JPH06510908A

JPH06510908A - 動物ビタミンｄ結合性蛋白からのマクロファージ活性化因子

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Publication number: JPH06510908A
Application number: JP5506901A
Authority: JP
Inventors: 信人山本
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Current assignee: Individual
Priority date: 1991-09-30
Filing date: 1992-09-02
Publication date: 1994-12-08
Anticipated expiration: 2013-10-08
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】動物ビタミンＤ結合性蛋白からのマクロファージ活性化因子発明の技術分野本発明はマクロファージ活性化に関し、詳細には有力なマクロファージ活性化因子のインビトロにおける酵素的生産に関するものである。

種々の組織の微生物感染は炎症を引起こして、食細胞の走化性および活性化をもたらす。炎症した組織は、ホスホリパーゼＡの活性化によりリゾホスホリピドを放出する。炎症した癌組織はアルキル−リゾホスホリピドおよびアルキルグリセロール、並びにリゾホスホリピドを生成する。何故なら、癌細胞はアルキルホスホリピドとモノアルキルジアシルグリセロールとを含有するからである。これらリゾホスホリピドおよびアルキルグリセロール、すなわち炎症した正常組織および癌組織における膜脂質の分解生産物は有力なマクロファージ活性化剤である［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第４７巻、第２００８頁（１９８７）；ヤマモト等、キャンサー・イミュノロジカル・イミュノテラピー、第２５巻、第１８５頁（１９８７）、ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第２４巻、第６０４４頁（１９８８）］。

ネズミに対するリゾホスホリピド（５〜２０μｇ／ネズミ１匹）およびアルキルグリセロール（１０〜１１００ｎ／ネズミ１匹）の投与はマクロファージを活性化せで、免疫グロブリンＧ−被覆ヒツジ赤血球を食作用（ｐｈａｇｏｃｙｌｉｚｅ　）させる。マクロファージはそのリセプタを介して標的赤血球を食作用し、これらリセプタは免疫グロブリンＧのＦｃ部分を認識するが補体のＣ３ｂ部分を認識しない［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第４７巻、第２００８頁（１９８７）］。

リゾホスホリピドもしくはアルキルグリセロールのみでネズミ腹膜マクロファージをインビトロ処理しても摂取活性を増大させない［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第４８巻、第６０４４頁（１９８８）］。しがしなから、腹膜細胞（マクロファージとＢおよびＴリンパ球との混合物）をリゾホスホリピドもしくはアルキルグリセロールと共に２〜３時間にわたりインキュベーション（１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ）　（培養）すれば、マクロファージのＦｃ−リセブタ媒介による食細胞活性を顕著に向上させる［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第４７巻、第２００８頁（１９８７）、ヤマモト等、キャンサー゛リサーチ、第４８巻、第６０４４頁（１９８８）］。

１０％胎児ウシ血清を含有する培地にてマクロファージをリゾホスホリピド処理もしくはアルキルグリセロール処理のＢおよびＴリンパ球と共に培養すれば、マクロファージの食細胞活性を著しく向上させた［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第４８巻、第６０４４頁（１９８８）；ホンマおよびヤマモト、　Ｃ１１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎ。

ド処理もしくはアルキルグリセロール処理のＢ−細胞は信号化因子をＴ−細胞まで伝達しうろことか明かとなった。次いてＴ−細胞はこの因子を改変して、摂取能力につきマクロファージを最終的に活性化しうる新たな因子を生成する［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第４８巻、第６０４４頁（１９８８）］。

Ｂ　ビタミンＤ結合性蛋白ＤＢＰとしても知られるビタミンＤ結合性蛋白は、動物間で進化論的に保守された糖蛋白である［クックおよびハタト、エンドクリン・レヒュー、第１０巻、第２９４頁（１９８９）・］。動物からのＤＢＰはヒトＤＢＰに対し血清学的に交差反応する［オガタ等、Ｃｏｍｐ、　Ｂｉｏｃｈ、　ＰｈＨｉｏｌ、第９０８巻、第１９３頁（１９８８）コ。動物ＤＢＰは成る動物種類においては遺伝子的に多形性の血漿蛋白であって、約５２，０００の相対的分子量を有する。これは一般に動物における血漿蛋白の約０．５％を占める。ｌｆＩ′Ｉ漿濃度は一般に約２６０μｇ　／　ｍ　ｌである。

「群特異性成分」もしくはｒＧｃ蛋白」として知られるヒトＤＢＰの多形性はゲル電気泳動分析によって示すことができ、２種の主たる表現型：ＧｃｌおよびＧａ４を示す［ヒルシフエルド等、ネイチャー、第１８５巻、第９３１頁（１９６０）］。ＧｃｌおよびＧｃ２遺伝子の全ヌクレオチドコード化配列、並びに予想アミノ酸配列が報告されている［タック等、ジャーナル・クリニカル・インベスチゲーション、第７６巻、第２４２０頁（１９８５）；ヤング等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第７９９４頁（１９８５）］。ＧｃｌはさらにＧｃｌｆおよびＧｃｌｓサブタイプに分割されて２つのバンド、すなわち「急速」および「低速」バンドとして電気泳動により移動する［スバスチ等、バイオケミストリー、第１８巻、第１６１１頁（１９７９）］。

