CH649785A5

CH649785A5 - Production d'hormone luteinisante humaine.

Info

Publication number: CH649785A5
Application number: CH5390/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-08-27
Filing date: 1981-08-21
Publication date: 1985-06-14
Also published as: KR860000900B1; JPS5756877B2; IT8149157A0; FR2489151A1; GB2085889B; GB2085889A; KR830005865A; IT1143230B; FR2489151B1; JPS5743696A; US4383035A

Description

La présente invention concerne un procédé selon le préambule de la revendication 1, à savoir un procédé de production d'hormone lutéinisante humaine, ci-après désignée en abrégé par HLh.

HLh est une hormone produite par le lobe antérieure de la glande hypophysäre, qui stimule la sécrétion de l'hormone andro-gène chez le mâle, et des hormones œstrogène et progestative chez la femelle. A ce jour, il n'existe pas de procédé de production à l'échelle industrielle d'HLh à bas prix.

La présente invention est fondée sur la constatation inattendue que des cellules humaines, obtenues par multiplication de cellules humaines capables de produire HLh à l'aide d'un animal à sang chaud, présentent une aptitude à produire HLh bien supérieure à celle des cultures de tissu in vitro, la production d'HLh par cellule étant jusqu'à 2 à 50 fois supérieure.

Le procédé mentionné au début est donc caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1. Des modes d'exécution du procédé particulièrement appropriés apparaissent dans les revendications dépendantes.

Le procédé selon l'invention, tout en aboutissant à une production supérieure en HLh, n'exige que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication cellulaire, et il permet de maintenir, plus facilement que dans le cas de la culture de tissu in vitro, le milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, toutes les cellules humaines capables de produire HLh peuvent être facilement multipliées, grâce à l'utilisation de fluide corporel nutritif provenant d'un animal à sang chaud, par transplantation des cellules en question dans le corps de l'animal, ou par leur mise en suspension dans une chambre de diffusion équipée pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant alimenté de manière habituelle.

Ce procédé est également caractérisé par une multiplication des cellules plus stable et plus élevée, et par une production supérieure d'HLh par cellule.

Conviennent toutes les cellules humaines dans la mesure où elles produisent HLh et se multiplient aisément dans le corps d'un animal à sang chaud: par exemple, les cellules humaines qui produisent par nature HLh, comme les cellules basophiles humaines, provenant du lobe antérieur de l'hypophyse, ces cellules transformées par le virus EB ou par irradiation aux rayons X, ou les cellules d'adénome d'un patient souffrant d'adénome basophile de l'hypophyse; des cellules humaines de carcinome du poumon, qui produisent de l'HLh ectopi-que, et des lignées de cellules établies des cellules humaines ci-dessus. L'utilisation de lignées de lymphoblastoïdes humains établis faciles à conserver, dotées de sites génétiques commandant la production d'HLh au moyen de techniques de recombinaison génétique utilisant des enzymes comme ADN ligase, nucléase et ADN polymérase, et au moyen de fusion cellulaire, utilisant des agents tels que polyéthy-lèneglycol ou virus de Sendai, aboutit avantageusement à une multiplication cellulaire remarquablement supérieure, lorsqu'on transplante les cellules dans le corps d'un animal à sang chaud, la production d'HLh par cellule étant alors de 2 à 10 fois, ou davantage, plus élevée. En outre, comme la transplantation au corps de l'animal des lignées de lymphoblastoïdes humains établis mentionnés plus haut aboutit à la formation de tumeurs massives pouvant être facilement désagrégées, et comme ces tumeurs ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal, la récolte des cellules vivantes de lymphoblastoïdes humains multipliés est facile.

Conviennent comme animaux utilisables dans le procédé selon l'invention tous ceux dans lesquels les cellules peuvent se multiplier, par exemple des volailles comme poulet et pigeon, des mammifères comme chat, chien, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, hamster, souris ou souris nue. Comme cette transplantation cellulaire provoque une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser des animaux nouveau-nés ou en bas âge, ou encore au stade le plus jeune possible, comme œuf, embryon ou fœtus. Afin de réduire l'immunoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation des cellules, par irradiation aux rayons X ou aux rayons y, d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'antisérum ou d'agent immunodépresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente l'immunoréaction la plus faible, même à l'âge adulte, on peut l'utiliser avantageusement sans prétraitement, pour y transplanter et y multiplier rapidement des lignées de cellules humaines établies.

