.

Conformément à l'invention, on peut utiliser--

tout procédé dans la mesure o il permet d'induire la pro-

duction de LK 2 dans les cellules humaines proliférées.

Ces cellules sont exposées, dans l'animal utilisé comme hô-

te pour la prolifération cellulaire, à un inducteur de LK 2. Par exemple, une cellule humaine ayant proliféré en ascite en suspension, ou une cellule tumorale formée par exemple sous la peau, est directement exposée in vivo à un inducteur de LK 2 pour en déclencher la production, et le LK 2 accumulé est recueilli à partir de l'ascite, du serum et/ou de la tumeur, puis on purifie ce produit. Ou bien, on recueille les cellules humaines ayant proliféré,

à partir de l'animal, et puis on les expose in vitro à l'ac-

tion d'un inducteur de LK 2. Par exemple, les cellules hu-

maines ayant proliféré, obtenues par récolte de la suspen-

sion d'ascite, ou par extraction et désagrégation des mas-

ses tumorales formées par exemple sous la peau, sont mises

en suspension dans un milieu de culture nutritif, préalable-

ment chauffé à une température de l'ordre de 20 à 40 C, de manière à avoir une densité cellulaire voisine de 105 à 108 cellules/ml,et l'on expose in vitro à l'action d'un inducteur de LK 2, puis on recueille à partir de la culture

le LK 2 accumulé.

Lorsqu'on utilise une chambre de diffusion de ty-

pe classique, l'exposition des cellules humaines ayant pro-

liféré à l'action d'un inducteur de LK 2, s'effectue dans

lachambre, ou après récolte.

Les cellules humaines ainsi obtenues peuvent être cultivées in vitro pendant 1 à 4 jours supplémentaires, afin de contrôler le temps de génération, avant l'induction

de LK 2.

La production de LK 2 par animal peut être encore

augmentée par utilisation de l'un ou de plusieurs des pro-

cédés suivants:

(1) Procédé au cours duquel les cellules humaines a-

yant proliféré sont exposées à un inducteur de LK 2 dans

l'animal, qui a été utilisé comme hôte pour la proliféra-

tion cellulaire, puis sont récoltées à partir de certains sites de l'animal ou de la totalité de son corps, et sont

soumises à l'exposition in vitro à l'inducteur de LK 2.

(2) Procédé dans lequel les cellules humaines sont exposées à maintes reprises à l'action d'un inducteur de LK 2. (3) Procédé au cours duquel la chambre de diffusion; incorporée dans l'animal ou reliée à lui, est remplacée

par intervalles par une chambre fraîche.

Les inducteurs de LK 2 utilisables conformément

à l'invention sont des inducteurs d'interféron- o classi-

ques (inducteurs IFN-ie), tels que virus, acide nucléique

et nucléotide; et des inducteurs d'interferon- -classi-

ques (inducteurs IFN-) comme phytohémagglutinine, con-

canavaline A, phytolaque mitogène, lipopolysaccharide, en-

dotoxine, polysaccharide et bactéries. Les antigènes agis-

sent sur les cellules sensibilisées comme des inducteurs

de LK 2.

La production de LK 2 peut être augmentée par l'u-

tilisation combinée des inducteurs de IFN-D et IFN- Y, com-

me inducteur de LK 2. Il-se confirme que cette combinaison induit simultanément la production d'interferon spécifique à l'homme (HuIFN). Cela s'avère très avantageux lors de la

production en grande quantité, à faible coût et simultané-

ment, de deux ou plusieurs substances biologiquelaent ac-

tives, c'est-à-dire de HuIFN et de LK 2 d'une valeur ines-

timable, aussi bien que pour une utilisation beaucoup plus efficace des cellules humaines. LK 2 ainsi obtenu peut être recueilli par un ou

plusieurs modes opératoires de purification et/ou de sépa-

ration, par exemple relargage, dialyse, filtration, cen-

trifugation, concentration et/ou lyophilisation. Lorsqu'on désire une préparation encore plus pure de LK 2, on peut

obtenir une préparation très pure par les modes opératoi-

res décrits plus haut, en combinaison avec d'autres modes

opératoires classiques, par exemple adsorption et désorp-

tion avec échange d'ions, filtration sur gel, fraction-

nement au point isoélectrique, électrophorèse, chromato-

graphie par échange d'ions, chromatographie liquide à

grande performance, chromatographie sur colonne, et/ou chro-

matographie par affinité.

Les anticorps monoclonaux immobilisés, obtenus par liaison d'un anticorps monoclonal anti-LK 2, qui sera décrit ci-après, sur un support convenable insoluble dans reau, par exemple Sepharose activé au BrCN, un produit de Pharmacia Fine Chemical AB,peuvent être avantageusement utilisés pour accélérer et faciliter la purification de LK 2. Il se confirme que LK 2 ainsi obtenu a bien les

propriétés physico-chimiques mentionnées plus haut.

Il se confirme également que LK 2 n'exerce prati-

quement pas de cytolyse sur les cellules humaines normales, mais a des effets cytolytiques remarquables sur un certain

nombre de cellules tumorales humaines, ainsi que sur la li-

gnée de fibroblastoides de souris, L 929, pour tuer ces cellules. Ainsi, LK 2, sous forme de composition, convient pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des

maladies sensibles à LK 2, par exemple les tumeurs mali-

gnes, plus particulièrement de différentes tumeurs malignes 1 0

dont le traitement est jugé très difficile.

Conformément à une forme de réalisation de la

présente invention, les effets anti-oncotiques des pro-

duits chimiothérapeutiques peuvent être augmentés à l'aide d'un renforçateur renfermant LK 2 comme constituant actif. La dose des produits chimiothérapeutiques peut être réduite d'environ 1/2 à 1/1000, du fait que leur effet

anti-oncotique peut être très augmenté par le renforçateur.

De plus, l'utilisation de ce renforçateur élargit le spec-

tre tumoral de ces produits, et permet le traitement de tu-

meurs résistant aux drogues. Les produits chimiothérapeuti-

ques utilisables selon l'invention, sont constitués par e-

xemple par un ou plusieurs des produits suivants: agents d'alkylation comme melphalan, cyclophosphamide, ifosfamide,

phosphate sodique d'estramustine, busulfan, tosylate d'i-

morposulfan, biphényl-disulfonate-4,4' de N-méthyl dimesyl-

3,3' oxydipropyl-amine, carboquone, thio-TEPA, carmustine, chlorhydrate de nimustine, streptozocine, dacarbazine et pipobroman; antagonistes métaboliques comme methotrexate, florouracile, tegaful, carmoful, cytarabine, chlorhydrate

d'ancitabine, enocitabine, mercapto-6 purine, et thioino-

sine; antibiotiques anti-oncotiques comme doxorubicine,

daunorubicine, aclarubicine, bleomycine, peplomycine, mito-

mycine C, actynomycines D et C, chromomycine A3, mithramy-

cine, et néocarzinostatine; et alcaloides végétaux comme sulfate de vincristine, sulfate de vinblastine, sulfate

de vindesine et podophyllotoxine. Dans le cas de traite-

ment du cancer de la prostate ou de cancer du sein, il

peut être souhaitable d'utiliser en combinaison une ou plu-

sieurs hormones anti-oncotiques comme prednisolone, méthyl-

testostérone et oestrogène conjugué. Les conditions pour combiner ces produits chimiothérapeutiques et LK 2 doivent

être choisies de manière souhaitable, et ne sont pas limi-

tées.