クーベンハーバ−等、アーキテクチャ−・バイオケミカル・バイオフィジークス、第２２６巻、第２１８〜２２３頁（１９８３）は、翻訳後のグリコジル化の差がスレオニン残基で生じ、ＧｃｌとＧａ４との間にアミノ酸が相違を有した蛋白の領域に出現することを報告している。

ビオ−等、バイオケミカル・バイオフィジークス・リサーチ・コミューニケーション、第１１７巻、第３２４〜３３１頁（１９８３）はＧｃｌのＯ−グルコシド結合したグリカンにつき推定構造を報告しており、これはせリンもしくはスレオニン残基に結合したシアル酸とガラクトースとＮ−アセチルガラクトサミンとの線状配置を有する。

哺乳動物ＤＢＰの多形性は、等電焦点法により示すことができる［ガーネおよびジエネヤ、アニマル・ブラッド・グループス・バイオケミカル・ジエネチックス、第９巻、第３７頁（１９７８）：パン・デ・ウエーゲ等、Ｃｏｍｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、第７３Ｂ巻、第９７７頁（１９８２）；オガタ等、Ｃｏｍｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈ７ｓｉｏ１．　、第９０Ｂ巻、第１９３頁（１９８８）］。

動物ＤＢＰは、文献に報告されでいる各種の手段により精製することができる。

たとえば、ＤＢＰは種々の動物種類の血漿から２５−ヒドロキシビタミンＤ３− セファロース（登録商標）親和性クロマトグラフィーにより精製することができる［リンク等、アナリチカル・バイオケミストリー、第１５７巻、第２６２頁（１９８６）］。さらにＤＢＰは、アクチンに対するその特異的結合能力に基づきアクチン−アガロース親和性クロマトグラフィーによっても精製することができる［ハダド等、バイオケミカル・ジャーナル、第２１８巻、第８０５頁（１９８４）］。

ヒトおよび動物ビタミンＤ結合性蛋白の特性化および集中的な研究、並びにその容易な精製方法の存在にも拘らずこれら蛋白から有力なマクロファージ活性化因子への変換は本発明に至るまで示されていない。

発明の要点有力なマクロファージ活性化因子の生産方法が提供される。ヒト血清における群特異性成分に対し血清学的に交差反応する進化論的に保守された動物蛋白である動物ビタミンＤ結合性蛋白は、マクロファージ活性化因子の先駆体である。動物ＤＢＰは、ＢおよびＴ細胞のグリコシダーゼの作用によりマクロファージ活性化因子まで変換される。

マクロファージ活性化因子の作成方法によれば、動物ＤＢＰをインビトロにて（ｉ）β−ガラクトシダーゼと、或いは（ｉｉ）シアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしくはその混合物と組合せたβ−ガラクトシダーゼと接触させる。有力なマクロファージ活性化因子が多量に得られる。

本発明の１具体例によれば、ガラクトースおよびシアル酸残基を含むオリゴ糖部分（以下ｒＤＢＰｇｓＪと称する）を有すると思われる動物ＤＢＰをβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと接触させて、マクロファージ活性化因子を生成させる。他の具体例によれば、ガラクトースおよびα−マンノース残基を含むオリゴ糖部分（以下ｒＤＢＰｇｍＪと称する）を有すると思われるＤＢＰをβ−ガラクトシダーゼおよびα−マンノシダーゼと接触させる。さらに他の具体例によれば、ガラクトース残基を含むがシアル酸もしくはα−マンノースを含まないオリゴ糖部分（以下ｒＤ　Ｂ　Ｐ　ｇＪと称する）を有すると思われるＤＢＰをβ −ガラクトシダーゼのみと接触させて、マクロファージ活性化因子を生成させる。ＤＢＰの遺伝子多形性により、マクロファージ活性化因子は好ましくは、特に種々異なる個体の貯蔵血漿から精製されたＤＢＰを用いる場合には、動物ＤＢＰを３種全ての酵素と接触させてマクロファージ活性化因子を得ることにより作成される。

さらに本発明は、上記方法またはその具体例により作成されるマクロファージ活性化因子、並びにマクロファージ活性化因子を医薬上許容しうるキャリヤと組合せてなる獣医用途の組成物に関するものである。

さらに本発明は、マクロファージ活性化を必要とする動物に対しマクロファージ活性化上有効量の新規なマクロファージ活性化因子を投与することによる動物におけるマクロファージ活性化の誘発方法にも関するものである。

ここで用いる「動物ＤＢＰＪとは、たとえばＤＢＰｇ。

ＤＢＰｇｓおよびＤＢＰｇｍのような全ての遺伝子変化を含め「ビタミンＤ結合性蛋白」としても知られる遺伝子的に多形性の動物（ヒトを除く）糖蛋白を意味する。

したがって単にｒＤＢＰＪと言う表現は、特記しない限り、これら全ての変種を包含すると了解される。

「マクロファージ活性化」とは、マクロファージを増大レベルの食細胞活性まで刺激することを意味する。

発明の詳細な説明動物ＤＢＰとして同定されている血清因子は、ＢおよびＴ細胞グリコシダーゼの作用によりマクロファージ活性化因子まで変換される。ＤＢＰは特定オリゴ糖を付着させたポリペプチドとして存在し、その１部は容易に入手しうるグリコシダーゼての処理によって容易に除去することかできる。これらグリコシダーゼは、ＤＢＰに対するＢおよびＴ細胞の機能と同等である。特定グリコシダーゼての処理により、ＤＢＰは高能力のマクロファージ活性化因子まで予想外に変換される。すなわちＤＢＰからマクロファージ活性化因子への効率的変換がＢ−およびＴ −細胞の不存在下にインビトロで達成される。ＤＢＰの酵素処理により生成される新規なマクロファージ活性化因子は実質的に純粋であって、微量（５００ｐｇ／体重ｋｇ）を宿主に投与しただけで食細胞マクロファージ活性化を著しく増大させるような高能力を有する。

