JP2808047B2 - 動物ビタミンｄ結合性蛋白からのマクロファージ活性化因子 - Google Patents
動物ビタミンｄ結合性蛋白からのマクロファージ活性化因子Info
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明はマクロファージ活性化に関し、詳細には有力
なマクロファージ活性化因子のインビトロにおける酵素
的生産に関するものである。
なマクロファージ活性化因子のインビトロにおける酵素
的生産に関するものである。
発明の背景 A.炎症は反応はマクロファージの活性化をもたらす 種々の組織の微生物感染は炎症を引起こして、食細胞
の走化性および活性化をもたらす。炎症した組織は、ホ
スホリパーゼＡの活性化によりリゾホスホリピドを放出
する。炎症した癌組織はアルキル−リゾホスホリピドお
よびアルキルグリセロール、並びにリゾホスホリピドを
生成する。何故なら、癌細胞はアルキルホスホリビドと
モノアルキルジアシルグリセロールとを含有するからで
ある。これらリゾホスホリピドおよびアルキルグリセロ
ール、すなわち炎症した正常組織および癌組織における
膜脂質の分解生産物は有力なマクロファージ活性化剤で
ある［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第47巻、第
2008頁（1987）；ヤマモト等、キャンサー・イミュノロ
ジカル・イミュノテラピー、第25巻、第185頁（198
7）；ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第24巻、第6
044頁（1988）］。
の走化性および活性化をもたらす。炎症した組織は、ホ
スホリパーゼＡの活性化によりリゾホスホリピドを放出
する。炎症した癌組織はアルキル−リゾホスホリピドお
よびアルキルグリセロール、並びにリゾホスホリピドを
生成する。何故なら、癌細胞はアルキルホスホリビドと
モノアルキルジアシルグリセロールとを含有するからで
ある。これらリゾホスホリピドおよびアルキルグリセロ
ール、すなわち炎症した正常組織および癌組織における
膜脂質の分解生産物は有力なマクロファージ活性化剤で
ある［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第47巻、第
2008頁（1987）；ヤマモト等、キャンサー・イミュノロ
ジカル・イミュノテラピー、第25巻、第185頁（198
7）；ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第24巻、第6
044頁（1988）］。
ネズミに対するリゾホスホリピド（５〜20μg/ネズミ
１匹）およびアルキルグリセロール（10〜100ng/ネズミ
１匹）の投与はマクロファージを活性化させて、免疫グ
ロブリンＧ−被覆ヒツジ赤血球を食作用（phagocytiz
e）させる。マクロファージはそのリセプタを介して標
的赤血球を食作用し、これらリセプタは免疫グロブリン
ＧのFc部分を確認するが補体のC3b部分を確認しない
［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第47巻、第2008
頁（1987）］。
１匹）およびアルキルグリセロール（10〜100ng/ネズミ
１匹）の投与はマクロファージを活性化させて、免疫グ
ロブリンＧ−被覆ヒツジ赤血球を食作用（phagocytiz
e）させる。マクロファージはそのリセプタを介して標
的赤血球を食作用し、これらリセプタは免疫グロブリン
ＧのFc部分を確認するが補体のC3b部分を確認しない
［ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第47巻、第2008
頁（1987）］。
リゾホスホリピドもしくはアルキルグリセロールのみ
でネズミ腹膜マクロファージをインビトロ処理しても摂
取活性を増大させない［ヤマモト等、キャンサー・リサ
ーチ、第48巻、第6044頁（1988）］。しかしながら、腹
膜細胞（マクロファージとＢおよびＴリンパ球との混合
物）をリゾホスホリピドもしくはアルキルグリセロール
と共に２〜３時間にわたりインキュベーション（incuba
tion）（培養）すれば、マクロファージのFc−リセプタ
媒介による食細胞活性を顕著に向上させる［ヤマモト
等、キャンサー・リサーチ、第47巻、第2008頁（198
7）；ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第48巻、第6
044頁（1988）］。
でネズミ腹膜マクロファージをインビトロ処理しても摂
取活性を増大させない［ヤマモト等、キャンサー・リサ
ーチ、第48巻、第6044頁（1988）］。しかしながら、腹
膜細胞（マクロファージとＢおよびＴリンパ球との混合
物）をリゾホスホリピドもしくはアルキルグリセロール
と共に２〜３時間にわたりインキュベーション（incuba
tion）（培養）すれば、マクロファージのFc−リセプタ
媒介による食細胞活性を顕著に向上させる［ヤマモト
等、キャンサー・リサーチ、第47巻、第2008頁（198
7）；ヤマモト等、キャンサー・リサーチ、第48巻、第6
044頁（1988）］。
10％胎児ウシ血清を含有する培地にてマクロファージ
をリゾホスホリピド処理もしくはアルキルグリセロール
処理のＢおよびＴリンパ球と共に培養すれば、マクロフ
ァージの食細胞活性を著しく向上させた［ヤマモト等、
キャンサー・リサーチ、第48巻、第6044頁（1988）；ホ
ンマおよびヤマモト、Clin.Exp.Immunol.、第79巻、第3
07頁（1990）］。非付着性（ＢおよびＴ）リンパ球間の
マクロファージ活性化信号伝達の分析により、リゾホス
ホリピド処理もしくはアルキルグリセロール処理のＢ−
細胞は信号化因子をＴ−細胞まで伝達しうることが明か
となった。次いでＴ−細胞はこの因子を改変して、摂取
能力につきマクトファージを最終的に活性化しうる新た
な因子を生成する［ヤマモト等、キャンサー・リサー
チ、第48巻、第6044頁（1988）］。
をリゾホスホリピド処理もしくはアルキルグリセロール
処理のＢおよびＴリンパ球と共に培養すれば、マクロフ
ァージの食細胞活性を著しく向上させた［ヤマモト等、
キャンサー・リサーチ、第48巻、第6044頁（1988）；ホ
ンマおよびヤマモト、Clin.Exp.Immunol.、第79巻、第3
07頁（1990）］。非付着性（ＢおよびＴ）リンパ球間の
マクロファージ活性化信号伝達の分析により、リゾホス
ホリピド処理もしくはアルキルグリセロール処理のＢ−
細胞は信号化因子をＴ−細胞まで伝達しうることが明か
となった。次いでＴ−細胞はこの因子を改変して、摂取
能力につきマクトファージを最終的に活性化しうる新た
な因子を生成する［ヤマモト等、キャンサー・リサー
チ、第48巻、第6044頁（1988）］。
B.ビタミンＤ結合性蛋白 DBPとしても知られるビタミンＤ結合性蛋白は、動物
間で進化論的に保守された糖蛋白である［クックおよび
ハダド、エンドクリン・レビュー、第10巻、第294頁（1
989）］。動物からのDBPはヒトDBPに対し血清学的に交
差反応する［オガタ等、Comp.Bioch.Physiol.、第90B
巻、第193頁（1988）］。動物DBPは或る動物種類におい
ては遺伝子的に多形性の血漿蛋白であって、約52,000の
相対的分子量を有する。これは一般に動物における血漿
蛋白の約0.5％を占める。血漿濃度は一般に約260μg/ml
である。「群特異性成分」もしくは「Gc蛋白」として知
られるヒトDBPの多形性はゲル電気泳動分析によって示
すことができ、２種の主たる表現型:Gc1およびGc2を示
す［ヒルシフェルド等、ネイチャー、第185巻、第931頁
（1960）］。Gc1およびGc2遺伝子の全ヌクレオチドコー
ド化配列、並びに予想アミノ酸配列が報告されている
［クック等、ジャーナル・クリニカル・インベスチゲー
ション、第76巻、第2420頁（1985）；ヤング等、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、US
A、第82巻、第7994頁（1985）］。Gc1はさらにGc1fおよ
びGc1sサブタイプに分割されて２つのバンド、すなわち
「急速」および「低速」バンドとして電気泳動により移
