JPH08507212A

JPH08507212A - 突然変異型タンパク質並びにそれを製造及び用いるための方法及び物質

Info

Publication number: JPH08507212A
Application number: JP6519333A
Authority: JP
Inventors: ローレンスエイポテンパ; ハンスエイチリアウ
Original assignee: Immtech International Inc
Current assignee: Immtech International Inc
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 1996-08-06
Also published as: ATE196649T1; EP0688224A1; ES2152976T3; DE69426018T2; EP0688224B1; AU6252294A; WO1994018999A1; EP0688224A4; DE69426018D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、非突然変異型Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）サブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰの少なくとも１のアミノ酸が欠失しているか、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰの少なくとも１のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されているか、少なくとも１のアミノ酸が非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰに付加しているか、又はかかる変換の組み合わせがなされていることを除いて、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰと同じアミノ酸配列を有する突然変異型タンパク質を提供する。付加、欠失及び／又は置換されるアミノ酸は、突然変異型タンパク質がその非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰよりも共有結合で架橋した凝集塊をあまり形成しそうにないように選ばれる。この突然変異型タンパク質も修飾ＣＲＰの少なくとも１の生物活性を示す。本発明は、本発明の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ分子、該突然変異型タンパク質の発現のためのベクター、該突然変異型タンパク質を発現できるように形質変換された宿主細胞、及び該形質転換宿主細胞を培養することを含む本発明の突然変異型タンパク質を製造する方法も提供する。最後に、本発明は、該突然変異型タンパク質を使用するための方法及物質を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】突然変異型タンパク質並びにそれを製造及び用いるための方法及び物質発明の分野この発明は、修飾Ｃ反応性タンパク質の少なくとも１の生物活性を有する突然変異型タンパク質及び該突然変異型タンパク質を組換えＤＮＡ法により製造するための方法及び物質に関する。本発明は、該突然変異型タンパク質を用いるための方法及び物質にも関する。発明の背景Ｃ反応性タンパク質は、急性病患者からの血清が肺炎レンサ球菌の細胞壁のＣポリサッカライドと一緒に沈殿することを観察したTillett及びFrancis［J．Exp ．Med.，52，561-71（1930）］により最初に記載された。その後、他の人達がこの反応性血清因子をタンパク質として同定したことから“Ｃ反応性タンパク質” と名付けられた。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は肝臓で合成され、血清中でのその濃度は、急性期反応の間に１，０００倍にも増加し得る。Gewurzら，Adv．Int．Med.，27， 345-372（1982）；Kushner，Ann．N.Y．Acad．Sci.，389，39-48（1982）；Pepy sら，Adv．Immunol.，34，141-212（1983）を参照のこと。急性期反応におけるＣＲＰの正確な役割は知られていないが、宿主防御において重要な部分を演じていると考えられる。例えば、次の事柄が報告されている：（1）ＣＲＰはホスホリルコリンに結合するが、これは露出したホスホリルコリン基を有する微生物及び損傷した組織のためのオプソニンとしてのＣＲＰについての役割を示唆している；（2）ＣＲＰはクロマチンに結合するが、これはＣＲＰが細胞溶解により放出されたクロマチンを捕捉するように働き得ることを示唆している；（3）ＣＲＰは血小板活性化因子を中和するが、これはＣＲＰが血小板及び好中球活性の調節物質として機能し得ることを示唆している；及び（4）一定の他の分子又はリポソームと複合化したＣＲＰは補体を活性化するが、これはＣＲＰが補体カスケードの引き金を引き得ることを示唆している。Kaplanら，J．Immunol.，112,2135-21 47（1974）；Volanakisら，J．Immunol.，113，9-17（1974）；Siegelら，J．Ex p．Med.，140，631-47（1974）；Siegelら，J．Exp．Med.，142，709-21（1975 ）；Moldら，J．Exp．Med.，154，1703-1708（1981）；Narkatesら，Proc．N.Y ．Acad．Sci.，389，172-182（1982）；Nakayamaら，Clin．Exp．Immunol.，54 ，319-326（1983）；Robeyら，J．Biol．Chem.，259，7311-7316（1984）；Robe yら，J．Exp．Med.，161，1344-56（1985）；Vigo，J．Biol．Chem.，260，3418 -3422（1985）；Shephardら，Clin．Exp．Immunol.，63，718-27（1986）；Horo witsら，J．Immunol.，138，2598-2603（1987）；Tatsumiら，Clinica Chimica Acta，172，85-92（1988）；DuClosら，J．Immunol.，141，4266-4260（1988）；DuClosら，J．Immunol.，146，1220-1225（1991）；Xiaら，FASEB J.，6，134 4a（1992）を参照のこと。ＣＲＰは、それぞれが約２３，５００の分子量を有する５つの同一のサブユニットからなる五量体である。このＣＲＰの五量体型は、ときどき“天然ＣＲＰ” といわれる。１９８３年頃に“修飾ＣＲＰ”又は“ｍＣＲＰ”といわれるＣＲＰのもう一つの型が発見された。修飾ＣＲＰは、天然ＣＲＰと比べて有意に相違する電荷、大きさ、溶解性及び抗原性を有する。Potempaら，Mol．Immunol.，20，1165-75（1 983）。修飾ＣＲＰは、結合性においても天然ＣＲＰと相違する；例えば、ｍＣＲＰはホスホリルコリンに結合しない。同文献；Chudwinら，J．AllergyClin．I mmunol.，77，216a（1986）。最後に、ｍＣＲＰは、その生物活性において天然ＣＲＰと相違する。Potempaら，Protides Biol．Fluids，34，287-290（1986）；Potempaら，Inflammation，12，391-405（1988）を参照のこと。ｍＣＲＰの特色ある抗原性は“ネオＣＲＰ”といわれている。ネオＣＲＰ抗原性は、１）適当な条件（以下に記載）を用いて調製された変性ＣＲＰ；２）ＣＲＰをコードするＤＮＡの一次翻訳産物（プレＣＲＰ）；及び３）固体表面上に固定化されたＣＲＰ上で発現される。Potempaら，Mol．Immunol.，20，1165-75（1983）； Mantzouranisら，Ped．Res.，18，260a（1984）；Samolsら，Biochem．J.，227 ，759-65（1985）；Chudwinら，J．Allergy Clin．Immunol.，77，216a（1986）；Potempaら，Inflammation，12，391-405（1988）。このネオＣＲＰ抗原性は抗体で検出することができる。例えば、ネオＣＲＰに特異性にした抗血清を用いることができる。Potempaら，Mol．Immunol.，24，53 1-41（1987）を参照のこと。一方、ｍＣＲＰのユニークな抗原決定基は、モノクローナル抗体で検出することができる。適するモノクローナル抗体は、１９９１年１月２４日に公開された公開ＰＣＴ出願ＷＯ９１／００８７２（１９８９年６月２７日に出願され今は放棄された米国出願第０７／３７２，４４２号の一部継続出願である１９８９年６月２９日に出願された係属中の米国出願第０７／３７４，１６６号に対応する）及びYingら，J．Immunol.，143，221-228（1989）、Y ingら，Immunol.，76，324-330（1992）、及びYingら，Molec．Immunol.，29，6 77-687（1992）に記載されている。ネオＣＲＰに対して特異性の抗血清と反応性の分子が、１０〜２５％の末梢血リンパ球（主にＮＫ及びＢ細胞）、８０％の単球及び６０％の好中球の表面上、及び組織傷害部位で同定されている。Potempaら，FASEB J.，2，731a（1988）； Brayら，Clin．Immunol．Newsletter，8，137-140（1987）；Reesら，Fed．Proc .，45，263a（1986）。加えて、ｍＣＲＰは単球細胞毒性の発生に影響を及ぼし、単球の補助細胞機能を向上させ、凝集ＩｇＧ誘発食細胞酸化代謝を増強し、そして単球によるインターロイキン１、プロスタグランジンＥ及びリポキシゲナーゼ産物の産生を増加することができると報告されている。Potempaら，Protides Biol．Fluids，34，287-290（1987）；Chuら，Proc．Amer．Acad．Cancer Res. ，28，344a（1987）；Potempaら，Proc．Amer．Acad．Cancer Res.，28，344a（ 1987）；Zellerら，Fed．Proc.，46，1033a（1987）；Potempaら，Inflammation ，12，391-405（1988）；Chuら，Proc．Amer．Acad．Cancer Res.，29，371a（1 988）。Chudwinら，J．Allergy Clin．Immunol.，77，216a（1986）は、ｍＣＲＰがグラム陽性型７Ｆ肺炎レンサ球菌で攻撃誘発されたマウスにおいて保護作用を有し得ることを教示している。ｍＣＲＰの他の活性が発見され、一定の係属中の米国特許出願及び公開ＰＣＴ出願に記載されている。特に、ｍＣＲＰは免疫複合体及び凝集イムノグロブリンに結合するので、液体から免疫複合体及び凝集イムノグロブリンを除去するのに及び免疫複合体を定量するのに用いることができることが発見された。１９８８年４月４日に出願され今は放棄された米国出願第０７／１７６，９２３号の一部継続出願である１９９０年１０月３日に出願された係属中の米国出願第０７／５８２，８８４号に対応する１９８９年１０月１９日に公開された公開ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２８を参照のこと。修飾ＣＲＰがウィルス感染症（１９９１年１１月２７日に出願された係属中の米国出願第０７／７９９，４４８号を参照のこと）、非レンサ球菌感染症及びエンドトキシンショック（１９９１年１１月２７日に出願された係属中の米国出願第０７／８００，５０８号を参照のこと）、及び癌（１９９２年４月２４日に出願された係属中の米国出願第０７／８７４，２６３号を参照のこと）の治療に有効であることも見出されている。ＣＲＰ及びｍＣＲＰの簡潔な委細については、Gotschlich，Ann．N.Y．Acad． Sci.，557，9-18（1989）を参照のこと。KilpatrikとVolanakis，Immunol．Res. ，10，43-53（1991）はＣＲＰの最近の委細を提供している。本発明より前には、ｍＣＲＰは、好ましくは出発原料として精製ＣＲＰを用いて作られた。一般に、ｍＣＲＰはＣＲＰを変性することによりＣＲＰから調製された。例えば、ＣＲＰは、（1）慣用的なキレート剤（好ましくは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はクエン酸）の存在下で有効量の尿素（好ましくは８Ｍ）で処理するか；（2）ＣＲＰのｐＨを約３未満又は約１１〜１２より上に調節するか；又は（3）ＣＲＰを変性させるのに十分な時間カルシウムの不存在下で又は上に列挙したものの如きキレート剤の存在下で５０℃以上に加熱することにより変性することができた。尿素処理が好ましい方法である。更に、ｍＣＲＰは、固体表面上にＣＲＰを吸着させることによりＣＲＰから調製することができる。ＣＲＰから調製されるｍＣＲＰは、５つのＣＲＰサブユニットが解離し、次いでそれらそれぞれが自発的コンフォメーション変化を受けてｍＣＲＰを形成することにより形成されると考えられる。Brayら，Clin．Immunol．Newsletter ，8，137-140（1987）を参照のこと。ＣＲＰの生物学的供給源及びそれら供給源からそれを精製する方法は周知であるが、かかる供給源からでは精製ＣＲＰは限られた量でしか得られない。従って、ＣＲＰからはｍＣＲＰを商業的な量で製造することができなかった。ヒト、マウス、及びウサギＣＲＰをコードするゲノミック及びｃＤＮＡクローンが単離されている。Tucciら，J．Immunol.，131，2416-2419（1983）；Whiteh eadら，Science，221，69-71（1983）；Leiら，J．Biol．Chem.，260，13377-83 （1985）；Wooら，Ｊ．Biol．Chem.，260，13384-88（1985）;Huら，Biochem.， 25，7834-39（1986）；SamolsとHu，Protides Biol．Fluids，34，263-66（1986 ）；Syinら，J．Biol．Chem.，261，5473-79（1986）；Cilibertoら，Nucleic A cids Res.，15，5895（1987）；Huら，J．Biol．Chem.，263，1500-1504（1988 ）；Whiteheadら，Biochem．J.，266，283-90（1990）。五量体天然ＣＲＰを得るには、真核宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞を用いるべきである。Samo lsとHu，Protides Biol．Fluids，34，263-66（1986）；Huら，J．Biol．Chem. ，263，1500-1504（1988）を参照のこと。かくして、組換えＤＮＡ法により天然ＣＲＰを大量に製造してから、上記のようにしてｍＣＲＰに転化できよう。しかしながら、ｍＣＲＰ又はｍＣＲＰの生物活性を有する分子を組換えＤＮＡ法により製造する直接法を持つことが便利であろう。上述のように、ＣＲＰｍＲＮＡの一次翻訳産物（プレＣＲＰ）がネオＣＲＰ抗原性を発現することが分かっている。