Le procédé de production d'un anticorps monoclo-

nal,selon la présente invention, comprend les stades de: 1 1 immunisation d'un animal à sang chaud avec le LK 2, comme

antigène;isolation à partir du corps de l'animal des cel-

lules productrices d'anticorps; fusion de ces cellules

avec des cellules de myélome; sélection d'un clone capa-

ble de produire un anticorps spécifique de LK 2 à partir

des cellules d'hybridome résultant; prolifération du clo-

ne; et production par les cellules ayant proliféré de

l'anticorps monoclonal spécifique de LK 2.

L'immunisation peut être obtenue par injection, par exemple par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou

sous-cutanée, d'une solution, émulsion ou suspension a-

queuse de LK 2, en tant qu'antigène, à un animal à sang chaud convenable, par exemple poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin,cobaye, rat, hamster ou souris, suivie de l'alimentation pendant 3 jours ou plus, de l'animal, afin d'induire la production d'anticorps. On peut également utiliser comme antigène un produit conjugué de LK 2 et d'un saccharide, comme décrit

dans la publication de brevet japonais n 23 847/83. L'an-

tigène peut être injecté en une dose unique, ou éventuel-

* lement en 2 ou plusieurs dosages à des intervalles de

l'ordre de 3 à 30 jours.

Les cellules spléniques de l'animal immunisé, dans lequel la production d'anticorps a été induite, sont

fusionnées avec des cellules de myélome d'espèce sembla-

ble ou différente, au moyen d'un mode opératoire conve-

nable, par exemple ceux qui sont reportés par G. Kohler et coll. dans Nature, vol. 256, pp. 495-497 (1975)et Eur. J. Immunol. vol. 6, pp. 511519 (1976). Les cellules hybrides ainsi obtenues sont alors choisies et clonées, après quoi les clones sont cultivés in vitro ou in vivo, puis on recueille à partir de la culture résultante les

anticorps monoclonaux hautement spécifiques, accumulés.

Plus particulièrement, le mode opératoire in vivo est de

beaucoup préférable au mode in vitro, car le premier per-

met d'atteindre une prolifération bien plus élevée du clo-

ne, et une production plus forte de l'anticorps monoclonal,

sans utilisation de serum coûteux. Au cours du mode opéra-

toire in vivo, le clone prolifère en utilisant le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, d'espèce sem- blable ou différente de celle qui a été utilisée lors de l'immunisation, soit en le transplantant directement dans

l'animal, soit en l'ensemençant dans une chambre de dif-

fusion de type classique conçue pour recevoir le fluide

corporel nutritif de cet animal, et l'anticorps monoclo-

nal accumulé est recueilli à partir de fluides corporels comme ascite et serum. Autre possibilité, le clone,après prolifération in vivo, peut être cultivé sur un milieu

de culture dénué de serum pendant 1 à 5 jours supplémen-

taires, avant que l'on recueille l'anticorps monoclonal

accumulé à partir de la culture résultante.

Les anticorps monoclonaux ainsi obtenus peuvent être facilement récupérés, avec un ou plusieurs modes de séparation et/ou de purification, comme relargage, dialyse,

filtration, centrifugation et/ou lyophilisation. Lors-

qu'on souhaite une purification plus poussée, on peut ob-

tenir une préparation très pure en combinant les modes opé-

ratoires ci-dessus avec d'autres modes opératoires classi-

ques comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, fractionnement au point isoélectrique,

électrophorèse, chromatographie avec échange d'ions, chro-

matographie liquide à haute performance, chromatographie

sur colonne, et/ou chromatographie par affinité. Le rende-

ment de récupération de l'anticorps monoclonal peut être avantageusement amélioré grâce à l'utilisation d'un gel-de LK 2 immobilisé, obtenu par liaison de LK 2 très pur sur un support insoluble dans leau, convenable, par exemple

Sepharose activé par BrCN.

L'anticorps monoclonal obtenu conform5ment à l'invention est avantageusement utilisable comme coordinat

pour la chromatographie par affinité orientée vers la pro-

duction de LK 2, aussi bien que pour le diagnostic de dif-

férentes maladies humaines, en raison de sa spécificité

envers LK 2, qui endommage les tumeurs malignes.

Les titres de LK 2 sont déterminés grâce à l'utilisation de cellules KB, ou de cellules L 929, prises comme cellules cibles: lorsqu'on utilise les cellules KB, l'activité cytostatique sur ces cellules est déterminée selon le procédé décrit dans Cancer Chemotherapy Reports, partie 3, Vol. 3, N 2, septembre (1972); lorsqu'on utilise

les cellules L 929, l'activité cytotoxique sur ces cellu-

les en présence d'Actinomycine D est déterminée par le procédé décrit dans Lymphokines, Vol. 2, pp.245-249, "Tumor Necrosis Factor", édité par E. Pick, publié par Academic Press, Inc. (1981), avec une légère modification. Dans la

présente description, sauf indication contraire, on utilise

le dernier procédé avec cellules L 929.

Les titres de HuIFN sont déterminés par le pro-

cédé classique de réduction sur plaque, utilisant des cel-

lules FL d'origine amniotique humaine, décrit dans Protein,

Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 20, N 6, pp. 616-643 (1975).

Les titres d'hémagglutination sont déterminés se-

lon le procédé reporté par S.E. Salk, The Journal of Immuno-

logy, Vol. 49, pp.87-98 (1944) avec une légère modifica-

tion.

Les expérimentations suivantes illustrent plus

en détails la présente invention.

EXPERIMENTATION A-1

Préparation de LK-2 partiellement purifié

On injecte à des hamsters nouveau-nés un anti-

serum classique préparé à partir de lapin afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une liqnée de lymphoblastoides humains, BALL-1, et on les

alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. Les mas-

ses tumorales, formées sous la peau, sont extraites, hâ-

chées et désagrégées dans du serum physiologique. La sus-

pension de cellules ainsi obtenue est alors rincée avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,2) additionné de sérum, et on remet en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, afin d'avoir une densité cellulaire de l'ordre de 2x10o6 cellules/ml. On ajoute à cette suspension du virus de Sendai (environ 400 titres d'hémagglutination/ml), et l'on met à incuber à 37 C pendant 24 heures pour induire la production de LK 2. La culture est alors centrifugée

vers 4 C et 1 000 g et le précipité résultant est enlevé.

La partie surnageante ainsi obtenue est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01 M de tampon phosphate

(pH 7,2) pendant 20 heures, et est traitée avec une mem-

brane filtrante. On fait alors passer le filtrat au tra-

vers d'une colonne d'un anticorps anti-HuIFN immobilisé, et l'on collecte la fraction non adsorbée. A partir de cette fraction on récupère une fraction active, au moyen de chromatoconcentration,on la concentre et la lyophilise

pour obtenir un produit pulvérulent doté d'activité LK 2.

L'activité spécifique de cette poudre est de l'or-

dre de 106 unités/mg de protéine. Le rendement en LK 2 est

de l'ordre de 2 x 107 unités par hamster.