Une multiplication cellulaire stabilisée et une augmentation de la production d'HLh peuvent être à la fois réalisées par transplantation répétée, utilisant des combinaisons de différents animaux à sang chaud: on peut atteindre ces objectifs en implantant d'abord les cellules chez le hamster, où elles se multiplient, puis en les réimplantant chez la souris nue. En outre, on peut effectuer la transplantation successive chez les animaux de la même classe ou division, aussi bien que chez ceux de la même espèce ou du même genre.

En ce qui concerne la localisation de l'implantation des cellules humaines, conviennent tous les sites de l'animal, pourvu que les cellules puissent s'y multiplier, par exemple la cavité allantoïque, ou les voies intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée.

A côté de cette transplantation directe des cellules au corps de l'animal existe la possibilité de faire se multiplier aisément les lignées connues de cellules humaines établies capables de produire HLh, en utilisant le fluide corporel nutritif provenant de l'animal, grâce à l'inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans le corps de

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l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille et de forme appropriées, munie d'une membrane filtrante, d'un ultrafiltre ou de fibre creuse d'un diamètre de pore de l'ordre de 10~7 à 10" 5 m, qui empêche la contamination de la chambre de diffusion par les cellules de l'hôte tout en permettant l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être conçue, si nécessaire, pour être placée sur l'hôte animal et permettre au fluide corporel de ce dernier de circuler dans la chambre, les parois de celle-ci peuvent être munies de fenêtres latérales, transparentes, permettant l'observation de la suspension de cellules, ainsi que le remplacement et l'échange avec une chambre fraîche: la multiplication cellulaire est ainsi augmentée à un niveau encore supérieur, rapporté à la durée de vie de l'animal, et la production par animal est encore accrue sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise cette chambre de diffusion, comme les cellules humaines multipliées peuvent être facilement récoltées, et qu'il n'y a pas manifestation d'immunoréaction du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, on peut utiliser comme hôte, conformément à l'invention, sans prétraitement destiné à réduire l'immunoréaction, tout animal à sang chaud.

L'alimentation de l'hôte animal auquel on a implanté des cellules humaines peut s'effectuer facilement par un procédé classique, même après la transplantation cellulaire, et elle ne nécessite pas de soins particuliers.

La multiplication cellulaire maximale est atteinte environ 1 à 20 semaines après l'implantation des cellules. Lorsque la lignée établie implantée est une lignée de cellules de tumeur humaine ou de lymphoblastoïdes humains, la multiplication cellulaire maximale est atteinte en 1 à 5 semaines, après la transplantation, en raison des vitesses de multiplication cellulaire très élevées de ce type de lignée.

Conformément à l'invention on obtient normalement 107 à 1012, ou plus, cellules humaines par hôte. Autrement dit, le nombre de cellules humaines implantées chez l'hôte animal s'accroît 102 à 107 fois ou plus, ou bien est d'environ 101 à 106 fois ou plus celui que l'on obtient avec un procédé de culture de tissu in vitro utilisant un milieu nutritif; aussi ces cellules sont-elles avantageusement utilisables pour la production d'HLh.

En ce qui concerne le procédé pour induire HLh, on peut employer tout moyen permettant la libération d'HLh par les cellules humaines obtenues par le mode opératoire mentionné plus haut. Par exemple, les cellules humaines obtenues par multiplication en ascite, en suspension, et récolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après désagrégation de la tumeur, sont mises en suspension pour atteindre une concentration de IO* à 108 cellules/ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température de l'ordre de 20 à 40° C, puis soumises à cette température, pendant 1 à 50 h, à l'action d'un inducteur d'hormone lutéinisante.

Les inducteurs préférés d'hormone lutéinisante sont des amino-acides comme lysine, arginine, tryptophane, leucine et acide casa-mino; des sels minéraux comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, et sulfate de magnésium; des hormones comme l'hormone libératrice de l'hormone lutéinisante.

La production simultanée d'autres hormones humaines comme l'hormone stimulant les follicules (en abrégé HSFh) peut être réalisée.