動する［スバスチ等、バイオケミストリー、第18巻、第
1611頁（1979）］。
間で進化論的に保守された糖蛋白である［クックおよび
ハダド、エンドクリン・レビュー、第10巻、第294頁（1
989）］。動物からのDBPはヒトDBPに対し血清学的に交
差反応する［オガタ等、Comp.Bioch.Physiol.、第90B
巻、第193頁（1988）］。動物DBPは或る動物種類におい
ては遺伝子的に多形性の血漿蛋白であって、約52,000の
相対的分子量を有する。これは一般に動物における血漿
蛋白の約0.5％を占める。血漿濃度は一般に約260μg/ml
である。「群特異性成分」もしくは「Gc蛋白」として知
られるヒトDBPの多形性はゲル電気泳動分析によって示
すことができ、２種の主たる表現型:Gc1およびGc2を示
す［ヒルシフェルド等、ネイチャー、第185巻、第931頁
（1960）］。Gc1およびGc2遺伝子の全ヌクレオチドコー
ド化配列、並びに予想アミノ酸配列が報告されている
［クック等、ジャーナル・クリニカル・インベスチゲー
ション、第76巻、第2420頁（1985）；ヤング等、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、US
A、第82巻、第7994頁（1985）］。Gc1はさらにGc1fおよ
びGc1sサブタイプに分割されて２つのバンド、すなわち
「急速」および「低速」バンドとして電気泳動により移
動する［スバスチ等、バイオケミストリー、第18巻、第
1611頁（1979）］。
クーペンハーバー等、アーキテクチャー・バイオケミ
カル・バイオフィジークス、第226巻、第218〜223頁（1
983）は、翻訳後のグリコシル化の差がスレオニン残基
で生じ、Gc1とGc2との間にアミノ酸が相違を有した蛋白
の領域に出現することを報告している。
カル・バイオフィジークス、第226巻、第218〜223頁（1
983）は、翻訳後のグリコシル化の差がスレオニン残基
で生じ、Gc1とGc2との間にアミノ酸が相違を有した蛋白
の領域に出現することを報告している。
ビオー等、バイオケミカル・バイオフィジークス・リ
サーチ・コミューニケーション、第117巻、第324〜331
頁（1983）はGc1のＯ−グルコシド結合したグリカンに
つき推定構造を報告しており、これはセリンもしくはス
レオニン残基に結合したシアル酸とガラクトースとＮ−
アセチルガラクトサミンとの線状配置を有する。
サーチ・コミューニケーション、第117巻、第324〜331
頁（1983）はGc1のＯ−グルコシド結合したグリカンに
つき推定構造を報告しており、これはセリンもしくはス
レオニン残基に結合したシアル酸とガラクトースとＮ−
アセチルガラクトサミンとの線状配置を有する。
哺乳動物DBPの多形性は、等電焦点法により示すこと
ができる［ガーネおよびジェネヤ、アニマル・ブラッド
・グループス・バイオケミカル・ジェネチックス、第９
巻、第37頁（1978）；バン・デ・ウェーゲ等、Comp.Bio
chem.Physiol.、第73B巻、第977頁（1982）；オガタ
等、Comp.Biochem.Physiol.、第90B巻、第193頁（198
8）］。
ができる［ガーネおよびジェネヤ、アニマル・ブラッド
・グループス・バイオケミカル・ジェネチックス、第９
巻、第37頁（1978）；バン・デ・ウェーゲ等、Comp.Bio
chem.Physiol.、第73B巻、第977頁（1982）；オガタ
等、Comp.Biochem.Physiol.、第90B巻、第193頁（198
8）］。
動物DBPは、文献に報告されている各種の手段により
精製することができる。たとえば、DBPは種々の動物種
類の血漿から25−ヒドロキシビタミンD3−セファロース
（登録商標）親和性クロマトグラフィーにより精製する
ことができる［リンク等、アナリチカル・バイオケミス
トリー、第157巻、第262頁（1986）］。さらにDBPは、
アクチンに対するその特異的結合能力に基づきアクチン
−アガロース親和性クロマトグラフィーによっても精製
することができる［ハダド等、バイオケミアル・シャー
ナル、第218巻、第805頁（1984）］。
精製することができる。たとえば、DBPは種々の動物種
類の血漿から25−ヒドロキシビタミンD3−セファロース
（登録商標）親和性クロマトグラフィーにより精製する
ことができる［リンク等、アナリチカル・バイオケミス
トリー、第157巻、第262頁（1986）］。さらにDBPは、
アクチンに対するその特異的結合能力に基づきアクチン
−アガロース親和性クロマトグラフィーによっても精製
することができる［ハダド等、バイオケミアル・シャー
ナル、第218巻、第805頁（1984）］。
ヒトおよび動物ビタミンＤ結合性蛋白の特性化および
集中的な研究、並びにその容易な精製方法の存在にも拘
らずこれら蛋白から有力なマクロファージ活性化因子へ
の変換は本発明に至るまで示されていない。
集中的な研究、並びにその容易な精製方法の存在にも拘
らずこれら蛋白から有力なマクロファージ活性化因子へ
の変換は本発明に至るまで示されていない。
発明の要点 有力なマクロファージ活性化因子の生産方法が提供さ
れる。ヒト血清における群特異性成分に対し血清学的に
交差反応する進化論的に保守された動物蛋白である動物
ビタミンＤ結合性蛋白は、マクロファージ活性化因子の
先駆体である。動物DBPは、ＢおよびＴ細胞のグリコシ
ダーゼの作用によりマクロファージ活性化因子まで変換
される。
れる。ヒト血清における群特異性成分に対し血清学的に
交差反応する進化論的に保守された動物蛋白である動物
ビタミンＤ結合性蛋白は、マクロファージ活性化因子の
先駆体である。動物DBPは、ＢおよびＴ細胞のグリコシ
ダーゼの作用によりマクロファージ活性化因子まで変換
される。
マクロファージ活性化因子の作成方法によれば、動物
DBPをインビトロにて（ｉ）β−ガラクトシダーゼと、
或いは（ii）シアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしく
はその混合物と組合せたβ−ガラクトシダーゼと接触さ
せる。有力なマクロファージ活性化因子が多量に得られ
る。
DBPをインビトロにて（ｉ）β−ガラクトシダーゼと、
或いは（ii）シアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしく
はその混合物と組合せたβ−ガラクトシダーゼと接触さ
せる。有力なマクロファージ活性化因子が多量に得られ
る。
本発明の１具体例によれば、ガラクトースおよびシア
ル酸残基を含むオリゴ糖部分（以下「DBPgs」と称す
る）を有すると思われる動物DBPをβ−ガラクトシダー
ゼおよびシアリダーゼと接触させて、マクロファージ活
性化因子を生成させる。他の具体例によれば、ガラクト
ースおよびα−マンノース残基を含むオリゴ糖部分（以
下「DBPgm」と称する）を有すると思われるDBPをβ−ガ
ラクトシダーゼおよびα−マンノシダーゼと接触させ
る。さらに他の具体例によれば、ガラクトース残基を含
むがシアル酸もしくはα−マンノースを含まないオリゴ
糖部分（以下「DBPg」と称する）を有すると思われるDB
Pをβ−ガラクトシダーゼのみと接触させて、マクロフ
ァージ活性化因子を生成させる。DBPの遺伝子多形性に
より、マクロファージ活性化因子は好ましくは、特に種
々異なる個体の貯蔵血漿から精製されたDBPを用いる場
合には、動物DBPを３種全ての酸素と接触させてマクロ
ファージ活性化因子を得ることにより作成される。
ル酸残基を含むオリゴ糖部分（以下「DBPgs」と称す
る）を有すると思われる動物DBPをβ−ガラクトシダー
ゼおよびシアリダーゼと接触させて、マクロファージ活
性化因子を生成させる。他の具体例によれば、ガラクト
ースおよびα−マンノース残基を含むオリゴ糖部分（以
下「DBPgm」と称する）を有すると思われるDBPをβ−ガ
ラクトシダーゼおよびα−マンノシダーゼと接触させ
る。さらに他の具体例によれば、ガラクトース残基を含
むがシアル酸もしくはα−マンノースを含まないオリゴ
糖部分（以下「DBPg」と称する）を有すると思われるDB
Pをβ−ガラクトシダーゼのみと接触させて、マクロフ
ァージ活性化因子を生成させる。DBPの遺伝子多形性に
より、マクロファージ活性化因子は好ましくは、特に種
