RU2183215C2 - Конъюгат для стимулирования иммунной реакции против клетки-мишени, способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего - Google Patents
Конъюгат для стимулирования иммунной реакции против клетки-мишени, способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего Download PDFInfo
- Publication number
- RU2183215C2 RU2183215C2 RU97102113/13A RU97102113A RU2183215C2 RU 2183215 C2 RU2183215 C2 RU 2183215C2 RU 97102113/13 A RU97102113/13 A RU 97102113/13A RU 97102113 A RU97102113 A RU 97102113A RU 2183215 C2 RU2183215 C2 RU 2183215C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sea
- binding
- cells
- conjugate
- superantigen
- Prior art date
Links
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 53
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 6
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 34
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 31
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 26
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 72
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 10
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 8
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 7
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 7
- 102220580968 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1_F47Y_mutation Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 102220580971 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1_F47W_mutation Human genes 0.000 description 3
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102220510409 Matrix-remodeling-associated protein 5_H50A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001023095 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1a Proteins 0.000 description 1
- 101000641989 Araneus ventricosus Kunitz-type U1-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001028691 Carybdea rastonii Toxin CrTX-A Proteins 0.000 description 1
- 101000685083 Centruroides infamatus Beta-toxin Cii1 Proteins 0.000 description 1
- 101000685085 Centruroides noxius Toxin Cn1 Proteins 0.000 description 1
- 101001028688 Chironex fleckeri Toxin CfTX-1 Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920008651 Crystalline Polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 101000644407 Cyriopagopus schmidti U6-theraphotoxin-Hs1a Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 101710120978 Kanamycin resistance protein Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101000679608 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) Cysteine rich necrotrophic effector Tox1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101000959719 Rattus norvegicus AP-3 complex subunit mu-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220528595 Ribonuclease P/MRP protein subunit POP5_L48A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108700037929 Streptococcus pyogenes SpeA Proteins 0.000 description 1
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 229940125716 antipyretic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002564 cardiac stress test Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108010032719 erythrogen Proteins 0.000 description 1
- 108010022946 erythrogenic toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102200044494 rs28903098 Human genes 0.000 description 1
- 102200082808 rs33980484 Human genes 0.000 description 1
- 102220237717 rs779249550 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 101150033897 sea gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
- A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Конъюгат для стимулирования иммунной реакции против клетки-мишени содержит моноклональное антитело С215, моноклональное антитело С242 или их антиген - связывающие фрагменты и стафилококковый энтеротоксин А (SEA). Последний содержит мутацию D 227 A, проявляет пониженную способность к связыванию с антигенами МНС класса II по сравнению с нативным SEA, сохраняет способность к связыванию с Vβ Т-клеточного рецептора. Коньюгат получен с помощью рекомбинантных методик. Лечение злокачественных опухолей у млекопитающего проводится за счет введения терапевтически эффективного количества конъюгата. Изобретение позволяет повысить способность связываться с антигенами МНС класса II клеток млекопитающих. 2 c.п.ф-лы, 6 ил., 3 табл.
Description
Суперантигены в основном являются белками вирусной или бактериальной природы и способны к одновременному связыванию с антигенами МНС класса II клеток млекопитающего и Vβ цепью рецептора Т клетки. Связывание приводит к активации Т-лимфоцитов и лизису клеток, проявляющих МНС класса II. Умеренная степень полиморфизма связывающей части Vβ цепи приводит к активации относительно большой части Т-лимфоцитов при контакте с суперантигеном (по сравнению с активацией посредством обычного процессинга антигена).
Первоначально понятие суперантигена было связано с различными стафилококковыми энтеротоксинами (SEA, SЕВ, SEC1, SEC2 и SEE. Недавно был открыт новый стафилококковый энтеротоксин, названный SЕН (Keyong et al., J. Exp. Med. 180 (1994) 1675-1683). С ростом интереса были открыты дальнейшие суперантигены. Среди прочих, примерами являются Токсин 1 синдрома токсического шока (ТСТШ-1-ТSSТ-1), отслаивающие (экзофолиирующие) токсины (Exft), которые связаны с синдромом шелушения кожи, стрептококковый пирогенный экзотоксин А, В и С (СПЭ А, В и С), белки вируса опухоли молочной железы мыши (ВОМЖМ-MMTV), М белки стрептококков, энтеротоксин Клостридиума перфрингенс (Clostridia perfringens) (КПЭТ-СРЕТ). В качестве обзора по суперантигенам и их свойствам см. Kotzin et al. (Adv. Immunol. 54 (1993) 99-166).
В качестве функционального суперантигена рассматривался экзотоксин A Pseudomonas, поскольку имеются данные, свидетельствующие, что данный токсин может быть подвержен внутриклеточной процессии под действием вспомогательных клеток на фрагменты, которые экспрессируются на клеточной поверхности, обладающие способностью связываться с Vβ цепью, с последующей активацией Т клеток. (Pseudomonas exotoxin A. Legaard et al., Cell Immunol 135 (1991) 372-382).
Для терапии различных заболеваний были предложены такие суперантигены с лечебным действием, которое сопровождается активацией иммунной системы (Kalland et al. , WO 9104053; Jerman et al., WO 9110680; Jerman et al., WO 9324136; Newell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (191) 1074-1078).
Совместно с вакцинами было предложено использовать суперантигены, которые мутировали таким образом, чтобы потерять свою ТСR. связывающую активность (Kappler & Marrack, WO 9314634).
Мутации суперантигенов были описаны ранее (Kappler & Marrack, WO 9314634; Kappler et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396; Grossman et al., J. Immunol. 147 (1991) 3274-3281; Hufnagle et al., Infect. Immun. 59 (1991) 2126-2134).
Ранее нами было предположено использовать для терапии конъюгаты между суперантигеном и антителом для того, чтобы лизировать клетки, которые экспрессируют структуры, относительно которых направлены антитела (Dohlsten et al. , WO 9201470; Lando et al., Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993) 223-228; Kalland et al., Med. Oncol. Jumor Pharmacother. 10 (1993) 37-47; Lando et al., J. Immunol. 150 (8, часть 2) (1993) 114A (Joint Meeting of the American Association of Immunologists and clinical Immunology Society, Denver, Colorado, USA, May 21-25 (1993)); Lando et al., Proc. Am. Assоc. Cancer Res, Annu. Meet. 33 (0) (1992) 339 (Annual Meeting of the American Association for Cancer ReSEArch, San Diego, California, USA, May 20-23 (1992)); Dohlsten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 9287-9291).
Предположительными заболеваниями, предназначенными для лечения являются рак, вирусные инфекции, паразитарные инвазии, аутоиммунные заболевания и другие заболевания, связанные с экспрессией структур на поверхности клеток, специфических для заболевания. Ранее проведенные экспериментальные работы были направлены на конъюгаты, содержащие рекомбинантные SЕА и различные противораковые антитела. Подобные конъюгаты имели несколько сниженную способность связываться с антигеном МНС класса II, сравнимую с таковой у неконъюгированной формы суперантигена. Является ли пониженная способность связывания антигена МНС класса II для достижения оптимального лизиса и оптимального терапевтического эффекта полезной или нет, определено не было.
Эксперименты по иммунной терапии с применением SЕВ: химически конъюгированным с опухолевоспецифическим антиидиотипическим антителом были ранее описаны Ochi et at., (J. Immunol. 151 (1993) 3180-3186).
В период проведения расследования приоритета заявки в Шведском патентном бюро, был дополнительно цитирован Buelow et al., (J. Immunol, 148 (1992) (1-6), который описывает слияния между белком А и фрагментами SEB, без усиления связывания МНС класса II, или использования слияния для уничтожения клеток; и Hartwig et al., (Int. Immunol. 5 (1993) 869-875), который описывает мутацию, влияющую на связывание МНС класса II неслитой формы суперантигена стрептококового эритрогенного токсина А.
Объекты изобретения
Первым объектом изобретения является усовершенствование ранее известных конъюгатов суперантиген-антитело в отношении к общей иммунной стимуляции по сравнению с направленной цитотоксичностью. Стимуляция приводит к активации Т-лимфоцитов и зависит от способности суперантигена связываться и с рецептором Т клетки, и с антигеном МНС класса II.
Первым объектом изобретения является усовершенствование ранее известных конъюгатов суперантиген-антитело в отношении к общей иммунной стимуляции по сравнению с направленной цитотоксичностью. Стимуляция приводит к активации Т-лимфоцитов и зависит от способности суперантигена связываться и с рецептором Т клетки, и с антигеном МНС класса II.
Вторым объектом изобретения является получение конъюгатов между дубликатами с биоспецифическим сродством (например, антителами) и суперантигенами с модифицированным сродством к антигенам МНК класса II. Это, как было теперь показано, улучшает селективность по отношению к суперантиген антитело зависимому цитолизу клетки (SADCC) в клетках, проявляющих антиген (по отношению к которому направлен конъюгат антитела/дубликата биоспецифического сродства) по сравнению с другими клетками, проявляющими антигены МНС класса II.
Третьим объектом изобретения является получение конъюгатов, которые могли бы быть использованы в качестве активного начала при лечении млекопитающих, болеющих раком, аутоиммунными заболеваниями, паразитарными инвазиями, вирусными инфекциями или другими заболеваниями, связанными с клетками, которые экспрессируют на своей поверхности структуры, которые являются специфическими для соответствующего заболевания.
Описание изобретения
Главным аспектом изобретения является конъюгат, включающий
а) дубликат с биоспецифическим сродством, который направлен по отношению к структуре, с которой он предназначен связываться в конъюгате,
б) пептид, который
i) является производным суперантигена,
ii) обладает способностью связываться с Vβ цепью рецептора Т клетки, и
iii) обладает модифицированной способностью связываться с антигенами МНС класса II, по сравнению с суперантигеном, производным которого является пептид (дикий тип суперантигена=SA(wt)).
Главным аспектом изобретения является конъюгат, включающий
а) дубликат с биоспецифическим сродством, который направлен по отношению к структуре, с которой он предназначен связываться в конъюгате,
б) пептид, который
i) является производным суперантигена,
ii) обладает способностью связываться с Vβ цепью рецептора Т клетки, и
iii) обладает модифицированной способностью связываться с антигенами МНС класса II, по сравнению с суперантигеном, производным которого является пептид (дикий тип суперантигена=SA(wt)).
Пептид и дубликат по сродству являются ковалентно связанными друг с другом через мостик (В).