L'HLh ainsi obtenue peut être recueillie facilement grâce à des techniques de purification et de séparation utilisant des modes opératoires classiques tels que relargage, dialyse, filtration, centrifuga-tion, concentration et lyophilisation. Quand on souhaite un produit encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des techniques mentionnées plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, tels qu'adsorption et désorp-tion avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.

La préparation d'HLh ainsi obtenue peut être avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration externe, interne ou de diagnostic, pour la prévention ou le traitement de maladies humaines.

Au cours de la présente description, la production d'HLh est dosée par le procédé de radio-immunoessai décrit par A.R. Midgley, Jr, «Endocrinology», vol. 79, pp. 10-18 (1966), et est exprimée en Unités Internationales (UI). La production simultanée d'HSFh est dosée par le procédé de radio-immunoessai décrit par C. Faiman, R.F. Ryan, «J. Clin. Endocrinol. Metab.», vol. 27, pp. 444-447 (1967) et est exprimée en Unités Internationales (UI).

L'invention est illustrée ci-après par plusieurs formes de réalisation non limitatives.

Exemple 1

Des cellules d'adénome basophile humain désagrégé, obtenues par extraction à partir d'un patient souffrant d'adénome basophile de l'hypophyse, suivie de hachage, sont implantées par voie sous-cutanée dans des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant chacune environ 10 g, sont extraites, désagrégées par hachage et mises en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine. Après lavage des cellules avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum fœtal de veau, les cellules sont remises en suspension, à une concentration de 105 cellules/ml, dans une préparation fraîche du même milieu qui contient, en tant qu'inducteur d'hormone lutéinisante, 30 mmol de L-arginine, et l'on met à incuber à 37° C pendant 15 h environ pour obtenir HLh. Les cellules sont ensuite soumises aux ultrasons, et la quantité d'HLh présente dans la partie surnageante est dosée. La production d'HLh est d'environ 400 mUI/ml de suspension cellulaire. La production simultanée d'HSFh dans la partie surnageante est de l'ordre de 500 mUI/ml de suspension cellulaire.

Les cellules témoins obtenues par culture in vitro de cellules d'adénome basophile humain, dans du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum fœtal de veau, et mises à incuber à 37° C, sont traitées comme plus haut pour induire la formation d'HLh. Cette production n'est que voisine de 70 mUI/ml de suspension cellulaire.

Exemple 2

Des cellules d'adénome basophile humain désagrégé obtenues comme dans l'exemple 1 et une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains de Namalwa sont mises en suspension ensemble dans un récipient avec une solution saline de 140 mmol de NaCl, 54 mmol de KCl, 1 mmol de NaH2P04 et 2 mmol de CaCl2, de manière à obtenir des concentrations cellulaires respectives de l'ordre de 103 cellules/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace est mélangée avec une préparation fraîche de la même solution saline, contenant du virus de Sendai préalablement inactivé par irradiation à l'ultraviolet; le tout est transféré 5 min après le mélange dans un incubateur à 37° C, et y est agité pendant 30 min pour réaliser la fusion cellulaire, introduisant l'aptitude à produire l'HLh des cellules d'adénome basophile humain dans la lignée des lymphoblastoïdes leucémiques humains. Après clonage selon un procédé classique de la souche de cellules d'hybridome capable de produire l'HLh, on implante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives résultantes, pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire l'HLh, à ceci près que l'on remplace les 30 mmol de L-arginine par environ 10 mg d'hormone libératrice d'hormone lutéinisante. La production d'HLh est d'environ 1400 mUI/ml de suspension cellulaire.

La production simultanée d'HSFh est de l'ordre de 1600 mUI/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de la lignée lymphoblastoïdes leucémiques humains fusionnées de Namalwa, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de 90 mUI/ml de suspension cellulaire.

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Exemple 3

Après injection à des hamsters nouveau-nés d'antisérum préparé à l'aide de lapin selon un procédé classique, on implante, par voie sous-cutanée, chez ces animaux, une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire HLh des cellules d'adénome basophile humain a été introduite comme dans l'exemple 2, puis on les nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau, et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire HLh. La production d'HLh est de l'ordre de 1300 mUI/ml de suspension cellulaire.