々異なる個体の貯蔵血漿から精製されたDBPを用いる場
合には、動物DBPを３種全ての酸素と接触させてマクロ
ファージ活性化因子を得ることにより作成される。
さらに本発明は、上記方法またはその具体例により作
成されるマクロファージ活性化因子、並びにマクロファ
ージ活性化因子を医薬上許容しうるキャリヤと組合せて
なる獣医用途の組成物に関するものである。
成されるマクロファージ活性化因子、並びにマクロファ
ージ活性化因子を医薬上許容しうるキャリヤと組合せて
なる獣医用途の組成物に関するものである。
さらに本発明は、マクロファージ活性化を必要とする
動物に対しマクロファージ活性化上有効量の新規なマク
ロファージ活性化因子を投与することによる動物におけ
るマクロファージ活性化の誘発方法にも関するものであ
る。
動物に対しマクロファージ活性化上有効量の新規なマク
ロファージ活性化因子を投与することによる動物におけ
るマクロファージ活性化の誘発方法にも関するものであ
る。
ここで用いる「動物DBP」とは、たとえばDBPg、DBPgs
およびDBPgmのような全ての遺伝子変化を含め「ビタミ
ンＤ結合性蛋白」としても知られる遺伝子的に多形性の
動物（ヒトを除く）糖蛋白を意味する。したがって単に
「DBP」と言う表現は、特記しない限り、これら全ての
変種を包含すると了解される。
およびDBPgmのような全ての遺伝子変化を含め「ビタミ
ンＤ結合性蛋白」としても知られる遺伝子的に多形性の
動物（ヒトを除く）糖蛋白を意味する。したがって単に
「DBP」と言う表現は、特記しない限り、これら全ての
変種を包含すると了解される。
「マクロファージ活性化」とは、マクロファージを増
大レベルの食細胞活性まで刺激することを意味する。
大レベルの食細胞活性まで刺激することを意味する。
発明の詳細な説明 動物DBPとして同定されている血清因子は、Ｂおよび
Ｔ細胞グリコシダーゼの作用によりマクロファージ活性
化因子まで変換される。DBPは特定オリゴ糖を付着させ
たポリペプチドとして存在し、その１部は容易に入手し
うるグリコシダーゼでの処理によって容易に除去するこ
とができる。これらグリコシダーゼは、DBPに対するＢ
およびＴ細胞の機能と同等である。特定グリコシダーゼ
での処理により、DBPは高能力のマクロファージ活性化
因子まで予想外に変換される。すなわちDBPからマクロ
ファージ活性化因子への効率的変換がＢ−およびＴ−細
胞の不存在下にインビトロで達成される。DBPの酸素処
理により生成される新規なマクロファージ活性化因子は
実質的に純粋であって、微量（500pg/体重kg）を宿主に
投与しただけで食細胞マクロファージ活性化を著しく増
大させるような高能力を有する。新規な因子の酸素的生
成はマクロファージ活性化におけるＢ−およびＴ−細胞
の機能を回避するので、これはワクチン接種のための有
力なアジュバントとして並びに重大な感染症のための感
染後の治療剤として用いられる。
Ｔ細胞グリコシダーゼの作用によりマクロファージ活性
化因子まで変換される。DBPは特定オリゴ糖を付着させ
たポリペプチドとして存在し、その１部は容易に入手し
うるグリコシダーゼでの処理によって容易に除去するこ
とができる。これらグリコシダーゼは、DBPに対するＢ
およびＴ細胞の機能と同等である。特定グリコシダーゼ
での処理により、DBPは高能力のマクロファージ活性化
因子まで予想外に変換される。すなわちDBPからマクロ
ファージ活性化因子への効率的変換がＢ−およびＴ−細
胞の不存在下にインビトロで達成される。DBPの酸素処
理により生成される新規なマクロファージ活性化因子は
実質的に純粋であって、微量（500pg/体重kg）を宿主に
投与しただけで食細胞マクロファージ活性化を著しく増
大させるような高能力を有する。新規な因子の酸素的生
成はマクロファージ活性化におけるＢ−およびＴ−細胞
の機能を回避するので、これはワクチン接種のための有
力なアジュバントとして並びに重大な感染症のための感
染後の治療剤として用いられる。
γ−インタフェロンとしても知られるＴ細胞リンホカ
インマクロファージ活性化因子はリンホカイン産生Ｔ細
胞により少量で生成され、或いは遺伝子工学によって得
られる。他方、本発明の新規なマクロファージ活性化因
子は、公知の精製法により動物血液の血漿から容易に精
製しうるDBPから容易に得ることができる。
インマクロファージ活性化因子はリンホカイン産生Ｔ細
胞により少量で生成され、或いは遺伝子工学によって得
られる。他方、本発明の新規なマクロファージ活性化因
子は、公知の精製法により動物血液の血漿から容易に精
製しうるDBPから容易に得ることができる。
多形性DBP表現型は、特にDBP分子のポリペプチド部分
に結合したオリゴ糖の差として現される。本発明の新規
なマクロファージ活性化因子は、β−ガラクトシダーゼ
とシアリダーゼとの組合せ物またはβ−ガラクトシダー
ゼとα−マンノシダーゼとの組合せ物と共に培養するこ
とにより動物DBPから効率的に産生させることができ
る。幾つかの場合、β−ガラクトシダーゼのみによるDB
Pの処理はマクロファージ活性化因子か効率的に生成さ
せる。市販酵素の作用によるDBPからマクロファージ活
性化因子へのインビトロ変換は極めて効率的であって、
マクロファージ活性化因子の極めて高い活性が得られ
る。
に結合したオリゴ糖の差として現される。本発明の新規
なマクロファージ活性化因子は、β−ガラクトシダーゼ
とシアリダーゼとの組合せ物またはβ−ガラクトシダー
ゼとα−マンノシダーゼとの組合せ物と共に培養するこ
とにより動物DBPから効率的に産生させることができ
る。幾つかの場合、β−ガラクトシダーゼのみによるDB
Pの処理はマクロファージ活性化因子か効率的に生成さ
せる。市販酵素の作用によるDBPからマクロファージ活
性化因子へのインビトロ変換は極めて効率的であって、
マクロファージ活性化因子の極めて高い活性が得られ
る。
多くの動物種類における遺伝子多形性に基づき、DBP
は好ましくは酵素混合物としての３種全ての酵素で処理
される。特に、各種類の数匹の個体から集めた血液から
得られるDBPは２種類以上のDBPを含有することがある。
したがってDBPからマクロファージ活性化因子への完全
変換は、酵素混合物としての３種全ての酵素で処理して
最も効率的に達成することができる。
は好ましくは酵素混合物としての３種全ての酵素で処理
される。特に、各種類の数匹の個体から集めた血液から
得られるDBPは２種類以上のDBPを含有することがある。
したがってDBPからマクロファージ活性化因子への完全
変換は、酵素混合物としての３種全ての酵素で処理して
最も効率的に達成することができる。
β−ガラクトシダーゼのみで処理されたDBPgはマクロ
ファージを効率的に活性化する。したがって、DBPgから
のガラクトースの除去はマクロファージ活性化因子の生
成をもたらす。他方、DBPgsおよびDBPgm動物からのDBP
を変換するには２種のグリコシダーゼが必要とされる。
DBPgsからマクロファージ活性化因子への変換は、β−
ガラクトシダーゼとシアリダーゼとの組合せ物と共に培
養することを必要とする。DBPgmの変換はβ−ガラクト
シダーゼとα−マンノシダーゼとを必要とする。
ファージを効率的に活性化する。したがって、DBPgから
のガラクトースの除去はマクロファージ活性化因子の生
成をもたらす。他方、DBPgsおよびDBPgm動物からのDBP
を変換するには２種のグリコシダーゼが必要とされる。
DBPgsからマクロファージ活性化因子への変換は、β−
ガラクトシダーゼとシアリダーゼとの組合せ物と共に培
養することを必要とする。DBPgmの変換はβ−ガラクト
シダーゼとα−マンノシダーゼとを必要とする。
動物DBP表現型およびサブタイプは、分子の蛋白部分
におけるアミノ酸残基に結合した次のオリゴ糖構造を有
する糖蛋白として特性化されると思われる： 特定の理論に拘束するものでないが、上記グリコシル
化はDBPの蛋白部分にてヒトDBPのほぼ位置420に対応す
るアミノ酸位置に存在するスレオニンもしくはセリン残
基を介し或いは同じ付近におけるスレオニンもしくはセ
リン残基を介して生じ、Ｏ−グリコシド結合 Ga1NAcα（１→０）−Thrもしくは Ga1NAcα（１→０）−Serを生成すると思われる。すな
わち特定の理論に拘束されるものでないが、新規なマク
ロファージ活性化因子は実質的にDBPのアミノ酸配列を