従って、ｍＣＲＰは、宿主細胞内でＣＲＰサブユニットを五量体天然ＣＲＰに組み立てないような条件を選択することによって調製することができよう。これは、原核性宿主内でＣＲＰゲノミック又はｃＤＮＡクローンを発現することによって達成できる。SamolsとHu，Prot．Biol． Fluids，34，263-66（1986）を参照のこと。このようにしてｍＣＲＰを製造しようとして、本発明者らは、大腸菌内で発現されるＣＲＰｃＤＮＡクローンの産物が、ＣＲＰサブユニット及び／又はプレＣＲＰ及びＣＲＰ断片の凝集塊、並びにフリーのＣＲＰサブユニット及び／又はプレＣＲＰからなることを発見した。このｃＤＮＡ産物は極端に不溶性なので精製に問題があることが分かった。特に、本発明者らは、これら調製物中の相当な割合の凝集塊が共有結合の架橋により形成されていること、及びかかる架橋凝集塊を捨てなければならず、それによって収率がかなり低下することを発見した。従って、ｍＣＲＰの生物活性を有するが、非突然変異型のそのタンパク質よりも共有結合で架橋した凝集塊をあまり形成しそうにない突然変異型ＣＲＰサブユニット又はプレＣＲＰ分子を製造することができれば、処理及び精製をより簡単にかつ効率的にするのに非常に望ましいであろう。本発明は、これら特徴を有する突然変異型タンパク質を提供するものであり、これら突然変異型タンパク質は、以下に更に詳細に説明するＣＲＰｃＤＮＡ又はゲノミッククローンの部位特異的突然変異誘発法により製造することができる。 Agrawalら，FASEB J.，6，1427a（1992）は、ＣＲＰのホスホリルコリン結合部位の構造決定基を探知するためにＣＲＰｃＤＮＡクローンの部位特異的突然変異誘発法を用いることを報告している。次の８つの突然変異型組換えＣＲＰが調製された：Tyr40-->Phe；Glu42-->Gln；Tyr40-->PheとGlu42-->Gln；Lys57-->Gl n；Arg58-->Gly；Lys57-->GlnとArg58-->Gly；Trp67-->Lys；及びLys57-->Glnと Arg58-->GlyとTrp67-->Lys。この著者は、Trp67はＣＲＰのホスホリルコリン結合部位の構造にとって臨界的であり、Lys57及びArg58もこの結合部位の形成に関係しており、そしてテトラペプチド39-Phe-Tyr-Thr-Glnはこの結合部位の形成に僅かしか又は何の役割も有していないと結論した。発明の要旨本発明は、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰの少なくとも１のアミノ酸が欠失しているか、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰの少なくとも１のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されているか、少なくとも１のアミノ酸が非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰに付加しているか、又はかかる変換の組み合わせがなされていることを除いて、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰと同じアミノ酸配列を有する突然変異型タンパク質を提供する。付加、欠失及び／又は置換されるアミノ酸は、この突然変異型タンパク質がその非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰよりも共有結合で架橋した凝集塊をあまり形成しそうにないように選ばれる。この突然変異型タンパク質もｍＣＲＰの少なくとも１の生物活性を示す。本発明は、更に、本発明の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ分子及び該突然変異型タンパク質の発現のためのベクターを提供する。このベクターは、発現制御配列に発効的に連結した本発明の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。本発明の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡを含有するように形質変換された宿主細胞も提供する。本突然変異型タンパク質をコードするこのＤＮＡは、発現制御配列に発効的に連結している。本発明は、更に、本発明の突然変異型タンパク質を製造する方法を提供する。この方法は、突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡを含有するように形質変換された宿主細胞を培養することを含む。本突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡは、発現制御配列に発効的に連結している。この培養は、本突然変異型タンパク質を発現できる条件下で起こる。本発明は、本発明の突然変異型タンパク質を用いる方法も提供する。特に、本発明の突然変異型タンパク質は、ｍＣＲＰの少なくとも１の生物活性を有するであろうから、ｍＣＲＰが用いられる場合に用いることができる。例えば、本発明の突然変異型タンパク質は、凝集イムノグロブリン及び免疫複合体に結合する。従って、それらを、ｍＣＲＰのように、液体から凝集イムノグロブリン及び免疫複合体を除去するのに、免疫複合体を定量するのに、及びそうすることを必要とする哺乳動物中の免疫複合体のレベルを低下させるのに用いることができる。本発明の突然変異型タンパク質は、ウィルス感染症、細菌感染症、エンドトキシンショック及び癌を治療するのに用いることもできる。本発明は、更に、液体から凝集イムノグロブリン及び免疫複合体を除去する装置を提供する。この装置は、本発明の突然変異型タンパク質が結合している固体表面を含む。この装置は、液体がこの固体表面に接触できるようにその固体表面を包む手段も含む。本発明は、免疫複合体を定量するキットも提供する。このキットは、本発明の突然変異型タンパク質の１種の容器を含む。最後に、本発明は、本発明の突然変異型タンパク質を薬学的に許容できるキャリヤーと共に含む治療用組成物及び哺乳動物内の免疫複合体又は癌細胞の検出が可能なように標識された本発明の突然変異型タンパク質を含む造影剤を提供する。図面の簡単な説明図１Ａは、本発明の突然変異型タンパク質を製造するために用いた一連のポリメラーゼ連鎖反応の図解である。図１Ｂは、プラスミドｐＩＴ４の制限酵素地図である。図２Ａ及び２Ｂは、プラスミドｐＩＴ３の調製を説明するものである。図３Ａ〜Ｄは、Q-Sepharose Fast Flow^R（Pharmacia）カラムでクロマトグラフィーに付した物質の溶離プロフィールである。図３Ａは天然ＣＲＰであり、図３ＢはｍＣＲＰであり、図３Ｃは野生型組換えＣＲＰであり、そして図３Ｄは本発明による突然変異型タンパク質である。図４は、クマシーブルーで染色したPhastGel^RＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Pharmac ia）である。図５Ａ〜Ｂは、野生型組換えＣＲＰ上での天然ＣＲＰ及びｍＣＲＰ抗原決定基の存在を検出するためのＥＬＩＳＡ検査の結果のグラフである。図５Ｃ〜Ｄは、その両方ともをQ-Sepharose Fast Flow^Rカラムに通すことによって精製した野生型組換えＣＲＰ及び本発明による突然変異型タンパク質上でのｍＣＲＰ抗原決定基の存在を検出するためのＥＬＩＳＡ検査の結果のグラフである。図６Ａ〜Ｂは、凝集ＩｇＧ及び単量体ＩｇＧへの結合を検出するためのＥＬＩＳＡ検査の結果のグラフである。現時点で好ましい態様の詳細な説明本発明の突然変異型タンパク質は、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰに比較して、付加、欠失又は置換した少なくと１のアミノ酸を有する。しかしながら、本突然変異型タンパク質は、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰに比較して、幾つかのアミノ酸変換を有する。例えば、本突然変異型タンパク質は、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又はプレＣＲＰに比較して、幾つかの付加アミノ酸、幾つかの欠失アミノ酸、幾つかの置換アミノ酸、又は付加、欠失若しくは置換アミノ酸の組み合わせを有することができる。付加、欠失及び／又は置換したアミノ酸は、本突然変異型タンパク質が、その非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰよりも共有結合で架橋した凝集塊をあまり形成しそうにないように選ばれる。適するアミノ酸変換には、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰ中の少なくとも１のシステイン、好ましくは全てのシステインの欠失又は置換が含まれる。ＣＲＰサブユニットは２のシステインを含有しそしてプレＣＲＰは３のシステインを含有するので、これらシステインの幾つかが分子間ジスルフィド結合を形成し、それによって共有結合で架橋した凝集塊の形成に寄与すると考えられる。従って、これらシステインの一方又は好ましくは両方を欠失又は置換するのが望ましい。システインを他のアミノ酸と置換するときには、それらを好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン又はメチオニンと置換するが、あらゆるアミノ酸を用いることができる。最も好ましいのはアラニンとの置換である。リシン及び誘導化リシン残基も、分子間共有架橋結合に寄与し得る。従って、適するアミノ酸変換には、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰ中の少なくとも１のリシンの欠失又は置換も含まれ得る。それらにおけるアミノ酸変換の結果として、本発明の突然変異型タンパク質は、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰよりも精製がより容易となり、収率もずっと高くなる。また、最終生成物は、非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰで得られるものよりもずっと純粋であり、凝集塊及び断片もずっと少なくなる（例えば、実施例１を参照のこと）。全ての変換を組み合わせた効果で分子間共有架橋結合が少なくなる限り、必ずしも全てのアミノ酸付加、欠失及び置換が、共有結合で架橋した凝集塊を形成する可能性を少なくするのに寄与する必要なない。例えば、本突然変異型タンパク質を製造するために用いられる組換えＤＮＡ操作で、ＣＲＰサブユニットのアミノ又はカルボキシ末端においてアミノ酸が付加されてもよい。これは、これらアミノ酸が共有結合で架橋した凝集塊の生成に寄与しない限り許容できる（例えば、実施例１を参照のこと）。加えて、幾つかのアミノ酸変換を他の目的のために行ってもよい。例えば、生成する突然変異型タンパク質の水性媒質中での溶解性を増すアミノ酸変換を行うのが望ましい。というのは、より可溶性の突然変異型タンパク質は精製及び処理がより容易だからである。溶解性を増すのに適するアミノ酸変換には、１又は２以上の疎水性アミノ酸を欠失すること、１又は２以上の疎水性アミノ酸を荷電アミノ酸と置換すること、１又は２以上の荷電アミノ酸を付加すること、又はこれら変換の組み合わせが含まれる。しかしながら、上述の理由から、リシン残基の付加は避けるのが望ましいといえる。水性媒質には、水、食塩水、緩衝液、培地、及び体液が含まれる。本発明の突然変異型タンパク質は、ｍＣＲＰの少なくとも１の生物活性も示す。ここで用いる場合“生物活性”とはｍＣＲＰの物理的及び化学的特性以外の特性をいう。ｍＣＲＰの生物活性には、凝集イムノグロブリン及び免疫複合体に結合するその能力が含まれ、この能力が液体（抗体試薬又は体液の如きもの）から凝集イムノグロブリン及び免疫複合体を除去するのに、及びそうすることを必要とする哺乳動物中の免疫複合体のレベルを低下させるのにｍＣＲＰを用いるのを可能にする。ｍＣＲＰの生物活性には、ウィルス感染症、細菌感染症、エンドトキシンショック及び癌の治療におけるその有効性も含まれる。例えば、本発明の突然変異型タンパク質が凝集イムノグロブリン及び免疫複合体に結合できることが分かった。凝集イムノグロブリン又は免疫複合体の結合は、凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を含有する液体に突然変異型タンパク質を直接添加することによっても、突然変異型タンパク質をまず固体支持体上に固定化してから凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を含有する液体に接触させても達成することができる。本突然変異型タンパク質を固体支持体上に結合させる場合、診断検査に用いるときには液体を固定化突然変異型タンパク質上で静的にインキュベートしてよく、又治療のために用いて体液中の免疫複合体に結合させるときには液体を体外装置中の固定化突然変異型タンパク質中に起動的に通してもよい。本発明で用いるのに適する固体支持体物質は、アガロースを基剤とする樹脂、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ラテックス、デキストラン、ガラス、ナイロン、ポリビニルアルコール、ゲル、粘土、セルロース誘導体、及び他のあらゆる疎水性又は親水性ポリマー物質でできていてもよい。この固体支持体は、カラムで用いるためのビーズの形であっても、マイクロタイタープレートのウェルの形であっても、ホローファイバー膜の形であっても、又は以下に説明するような他の形をとってもよい。カラム及び固相物質は、合衆国内ではBio Rad Laboratories（Richmond，CA）；Pierce Chemical Co.（Rockfor d，IL）；Pall Biosupport（Glen Cove，NY）；Micro Membranes（Newark，NJ）；Pharmacia Fine Chemicals（Uppsala，Sweden）；及びその他から市販されている。本突然変異型タンパク質は、固体支持体への共有結合により固定化されていても非共有結合により固定化されていてもよい。固体支持体上にタンパク質を固定化する方法は当該技術分野で周知である。例えば、突然変異型タンパク質を固体支持体と共に単にインキュベートして突然変異型タンパク質を吸着させることによって固体支持体上に固定化することができる。本突然変異型タンパク質への凝集イムノグロブリン又は免疫複合体の結合が最大となるのを確保するために、結合剤を用いてポリマー物質への突然変異型タンパク質の結合を確実にしてもよい。本突然変異型タンパク質を結合剤でポリマー物質の表面上に非共有結合で固定化しても共有結合で固定化してもよい。この発明の目的のためには、結合剤は、突然変異型タンパク質を添加する前に、ポリマー固体表面の一部として組み入れられるか、又はポリマー固体表面上に誘導化される。これら結合剤は慣用的なものであって、それらには、ジイミドエステル、カルボジイミド、過ヨウ素酸塩、アルキルハライド、ジメチルピメリミデート及びジマレイミドが含まれる［Blait，A.H．とGhose，T.I.，J．Immunol.Methods ，59:129（1983）；Blair，A.H．とGhose，T.I.，Cancer Res.，41:2700（1981 ）；Gauthierら，J．