EXPERIMENTATION A-2

Préparation d'anticorps anti-LK-2 Une préparation de LK-2, obtenue par le procédé

décrit dans l'Expérimentation A-1,est dissoute dans du sé-

rum physiologique afin d'avoir une concentration de l'or-

dre de 0,05% de protéine en poids/volume, et on ajoute à cette solution le même volume d'adjuvant complet de Freund.

Des souris sont immunisées par injection sous-cutanée de portions de 0,2 ml du mélange ainsi obtenu, avec rappel 7 jours après la première injection. Après induction de

la production d'anticorps anti-LK-2 dans les cellules pro-

ductrices d'anticorps des animaux, on extrait les rates de

ces derniers, les hâche, les désagrège, et les met en sus-

pension conjointement avec une lignée cellulaire de myé-

lome de souris, P3-X63-Ag8, en provenance de Flow Labora-

tories Inc. USA, dans du milieu essentiel minimal de Eagle dépourvu de serum (pH 7,2) renfermant 50% poids/,volume de polyéthylène glycol 1000, préchauffé à 37 C, afin d'ob- tenir des densités cellulaires respectives de 104 cellules

/ml, puis on laisse reposer 5 minutes le mélange résultant.

Ce mélange est ensuite dilué 20 fois dans une préparation

fraîche du même milieu de culture, et les cellules d'hy-

bridome capables de se développer sur le milieu renfermant hypoxanthine, aminoptérine et thymidine, sont recueillies selon le procédé reporté par R.L. Davidson et P.S. Gerald dans Somatic Cell Genetics, Vol. 2, N 2, pp. 175-176 (1976) pour cloner les cellules d'hybridome capables de produire l'anticorps anti-LK 2. On transplante dans des souris,par voie intrapéritonéale, les cellules d'hybridome clonées à la dose d'environ 106 cellules par souris, on les alimente

pendant 2 semaines avant de les sacrifier. Les fluides cor-

porels des animaux, comme fluide-ascitique et sang, sont

recueillis, centrifugés, et relargués avec du sulfate d'am-

monium, puis on collecte les fractions déposées pour des saturations de 30-50%. Ces fractions sont dialysées, et soumises à une chromatographie par affinité utilisant un gel d'anticorps anti-LK 2 immobilisé, obtenu par réaction d'un spécimen de LK-2, préparé par le procédé décrit dans l'Expérimentation A-1, avec du Sepharose activé par BrCN,

à température ambiante, pour obtenir une fraction d'anti-

corps anti-LK 2, qui est ensuite dialysée, concentrée et lyophilisée. Le produit pulvérulent résultant présente

une neutralisation immunologiquement spécifique de l'acti-

vité cytotoxique de LK 2.

La stabilité de l'anticorps monoclonal en solu-

tion aqueuse est étudiée par détermination des activités neutralisantes résiduelles, après mise en incubation dans les conditions prescrites: lorsqu'on opère à pH 7,2 et à différentes températures pendant 30 minutes, à 60 C il reste au moins 80% de l'activité, mais à 70 C il y a perte

de plus de 90%. Après mise en incubation à 4 C et diffé-

rents pH Pendant 16 heures, l'activité reste stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et 11, mais à pH 2

la perte d'activité est d'au moins 90%.

Lorsqu'on étudie les propriétés de l'anticorps monoclonal, on constate qu'il ne résiste pas au mercapto-2

éthanol, et provoque une réaction spécifique antigène-anti-

corps avec l'anticorps immunoglobuline M anti-souris. Ainsi, le présent anticorps monoclonal se classe-t-il dans le groupe des anticorps immunoglobuline M.

EXPERIMENTATION A-3

Préparation et propriétés physicochimiques de LK 2 très pur Un spécimen de LK 2 partiellement purifié, obtenu

par le procédé décrit dans l'Expérimentation A-1, est sou-

mis à une chromatographie par affinité au moyen d'un gel d'anticorps monoclonal immobilisé, préparé par le procédé décrit dans l'Expérimentation A-2, et l'on recueille des fractions de LK 2 qui sont ensuite dialysées, concentrées

et lyophilisées.

Le résultat est une préparation très pure de LK 2 ayant une activité spécifique de l'ordre de 10 unités/mg

de protéine.

Les propriétés physicochimiques de LK 2 sont étu-

diées à partir de cette préparation.

1) Poids moléculaire: Le poids moléculaire de LK 2 est déterminé par les procédés électrophorétiques utilisant du gel de SDS-polyacrylamide, décrits par K. Weber et M.Osborn, J.Biol.Chem., Vol. 244, p. 4 406 (1969). Les colonnes de gel à 10% d'acrylamide

sont chargées avec des portions d'environ 10 gg de la pré-

paration,en présence de 0,1% de SDS, et l'on met sous char-

ge de 8 mA par colonne pendant 4 heures, afin de réaliser l'électrophorèse. Après extraction et dosage ultérieur de LK 2 des fractions actives, le poids moléculaire de LK 2

est de 20 000 - 2 000 daltons.

2) Point isoélectrique:

Une électroconcentration à 25W de la préparation, de 2 heu-

res, utilisant "AMPHOLINE PAGPLATE" (pH = 3,5 à 9,5), un gel fabriqué pour l'électroconcentration par LKB-Produkter

AB, Suède, donne un point isoélectrique pI de 6,2 - 0,3.

3) Mobilité électrophorétique:

Selon le procédé décrit par B.J. Davis, Ann. N.Y. Acad.Sci.

Vol. 121, page 404 (1964), on charge sur des colonnes de gel d'acrylamide à 7,5% des fractions d'environ 10 gg de la préparation, on soumet à une électrophorèse à pH 8,3 et 3 mA par colonne pendant 2 heures, on extrait et on dose mobilt. l'activité de LK-2 pour obtenir une/e ectrophorétique Rf

de 0,29 - 0,02.

4) Spectre d'absorption UV: Après analyse du spectre UV de la préparation à l'aide d'un spectromètre UV-250, fabriqué par Shimadzu Seisakusho KK, Japon, on observe une absorption maximale au voisinage de

280 nm.

) Solubilité dans les solvants: Le produit est soluble dans l'eau, le sérum physiologique et la solution tampon phosphate; faiblement ou pas soluble

dans l'oxyde de diéthyle, l'acétate d'éthyle et le chloro-

forme.

6) Réaction colorée:

Elle est protéine -positive par le procédé de Lowry et ce-

lui de microburet; sucre-positive par le procédé au phénol-

acide sulfurique et celui à l'anthrone-acide sulfurique.

7) Activité biologique: On observe une activité cytotoxique sur les cellules L 929 et une activité cytostatique sur les cellules KB. On ne

remarque pas d'activité HuIFN marquée.