Предпочтительные конъюгаты имеют способность активировать и направлять Т-лимфоциты к избирательному лизису клеток, которые на своей поверхности проявляют структуру, по отношению к которой направлен дубликат по сродству. Это означает, что конъюгаты будут вызывать цитолиз в способе, опосредованном SADCC (суперантиген антитело зависимая клеточная цитотоксичность). См. экспериментальную часть ниже и наши предыдущие публикации, относящиеся к конъюгатам между суперантигенами и антителами (например, Dohlsten et al., WO 9201470).
Конъюгаты по изобретению имеют структуру, которая является аналогичной к конъюгату суперантигена-антитела, описанной в предшествующей области техники (Dolsten et al., WO 9201470, которая здесь включена в качестве ссылки), т.е. , конъюгат соответствует формуле:
Т-В-SА (m)
где, Т представляет дубликат по биоспецифическому сродству, SА (m) представляет модифицированный суперантиген (вышеупомянутый пептид) и В представляет ковалентный мостик, связывающий Т и SА(m) вместе.
Т-В-SА (m)
где, Т представляет дубликат по биоспецифическому сродству, SА (m) представляет модифицированный суперантиген (вышеупомянутый пептид) и В представляет ковалентный мостик, связывающий Т и SА(m) вместе.
Т, в принципе, может быть любой структурой, которая связывается посредством биоспецифического сродства. В большинстве важных случаев, Т способен к связыванию с поверхностной структурой клетки, предпочтительно, специфической для заболевания структурой, как дано выше. Структура, относительно которой направлен Т, обычно является отличной от (а) эпитопа Vβ цепи, с которым связывается пептид, производный от суперантигена (SА(m) и (б) эпитопа антигена МНС класса II, с которым связывается немодифицированный суперантиген. Дубликат Т по биоспецифическому сродству может первично быть отобран из интерлейкинов (например, интерлейкин-2), гормонов, антител и фрагментов антител, связывающих антиген, факторов роста и т.п. См., например, Woodworth, Preclinical and Clinical Development of Cytokine Toxines (доклиническая и клиническая разработка цитокинных токсинов), представленная на конференции " Molecular Approaches to Cancer Immunotherapy; Ashvill, North Carolina, ноябрь 7-11, 1993. Связывание полипептидов с константным доменом иммуноглобулинов (например, протеины А, G и L), пектинами, стрептавидином, биотином и т.п., находилось в порядке очередности, представляющем меньшее значение.
В порядке очередности, было предпочтительным, чтобы Т являлся антителом или фрагментом антитела, связывающим антиген (включая Fab, F(ab)2, Fv, антитело с одной цепью и т.п.), с конкретным усилением активного фрагмента антитела (такого как Fab) у антител, направленных относительно так называемых С242 эпитопов (Lindholm et al., WO 9301303) или по отношению к другим раковоспецифическим эпитопам.
В случае, когда Т является антителом, это первично моноклональное или смесь определенного количества моноклональных (например, 2, 3, 4, 5 или больше) антител. Т может быть поликлональным антителом, в случае, если использование является нетерапевтическим.
Необязательно, для Т иметь полипептидную структуру.
Модифицированный суперантиген SА(m) является первично мутированным антигеном, но может также потенциально быть химически модифицированным суперантигеном, включая фрагменты суперантигенов, сохраняющих способность связываться с Vβ цепью рецептора Т клетки.
Выражение "мутированный суперантиген" означает, что природная способность суперантигена связываться с антигенами МНС класса II была модифицирована на геномном уровне путем замены, вставки или удаления одной или нескольких аминокислот из природного суперантигена.
Фрагменты суперантигена, полученные путем мутаций по удалению части полной аминокислотной последовательности, и фрагменты, полученные путем ферментативного или химического расщепления суперантигена, могут быть использованы эквивалентно в химических конъюгатах по изобретению.
Модифицированный суперантиген SА(m) может включать одну или несколько аминокислотных последовательностей, которые являются производными от различных суперантигенов и, которые могли быть мутированными, например, комбинации предпочтительных суперантигенов, упомянутых выше.
Модифицированный суперантиген SА(m) как таковой может проявлять пониженную иммуногенность и токсичность, по сравнению с нативным суперантигеном.
Другие группы/соединения, которые способны к перекрестной реакции с Vβ-цепью рецептора Т клетки, могут также потенциально быть использованы эквивалентно с мутированным суперантигеном (SА(m)), как дано выше. Подобные группы/соединения могут быть не полипептидной структуры.
В конце года приоритета большинство интересующих продуктов-кандидатов по изобретению, включали мутированные формы суперантигенов, имеющих множественные участки связывания МНС класса II, и/или способность к координатной связи с Zn2+, например, SEA, SED, SEE и SЕН.
Т, так же как и SА(m), может быть получен при помощи рекомбинантного способа.
Мостик В может быть выбран, как ранее было описано (Dohlsten et al., WO 9201470), а именно, будет предпочтительно гидрофильным и проявлять одну или несколько структур(у), выбранных из амида, тиоэфира, эфира, дисульфида и т. п. В случае, если мостик имеет незамещенные неразорванные углеводородные цепи, они предпочтительно не имеют ароматических колец, таких как фенил. Наиболее важными мостиками являются те, которые получены при помощи рекомбинантного способа, т.е., когда конъюгация имеет место на геномном уровне. В подобных случаях являются предпочтительными олигопептидные мостики, содержащие остатки гидрофильных аминокислот, такие как Gln, Ser, Gly, Glu и Arg. Могут быть включены также Pro и His. В течение года приоритета было решено, что предпочтительным мостиком является пептид, включающий три аминокислотных остатка (GlyGlyPro).
Конъюгат по изобретению может включать один или несколько модифицированных суперантигенов на дубликат по биоспецифическому сродству, и наоборот. Это означает, что Т в вышеуказанной формуле, может содержать один или несколько модифицированных суперантигенов в добавление к биоспецифическому дубликату. По аналогии, SА(m) может содержать один или несколько Т дубликатов по биоспецифическому сродству. Дубликат по сродству Т и SA(m) может также с включать другие структуры. Количество модифицированных суперантигенов на дубликат по сродству составляет предпочтительно один или два.
Синтез новых конъюгатов по изобретению может быть проведен в принципе согласно двум главным путям: 1) рекомбинантным способом и 2) химическим присоединением Т к SА(m). Способы хорошо известны для обычного, квалифицированного в данной области работника и включают большое количество вариантов. Из этого следует, что изобретение относится первично к искусственным конъюгатам, то есть, конъюгатам, которые не обнаруживаются в природе.
Химическое сшивание модифицированного суперантигена с дубликатом Т биоспецифического сродства часто применяет функциональные группы (например, первичные аминогруппы или карбоксигруппы), которые имеются во многих положениях каждого соединения. Из этого следует, что конечный продукт будет содержать смесь конъюгатов молекул, различающихся по отношению к положению, по которому произошло сшивание.
Для рекомбинантных конъюгатов (слитых белков), полученные конъюгированные субстанции будут единообразными по отношению к положению сшивания. Или концевой амин модифицированного суперантигена пришивается к карбокси концу дубликата по биоспецифическому сродству, или наборот. Для подобного слияния для антител, таких как интактные антитела и фрагменты связывания антигена (Fab, FV и т.п.), может быть использована либо легкая, либо тяжелая цепь. В настоящее время предпочтительны рекомбинантные конъюгаты, с предпочтением для Fab фрагментов и пришиванием амино конца модифицированного суперантигена к первому константному домену тяжелой цепи антитела (СНl), без включения аналогов, сшивающихся с легкой цепью или с VH, VL доменами, которые также могут дать достаточно хорошие результаты.
Существует два различных способа получения больших количеств суперантигенов (включая модифицированные и слитые формы) на E. coli: внутриклеточная продукция и секреция. Последний способ предпочтителен для конъюгатов по изобретению, поскольку он предполагает очистку правильно уложенного белка из периплазмы и из культуральной среды. Внутриклеточная продукция приводит к сложному способу очистки и часто требует повторное укладывание белка in vitro (для того, чтобы получать белок с правильной третичной структурой). Вышеуказанное не исключает, что возможно получить активные конъюгаты также и в других клетках хозяевах, например, эукариотических клетках, таких как дрожжи или клетки млекопитающих.
Получение мутированных суперантигенов и отбор мутантов, имеющих модифицированную способность связываться (сродство) к антигену МНС класса II, может быть проведено в соответствии с известными способами (см. Kappler et al., J. Exp. Med. 165 (1992) 387-396). См. также нашу экспериментальную часть.
Способность конъюгата связываться с Vβ цепью рецептора Т клетки, со структурой-мишенью и вызывать лизис клетки-мишени зависит, в частности, от пептида (SА)m)), который является производным от суперантигена, дубликата (Т) по биоспецифическому сродству и структуры и длины мостика (В). Квалифицированный работник способен оптимизировать конъюгаты по изобретению в отношении способности связываться и способности вызывать лизис путем изучения взаимоотношения между структурой и эффектом с помощью той модели, которая описана в соответствии с предыдущим знанием по конъюгатам суперантигена и антитела (см. вышеприведенные публикации). См. также экспериментальную часть ниже.
Первоначально предполагалось, что путем модификации способности связывать антиген МНС класса II, соотношение IC50 (SA(wt): IC50(SA(m)) составляет <0,9 (90%), такое как <0,5 (<50%) и возможно также <0,01 (<1%). В альтернативе, модифицированная способность связывания конъюгатов по изобретению может быть измерена в виде отношения констант диссоциации Kd (SA(wt): Кd (SA((m)), при Kd, измеренной в нМ и в том же пределе, как для соотношения IС50(SA(wt): IC50(SА(m)). Для определения IC50 (SA(wt)), IC50(SA(m)), Kd(SA(wt) и Кd(SА((m)) см. экспериментальную часть ниже.
Ранее было известно, что некоторые суперантигены могут иметь два или более участков, которые связывают антиген МНС класса 11 (Fraser et al., In: Superantigen: A patogens view on the immun system. bds. Huber & Palmer, Current Communications in Cell Molecular Biology
7 (1993) 7-29). Для этого типа суперантигенов способность связывания была бы модифицирована по крайней мере по одному из связывающих участков, например, в виде снижения вышеупомянутой способности. Вместе с модификацией суперантигена, это возможно достаточно, чтобы создать изменения в разнице в сродстве для двух участков связывания МНС класса II, экспериментально >10%, и предпочтительно путем снижения сродства по крайней мере одного участка.