Expr．Med.，156:766-777（1982）を参照のこと］。結合剤への本突然変異型タンパク質の結合には、一般に、タンパク質アミノ酸Ｒ基の事前修飾又は架橋剤又はその両方を要する。かかる修飾は、Ｒ基を選択的に活性化（例えば、カルボジイミド−Ｏ−アシル尿素；アスパラギン酸、グルタミン酸、及びＣ末端カルボキシ残基での中間体形成）して、適切な利用可能結合剤の官能基（カルボジイミドの場合にはアミノ基）と反応できるようにするのに役立ち得る。修飾には、リシンε−アミノ残基上にピリジルジチオ基を導入する新たな反応性部分（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）の導入も含まれ得る。これは、タンパク質と結合剤の間のジスルフィド結合形成を可能にする。ある場合には、興味の対象であるタンパク質Ｒ基と結合剤の間に橋を形成する二官能性カップリング試薬を用いる。本突然変異型タンパク質は、研究のために、治療手順において、又は診断試験において用いられる液体、例えば、モノクローナル抗体、抗血清、誘導化試薬、静脈内γグロブリン、又は単離血液成分を含有する溶液から、凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を除去するのに用いることができる。かかる液体中での凝集イムノグロブリンの存在は、補体を不活性化するための抗血清の熱処理の如きこれら液体を作るのに用いられる加工工程からして考え得ることである。かかる液体から凝集又は複合化イムノグロブリンを除去するために、本突然変異型タンパク質を固体支持体上に結合させることができる。適する固体支持体は上記したものであり、本突然変異型タンパク質をそれらに上記のようにして結合させる。また、凝集又は複合化イムノグロブリンを除去するために、本突然変異型タンパク質をかかる液体に直接添加してもよい。本発明の突然変異型タンパク質を用いて、体液を本突然変異型タンパク質と接触させることにより、全血又は血漿の如き体液から免疫複合体を除去することもできる。本突然変異型タンパク質を体液に直接添加しても、固体支持体上に固定化してから体液と接触させてもよい。適する固体支持体は上記したものであり、本突然変異型タンパク質をそれらに上記のようにして結合させる。癌、自己免疫疾患、関節炎、及び感染症の如き疾患では高レベルの免疫複合体がなかなか解消しないことがあり得る。血行中での免疫複合体の継続的存在及びそれらの組織内への堆積は、免疫系機能の弱体化及び炎症性異常の一因となる。従って、免疫複合体のレベルを低下させるのは有益な筈である。Theofilopoulos ら，Adv．Immunol.，28，90-220（1979）；Theofilopoulosら，Immnodiaqnostic s of Cancer，p.896（1979）を参照のこと。かかる治療用途のために、本突然変異型タンパク質で被覆された固体支持体を有する体外装置に血液、血漿又は他の液体を通すことにより、本突然変異型タンパク質を体液と接触させてもよい。この装置は、固体支持体に結合した本突然変異型タンパク質に液体が接触できるように固体支持体を包む手段も有するであろう。血液、血漿又は他の液体は起動的にこの装置を循環して、そこに含有される免疫複合体が結合し、例えば、慣用的な血漿交換法や血液透析法におけるように除去される。液体は、血液置換治療の必要がなければ身体に戻され得る。この体外装置の固体支持体及び包み込み手段は、どのような生体適合性物質でできていてもよい。例えば、固体支持体は、本突然変異型タンパク質で被覆された膜表面であっても、アガロースを基剤とするビーズであっても、ホローファイバーであってもよい。体外装置は、ビーズを詰めたカラムであってもホローファイバー膜を包むシリンダーであってもよい。この装置は、液体をこの装置に通して患者に戻すため及び空気が系に入り込むのを阻止するために、この装置を患者及びポンプに繋ぐのに適切なチュービングも含むことができる。特に、慣用的な血漿交換装置を本発明の実施に用いることができ、それは、本突然変異型タンパク質を固定化した固体支持体を含有できるようにそれらに手を加えることによってできる。例えば、慣用的な血漿交換装置を記載しているRandersonら，Art．Or gans，6，43-49（1982）；Smithら，Cleve．Clin．Q.，51，135-142（1984）；N ilssonら，Plasma Ther．Transfus．Technol.，5,127-134（1984）；Nilssonら，Affinity Adsorption of Inhibitorsにおけるpp.223-241（Hoyer編,1984）；O pportunities In The Oncology Marketplaceで提出されたLiberti，“Developme nt Of A Universal Immune Specific Filtration Device（Blood Filter）,”； Mittelmanら，Seminars in Hematology，26，15-18（1989）；１９８４年２月２１日に発行された米国特許第４,４３２,８７１号；１９８５年１１月５日に発行された米国特許第４,５５１,４３５号；１９８６年９月３０日に発行した米国特許第４,６１４,５１３号を参照のこと。この装置は、治療用途のためには滅菌されていなくてはならない。滅菌は、スチーム、熱、酸化エチレンでのパージング又は照射の如き慣用的な方法で行うことができる。本発明は、免疫複合体を検出又は定量する方法であって、該免疫複合体を本発明の突然変異型タンパク質に、該免疫複合体が該突然変異型タンパク質に結合するように接触させることを含む方法も包含する。本突然変異型タンパク質を、免疫複合体を含有する液体に直接添加して、該液体中の免疫複合体を検出又は定量することができる。また、本突然変異型タンパク質を固体支持体上に固定化してからそれを免疫複合体を含有する液体に接触させてもよい。本突然変異型タンパク質をその上に免疫複合体を有する細胞又は組織サンプルに直接添加してもよく、また標識した突然変異型タンパク質を哺乳動物に注射して、免疫複合体が見出される炎症領域の如き哺乳動物の身体の領域にそれを局在化させてもよい。適する固体支持体物質は上記したものであり、突然変異型タンパク質をそれらに上記のようにして固定化される。診断検査用では、適する固体支持体には、免疫検査に慣用的に用いられるものが含まれる。例えば、この固体支持体は、試験管、マイクロタイタープレートのウェル、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、その他のビーズ、濾紙、ガラスファイバー製濾紙、又は、例えば、ポリカーボネート、ポリスルホン又はラテックス製のディップスティックであってもよい。免疫複合体を検出又は定量するには、標識突然変異型タンパク質を用いることができる。本発明で有用な標識は、酵素、蛍光、生物発光、化学発光、及び放射性標識及びビオチンの如き当該技術分野で公知のものである。また、免疫複合体は、慣用的な免疫検査法を用いて、免疫複合体に結合する標識成分を添加することにより検出又は定量することができる。適する標識成分には、免疫検査で用いられる慣用的な試薬が含まれる。例えば、免疫複合体中のイムノグロブリン又は抗原に対する標識抗体が用いられよう。さもなければイムノグロブリンのＦｃ部分に結合する標識プロテインＡが用いられよう。用いられる標識は上記したものである。適する慣用的な免疫検査法には、凝集検査法、放射性免疫検査法、酵素免疫検査法及び蛍光検査法が含まれる。例えば、本突然変異型タンパク質を、凝集検査に用いるためにラテックスビーズ上に被覆しても、定量的又は半定量的免疫検査に用いるためにディップスティック上に被覆してもよい。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＩＡ）が好ましい。というのは、それらは免疫複合体のレベルの感度のよい定量手段を提供するからである。一般に、観察可能な特性変化をもたらすあらゆる免疫検査法を用いることができる。試薬の比濃度、インキュベーションの温度及び時間、並びに他の検査条件は、検査が免疫複合体の検出に用いらようと定量に用いられようと、サンプル中の免疫複合体の濃度、サンプルの性質等の如き要因に依存して変動してもよい。当業者は、日常的な実験を用いながら各測定について有効で最適な条件を決めることができるよう。哺乳動物からの体液は普通は一定の免疫複合体を含有しているので、哺乳動物からの試験サンプル中の免疫複合体のレベルの比較は、疾患状態の指標となる免疫複合体のレベルを同定するには、正常体に見出されるレベルに対してなされなければならないだろう。免疫複合体を検出又は定量するための試験キットも本発明の一部である。このキットは、突然変異型タンパク質の溶液又は固体支持体に付着した突然変異型タンパク質を保持する容器を含む。これら固体支持体は上記したタイプのものであり、突然変異型タンパク質を上記の通りに付着させる。かくして、その容器は、突然変異型タンパク質の溶液を保持するボトル、保護パッケージ内に包まれた突然変異型タンパク質で被覆されたディップスティック、突然変異型タンパク質で被覆されたラテックスビーズを保持するボトル、又は突然変異型タンパク質でウェルが被覆されたマイクロタイタープレートとなろう。本突然変異型タンパク質は、それを免疫複合体の検出又は定量に用いる場合は標識されてもよい。また、このキットは、更に、免疫複合体に又は本突然変異型タンパク質に結合することによって免疫複合体の検出又は定量を可能にする標識成分を保持する容器を含むことができる。適する標識成分は上記したものである。本発明の突然変異型タンパク質は、哺乳動物に投与して該哺乳動物中の免疫複合体のレベルを低下させることができる。免疫複合体を含有する哺乳動物の体液中に本突然変異型タンパク質を導入すると、可溶性免疫複合体の物理的サイズがより大きく成長して沈殿する（溶液からの沈降）か又は食細胞によるそれらの除去が促進されるように修飾されるだろう。哺乳動物中の免疫複合体のレベルを低下させるには、有効量の突然変異型タンパク質を、注射、好ましくは静脈内注射によって該哺乳動物に投与する。本発明の突然変異型タンパク質を用いてウィルス感染症を治療することもできる。それらを用いてレトロウィルス科の感染症の如きあらゆるタイプのウィルス感染症を治療することができる。レトロウィルス科は、３つの亜科、つまりオンコウィルス亜科、スプマウィルス亜科及びレンチウィルス亜科を含む球状の外膜があるＲＮＡウィルスの科である。Hullら，Virology：Directory & Dictionary of Animal，Bacterial and Plant Viruses，p.191（Stockton Press 1989）。複製は、宿主の染色体ＤＮＡ内に取り込まれるＤＮＡへのウィルスＲＮＡの逆転写で始まる。同文献。内因性オンコウィルスは脊椎動物の間に広く存在しており、多くの疾患と関係している。同文献。レンチウィルスにはＨＩＶ−１及びＳＩＶが含まれる。Fauci，Science，239，617-622（1988）。哺乳動物のウィルス感染症を治療するには、有効量の突然変異型タンパク質を該哺乳動物に投与する。好ましくは、感染症があまりに重くならないうちに突然変異型タンパク質を哺乳動物に投与する。最も好ましくは、ウィルス感染症の最初の徴候で本突然変異型タンパク質を投与するか又はウィルス感染症にかかる恐れのある哺乳動物に予防的に投与する。例えば、ＨＩＶ−１若しくは肝炎ウィルスの如きウィルスで汚染された血液を輸血される血友病患者又は外科患者に本突然変異型タンパク質を予防的に投与してもよい。もちろん、既にウィルス感染症にかかった哺乳動物に突然変異型タンパク質を投与してもよい。本突然変異型タンパク質は、一般に、ウィルス感染症にかかっている哺乳動物に注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）により投与されるであろう。好ましくは静脈内注射が用いられる。本突然変異型タンパク質を液体で注射してもリポソーム内に封入してもよい。また、本突然変異型タンパク質を、例えば、創傷部位又は他の感染部位に局所適用してもよい。最後に、本突然変異型タンパク質をスプレーによって投与して呼吸器系感染症を治療するのも可能な筈である。本発明の突然変異型タンパク質は、細菌感染症、特にグラム陰性菌感染症、及びエンドトキシンショックを治療するのにも用いることができる。エンドトキシンは、敗血症及びグラム陰性菌血症において多くの全身有害作用及び重い後遺症を引き起こすグラム陰性菌の外膜のリポポリサッカライド成分である。哺乳動物の細菌感染症又はエンドトキシンショックを治療するには、有効量の突然変異型タンパク質を該哺乳動物に投与する。好ましくは、細菌感染症があまりに重くならないうちに及び敗血症性ショック又はエンドトキシンショックが発症する前に本突然変異型タンパク質を哺乳動物に投与する。最も好ましくは、細菌感染症の最初の徴候で本突然変異型タンパク質を投与するか又は細菌感染症にかかる恐れのある哺乳動物に予防的に投与する。例えば、突然変異型タンパク質を外科患者又は細菌感染症にかかる恐れのある集中治療中の患者に予防的に投与してもよい。もちろん、既に細菌感染症にかかっているか又は既に敗血症性ショック若しくはエンドトキシンショックにかかっている哺乳動物に本突然変異型タンパク質を投与してもよい。本突然変異型タンパク質は、一般に、細菌感染症又はエンドトキシンショックにかかっている哺乳動物に注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）により投与されるであろう。好ましくは静脈内注射により投与される。本突然変異型タンパク質を液体で投与してもリポソーム内に封入してもよい。また、本突然変異型タンパク質を、例えば、創傷部位又は他の感染部位に局所適用してもよく、本突然変異型タンパク質をスプレーによって投与して呼吸器系感染症を治療するのも可能な筈である。最後に、本発明の突然変異型タンパク質を用いて癌を治療することができる。本発明の突然変異型タンパク質を用いて、腺癌、リンパ腫、線維肉腫、及び白血病を含むがこれらに限定されない種々の癌を治療すること及び転移を抑えることを意図している。哺乳動物中での癌細胞の存在が最初に検出されたときに本突然変異型タンパク質をその哺乳動物に投与すべきである。癌の治療には、本突然変異型タンパク質を哺乳動物に好ましくは注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）により投与する。本突然変異型タンパク質を液体で投与してもリポソーム内に封入してもよい。治療のために哺乳動物に投与されなければならない突然変異型タンパク質の投与量は、該突然変異型タンパク質を投与される哺乳動物、該突然変異型タンパク質を投与する理由（例えば、免疫複合体のレベルを低下させるため、ウィルス感染症を治療するため、細菌感染症を治療するため、エンドトキシンショックを治療するため、癌を治療するため）、哺乳動物の症状の重さ、投与ルート、及び哺乳動物に投与される他の何らかの薬剤の個性に依存して変動するであろうことは当業者に理解される。１回投与を越えて本突然変異型タンパク質を投与する必要があり得ることも理解される。本突然変異型タンパク質の投与の有効量及びスケジュールは経験的に決めることができ、かかる決定は当該技術分野の熟練に属する。