DE69426018T2

DE69426018T2 - Ein mutiertes crp-protein und verfahren und mittel zu dessen herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69426018T2
Application number: DE69426018T
Authority: DE
Inventors: Hans H. Liao; Lawrence A. Potempa
Original assignee: Immtech International Inc
Current assignee: Immtech International Inc
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 2001-02-22
Anticipated expiration: 2014-02-25
Also published as: ES2152976T3; AU6252294A; WO1994018999A1; EP0688224A4; EP0688224A1; DE69426018D1; JPH08507212A; EP0688224B1; ATE196649T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein mutiertes Protein mit mindestens einer der biologischen Aktivitäten von modifiziertem C-reaktivem Protein und Methoden und Materialien zur Herstellung des mutierten Proteins durch rekombinante DNA-Techniken. Diese Erfindung betrifft auch Methoden und Materialien zur Verwendung des mutierten Proteins.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

C-reaktives Protein wurde zuerst von Tillett und Francis [J. Exp. Med., 52, 561-71 (1930)] beschrieben, die feststellten, daß Seren von akut kranken Patienten mit dem C-Polysaccharid der Zellwand von Streptococcus pneumoniae präzipitierten. Später identifizierten andere den reaktiven Serumfaktor als Protein, daher die Bezeichnung "C-reaktives Protein".
C-reaktives Protein (CRP) wird in der Leber synthetisiert und während der Akutphase-Reaktion kann seine Serumkonzentration bis zu 1.000-fach ansteigen. Siehe Gewurz et al., Adv. Int. Med., 27, 345-372 (1982); Kushner, Ann. N. Y. Acad. Sci., 389, 39-48 (1982); Pepys et al., Adv. Immunol., 34, 141-212 (1983). Obwohl die genaue Rolle von CRP in der Akutphase-Reaktion unbekannt ist, wird angenommen, daß es eine wichtige Rolle in der Abwehr des Wirts spielt. Beispielsweise wurde berichtet, daß: (1) CRP Phosphorylcholin bindet, was für CRP eine Rolle als Opsonin für Mikroorganismen und geschädigtes Gewebe, die exponierte Phosphorylcholingruppen aufweisen, nahelegt; (2) CRP Chromatin bindet, was nahelegt, daß eine Wirkung von CRP das Abfangen von Chromatin, das durch Zellyse freigesetzt wurde, sein könnte; (3) CRP Plättchen-aktivierenden Faktor neutralisiert, was nahelegt, daß CRP eine Funktion als Regulator der Aktivitäten von Plättchen und Neutrophilen ausüben könnte; und (4) CRP, das mit bestimmten anderen Molekülen oder Liposomen komplexiert vorliegt, das Komplementsystem aktiviert, was nahelegt, daß CRP die Komplementkaskade auslösen könnte. Siehe Kaplan et al., J. Immunol., 112, 2135-2147 (1974); Vohanakis et at., J. Immunol., 113, 9-17 (1974); Siegel et al., J. Exp. Med., 140, 631-47 ('1974); Siegel et al., J. Exo. Med., 142, 709-21 (1975); Mold et al., J. Exp. Med., 154, 1703-1708 (1981); Narkates et al., Proc. N. Y. Acad. Sci., 389, 172-182 (1982); Nakayama et al., Clin. Exp. Immunol., 54, 319-326 (1983); Robey et al., J. Biol. Chem., 259, 7311-7316 (1984); Robey et al., J. Exp. Med., 161, 1344-56 (1985); Vigo, J. Biol. Chem., 260 3418-3422 (1985); Shephard et al., Clin. Exp. Immunol., 63, 718-27 (1986); Horowitz et al., J. Immunol., 138, 2598-2603 (1987); Tatsumi et al., Clinica Chimica Acta, 172, 85-92 (1988); Du Clos et al., J. Immunol., 141, 4266-4260 (1988); Du Clos et al., J. Immunol., 146, 1220-1225 (1991); Xia et al., FASEB J., 6 1344a (1992).