7 (1993) 7-29). Для этого типа суперантигенов способность связывания была бы модифицирована по крайней мере по одному из связывающих участков, например, в виде снижения вышеупомянутой способности. Вместе с модификацией суперантигена, это возможно достаточно, чтобы создать изменения в разнице в сродстве для двух участков связывания МНС класса II, экспериментально >10%, и предпочтительно путем снижения сродства по крайней мере одного участка.
Суперантигены связываются с Vβ цепями TCR различных подгрупп с различным сродством. В белках слияния/конъюгатах по изобретению, использованный суперантиген может быть модифицированным таким образом, чтобы проявить измененную специфичность подгруппы, или измененное сродство к одному или нескольким членам подгруппы. Имеются серьезные причины полагать, что существует параболическое взаимоотношение между сродством к Vβ ТСR и стимуляцией, посредством TCR, то есть умеренное сродство будет давать максимальную стимуляцию. Соответственно, подходящее сродство модифицированного суперантигена к Vβ ТСR, может быть близким, в такой же мере, как у сплавления белка/конъюгата, включающего модифицированный суперантиген, способное значительно стимулировать к делению покоящуюся популяцию Т клеток, представляющих, по существу, распределение всех подгрупп Vβ человека. Популяция Т клетки может быть накопленной из Т клеток от случайно выбранных человеческих индивидуумов. Это существенно означало, что стимуляцию возможно измерить. Результаты, представленные в Таблице II (правая колонка), в экспериментальной части отмечают, что способность вызывать SADCC у белков конъюгатов/слияния по изобретению часто, по существу, та же, что для слияния, включающего дикий тип суперантигена.
Основное использование белков конъюгатов/слияния по изобретению.
Конъюгаты согласно изобретению первоначально предназначались для лечения тех же заболеваний, что и конъюгаты между обычными суперантигенами и антителами. См. вышеупомянутые публикации. Таким образом, конъюгаты по изобретению могут быть введены либо в качестве основной терапии, либо в качестве адъювантной терапии при хирургическом вмешательстве, или совместно с другими препаратами.
Фармацевтическая композиция по изобретению включает составы, которые подобны известным в данной области, но теперь содержат наши новые конъюгаты. Таким образом, композиции могут быть в виде материала из лиофилизированных частичек, стерильного или асептического производственного раствора, таблеток, ампул и т.п. Могут присутствовать наполнители, такие как вода (предпочтительно, подведенная буфером до физиологического значения рН при помощи, например, РВS) или другой инертный твердый или жидкий материал. В целом, термины композиции представляют, полученные путем смешивания конъюгата с, растворения в, привязывания к, или составленные другим образом с одним или несколькими водорастворимыми или нерастворимыми в воде водными или неводными наполнителями, если необходимо, вместе с подходящими добавками и адъювантами. Обязательно необходимо, чтобы наполнители и кондиционеры не проявляли неблагоприятного воздействия на активность конъюгата. Вода, как и подобное, включается в понятие наполнитель.
Обычно, конъюгаты будут продаваться и вводиться в предварительно приготовленных дозировках, содержащих каждая эффективное количество конъюгата, которое основано на результатах, представленных в настоящее время, предположительно, в интервале 10-50 мкг. Точная доза варьируется от случая к случаю и зависит от веса пациента и возраста, пути введения, типа заболевания, антитела, суперантигена, пришивания (-В-) и т.п.
Пути введения являются широко известными в данной области, то есть, эффективное количество, лизирующее клетку-мишень, или терапевтически эффективное количество конъюгата по изобретению, контактирует с клетками-мишенями. Для назначений, отмеченных выше, это главным образом представляет парентеральное введение, такое как инъекция или инфузия (подкожно, внутривенно, внутриартериально внутримышечно) животному, такому как человек. Конъюгат может быть введен локально или системно.
Предполагается, что "эффективное количество, лизирующее клетку-мишень", является эффективным количеством для активации и направления Т-лимфоцитов на разрушение клетки-мишени.
В конце года приоритета было решено, что предпочтительным путем введения для белка конъюгата/слияния, содержащего немодифицированные суперантигены, является 3-часовая внутривенная инфузия в день, комбинированная с жаропонижающим агентом (парацетомол). Введение повторяется в течение 4 дней и прекращается перед появлением у пациента второго антитела к слитому белку/конъюгату. Данная схема дозировки, по-видимому, будет применима также для белков конъюгатов/слияния по настоящему изобретению.
Альтернативные области использования
Конъюгаты по изобретению могут также применяться для количественного и качественного определения структур, по отношению к которым направлены отыскивающие мишень группы (Т). В целом, данные способы являются хорошо известными для специалистов в данной области. Таким образом, модифицированный суперантиген может функционировать в качестве маркерной группы в иммуноопределениях, включая иммуногистохимические определения, поскольку маркерная группа, в свою очередь определяется, например, при помощи антитела, которое направлено по отношению к пептиду (SA(m)) и мечено ферментативно, изотопом, флуорофором или другими известными маркерными группами. Другой метод иммуноопределения определяет в клеточной популяции клетки, которые на своей поверхности экспрессируют структуру, способную связываться с группой, отыскивающей мишень (Т). Данное применение означает, что образец из клеточной популяции инкубируется вместе с Т-лимфоцитами и конъюгатами по настоящему изобретению, так же как и в SADСС определении. В случае, если инкубация приводит к лизису клеток, это показывает, что популяция содержит клетки, которые на своей поверхности экспрессируют структуру.
Конъюгаты по изобретению могут также применяться для количественного и качественного определения структур, по отношению к которым направлены отыскивающие мишень группы (Т). В целом, данные способы являются хорошо известными для специалистов в данной области. Таким образом, модифицированный суперантиген может функционировать в качестве маркерной группы в иммуноопределениях, включая иммуногистохимические определения, поскольку маркерная группа, в свою очередь определяется, например, при помощи антитела, которое направлено по отношению к пептиду (SA(m)) и мечено ферментативно, изотопом, флуорофором или другими известными маркерными группами. Другой метод иммуноопределения определяет в клеточной популяции клетки, которые на своей поверхности экспрессируют структуру, способную связываться с группой, отыскивающей мишень (Т). Данное применение означает, что образец из клеточной популяции инкубируется вместе с Т-лимфоцитами и конъюгатами по настоящему изобретению, так же как и в SADСС определении. В случае, если инкубация приводит к лизису клеток, это показывает, что популяция содержит клетки, которые на своей поверхности экспрессируют структуру.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение рекомбинантных белков
Антитела
Экспериментальная работа вместе с изобретением первоначально была выполнена с моноклональным антителом С215 в качестве модельной субстанции. Данное антитело направлено против антигена из семейства GA-733 (см., например, ЕП 376746), цитируемые здесь ссылки и Larsson et al., Int. J. Canc. 32 (1988) 877-82). Эпитоп С215 оценивается как не достаточно специфический для лечения рака у человека. На дату приоритета, по экспериментальной оценке, mab C242 (Lindholm et al., WO 9301303) вместе со своим продуктом слияния с диким типом SЕА, по-видимому, был лучшим кандидатом.
Получение рекомбинантных белков
Антитела
Экспериментальная работа вместе с изобретением первоначально была выполнена с моноклональным антителом С215 в качестве модельной субстанции. Данное антитело направлено против антигена из семейства GA-733 (см., например, ЕП 376746), цитируемые здесь ссылки и Larsson et al., Int. J. Canc. 32 (1988) 877-82). Эпитоп С215 оценивается как не достаточно специфический для лечения рака у человека. На дату приоритета, по экспериментальной оценке, mab C242 (Lindholm et al., WO 9301303) вместе со своим продуктом слияния с диким типом SЕА, по-видимому, был лучшим кандидатом.
Бактериальные штаммы и плазмиды
Для экспрессии и клонирования были использованы штаммы E. coli UL 635 (xyl-7, аrа-14, Т4R, ΔompT) и НВ101 (Boyer and Roulland-Dessoix, J. Mol. Biol. 41 (1969) 459-472) соответственно. Для экспрессии Fab-SEA белков слияния (производных от антитела мыши С215) был использован вектор рКР889 и для секреции SЕА (фиг.1) векторы рКР943 и рКР1055. Вектор рКР889 экспрессии Fab-SЕА идентичен рКР865 (Dohlsten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) in press), за исключением того, что спейсером между СH 1 и SЕА является GIyGlyAlaAlaHis TyrGly. Экспрессия из рКР943 дает выход SЕА с природными аминокислотными остатками. Использование рКР1055 дает SЕА, обладающее добавленным Gly к аминоконцу. У обеих векторов для транскрипции и трансляции используют сигналы из стафилококкового белка А (Uhlen et al., J. Biol. Chem. 259 (1984) 1695-1702) и синтетический сигнальный пептид для секреции (L. Abrahmsen,, неопубликовано).
Для экспрессии и клонирования были использованы штаммы E. coli UL 635 (xyl-7, аrа-14, Т4R, ΔompT) и НВ101 (Boyer and Roulland-Dessoix, J. Mol. Biol. 41 (1969) 459-472) соответственно. Для экспрессии Fab-SEA белков слияния (производных от антитела мыши С215) был использован вектор рКР889 и для секреции SЕА (фиг.1) векторы рКР943 и рКР1055. Вектор рКР889 экспрессии Fab-SЕА идентичен рКР865 (Dohlsten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) in press), за исключением того, что спейсером между СH 1 и SЕА является GIyGlyAlaAlaHis TyrGly. Экспрессия из рКР943 дает выход SЕА с природными аминокислотными остатками. Использование рКР1055 дает SЕА, обладающее добавленным Gly к аминоконцу. У обеих векторов для транскрипции и трансляции используют сигналы из стафилококкового белка А (Uhlen et al., J. Biol. Chem. 259 (1984) 1695-1702) и синтетический сигнальный пептид для секреции (L. Abrahmsen,, неопубликовано).