体重１ｋｇ当たり約５μ ｇ〜約１５０ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約２０ｍｇの量の突然変異型タンパク質が、免疫複合体のレベルを低下させるのに、ウィルス感染症を治療するのに、細菌感染症を治療するのに、エンドトキシンショックを治療するのに又は癌を治療するのに有効であろう。癌を治療するには、投与量は、最も好ましくは１ｋｇ当たり約２ｍｇ〜約１０ｍｇである。一般に、細菌感染症又はエンドトキシンショックを治療するには１回の投与で十分である。免疫複合体のレベルの低下、ウィルス感染症の治療及び癌の治療には、多数回投与が一般に必要であろう。多数回投与が必要な場合には、投与と投与の間隔は、好ましくは約１日〜約７日である。癌を治療するには、最も好ましくは、約１日〜約３日離して多数回投与が行われる。突然変異型タンパク質の投与は、免疫複合体のレベルが正常に戻るまで又は健康が元に戻るまでその哺乳動物に対して継続すべきである。本突然変異型タンパク質は、薬学的に許容できるキャリヤー中で哺乳動物に投与される。薬学的に許容できるキャリヤーは周知である。例えば、本発明の突然変異型タンパク質の投与に適するキャリヤーには、水、食塩水及び緩衝液の如き液体が含まれる。免疫複合体のレベルを低下させるために用いる場合を除いて、本突然変異型タンパク質をリポソーム内に封入して投与することもできる［Deod harら，Cancer Research，42，5084-5088（1982）；Thombreら，Cancer Immunol ．Immunother.，16，145-150（1984）；Barnaら，Cancer Research，44，305-31 0（1984）を参照のこと］。癌の治療には、本突然変異型タンパク質を好ましくはリポソーム内に封入して投与する。“リポソーム”という用語は、突然変異型タンパク質を封入することができるあらゆる袋状又は空の小嚢状構造のことをいい、多層小嚢、単層小嚢、及び赤血球形骸を含む。リポソームを調製する方法及びそれらの中に分子を封入する方法は当該技術分野で周知である。好ましくは、突然変異型タンパク質を含有するリポソームは、MacDonaldら， Biochim．Biophys．Acta，1061:297-301（1991）に記載された通りに調製できる押出品により形成される単層小嚢である。局所適用には、適切な場合には、当該技術分野で周知のように、本突然変異型タンパク質をローション、ゲル、クリーム等の中に混入させてもよい。許容できかつ最適なキャリヤー及び投与のルートを決めるのは当該技術分野の熟練に属する。本突然変異型タンパク質は、哺乳動物に単独で投与しても他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、本突然変異型タンパク質を細菌感染症を治療するために用いるときは抗生物質と組み合わせて用いてもよく、癌を治療するために用いるときは他の抗癌剤と一緒に用いてもよい。本突然変異型タンパク質を投与する有効量とスケジュール及びこれら他の薬剤は、上述のように経験的に決めることができる。癌を治療するために突然変異型タンパク質と抗癌剤を組み合わせて用いるときは、それらを別々に用いるときに比べて類似の量の突然変異型タンパク質と抗癌剤（５０％又はそれ未満）を用いることができると考えられる。本突然変異型タンパク質と他の薬剤を組み合わせて使用する場合のそれらについての許容できかつ最適なキャリヤー及び投与ルートを決めるのも当該技術分野の熟練に属する。本突然変異型タンパク質と組み合わせて用いることができる他の抗癌剤には、チオテパ、ブスルファン、シクロホスファミド、メトトレキセート、シタラビン、ブレオマイシン、シスプラチン、ドキソルビシン、メルファラン、メルカプトプリン、ビンブラスチン、及び５−フルオロウラシルの如き当該技術分野で公知の細胞毒性化学療法化合物が含まれる。他の適する化学療法化合物は、Krakoff ，CA-A Cancer Journal For Clinicians，41:264-278（1991）に列挙されている。典型的には、細胞毒物質は、細胞の破壊及び／又はそれらの増殖の阻止に機能するので、癌を治療するのに有用である。この他の抗癌剤は、免疫アジュバントであってもサイトカインであってもよい。“生体応答調整物質”ともいわれる免疫アジュバント及びサイトカインは、当該技術分野で公知である。一般に、かかる分子は宿主防御メカニズムを刺激又は増進するのに有用であるので、抗癌治療に有用である。投与することができる免疫アジュバント又はサイトカインの例には、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ステロイドの如きホルモン、及びＩＬ−１、ＩＬ−２及びＩＬ−６の如きインターロイキンが含まれる。本突然変異型タンパク質は、免疫複合体又は癌細胞をin vivoで検出するための造影剤としても用いることができる。そうするには、標識突然変異型タンパク質を哺乳動物に注射して、免疫複合体が堆積している（炎症の領域の如き）領域又は癌細胞が占拠している領域に局在させることになろう。また、未標識突然変異型タンパク質を注射してもよい。次いで、この突然変異型タンパク質に結合する結合する標識物質を注射し、そしてこの標識物質をその突然変異型タンパク質に、それが局在している領域で結合させる。造影剤及びそれらに適する標識を作る方法及び使用する方法は、当該技術分野で周知である。本発明の突然変異型タンパク質は、形質転換宿主細胞内でのそれらをコードするＤＮＡの発現により調製することができる。本発明による突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡは、ＣＲＰゲノミック又はｃＤＮＡクローンのin vitro突然変異誘発法により調製しても化学的に合成してもよい。発明の背景の節で説明したように、ヒト、マウス、及びウサギＣＲＰをコードするゲノミック及びｃＤＮＡクローンが単離されている。異なる種からのＣＲＰのアミノ酸配列の間には大きな相同性がある。例えば、種々の哺乳動物種からのＣＲＰの間には約５０から約８０％の配列相同性がある。Huら，Biochem.，25， 7834-39（1986）；Whiteheadら，Biochem．J.，266,283-90（1990）；Kilpatrik とVolanakis，Immunol．Res.，10，43-53（1991）。異なる種からのＣＲＰの間に大きな相同性があるので、他の種からのＣＲＰをコードするゲノミック及びｃＤＮＡクローンを単離することができるプローブを容易に調製することができる。かかるプローブを調製する方法及びゲノミック及びｃＤＮＡクローンを単離する方法は周知である。例えば、Leiら，J．Biol．Chem.，260，13377-83（1985）；Wooら，J．Biol．Chem.，260，13384-88（1985）；Huら，Biochem.，25，7834 -39（1986）；Huら，J．Biol．Chem.，263，1500-1504（1988）；Whiteheadら， Biochem．J.，266，283-90（1990）を参照のこと。公知のクローンの１つ又は新たに単離したクローンを用いて、本発明による突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡを慣用的で周知のin vitro突然変異誘発法を用いて調製することができる。特に好ましいのは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法を用いる部位特異的突然変異誘発法である。実施例１を参照のこと。次の参考文献は、本発明の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡを産生させるのに用いることができる他の部位特異的突然変異誘発法を記載している：Current Protocools In Molecular Biology，Chapter 8，（Ansubel編．1987 ）；Smith & Gilliam，Genetic Engineering Principles And Methods，3，1-32 （1981）；Zoller & Smith，Nucleic Acids Res.，10，6487-6500（1982）；Zol lerら，Methods Enzymol.，100，468-500（1983）;Zoller & Smith，DNA,3，479 -88（1984）；Brakeら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81，4642-46（1984）；B io/Technology，pp.634-39（July 1984）；Botsteinら，Science，229，1193（1 985）；Kunkelら，Methods Enzymol.，154，367-82（1987）。本発明の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡは、化学合成により調製することもできる。特定の配列を有するＤＮＡを化学的に合成する方法は、当該技術分野で周知である。かかる方法には、ホスホラミダイト法（例えば、Beaucage とCaruthers，Tetrahedron Letters，22，1859（1981）；MatteucciとCaruthers ，Tetrahedron Letters，21，719（1980）；及びMatteucciとCaruthers，J．Ame r．Chem．Soc.，103，3185（1981）を参照のこと）及びホスホトリエステルアプローチ（例えば、Itoら，Nucleic Acids Res.，10,1755-69（1982）を参照のこと）が含まれる。本発明は、本発明による突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターも包含する。このＤＮＡコーディング配列は、このベクター内で適切な発現制御配列に発効的に連結される。この発効的連結（operative linking）をもたらす方法は、本突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡをベクター内に挿入する前であっても後であっても周知である。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写の制御に関与する他のシグナルが含まれる。このベクターは、プロモーター及び転写終結シグナルを含有しなければならず、これら両方はこのＤＮＡ配列に発効的に連結している、即ち、プロモーターはこのＤＮＡ配列の上流にあって転写終結シグナルはそれから下流にある。プロモーターは、宿主細胞内で転写活性を示す如何なるＤＮＡ配列であってもよく、アミラーゼ、グリコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、及び解糖酵素の如き同種又は異種のタンパク質であって細胞外又は細胞内のタンパク質をコードする遺伝子から誘導することができる。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターも、その宿主もＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含有するように処理されているなら、用いることができる。プロモーターは、上流又は下流にアクチベーター及びエンハンサー配列を含有してもよい。所望により、オペレーター配列もプロモーターの下流に含まれてもよい。しかしながら、プロモーターはいずれかの天然に存在するプロモーターと同一でなくてもよい。それは、種々のプロモーターの部分から構成されていても、部分的に又は完全に合成されたものであってもよい。プロモーターのデザインの手引きは、HarleyとReynolds，Nucleic Acids Res.，15，2343-61（1987）のものの如きプロモーター構造の研究により与えられる。また、転写開始に関するプロモーターの位置を最適化することができる。Robertsら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，76，760-4（1979）を参照のこと。本発明で用いるのに適する発現制御配列は周知である。それらには、大腸菌ｌａｃ系、大腸菌ｔｒｐ系、ＴＡＣ系及びＴＲＣ系のもの；バクテリオファージλ の主要なオペレーター及びプロモーター領域；糸状一本鎖ＤＮＡファージの制御領域；他の細菌の発現制御配列；サッカロミセス・セレビシエＴＰＩ、ＡＤＨ、ＰＧＫ及びα因子をコードする遺伝子から誘導されるプロモーター：アスペルギルス・オリザエ（oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニガーグリコアミラーゼ、中性α−アミラーゼ及び酸安定α−アミラーゼをコードする遺伝子から誘導されるプロモーター；リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei ）アスパラギン酸プロテイナーゼ及びリパーゼをコードする遺伝子から誘導されるプロモーター；マウス乳腺癌プロモーター；ＳＶ４０プロモーター；アクチンプロモーター;及び、原核細胞、真核細胞、それらのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、又はそれらの組み合わせが含まれる。このベクターは自己複製ベクターであっても組込みベクターであってもよい。このベクターが自己複製ベクターである場合、それは、宿主細胞内でそれが複製するのを可能にする１又は２以上の複製系を含有しなければならない。特に、宿主が酵母である場合、このベクターは酵母２ｕ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複製起点を含有すべきである。このベクターが自己複製ベクターである場合、それは好ましくは高レベルの発現が得られるように高コピー数プラスミドである。ここで用いる場合“高コピー数プラスミド”とは、細胞当たり約１００コピー又はそれを越えて存在するものである。多くの適する高コピー数プラスミドが公知であり、ｐＵＣの如き細菌性プラスミド及びｐＣの如き酵母プラスミドが含まれる。一方、本突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡの宿主細胞染色体内への組込みが可能な組込みベクターを用いてもよい。宿主細胞内でのコーディング配列のコピー数は自己複製ベクターを用いる場合よりも低いであろうが、それらの染色体内に組込まれた配列を有する形質転換体は一般に至極安定である。このベクターは、更に、そのベクター内にＤＮＡ配列を挿入するための１又は２以上の制限酵素部位を含むべきであり、好ましくは、そのベクターが宿主細胞内に存在する場合に表れる選択可能な又は同定可能な表現型特性をコードするＤＮＡ配列（選択マーカー）を含有する。適する選択マーカーは当該技術分野で公知である。本発明で用いるのに適するベクターは周知である。それらには、レトロウィルスベクター、ワクシニアベクター、ｐＵＣ（ｐＵＣ８及びｐＵＣ４Ｋの如きもの）、ｐＢＲ（ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２８の如きもの）、ｐＴＺ（ｐＴＺ１８Ｒの如きもの）、ｐＵＲ（ｐＵＲ２８８の如きもの）、ファージλ、ＹＥｐ（ＹＥｐ２４の如き）プラスミド、及びこれらベクターの誘導体が含まれる。