CRP ist ein Pentamer, das aus fünf identischen Untereinheiten mit jeweils einem Molekulargewicht von etwa 23.500 besteht. Die pentamere Form von CRP wird manchmal als "natives CRP" bezeichnet.
Etwa 1993 wurde eine weitere Form von CRP entdeckt, die als "modifiziertes CRP" oder "mCRP" bezeichnet wird. Modifiziertes CRP hai: im Vergleich zu nativem CRP erheblich verschiedene Ladung, Größe, Löslichkeit und antigene Eigenschaften. Potempa et al., Mol. Immunol., 20, 1165-75 (1983). Modifiziertes CRP unterscheidet sich von nativem CRP hinsichtlich der Bindungseigenschaften, beispielsweise bindet mCRP Phosphorylcholin nicht. Id.; Chudwin et al., J.. Allergy Clin. Immunol., 77, 216a (1986). Schließlich unterscheidet sich mCRP von nativem CRP hinsichtlich seiner biologischen Aktivität. Siehe Potempa et al., Protides Biol. Fluids, 34, 287-290 (1986); Potempa et al., Infiammation, 12, 391-405 (1988).
Die charakteristische Antigenizität von mCRP wurde als "neo-CRP" bezeichnet. Neo- CRP Antigenizität wird exprimiert auf:
(1) denaturiertem CRP, das unter Verwendung geeigneter Bedingungen hergestellt wurde (nachstehend beschrieben),
(2) dem primären Translationsprodukt von für CRP kodierender DNA (prä-CRP), und
(3) CRP, das auf Festoberflächen immobilisiert worden ist.
Potempa et al., Mol. Immunol., 20, 1165-75 (1983); Mantzouranis et al., Ped. Res., Aß, 260a (1984); Samols et al., Biochem. J., 227, 759-65 (1985); Chudwin et al J. Allergy Clin. Immunol., 77, 216a (1986); Potempa et al., Inflammation, 12, 391-405 (1988).
Die neo-CRP Antigenizität kann mit Antikörpern nachgewiesen werden.
Beispielsweise kann ein für neo-CRP spezifisch gemachtes Antiserum verwendet werden. Siehe Potempa et al., Mol. Immunol., 24, 531-41 (1987). Alternativ können die einzigartigen antigenen Determinanten von mCRF' mit monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden. Geeignete monoklonale Antikörper sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 91100872, veröffentlicht am 24. Januar 1991, und in Ying et al., J. Immunol., 143, 221-228 (1989); Ying et al., Immunol., 76, 324- 330 (1992) und Ying et al., Molec. Immunol., 29, 677·-687 (1992) beschrieben.
Ein Molekül, welches mit für neo-CRP spezifischem Antiserum reaktiv ist, wurde auf der Oberfläche von 10-25% der peripheren Blutlymphozyten (vorwiegend NK- und B- Zellen), 80% der Monozyten und 60% der Neutrophilen, und an Gewebeverletzungsstellen identifiziert. Potempa et al., FASEB J., 2, 731a (1988); Bray et al., Clin. Immunol. Newsletter, 8 137-140 (1987); Rees et al., Fed. Proc., 45, 263a (1986). Zusätzlich wurde berichtet, daß mCRP die Ausbildung von Monozyten- Cytotoxizität beeinflussen, die Helferzellfunktion von Monozyten verbessern, IgG- Aggregatinduzierten oxidativen Metabolismus von phagozytischen Zellen potentieren und die Produktion von Interleukin-1, Prostaglandin E und Lipoxygenaseprodukten durch Monozyten steigern kann. Potempa et al., Protides Biol. Fluids, 34, 287-290 (1986); Chu et al., Proc. Amer. Acad. Cancer Res., 28, 344a (1987); Potempa et al., Proc. Amer. Acad. Cancer Res., 28, 344a (1987); Zeller et al., Fed. Proc., 46, 1033a (1987); Potempa et al., Infiammation, 12, 391-405 (1988); Chu et al., Proc. Amer. Acad. Cancer Res., 29, 371a (1988). Chudwin et al., J. Allergy Clin. Immunol., 77, 216a (1986) lehren, daß mCRP in Mäusen, die einer Exposition mit grampositivem Typ 7F Streptococcus pneumoniae ausgesetzt worden waren, eine Protektionswirkung haben kann.
