CH652746A5

CH652746A5 - Production d'hormone lactogene, placentaire, humaine.

Info

Publication number: CH652746A5
Application number: CH8058/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-12-19
Filing date: 1981-12-17
Publication date: 1985-11-29
Also published as: GB2093038A; FR2496466A1; KR830007088A; FR2496466B1; KR860001575B1; JPS57102819A; IT1148017B; IT8149901A0; GB2093038B; JPS6045851B2

Description

La présente invention concerne un procédé selon le préambule de la revendication 1, à savoir un procédé de production d'hormone lactogène placentaire humaine ou somatolactostimuline chorionique humaine, ci-après désignée en abrégé par HLPh.

L'HLPh est une hormone sécrétée par les cellules syncytiotro-phoblastiques humaines des villosités chorioniques, qui stimule la croissance et présente une activité anti-insulinique. A ce jour, il n'existe pas de procédé de production à l'échelle industrielle d'HLPh à bas prix.

La présente invention est fondée sur la constatation inattendue que certains lymphoblastoïdes humains capables de produire cette hormone conviennent pour la production industrielle d'HLPh, en raison de leur vitesse de multiplication et de leur taux de production d'hormone par cellule très élevés.

Le nouveau procédé selon l'invention de production d'HLPh consiste à multiplier des lymphoblastoïdes humains capables de produire cette hormone par transplantation de ces cellules dans le corps d'un animal à sang chaud ou en fournissant à ces cellules, à l'aide d'un dispositif, le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud et à laisser les cellules humaines, ainsi multipliées, libérer l'HLPh.

Le procédé selon l'invention, tout en aboutissant à une production supérieure en HLPh, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire, et il permet de maintenir, plus facilement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, tous les lymphoblastoïdes humains capables de produire l'HLPh peuvent être facilement multipliées grâce à l'utilisation de fluide corporel nutritif provenant d'un animal à sang chaud, par transplantation des cellules en question dans le corps de l'animal ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion équipée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant alimenté de manière habituelle.

Ce procédé donne en plus une multiplication des cellules plus stable et plus élevée et une production supérieure d'HLPh par cellule.

L'invention concerne en plus un procédé selon la préambule de la revendication 10, ce procédé étant caractérisé par la partie caractérisante de cette revendication.

Conviennent tous les lymphoblastoïdes humains dans la mesure où ils produisent l'HLPh et se multiplient aisément dans le corps d'un animal à sang chaud. Les lymphoblastoïdes humains préférés sont ceux qui sont dotés de sites génétiques, commandant la production d'HLPh, des cellules humaines qui produisent par nature cette hormone, comme les syncytiotrophoblastes des villosités chorioniques ou des cellules d'épithélioma chorionique ou ceux qui produisent de l'HLPh ectopique comme les cellules de carcinome du poumon; ces sites peuvent être introduits au moyen de la fusion cellulaire, utilisant des agents tels que polyéthylèneglycol ou virus de Sendaï, ou par des techniques de recombinaison génétique avec de l'ADN ligase, nucléase ou polymérase; conviennent aussi des lymphoblastoïdes humains qui produisent de l'HLPh ectopique. Comme l'utilisation de ces lymphoblastoïdes humains aboutit à la formation de tumeurs massives, pouvant être facilement désagrégées, et que ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal, la récolte des cellules de lymphoblastoïdes humains multipliés vivantes est facile.

Conviennent comme animaux utilisables tous ceux dans lesquels les lymphoblastoïdes humains peuvent se multiplier, par exemple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire provoque une immunoréaction indésirable, il se révèle souhaitable d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, commi1 œuf, embryon ou fœtus. Afin de réduire l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des cellules, par irradiation aux rayons X ou aux rayons y, d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'antisérum ou d'agent immunodépresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente l'immunoréaction la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'utiliser avantageuse5

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ment sans prétraitement pour y transplanter et y multiplier rapidement des lignées de lymphoblastoïdes humains.

Une multiplication cellulaire stabilisée et une augmentation de la production d'HLPh peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellules chez le hamster, où elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez des animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou genre.

En ce qui concerne la localisation de l'implantation des lymphoblastoïdes humains conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que les cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoï-que ou les voies intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée.