シグナル又はシグナルリーダー配列をコードするＤＮＡは、本突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡの上流に位置してもよい。シグナル又はシグナルリーダー配列は、タンパク質のアミノ末端におけるアミノ酸配列であって、それが結合しているそのタンパク質がそれを産生する細胞から分泌されるのを可能にするアミノ酸配列である。適するシグナル又はシグナルリーダー配列は周知であり、ＣＲＰプレ配列（発明の背景の節を参照のこと）、酵母α−因子シグナル配列（米国特許第４,５４６,０８２号及び４,８７０,００８号を参照のこと）、酵母ＢＡＲ１分泌系（米国特許第４,６１３,５７２号を参照のこと）、クリーベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）シグナルリーダー配列、及び酵母インベルターゼシグナル配列（Stetlerら，Bio/Technology，7:55-60（1989）、Smit hら，Science，299:1219-1229（1985））が含まれる。分泌されたタンパク質は、分泌の不存在化で得ることができるものよりも精製するのがより容易であることが多いが、発現レベルはずっと低い。本発明の突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ及び他の配列の化学合成は、幾つかの理由で好ましい。第１に、化学合成は、ＤＮＡ配列を発現することになる宿主により好まれるコドンを用いて本突然変異型タンパク質の発現を最高にすることができるので望ましい。向上した発現を得るためには必ずしも全てのコドンを変異するに及ばないが、５０％より多く、最も好ましくは少なくとも約８０％のコドンが宿主好みのコドンに変換されるべきである。大腸菌、酵母、及び他の原核細胞及び真核細胞を含む多くの宿主細胞のコドンの好みは知られている。Maximizing Gene Expression，pp.225-85（Reznikoff & Gold,編，1986）を参照のこと。他の宿主細胞のコドンの好みは、当該技術分野で公知の方法により推定することができる。特に、次の方法が広く用いられる。まず、意図する宿主細胞内で高度に発現される約１２のタンパク質をコードする遺伝子内のコドン利用度を確認する。次いで、その宿主細胞内で低レベルでしか発現されない約１２のタンパク質をコードする遺伝子内のコドン利用度を確認する。これら結果を吟味することにより、頻繁に用いられるコドンと稀にしか用いられないコドンを同定する。高度に発現される遺伝子内で最も頻繁に用いられるコドンが好ましい。高度に発現される遺伝子内で稀にしか用いられないか又は低レベルでしか発現されない遺伝子内で用いられるコドンは、好ましくは用いられない。化学的に合成されたＤＮＡを用いても、その配列内の都合のよい点で特有の又は殆ど特有の制限部位を与える目的でコドンを選択するのが可能である。これら部位の使用は、合成コーディング配列を構築する便利な手段を提供し、カセット突然変異誘発により配列の迅速な変換が容易になる。加えて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物により形成される第二構造が転写又は翻訳を妨害する場合は、コドン選択を変更することによってそれらを排除することができる。化学合成で、本突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ配列で最適化された発現制御配列を用いるのも可能になる。このようにして、本突然変異型タンパク質の最高の発現が得られる。例えば、上述のように、プロモーターを化学的に合成して転写開始に関してそれらの位置を最適化することができる。同様に、最適化したリボソーム結合部位及びスペーサーを化学的に合成して、原核細胞内で発現されるべきコーディング配列と共に用いることができる。原核性ｍＲＮＡでは、リボソームがこのメッセンジャーに結合する部位は３〜９プリンの配列を含む。この一続きのコンセンサス配列は5’-AGGAGG-3’であり、それはしばしばシャイン・ダルガーノ配列といわれている。リボソーム結合部位のこの配列を修飾して発現を変化させてもよい。HuiとDeBoer，Proc．Natl．A cad．Sci．USA，84，4762-66（1987）を参照のこと。Schererら，Nucleic Acids Res.，8，3895-3907（1987）の研究の如きリボソーム結合部位の比較研究が、適する塩基変換についての手引きを提供することができる。リボソーム結合部位は開始コドン（ＡＵＧ）の上流３〜１２塩基にある。リボソーム結合部位と翻訳開始コドンの間の正確な距離及びこの“スペーサー”領域の塩基配列は翻訳の効率に影響するものであって、経験的に最適化することができる。原核細胞内での本発明の突然変異型タンパク質の最高の発現を達成するには、原核宿主細胞内で効率的な翻訳を与えるリボソーム結合部位及びスペーサーが与えられるべきである。大腸菌内での最適な翻訳に好ましいリボソーム結合部位及びスペーサー配列は、SpringerとSligar，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84 ，8961-65（1987）及びvon Bodmanら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83，9443- 47（1986）に記載されている。真核細胞の翻訳開始配列についてのコンサンセス配列は、C(A/G)CCAUGGであるとKozak（Cell，44，283-292（1986））により定義されている。この配列からの逸脱、特に−３位（Ａ又はＧ）における逸脱は、特定のｍＲＮＡの翻訳に大きな影響を有している。殆ど全ての高度発現哺乳動物遺伝子はこの配列を使用している。一方、高度発現酵母ｍＲＮＡは、この配列とは異なって代わりに配列（A/ Y)A(A/U)AAUGUCUを使用している（CiganとDonahue，Gene，59，1-18（1987））。特定の宿主細胞内で用いるのに最適な配列を決めるためにこれら配列を経験的に変化させてもよい。本発明による突然変異型タンパク質を発現することができる宿主細胞は、その突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターでその細胞を形質転換することにより調製することができる。また、突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換してもよい。細胞をベクター又はＤＮＡで形質転換する方法は当該技術分野で周知である。入手可能で周知の多くの宿主細胞のうちのいずれもこの発明の実施に用いることができる。特定の宿主の選択は、当該技術分野で認識されている幾つかの要因に依存する。これらには、例えば、選んだ発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ配列によりコードされる本突然変異型タンパク質のそれに対する毒性、形質転換の比率、発現特性、生物安全性及びコストが含まれる。これら要因のバランスは、必ずしも全ての宿主が特定の突然変異型タンパク質の発現に等しく有効であるとは限らないという知見と突き合わせなければならない。これら一般的な手引きの範囲内で、有用な宿主には、細菌（大腸菌種の如きもの）、酵母（サッカロミセス種の如きもの）及び他の真菌、昆虫、植物、動物（ヒトを含む）、又は当該技術分野で公知の他の宿主が含まれる。本発明の突然変異型タンパク質は、該突然変異型タンパク質の発現ができる条件下で、選んだ宿主細胞を培養することによって産生させることができる。培養の方法及び培地は当該技術分野で周知であるが、ずっと高い収率が得られるので（最小培地よりはむしろ）富化培地を用いるのが好ましい。実施例以下の実施例で用いる制限酵素は、種々の市販の供給源から得てそのメーカーの使用説明書に従って又は標準的緩衝液系（Maniatisら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（1982））を利用することによって使用した。実施例１：Cys36→Ala，Cys97→Ala突然変異型Ｃ−反応性タンパク質サブユニットの調製この実施例は、位置３６及び９７（Wooら，J．Biol．Chem.，260，13384-1338 8（1985）の番号割当方式を用いた）における２つのシステイン残基をアラニン残基と置換し、そしてメチオニンをそのアミノ末端に付加した突然変異型ヒトＣＲＰサブユニットをコードする組換えＤＮＡ分子の調製を記載するものである。この実施例は、発現制御配列に発効的に連結した組換えＤＮＡ分子を含有するベクターの調製及び大腸菌内での突然変異型ＣＲＰサブユニットの発現も記載するものである。Ａ．ポリメラーゼ連鎖反応法を用いるＣＲＰコーディング配列中のシステイン３６及びシステイン９７のコドンの置換成熟ヒトＣＲＰサブユニットのコーディング配列中のシステイン３６及びシステイン９７のコドンのアラニンのコドンとの置換をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saikiら，Science，239，487-491（1988））に基づくHortonら，BioTechniq ues，8，528-535（1990）の方法を用いて行った。２つの独立した変換が望ましかったので、図１Ａに示す通り合計で５のＰＣＲ反応を組み入れられるようにこのプロセスに手を加えた。表１は、このＰＣＲ反応においてプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。イタリックを使用した塩基は制限酵素認識部位を示す。太字の塩基は突然変異コドン及びイニシエーターＡＴＧコドンを示す。下線を付した塩基はＣＲＰｃＤＮＡ配列に相補的である。図１Ａに示すように、これら５反応は：（1）ＰＣＲ産物Ａを生成するためのプレＣＲＰをコードするｃＤＮＡクローンとプライマー１及び２との反応；（2 ）ＰＣＲ産物Ｂを生成するためのプレＣＲＰをコードするｃＤＮＡとプライマー３及び４との反応；（3）ＰＣＲ産物Ｃを生成するためのプレＣＲＰをコードするｃＤＮＡとプライマー５及び６との反応；（4）ＰＣＲ産物Ｄ１を生成するためのプライマー１と４の存在下での産物ＡとＢとの反応；及び（5）最終産物Ｄ２を生成するためのプライマー１と６の存在下での産物Ｄ１とＣとの反応であった。Ｄ２は、Ｎ−末端にメチオニンが付加してシステイン３６及びシステイン９７がアラニンにより置換されていることを除いては、ヒトＣＲＰサブユニットの成熟配列（プレ配列は排除されている）をコードする。これらＰＣＲ反応の出発原料として用いたヒトプレＣＲＰをコードするＤＮＡは、ｐＣＲＰ５をＥｃｏＲＩで消化して直鎖状（非環状）ＤＮＡを生成させることにより得たものである。プラスミドｐＣＲＰ５は、ミズーリ州セントルイスの Washington University School of MedicineのBruce DowtonとHarvey Colten両博士から得た。ｐＣＲＰ５は、Tucciら，J．Immunol.，131，2416-19（1983）に記載された通りに、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離したものである。ｐＣＲＰ５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びそれによりコードされるプレＣＲＰのアミノ酸配列は、Wooら，J．Biol．Chem，260，13384-13388（1985）に示されている。これらＰＣＲ反応は、ＶＥＮＴポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて行って塩基の誤った取り込みによる不要な突然変異を最小限にし、そしてこのＰＣＲ反応を２０サイクルを用いて行った。各サイクルは、９４℃で１分間；３７℃、４２℃又は６０℃で１分間（アニーリング温度はプライマーの配列に依存する）；及び７４℃で３分間からなるものであった。この増幅工程に続いて、この反応体を更に７４℃で５分間インキュベートして二本鎖ＤＮＡの合成を完了させた。各産物をHortonらの前記文献に記載された通りにアガロースゲル電気泳動により精製した。鋳型が２つの重複配列（図１ＡのＰＣＲＤ１及びＰＣＲＤ２）からなるＰＣＲ反応については、反応体をプライマーなしで４サイクルインキュベートして、正常な増幅を行う前に完全長鋳型の形成ができるようにした。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＨｈａＩ及びＮｒｕＩ（表１を参照のこと）で消化して、それら産物が所期の突然変異を組み込んだことを確認した。Ｂ．突然変異型ＣＲＰサブユニットの過剰発現用プラスミドの構築最終ＰＣＲ産物Ｄ２をCentricon 30装置（Amicon，Beverly，MA）での濾過により濃縮してから、Denneyら，Amplifications，4，25-26（1990）に記載された通りに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia，Piscataway，NJ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs，Inc.）で処理した。得られた物質をＮｄｅＩとＢｇｌIIで消化して突然変異型ＣＲＰコーディング配列を放出させ、そしてその放出したコーディング配列を、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した発現ベクターｐＥＴＶに連結し、子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Promega，Mad ison，WI）で処理した。この連結混合液を用いて大腸菌ＤＨ５α（Gibco BRL L ife Technologies，Inc.）を形質転換し、そして形質転換体をBirnboimら，Nucl eic Acids Res.，7，1513-1523（1979）に記載された通りに行ったミニプレップス（minipreps）によりスクリーニングして間違いのないプラスミドｐＩＴ４を同定した。ｐＩＴ４の制限酵素地図を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、突然変異型ＣＲＰコーディング配列は、Ｔ７プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＥＴＶはｐＥＴ３ａの誘導体である。ｐＥＴ３ａの調製はRosenb ergら，Gene，56，125-135（1987）に記載されている。プラスミドｐＥＴ３ａは、ニューヨーク州UptonのBrookhaven National LaboratoryのW.Studier博士から得た。プラスミドｐＥＴ３ａは、２つのＮｈｅＩ制限酵素部位を有する。１つは、突然変異型ＣＲＰコーディング配列を挿入することが望まれるＴ７遺伝子１０翻訳開始部位に位置している。第２ＮｈｅＩ部位は、ＥｃｏＲＶ部位により両端を結び合わされた１９０−ｂｐ断片内に位置している。この第２ＮｈｅＩ部位はＥｃｏＲＶでの消化により取り除かれ、そのプラスミドが再環状化してｐＥＴＶが生成した。ｐＥＴＶの発現系とｐＩＴ４中の突然変異型ＣＲＰサブユニットのコーディング領域の間の連結部の予測配列は、次のようにＤＮＡ配列分析により確認した。