有すると共にアミノ酸残基に結合した末端Ｎ−アセチル
ガラクトサミン基を有する実質的に純粋形態の蛋白で構
成されると思われる。
におけるアミノ酸残基に結合した次のオリゴ糖構造を有
する糖蛋白として特性化されると思われる： 特定の理論に拘束するものでないが、上記グリコシル
化はDBPの蛋白部分にてヒトDBPのほぼ位置420に対応す
るアミノ酸位置に存在するスレオニンもしくはセリン残
基を介し或いは同じ付近におけるスレオニンもしくはセ
リン残基を介して生じ、Ｏ−グリコシド結合 Ga1NAcα（１→０）−Thrもしくは Ga1NAcα（１→０）−Serを生成すると思われる。すな
わち特定の理論に拘束されるものでないが、新規なマク
ロファージ活性化因子は実質的にDBPのアミノ酸配列を
有すると共にアミノ酸残基に結合した末端Ｎ−アセチル
ガラクトサミン基を有する実質的に純粋形態の蛋白で構
成されると思われる。
本発明の方法に使用する高純度の動物DBPはリンク
等、アナリチカル・バイオケミストリー、第157巻、第2
62頁（1986）（その開示全体を参考のため、ここに引用
する）の方法にしたがい動物血液の25−ヒドロキシビタ
ミンD3−セファロース（登録商標）親和性クロマトグラ
フィーにより最も容易に作成される。DBPはハダド等、
バイオケミカル・ジャ・ナル、第218巻、第805頁（198
4）の方法にしたがいアクチン−アガロース親和性クロ
マトグラフィーによっても精製することができ、これは
アクチンに対するDBPの結合特異性を利用する［ハダド
等の開示全体を参考のため、ここに引用する］。高純度
でDBPを得る他の方法は文献に報告されている。対応す
るヒト蛋白、すなわちGc蛋白を精製するため用いられる
公知の方法を、動物DBPの精製にも直接用いることがで
きる。
等、アナリチカル・バイオケミストリー、第157巻、第2
62頁（1986）（その開示全体を参考のため、ここに引用
する）の方法にしたがい動物血液の25−ヒドロキシビタ
ミンD3−セファロース（登録商標）親和性クロマトグラ
フィーにより最も容易に作成される。DBPはハダド等、
バイオケミカル・ジャ・ナル、第218巻、第805頁（198
4）の方法にしたがいアクチン−アガロース親和性クロ
マトグラフィーによっても精製することができ、これは
アクチンに対するDBPの結合特異性を利用する［ハダド
等の開示全体を参考のため、ここに引用する］。高純度
でDBPを得る他の方法は文献に報告されている。対応す
るヒト蛋白、すなわちGc蛋白を精製するため用いられる
公知の方法を、動物DBPの精製にも直接用いることがで
きる。
本発明の実施に用いられるグリコシダーゼは周知され
かつ市販されている。β−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−
ガラクトシダーゼガラクトヒドロラーゼ、EC3.2.1.23）
は大腸菌（Escherichia coli）から得られる。β−ガラ
クトシダーゼはたとえばベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルス社、インジアナポリス、インジアナ州か
らカタログNo.634395として入手できる。
かつ市販されている。β−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−
ガラクトシダーゼガラクトヒドロラーゼ、EC3.2.1.23）
は大腸菌（Escherichia coli）から得られる。β−ガラ
クトシダーゼはたとえばベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルス社、インジアナポリス、インジアナ州か
らカタログNo.634395として入手できる。
α−マンノシダーゼ（α−Ｄ−マンノシドマンノヒド
ロラーゼ、EC3.2.1.24）はタチナタマメ（Canavalia en
siformis）から得られる。これはたとえばベーリンガー
・マンハイム・バイオケミカルス社からカタログNo.269
611として入手できる。
ロラーゼ、EC3.2.1.24）はタチナタマメ（Canavalia en
siformis）から得られる。これはたとえばベーリンガー
・マンハイム・バイオケミカルス社からカタログNo.269
611として入手できる。
「ノイラミニダーゼ」としても知られるシアリダーゼ
（アシルノイラミニルヒドロラーゼ、EC3.2.1.18）はク
ロストリジウム・ペルフリンゲンス（Clostridium perf
ringens）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）ま
たはアースロバクター・ウレアファシエンス（Arthroba
cter ureafaciens）から得られる。これら３種の全ての
シアリダーゼはベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルス社からカタログNo.107590、1080725および269611
として入手できる。
（アシルノイラミニルヒドロラーゼ、EC3.2.1.18）はク
ロストリジウム・ペルフリンゲンス（Clostridium perf
ringens）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）ま
たはアースロバクター・ウレアファシエンス（Arthroba
cter ureafaciens）から得られる。これら３種の全ての
シアリダーゼはベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルス社からカタログNo.107590、1080725および269611
として入手できる。
DBPは、加水分解上有効量の１種もしくはそれ以上の
上記グリコシダーゼとの接触によりマクロファージ活性
化因子まで容易に変換される。DBPからマクロファージ
活性化因子への実質的に完全な変換を達成するのに充分
な量の酵素を用いることができる。約0.1単位（１単位
は１μモルの基質を１分間で触媒する酵素の量である）
の各酵素をDBP1μｇ当りに使用すればこの目的に充分で
ある。好ましくは、糖蛋白をマクロファージ活性化因子
まで変換するのに実際に必要とされる量よりも過剰の酵
素を用いて完全変換を確保する。
上記グリコシダーゼとの接触によりマクロファージ活性
化因子まで容易に変換される。DBPからマクロファージ
活性化因子への実質的に完全な変換を達成するのに充分
な量の酵素を用いることができる。約0.1単位（１単位
は１μモルの基質を１分間で触媒する酵素の量である）
の各酵素をDBP1μｇ当りに使用すればこの目的に充分で
ある。好ましくは、糖蛋白をマクロファージ活性化因子
まで変換するのに実際に必要とされる量よりも過剰の酵
素を用いて完全変換を確保する。
DBPと酵素とを、たとえば燐酸塩緩衝液または酢酸塩
緩衝液にて接触させることができる。燐酸塩緩衝液が好
適である（pH5.5）。酵素反応を行う当業者に知られた
他の培地を用いることもできる。
緩衝液にて接触させることができる。燐酸塩緩衝液が好
適である（pH5.5）。酵素反応を行う当業者に知られた
他の培地を用いることもできる。
反応は、酵素反応を行うのに適した任意の温度で行う
ことができる。典型的には温度は25〜37℃の範囲とする
ことができ、約37℃が好適である。基質と酵素とを反応
媒体中でDBPからマクロファージ活性化因子への実質的
変換が達成されるまで培養する。用いる実際の培養時間
はたとえば反応体の濃度、反応温度などの諸因子に依存
しうると思われるが、37℃にて約30分間の反応時間にて
一般的にDBPからマクロファージ活性化因子への完全変
換を得るのに充分である。
ことができる。典型的には温度は25〜37℃の範囲とする
ことができ、約37℃が好適である。基質と酵素とを反応
媒体中でDBPからマクロファージ活性化因子への実質的
変換が達成されるまで培養する。用いる実際の培養時間
はたとえば反応体の濃度、反応温度などの諸因子に依存
しうると思われるが、37℃にて約30分間の反応時間にて
一般的にDBPからマクロファージ活性化因子への完全変
換を得るのに充分である。
DBPからマクロファージ活性化因子への変換は、酵素
反応に適する任意の容器で行うことができる。シアリダ
ーゼは不溶性型（たとえばビーズ化したアガロース（シ