A côté de cette transplantation directe des lymphoblastoïdes humains au corps de l'animal existe la possibilité de faire se multiplier aisément les lignées classiques de lymphoblastoïdes humains capables de produire l'HLPh en utilisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, grâce à l'inclusion, par exemple par voie intrapé- -ritonéale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille et de forme appropriées, munie d'une membrane poreuse filtrante, d'un ultrafiltre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de 10~7 à 10~5 m, qui empêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'hôte tout en permettant l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour être placée sur l'hôte animal et permettre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fenêtres latérales, transparentes, permettant l'observation de la suspension de cellules ainsi que le remplacement et l'échange avec une chambre fraîche: la multiplication cellulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, comme les cellules humaines multipliées peuvent être facilement récoltées et qu'il n'y a pas manifestation d'immunoréaction, du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'invention, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaud.

L'alimentation de l'hôte animal auquel on a implanté des lymphoblastoïdes humains peut s'effectuer facilement par procédé classique même après la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers.

La multiplication cellulaire maximale est atteinte environ 1 à 20 semaines après l'implantation des cellules, en général au bout de 1 à 5 semaines.

On peut obtenir 107 à 1012, ou plus, de lymphoblastoïdes humains par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines implantées chez l'hôte animal s'accroît 102 à 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois ou plus celui que l'on obtient avec un procédé de culture de tissu in vitro utilisant un milieu nutritif,

aussi ces cellules sont-elles avantageusement utilisables pour la production d'HLPh.

En ce qui concerne la libération de l'HLPh par les lymphoblastoïdes humains, tout moyen approprié peut être employé. Par exemple, les lymphoblastoïdes humains obtenus par multiplication en ascite, en suspension, et par récolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau, et par récolte après désagrégation de la tumeur, sont mis en suspension pour atteindre une concentration de 104 à 108 cellules par millilitre dans un milieu nutritif, préchauffé à une température de l'ordre de 20 à 40 C, puis mis à incuber à cette température pendant 1 à 50 h, pour produire l'HLPh. L'augmentation de la production d'HLPh peut être réalisée par la présence d'une ou de plusieurs substances comprenant des aminoacides comme leucine, lysine, arginine ou cys-téine; des sels minéraux comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, et sulfate de magnésium; et des hormones comme celle qui libère l'hormone lutéinisante. En outre, au cours de la production d'HLPh, il peut, conformément à l'invention, y avoir production simultanée de gonadotropine chorionique humaine, désignée ci-après par l'abréviation GCh.

L'HLPh, ainsi obtenue, peut être recueillie facilement grâce à des techniques de purification et de séparation utilisant des modes opératoires classiques tels que relargage, dialyse, filtration, centrifuga-tion, concentration et lyophilisation. Quand on souhaite un produit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques mentionnées plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu'adsorption et désorp-tion avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.

La préparation d'HLPh, ainsi obtenue, peut être avantageusement utilisée seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration externe, interne ou de diagnostic,

pour la prévention ou le traitement de maladies humaines.

Au cours de la présente description, la production d'HLPh est dosée par le procédé de radio-immuno essai décrit par P. Bech. et coll., «J. Clin. Endocrinol.», vol. 25, pp. 1457-1462 (1965); elle est exprimée en poids par rapport à la préparation étalon d'HLPh disponible au National Institutes of Health (USA). De même, la production de GCh est dosée par le procédé de radio-immuno essai décrit par A.R. Midgley, Jr., «Endocrinology,», vol. 79, pp. 10-18 (1966), et exprimée en Unités Internationales (UI).

L'invention est illustrée ci-après par plusieurs formes de réalisation.

Exemple 1 :