新規な因子の酵素的生成はマクロファージ活性化におけるＢ−およびＴ−細胞の機能を回避するので、これはワクチン接種のための有力なアジュバントとして並びに重大な感染症のための感染後の治療剤として用いられる。

γ−インクフエロンとしても知られるＴ細胞リンホカインマクロファージ活性化因子はリンホカイン産生Ｔ細胞により少量で生成され、或いは遺伝子工学によって得られる。他方、本発明の新規なマクロファージ活性化因子は、公知の精製法により動物血液の血漿から容易に精製しうるＤＢＰから容易に得ることができる。

多形性ＤＢＰ表現型は、特にＤＢＰ分子のポリペプチド部分に結合したオリゴ糖の差として現される。本発明、の新規なマクロファージ活性化因子は、β−ガラクトシダーゼとシアリダーゼとの組合せ物またはβ−ガラクトシダーゼとα−マンノシダーゼとの組合せ物と共に培養することにより動物ＤＢＰから効率的に産生させることができる。幾つかの場合、β−ガラクトシダーゼのみによるＤＢＰの処理はマクロファージ活性化因子を効率的に生成させる。市販酵素の作用によるＤＢＰからマクロファージ活性化因子へのインビトロ変換は極めて効率的であって、マクロファージ活性化因子の極めて高い活性が得られる。

多くの動物種類における遺伝子多形性に基づき、ＤＢＰは好ましくは酵素混合物としての３種全ての酵素で処理される。特に、各種類の数匹の個体から集めた血液から得られるＤＢＰは２種類以上のＤＢＰを含有することがある。したがってＤＢＰからマクロファージ活性化因子への完全変換は、酵素混合物としての３種全ての酵素で処理して最も効率的に達成することができる。

β−ガラクトシダーゼのみて処理されたＤＢＰｇはマクロファージを効率的に活性化する。したがって、ＤＢＰｇからのガラクトースの除去はマクロファージ活性化因子の生成をもたらす。他方、ＤＢＰｇｓおよびＤＢＰｇｍ動物からのＤＢＰを変換するには２種のグリコシダーゼが必要とされる。ＤＢＰｇｓからマクロファージ活性化因子への変換は、β−ガラクトシダーゼとシアリダーゼとの組合せ物と共に培養することを必要とする。ＤＢＰｇｍの変換はβ−ガラクトシダーゼとα−マンノシダーゼとを必要とする。

動物ＤＢＰ表現型およびサブタイプは、分子の蛋白部分におけるアミノ酸残基に結合した次のオリゴ糖構造を有する糖蛋白として特性化されると思われる：代表的ＤＢＰ型　オリゴ糖　動物種類ＤＢＰｇｓ　Ｇａ１−Ｇａ１ＮＡｃ−サル、ウシ、ＮｅｕＮＡｃ　ブタ、ウマＤＢＰｇｍ　Ｇａ１−Ｇａ１ＮＡｃ−ウシαＭａｎＤＢＰｇ　Ｇａ　１−Ｇａ　ｌＮＡｃ−イヌ、ネコ、特定の理論に拘束するものてないが、上記グリコジル化はＤＢＰの蛋白部分にてヒトＤＢＰのほぼ位置４２０に対応するアミノ酸位置に存在するスレオニンもしくはセリン残基を介し或いは同じ付近におけるスレオニンもしくはセリン残基を介して生じ、０−グリコシド結合Ｇａ１ＮＡｃａ　（１→０）−ＴｈｒもしくはＧａ１ＮＡｃａ　（１−” ０）−５ｅｔを生成すると思われる。すなわち特定の理論に拘束されるものでないが、新規なマクロファージ活性化因子は実質的にＤＢＰのアミノ酸配列を有すると共にアミノ酸残基に結合した末端Ｎ−アセチルガラクトサミン基を有する実質的に純粋形態の蛋白で構成されると思われる。

本発明の方法に使用する高純度の動物ＤＢＰはリンク等、アナリチカル・バイオケミストリー、１１５７巻、第２６２頁（１９８６）　（その開示全体を参考のため、ここに引用する）の方法にしたがい動物血液の２５−ヒドロキシビタミンＤ３−セファロース（登録商標）親和性クロマトグラフィーにより最も容易に作成される。ＤＢＰはハダド等、バイオケミカル・ジャーナル、第２１８巻、第８０５頁（１９８４）の方法にしたかいアクチン−アガロース親和性クロマトグラフィーによっても精製することかでき、これはアクチンに対するＤＢＰの結合特異性を利用する［）飄ダト等の開示全体を参考のため、ここに引用する］。高純度でＤＢＰを得る池の方法は文献に報告されている。対応するヒト蛋白、すなわちＧｃ蛋白を精製するため用いられる公知の方法を、動物ＤＢＰの精製にも直接用いることができる。

本発明の実施に用いられるグリコシダーゼは周知されかつ市販されている。β− ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−ガラクトシダーゼガラクトヒドロラーゼ、Ｅ、Ｃ３，２゜１．２３）は大腸菌（Ｅｓｃｈｃ＋１ｃｈｉａ　Ｃｏ１１）から得られる。