Мутагенез
Мутации, полученные при помощи реакции полимеразной цепи, проанализировали на Perkin Elmer Thermocycler. Реакционная смесь (100 мкл) содержала: 1•буфера РПЦ от Perkin Elmer Cetus (10 мМ Трис/HCl рН 8,3; 1,5 мМ MgCl2, 0,001% (вес/объем) желатин; и дополнительные 2 мМ МgСl2; 0,4 мМ dNТРS (Perkin Elmer Cetus): 2,5 единицы Ampli Tag ДНК полимеразы (Perkin Elmer Cetus, США) и 100 нг матрицы ДНК. Праймеры добавляли в конечной концентрации 0,8 мкМ. Оригинальная матрица представляла плазмиду, содержащую ген энтеротоксина А Staphylococcus aureus, идентичный к опубликованному Betley et al., (J. Bacteriol. 170 (1988) 34-41), за исключением того, что первый кодон (кодирующий Ser) заменен на ТСС для обставления сайта Ваm HI на 5' конце гена. Далее было использовано производное, содержащее несколько уникальных участков рестрикции ферментами, введенных путем покоящейся мутации. Мутации, введенные в окружение участков рестрикции, были получены путем одного набора праймеров, один из них охватывает мутацию и участок рестрикции. Для большинства мутаций должны были использовать два набора праймеров, и проводить реакцию полимеразной цепи в два последовательных этапа. Новый участок рестрикции ферментом был введен вместе с каждой мутацией для возможности легкой идентификации. Олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров, были синтезированы на Gene Assemble (Pharmacia Biotech AB, Sweden). Для подтверждения каждой мутации определяли родственную часть нуклеотидной последовательности на Applied Biosystems DNA-Sequenser, используя набор Taq Dye Deoxy Termination Sequencing Kit.
Мутации, полученные при помощи реакции полимеразной цепи, проанализировали на Perkin Elmer Thermocycler. Реакционная смесь (100 мкл) содержала: 1•буфера РПЦ от Perkin Elmer Cetus (10 мМ Трис/HCl рН 8,3; 1,5 мМ MgCl2, 0,001% (вес/объем) желатин; и дополнительные 2 мМ МgСl2; 0,4 мМ dNТРS (Perkin Elmer Cetus): 2,5 единицы Ampli Tag ДНК полимеразы (Perkin Elmer Cetus, США) и 100 нг матрицы ДНК. Праймеры добавляли в конечной концентрации 0,8 мкМ. Оригинальная матрица представляла плазмиду, содержащую ген энтеротоксина А Staphylococcus aureus, идентичный к опубликованному Betley et al., (J. Bacteriol. 170 (1988) 34-41), за исключением того, что первый кодон (кодирующий Ser) заменен на ТСС для обставления сайта Ваm HI на 5' конце гена. Далее было использовано производное, содержащее несколько уникальных участков рестрикции ферментами, введенных путем покоящейся мутации. Мутации, введенные в окружение участков рестрикции, были получены путем одного набора праймеров, один из них охватывает мутацию и участок рестрикции. Для большинства мутаций должны были использовать два набора праймеров, и проводить реакцию полимеразной цепи в два последовательных этапа. Новый участок рестрикции ферментом был введен вместе с каждой мутацией для возможности легкой идентификации. Олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров, были синтезированы на Gene Assemble (Pharmacia Biotech AB, Sweden). Для подтверждения каждой мутации определяли родственную часть нуклеотидной последовательности на Applied Biosystems DNA-Sequenser, используя набор Taq Dye Deoxy Termination Sequencing Kit.
Получение белков и анализ
Клетки E. coli, содержащие конструкции различных генов, выращивали в течение ночи при комнатной температуре (Fab-SEA векторы) и при 34oС (векторы секреции, оптимум зависит от мутации). Питательная среда содержала 2•УТ (16 г Бакто триптона, 10 г/л дрожжевого Бакто экстракта, 5 г/л NаСl), дополненного канамицином (50 мг/л). Слияние белков индуцировали путем добавления изопропил-β-D-тиогалактозида в конечной концентрации 100 мкМ. (Промотор белка А, использованный в экспрессии не слитого SЕА являлся конституитивным). Клетки осаждали при 5000•g и содержимое периплазмы отделяли путем осторожного размораживания, ранее замороженного осадка клеток в Трис-НСl (рН 7,5), на льду при потряхивании в течение 1 часа. Экстракт периплазмы просветляли путем центрифугирования при 9500•g в течение 15 минут. Fab-SEA белки использовали без дальнейшей очистки. SEA и Glу-SЕА далее очищали путем аффинной хроматографии на колонке с анти-SЕА. Поликлональные анти-SЕА антитела кролика были ранее получены от кроликов, предварительно иммунизированных SЕА и очищали путем аффинной хроматографии на протеин GСефарозе® (Pharmacia Biotech).
Клетки E. coli, содержащие конструкции различных генов, выращивали в течение ночи при комнатной температуре (Fab-SEA векторы) и при 34oС (векторы секреции, оптимум зависит от мутации). Питательная среда содержала 2•УТ (16 г Бакто триптона, 10 г/л дрожжевого Бакто экстракта, 5 г/л NаСl), дополненного канамицином (50 мг/л). Слияние белков индуцировали путем добавления изопропил-β-D-тиогалактозида в конечной концентрации 100 мкМ. (Промотор белка А, использованный в экспрессии не слитого SЕА являлся конституитивным). Клетки осаждали при 5000•g и содержимое периплазмы отделяли путем осторожного размораживания, ранее замороженного осадка клеток в Трис-НСl (рН 7,5), на льду при потряхивании в течение 1 часа. Экстракт периплазмы просветляли путем центрифугирования при 9500•g в течение 15 минут. Fab-SEA белки использовали без дальнейшей очистки. SEA и Glу-SЕА далее очищали путем аффинной хроматографии на колонке с анти-SЕА. Поликлональные анти-SЕА антитела кролика были ранее получены от кроликов, предварительно иммунизированных SЕА и очищали путем аффинной хроматографии на протеин GСефарозе® (Pharmacia Biotech).
Анализ белков
Белки разделяли на предварительно залитых полиакриламидных SDS Трис-Глицин гелях Novex (градиент 4-20%, или гомогенном 12%, новая экспериментальная технология Novex) и, либо прокрашивали Кумасси бриллиантовым синим, либо использовали в Western блоте. Поликолональные анти-SЕА антитела кролика (выше) использовали для определения SЕА в Western блот анализе после обработки антителами свиньи против Ig кролика и антителами кролика против пероксидазы хрена, и пероксидазой. Вместе с белками слияния Fab-SEA, использовали также конъюгированные при помощи пероксидазы хрена антитела крысы, распознающие каппа цепи (AAC 08P, Serotech Ltd, England). Для визуализации пероксидазы использовали 3,3-диаминобензидин (Sigma).
Белки разделяли на предварительно залитых полиакриламидных SDS Трис-Глицин гелях Novex (градиент 4-20%, или гомогенном 12%, новая экспериментальная технология Novex) и, либо прокрашивали Кумасси бриллиантовым синим, либо использовали в Western блоте. Поликолональные анти-SЕА антитела кролика (выше) использовали для определения SЕА в Western блот анализе после обработки антителами свиньи против Ig кролика и антителами кролика против пероксидазы хрена, и пероксидазой. Вместе с белками слияния Fab-SEA, использовали также конъюгированные при помощи пероксидазы хрена антитела крысы, распознающие каппа цепи (AAC 08P, Serotech Ltd, England). Для визуализации пероксидазы использовали 3,3-диаминобензидин (Sigma).
Спектры кругового дихроизма (КД) получали на J-720 спектрополяриметре (JASCO, Япония) при комнатной температуре (22-25oС) в 10 мМ фосфатном буфере, рН 8,2, в присутствтии 0,02 мМ ZnSO4 и 0,005% (объем/объем) Tween® 20. Скорость сканирования составляла 10 нм/мин, и каждый спектр представлял среднее из пяти последовательных сканирований. Длина пути ячейки составляла 1 мм и концентрация белка от 0,2 до 0,5 мг/мл. Денатурацию при равновесии гуанидин гидрохлоридом (Gdn-HCl) определяли при 23oС путем КД при 222 нм при концентрации белка 0,3 мг/мл и длине пути ячейки 1 мм. Эти данные использовали для расчета кажущейся Фракции развернутого белка (Fарр). Параметры равновесия развертывания выводили путем подбора данных для двухсайтового процесса складывания (Hurle et al., Biochemistry 29 (1990) 4410-4419.
СВЯЗЫВАНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO
Материалы
Реактивы: Использовали среду RPMI 1640, полученную от (Gibco, Middlesex, Англия. Среда имела рН 7,4 и содержала 2 мМ L-глютамина (Gibco, Middlesex, Англия), 0,01 М НЕРЕS (Biological Industries, Израиль), 1 мМ NаНСО3 (Biochrom AG, Германия), 0,1 мг/мл Гентамицин сульфата (Biological Industries Израиль), 1 мМ Nа-перувата (JRH Bioscences Industries, США), 0,05 мМ меркаптоэтанола (Sigma Co. , США), эссенциальные аминокислоты, концентрированные в 100 раз (Flow Laboratories, Шотландия), дополненные 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой (Gibco, Middlesex, Англия). Рекомбинантный SEA(wt), SEA(m) и продукты слияния С21Fаb-SEA(wt) и C21Fab-SЕА(m) получили как описано выше. Рекомбинантный IL-2 человека получен от Cetus Corp., США. Митомицин С получен от Sigma Co., США. Na2 51CrO4 получен от Merck, Германия. Физраствор на буфере (РВS) без магния и кальция получили от Imperial Англия.
Материалы
Реактивы: Использовали среду RPMI 1640, полученную от (Gibco, Middlesex, Англия. Среда имела рН 7,4 и содержала 2 мМ L-глютамина (Gibco, Middlesex, Англия), 0,01 М НЕРЕS (Biological Industries, Израиль), 1 мМ NаНСО3 (Biochrom AG, Германия), 0,1 мг/мл Гентамицин сульфата (Biological Industries Израиль), 1 мМ Nа-перувата (JRH Bioscences Industries, США), 0,05 мМ меркаптоэтанола (Sigma Co. , США), эссенциальные аминокислоты, концентрированные в 100 раз (Flow Laboratories, Шотландия), дополненные 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой (Gibco, Middlesex, Англия). Рекомбинантный SEA(wt), SEA(m) и продукты слияния С21Fаb-SEA(wt) и C21Fab-SЕА(m) получили как описано выше. Рекомбинантный IL-2 человека получен от Cetus Corp., США. Митомицин С получен от Sigma Co., США. Na2 51CrO4 получен от Merck, Германия. Физраствор на буфере (РВS) без магния и кальция получили от Imperial Англия.