プラスミドｐＩＴ４をＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化し、関連断片をＭ１３ｍｐ１８ＲＦ内にサブクローン化した（Yanisch-Perronら，Gene，33，103-119（1985））。Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦを保持する培養物から一本鎖ＤＮＡを得て、Applied Biosystems Model 370A Automated DNA Sequencer を用いてSangerら，J．Mol．Biol.，94，441-558（1975）に記載されている通りに配列決定した。Ｃ．突然変異型ＣＲＰサブユニットの発現及び精製プラスミドｐＩＴ４を用いて、ｌａｃＵＶ５オペレーター及びプロモーターの発現制御下でファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（調製はStudierら，J．Mol．Biol.，189，113-130（1986）に記載されている）を形質転換した。コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ウィスコンシン州マジソンのNovogenから得たものである。形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（Miller，Experiments In Molecular Genet ics（1972））上で選択した。形質転換細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＭ９ＺＢ培地（Stud ierら，J．Mol．Biol.，189，113-130（1986））中で３７℃で小スケール実験のために生育させた。１０リッター培養液をNew Brunswick Microgen SF-116発酵器内で２ＹＴ培地（Miller，Experiments In Molecular Genetics（1972））＋０.４％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリン中、３７℃で分当たり１０リッターの速度の圧縮空気を用いてエアレーションしながら生育させた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの合成、引いては突然変異型ＣＲＰサブユニットの合成を細胞密度がＯＤ₆₀₀＝４に達したときに１ｍＭ（最終濃度）イソプロピル− β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ：Boehringer Mannheim）で誘発した。培養液を等容量の氷と素早く混合し、Durapore０.５μＭ膜を装着した Millipore Pellicon装置を用いて濾過することにより細胞を濃縮し、そしてBeck mann JA10ローター中で１０,０００ｒｐｍで細胞を２０分間遠心分離することによって、誘発後３時間で細胞を採取した。採取した細胞を５ｍＭＥＤＴＡ（５００ｍｌ中４０ｇ）を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）中に懸濁して、１０,０００ｐｓｉでManton- Gaul inホモジナイザに３回通すことによって崩壊させた。その抽出物をBeckmann JA1 0ローター中で８,０００ｒｐｍで２０分間２℃で遠心分離した。不溶性突然変異型ＣＲＰサブユニットを含有するペレットを０.５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００（Bio-Rad）を含有する２０ｍｌの同じ緩衝液で２回洗浄した後、JA18ローター中で９,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してこの可溶性物質を除去した。約５〜６ｍｇの最終ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５〜８.０）中の８Ｍ超純粋尿素（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）５０〜７０ｍｌ中に再懸濁して、混合しながら４℃で一晩インキュベートして突然変異型ＣＲＰサブユニットを可溶化した（以下、この物質を“突然変異型ｒＣＲＰ封入体調製物”という）。次に、この物質を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５〜８.０）で６Ｍ尿素の最終濃度まで希釈してから、４０ｃｃのQ-Sepharose Fast Flow^R アニオン交換樹脂（Pharmacia）を含有するカラム上に分当たり６ｍｌで充填した。結合した物質を６Ｍ尿素及び１ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５〜８.０）を用いて一次ＮａＣｌ勾配で溶離した。BioPilot^R自動クロマトグラフィーシステム（Pharmacia）を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定し、溶離プロフィールを得た。比較のため、天然ＣＲＰ、ｍＣＲＰ及びＣＲＰｃＤＮＡクローンの一次翻訳産物（以下“野生型ｒＣＲＰ”という）もQ-Sepharose Fast Flow^Rでクロマトグラフィーに付した。天然ＣＲＰ、ｍＣＲＰ及び野生型ｒＣＲＰは、次のようにして調製しクロマトグラフィーに付した。天然ＣＲＰは、Volanakisら［J．Immunol.，113，9-17（1978）］に記載されている通りにホスホリルコリン置換BioGel^RＡ0.5m（Bio-Rad Laboratoriesから得られるアガロースを基剤とする樹脂）を用いるカルシウム依存アフィニティクロマトグラフィーにより胸膜液又は腹水から単離して、Potempaら［Mol.Immunol .，24，531-41（1987）］により修飾した。簡単に説明すると、胸膜液又は腹水をホスホリルコリン置換カラムに通してＣＲＰを結合させた。次いで、このカラムを２ｍＭＣａＣｌ₂を含有する７５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝生理食塩水（ｐＨ７.２）で２８０ｎｍの吸光度が０.０２未満になるまで徹底的に洗浄した。ＣＲＰを７５ｍＭトリス，７.５mＭクエン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７.２）で溶離した。この高濃度のトリスは、アフィニティ精製ＣＲＰ調製物をしばしば汚染する非特定的吸着タンパク質を有意に減少させる。ＣＲＰ含有画分をプールし、脱イオン水で３〜５倍に希釈し、Q-Sepharose Fast Flow^Rイオン交換樹脂に吸着させ、次いで１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の０〜１ＭＮａＣｌの一次塩勾配で溶離した。ＣＲＰ含有画分をプールし、（適当量の１Ｍ溶液を添加することにより）２〜５ｍＭＣａＣｌ₂まで再カルシウム化し、そして未置換BioGe l^RＡ0.5mカラムに適用して残留血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）を除去した。次いで、１０〜２０ｐｓｉ窒素下での超濾過（Amicon;ＰＭ３０膜）を用いてこのＣＲＰを１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。１.９８のＣＲＰ吸光率（ｍｇ／ｍｌ）を用いて濃度を決めた。次に、この濃縮したＣＲＰを２ｍＭＣａＣｌ₂を含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝生理食塩水（ｐＨ７.２）に対して徹底的に透析した。この調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動上で単一のＭｒ２３,０００バンドをもたらし、ＳＡＰ、ＩｇＧ及び抗原性を試験した他の全てのタンパク質を含まず９９％を越えるものであった。 Q-Sepharose Fast Flow^Rカラム用に、５ｍｇの精製天然ＣＲＰを含有する５ｍｌの最終濃縮ＣＲＰ溶液を約３０ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）で希釈して、得られた溶液をQ-Sepharose Fast Flowカラム上に分当たり６ｍｌで充填した。結合した物質を１ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）を用いて一次ＮａＣｌ勾配で溶離した。BioPilot^R自動クロマトグラフィーシステムを用いてＡ₂₈₀を測定した。ｍＣＲＰを作るため、上記の通りに調製した精製天然ＣＲＰを１ｍｇ／ｍｌで８Ｍ超純粋尿素中、１０ｍＭＥＤＴＡの存在下で３７℃で１時間インキュベートした。Q-Sepharose Fast Flow^Rカラムについては、６ｍｇのｍＣＲＰを含有する６ｍｌのこの物質を６Ｍ超純粋尿素を含有する約３０ｍｌの１０ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ７.５〜８.０）で希釈して、得られた溶液をQ-Sepharose Fast F low^Rカラム上に分当たり６ｍｌで充填した。結合した物質を６Ｍ尿素と１ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５〜８.０）を用いて一次ＮａＣｌ勾配で溶離した。BioPilot^R自動クロマトグラフィーシステムを用いてＡ₂₈₀ を測定した。野生型ｒＣＲＰは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内でのｐＩＴ３の発現により調製した。プラスミドｐＩＴ３は、ｐＣＲＰ５をＭｓｃＩ及びＢｇｌIIで開裂させることによって調製した（図２Ａを参照のこと）。次に、ｐＥＴＶをＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで開裂して、それら消化ｐＥＴＶ及びｐＣＲＰ５を混合して連結した（図２Ａを参照のこと）。この連結混合液を用いて大腸菌株ＤＨ５αを形質転換して、所期の発現プラスミドｐＩＴ３を保持するコロニーを同定して、全てｐＩＴ４について上記した通りに行った。プラスミドｐＩＴ３は、Ｎ−末端においてペプチドMet Ala Serを有することを除いては、非突然変異型ヒトＣＲＰサブユニットの配列を有するＣＲＰサブユニットをコードする（図２Ｂを参照のこと）。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＩＴ３で形質転換してｐＩＴ４について上記した通りに培養した。これら培養物を誘発し、細胞を採取し、そして野生型ｒＣＲＰを含有するペレットを得て、全て上記した通りに行った。約７．４ｍｇのペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５〜８.０）中の８Ｍ尿素５０〜７０ｍｌ中に再懸濁して、混合しながら４℃で一晩インキュベートした（以下、この物質を“野生型rＣＲＰ封入体調製物”という）。この可溶化封入体調製物を濾紙に通して非可溶化デブリを除去した。次に、この物質を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜８．０）で６Ｍ超純粋尿素の最終濃度まで希釈してから、Q-Se pharose Fast Flow^Rカラム上に分当たり６ｍｌで充填した。結合した物質を６Ｍ尿素と１ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を用いて一次ＮａＣｌ勾配で溶離した。BioPilot^Rシステムを用いてＡ_280nmを測定した。天然ＣＲＰ、ｍＣＲＰ、野生型ｒＣＲＰ及び突然変異型ＣＲＰサブユニットについてBioPilot^Rシステムにより生じた溶離プロフィールを図３Ａ−Ｄに示す。このBioPilot^Rシステムは、それぞれの場合に用いた塩勾配が直接比較できるようにプログラムされたものである。図３Ａに示すように、天然ＣＲＰは１本だけの有意な溶離ピークを示した。それは４７．７６分の溶離時間を有した。このピークを２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂（ｐＨ７.４）に対して透析してから、次の節に記載した試験をするためにAmicon濾過を用いて約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。この濃縮ピーク物質を以下“天然ＣＲＰ_Q”という。図３Ｂは、ｍＣＲＰについての溶離プロフィールを示す。その主ピークは、３６．１８分の溶離時間を有する。このピークを低イオン強度緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４））に対して透析してから、Amicon濾過を用いて濃縮し、そして次の節に記載した通りに試験をした。この濃縮ピーク物質を以下“ｍＣＲＰ_Q”という。次の節に記載した試験をして、このピーク中の物質がｍＣＲＰであることが証明された。このことから、ｍＣＲＰは天然ＣＲＰよりもずっと早くQ-Sepharose^Rから溶離する（約１１．５分早い）。図３Ｃは、野生型ｒＣＲＰについての溶離プロフィールを示す。その主ピークは３４．５５分で溶離し、この溶離時間はｍＣＲＰのものと殆ど同一で天然ＣＲＰの溶離時間とは非常に離れている。この主ピーク中のタンパク質を低イオン強度緩衝液に対して透析してから、次の節に記載した通りに更に試験するためにAm icon濾過を用いて濃縮した。この濃縮ピーク物質を以下“野生型ｒＣＲＰ_Q”という。最後に、図３Ｄは、突然変異型ＣＲＰサブユニットについての溶離プロフィールを示す。その主ピークは３４.５５分で溶離し、この溶離時間は野生型ｒＣＲＰ及びｍＣＲＰのものと本質的に同一で、天然ＣＲＰのものとは離れている。この主ピークを低イオン強度緩衝液に対して透析してから、次の節に記載した通りに更に試験するためにAmicon濾過を用いて濃縮した。この濃縮ピーク物質を以下 “突然変異型ｒＣＲＰ_Q”という。タンパク質をＮａＣｌ段階勾配（０.１〜１.０ＭＮａＣｌ）でQ-Sepharose Fast Flow^Rカラムから溶離してもよい。組換え突然変異型ＣＲＰタンパク質をカラムに流して段階勾配で溶離すると、そのＡ₂₈₀読み取り値から、殆どのタンパク質が０.１〜０.２ＭＮａＣｌでカラムから溶離したことが分かった。天然ＣＲＰをカラムに流して段階勾配で溶離すると、そのＡ₂₈₀読み取り値から、殆どのタンパク質が０.４ＭＮａＣｌで溶離したことが分かった。Ｄ． Q-Sepharose Fast Flow^Rカラムから溶離した画分の特性決定 Q-Sepharose Fast Flow カラムからのピークを、ドットブロット、ウェスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡにより分析した。野生型ｒＣＲＰ及び突然変異型ｒＣＲＰ封入体調製物もときどき試験した。天然ＣＲＰ及びｍＣＲＰをときどきコントロールとして用いた。これら物質の全ての調製は、先の節に記載されている。１．ドットブロット検査 Zhang，J．Immunol.