β−ガラクトシダーゼはたとえばベーリンガー・マン／ｈイム・バイオケミカルス社、インジアナポリス、インジアす州からカタログＮｏ。６３４３９５として入手できる。

α−マンノシダーゼ（α−Ｄ−マンノシドマンノヒドロラーゼ、ＥＣ３，２，１，２４）はタチナタマメ　（Ｃｌｎａｖｇｌ目ｅｎｓｉｌｏ＋ｍ１ｓ）から得られる。これはたとえばベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社からカタログｔ１ｏ、２６９６１１として入手できる。

「ノイラミニダーゼ」としても知られるシアリダーゼ（アシルノイラミニルヒドロラーゼ、ＥＣ３，２，１゜１８）はクロストリジウム・ベルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔ＋１ｄｉｕ＋ｎ　ｐｅ＋ｌ＋ｉｎｇｅｎ＋　）　、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂ＋ｉｏ　ｃｈ○ｌｅ＋ａｅ　）またはアースロバフタ−・ウレアファシェンス（＾＋ｌｈ＋ｏｂａｃｔｅ＋　ｕ＋ｅａｌａｃｉｅｎ＋）から得られる。

これら３種の全てのシアリダーゼはヘーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社からカタログＮｏ、１０７５９０．１、０８０７２５および２６９６１１として入手できる。

ＤＢＰは、加水分解上有効量の１種もしくはそれ以上の上記グリコシダーゼとの接触によりマクロファージ活性化因子まで容易に変換される。ＤＢＰからマクロファージ活性化因子への実質的に完全な変換を達成するのに充分な量の酵素を用いることかできる。約０．１単位（１単位は１μモルの基質を１分間で触媒する酵素の量である）の各酵素をＤＢＰＩμｇ当りに使用すればこの目的に充分である。好ましくは、糖蛋白をマクロファージ活性化因子まで変換するのに実際に必要とされる量よりも過剰の酵素を用いて完全変換を確保する。

ＤＢＰと酵素とを、たとえば燐酸塩緩衝液または酢酸塩緩衝液にて接触させることができる。燐酸塩緩衝液が好適である（ｐＨ５，５）。酵素反応を行う当業者に知られた他の培地を用いることもできる。

反応は、酵素反応を行うのに適した任意の温度で行うことができる。典型的には温度は２５〜３７°Ｃの範囲とすることができ、約３７℃が好適である。基質と酵素とを反応媒体中でＤＢＰからマクロファージ活性化因子への実質的変換が達成されるまで培養する。用いる実際の培養時間はたとえば反応体の濃度、反応温度などの諸刃子に依存しうると思われるが、３７℃にて約３０分間の反応時間にて一般的にＤＢＰからマクロファージ活性化因子への完全変換を得るのに充分である。

ＤＢＰからマクロファージ活性化因子への変換は、酵素反応に適する任意の容器で行うことができる。シアリダーゼは不溶性型（たとえばビーズ化したアガロース（シグマ・ケミカル・カンパニー社、カタログＮｏ、Ｎ−４４８３）に付着）にて使用し、同様な分子量のシアリダーゼ断片により得られたマクロファージ活性化因子の汚染を回避するのが好適である。マクロファージ活性化因子は、適する酵素を液体培地中でＤＢＰに添加し、次いで液体を濾過してマクロファージ活性化因子を回収することにより製造することができる。たとえば酵素−ＤＢＰの反応混合物を無菌の１００ｋＤａ切断フイルタ（たとえばアミコンＹＭ１００）に通過させて、固定化シアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＭＷ＝５４０　ｋＤａ）およびα−マンノシダーゼ（ＭＷ＝　１９０　ｋ　Ｄ　ａ）を除去することができる。濾液は実質的に純粋な高活性のマクロファージ活性化因子を含有する。多量のＤＢＰからマクロファージ活性化因子への変換を所望する場合は、最も有利には全酵素を固相に含有させる。β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼもしくはα−マンノシダーゼ、最も好ましくは３種全ての酵素の混合物をたとえばシアンブロマイドのような適するカップリング剤によりたとえばアガロースビーズに固定する。酵素を固体支持体に付着させる方法は当業者に知られている。固定化酵素との培養によるＤＢＰからマクロファージ活性化因子への変換が好適である。何故なら、その後に酵素混合物からマクロファージ活性化因子を分離する工程が省略されるからである。

固定化酵素または液相酵素のいずれを用いるかに拘らず生成混合物を限外フィルタ（好ましくは約０．４５μ以下の孔径を有するフィルタ）に通過させてマクロファージ活性化因子の無菌調製物を得ることが望ましい。

Ｂ−細胞はβ−ガラクトシダーゼに対応する機能を有し、さらにＴ−細胞はシアリダーゼおよび。−マンノシダーゼに対応する機能を有する。特定の理論に拘束されるものではないが、ＤＢＰは、正規配列でＢ及びＴリンパ球の膜酵素によりインビボ改変されて、マクロファージ活性化因子を生成すると思われる。

その増大した食細胞活性を特徴とするマクロファージの活性化は、宿主免疫防御メカニズムにおける主たる第１段階である。マクロファージ活性化はＢおよびＴリンパ球機能を必要とし、この機能は新規なマクロファージ活性化因子を生成するよう段階的にＤＢＰを改変する。