グマ・ケミカル・カンパニー社、カタログNo.N−4483）
に付着）にて使用し、同様な分子量のシアリダーゼ断片
により得られたマクロファージ活性化因子の汚染を回避
するのが好適である。マクロファージ活性化因子は、適
する酵素を液体培地中でDBPに添加し、次いで液体を濾
過してマクロファージ活性化因子を回収することにより
製造することができる。たとえば酵素−DBPの反応混合
物を無菌の100kDa切断フィルタ（たとえばアミコンYM10
0）に通過させて、固定化シアリダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ（MW＝540kDa）およびα−マンノシダーゼ（MW
＝190kDa）を除去することができる。濾液は実質的に純
粋な高活性のマクロファージ活性化因子を含有する。多
量のDBPからマクロファージ活性化因子への変換を所望
する場合は、最も有利には全酵素を固相に含有させる。
β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼもしくはα−
マンノシダーゼ、最も好ましくは３種全ての酵素の混合
物をたとえばシアンブロマイドのような適するカップリ
ング剤によりたとえばアガロースビーズに固定する。酵
素を個体支持体に付着させる方法は当業者に知られてい
る。固定化酵素との培養によるDBPからマクロファージ
活性化因子への変換が好適である。何故なら、その酵素
混合物からマクロファージ活性化因子を分離する工程が
省略されるからである。
反応に適する任意の容器で行うことができる。シアリダ
ーゼは不溶性型（たとえばビーズ化したアガロース（シ
グマ・ケミカル・カンパニー社、カタログNo.N−4483）
に付着）にて使用し、同様な分子量のシアリダーゼ断片
により得られたマクロファージ活性化因子の汚染を回避
するのが好適である。マクロファージ活性化因子は、適
する酵素を液体培地中でDBPに添加し、次いで液体を濾
過してマクロファージ活性化因子を回収することにより
製造することができる。たとえば酵素−DBPの反応混合
物を無菌の100kDa切断フィルタ（たとえばアミコンYM10
0）に通過させて、固定化シアリダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ（MW＝540kDa）およびα−マンノシダーゼ（MW
＝190kDa）を除去することができる。濾液は実質的に純
粋な高活性のマクロファージ活性化因子を含有する。多
量のDBPからマクロファージ活性化因子への変換を所望
する場合は、最も有利には全酵素を固相に含有させる。
β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼもしくはα−
マンノシダーゼ、最も好ましくは３種全ての酵素の混合
物をたとえばシアンブロマイドのような適するカップリ
ング剤によりたとえばアガロースビーズに固定する。酵
素を個体支持体に付着させる方法は当業者に知られてい
る。固定化酵素との培養によるDBPからマクロファージ
活性化因子への変換が好適である。何故なら、その酵素
混合物からマクロファージ活性化因子を分離する工程が
省略されるからである。
固定化酵素または液相酵素のいずれを用いるかに拘ら
ず生成混合物を限外フィルタ（好ましくは約0.45μ以下
の孔径を有するフィルタ）に通過させてマクロファージ
活性化因子の無菌調製物を得ることが望ましい。
ず生成混合物を限外フィルタ（好ましくは約0.45μ以下
の孔径を有するフィルタ）に通過させてマクロファージ
活性化因子の無菌調製物を得ることが望ましい。
Ｂ−細胞はβ−ガラクトシダーゼに対応する機能を有
し、さらにＴ−細胞はシアリダーゼおよびα−マンノシ
ダーゼに対応する機能を有する。特定の理論に拘束され
るものではないが、DBPは、正規配列でＢ及びＴリンパ
球の膜酵素によりインビボ改変されて、マクロファージ
活性化因子を生成すると思われる。
し、さらにＴ−細胞はシアリダーゼおよびα−マンノシ
ダーゼに対応する機能を有する。特定の理論に拘束され
るものではないが、DBPは、正規配列でＢ及びＴリンパ
球の膜酵素によりインビボ改変されて、マクロファージ
活性化因子を生成すると思われる。
その増大した食細胞活性を特徴とするマクロファージ
の活性化は、宿主免疫防御メカニズムにおける主たる第
１段階である。マクロファージ活性化はＢおよびＴリン
パ球機能を必要とし、この機能は新規なマクロファージ
活性化因子を生成するよう段階的にDBPを改変する。DBP
からマクロファージ活性化因子への本発明によるインビ
トロ変換に用いるグリコシダーゼはマクロファージ活性
化因子の産生に必要とされるＢ−およびＴ−細胞機能に
対応するので、マクロファージ活性化因子のインビトロ
酵素発生はＢ−およびＴ−細胞の機能を必要としない。
さらに、ここに説明したマクロファージ活性化因子は処
理を受けた同じ動物種類の血液から発生させうるので、
たとえば免疫原性のような副作用が最小化されると思わ
れる。
の活性化は、宿主免疫防御メカニズムにおける主たる第
１段階である。マクロファージ活性化はＢおよびＴリン
パ球機能を必要とし、この機能は新規なマクロファージ
活性化因子を生成するよう段階的にDBPを改変する。DBP
からマクロファージ活性化因子への本発明によるインビ
トロ変換に用いるグリコシダーゼはマクロファージ活性
化因子の産生に必要とされるＢ−およびＴ−細胞機能に
対応するので、マクロファージ活性化因子のインビトロ
酵素発生はＢ−およびＴ−細胞の機能を必要としない。
さらに、ここに説明したマクロファージ活性化因子は処
理を受けた同じ動物種類の血液から発生させうるので、
たとえば免疫原性のような副作用が最小化されると思わ
れる。
感染の後、微生物抗原はマクロファージにより結合さ
れる。この表面結合した抗原の大部分は内部化され（す
なわち食作用を受け）、切断により処理される。マクロ
ファージは幾つかの処理された抗原をその表面に復帰さ
せて、抗原決定基を抗原特異性リンパ球に効率的に「提
示」することができる。しかしながら、抗原の結合、食
作用、処理および提示は、最初にマクロファージが活性
化されることを必要とする。感染後の免疫反応の発生は
したがって、典型的には完全なマクロファージ活性化に
応じ１〜２週間遅延する。これは、Ｂ−およびＴ−細胞
がマクロファージ活性化因子の発生に関与する期間であ
る。この遅延期間の間に、感染は明確になりうる。
れる。この表面結合した抗原の大部分は内部化され（す
なわち食作用を受け）、切断により処理される。マクロ
ファージは幾つかの処理された抗原をその表面に復帰さ
せて、抗原決定基を抗原特異性リンパ球に効率的に「提
示」することができる。しかしながら、抗原の結合、食
作用、処理および提示は、最初にマクロファージが活性
化されることを必要とする。感染後の免疫反応の発生は
したがって、典型的には完全なマクロファージ活性化に
応じ１〜２週間遅延する。これは、Ｂ−およびＴ−細胞
がマクロファージ活性化因子の発生に関与する期間であ
る。この遅延期間の間に、感染は明確になりうる。
本発明者は、DBPから作成されたマクロファージ活性
化因子の投与の後に６時間未満でマウスにおけるマクロ
ファージ活性化の発生を観察した。実質的な抗体産生
は、マクロファージ活性化因子と抗原とを同時に注射し
て48時間位の短時間後にマウスで観察される。多量の抗
原特異性抗体が96時間以内に産生される。したがって、
極めて急速なマクロファージの活性化を誘発しうる本発
明のマクロファージ活性化因子は免疫反応の発現を増大
かつ加速させると共に多量の抗原特異性抗体を発生させ
るワクチン接種のためのアジュバントとして有用である
と思われる。さらに同じ理由から、マクロファージ活性
化因子は単独で或いは他の治療剤と組合せて抗体産生を
促進するための感染後の治療剤として用いうると考えら
れる。この療法は、狂犬病のような長潜伏期間を伴う感
染症の処置に特に有効である。
化因子の投与の後に６時間未満でマウスにおけるマクロ
ファージ活性化の発生を観察した。実質的な抗体産生
は、マクロファージ活性化因子と抗原とを同時に注射し
て48時間位の短時間後にマウスで観察される。多量の抗
原特異性抗体が96時間以内に産生される。したがって、
極めて急速なマクロファージの活性化を誘発しうる本発
明のマクロファージ活性化因子は免疫反応の発現を増大