La production simultanée d'HSFh est de l'ordre de 1500 mUI/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains fusionnés JBL, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de l'ordre de 80 mUI/ml de suspension cellulaire.

Exemple 4

A des rats nouveau-nés on implante, par voir intraveineuse, une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains de Namalwa, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLh de cellules d'adénome basophile humain a été introduite comme dans l'exemple 2, puis on nourrit les rats de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives résultantes, environ 40 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'HLh. La production d'HLh est voisine de 1000 mUI/ml de suspension cellulaire. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains fusionnés de Namalwa, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de 70 mUI/ml de suspension cellulaire.

Exemple 5

Après avoir subi une irradiation de 400 rems environ de rayons X pour la réduction de l'immunoréaction, des souris adultes reçoivent par voie sous-cutanée des implants de cellules d'adénome basophile humain obtenues comme dans l'exemple 1, puis on nourrit les souris de manière habituelle, pendant 4 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'HLh. La production d'HLh est d'environ 500 mUI/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro des cellules d'adénome basophile humain, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que de l'ordre de 50 mUI/ml de suspension cellulaire.

Exemple 6

Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLh des cellules d'adénome basophile humain a été introduite comme dans l'exemple 3, est mise en suspension dans du sérum physiologique, puis le tout est transféré dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique,

dont le volume intérieur est de l'ordre de 10 ml, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de pore voisine de 0,5 |i. Après inclusion par voie intrapéritonéale de cette chambre dans un rat adulte, on nourrit celui-ci de manière habituelle pendant 4 semaines, puis on enlève la chambre. La densité en cellules humaines dans la chambre atteinte au cours de l'opération ci-dessus est d'environ 2 x 10® cellules/ml, ce qui est environ 103 fois supérieur, ou même plus, à ce qu'on atteint avec une culture in vitro à l'aide d'un incubateur à C02. Les cellules humaines ainsi obtenues sont traitées comme dans l'exemple 2 pour induire l'HLh. La production en HLh est de l'ordre de 1600 mUI/ml de suspension cellulaire.

La production simultanée d'HSFh est voisine de 1300 mUI/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro d'une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains fusionnés JBL, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone lutéinisante. La produc-tuin d'HLh n'est que de l'ordre de 80 mUI/ml de suspension cellulaire.

Exemple 7

Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'HLh des cellules d'adénome basophile humain a été introduite comme dans l'exemple 3, est implantée dans la cavité allantoïque d'oeufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 37° C pendant 5 d. Après incubation des œufs embryonnés à cette température, pendant 1 semaine supplémentaire, les cellules humaines multipliées sont récoltées et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire l'HLh. La production d'HLh est voisine de 1200 mUI/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains fusionnés JBL, et exposition des cellules humaines multipliées à l'action de l'induction d'hormone lutéinisante. La production d'HLh n'est que d'environ 80 mUI/ml de suspension cellulaire.

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Claims

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1. Procédé pour la production d'hormone lutéinisante, humaine, HLh, par multiplication de cellules humaines, capables de produire HLh, et exposition des cellules multipliées à l'action d'un inducteur d'hormone lutéinisante, caractérisé en ce qu'on utilise, pour la multiplication cellulaire, un animal à sang chaud.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée par implantation des cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud.

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REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la multiplication cellulaire est réalisée à l'aide d'un dispositif dans lequel le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est fourni aux cellules humaines.

4. procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion équipée de manière que les cellules de l'hôte animal ne la contaminent pas.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire HLh sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lympho-blastoïdes humains établis avec ces cellules d'adénome basophile humain.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes humains est une lignée de lymphoblas-toïdes leucémiques humains.

7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que la lignée de lymphoblastoïdes humains est une lignée de Namalwa ou JBL.

8. Procédé selon une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la fusion cellulaire est réalisée à l'aide de virus de Sendai.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'inducteur d'hormone lutéinisante est un aminoacide comme lysine, arginine, tryptophane, leucine ou acide casamino, un sel minéral comme chlorure de sodium, de potassium ou de calcium, ou bien sulfate de magnésium, ou une hormone comme hormone libératrice d'hormone lutéinisante.

10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille, en particulier poulet ou pigeon, ou un mammifère, notamment chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, rat, cobaye, hamster, souris ou souris nue.