Клетки: Линия клеток карциномы толстой кишки Соlо205 и клетки В лимфомы клеточной линии Raji получены от American Type Cell Culture Collection (Rockvill, MD, США ) (экспрессирующие HLA-DR23/w/10, -DР7, -Dqw1/w2). Лимфобластоидные В клетки линии ВSМ, трансформированные EBV представляли любезный дар Др. van Dе Griend, Dept, of Immunology, Dr. Daniel den Ноеd Cancer Centre, Leiden. Нидерланды. Клетки неоднократно проверяли на загрязнение микоплазмой при помощи Gen-Probe Mycoplasma Т. С. теста. Gen-Probe Inc., San Diego, США.
Линии Т клеток, активированных SEA, были получены путем активации моноядерных клеток из периферической крови. Кровь получали в виде кожистого слоя от доноров крови из Госпиталя Университета Лунда. Клетки РВМ стимулировали при концентрации 2•106 клеток/мл, обработанными митомицином С, покрытыми SЕА клетками ВSМ (проинкубированными с 100 нг/мл SЕА) в среде с 10% FСS. Линию Т клеток стимулировали повторно с двухнедельным интервалом рекомбинантным IL-2 человека 20 U/мл и еженедельно, обработанными митомицином С, покрытыми SEA клетками BSM. Линии клеток культивировали в течение 4-12 недель перед использованием в определении.
Жизнеспособность эффекторных клеток, согласно определению включения трипанового синего, превышало 50%.
Определение характеристик связывания МНС класса II дикого типа и мутанта SЕА.
Способы радиоактивного иодирования. Подходящие количества дикого типа или мутанта SЕА метили радиоактивностью от 10 до 25 мСi Nа125I, используя способ с лактопероксидазой и ферментом на подложке (NEN, Boston, MА). Реакцию останавливали при помощи гашения азидом натрия, и связанную с белком радиоактивность отделяли от свободного иода путем фильтрации через колонку РD-10 (Pharmacia Biotech АВ, Швеция) в среде R10 в качестве буфера элюции. Условия выбирали, чтобы получить стехиометрическое соотношение между иодом-125 и белком ≤2:1. Радиохимическую чистоту подтверждали путем эксклюзионной ЖХВР хроматографии по размеру на колонке ТSК SW 3000. Влияние радиоиодирования на связывающую активность тестировали только для дикого типа SЕА и изменения не обнаружили (данные не представлены).
Прямое определение связывания. Клетки Raji. 6•104/100 мкл, предварительно культивированные в среде R10, добавляли в конические полипропиленовые пробирки и инкубировали (22oС/45 мин) в трипликатах со 100 мкл/на пробирку, серийно разбавленного меченного 125I дикого типа или мутанта SЕА. Клетки промывали 2 мл 1% (вес/объем) бычьим сывороточным альбумином (ВSА) в 10 мМ физрастворе на фосфатном буфере (РВS), рН 7,4, центрифугировали при 300•g в течение 5 минут и аспирировали. Данную процедуру повторяли дважды. В конце клетки анализировали на связанную с клетками радиоактивность в гамма счетчике (Packard Instruments Co., Downers Grove, IL, США). Кажущуюся константу диссоциации, kd, и количество участков связывания, N, при насыщении определяли по Скэтчарду (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1949) 660-72), после вычитания неспецифического связывания (т.е. связывания после инкубации только в среде R10).
Определение ингибирования (ингибирование связывания 125I-меченного дикого типа SEA мутантами SEA). Данные эксперименты по ингибированию проводили как описано для определения прямого связывания с небольшими модификациями. В кратком виде, 50 мкл 125I-меченного дикого типа SЕА оставляли конкурировать с избытком немеченного дикого типа или мутанта SЕА (50 мкл/пробирку) для связывания с 6•104/100 мкл клеток Raji. Для получения максимальной чувствительности в исследовании ингибирования использовали следовые концентрации, дающие ≈40% связавшейся радиоактивности от прямого определения. Эффективность вытеснения конкурента выражали в виде концентрации, дающей 50%-ное ингибирование (IС50) связавшейся радиоактивности. Сродство связывания мутантов по отношению к дикому типу SЕА рассчитывали, используя уравнение
IC50(SEA(wt)):IС50(SЕА(m))
Для того, чтобы проанализировать, действительно ли мутанты конкурируют за связывание с тем же участком на клетках Raji, как и дикий тип SЕА, данные по связыванию, полученные с мутантами SЕА, выражали графически в виде двойной логарифмической функции и исследовали на параллельность с соответствующими данными для дикого типа SEA.
IC50(SEA(wt)):IС50(SЕА(m))
Для того, чтобы проанализировать, действительно ли мутанты конкурируют за связывание с тем же участком на клетках Raji, как и дикий тип SЕА, данные по связыванию, полученные с мутантами SЕА, выражали графически в виде двойной логарифмической функции и исследовали на параллельность с соответствующими данными для дикого типа SEA.
Определение ингибирования (ингибирование связывания меченного флуоресцентной меткой SЕА дикого типа под действием немеченного SЕА дикого типа и мутантов SЕА). Клетки Raji. (2.5•105) инкубировали с ингибитором (диким типом или мутантом SEA; 0-6000 нМ), разведенным в 50 мкл СО2-независимой среды (Gibco) дополненной 10% FСS, глютамином и гентамицином при 37oС в течение 30 минут. Добавляли флуоресцеин, конъюгированный с диким типом SЕА в конечной концентрации 30 нМ и образцы инкубировали дополнительные полчаса при 37oС. Образцы промывали три раза ледяным РВS, дополненным 1% ВSА (РВS-ВSА) и окончательно выдерживали в 0,4 мл РВS-ВSА во льду до анализа. Из каждого образца анализировали 10 000 живых клеток по зеленой флуоресценции на FACStar (Becton Dickinson) проточном цитометре и рассчитывали среднее значение флуоресценции, используя программу LYSIS II.
Определение SDCC и SADCC SЕА(wt), SЕА(m) и их белков слияния при помощи С21Fаb.
Определение SDСС. Анализировали цитотоксичность SEA (wt), SЕА(m) и их белков слияния при помощи С21Fаb по отношению МНС класса II+ клеток Raji в обычном исследовании высвобождения 51Сr3+, используя стимулированную in vitro SEA-специфическую линию Т клеток в качестве эффекторных клеток. В кратком виде, клетки Raji, меченные 51Сr, инкубировали в количестве 2,5•103 клеток на 0,2 мл среды (RPMI, 10% FCS) в микротитровальных ячейках при определенном соотношении эффектора для клетки-мишени, в присутствии или отсутствии (контроль) добавок. Рассчитывали процент специфической цитотоксичности в виде 100•([счет в мин, высвобождение в эксперименте - счет в мин, фоновое высвобождение] /[счет в мин, общее высвобождение - счет в мин, фоновое высвобождение] ). Соотношение эффекторов к клеткам составляло 30:1 для неслитых белков и 40:1 для белков слияния.
SАDСС против клеток рака толстой кишки человека
Анализировали цитотоксичность C21Fab-SEA(wt), С21Fаb-SЕА(m), SЕА(wt) и мутантов SЕА по отношению к С215+ МНС класса II клеток карциномы толстой кишки SW 620 в обычных условиях в течение 4 часов по определению выхода 51Сr3+, используя стимулированную in vitro под действием SEA, линию Т клеток в качестве эффекторных клеток. В кратком виде, клетки, SW 620, меченные 51Сr3+, инкубировали в количестве 2,5•103 клеток на 0,2 мл среды (RPMI, 10% FCS) в микротитровальных ячейках при соотношении эффектора к клеткам-мишеням 30: 1 в присутствии или отсутствие (контроль) добавок. Процент специфической цитотоксичности рассчитывали так же, как и для определения SD СС.
Анализировали цитотоксичность C21Fab-SEA(wt), С21Fаb-SЕА(m), SЕА(wt) и мутантов SЕА по отношению к С215+ МНС класса II клеток карциномы толстой кишки SW 620 в обычных условиях в течение 4 часов по определению выхода 51Сr3+, используя стимулированную in vitro под действием SEA, линию Т клеток в качестве эффекторных клеток. В кратком виде, клетки, SW 620, меченные 51Сr3+, инкубировали в количестве 2,5•103 клеток на 0,2 мл среды (RPMI, 10% FCS) в микротитровальных ячейках при соотношении эффектора к клеткам-мишеням 30: 1 в присутствии или отсутствие (контроль) добавок. Процент специфической цитотоксичности рассчитывали так же, как и для определения SD СС.
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ IN VIV0
Опухолевые клетки. Клетки меланомы B16-F10, трансфецированные кДНК, кодирующей ассоциированный антиген рака человека С215 (В16-С215) (Dohlsten et al., Monoclonal antibody - Superantigen fusion proteins: Tumor specific agents for T cell based tumor therapy; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, In press, 1994), выращивали в виде налипших клеток до субконфлуентности. Культуральная среда состояла из RPMI 1640 (GIBCO, Middlesex, UK), дополненной 5•10-5 М β-меркаптоэтанолом (Sigma, St Louis, MO США), 2 мМ L-глютамина (GlBCO), 0,01 Нереs (Biological Industries, Израиль) и 10% эмбриональной сывороткой теленка (GlBCO). Клетки снимали путем быстрой инкубации в 0,02% ЭДТА и суспендировали в ледяном физрастворе на фосфатном буфере с 1% сывороткой сингенных мышей (наполнитель) в концентрации 4•105 клеток/мл.
Опухолевые клетки. Клетки меланомы B16-F10, трансфецированные кДНК, кодирующей ассоциированный антиген рака человека С215 (В16-С215) (Dohlsten et al., Monoclonal antibody - Superantigen fusion proteins: Tumor specific agents for T cell based tumor therapy; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, In press, 1994), выращивали в виде налипших клеток до субконфлуентности. Культуральная среда состояла из RPMI 1640 (GIBCO, Middlesex, UK), дополненной 5•10-5 М β-меркаптоэтанолом (Sigma, St Louis, MO США), 2 мМ L-глютамина (GlBCO), 0,01 Нереs (Biological Industries, Израиль) и 10% эмбриональной сывороткой теленка (GlBCO). Клетки снимали путем быстрой инкубации в 0,02% ЭДТА и суспендировали в ледяном физрастворе на фосфатном буфере с 1% сывороткой сингенных мышей (наполнитель) в концентрации 4•105 клеток/мл.