ＤＢＰからマクロファージ活性化因子への本発明によるインビトロ変換に用いるグリコシダーゼはマクロファージ活性化因子の産生に必要とされるＢ−およびＴ −細胞機能に対応するので、マクロファージ活性化因子のインビトロ酵素発生はＢ−およびＴ−細胞の機能を必要としない。さらに、ここに説明したマクロファージ活性化因子は処理を受けた同じ動物種類の血液から発生させうるので、たとえば免疫原性のような副作用が最小化されると思われる。

感染の後、微生物抗原はマクロファージにより結合される。この表面結合した抗原の大部分は内部化され（すなわち食作用を受け）、切断により処理される。マクロファージは幾つかの処理された抗原をその表面に復帰させて、抗原決定基を抗原特異性リンパ球に効率的に「提示」することができる。しかしながら、抗原の結合、食作用、処理および提示は、最初にマクロファージが活性化されることを必要とする。感染後の免疫反応の発生はしたがって、典型的には完全なマクロファージ活性化に応じ１〜２週間遅延する。これは、Ｂ−およびＴ−細胞がマクロファージ活性化因子の発生に関与する期間である。この遅延期間の間に、感染は明確になりうる。

本発明者は、ＤＢＰから作成されたマクロファージ活性化因子の投与の後に６時間未満でマウスにおけるマクロファージ活性化の発生を観察した。実質的な抗体産生は、マクロファージ活性化因子と抗原とを同′時に注射して４８時間位の短時間後にマウスで観察される。多量の抗原特異性抗体が９６時間以内に産生される。したがって、極めて急速なマクロファージの活性化を誘発しうる本発明のマクロファージ活性化因子は免疫反応の発現を増大かつ加速させると共に多量の抗原特異性抗体を発生させるワクチン接種のためのアジュバントとして有用であると思われる。さらに同し理由から、マクロファージ活性化因子は単独で或いは他の治療剤と組合せて抗体産生を促進するための感染後の治療剤として用いうると考えられる。この療法は、狂犬病のような長潜伏期間を伴う感染症の処置に特に有効である。

マクロファージ活性化因子を投与してから生じつる免疫学的反応を最小化させるには、各種類の動物に同じ動物種類の血液から得られたマクロファージ活性化因子のみを摂取させるのが好適である。同様に個々の動物における免疫学的反応の危険は、種類内ＤＢＰ多形性が存在する状況にて同一種類のＤＢＰ由来のマクロファージ活性化因子のみを投与することにより最小化される。

マクロファージ活性化因子は、単独で或いは他の治療剤と組合せてマクロファージ活性化を誘発させるべく動物に投与することができる。投与するマクロファージ活性化因子の量はたとえば薬剤の効力、求めるマクロファージ活性化の持続時間および種変、患者の体格および体重、病気の種類など種々の因子に依存する。

一般に、患者の体重１ｋｇ当り約０．５％ｇ程度に少ない因子の投与で実質的なマクロファージ活性化が生ずる。１つの処置によれば、動物に３〜５日毎に約２ｎｇのマクロファージ活性化因子を摂取させて、マクロファージ活性化の有意なレベルを維持することができる。

マクロファージ活性化因子は、実質的なマクロファージ活性化を誘発させるのに充分な量の因子を循環させるよう供給する便利な手段によって投与することができる。

たとえば、静脈注射または筋肉内注射により供給することかできる。筋肉的投与が投与経路として現在好適である。

マクロファージ活性化因子は、医薬上許容しつるキャリヤ（特に蛋白質薬品の供給に適するようなキャリヤ）に混入することができる。因子は水または塩水溶液に可溶性である。したがって、獣医薬理学的用途に好適な処方は、この薬剤の塩水溶液で構成される。処方物は必要に応じ他の薬剤、たとえば浸透圧バランスを維持するための薬剤等を含有することもできる。たとえば注射用の典型的なキャリヤは０．９％ＮａＣ１水溶液もしくは燐酸塩緩衝塩水（０，ＯＩＭの燐酸ナトリウムを含をする０、９％ＮａＣ１水溶液、＝ｐＨ７，０）で構成することができる。

以下、限定はしないが実施例により本発明を説明する。

（Ａ）ウシ、（Ｂ）７頭のウシの保存血液、（Ｃ）ネコまたは（Ｄ）イヌから得られた精製ＤＢＰ　（１，０μｇ）を、Ｏ，ＯＩＭの燐酸ナトリウムと０．９％のＮａＣ１と１ｍＭのＭｇＳＯ４とを含有する１ｍｌの燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ −Ｍｇ）と合し、表１に示した酵素組合せ物のＯ，ＩＵを含有する２μｌのＰＢＳ−Ｍｇで処理した。用いた酵素は次の通りである：シアリダーゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社、カタログＮｏ、Ｉ　Ｑ　７５９０　）　；α−マンノンダーゼ（ヘーリンガー社、カタログＮ。

１０７３７９）： β−ガラクトシダーゼ（ヘーリンガー社、カタログＮ０６３４３９５）。

各酵素−ＤＢＰ混合物を微小遠沈管にて３７℃で６０分間培養した。酵素処理されたＤＢＰを含有する反応混合物を次いで０．１％卵アルブミン（Ｅ　Ａ）補充培地にて次の分析のため１０−４に希釈した。