Des cellules d'épithélioma chorionique humain désagrégé, obtenues par extraction à partir d'un patient souffrant d'épithélioma chorionique, suivie de hachage, et une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains de Namalwa sont mises en suspension ensemble dans un récipient avec une solution saline de 140 mmol de NaCl, 54 mmol de KCl, 1 mmol de NaH2P04 et 2 mmol de CaCl2, de manière à obtenir des concentrations cellulaires respectives de l'ordre de 104 cellules/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation fraîche de la même solution saline, contenant du virus de Sendaï préalablement inactivé par irradiation à l'ultraviolet, le tout est transféré 5 min après le mélange dans un incubateur à 37° C et y est agité pendant 30 min pour réaliser la fusion cellulaire, introduisant l'aptitude à produire l'HLPh des cellules d'épithélioma chorionique humain, dans la lignée des lymphoblastoïdes leucémiques humains. Après clonage selon un procédé classique de la souche de cellules d'hybridome capable de produire l'HLPh, on l'implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives résultantes formées sous la peau et pesant chacune environ 15 g sont extraites, désagrégées par hachage et mises en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine. Après lavage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum fœtal de veau, les cellules sont remises en suspension, à une concentration de 10ö cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu qui contient 30 mm de L-arginine, et l'on met à incuber à 35° C pendant 20 h environ pour obtenir l'HLPh. Les cellules sont ensuite soumises aux ultrasons et la quantité d'HLPh présente dans la partie surnageante est dosée. La production d'HLPh est d'environ 340 |!g/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de GCh dans la partie surnageante est de l'ordre de 230 IU/ml de suspension cellulaire.

Les cellules témoins, obtenues par implantation dans la souris nue de cellules d'épithélioma chorionique humain, suivie d'une alimentation normale des animaux pendant 5 semaines, puis d'une extraction des tumeurs massives résultantes se formant sous la peau et pesant 5 g chacune qui sont désagrégées, sont traitées comme plus haut pour induire l'HLPh. La production de cette hormone n'est que de 3 ng/ml de suspension cellulaire.

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Exemple 2:

Des cellules de carcinome du poumon humain désagrégé, obtenues par extraction à partir d'un patient souffrant de carcinome pulmonaire, suivie de hachage, et une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL sont mises à fusionner comme dans l'exemple 1 ; on introduit ainsi l'aptitude à produire de l'HLPh des cellules de carcinome du poumon humain dans la lignée des lymphoblastoïdes leucémiques humains. Après clonage à la manière classique de la souche de cellules d'hybridome capable de produire l'HLPh, on l'implante par voie sous-cutanée chez des hamsters nouveau-nés, ayant préalablement reçu de l'antisérum, préparé à partir d'un lapin par un procédé classique, afin de réduire leur immunoréaction; ces animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune sont extraites et désagrégées par hachage, puis mises en suspension dans du sérum physiologique contenant de la collagé-nase. Après lavage des cellules avec du milieu essentiel minimal d'Eagle (pH 7,2), additionné de 5% volume/volume de sérum humain, ces cellules sont remises en suspension à la concentration de l'ordre de 10s cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu, contenant 20 mmol de L-lysine et 10 mmol de sulfate de magnésium; elles sont ensuite mises à incuber à 37° C pendant 15 h pour produire de l'HLPh. La production de cette hormone est de 150 p.g/ml de suspension cellulaire.

Les cellules témoins, obtenues par implantation de cellules de carcinome du poumon humain à des hamsters que l'on nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines, suivie de l'extraction des tumeurs massives résultantes qui se forment sous la peau, de 3 g chacune environ, et de la désagrégation de ces tumeurs, sont traitées comme plus haut. La production d'HLPh n'est que de 0,9 |ig/ml de suspension cellulaire.

Exemple 3:

A des rats nouveau-nés on implante, par voie intraveineuse, une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains BALL-1 dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLPh de cellules d'épithélioma chorionique humain a été introduite comme dans l'exemple 1 ; puis on nourrit les rats de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives résultantes, environ 30 g chacune, sont extraites et désagrégées. Après lavage des cellules avec du milieu RPMI1640 (pH 7,4), additionné de 10% en volume/volume de sérum de veau fœtal, ces cellules sont remises en suspension, à la concentration de l'ordre de 107 cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu, contenant 30 mmol de L-arginine; on met alors à incuber à 30° C pendant 40 h pour produire l'HLPh. La production d'HLPh est de l'ordre de 410 ng/ml de suspension cellulaire. La production simultanée de GCh est voisine de 870 Ul/ml de suspension cellulaire.

Les cellules témoins, obtenues par implantation de cellules d'épithélioma chorionique humain à des rats que l'on nourrit de manière habituelle pendant 4 semaines, suivie de l'extraction des tumeurs massives résultantes (environ 5 g chacune) et de leur désagrégation, sont traitées comme plus haut. La production d'HLPh n'est que de 2[ig/ml de suspension cellulaire.