8) Stabilité en solution aqueuse: a) Stabilité à la chaleur: On met à incuber à pH 7,2, pendant 30 minutes, et à différentes températures, des fractions d'environ 1x105 unités/ml de la préparation, et l'on détermine les activités cytotoxiques résiduelles. On constate que LK 2 est stable jusqu'à 60 C. b) Stabilité au pH: Des fractions de 0,1 ml de la préparation (1x106 unités/ml) sont additionnées avec 1 ml de solution tampon de différentes valeurs de pH, c'est-à-dire de tampon de Mcllvaine à pH 2 à 7; tampon phosphate, pH 7 à 8; tampon

glycine-NaOH, pH 8 à 11, et l'on met à incuber à 4 C pen-

dant 16 heures. Puis on ajuste à pH 7,2 avec du tampon phos-

phate 0,05 M, 0,1 ml du mélange incubé, et l'on détermine l'activité résiduelle. On constate que LK 2 est stable dans

l'intervalle de pH compris entre 4 et 11.

c) Stabilité à la DISPASE: A environ 1 x 105 unités/ml de la préparation, on ajoute de la "DISPASE", une protéase de microorganisme Bacillus, commercialisée par Godo Shusei Co., Ltd. Japon, de manière à donner une activité enzymatique de 100 unités/

ml, et l'on fait incuber ce mélange à pH 7,2 et à 37 C pen-

dant 2 heures. Au cours de l'incubation, on prélève pério-

diquement de petites portions du mélange et on les addi-

tionne d'albumine de serum de veau de manière à avoir une

concentration de 1% en poids/volume, afin d'arrêter la ré-

action enzymatique. Lors du dosage des activités LK 2 dans les échantillons, on constate que LK 2 est sensible au traitement par la dispase et perd son activité à mesure que

se déroule la réaction enzymatique.

9) Stabilité à la cryoconservation: La préparation de LK 2 est entreposée en solution aqueuse à -10 C et pH 7,2 pendant 1 mois,est-dégelée et dosée. On

ne constate pas de diminution d'activité.

Il ressort de ce qui précède que LK 2 a des pro-

priétés physico-chimiques différentes de celles des lympho-

kines connues comme LT, TNF ou IFN. De même, l'anticorps monoclonal selon l'invention est nouveau, car il présente

une neutralisation immunologiquement spécifique de l'acti-

vité cytotoxique du nouveau lymphokine LK 2.

EXPERIMENTATION B-1

Action cytostatique sur les cellules des tumeurs malignes

L'effet cytostatique,exercé par LK 2 sur plu-

sieurs cellules humaines, a été étudié en utilisant les préparations de ce produit obtenues par le procédé décrit

dans les expérimentations A-1 et A-3.

106 cellules de l'une des lignées humaines, énu-

mérées dans le tableau 1, sont mises en suspension dans 1 ml de milieu nutritif classique additionné de sérum foetal de veau; on cultive pendant 1 jour, y ajoute 0,1 ml de serum physiologique renfermant 50 ou 500 unités de préparation de LK 2, préparée par le procédé décrit dans

l'Expérimentation A-1 ou A-3, et met à incuber à 37 C pen-

dant 2 jours. Lorsque la culture est achevée, les cellules viables sont colorées avec du rouge neutre, un type d'agent colorant, selon le procédé décrit dans Applied Microbiology Vol. 22, N 4, pp.671-677 (1971), et l'agent colorant est élué au moyen d'une solution d'éthanol acidifié. Ensuite, le nombre de cellules viables est déterminé par mesure de la capacité d'absorption de l'éluat, pour une longueur

d'onde de 540 nm.

On utilise comme témoin 0,1 ml de serum physio-

logique exempt de LK 2.

Le pourcentage d'inhibition de croissance est calculé grâce à l'équation suivante: Inhibition de croissance (%) = Capacité d'absorption avec LK-2 (1 -) x 100 Capacité d'absorption du témoin Les résultats sont indiqués dans le tableau I.

TABLEAU I

LK-2 de l'Expéri- LK-2 de l'Expéri-

Nom de la lignée Source de la mentation A-1 mentation A-3 cellulaire lignée cellulaire unités 500 unités 50 unités 500 unités HEpo2* Carcinome épidermoide du larynx 33 40 46 68 PC-8* Carcinome du poumon 26 37 56 80 MKN 7* Cancer de l'estomac 35 41 60 77 HLE* Carcinome du foie 32 38 55 71 HeLa* Carcinome épitheloide du col de l'utérus 24 35 46 68 L-132** Poumon embryonnaire 3 -2 1 -3 Foie de Chang** Foie 2 -3 -4 -1 Coeur de Giradi** Coeur -2 2 -1 -2 Note: *)indique les lignées cellulaires humaines provenant de tumeurs malignes;

**)celles d'origines normales.

ru Ces résultats confirment que LK 2 n'affecte guère

les cellules normales, mais qu'il inhibe fortement la crois-

sance de différentes cellules de tumeurs malignes. Il se confirme également que l'action d'un LK 2 partiellement purifié (A-1) est bien comparable à celle du produit très

purifié (A-3).

EXPERIMENTATION B-2

Un groupe de souris BALB/c reçoivent un trans-

plant de cellules Meth A, provenant de sarcome de souris.

A partir du dixième jour après la transplantation, on in-

jecte par voie sous-cutanée aux souris, du serum physiolo-

gique renfermant une préparation de LK 2, obtenu par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3, à raison de ou 1 000 unités/kg et par jour, pendant 15 jours. Ces souris sont ensuite sacrifiées, et les masses tumorales

formées chez les animaux sont mesurées.

Les résultats figurent dans le tableau II.

TABLEAU II

Traitement Dosage/jour Masse tumorale (unités/kg) (g) Témoin 0 5,7+0,7

100 3,3-0,4*

LK 2

1000 2,8-0,4*

Note: *) indique les résultats statistiquement signi-

ficatifs par rapport au témoin de valeur 5%.

EXPERIMENTATION B-3

Des groupes de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés dans la région dorsale, de petits

fragments de tissu de cancer du sein humain.

Lorsque la croissance des masses tumorales at-

teint environ 200 mm3 dans le corps des animaux, on in-

jecte par voie intraveineuse du serum physiologique ren-

fermant une préparation de LK 2, obtenue par le procédé décrit dans l'Expérimentation A-1 ou A-3, une fois par jour à raison de 100 ou de 1000 unités/kg, pendant 20

jours. Puis on sacrifie les animaux et les tumeurs résul-

tantes sont pesées.

Les résultats figurent dans le tableau III.

TABLEAU III

Traitement Dosage quotidien Masse tumorale (unités/kg) (g) Témoin 0 10,8 1,0

- 100 7,3 0,7*

LK-2 de l'Expérimentation +

A-1 1 000 6,8 - 0,5*

LK-2 de 100 6,4 - 0,5* LK-2 de l'Expérimentation

A-3 1 000 5,6 - 0,7*

note: *) indique les résultats statistiquement signifi-

catifs par rapport au témoin de valeur 5%.

EXPERIMENTATION B-4

Un groupe de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés dans la région dorsale, de petits fragments de tissu de cancer du sein humain, comme dans l'expérimentation B-3. Lorsque la croissance des masses

tumorales atteint environ 200 mm3 dans le corps des ani-

maux, on injecte par voie intraveineuse du serum physio-

logique renfermant une préparation de LK 2, obtenue par le

procédé décrit dans l'Expérimentation A-3, et/ou une pré-

paration de HuIFN- <, une fois par jour pendant 20 jours.

Puis on sacrifie les animaux et les tumeurs résultantes

sont pesées. On utilise comme témoin un sérum physiologi-

que exempt de LK 2 et d'HuIFN- o.

Les résultats sont reportés dans le tableau IV.

Il enressort clairement que l'utilisation com-

binée de LK 2 et de HuIFN- a augmente considérablement

l'effet anti-oncotique de HuIFN-X.