０、ＯＩＭの燐酸ナトリウムと０．９％のＮａＣ１と５単位／ｍｌのヘパリンとを含有する５ｍｌの燐酸塩緩衝塩水をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔に注射することにより、腹膜細胞を集めた。腹膜細胞を副出し、低速遠心分離により洗浄すると共に、０．１％卵アルブミンを補充の組織培養培地ＲＰＭＩ　１６４０　（ＥＡ培地）に１〜２Ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁させた。１ｍｌの細胞懸濁物を、組織培養プレート（コスタ−社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の直径１６ｍｍの穴に置かれた１２ｍｍのカバーグラスに載せた。これらプレートを５％ＣＯ２培養器にて３７℃で３０分間培養して、カバーグラスに対しマクロファージを付着させた。カバーグラスを外し、ＲＰＭＩ培地中で緩和に攪拌して浸漬させることにより非付着性のＢ−およびＴ−細胞を脱着させ、ＥＡ− 培地を含有する新たな組織培養穴に入れた。

洗浄されたヒツジ赤血球を、ウサギ抗ヒツジ赤血球抗体の精製１ｇＧフラクションの亜凝集希釈物で被覆した。

ＲＰＭＩ　１６４０培地におけるウサギＩｇＧ被覆ヒツジ赤血球の０．５％懸濁物を次の食作用分析に用いるた上記Ａからの１ｍｌの希釈反応混合物を上記８．１からのマクロファージ被覆カバーグラスに載せ、５％Ｃ０２培養器にて３７℃ で２時間培養した。次いで培地を除去し、０．５ｍｌの０．５％赤血球−ＩｇＧ結合体懸濁物をマクロファージ被覆カバーグラスに添加し、３７℃にて１時間培養した。次いでカバーグラスを低張性溶液（水における１１５希釈の燐酸塩緩衝塩水）で洗浄して、未摂取の赤血球を溶解させた。摂取された赤血球を有するマクロファージを計数した。マクロファージ１個当りに摂取された赤血球の平均個数も測定した。マクロファージ食作用活性を、「摂取指数（Ｉｎｇｅ＋ｔｉｏｎ　１ｎｄｅｘ　）　Ｊ（赤血球を摂取したマクロファージの比率×マクロファージ１個当りに摂取された赤血球の平均数）として計算第１表グリコシダーゼ処理されたＤＢＰによるマクロファージ活性化ＤＢＰを処理するため −５５±１０　６７±１５シアリダーゼ　５９±１５　７１±１９β−ガラクトシダーゼ　６３±１８　７６±１５α−マンノシダーゼ　６１±１３　７３±２８β−ガラクトシダーゼ　２９５±３４　３３５±３２α−マンノシダーゼ　６７±２２　５４±１２＋シアリダーゼ β−ガラクトシダーゼ　７２±１５　１８８±３８＋α−マンノシダーゼ第１表（続き）グリコシダーゼ処理されたＤＢＰによるマクロファージ活性化ＤＢＰを処理するため −７７±１２　７３±１９ンアリダーゼ　８０±２１　５９±１゜β−ガラクトシダーゼ　２７８±３５　２８４±４１α−マンノシダーゼ　６９±１５　６２±２６β−ガラクトシダーゼ　２６９±３１　２６５±３７＋シアリダーゼ α−マンノシダーゼ　７３±２０　６７±２６＋シアリダーゼ β−ガラクトシダーゼ　２６６±３８　２５２±３３＋α−マンノシダーゼ第１表から明らかなように、ウシの種類はＤＢＰ型に関し多形性を示す。単一のウシ個体からの精製ＤＢＰ（Ａ欄）は、シアリダーゼとβ−ガラクトシダーゼとの組合せ物での処理によりマクロファージ活性化因子まで変換されたが、β−ガラクトシダーゼとシアリダーゼもしくはα−マンノシダーゼとによる処理は７頭のウシの保存ウシ血漿より精製されたＤＢＰからマクロファージ活性化因子を発生させた。したがって単一のウシ個体はＤＢＰ型ｒｇｓＪであったのに対し、保存材料はＤＢＰｇｓ個体とＤＢＰｇｍ個体との両者か、らのＤＢＰで構成されたことが明かである。同様に、ネコおよびイヌＤＢＰドナーは、ガラクトシダーゼ単独での処理がマクロファージ活性化因子の発生につき充分であったので、ＤＢＰｇ型であったことも第１表から明かである。