Exemple 4:

Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons X, pour la réduction de l'immunoréaction, des souris adultes reçoivent, par voie sous-cutanée, des implants de lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains NALL-1 dans laquelle l'aptitude à produire l'HLPh des cellules de carcinome du poumon humain a été introduite comme dans l'exemple 2; puis on nourrit les souris de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune sont extraites et désagrégées. Les cellules obtenues sont traitées comme dans l'exemple 2 pour produire l'HLPh. La production de cette hormone est d'environ 210 (ig/ml de suspension cellulaire.

Les cellules témoins, obtenues par implantation de cellules de carcinome du poumon humain à des souris que l'on nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines, suivie de l'extraction des tumeurs massives résultantes (5 g environ chacune) et de leur désagrégation, sont traitées comme plus haut. La production d'HLPh n'est que de 1 (ig/ml de suspension cellulaire.

Exemple 5:

Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains TALL-1, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLPh des cellules d'épithélioma chorionique humain a été introduite comme dans l'exemple 1, est mise en suspension dans du sérum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5 [t de diamètre. Après inclusion, par voie intrapéritonéale, de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui-ci de manière habituelle pendant 4 semaines, puis on enlève la chambre. La densité en cellules humaines dans la chambre, atteinte au cours de l'opération ci-dessus, est d'environ 7 x 108 cellules/ml, ce qui est environ 102 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro à l'aide d'un incubateur à C02. Les cellules humaines, ainsi obtenues, sont traitées comme dans l'exemple 3, pour induire l'HLPh. La production en HLPh est de l'ordre de 380 |ig/ml de suspension cellulaire. La production simultanée du GCh est voisine de 750 IU/ml de suspension cellulaire.

Les cellules témoins, obtenues par mise en suspension dans du sérum physiologique de cellules d'épithélioma chorionique humain, par transfert de la suspension de cellules résultante dans la chambre de diffusion, par inclusion par voie intrapéritonéale de la chambre dans un rat, par alimentation de ce dernier de manière habituelle pendant 4 semaines et par récolte des cellules de lymphoblastoïdes humains, multipliées à une densité d'environ 107 cellules/ml, sont traitées comme plus haut. La production en HLPh n'est que de 1 Hg/ml de suspension cellulaire.

Exemple 6:

Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLPh des cellules syncytiotropho-blastiques humaines a été introduite comme dans l'exemple 1, est implantée dans la cavité allantoïque d'œufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 37° C pendant 5 d. Après incubation des œufs embryonnés à cette température, pendant 1 semaine supplémentaire, les cellules humaines multipliées sont récoltées et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire l'HLPh. La production d'HLPh est voisine de 190 Hg/ml de suspension cellulaire.

La production simultanée de GCh est de l'ordre de 210 Ul/ml de suspension cellulaire.

Lors de l'expérimentation témoin, au cours de laquelle des syn-cytiotrophoblastes humains sont implantés dans les cavités allantoï-ques d'œufs embryonnés, on n'observe pas de multiplication cellulaire.

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REVENDICATIONS

1. Procédé pour la production d'hormone lactogène placentaire humaine HLPh, par multiplication de lymphoblastoïdes humains capables de produire HLPh et par libération de cette hormone par les cellules multipliées, caractérisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cellulaire, un animal à sang chaud.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par implantation des cellules humaines dans le corps de l'animal à sang chaud.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif, dans lequel le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules humaines.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par la production simultanée d'hormone gonadotropique chorionique humaine GCh.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on laisse les lymphoblastoïdes humains multipliés libérer l'HLPh en présence d'un ou de plusieurs produits suivants : leucine, lysine, arginine, cystéine, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de calcium, sulfate de magnésium et hormone libératrice d'hormone lutéinisante.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notamment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes humains est une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains est une lignée de Namalwa, de NALL-1, de BALL-1, de TALL-1 ou JBL.
10. Procédé de préparation des lymphoblastoïdes humains utilisés dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les lymphoblastoïdes humains capables de produire l'HLPh sont des cellules d'hybridome que l'on obtient par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoïdes humains avec des cellules humaines capables de produire l'HLPh.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoïdes humains avec des cellules d'épithélioma chorionique humain.
12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoïdes humains avec des cellules syncytiotrophoblasti-ques humaines, provenant des villosités chorioniques.
13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoïdes humains avec des cellules de carcinome du poumon humain.
14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes humains est une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains est une lignée de Namalwa, de NALL-1, de BALL-1, de TALL-1 ou JBL.