TABLEAU IV

Traitement Dosage quotidien Masse uné/gtumorale (unités/kg). (g) Témoin O0 10,8 + 1,0

LK 2 100 6,4 - 0,5*

HuIFN-oi 1000 6,7 - 0,5*

LK 2 100 5,3 - 0,4*

plus HuIFN- 1000

Note: *) indique les résultats statistiquement signifi-

catifs par rapport au témoin de valeur 5%.

EXPERIMENTATION B-5

Un essai de toxicité aiguë, au cours duquel on

administre à un groupe de souris âgées de 20 jours une pré-

paration de LK 2, obtenue par le procédé décrit dans l'ex-

périmentation A-3, confirme que la toxicité de la prépara-

tion est extrêmement faible, c'est-à-dire que DL50 est

égale ou supérieure à 10 unités, par injection intrapéri-

tonéale.

Ainsi qu'il ressort des expérimentations ci-

dessus, le LK 2 exerce un fort effet cytostatique sur les tumeurs malignes in vitro aussi bien qu'in vivo. En outre, l'administration de LK 2 est sans risque eu égard au fait

qu'un dosage élevé n'affecte pratiquement pas les cellu-

les normales, alors qu'un faible dosage agit remarquable-

ment sur les cellules tumorales.

Le dosage efficace du présent LK-2 se situe gé-

néralement dans l'intervalle de 5 à 500 000 000 unités/

jour pour un adulte; plus particulièrement, pour l'admi-

* nistration locale, par exemple sous forme de collyre ou d'injection locale, le dosage se situe entre 5 et 10 000 000 unités/jour; pour l'administration percutanée ou permucosale, par exemple sous forme d'onguent ou de suppositoire, entre 10 et 50 000 000 unités/jour; pour l'administration systémique, par exemple par injection intraveineuse ou intramusculaire, entre 50 et 100 000 000 unités/jour; et pour l'administration orale, entre 500 et 500 000 000 unités/jour, mais ces dosages sont très

variables selon les symptômes dupatient et les indica-

tions. Bien que LK 2 puisse être préparé sous forme de médicament de manière habituelle après mélange avec support, base et/ou véhicule convenable, la teneur en

LK 2 doit être d'au moins 5 unités/g, eu égard à la toxi-

cité, au dosage actif et à l'inocuité.

La forme et le conditionnement des agents prophy-

lactiques et/ou thérapeutiques,pour les maladies sensibles à LK 2,peuvent être librement choisies: par exemple pour

l'administration orale, ils peuvent être façonnés en pré-

parations pour usage entérique, par exemple capsule, com-

primé ou poudre; pour l'administration rectale, supposi-

toire; pour injection, ils peuvent être par exemple pré-

parés sous forme de produit lyophilisé qui est dissous,

avant l'usage, avec de l'eau distillée pour donner une so-

lution injectable; ils peuvent également se présenter sous

forme d'onguent, de collyre ou de "collunarium".

Lors du traitement d'un patient à tumeur maligne, par exemple, on peut traiter in vitro un fragment de tissu tumoral provenant de ce patient, avec LK 2 afin d'augmenter

l'immunogénicité de ce fragment, que l'on administre au pa-

tient afin d'obtenir un traitement beaucoup plus efficace

de la tumeur maligne.

Les utilisations combinées de LK 2 avec des anti-

oncotiques, par exemple, des lymphokines comme HuIFN, TNF,

LT et TGCF (facteur de croissance de cellule-T); des sac-

charides anti-oncotiques comme r -glucane-1,3, arabinoman-

nane, lipopolysaccharide, OK-432 (picibanil), PSK (krestin)

et lentinane; des antagonistes métaboliques comme métho-

trexate et fluorouracile; et des antibiotiques anti-onco-

tiques comme doxorubicine et mitomycine C, sont très avan-

tageuses car elles augmentent considérablement l'effet

anti-oncotique de LK 2.

Plus particulièrement, est éclairci ci-après la propriété de LK 2 d'augmenter l'effet anti-oncotique des

produits chimiothérapeutiques.

EXPERIMENTATION C -1

Augmentation de l'effet anti-oncotique des produits chimiothérapeutiques par LK 2 Cet effet est étudié sur des cellules de tumeurs

malignes. On ensemence 106 cellules de tumeur maligne hu-

maine sur 1 ml d'un milieu de culture nutritif, de type classique, additionné de serum foetal de veau, et l'on cultive pendant 1 jour. Puis on ajoute à cette culture 0,1 ml de sérum physiologique renfermant 100 unités d'un

échantillon de LK 2, préparé par le procédé de l'Expéri-

mentation A-3, et/ou un produit chimiothérapeutique, et

l'on cultive pendant 2 jours supplémentaires à 37 C.

Comme témoin, on utilise un serum physiologique

exempt de LK 2 et de produit chimiothérapeutique.

Lorsque la culture est terminée, on compte le

nombre de cellules viables selon le procédé de l'Expérimen-

tation B-1, et l'on détermine le pourcentage d'inhibition

de croissance.

Les concentrations des produits chimiothérapeu-

tiques essayés sont comme suit: chlorhydrate de nimustine (ACNU), 1 x 10 g/ml de culture; florouracile (5-FU), 1,5 x 10-8 g/ml de culture; doxorubicine (ADM), 1 x 10 10g/ml

de culture; mitomycine C (MMC), 2,5 x 10-9 g/ml de cul-

ture; et sulfate de vincristine (VCR), 1,5 x 1010 g/ml

de culture.

Les résultats sont reportés dans le tableau V. Ils montrent clairement que LK 2 augmente considérablement

l'effet anti-oncotique des produits chimiothérapeutiques.

(Voir Tableau V page suivante.) k

ZS \\

TABLEAU V

Néant ACNU 5-FU ADM MMC VCR Lignée cellulaire

_+ _ + -_ + _ + - +

HEpe2 52 4 67 8 80 13 70 10 72 5 66 (carcinome épidermoide du larynx)

PC-8 62 2 71 10 85 6 71 5 68 8 72

(carcinome du poumon)

MKN 7 62 4 73 6 77 5 69 3 73 6 70

(cancer de l'estomac)

HLE 57 5 75 8 81 7 73 12 74 10 69

(carcinome du foie) Hela 51 5 71 12 69 7 62 7 61 10 63 (carcinome épithéloide du col de l'utérus) Note: +) avec produit chimiothérapeutique, -) sans produit chimiothérapeutique; et les valeurs indiquent le pourcentage d'inhibition de croissance des cellules tumorales. -'J o

EXPERIMENTATION C-2

Un groupe de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés dans la région dorsale, de petits

fragments de tissu de cancer du sein humain.

Lorsque la croissance des masses tumorales at- teint environ 200 mm3 dans le corps des animaux, on injecte par voie intraveineuse du serum physiologique renfermant une préparation de LK 2, obtenue par le procédé décrit

dans l'Expérimentation A-3 et/ou un produit chimiothérapeu-

tique, une fois par jour pendant 20 jours. Puis on sacrifie

les animaux et les masses tumorales résultantes sont pesées.

On utilise comme témoin du serum physiologique exempt de

LK 2 et de produits chimiothérapeutiques.