，138，575（1987）の操作に手を加えた操作に従って、ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell，Keene,NH）をＴＢＳ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０.１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４））中に予め３０分間浸して、過剰の緩衝液を濾紙で除去した。次いで、この膜をBio-Dot^TM微量濾過装置（Bio-R ad）の中に嵌めた。５μｇ／ｍｌの種々の試験タンパク質のアリコート（５０μ ｌ）をこの膜上に付点し、４℃で一晩インキュベートし、次いで減圧濾過してウェルから全ての液体を除去した。ブロッキング溶液（ＴＢＳ中１％ＢＳＡを１００μｌ）をそれらウェルに添加して室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートし、そしてその膜を通して減圧濾過した。ウェルを１％ＢＳＡと０．０５％ツィーン２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ洗浄用緩衝液）で３回洗浄した。マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）３Ｈ１２及び抗血清ＬＰ３−ＨＲＰを添加してＲＴで３０分間インキュベートした後に洗浄した。モノクローナル抗体３Ｈ１２は標識しないで用い、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したウサギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂（Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL）を添加することにより像を出現させ、ＲＴで３０分間インキュベートし、指示（Bio- Rad）通りに調製したメタノール及びＨ₂Ｏ₂を含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌ中のペルオキシダーゼ基質４−クロロ−２−ナフトール（Bio-Rad）を添加し、そしてＲＴで３０分間インキュベートして発色させた。ＬＰ３−ＨＲＰをホースラディッシュペルオキシダーゼで標識し、４− クロロ−２−ナフトールを添加することによりそれらブロットの像を出現させた後、発色のためにＲＴで３０分間インキュベートした。モノクローナル抗体３Ｈ１２は、ｍＣＲＰ上で見出されるが天然ＣＲＰ上で見出されない抗原決定基に対して特異性のＩｇＧ抗体である。その調製及び特性は、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／００８７２及びYingら，J．Immunol.，143， 221-228（1989）に記載されている。抗血清ＬＰ３は、ヤギを完全フロイントアジュバント中でｍＣＲＰで免疫感作してから、その採取した抗血清をｍＣＲＰで置き換えられた臭化シアン活性化BioGel^Rのカラムに通すことにより親和精製することによって調製される抗血清である。得られた親和精製抗ネオＣＲＰ抗血清ＬＰ３は、ｍＣＲＰにより発現されるが天然ＣＲＰによっては発現されないネオＣＲＰ抗原性に対して単一特異性であった。ＬＰ３は、Potempaら，Molec．Immu nol.，24，531-541（1987）に記載された通りにホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した。ドットブロットから、ｍＣＲＰ、ｍＣＲＰ_Q、野生型ｒＣＲＰ_Q及び突然変異型ｒＣＲＰ_Qはモノクローナル抗体３Ｈ１２及び単一特異性抗ネオＣＲＰＬＰ３ −ＨＲＰと反応したことが分かり、これら全ての物質が、ｍＣＲＰ上で見出されるが天然ＣＲＰ上では見出されない抗原決定基を発現することを示している。天然ＣＲＰ及び天然ＣＲＰ_Qは予想通り抗体３Ｈ１２及びＬＰ３−ＨＲＰと反応しなかった。２．ウェスタンブロットこれらピークをウェスタンブロットによっても分析した。ウェスタンブロットを行うために、５〜１０μｌのピーク濃縮物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で還元及び非還元条件下で電気泳動した。電気泳動後、JKA Biotech（デンマーク）Semidryエレクトロブロッターを用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。残りの操作は、３種のマウスｍＡｂ（３Ｈ１２、２Ｃ１０及び８Ｃ１０）を用いたことを除いて、ドットブロットについて上記したのと同じであった。３Ｈ１２について先の節で記載した通りに発色させた。モノクローナル抗体３Ｈ１２は上に記載している。モノクローナル抗体８Ｃ１０はｍＣＲＰ上にしか見出されない決定基と反応するのに反して、２Ｃ１０は天然ＣＲＰ上とｍＣＲＰ上の両方で見出される決定基と反応する。２Ｃ１０及び８Ｃ１０の調製及び特性は、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／００８７２及びYing ら，J．Immunol.，143，221-228（1989）に記載されている。このウェスタンブロットの結果から、ｍＣＲＰ、ｍＣＲＰ_Q、野生型ｒＣＲＰ_Q 及び突然変異型ｒＣＲＰ_Qは３種全てのｍＡｂと反応することが分かった。これは、これら全ての物質がｍＣＲＰ上で見出される抗原決定基を発現することを示している。天然ＣＲＰ及び天然ＣＲＰ_QはｍＡｂ２Ｃ１０と反応したが、ｍＡｂ３Ｈ１２及び８Ｃ１０とは反応しなかった。これから、これら物質は天然ＣＲＰでありそれら抗体は予想通り反応したことが確認された。このウェスタンブロットの結果から、突然変異型ｒＣＲＰ_Q中に存在する主要物質（突然変異型ＣＲＰサブユニットをQ-Sepharose Fast Flow^Rでクロマトグラフィーに付したときに得られる主ピーク）はフリーの単量体サブユニットであることも分かった。ｍＣＲＰ決定基に特異性の抗体と反応性の幾つかの多量体及び断片が存在するが、かかる不要なバンドの数は野生型ｒＣＲＰ_Qで認められるよりもずっと少なくなった。これは、ＣＲＰサブユニット中のシステイン残基を置換することによって、得られる組換え産物がより効率的に処理されてより純粋でより明瞭な産物を与えることを示している。３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥこれらピーク濃縮物をPhastGel^R ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Pharmacia）で流した。８〜２５％勾配アクリルアミドの勾配を用いた。電気泳動が完了した後、ゲルをクマシーブルーで染色した。その結果を図４に示す。図４において、レーン１はｍＣＲＰを含有する。約２７,０００分子量の単一バンドが得られた。レーン２は、突然変異型ｒＣＲＰ封入体調製物を含有する。単一ｍＣＲＰバンドと大体同じ位置の１本（約２７,０００のＭｒ）を含む２本の主バンドがあることに注目のこと。このバンドはｍＣＲＰ決定基に対して特異性の抗体と抗原的に反応性であることが、ウェスタンブロット分析により証明された。レーン３は、突然変異型ｒＣＲＰ_Q（Q-Sepharose Fast Flow^Rでクロマトグラフィーに付された突然変異型ｒＣＲＰ封入体調製物）を含有する。約２７,０００の分子量、つまり所期のフリーの突然変異型ＣＲＰサブユニットの分子量を有するただ１つの主バンドが得られたことに注目のこと。見ての通り、突然変異型ｒＣＲＰ封入体調製物（レーン２）に比べてバンドがずっと少なく、残りの汚染物質、特に１８，０００未満のMｒを有する１つの主汚染物質の量は相当減少している。かくして、突然変異型ＣＲＰサブユニットの純度は、この一工程Q-Seph aroseクロマトグラフィー操作により大きく向上した。レーン４は、野生型ｒＣＲＰ封入体調製物を含有する。見ての通り、多数のタンパク質バンドが存在する。このレーンの約８０％下方のバンドは、フリーの無傷野生型ｒＣＲＰサブユニット（約２７,０００のＭｒ）である。主バンドがなく、このレーンの下部のバンドの方が強度が大きいことに注目のこと。レーン５は、野生型ｒＣＲＰ_Q（Q-Sepharose Fast Flow^Rでクロマトグラフィーに付された野生型ｒＣＲＰ封入体調製物）を含有する。見ての通り、クロマトグラフィーに付された封入体調製物（レーン４）に比較して多数のバンドが依然として存在する。実際、その正体が不明である幾つかの新たなバンドが（約４５ ,０００及び１４,０００の分子量のところに）現れており、幾つかのバンドの強度は増加している。かくして、Q-Sepharose Fast Flow^Rカラムを用いても野生型ｒＣＲＰの精製に何の改善もなかった。レーンの約８０％下方のバンドは、フリーのサブユニットである。このバンド及びその他の多くのバンドは、ウェスタンブロット分析によりｍＣＲＰ決定基に対して特異性の抗体と反応性であった。このことは、Q-Sepharose Fast Flow^Rカラムでの野生型ｒＣＲＰ調製物のクロマトグラフィー後に回収された殆どのタンパク質は野生型ｒＣＲＰであるが、多量体化及び断片化の問題があることを示している。レーン６は、Prestained BioGel^R分子量スタンダード（BioRad）を含有する。最上部から最下部にかけて、これらバンドは、凡その分子量１０６，０００、８０，０００、４９，５００、３２，５００、２７，５００及び１８，５００のバンドである。４．ＥＬＩＳＡ最後に、ＥＬＩＳＡを行ってQ-Sepharose Fast Flow^Rカラムから溶離したピーク中の物質への天然ＣＲＰ及びｍＣＲＰに特異性の抗体の結合を検出した。直接結合ＥＬＩＳＡ（direct binding ELISA）をｍＣＲＰ及び組換えＣＲＰ調製物について用いた。天然ＣＲＰ調製物については、リガンド捕捉ＥＬＩＳＡ（ligand capture ELISA）を用いた。直接ＥＬＩＳＡでは、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中の各試験タンパク質（５μｇ／ｍｌ）１００μｌをNuncポリスチレンプレート（Scie ntific Supply，Shiller Park，IL）のウェルに入れて３７℃で２時間又は４℃ で一晩インキュベートした。これらウェルを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＢＳ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７. ４））（ＴＢＳ−Ａ）で３７℃で６０〜1２０分間ブロック処理した。これらウェルを０．０５％ツィーン２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ洗浄用緩衝液）で洗浄した。抗体をＴＢＳ−Ａで順次希釈し、１００μｌアリコートをウェルに添加して３７℃で６０分間インキュベートした後、洗浄した。ＴＢＳ−Ａ中のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotech）を３７℃で６０分間でこれらウェルに添加した。洗浄後、ウェル当たり１００μｌのＡＢＴＳ基質（2, 2’−アジノビス（３−エチルベンジルチアゾリン−６−スルホン酸，Sigma Che mical Co.）を添加してＲＴで約５〜１５分間インキュベートした。Titertek^R マルチスキャンプレートリーダー（フィンランド，ヘルシンキのFlow Laborator ies）上で４１４ｎｍの吸光度を読み取った。リガンド捕捉ＥＬＩＳＡについては、プレートを重炭酸緩衝液中のＰＣ−ＫＬＨ（５μｇ／ｍl）１００μｌ／ウェルと共に３７℃で２時間又は４℃で一晩インキュベートした。上記の通りに２ｍＭＣａＣｌ₂を含有するＴＢＳ−Ａでウェルをブロック処理した。ブロック後、２ｍＭＣａＣｌ₂を含有するＴＢＳ−Ａ中の天然ＣＲＰ（５μｇ／ｍｌ）１００μｌ／ウェルを添加して３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、全ての緩衝液に２ｍＭＣａＣｌ₂を含めたことを除いては、この検査の残りを上記の通り行った。ＰＣ−ＫＬＨは、ホスホリルコリン（ＰＣ）置換キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。それは、ＫＬＨ（Sigma Chemical Co.）をChesebroとMetzger，Biochemistry，1 1,766（1972）に記載された通りにジアゾ化したｐ−ニトロフェニルホスホリルコリン（Sigma Chemical Co.）と共にインキュベートすることによって調製されたものである。この最後の誘導化で、１×１０^-5ＫＬＨのＭｒ当たり２８〜５２モルＰＣになった。これらＥＬＩＳＡの結果を図５Ａ〜Ｄに示す。図５Ａは、ｍＣＲＰ、野生型ｒＣＲＰ封入体調製物及び天然ＣＲＰのｍＡｂ３Ｈ１２との反応性を示す。予想通り、ｍＡｂ３Ｈ１２はｍＣＲＰと反応したが、天然ＣＲＰとは反応しなかった。また、野生型ｒＣＲＰ封入体調製物も、ｍＣＲＰと同じくそして天然ＣＲＰとは異なり反応した。このことは、ｍＡｂ３Ｈ１２により認識されるｍＣＲＰエピトープ（ＣＲＰサブユニットのカルボキシ末端オクタペプチド）は野生型ｒＣＲＰ上で発現されることを示している。図５Ｂは、ｍＣＲＰ、野生型rＣＲＰ封入体調製物及び天然ＣＲＰのｍＡｂ１Ｄ６との反応性を示す。モノクローナル抗体１Ｄ６は、天然ＣＲＰ上でのみ見出される抗原決定基に対して特異性である。その調製及び特性は、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／００８７２及びYingら，J．Immunol.，143，221-228（1989）に記載されている。予想通り、ｍＡｂ１Ｄ６は、天然ＣＲＰと反応したがｍＣＲＰとは反応しなかった。示すように、野生型ｒＣＲＰ封入体調製物は、ｍＣＲＰと同じくｍＡｂ１Ｄ６と反応しなかった。このことは、ｍＡｂ１Ｄ６により認識される天然ＣＲＰエピトープは野生型ｒＣＲＰ上では発現されないことを示している。図５Ｃは、ｍＣＲＰ、野生型ｒＣＲＰ_Q及び突然変異型ｒＣＲＰ_QのｍＡｂ８Ｃ１０との反応性を示す。モノクローナル抗体８Ｃ１０はｍＣＲＰ上でのみ見出されるエピトープと反応するが、ｍＡｂ３Ｈ１２が反応するのとは異なるｍＣＲＰ上のピトープと反応する。このＥＬＩＳＡについては、各試験タンパク質を、１０００ｎｇのタンパク質がポリスチレンＥＬＩＳＡプレートの最初のウェル上に固定化されるように調節した。次いで、これら試験タンパク質を順次希釈してウェル当たりのタンパク質が次第に減少してゆくように固定化した。ウェル当たりに固定化したタンパク質の量を図５Ｃのグラフの横座標に示す。示されるように、野生型ｒＣＲＰ_Qと突然変異型ｒＣＲＰ_Qの両方が、ｍＣＲＰと同じようにｍＡｂ８Ｃ１０と反応した。このことは、この組換えタンパク質が、ｍＣＲＰ上で見出されるのと類似の８Ｃ１０特異性エピトープを発現することを示唆している。図５Ｄは、ｍＣＲＰ、野生型ｒＣＲＰ_Q及び突然変異型ｒＣＲＰ_QのネオＣＲＰ抗原性に特異性の親和精製抗血清ＬＰ３−ＨＲＰとの反応性を示す。このＥＬＩＳＡ用に、各試験タンパク質を、１０００ｎｇのタンパク質がポリスチレンＥＬＩＳＡプレートの最初のウェル上に固定化されるように調節した。