活性に対するマクロファージ活性化因子濃度の効果を、同しウシＤＢＰｇｓ、保存ウシＤＢＰおよびネコＤＢＰｇを実施例１にしたがい最初の１．０μｇ／ｍｌ溶液の１０　．１０’および１０−６におけるグリコシダーゼ処環ＤＢＰ希釈にて処理することにより検査した。結果を第２表（ウシＤＢＰｇｓ）　、第３表（保存ウシＤＢＰ）第２表グリコシダーゼ処理ウシＤＢＰｇｓによるマクロファージ活性化グリコシダーゼ　ウシＤＢＰ　β−ガラクトシとで処理されたＤＢＰｇｓの希釈　未処理比較　ウシＤＢＰＩＱ−４６３土１２　２８９±１１１０’　５９±１．５　３２２±３５１０−６　５５±１８　１１６±２２第３表グリコシダーゼ処理保存ウシＤＢＰによるマクロファージ活性化グリコシダ　ウシＤＢＰ　β−ガラクト　β−ガラクトーゼ処理　シダーゼおよび　シダーゼされた保存　シアリダーゼ　およびα−ウシＤ　Ｂ　Ｐ　Ｈで処理された　マンノシダーおよびＤ　Ｂ　Ｐ　ｇｍ　ウシＤＢＰ　ゼで処理されの希釈　未処理比較　ウシＤＢＰ１０”　７２±２５　３１２±３８　２８５±３８１０　’　８３＋　２０　２９７＋　４５　２０３＋　３６１０’　７６±１８　川±３４　１２２±２３第４表グリコシダーゼ処理ネコＤＢＰｇによるマクロファージ活性化グリコシダーゼ　ネコＤＢＰ　β−ガラクトシ処理　ダーゼで処理されたネコＤＢＰの希釈　未処理比較　ネコＤＢＰ１０’　６８±２６　３２０±２９１０’　７６±２０　１０８±３４実施例３精製されたＤＢＰ　（下記の第５表に同定された各動物種類から１．０μｇ）を実施例１にしたがいβ−ガラクトンダーゼとシアリダーゼとα−マンノシダーゼとの混合物（それぞれ０．５０）により、０．ＯＩＭの燐酸す、トリウムと０．９％のＮａＣｌと１ｍＭのＭｇＳＯ４とを含有する１ｍｌのＰ　Ｂ　５−Ｍｇにて３７℃で６０分間処理した。次いで、それぞれ処理ＤＢＰを含有する反応混合物を０．１％補充ＥＡ培地にて１０−４に希釈し、実施例ＩＢのインビトロ分析にしたがいマクロファージ活性化の活性につき分析した。結果を第５表に示す。

観察されうるように、３種全ての酵素を含有する混合物での処理はＤＢＰ多形性とは無関係にＤＢＰを有力なマクロファージ活性化因子まで変換させた。

摂取指数グリコシダーゼ　未処理　β−ガラクトシダーゼ処理ＤＢＰ　比較　＋ンアリダーゼサル　７２±２６　２９５±３８（Ｍａｃｘｃａ　Ｉｕｃａｔａ　）ウシ　５２±１９　３２０±５２（Ｂｏｓ　ｆａｕｎａｓ）ヒツジ　４８±１７　３１３±４８（Ｏｖｉｓ　＠ｌｉｅ＋）、ヤギ　５６　±　２４　２８９　±　３２（Ｃａｐｒａ　ｈｉ＋ｃｏｓ）第５表（続き）摂取指数グリコシダーゼ　未処理　β−ガラクトシダーゼ処理ＤＢＰ　比較　＋シアリダーゼブタ　４７±１２　３３２±２７（Ｓｕｓ　ｓｅ＋ｏｆａ）ウマ　６９±２３　２６６±３８（Ｅｑｕｕｓ　ｃａｂａｌｌｕ＋）ネコ　５８±１５　３２８±４３（Ｆｅｌｉ＋　ｃａｌｕ＋　）イヌ　６０±１７　３３７±１８（Ｃａｎｉ＋　ｌａｍｉｌｉｇ＋ｉｓ）ラット　６５±２５　２８４±３７（Ｆｉｓｈｅｒ）マウス　７１±２８　２７６±３４（ＢＡＬＢ／Ｃ）実施例４１００ｍｇのＣＮＢｒ−活性化アガロース（セファロース４Ｂ）を１ｍＭのＨＣＩで洗浄し、次いでＮａＨＣＯ３緩衝液（０，１Ｍ５ｐＨ８，３）およびＮａＣ１（０，５Ｍ）を含有するカップリング緩衝液（３００μｌ）に懸濁させた。β −ガラクトシダーゼとα−マンノシダーゼもしくはシアリダーゼまたは３種全ての酵素の混合物（各酵素２Ｕ）を６００μｌのカップリング緩衝液に混入し、室温で２時間にわたり転動ミキサで培養した。アガロースにおける残留活性基を、室温での２時間にわたるカップリング緩衝液中における０、２Ｍグリシンとの培養により封鎖した。アガロース−固定化酵素をカップリング緩衝液で洗浄して未吸収の蛋白およびグリシンを除去し、次いでＮａＣ１（０，５Ｍ）を含−有する酢酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ４）と追加のカップリング緩衝液とで洗浄した。

アガロース−固定化酵素の調製物を４℃で貯蔵した。

２、ＤＢＰからマクロファージ活性化因子への変換１ｍｌのＰＢＳ−Ｍｇ　（ｐＨ５，５）におけるＤＢＰを上記で作成されたアガロース−固定化酵素（各酵素２単位）の混合物と１ｍｌのＰＢＳ−Ｍｇ　（ｐＨ５，５）にて合した。この反応混合物を５ｍｌのプラスチックチューブにて３７℃で３０分間にわたり転動ミキサで培養した。次いて反応混合物を卓上遠心分離器で２．００Ｏｒｐｍにて１５分間にわたり遠心分離した。各反応混合物の上澄液を集め、滅菌された孔径０．４５μのフィルタ（タイプＨＡ、ミリポア・カンパニー社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）で濾過すると共に、希釈シた。