Les résultats figurent dans le tableau VI. Il en ressort clairement que LK 2 augmente considérablement l'effet anti-oncotique des produits chimiothérapeutiques,

même in vivo.

TABLEAU VI

Traitement Dosage quotidien Masse tumorale (g) Témoin 0 10,8 - 1,0 + LK 2 100 unités / kg 6,4 - 0,5* MMC 1 mg / kg 5,1 0,4* LK 2 100 unités / kg 48 04* plus MMC 0,1 mg / kg Note: *) indique les résultats statistiquenent significatifs par

rapport au témoin de valeur 5%.

Les preuves mentionnées ci-dessus confirment qu'une combinaison d'un produit chimiothérapeutique avec

LK 2 aboutit à un effet anti-oncotique supérieur.

L'utilisation de LK 2 comme renforçateur des produits chimiothérapeutiques réduit considérablement dans ia pratique la concentration de ces derniers, empêche la

manifestation d'effets secondaires, et élargit leurs spec-

tres tumoraux.

Le renforçateur renfermant LK 2 selon l'inven-

tion, qui présente une activité de renforcement de l'effet anti-oncotique quand il est utilisé conjointement avec des produits chimiothérapeutiques, est mélangé avec un de ces produits avant d'être administré avec lui, par une seule voie. Ou bien, on peut administrer d'abord le renforçateur ou le produit chimiothérapeutique, puis l'autre produit,

par une voie identique ou différente.

Les exemples suivants A, B et C illustrent

respectivement la production de LK 2, des compositions phar-

maceutiques renfermant LK 2 et l'anticorps monoclonal spé-

cifique de LK 2.

EXEMPLE A-1

Une ligne humaine de lymphoblastoides, BALL-1, est ensemencée sur un milieu essentiel minimal de Eagle (pH

7,4) additionné de 20% de serum foetal de veau, et est cul-

tivée in vitro,en suspension à 37 C, de manière habituelle.

Les cellules humaines ayant proliféré sont alors rincées avec du milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,4) exempt

de serum, et sont remises en suspension dans une prépara-

tion fraîche du même milieu de culture, de façon à avoir

une densité cellulaire de 1 x 10 cellules/ml. Cette sus-

pension cellulaire est additionnée de virus de Sendai à la dose d'environ 1 000 titres d'hémagglutination/ml, et l'on met à incuber à 38 C pendant 1 jour afin d'induire la

production de LK 2. Après centrifugation de la culture ré-

sultante à 4 C et 1 000 xg, environ, la partie surnageante est dialysée contre du serum physiologique renfermant 0,01M de tampon phosphate (pH 7, 2) pendant 15 heures, et l'on traite avec une membrane filtrante. On fait ensuite passer le filtrat au travers d'une colonne d'anticorps

anti-LK 2, comme dans l'Expérimentation A-1, et la frac-

tion non adsorbée est purifiée comme dans l'Expérimentation A-3, au moyen d'une chromatographie par affinité utilisant

une colonne de gel d'anticorps anti-LK 2, puis l'on concen-

tre afin d'obtenir un concentré ayant une activité spécifi-

que LK 2 d'environ 109 unités/mg de protéine.

Le rendement est de l'ordre de 1,5 x 106 uni-

tés/litre de suspension de cellules induites.

EXEMPLES A-2

On injecte à des hamsters nouveau-nés un

antiserum classique, préparé à partir de lapin, afin d'af-

faiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-

cutanée une lignée de lymphoblastoides humains, BALL-1, et

on les nourrit pendant 3 semaines de manière habituelle.

Les masses tumorales, environ 15 g chaque, formées sous la peau des animaux, sont extraites, hâchées et désagrégées dans du serum physiologique. Après rinçage avec du milieu

RPMI 1640 exempt de serum (pH 7,2) les cellules ayant pro-

liféré sont remises en suspension dans une préparation

fraîche du même milieu de culture, afin d'obtenir une den-

sité cellulaire de l'ordre de 5 x 106 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée de virus de Sendai et d'endotoxine de E. Coli, à raison respectivement de

1 000 titres d'hémagglutination/ml et de 10 gg/ml, envi-

ron, et l'on met à incuber à 37 C pendant 1 jour, pour in-

duire la production de LK 2. Après centrifugation de la

culture à 4 C et 1000 xg, environ, pour éliminer le sédi-

ment, la partie surnageante est dialysée contre du serum physiologique renfermant 0,01 M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 21 heures, et est taitée avec une membrane

filtrante. Le filtrat est purifié avec une colonne d'anti-

corps, comme dans l'exemple A-1, et la solution d'éluat

est concentrée et lyophilisée pour donner un produit pul-

vérulent ayant une activité spécifique LK 2 de l'ordre de

109 unités/mg de protéine.

Le rendement est voisin de 3,2 x 107 unités.

EXEMPLE A-3

On transplante dans des souris nues adultes, par voie intrapéritonéale, une lignée de lymphoblastoldes

humains, TALL-1,on les alimente de manière habituelle pen-

dant 5 semaines, leur injecte par voie intrapéritonéale du virus de la maladie de Newcastle (environ 3 000 titres d'hémagglutination par souris nue) qui a été au préalable

pratiquement inactivé par irradiation aux UV, et les sacri-

fie 24 heures après cette injection, puis on recueille

leurs fluides ascitiques. Ces fluides sont purifiés, con-

centrés et lyophilisés comme dans l'exemple A-2, pour don-

ner un produit pulvérulent possédant l'activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 3,5 x 106 unités

/souris nue.

EXEMPLE A-4

Des souris adultes sont irradiées avec envi-

ron 400 rem de rayons-X afin d'affaiblir leur immunoréac-

tion, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoides humains, Mono-1, et on les alimente de

manière habituelle pendant 3 semaines. Les masses tumora-

les, environ 10 g chaque, formées sous la peau des animaux,

sont extraites, et désagrégées comme dans l'exemple A-2.

Les cellules humaines ainsi obtenues sont mises en suspen-

sion comme dans l'exemple A-2, après quoi la suspension cellulaire résultante est additionnée de virus de Sendai et de concanavaline A, aux doses respectives de 500 litres

d'hémagglutination/ml et de 0,8 gg/ml, et l'on met à incu-

ber à 37 C pendant 1 jour pour induire la production de LK 2. Cette culture est ensuite purifiée, concentrée et

lyophilisée comme dans l'exemple A-2, pour donner une pou-

dre possédant une activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 2 x 107 unités/ souris.

EXEMPLE A-5

On transplante,dans des hamsters nouveau-nés, une lignée de lymphoblastoides humains, Namalwa (ATCC CRL 1432), comme dans l'exemple A2, et on les alimente de

manière habituelle pendant 4 semaines. Les masses tumora-

les, environ 20 g chaque, formées sous la peau des ani-

maux, sont extraites et désagrégées pour donner une sus-

pension cellulaire ayant une densité de l'ordre de 3 x 10 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est addition-

née de virus de Sendai à raison de 1 000 titres d'hémagglu-

tination/ml, et l'on met à incuber à 36 C pendant 2 jours

pour induire la production de LK 2. Cette culture est pu-

rifiée et concentrée comme dans l'exemple A-1, pour donner

un concentré possédant l'activité LK 2 Le rendement est de l'ordre de 2,2 x 107 uni-

tés/hamster.