かつ加速させると共に多量の抗原特異性抗体を発生させ
るワクチン接種のためのアジュバントとして有用である
と思われる。さらに同じ理由から、マクロファージ活性
化因子は単独で或いは他の治療剤と組合せて抗体産生を
促進するための感染後の治療剤として用いうると考えら
れる。この療法は、狂犬病のような長潜伏期間を伴う感
染症の処置に特に有効である。
マクロファージ活性化因子を投与してから生じうる免
疫学的反応を最小化させるには、各種類の動物の同じ動
物種類の血液から得られたマクロファージ活性化因子の
みを摂取させるのが好適である。同様に個々の動物にお
ける免疫学的反応の危険は、種類内DBP多形性が存在す
る状況にて同一種類のDBP由来のマクロファージ活性化
因子のみを投与することにより最小化される。
疫学的反応を最小化させるには、各種類の動物の同じ動
物種類の血液から得られたマクロファージ活性化因子の
みを摂取させるのが好適である。同様に個々の動物にお
ける免疫学的反応の危険は、種類内DBP多形性が存在す
る状況にて同一種類のDBP由来のマクロファージ活性化
因子のみを投与することにより最小化される。
マクロファージ活性化因子は、単独で或いは他の治療
剤と組合せてマクロファージ活性化を誘発させるべく動
物に投与することができる。投与するマクロファージ活
性化因子の量はたとえば薬剤の効力、求めるマクロファ
ージ活性化の持続時間および程度、患者の体格および体
重、病気の種類など種々の因子に依存する。一般に、患
者の体重1kg当り約0.5ng程度に少ない因子の投与で実質
的なマクロファージ活性化が生ずる。１つの処置によれ
ば、動物に３〜５日毎に約2ngのマクロファージ活性化
因子を摂取させて、マクロファージ活性化の有意なレベ
ルを維持することができる。
剤と組合せてマクロファージ活性化を誘発させるべく動
物に投与することができる。投与するマクロファージ活
性化因子の量はたとえば薬剤の効力、求めるマクロファ
ージ活性化の持続時間および程度、患者の体格および体
重、病気の種類など種々の因子に依存する。一般に、患
者の体重1kg当り約0.5ng程度に少ない因子の投与で実質
的なマクロファージ活性化が生ずる。１つの処置によれ
ば、動物に３〜５日毎に約2ngのマクロファージ活性化
因子を摂取させて、マクロファージ活性化の有意なレベ
ルを維持することができる。
マクロファージ活性化因子は、実質的なマクロファー
ジ活性化を誘発させるのに充分な量の因子を循環させる
よう供給する便利な手段によって投与することができ
る。たとえば、静脈注射または筋肉内注射により供給す
ることができる。筋肉内投与が投与経路として現在好適
である。
ジ活性化を誘発させるのに充分な量の因子を循環させる
よう供給する便利な手段によって投与することができ
る。たとえば、静脈注射または筋肉内注射により供給す
ることができる。筋肉内投与が投与経路として現在好適
である。
マクロファージ活性化因子は、医薬上許容しうるキャ
リヤ（特に蛋白質薬品の供給に適するようなキャリヤ）
に混入することができる。因子は水または塩水溶液に可
溶性である。したがって、獣医薬理学的用途に好適な処
方は、この薬剤の塩水溶液で構成される。処方物は必要
に応じ他の薬剤、たとえば浸透圧バランスを維持するた
めの薬剤等を含有することもできる。たとえば注射用の
典型的なキャリヤは0.9％NaCl水溶液もしくは燐酸塩緩
衝塩水（0.01Mの燐酸ナトリウムを含有する0.9％NaCl水
溶液、pH7.0）で構成することができる。
リヤ（特に蛋白質薬品の供給に適するようなキャリヤ）
に混入することができる。因子は水または塩水溶液に可
溶性である。したがって、獣医薬理学的用途に好適な処
方は、この薬剤の塩水溶液で構成される。処方物は必要
に応じ他の薬剤、たとえば浸透圧バランスを維持するた
めの薬剤等を含有することもできる。たとえば注射用の
典型的なキャリヤは0.9％NaCl水溶液もしくは燐酸塩緩
衝塩水（0.01Mの燐酸ナトリウムを含有する0.9％NaCl水
溶液、pH7.0）で構成することができる。
以下、限定はしないが実施例により本発明を説明す
る。
る。
実施例１ A. DBPからマクロファージ活性化因子への変換 （Ａ）ウシ、（Ｂ）７頭のウシの保存血液、（Ｃ）ネ
コまたは（Ｄ）イヌから得られた精製DBP（1.0μｇ）
を、0.01Mの燐酸ナトリウムと0.9％のNaClと1mMのMgSO4
とを含有する1mlの燐酸塩緩衝塩水（PBS−Mg）と合し、
表１に示した酵素組合せ物の0.1Uを含有する２μｌのPB
S−Mgで処理した。用いた酵素は次の通りである： シアリダーゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルス社、カタログNo.107590）； α−マンノシダーゼ（ベーリンガー社、カタログNo.1
07379）； β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー社、カタログN
o.634395）。
コまたは（Ｄ）イヌから得られた精製DBP（1.0μｇ）
を、0.01Mの燐酸ナトリウムと0.9％のNaClと1mMのMgSO4
とを含有する1mlの燐酸塩緩衝塩水（PBS−Mg）と合し、
表１に示した酵素組合せ物の0.1Uを含有する２μｌのPB
S−Mgで処理した。用いた酵素は次の通りである： シアリダーゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルス社、カタログNo.107590）； α−マンノシダーゼ（ベーリンガー社、カタログNo.1
07379）； β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー社、カタログN
o.634395）。
各酵素−DBP混合物を微小遠沈管にて37℃で60分間培
養した。酵素処理されたDBPを含有する反応混合物を次
いで0.1％卵アルブミン（EA）補充培地にて次の分析の
ため10-4に希釈した。
養した。酵素処理されたDBPを含有する反応混合物を次
いで0.1％卵アルブミン（EA）補充培地にて次の分析の
ため10-4に希釈した。
B. マクロファージ活性化因子のインビトロ分析 1. マクロファージ組織培養物の作成 0.01Mの燐酸ナトリウムと0.9％のNaClと５単位/mlの
ヘパリンとを含有する5mlの燐酸塩緩衝塩水をBALB/cマ
ウスの腹腔に注射することにより、腹膜細胞を集めた。
腹膜細胞を剔出し、低速遠心分離により洗浄すると共
に、0.1％卵アルブミンを補充の組織培養培地RPMI 164
0（EA培地）に１〜２×106細胞/mlの濃度で懸濁され
た。1mlの細胞懸濁物を、組織培養プレート（コスター
社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の直径16mmの
穴に置かれた12mmのカバーグラスに載せた。これらプレ
ートを５％CO2培養器にて37℃で30分間培養して、カバ
ーグラスに対しマクロファージを付着させた。カバーグ
ラスを外し、RPM1培地中で緩和に撹拌して浸漬させるこ
とにより非付着性のＢ−およびＴ−細胞を脱着させ、EA
−培地を含有する新たな組織培養穴に入れた。
ヘパリンとを含有する5mlの燐酸塩緩衝塩水をBALB/cマ
ウスの腹腔に注射することにより、腹膜細胞を集めた。
腹膜細胞を剔出し、低速遠心分離により洗浄すると共
に、0.1％卵アルブミンを補充の組織培養培地RPMI 164
0（EA培地）に１〜２×106細胞/mlの濃度で懸濁され
た。1mlの細胞懸濁物を、組織培養プレート（コスター
社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の直径16mmの
穴に置かれた12mmのカバーグラスに載せた。これらプレ
ートを５％CO2培養器にて37℃で30分間培養して、カバ
ーグラスに対しマクロファージを付着させた。カバーグ
ラスを外し、RPM1培地中で緩和に撹拌して浸漬させるこ
とにより非付着性のＢ−およびＴ−細胞を脱着させ、EA
−培地を含有する新たな組織培養穴に入れた。
2. ヒツジ赤血球／ウサギ抗赤血球IgG結合体の作成 洗浄されたヒツジ赤血球を、ウサギ抗ヒツジ赤血球抗
体の精製IgGフラクションの亜凝集希釈物で被覆した。R
PMI 1640培地におけるウサギIgG被覆ヒツジ赤血球の0.