Ｂ、　マクロファージ′”　のインビボ酵素改変されたＤＢＰ　（１００，３０，１０，３およびｉｐｇ試料）を体重２０ｇまでのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに筋肉内投与した。投与してから１８時間の後、腹膜細胞を集めて組織培養プレートの１６ｍｍ穴における１２ｍｍのカバーグラスに載せた。これらプレートを３７°Ｃて３０分間培養してマクロファージを付着させた。カッく一グラスをＲＰＭＩ　１６４０培地で洗浄して非付着性細胞を脱着させ、次いて新たな穴に入れた。実施例ＩＢ。

２で作成したウサギＩｇＧ−被覆ヒツジ赤血球をこのカバーグラスに載せ、食作用分析を実施例ＩＢ、３におけ第６表グリコシダーゼ処理ウシＤＢＰｇｓによるマクロファージ活性化のインビボ分析酵素改変された　未処理比較　β−ガラクトシダＤＢＰの投与量　−ゼおよび］、　ＯＯ６３±１８　２８３±４２３０　５６±１７　３４１±３８１０　５２±１８　３１５±４４３　５１±１２　１４１±２７１　６５±１５　８６±１２第６表（続き）グリコシダーゼ処理ウシＤＢＰｇｓによるマクロファージ活性化のインビボ分析酵素改変された　未処理比較　β−ガラクトシダＤＢＰの投与量　−ゼおよび（ｐｇ／マウス）　シアリダーゼでの処理１００　５５±２２　２７３±２９３０　４３±１２　２９５±３５１０　６３±１７　２７７±４１３　５１±１５　１２８±２７１　６０±１８　８９±２６本発明はその思想または本質的特徴から逸脱することなく他の特定形態で実施することもでき、したがって本発明の範囲を示すには上記説明でなく請求の範囲を参照すべきである。

フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ

Claims

【特許請求の範囲】

１．グリコシル化された動物ビタミンＤ結合性蛋白をインビトロにて β−ガラクトシダーゼ、またはシアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしくはその混合物と組合せたβ−ガラクトシダーゼと接触させ、次いでマクロファージ活性化因子を分離することを特徴とするマクロファージ活性化因子の生産方法。
２．ビタミンＤ結合性蛋白をβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。
３．ビタミンＤ結合性蛋白をβ−ガラクトシダーゼおよびα−マンノシダーゼと接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。
４．ビタミンＤ結合性蛋白をβ−ガラクトシダーゼと接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。
５．ビタミンＤ結合性蛋白をβ−ガラクトシダーゼとシアリダーゼとα−マンノシダーゼとからなるグリコシダーゼの混合物と接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。
６．ビタミンＤ結合性蛋白がウシビタミンＤ結合性蛋白からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
７．ビタミンＤ結合性蛋白がウマビタミンＤ結合性蛋白からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
８．ビタミンＤ結合性蛋白がヒツジビタミンＤ結合性蛋白からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
９．ビタミンＤ結合性蛋白がブタビタミンＤ結合性蛋白からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
１０．ビタミンＤ結合性蛋白がヤギビタミンＤ結合性蛋白からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
１１．ビタミンＤ結合性蛋白がイヌビタミンＤ結合性蛋白からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
１２．ビタミンＤ結合性蛋白がネコビタミンＤ結合性蛋白からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
１３．酵素を固体支持体に固定化する請求の範囲第１項に記載の方法。
１４．固体支持体がアガロースからなる請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．請求の範囲第１項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
１６．請求の範囲第２項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
１７．請求の範囲第３項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
１８．請求の範囲第４項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
１９．請求の範囲第５項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２０．請求の範囲第６項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２１．請求の範囲第７項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２２．請求の範囲第８項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２３．請求の範囲第９項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２４．請求の範囲第１０項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２５．請求の範囲第１１項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２６．請求の範囲第１２項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２７．請求の範囲第１３項に記載の方法により作成されるマクロファージ活性化因子。
２８．グリコシル化された動物ビタミンＤ結合性蛋白をインビトロにて β−ガラクトシダーゼ、またはシアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしくはその混合物と組合せたβ−ガラクトシダーゼで処理することにより生成されたマクロファージ活性化因子を医薬上許容しうるキャリヤと組合せてなるマクロファージ活性化組成物。
２９．ビタミンＤ結合性蛋白がβ−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼで処理される請求の範囲第２８項に記載のマクロファージ活性化組成物。
３０．ビタミンＤ結合性蛋白がβ−ガラクトシダーゼおよびα−マンノシダーゼで処理されてなる請求の範囲第２８項に記載のマクロファージ活性化組成物。
３１．ビタミンＤ結合性蛋白がβ−ガラクトシダーゼで処理されてなる請求の範囲第２８項に記載のマクロファージ活性化組成物。
３２．ビタミンＤ結合性蛋白がβ−ガラクトシダーゼとシアリダーゼとα−マンノシダーゼとからなるグリコシダーゼの混合物で処理されてなる請求の範囲第２８項に記載のマクロファージ活性化組成物。
３３．グリコシル化された動物ビタミンＤ結合性蛋白をインビトロにて β−ガラクトシダーゼ、またはシアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしくはその混合物と組合せたβ−ガラクトシダーゼと接触させて作成されたマクロファージ活性化因子を、マクロファージ活性化因子を必要とする動物に投与することを特徴とする動物におけるマクロファージ活性化の誘発方法。
３４．マクロファージ活性化因子が、ビタミンＤ結合性蛋白をインビトロにてβ −ガラクトシダーゼとシアリダーゼとα−マンノシダーゼとからなるグリコシダーゼの混合物と接触させて作成されたものである請求の範囲第３３項に記載の方法。