Животные и лечение животных. Мыши, возрастом 12-19 недель, являлись трансгенными мышами С57В1/6 по Vβ 3 цепи рецептора Т клеток (Dohlsten et al. , Immunology 79 (1993) 520-527). Внутривенно в хвостовую вену инъецировали сто тысяч опухолевых клеток В16-С215 в 0,2 мл наполнителя. На 1, 2 и 3 дни мыши получали при внутривенной инъекции C215Fab-SEA(wt) или C215Fab-SЕА (D 227А) в 0,2 мл наполнителя в дозах, отмеченных на фиг. 5. Контрольные мыши получали только наполнитель согласно той же схеме. На 21 день после инъекции опухолевых клеток, мышей забивали путем смещения шейных позвонков, извлекали легкие и фиксировали в растворе Bouin, подсчитывали количество метастазов в легких.
РЕЗУЛЬТАТЫ
"Сканирование аланина" в стафилококковом энтеротоксине А.
"Сканирование аланина" в стафилококковом энтеротоксине А.
Первоначально структура SЕА была неизвестна и можно было только делать спекуляции в том, какие боковые цепи доступны на поверхности. Следовательно, большинство мутантов, выбрали из линейно расположенных гомологичных суперантигенов (Marrack and Kappler, Science 248 (1990) 705-711). Чтобы некоторые из тех суперантигенов предположительно связывались с HLA-DR консервативным образом, по традиции выбирали консервативные (в основном полярные) остатки, (Chitagumpala et al., J. Immunol. 147 (1991) 3876-3881). Замещения на аланин использовали в соответствии с опубликованной стратегией (Cunnigham and Wells, Science 244 (1988) 1081-1085). В процессе выполнения настоящей работы появилась доступная информация:
i) было показано, что ион Zn2+ является важным для взаимодействия между SEА и МНС классом II (HLA-DR) (Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1991) 5507-5511),
ii) был представлен множественный анализ энтеротоксина В стафилококка (SЕВ) (Kappler et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396),
iii) представлена структура SЕВ (Swaminathan et al., Nature 359 (1992) 801-806).
i) было показано, что ион Zn2+ является важным для взаимодействия между SEА и МНС классом II (HLA-DR) (Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1991) 5507-5511),
ii) был представлен множественный анализ энтеротоксина В стафилококка (SЕВ) (Kappler et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396),
iii) представлена структура SЕВ (Swaminathan et al., Nature 359 (1992) 801-806).
Было обнаружено, что наш первый мутант, проявляющий серьезно пониженное сродство к HLA-DR, D227A очень плохо образует координатную связь с Zn2+ (данные не представлены). Учитывая полную укладку SЕА и, SЕВ, новые данные предполагают две области связывания МНС класса II; одна включает ион Zn2+, и одна соответствует участку, определенному у SЕВ. На основе данного предположения был получен второй набор мутантов. Этот второй набор мутантов экспрессировали в виде SEA, несущего глицин, добавленный к амино концу. Сначала было показано, что расширение не имеет влияния на связывающие свойства дикого типа SEA (следующий раздел).
Большинство мутантов экспрессировались и секретировались E. coli в функциональном виде, что определяли по данным анализа связывания моноклональных антител (Таблица I). Были получены очень небольшие количества мутантов Е154А/ D156А и R160A. Они были последовательно исключены из исследования. Мутанты, обладающие замещением на Ала по остаткам 128, 187, 225 или 227 не различались моноклональным антителом 1Е. Последние два мутанта, проявляющие пониженный уровень экспрессии (более выраженный при 34oС, чем при 24oС) мигрировали быстрее при SDS-PAGE электрофорезе в денатурирующих, но не восстанавливающих условиях (все другие мутанты мигрировали как дикий тип SЕА, данные не представлены). При оценке анализа КД спектра, структура D227А могла немного отличаться от нативного SЕА (фиг.2), но стабильность была очень близка к дикому типу SEA (определяли по устойчивости к денатурации гуанидинхлоридом). Рассчитанная ΔΔG между мутантом и нативным SЕА (SЕА(wt)) составляла 0,16 ккал/моль, что составляет только около 4% от значений ΔG° (данные не представлены). В целом, все сигналы при КД анализе были очень низкими, как ожидается, преимущественно, от β-складчатой структуры. Недавно было доложено, что His 225 координирует Zn2+ (неопубликованные данные в работе Fraser et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1991) 5507-5511).
Поскольку Asp 227 участвует в координатной связи Zn2+ (выше) и предположительно расположен в той же β-складчатой структуре, как и His 225, это предполагает, что данных два остатка составляют цинк-связывающие ядра, обнаруженные в белках с цинк-координирующими структурами (Vallee and Alud, Biochemistry, 29 (1990) 5647-5659).
Связывание с МНС классом II и рецептором Т клетки
Сродство МНС класса II рассчитывали из количества, требующегося для конкуренции с меченным флуоресцеином SЕА дикого типа для клетки Raji, проявляющей большое количество МНС класса II. Способность вытеснения для мутанта рассчитывали из концентрации, дающей 50% ингибирования (IС50), связанной флуоресцентной метки, по сравнению с концентрацией, требующейся для, SEA дикого типа, в качестве конкурента. Для SЕА дикого типа и некоторых мутантов сравнивали результаты данного анализа с результатами, где использовали меченный 125I SЕА дикого типа, в качестве следового количества. Как можно видеть из Таблицы II, значения, полученные из этих двух анализов ингибирования, хорошо коррелируют.
Сродство МНС класса II рассчитывали из количества, требующегося для конкуренции с меченным флуоресцеином SЕА дикого типа для клетки Raji, проявляющей большое количество МНС класса II. Способность вытеснения для мутанта рассчитывали из концентрации, дающей 50% ингибирования (IС50), связанной флуоресцентной метки, по сравнению с концентрацией, требующейся для, SEA дикого типа, в качестве конкурента. Для SЕА дикого типа и некоторых мутантов сравнивали результаты данного анализа с результатами, где использовали меченный 125I SЕА дикого типа, в качестве следового количества. Как можно видеть из Таблицы II, значения, полученные из этих двух анализов ингибирования, хорошо коррелируют.
Было определено прямое связывание МНС класса II для шести выбранных мутантов, используя 125I-меченный мутант SЕА (Таблица II). Для мутанта Н50А значения, полученные из прямого определения связывания и определения ингибирования коррелируют хорошо, однако с мутантом F47А было обнаружено большое расхождение: непосредственное связывание показывает только в 7 раз более слабое связывание, чем для дикого типа SЕА, но оба конкурентных анализа показывают, около, в 70 раз пониженное связывание. Данные двух из других мутантов показывают два различных типа взаимодействий при связывании. Для мутантов Н225А и Д227А в тех же определениях сродство было ниже, чем предел определения.
Ранее мы показали, что белки слияния, состоящие из Fab фрагмента реактивного к карциноме антитела и SЕА, могут быть использованы для направления цитотоксического действия Т клеток на специфический лизис раковых клеток, несмотря на то, что взаимодействие между SEA и рецептором Т клетки (TCR) являлось слишком слабым, чтобы быть зарегистрированным само по себе (Dohlsten et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA в печати). Таким образом, в противоположность к анализам, включающим контекст выделенного суперантигена слияния Fab, позволяет проводить функциональное определение для взаимоедйствия между SЕА и TCR, независимо от связывания МНС класса II. Соответственно, эффективность различных конъюгатов непосредственно направлять Т клетки на лизис клеток, распознаваемых по Fab остатку, определяли по выходу хрома. Данный анализ подтверждает, что мутации, проявляющие воздействие на связывание МНС класса II, не влияют на связывание TCR (Таблица II).
Биологические эффекты мутаций
Пролиферативное действие было определено в виде способности стимулировать периферические лимфоциты к делению. Все три мутанта, которые очень слабо конкурировали за МНС класс II, индуцировали слабую пролиферацию, или не вызывали ее, а промежуточный мутант Н187А проявлял некоторую пролиферативную способность, тогда как другие исследованные мутанты были неразличимы от дикого типа (Tаблица III). Harris et al. (Infect. Immun. 61 (1993) 3175-3183) недавно доложил о сходной сильной редукции стимуляторной активности Т клетки для мутантов SЕА F47G и L48G. Очевидно, сильная редукция в любой из двух предполагаемых областей связывания приводит к сильному воздействию на способность индуцировать пролиферацию. Это предполагает, что SЕА перекрестно сшивает две молекулы МНС класса II, приводя к димеризации ТСД, и что это является необходимым для получения сигнала трансдукции.
Пролиферативное действие было определено в виде способности стимулировать периферические лимфоциты к делению. Все три мутанта, которые очень слабо конкурировали за МНС класс II, индуцировали слабую пролиферацию, или не вызывали ее, а промежуточный мутант Н187А проявлял некоторую пролиферативную способность, тогда как другие исследованные мутанты были неразличимы от дикого типа (Tаблица III). Harris et al. (Infect. Immun. 61 (1993) 3175-3183) недавно доложил о сходной сильной редукции стимуляторной активности Т клетки для мутантов SЕА F47G и L48G. Очевидно, сильная редукция в любой из двух предполагаемых областей связывания приводит к сильному воздействию на способность индуцировать пролиферацию. Это предполагает, что SЕА перекрестно сшивает две молекулы МНС класса II, приводя к димеризации ТСД, и что это является необходимым для получения сигнала трансдукции.
В отличие от эффективности различных мутантов по направлению, стимулированных in vitro под действием SEA Т клеток, к лизису клеток-мишеней, обладающих МНС класса II, скорее наблюдается корреляция со сродством связывания, чем со способностью конкурировать (Таблица III). Например, эффективности F47A и D48А являются пониженными только в 2,5 раза и 300 раз соответственно. Таким образом, здесь, очевидно, также нет неотъемлемого требования для двухвалентности.
Увеличение в мультивалентности, являющееся результатом значительно большего количества ТSR на поверхности активированной Т клетки, возможно, частично экранирует эффект низкой способности взаимодействия SЕА/МНС класса II. Путем использования специфических бифункциональных антител карциномы, содержащих один анти-СD3 остаток и один антикарциномный остаток, ранее было показано, что данная димеризация не является необходимой для непосредственной цитотоксичности Т клетки (Renner et al., Science 264 (1994) 833-35).
Функциональные эксперименты in vivo: Результаты представлены на фиг. 6А и 6Б. Лечение мышей C21Fab-SEA(wt) и C21Fab- SEA (D227А) по понижению количества метастазов в легких клеток В16-С215 меланомы являлось высокоэффективным. Терапевтическое действие, по существу, было идентичным для двух вариантов целевых суперантигенов. Лечение С21Fаb-SЕА(wt) приводило к 70% летальности в дозах 5 мкг/инъекцию. В противоположность этому, смертность мышей в тех же дозах при применении C21Fab-SEA (D5227А) не было. Рассматривая вместе, SЕА(D227А) является примером мутанта с пониженной токсичностью и сохраненной терапевтической эффективностью при включении в Fаb-SEA белок слияния.