EXEMPLE A-6

Une lignée de lymphoblastoides humains, NALL-1, est mise en suspension dans du serum physiologique, et est placée dans une chambre de diffusion cylindrique de 10 ml

environ, en matière plastique, munie d'une membrane fil-

trante ayant une dimension de pore nominale d'environ 0,5g.

Cette chambre est incluse par voie intrapéritonéale dans un rat adulte, et l'animal est nourri de manière habituelle

pendant 4 semaines. Après enlèvement de la chambre, on cons-

tate que la densité cellulaire dans celle-ci est de l'ordre de 5 x 108 cellules/ml, ce qui est environ 102 fois, ou

plus, supérieur à ce que l'on obtient dans le cas d'une pro-

lifération in vitro dars un incubateur à C02 utilisant un milieu de culture nutritif. Ces cellules humaines sont mises en suspension dans un milieu de culture semblable à celui de l'exemple A-2, on y ajoute du virus de la maladie de Newcastle (environ 500 titres d'hémagglutination/ml) préalablement inactivé par irradiation aux UV, et de la

phytohémagglutinine (environ 50 gg/ml), et l'on met à in-

cuber à 37 C pendant un jour pour induire la production de

LK 2. Cette culture est ensuite purifiée, concentrée et lyo-

philisée nomme dans l'exemple A-2 pour donner une poudre

possédant l'activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 8 x 106 unités/ rat.

EXEMPLE A-7

Une lignée de lymphoblastoïdes humains, CCRF-

CEM (ATCC CCL 119),est ensemencée dans les cavités allan- toilques d'oeufs embryonnés qui ont été mis à incuber à 37 C pendant 5 jours,et ces oeufs sont remis à incuber à la même

température pendant une semaine supplémentaire. Les cellu-

les humaines ayant proliféré sont recueillies à partir des oeufs, et mises en suspension comme dans l'exemple A-1 de

manière à donner une densité cellulaire de 5 x 106 cellu-

les/ml. Cette suspension cellulaire est alors additionnée de virus de Sendal (environ 500 titres d'hémagglutination/ ml) et mise à incuber à 37 C pendant un jour, pour induire la production de LK 2. La culture résultante est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2, pour donner une

poudre possédant l'activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 7 x 105 unités

pour 10 oeufs embryonnés.

EXEMPLE B -1

Injection 500 000 unités de specimen de LK 2, préparées

dans l'exemple 1-2, sont dissous dans 200 ml de serum phy-

siologique, et on filtre dans des conditions stériles à l'aide d'une membrane filtrante. Des portions de 2 mi de

ce filtrat sont réparties dans des fioles de verre stéri-

lisées, sont lyophilisées et on scelle ces fioles pour ob-

tenir un produit injectable en poudre.

Ce produit injectable est avantaqeusement uti-

lisable seul, ou comme renforçateur en combinaison avec

un produit chimiothérapeutique comme melphalan, méthotre-

xate ou doxorubicine, pour le traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon, du carcinome du foie et de

la leucémie.

EXEMPLE B-2

Injection Un produit injectable en poudre est préparé comme dans l'exemple B-1, mais avec dissolution dans 200ml de serum physiologique, de 3 x 108 unités de HuIFN-4 pro-

venant de cellules de lymphoblastolde humain, conjointe-

ment avec 5 x 105 unités de LK 2.

Ce produit injectable est avantageusement utili-

sable seul, ou comme renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeutique comme tegafur, mitomycine C ou sulfate de vincristine, pour le traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon, du carcinome du foie, et de la leucémie, et son efficacité thérapeutique est supérieure

à celle du produit injectable de l'exemple B-1.

EXEMPLE B-3

Onguent Le spécimen de LK 2, préparé dans l'exemple A-3, est pétri avec une quantité minimale de paraffine liquide,

jusqu'à homogénéité. Ce mélange est alors additionné de va-

seline blanche de manière habituelle, pour obtenir un on-

guent ayant une teneur en LK 2 de 20 000 unités/g.

Cet onguent est avantageusement utilisable seul, ou comme

renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeu-

tique comme cyclophosphamide, fluorouracile ou sulfate de vincristine, pour le traitement du carcinome de la peau,

du cancer du sein et de la maladie de Hodgkin.

EXEMPLE B-4

Collyre Un mélange de 800 ml d'eau distillée, 5 ml de -phényléthanol et 20 000 000 unités de spécimen de LK 2, préparé dans l'exemple A-4, est mélangé avec du chlorure de sodium dans une quantité supplémentaire d'eau distillée,

afin d'obtenir 1 000 ml de solution isotonique.

Cette solution peut être avantageusement uti-

lisée seule, ou comme renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeutique comme cytarabine ou sulfate

de vincristine, pour traiter le rétinoblastoma.

EXEMPLE B-5

Comprimés entériques enrobés On prépare des comprimés entériques enrobés selon un procédé classique, à partir d'un mélange d'amidon, de maltose et de spécimen de LK 2, préparé dans l'exemple

A-7, de manière à avoir une teneur en LK 2 de 200 000 uni-

tés par comprimé (100 mg), puis on enrobe les comprimés

avec de l'ester phtalique de méthyl cellulose. Ces compri-

més peuvent être avantageuseement utilisés seuls, ou comme

renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeu-

tique comme doxorubicine, fluorouracile ou mitomycine C, pour le traitement du carcinome du colon et du carcinome

du foie.

EXEMPLE C-1

Des souris sont immunisées comme dans l'Expéri-

mentation A-2, à ceci près que l'on utilise comme antigène

un LK 2 très pur, obtenu par le procédé décrit dans l'Ex-

périmentation A-3. Ensuite des cellules de rate de ces ani-

maux sont mises en suspension avec une lignée de myélome

de souris, P3-NS-1/1-Ag4-1, un produit de Dainippon Phar-

maceutical Co., Ltd, Japon, dans une solution saline renfer-

mant 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, de manière à avoir des densités cellulaires

respectives de 104 cellules/ml. On ajoute à cette suspen-

sion cellulaire une solution saline fraîche de même compo-

sition, mais renfermant en plus du virus Sendai, préalable-

* ment inactivé par une irradiation aux UV, avec refroidis-

sement à la glace, et on laisse reposer ce mélange-pendant reprises. Puis on le dilue environ 20 fois dans un milieu RPMI 1640 à 37 C, et les cellules d'hybridome capables de produire l'anticorps anti LK 2, sont clonées comme dans l'Expérimentation A-2. Les cellules d'hybridome clonées sont transplantées par voie intrapéritonéale dans des hamsters âgés de 7 jours (environ 10 cellules par hamster) dont l'immunoréaction a été affaiblie par des modes opératoires classiques,et l'on récupère l'anticorps monoclonal à partir

des corps des animaux comme dans l'expérimentation A-2.

Tout comme l'anticorps monoclonal préparé dans

l'expérimentation A-2, le produit présente une neutralisa-

tion immunologiquement spécifique de l'activité cytotoxi-

que de LK 2.