5％懸濁物を次の食作用分析に用いるため作成した。
体の精製IgGフラクションの亜凝集希釈物で被覆した。R
PMI 1640培地におけるウサギIgG被覆ヒツジ赤血球の0.
5％懸濁物を次の食作用分析に用いるため作成した。
3. 食作用分析 上記Ａからの1mlの希釈反応混合物を上記B.1からのマ
クロファージ被覆カバーグラスに載せ、５％CO2培養器
にて37℃で２時間培養した。次いで培地を除去し、0.5m
lの0.5赤血球−IgG結合体懸濁物をマクロファージ被覆
カバーグラスに添加し、37℃にて１時間培養した。次い
でカバーグラスを低張性溶液（水における1/5希釈の燐
酸塩緩衝塩水）で洗浄して、未摂取の赤血球を溶解させ
た。摂取された赤血球を有するマクロファージを計数し
た。マクロファージ１個当りに摂取された赤血球の平均
個数も測定した。マクロファージ食作用活性を、「摂取
指数（Ingestion index）」（赤血球を摂取したマクロ
ファージの比率×マクロファージ１個当りに摂取された
赤血球の平均数）として計算した。データを第１表に示
す。
クロファージ被覆カバーグラスに載せ、５％CO2培養器
にて37℃で２時間培養した。次いで培地を除去し、0.5m
lの0.5赤血球−IgG結合体懸濁物をマクロファージ被覆
カバーグラスに添加し、37℃にて１時間培養した。次い
でカバーグラスを低張性溶液（水における1/5希釈の燐
酸塩緩衝塩水）で洗浄して、未摂取の赤血球を溶解させ
た。摂取された赤血球を有するマクロファージを計数し
た。マクロファージ１個当りに摂取された赤血球の平均
個数も測定した。マクロファージ食作用活性を、「摂取
指数（Ingestion index）」（赤血球を摂取したマクロ
ファージの比率×マクロファージ１個当りに摂取された
赤血球の平均数）として計算した。データを第１表に示
す。
第１表から明らかなように、ウシの種類はDBP型に関
し多形性を示す。単一のウシ個体からの精製DBP（Ａ
欄）は、シアリダーゼとβ−ガラクトシダーゼとの組合
せ物での処理によりマクロファージ活性化因子まで変換
されたが、β−ガラクトシダーゼとシアリダーゼもしく
はα−マンノシダーゼとによる処理は７頭のウシの保存
ウシ血漿より精製されたDBPからマクロファージ活性化
因子を発生させた。したがって単一のウシ個体はDBP型
「gs」であったのに対し、保存材料はDBPgs個体とDBPgm
個体との両者からのDBPで構成されたことが明かであ
る。同様に、ネコおよびイヌDBPドナーは、ガラクトシ
ダーゼ単独での処理がマクロファージ活性化因子の発生
につき充分であったので、DBPg型であったことも第１表
から明かである。
し多形性を示す。単一のウシ個体からの精製DBP（Ａ
欄）は、シアリダーゼとβ−ガラクトシダーゼとの組合
せ物での処理によりマクロファージ活性化因子まで変換
されたが、β−ガラクトシダーゼとシアリダーゼもしく
はα−マンノシダーゼとによる処理は７頭のウシの保存
ウシ血漿より精製されたDBPからマクロファージ活性化
因子を発生させた。したがって単一のウシ個体はDBP型
「gs」であったのに対し、保存材料はDBPgs個体とDBPgm
個体との両者からのDBPで構成されたことが明かであ
る。同様に、ネコおよびイヌDBPドナーは、ガラクトシ
ダーゼ単独での処理がマクロファージ活性化因子の発生
につき充分であったので、DBPg型であったことも第１表
から明かである。
活性に対するマクロファージ活性化因子濃度の効果
を、同じウシDBPgs、保存ウシDBPおよびネコDBPgを実施
例１にしたがい最初の1.0μg/ml溶液の10-4、10-5およ
び10-6におけるグリコシダーゼ処理DBP希釈にて処理す
ることにより検査した。結果を第２表（ウシDBPgs）、
第３表（保存ウシDBP）および第４表（ネコDBPg）に示
す。
を、同じウシDBPgs、保存ウシDBPおよびネコDBPgを実施
例１にしたがい最初の1.0μg/ml溶液の10-4、10-5およ
び10-6におけるグリコシダーゼ処理DBP希釈にて処理す
ることにより検査した。結果を第２表（ウシDBPgs）、
第３表（保存ウシDBP）および第４表（ネコDBPg）に示
す。
実施例３ 精製されたDBP（下記の第５表に同定された各動物種
類から1.0μｇ）を実施例１にしたがいβ−ガラクトシ
ダーゼとシアリダーゼとα−マンノシダーゼとの混合物
（それぞれ0.5U）により、0.01Mの燐酸ナトリウムと0.9
％のNaClと1mMのMgSO4とを含有する1mlのPBS−Mgにて37
℃で60分間処理した。次いで、それぞれ処理DBPを含有
する反応混合物を0.1％補充EA培地にて10-4に希釈し、
実施例1Bのインビトロ分析にしたがいマクロファージ活
性化の活性につき分析した。結果を第５表に示す。観察
されうるように、３種全ての酵素を含有する混合物での
処理はDBP多形性とは無関係にDBPを有力なマクロファー
ジ活性化因子まで変換させた。
類から1.0μｇ）を実施例１にしたがいβ−ガラクトシ
ダーゼとシアリダーゼとα−マンノシダーゼとの混合物
（それぞれ0.5U）により、0.01Mの燐酸ナトリウムと0.9
％のNaClと1mMのMgSO4とを含有する1mlのPBS−Mgにて37
℃で60分間処理した。次いで、それぞれ処理DBPを含有
する反応混合物を0.1％補充EA培地にて10-4に希釈し、
実施例1Bのインビトロ分析にしたがいマクロファージ活
性化の活性につき分析した。結果を第５表に示す。観察
されうるように、３種全ての酵素を含有する混合物での
処理はDBP多形性とは無関係にDBPを有力なマクロファー
ジ活性化因子まで変換させた。
実施例４ A. 固定化酵素によるDBPからマクロファージ活性化因
子への変換 1. 固定化酵素の作成 100mgのCNBr−活性化アガロース（セファロース4B）
を1mMのHClで洗浄し、次いでNaHCO3緩衝液（0.1M、pH8.
3）およびNaCl（0.5M）を含有するカップリング緩衝液
（300μｌ）に懸濁させた。β−ガラクトシダーゼとα
−マンノシダーゼもしくはシアリダーゼまたは３種全て
の酵素の混合物（各酵素2U）を600μｌのカップリング
緩衝液に混入し、室温で２時間にわたり転動ミキサで培
養した。アガロースにおける残留活性基を、室温での２
時間にわたるカップリング緩衝液中における0.2Mグリシ
ンとの培養により封鎖した。アガロース−固定化酵素を
カップリング緩衝液で洗浄して未吸収の蛋白およびグリ
シンを除去し、次いでNaCl（0.5M）を含有する酢酸塩緩
衝液（0.1M、pH4）と追加のカップリング緩衝液とで洗
浄した。アガロース−固定化酵素の調製部を４℃で貯蔵
した。
子への変換 1. 固定化酵素の作成 100mgのCNBr−活性化アガロース（セファロース4B）
を1mMのHClで洗浄し、次いでNaHCO3緩衝液（0.1M、pH8.