ДИСКУССИЯ
Недавно была доложена структура комплекса между SЕВ и HLA-DR (Jardetzky et al., Nature 368 (1994) 711-718). Большинство идентифицированных остатков SЕВ, участвующих в данном взаимодействии являются консервативными в SЕА. Наши данные по мутанту D227А показывают слабое сродство взаимодействия между данным участком в SЕА (амино концевой участок) и МНС классом II, имеющим значение kd выше 8 мкМ. Недавно было доложено, что kd взаимодействия между SЕВ и HLA-DR. составляет 1,7 мкМ (Seth et al., Nature (1994) 324-27). Были исследованы различия во взаимодействии между SЕВ, TCR и HLA-DR и было показано, что комплекс между SEB и HLA-DR, не являлся стабильно поддерживаемым в отсутствие ТСR. Эксперименты по плазмоновому (рентгеновскому) резонансу показывают, что это происходило из-за очень быстрой скорости распада. Полученные эффекты захвата, если SЕА перекрестно пришивает две молекулы МНС класса II, вслед за последовательной полимеризацией TCR, могли бы объяснить, каким образом SЕА может индуцировать пролиферативное действие при концентрациях, много ниже kd. Учитывая, что мутация F47A снижает сродство амино концевого участка ниже значимого, Кd участка с Zn2+ составляет около 95 нМ. Данная гипотеза недавно была подтверждена наблюдением, что мутанты F47R, F47R/H50A и F47R/L48A/H50D проявляют идентичное сродство к МНС класса II, так же как и F47A (неопубликовано).
Недавно была доложена структура комплекса между SЕВ и HLA-DR (Jardetzky et al., Nature 368 (1994) 711-718). Большинство идентифицированных остатков SЕВ, участвующих в данном взаимодействии являются консервативными в SЕА. Наши данные по мутанту D227А показывают слабое сродство взаимодействия между данным участком в SЕА (амино концевой участок) и МНС классом II, имеющим значение kd выше 8 мкМ. Недавно было доложено, что kd взаимодействия между SЕВ и HLA-DR. составляет 1,7 мкМ (Seth et al., Nature (1994) 324-27). Были исследованы различия во взаимодействии между SЕВ, TCR и HLA-DR и было показано, что комплекс между SEB и HLA-DR, не являлся стабильно поддерживаемым в отсутствие ТСR. Эксперименты по плазмоновому (рентгеновскому) резонансу показывают, что это происходило из-за очень быстрой скорости распада. Полученные эффекты захвата, если SЕА перекрестно пришивает две молекулы МНС класса II, вслед за последовательной полимеризацией TCR, могли бы объяснить, каким образом SЕА может индуцировать пролиферативное действие при концентрациях, много ниже kd. Учитывая, что мутация F47A снижает сродство амино концевого участка ниже значимого, Кd участка с Zn2+ составляет около 95 нМ. Данная гипотеза недавно была подтверждена наблюдением, что мутанты F47R, F47R/H50A и F47R/L48A/H50D проявляют идентичное сродство к МНС класса II, так же как и F47A (неопубликовано).
Основываясь на структуре SEB (Kappler et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396) и на линейной гомологии (Marrack and Kappler, Science 248 (1990) 705-711), строго подтверждается, что Нis 225 и Аsр227 расположены в той же β-складке и, таким образом, цепи должны быть проксимальными. Следовательно, наиболее вероятно, что эти два остатка составляют цинк-связывающее ядро, обнаруженное в цинк-координирующих белках (Vallee and Auld, Biochemistry, 29 (1990) 5647-5659). Подобно данным мутантам, мутанты с заменами по остаткам 128 и 187 также являются распознаваемыми всеми моноклонами, за исключением 1Е. Fraser et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1991) 5507-5511) показали, что Zn2+ связывается с SЕА и требуется для высокоаффинного взаимодействия с МНС класса II. Сродство для цинка не изменяется путем добавления HLA-DR. Основываясь на данном наблюдении и высоком сродстве к Zn2+ (Kd около 1 мкМ) было предположено, что координатная связь обеспечивается исключительно SЕА и включает 4 координатных складки. Наши данные отмечают участие четырех остатков N128, Н187, Н225 и D227. Функции двух бывших остатков не ясны; за исключением обеспечения возможной помощи лиганда N128 в депротонировании D227. Одним из аргументов в пользу этого является то, что влияние замены D227 более серьезное, чем замены Н225.
Ранее было доложено, что корреляция между сродством различных суперантигенов к МНС класса II и способностью стимулировать Т клетки к пролиферации отсутствует (Chintagumpala et al., J. Immunol. 147 (1991) 3876-3881). Эти данные возможно частично объясняются различным сродством суперантигенов по отношению к различным Vβ-цепям TCR. Здесь нами обнаружено такое же отсутствие корреляции, но в отличие от отдельных суперантигенов, мутанты проявляют идентичное сродство к ТСR, как показано в контексте Fab-SЕА (определяемого в виде SАDСС). Наиболее вероятным объяснением отсутствия корреляции является то, что две связывающие области, идентифицированные в данном анализе, представляют два различных участка связывания, которые обеспечивают не только кооперативное связывание, но которые приводят к перекрестному сшиванию двух молекул МНС класса II, который, в свою очередь, обеспечивает димеризацию двух молекул рецептора Т клетки. Это означало бы, что сродство обеих участков является важным для получения пролиферативного эффекта. Взаимодействия внутри гексамерного комплекса, включающего две молекулы SЕА, TCR и МНС класса II, приводят к высокой захватываемости. Таким образом, сильное средство/захватываемость SEA по отношению к МНС класса II, дает возможность взаимодействия SЕА с ТСR, несмотря на низкое непосредственное сродство.
Другие дубликаты биоспецифического сродства: Белок слияния SЕА(D227А) и IgG-связывающего домена белка А стафилококка был получен путем рекомбинантной технологии и экспрессируется в E. coli. Данный реактив успешно применяли для нацеливания Т-лимфоцитов на клетки Моt 4 и CCRF-CEM (полученные из АТСС), которые являются CD7 и СD38 позитивными, но HLA-DP, -DQ и -DR негативными. Клетки Моt 4 и CCRF-CEM преинкубировали с анти-СD7 или анти-СD38 моноклонами мыши (Dianova, Hamburg Германия). Для того чтобы усилить связывание между моноклонами мыши и IgG-связывающей частью белка слияния, было также добавлено антитело кролика против Ig мыши.
По сравнению с белком А-SЕА(wt), белок А-SЕА(D 227А) имеет пониженную способность связываться с клетками Daudi, экспрессирующими антиген МНС класса II.
Общее к чертежам : Мутант SЕА(D227А) (=SЕА(m9), или мутант m 9) ко времени даты приоритета был наиболее многообещающим вариантом SЕА. Таким образом, мы отбирали для представления результаты in vitro и in vivo с данным вариантом (фиг. 3-6).
Фиг. 1 представляет схематическое изображение плазмиды, используемой для экспрессии SЕА и C21Fab-SEA. Кодирующие области и два транскрипционных терминатора, следующие за продуктами генов, отмечены прямоугольниками. Ген, кодирующий белок устойчивости к канамицину, отмечен Кm. lacI представляет репрессор гена lac. VH и СH1 отмечают гены, кодирующие Fd фрагмент тяжелой цепи антигена мыши С215. Подобно Vк и Ск отмечают гены, кодирующие каппа цепь. Rop представляет ген, кодирующий белок контроля репликации из рВ322. Промотеры, направляющие транскрипцию продукта генов показаны стрелками, в рК889 промотор trc и в других двух векторах промотор белка A стафилококка (sра). Область, содержащая природу репликации, отмечена ori. Различием между SЕА, кодирующим рКР943 и рКР1055, является только глициновый остаток, добавленный к Н-концу последнего. Ген SЕА, содержащий последний вектор, также содержит несколько уникальных участков для рестрикционных ферментов, введенных путем молчащих мутаций.
Фиг. 2 представляет спектр кругового дихроизма SЕА дикого типа и мутантов F47A и D227А, представляющих мутации с наиболее серьезными редукциями в области связывания каждого МНС класса II. Сплошная линия представляет кривую для дикого типа SЕА. Кривые для мутантов представлены пунктирной или штрихпунктирной линиями для Р47А и D227А соответственно.
Фиг. 3 представляет концентрационную зависимость суперантиген-зависимой опосредованной клеточной цитотоксичности (SDСС) для SЕА(wt) и SEA(D227A).
Фиг. 4 представляет концентрационную зависимость суперантиген-зависимой опосредованной клеточной цитотоксичности (SDСС) для C21Fab-SEA(wt) и C21Fab-SEA (D 227А).
Фиг. 5 представляет концентрационную зависимость суперантиген mab-зависимой опосредованной клеточной цитотоксичности (SADCC) для C215Fab-SEA(wt) и С215Fаb-SЕА(D227А).
Фиг. 6А представляет сравнение терапевтического действия, полученного на С57В1/6 мышах, несущих легочные метастазы клеток меланомы В16-С215 при лечении с C215Fab-SEA(wt) и С215Fаb-SЕА(D227А).
Фиг. 6Б представляет токсическое действие С215-SEA(wt) и С215-SЕА(D227А) при лечении, как представлено на фиг. 6А.
Claims (2)
1. Конъюгат для стимулирования иммунной реакции против клетки-мишени, экспрессирующей эпитоп, специфичный для злокачественной клетки, содержащий моноклональное антитело С215, моноклональное антитело С242 или их антиген - связывающие фрагменты и стафилококковый энтеротоксин А (SEA), содержащий мутацию D227A, проявляющий пониженную способность к связыванию с антигенами МНС класса II по сравнению с нативным SEA и сохранивший способность к связыванию с Vβ Т-клеточного рецептора, причем указанный конъюгат получен с помощью рекомбинантных методик.
2. Способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего, отличающийся тем, что включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества конъюгата, охарактеризованного в п. 1.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9402430-4 | 1994-07-11 | ||
SE9402430A SE9402430L (sv) | 1994-07-11 | 1994-07-11 | Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU97102113A RU97102113A (ru) | 1999-05-10 |
RU2183215C2 true RU2183215C2 (ru) | 2002-06-10 |
Family
ID=20394684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU97102113/13A RU2183215C2 (ru) | 1994-07-11 | 1995-06-07 | Конъюгат для стимулирования иммунной реакции против клетки-мишени, способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7226601B1 (ru) |
EP (1) | EP0766566B1 (ru) |
JP (1) | JP4175489B2 (ru) |
KR (1) | KR100377506B1 (ru) |
CN (1) | CN1089606C (ru) |
AT (1) | ATE200626T1 (ru) |
AU (1) | AU699147B2 (ru) |
CA (1) | CA2194673C (ru) |
DE (1) | DE69520739T2 (ru) |
DK (1) | DK0766566T3 (ru) |
ES (1) | ES2158950T3 (ru) |
FI (1) | FI118150B (ru) |
GR (1) | GR3036187T3 (ru) |
HK (1) | HK1012226A1 (ru) |
HU (1) | HU221254B1 (ru) |
IL (1) | IL114445A (ru) |
MY (1) | MY112916A (ru) |
NO (1) | NO320151B1 (ru) |
NZ (1) | NZ289951A (ru) |
PL (1) | PL180747B1 (ru) |
PT (1) | PT766566E (ru) |
RU (1) | RU2183215C2 (ru) |
SE (1) | SE9402430L (ru) |
TW (1) | TW413636B (ru) |
UA (1) | UA73067C2 (ru) |
WO (1) | WO1996001650A1 (ru) |
ZA (1) | ZA955746B (ru) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE9402430L (sv) * | 1994-07-11 | 1996-01-12 | Pharmacia Ab | Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten |
SE9601245D0 (sv) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Pharmacia Ab | Chimeric superantigens and their use |
TW517061B (en) * | 1996-03-29 | 2003-01-11 | Pharmacia & Amp Upjohn Ab | Modified/chimeric superantigens and their use |
WO1999004820A2 (en) * | 1997-07-21 | 1999-02-04 | Pharmacia & Upjohn Ab | Cytolysis of target cells by superantigen conjugates inducing t-cell activation |
DE19827837A1 (de) * | 1998-06-23 | 1999-12-30 | Ernst Gleichmann | Universell an Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle der Klasse II bindende Peptide zur prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von Sensibilisierungen gegen Chemikalen |
US7491402B2 (en) | 1998-12-24 | 2009-02-17 | Auckland Uniservices Limited | Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof |
SE0102327D0 (sv) | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Active Biotech Ab | A novel engineered superantigen for human therapy |
GB0118155D0 (en) * | 2001-07-25 | 2001-09-19 | Lorantis Ltd | Superantigen |
NZ519371A (en) | 2002-06-04 | 2004-11-26 | Auckland Uniservices Ltd | Immunomodulatory constructs and their uses |
US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8025873B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8007805B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
SE0402025D0 (sv) * | 2004-08-13 | 2004-08-13 | Active Biotech Ab | Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent |
EP1812574A2 (en) * | 2004-11-18 | 2007-08-01 | Avidex Limited | Soluble bifunctional proteins |
BRPI0615026A8 (pt) * | 2005-08-19 | 2018-03-06 | Abbott Lab | imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos |
CN102516392B (zh) * | 2011-11-25 | 2014-05-28 | 孙嘉琳 | 一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途 |
WO2014025199A2 (ko) * | 2012-08-09 | 2014-02-13 | 주식회사 한독 | 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도 |
EA201891601A1 (ru) | 2016-01-10 | 2019-03-29 | Неоткс Терапьютикс Лтд. | Способы и композиции, усиливающие эффективность опосредованной суперантигеном иммунотерапии злокачественных опухолей |
US11583593B2 (en) | 2016-01-14 | 2023-02-21 | Synthis Therapeutics, Inc. | Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses |
CA3104934A1 (en) * | 2018-07-09 | 2020-01-16 | Synthis Therapeutics, Inc. | Antibody-alk5 inhibitor conjugates and their uses |
WO2020230142A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Neotx Therapeutics Ltd. | Cancer treatment |
IL296103A (en) | 2020-03-05 | 2022-11-01 | Neotx Therapeutics Ltd | Methods and preparations for treating cancer with immune cells |
WO2023215560A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Atoosa Corporation | Tumor cell/immune cell multivalent receptor engager – bio-nanoparticle (timre-bnp) |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3627644A (en) | 1968-03-01 | 1971-12-14 | Hajime Okamoto | Process for the cultivation of hemolytic streptococci |
US4237224A (en) | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
US4268434A (en) | 1979-01-09 | 1981-05-19 | Higerd Thomas B | Immunosuppressive extracellular product from oral bacteria |
US5091091A (en) | 1981-11-06 | 1992-02-25 | Terman David S | Protein A perfusion and post perfusion drug infusion |
US4699783A (en) | 1983-03-11 | 1987-10-13 | Terman David S | Products and methods for treatment of cancer |
US4681870A (en) | 1985-01-11 | 1987-07-21 | Imre Corporation | Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production |
IT1192014B (it) | 1986-06-27 | 1988-03-31 | Rubinetterie Mariani Spa | Becco di erogazione per lavabo o simile apparecchio idraulico con comando del salterello |
US4980160A (en) | 1986-10-16 | 1990-12-25 | Biogen, Inc. | Combinations of tumor necrosis factors and anti-inflammatory agents and methods for treating malignant and non-malignant diseases |
DE68907388T2 (de) | 1988-07-22 | 1994-01-05 | Imre Corp | Gereinigte Protein A-Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
SE8903100D0 (sv) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | Pharmacia Ab | New pharmaceutical agent |
US6126945A (en) * | 1989-10-03 | 2000-10-03 | Pharmacia Ab | Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds |
EP1103268B1 (en) | 1990-01-17 | 2005-08-31 | TERMAN, David S. | Use of staphylococcal enterotoxins or related compounds for cancer treatment |
US5858363A (en) * | 1990-07-20 | 1999-01-12 | Pharmacia & Upjohn Ab | Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation |
US6197299B1 (en) * | 1990-07-20 | 2001-03-06 | Pharmacia & Upjohn Ab | Antibody conjugates |
WO1992001470A1 (en) | 1990-07-20 | 1992-02-06 | Kabi Pharmacia Ab | Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation |
WO1993024136A1 (en) | 1991-01-17 | 1993-12-09 | Terman David S | Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds |
SE9102074D0 (sv) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Kabi Pharmacia Ab | Tomour antigen specific antibody |
JPH08500328A (ja) | 1992-01-28 | 1996-01-16 | ナショナル ジューイッシュ センター フォア イミュノロジィ アンド レスパラトリィ メディスン | 突然変異したスーパー抗原の保護作用 |
SE9402430L (sv) * | 1994-07-11 | 1996-01-12 | Pharmacia Ab | Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten |
SE9601245D0 (sv) * | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Pharmacia Ab | Chimeric superantigens and their use |
TW517061B (en) * | 1996-03-29 | 2003-01-11 | Pharmacia & Amp Upjohn Ab | Modified/chimeric superantigens and their use |
SE0102327D0 (sv) * | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Active Biotech Ab | A novel engineered superantigen for human therapy |
-
1994
- 1994-07-11 SE SE9402430A patent/SE9402430L/xx not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-06-07 CA CA002194673A patent/CA2194673C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 US US08/765,695 patent/US7226601B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 HU HU9700063A patent/HU221254B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 PL PL95318162A patent/PL180747B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 CN CN95194071A patent/CN1089606C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 DK DK95926057T patent/DK0766566T3/da active
- 1995-06-07 DE DE69520739T patent/DE69520739T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 PT PT95926057T patent/PT766566E/pt unknown
- 1995-06-07 NZ NZ289951A patent/NZ289951A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 ES ES95926057T patent/ES2158950T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 KR KR1019970700156A patent/KR100377506B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 WO PCT/SE1995/000681 patent/WO1996001650A1/en active IP Right Grant
- 1995-06-07 EP EP95926057A patent/EP0766566B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 AT AT95926057T patent/ATE200626T1/de active
- 1995-06-07 RU RU97102113/13A patent/RU2183215C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 AU AU29940/95A patent/AU699147B2/en not_active Ceased
- 1995-06-07 JP JP50425196A patent/JP4175489B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-01 TW TW084106800A patent/TW413636B/zh not_active IP Right Cessation
- 1995-07-04 IL IL11444595A patent/IL114445A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-07-06 UA UA97020534A patent/UA73067C2/uk unknown
- 1995-07-10 MY MYPI95001925A patent/MY112916A/en unknown
- 1995-07-11 ZA ZA955746A patent/ZA955746B/xx unknown
-
1997
- 1997-01-10 NO NO19970108A patent/NO320151B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-01-10 FI FI970100A patent/FI118150B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-12-14 HK HK98113340A patent/HK1012226A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-07-06 GR GR20010401035T patent/GR3036187T3/el unknown
-
2005
- 2005-07-29 US US11/193,869 patent/US20060062795A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-29 US US11/193,748 patent/US20050260215A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2183215C2 (ru) | Конъюгат для стимулирования иммунной реакции против клетки-мишени, способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего | |
RU2198895C2 (ru) | Конъюгат, обладающий способностью активировать иммунную систему, и фармацевтическая композиция, включающая указанный конъюгат | |
JP4114951B2 (ja) | 改変/キメラスーパー抗原およびその使用 | |
JP4056543B2 (ja) | 非抗原性即素複合体およびインターナライジング受容体システムの融合タンパク | |
AU2005270336B2 (en) | Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent | |
JP2005507870A (ja) | 低毒性のインターロイキン−2突然変異体 | |
KR19980064719A (ko) | 인터로이킨-18-수용체 단백질 | |
JP2003524587A (ja) | 多発性骨髄腫を処置するための、cd38に対する、遺伝子操作した抗体の使用 | |
EP2268297A1 (en) | Modified toxins | |
Scherf et al. | Cytotoxic and antitumor activity of a recombinant tumor necrosis factor-B1 (Fv) fusion protein on LeY antigen-expressing human cancer cells. | |
JP2004507205A (ja) | Ca19−9抗原陽性細胞の検出および除去のためのポリペプチド | |
US20030180799A1 (en) | Antibodies against plasma cells | |
CN118434770A (zh) | 由抗体和突变蛋白组成的融合蛋白 | |
Pastan et al. | Cytotoxic and Antitumor Activity of a Recombinant Tumor Necrosis Factor-B1 (Fv) Fusion Protein on Le’Antigen-expressing Human Cancer Cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20071108 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140608 |