次いで、これら試験タンパク質を順次希釈してウェル当たりのタンパク質が次第に減少してゆくように固定化した。ウェル当たりに固定化したタンパク質の量を図５Ｄのグラフの横軸に示す。示すように、野生型ｒＣＲＰ_Qと突然変異型ｒＣＲＰ_Qの両方が、ｍＣＲＰと同じようにヤギ抗ネオＣＲＰＬＰ３−ＨＲＰと反応した。このことは、この組換えタンパク質がｍＣＲＰに抗原的に非常に似ていることを示唆している。Ｅ．突然変異型ＣＲＰサブユニットの生物活性の評価最後に、Q-Sepharose Fast Flow^Rカラムからのピーク中の物質の凝集ＩｇＧへの結合を検出するためにＥＬＩＳＡを行った。凝集イムノグロブリン及び免疫複合体への結合は、凝集イムノグロブリン及び免疫複合体を液体から除去するのに及び免疫複合体を定量するのにｍＣＲＰを用いれるようにしているｍＣＲＰの重要な活性である。このＥＬＩＳＡは次の通りに行った。１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.５）中の各試験タンパク質（１０ μｇ／ｍｌ）１００μｌをポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに入れて３７℃で２時間又は４℃で一晩インキュベートした。これらウェルをＴＢＳ −Ａで３７℃で６０−１２０分間ブロック処理した。これらウェルをＴＢＳ洗浄用緩衝液で洗浄した。次いで、１００μｌの凝集ヒトＩｇＧ又は単量体ＩｇＧをＴＢＳ−Ａで濃度を変動させて添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。ヒト免疫グロブリン（U.S.P．-Gammer^R，Armour Pharmaceutical Co.）をｐＨ９．０の緩衝液で２０ｍｇ／ｍｌに希釈して６３℃に約３０分間加熱することにより凝集させた。２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．３ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）でのBioGel^RA1.5mを用いる４℃でのモレキュラーシーブクロマトグラフィーにより未凝集単量体ＩｇＧを凝集ＩｇＧから分離した。単量体ＩｇＧ又は凝集ＩｇＧを試験タンパク質被覆ウェル上でインキュベートした後、ウェルをＴＢＳ洗浄用緩衝液で洗浄し、そしてＴＢＳ−Ａ中のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ'）₂（Cappel，Durham，NC）１００μｌをウェルに添加して３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、ウェル当たり１００μｌのＡＢＴＳ基質を添加してＲＴで５〜１５分間インキュベートした。Titertek^Rマルチスキャンプレートリーダー上で４１４ｎｍの吸光度を読み取った。これら結果を図６Ａ〜Ｂに示す。図６Ａに示すように、野生型ｒＣＲＰ封入体調製物は凝集ＩｇＧに結合したが、単量体ＩｇＧには結合しなかった。その反応性は、ｍＣＲＰのものと類似していた。図６Ｂは、Q-Sepharose分画野生型ｒＣＲＰ_Qと突然変異型ｒＣＲＰ_Qのいずれもが凝集ＩｇＧに結合したが、単量体ＩｇＧには結合しなかったことを示している。このことから、野生型と突然変異型のいずれの組換えＣＲＰも、凝集イムノグロブリンに選択的に結合するそれらの能力において機能的にｍＣＲＰと同じように反応する。凝集イムノグロブリンは免疫複合体の標準的モデルなので、これら結果は、本発明の突然変異型タンパク質が免疫複合体に結合するであろうこと及び単量体イムノグロブリンの存在下でそれらに選択的に結合するであろうことも示している。配列表（1）配列番号：１の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：28塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列;配列番号：１：（1）配列番号：２の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：20塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列；配列番号：２：（1）配列番号：３の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：16塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列；配列番号：３：（1）配列番号：４の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：19塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列;配列番号：４：（1）配列番号：５の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：17塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列;配列番号：５：（1）配列番号：６の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：24塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列;配列番号：６：（1）配列番号：７の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：12塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（xi）配列；配列番号：７：（１）配列番号：８の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：15塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（xi）配列;配列番号：８：（1）配列番号：９の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：21塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（xi）配列；配列番号：９：（1）配列番号：10の情報：（i）配列の特性：（Ａ）長さ：24塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（xi）配列；配列番号：10：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 49/00 Ａ 7431−4Ｃ 49/04 Ａ 7431−4Ｃ 51/00 Ｃ０７Ｋ 14/435 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/53 Ｘ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 8310−2ＪＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 7431−4Ｃ 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リアウハンスエイチアメリカ合衆国ウィスコンシン州 53717 マディソンノースハーウッドサークル２【要約の続き】び該形質転換宿主細胞を培養することを含む本発明の突然変異型タンパク質を製造する方法も提供する。最後に、本発明は、該突然変異型タンパク質を使用するための方法及物質を提供する。

Claims

【特許請求の範囲】１．下記（i）〜（iv）の場合を除いて非突然変異型Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）サブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する突然変異型タンパク質。（i）該非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰの少なくとも１のアミノ酸が欠失しているか、（ii）該非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰの少なくとも１のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されているか、（iii）少なくとも１のアミノ酸が該非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰに付加しているか、又は（iv）かかる変換の組み合わせがなされていること。この際、付加するアミノ酸、欠失するアミノ酸及び置換されるアミノ酸は、該突然変異型タンパク質がその非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰよりも共有結合で架橋した凝集塊をあまり形成しそうにないように選ばれ、該突然変異型タンパク質も修飾ＣＲＰの少なくとも１の生物活性を示す。２．付加するアミノ酸、欠失するアミノ酸及び置換されるアミノ酸が、突然変異型タンパク質がその非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰよりも水性媒質中でより可溶性になるようにも選ばれる、請求項１の突然変異型タンパク質。３．非突然変異型ＣＲＰサブユニット又は非突然変異型プレＣＲＰの少なくとも１のシステインが欠失しているか又は他のアミノ酸により置換されている、請求項１の突然変異型タンパク質。４．下記（i）〜（iv）の場合を除いて非突然変異型Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）サブユニットのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する突然変異型タンパク質。（i）該非突然変異型ＣＲＰサブユニットの少なくとも１のアミノ酸が欠失しているか、（ii）該非突然変異型ＣＲＰサブユニットの少なくとも１のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されているか、（iii）少なくとも１のアミノ酸が該非突然変異型ＣＲＰサブユニットに付加しているか、又は（iv）かかる変換の組み合わせがなされていること。この際、付加するアミノ酸、欠失するアミノ酸及び置換されるアミノ酸は、該突然変異型タンパク質がその非突然変異型ＣＲＰサブユニットよりも共有結合で架橋した凝集塊をあまり形成しそうにないように選ばれ、該突然変異型タンパク質も修飾ＣＲＰの少なくとも１の生物活性を示す。５．非突然変異型ＣＲＰサブユニットの少なくとも１のシステインが欠失しているか又は他のアミノ酸により置換されている、請求項４の突然変異型タンパク質。６．非突然変異型ＣＲＰサブユニットの全てのシステインが欠失しているか又は他のアミノ酸により置換されている、請求項５の突然変異型タンパク質。７．非突然変異型ＣＲＰサブユニットの少なくとも１のシステインがアラニンにより置換されている、請求項５の突然変異型タンパク質。８．非突然変異型ＣＲＰサブユニットの全てのシステインがアラニンにより置換されている、請求項７の突然変異型タンパク質。９．請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡ分子。 10．請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質の発現のためのベクターであって、発現制御配列に機能し得るように連結している該突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター。 11．請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡを含有するように形質転換された宿主細胞であって、該突然変異型タンパク質をコードする該ＤＮＡが発現制御配列に機能し得るように連結している宿主細胞。 12．請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質を製造する方法であって、該突然変異型タンパク質をコードするＤＮＡを含有するように形質転換された宿主細胞を培養することを含み、該突然変異型タンパク質をコードする該ＤＮＡが発現制御配列に機能し得るように連結しており、該培養が該突然変異型タンパク質を発現できる条件下で起こる方法。 13．凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を結合させる方法であって、該凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質と接触させることを含む方法。 14．液体から凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を除去する方法であって、該凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質と接触させることを含む方法。 15．免疫複合体を定量する方法であって、該免疫複合体を請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質と接触させることを含む方法。 16．液体から凝集イムノグロブリン又は免疫複合体を除去する装置であって、固体表面に結合した請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質；及び該液体が該固体表面に接触できるように該固体表面を包む手段；を含む装置。 17．請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質の容器を含む、免疫複合体を定量するためのキット。 18．請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質及び薬学的に許容できるキャリヤーを含む医薬組成物。 19．免疫複合体のレベルの低下を必要とする哺乳動物中の免疫複合体のレベルを低下させる方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質を投与することを含む方法。 20．ウィルス感染症にかかっている哺乳動物のウィルス感染症を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質を投与することを含む方法。 21．細菌感染症にかかっている哺乳動物の細菌感染症を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質を投与することを含む方法。 22．エンドトキシンショックにかかっている哺乳動物のエンドトキシンショックを治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質を投与することを含む方法。 23．癌にかかっている哺乳動物の癌を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質を投与することを含む方法。 24．哺乳動物中の免疫複合体又は癌細胞の検出が可能になるように標識された請求項１〜８のいずれか１項の突然変異型タンパク質を含む造影剤。