La stabilité de l'anticorps monoclonal en so-

lution aqueuse est étudiée par dosage des activités neutra-

lisantes résiduelles après mise à incuber dans les condi-

tions prescrites: Lors d'une incubation à pH 7,2 et de dif-

férentes températures pendant 30 minutes, 80% ou plus de l'activité est conservée à 60 C; mais 90% ou plus est

perdue à 70 C. Après incubation à 4 C et différentes va-

leurs de pH pendant 16 heures, l'activité reste stable dans

un intervalle de pH compris entre 2 et 11.

Lors de l'étude de plusieurs propriétés de

- l'anticorps monoclonal, on constate que l'anticorps mono- -

clonal selon l'invention résiste au mercapto-2 éthanol, et suscite une réaction spécifique antigène-anticorps avec un

anticorps anti-immunoglobuline de souris. Ainsi, l'anti-

corps monoclonal selon l'invention se classe-t-il dans le

groupe des anticorps de l'immunoglobuline.

EXEMPLE C-2

Un anticorps anti LK 2 monoclonal est préparé comme dans l'exemple C-1, à ceci près que l'on remplace P3-NS-1/1-Ag4-1 par une lignée de myélome de souris, SP2/0-Ag14, provenant de Dainippon Pharmaceutical Co.,

Ltd, Japon.

Lors de la neutralisation immunologiquement

spécifique par l'anticorps monoclonal de l'activité cyto-

toxique de LK 2, on obtient des résultats semblables à ceux de l'exemple C-1. A.nsi, l'anticorps monoclonal se

situe-t-il dans la classe des anticorps d'immunoglobu-

line G.

Il est bien entendu que la description détail-

lée et les exemples particuliers indiquant des formes de réalisation préférées de l'invention ne sont donnés qu'à

titre d'illustration; différents changements et modifica-

tions possibles apparaîtront à l'homme de l'art en partant

de cette description détaillée, sans sortir du cadre- de

l'invention.

Claims (14)

Revendications

1. Lymphokine humain (LK 2), ayant une activité cyto-

toxique sur les cellules de tumeurs malignes, caractérisé par les propriétés physicochimiques suivantes: (1) Poids moléculaire: 20 000 2 000 daltons (2) Point isoélectrique: pI = 6,2 - 0,3 (3) Mobilité électrophorétique: Sur pastille de PAGE, Rf = 0,29 - 0,02

(4) Spectre d'absorption dans l'UV: -

Absorption maximale pour une longueur d'onde

proche de 280 nm.

(5) Solubilité dans les solvants: Soluble dans l'eau, le serum physiologique et le tampon phosphate; difficiiement soluble ou insoluble

dans l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle ou le chloro-

forme. (6) Réactions colorées: Protéine positive selon le procédé de Lowry, ou le procédé à la microburette;

Saccharide positive selon le procédé phénol-

acide sulfurique ou le procédé anthrone-acide sulfurique.

(7) Acrivités biologiques: Cytotoxique sur cellule L 929, et sur cellule

KB. Pratiquement exempt d'activité interferon.

(8) Stabilité en solution aqueuse: Stable jusqu'à 60 C lorsqu'on met à incuber

à pH 7,2 pendant 30 minutes.

Stable dans l'intervalle de pH de 4 à 11 lors-

qu'on met à incuber à 4 C pendant 16 heures.

(9) Stabilité à la cryoconservation: -

Stable à -10 C sur une durée de 1 mois ou plus.

2. Procédé pour la production de lymphokine humain (LK 2), caractérisé par les stades de: - exposition d'une cellule humaine capable de produire LK 2, de préférence après prolifération, à l'action d'un inducteur de LK 2, dans des conditions permettant l'accumulation de quantités marquées de ce produit, et - récupération du LK 2 ainsi obtenu,

la prolifération étant réalisée in vitro ou in vivo.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire LK 2, sont obtenues in vivo, par leur transplantation dans un animal à sang chaud, que l'on alimente, afin de permettre

à ces cellules d'utiliser le fluide corporel nutritif de-

l'animal pour leur prolifération, suivie d'une extraction et de la désagrégation de la tumeur qui s'est formée dans

l'animal.

- 4-. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire LK 2

sont obtenues in vivo, par mise en suspension de cellu-

les humaines dans une chambre de diffusion, dans laquelle

leur est apporté le fluide corporel nutritif dans un ani-

mal à sang chaud, la chambre de diffusion étant incrustée dans ou placée sur l'animal de façon à permettre l'apport

de son fluide corporel nutritif dans la chambre, et l'ani-

mal étant alimenté pour permettre aux cellules humaines d'utiliser ce fluide pour leur prolifération, suivie de

la récolte des cellules, ayant proliféré, à partir de cet-

te chambre.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'animal est immunodéficient ou que ses réactions

immunologiques sont supprimées.

6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en

ce que la chambre de diffusion est munie d'une ou de plu-

sieurs membranes filtrantes, fibres creuses ou ultrafil-

tres, ayant une dimension de pore nominale de 10 à

10-5.

10 m.

7. Procédé selon une des revendications 2 à 6, ca-

ractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire LK 2, sont des lymphocytes ou des leucocytes humains, en particulier des lymphoblastoides, notamment ceux des lignées suivantes: Namalwa (ATCC CRL 1432), BALL-1, TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBVHO, MOLT-3 (ATCC CRL 1552), CCRF-SB (ATCC CCL 120), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), BALM-2, DND-41 et Mono-1.

8. Procédé selon une des revendications 2 à 7, carac-

térisé en ce que l'inducteur de LK 2 est choisi dans les groupes suivants: inducteur d'interferon-P, inducteur

d'interferon-Y et leurs mélanges. -

9. Procédé suivant une des revendications 2 à 8, ca-

ractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une so-

lution renfermant LK 2 et une quantité marquée d'impuretés, avec une colonne d'un anticorps anti-LK-2 immobilisé, afin

de réaliser une chromatographie par affinité,puis à-recueil-

lir la fraction active de LK 2 résultante.

10. Composition pharmaceutique à action anti-oncotiques,

caractérisée en ce qu'elle renferme, outre un support phar-

maceutiquement acceptable, une quantité efficace de LK 2 selon la revendication 1, de préférence au moins 5 unités

de ce produit par gramme.

11 Composition selon la revendication 10, caractérisée

en ce qu'elle renferme en outre un produit chimiothérapeuti-

que comme agent d'alkylation, antagoniste métabolique, an-

tibiotique anti-oncotique, alcaloïde, et leurs mélanges.

12. Application de LK 2, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste à immuniser un animal à sang chaud avec LK 2 comme antigène, à recueillir les cellules productrices d'anticorps à partir de cet animal, à fusionner ces cellules avec des cellules de myelome, à choisir un clone capable de púoduire à partir des cellules

d'hybridome résultant des anticorps anti LK 2, à faire pro-

liférer ce clone et à laisser les cellules ayant proliféré,

produire un anticorps monoclonal spécifique de LK 2.

13. Application selon la revendication 12, caractéri-

sée en ce que la cellule productrice est une cellule splé-

nique, en particulier de souris.

14. Application selon la revendication 12 ou 13, ca-

ractérisée en ce que le stade de fusion comprend la mise en suspension des cellules productrices d'anticorps avec des cellules de myélome, dans une solution saline renfermant une quantité efficace d'un agent inducteur de la fusion, en particulier du virus de Sendai ou du polyéthylène glycol, suivie d'un repos de durée suffisante pour que la fusion

se réalise. -