3）およびNaCl（0.5M）を含有するカップリング緩衝液
（300μｌ）に懸濁させた。β−ガラクトシダーゼとα
−マンノシダーゼもしくはシアリダーゼまたは３種全て
の酵素の混合物（各酵素2U）を600μｌのカップリング
緩衝液に混入し、室温で２時間にわたり転動ミキサで培
養した。アガロースにおける残留活性基を、室温での２
時間にわたるカップリング緩衝液中における0.2Mグリシ
ンとの培養により封鎖した。アガロース−固定化酵素を
カップリング緩衝液で洗浄して未吸収の蛋白およびグリ
シンを除去し、次いでNaCl（0.5M）を含有する酢酸塩緩
衝液（0.1M、pH4）と追加のカップリング緩衝液とで洗
浄した。アガロース−固定化酵素の調製部を４℃で貯蔵
した。
2. DBPからマクロファージ活性化因子への変換 1mlのPBS−Mg（pH5.5）におけるDBPを上記で作成され
たアガロース−固定化酵素（各酵素２単位）の混合物と
1mlのPBS−Mg（pH5.5）にて合した。この反応混合物を5
mlのプラスチックチューブにて37℃で30分間にわたり転
動ミキサで培養した。次いで反応混合物を卓上遠心分離
器で2,000rpmにて15分間にわたり遠心分離した。各反応
混合物の上澄液を集め、滅菌された孔径0.45μのフィル
タ（タイプHA、ミリポア・カンパニー社、ベッドフォー
ド、マサチューセッツ州）で濾過すると共に、希釈し
た。
たアガロース−固定化酵素（各酵素２単位）の混合物と
1mlのPBS−Mg（pH5.5）にて合した。この反応混合物を5
mlのプラスチックチューブにて37℃で30分間にわたり転
動ミキサで培養した。次いで反応混合物を卓上遠心分離
器で2,000rpmにて15分間にわたり遠心分離した。各反応
混合物の上澄液を集め、滅菌された孔径0.45μのフィル
タ（タイプHA、ミリポア・カンパニー社、ベッドフォー
ド、マサチューセッツ州）で濾過すると共に、希釈し
た。
B. マクロファージ活性化因子のインビボ分析 酵素改変されたDBP（100、30、10、３および1pg試
料）を体重20gまでの6BALB/cマウスに筋肉内投与した。
投与してから18時間の後、腹膜細胞を集めて組織培養プ
レートの16mm穴における12mmのカバーグラスに載せた。
これらプレートを37℃で30分間培養してマクロファージ
を付着させた。カバーグラスをRPMI 1640培地で洗浄し
て非付着性細胞を脱着させ、次いで新たな穴に入れた。
実施例1B.2で作成したウサギIgG−被覆ヒツジ赤血球を
このカバーグラスに載せ、食作用分析を実施例1B.3にお
けると同様に行った。結果を第６表に示す。
料）を体重20gまでの6BALB/cマウスに筋肉内投与した。
投与してから18時間の後、腹膜細胞を集めて組織培養プ
レートの16mm穴における12mmのカバーグラスに載せた。
これらプレートを37℃で30分間培養してマクロファージ
を付着させた。カバーグラスをRPMI 1640培地で洗浄し
て非付着性細胞を脱着させ、次いで新たな穴に入れた。
実施例1B.2で作成したウサギIgG−被覆ヒツジ赤血球を
このカバーグラスに載せ、食作用分析を実施例1B.3にお
けると同様に行った。結果を第６表に示す。
本発明はその思想または本質的特徴から逸脱すること
なく他の特定形態で実施することもでき、したがって本
発明の範囲を示すには上記説明でなく請求の範囲を参照
すべきである。
なく他の特定形態で実施することもでき、したがって本
発明の範囲を示すには上記説明でなく請求の範囲を参照
すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C07K 14/52 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】グリコシル化されたヒトを除く動物ビタミ
ンＤ結合性蛋白をインビトロにて β−ガラクトシダーゼ、または シアリダーゼ、α−マンノシダーゼもしくはその混合物
と組み合わせたβ−ガラクトシダーゼ と接触させ、ついでマクロファージ活性化因子を分離す
ることを特徴とするマクロファージ活性化因子の生産方
法。 - 【請求項２】請求の範囲第１項に記載の方法により作成
されることを特徴とするマクロファージ活性化因子。 - 【請求項３】ヒトを除く動物ビタミンＤ結合性蛋白のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、および前記ポリペプ
チドのアミノ酸残基に結合した末端Ｎ−アセチルガラク
トサミン基を含むことを特徴とするマクロファージ活性
化因子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/767,742 US5177001A (en) | 1989-11-20 | 1991-09-30 | In vitro enzymatic conversion of glycosylated mammalian vitamin D-binding protein to a potent macrophage activating factor |
| US767,742 | 1991-09-30 | ||
| PCT/US1992/007535 WO1993007288A1 (en) | 1991-09-30 | 1992-09-02 | Macrophage activating factor from animal vitamin d-binding protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06510908A JPH06510908A (ja) | 1994-12-08 |
| JP2808047B2 true JP2808047B2 (ja) | 1998-10-08 |
Family
ID=25080428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5506901A Expired - Fee Related JP2808047B2 (ja) | 1991-09-30 | 1992-09-02 | 動物ビタミンｄ結合性蛋白からのマクロファージ活性化因子 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5177001A (ja) |
| EP (1) | EP0607186B1 (ja) |
| JP (1) | JP2808047B2 (ja) |
| AU (1) | AU2594692A (ja) |
| CA (1) | CA2119773C (ja) |
| DE (1) | DE69220375T2 (ja) |
| WO (1) | WO1993007288A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5326749A (en) * | 1989-11-20 | 1994-07-05 | Nobuto Yamamoto | Macrophage activating factor from vitamin D binding protein |
| US5691160A (en) * | 1992-08-14 | 1997-11-25 | Biogen, Inc. | Effects of actin filaments of fibrin clot structure and lysis |
| US5641747A (en) * | 1994-07-25 | 1997-06-24 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Treatment of osteopetrotic diseases |
| US6410269B1 (en) * | 1995-06-07 | 2002-06-25 | Nobuto Yamamoto | Preparation of potent macrophage activating factors derived from cloned vitamin D binding protein and its domain and their therapeutic usage for cancer, HIV-infection and osteopetrosis |
| AU2001261378B2 (en) * | 2000-05-09 | 2005-03-17 | Children's Medical Center Corporation | Method and composition for the treatment of angiogenesis |
| JP5860401B2 (ja) * | 2010-09-03 | 2016-02-16 | 森田薬品工業株式会社 | 新規Ｇｃグロブリンガラクトース脱糖体の製造方法 |
| CN103547280B (zh) * | 2011-04-07 | 2017-06-09 | 艾弗兰纳特有限公司 | 用于药物组合物的巨噬细胞活化因子 |
| WO2014199373A1 (en) * | 2013-06-09 | 2014-12-18 | Efranat Ltd. | Compositions comprising gc- macrophage activating factor and uses thereof |
| ES2942850T3 (es) | 2015-06-01 | 2023-06-07 | Saisei Pharma Co Ltd | Producto lácteo tratado con enzimas, procedimiento para producirlo, composición y producto |
| AT518622A1 (de) * | 2016-04-21 | 2017-11-15 | Hg Pharma Gmbh | Dimerer Komplex aus selektiv deglycosyliertem Vitamin D bindenden Protein (GcMAF) und Cholecalciferol (Calciol) und Verfahren zu dessen Herstellung |
| KR20220161369A (ko) * | 2020-03-25 | 2022-12-06 | 가부시키가이샤 메디카루비아라 | Gc 단백질의 고순도 정제 기술 |
| AU2021398261A1 (en) | 2020-12-08 | 2023-07-06 | Saisei Pharma Co., Ltd. | Macrophage activator |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5177002A (en) * | 1989-11-20 | 1993-01-05 | Nobuto Yamamoto | In vitro enzymatic conversion of glycosylated human vitamin D binding protein to a potent macrophage activating factor |
-
1991
- 1991-09-30 US US07/767,742 patent/US5177001A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-09-02 DE DE69220375T patent/DE69220375T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-02 JP JP5506901A patent/JP2808047B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-02 AU AU25946/92A patent/AU2594692A/en not_active Abandoned
- 1992-09-02 WO PCT/US1992/007535 patent/WO1993007288A1/en active IP Right Grant
- 1992-09-02 EP EP92919890A patent/EP0607186B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-02 CA CA002119773A patent/CA2119773C/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１４７，Ｎｏ．１（１９９１）ｐ．２７３−２８０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0607186A1 (en) | 1994-07-27 |
| DE69220375T2 (de) | 1998-01-22 |
| JPH06510908A (ja) | 1994-12-08 |
| AU2594692A (en) | 1993-05-03 |
| WO1993007288A1 (en) | 1993-04-15 |
| DE69220375D1 (de) | 1997-07-17 |
| EP0607186B1 (en) | 1997-06-11 |
| EP0607186A4 (en) | 1995-03-15 |
| US5177001A (en) | 1993-01-05 |
| CA2119773C (en) | 1999-12-07 |
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