Andere Aktivitäten von mCRP sind entdeckt worden und sind in bestimmten veröffentlichten PCT-Anmeldungen beschrieben. Insbesondere wurde herausgefunden, daß mCRP Immunkomplexe und aggregiertes Immunglobulin bindet, und daher zur Entfernung von Immunkomplexen und aggregiertem Immunglobulin aus Fluiden und zur Quantifizierung von Immunkomplexen verwendet werden kann. Siehe die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 89/09628, veröffentlicht am 19. Oktober 1989. Es wurde auch herausgefunden, daß modifiziertes CRP bei der Behandlung von viralen Infektionen (siehe PCT-Anmeldung WO 93110799), bakteriellen Infektionen, die nicht durch Streptococcen hervorgerufen wurden, und endotoxischem Schock (siehe PCT-Anmeldung WO 93/10800), und Krebs (siehe PCT-Anmeldung WO 93/21944), wirksam ist.
Siehe Gotschlich, Ann. N. Y. Acad. Sci., 557, 9-18 (1989) für eine kurze Übersicht über CRP und mCRP. Kilpatrick und Volanakis, Immunol. Res., 10, 43-53 (1991) liefern eine neuere Übersicht über CRP.
Vor der vorliegenden Erfindung wurde mCRP bevorzugt unter Verwendung von gereinigtem CRP als Ausgangsmaterial hergestellt. Im allgemeinen wurde mCRP aus CRP durch Denaturierung des CRP hergestellt. Beispielsweise könnte CRP denaturiert werden durch: (1) Behandlung mit einer wirksamen Menge Harnstoff (bevorzugt 8 M) in der Gegenwart eines herkömmlichen Chelators (bevorzugt Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Zitronensäure), (2) Einstellen des pH- Werts des CRP auf unterhalb von etwa 3 oder oberhalb von etwa 11-12, oder (3) Erwärmen von CRP auf oberhalb 50ºC während eines ausreichenden Zeitraums um Denaturierung zu verursachen (bevorzugt 2 Minuten bei 63ºC) in der Abwesenheit von Calcium oder in der Gegenwart eines Chelators, wie etwa den vorstehend aufgeführten. Behandlung mit Harnstoff war die bevorzugte Methode. Zusätzlich konnte mCRP aus CRP hergestellt werden durch Adsorption des CRP an Festoberflächen. Es wird angenommen, daß mCRP, das aus CRP hergestellt wurde, gebildet wird durch die Dissoziation der fünf CRP-Untereinheiten, die dann jeweils eine spontane Konformationsänderung eingehen, wobei CRP gebildet wird. Siehe Bray et al., Clin. Immunol. Newsletter, 8 137-140 (1987).
Obwohl biologische Quellen für CRP und Methoden zu dessen Reinigung aus diesen Quellen gut bekannt sind, kann gereinigtes CRP nur in begrenzten Mengen aus solchen Quellen erhalten werden. Demgemäß konnte mCRP nicht in kommerziellen Mengen aus CRP hergestellt werden.
Genomische Klone und cDNA-Klone, die für CRP aus Mensch, Maus und Kaninchen kodieren, sind isoliert worden. Tucci et al., J. Immunol, 131, 2416-2419 (1983); Whitehead et al., Science, 221, 69-71 (1983); Lei et al., J. Biol. Chem., 260, 13377- 83 (1985); Woo et al., J. Biol. Chem., 260, 13384-88 (1985); Hu et al., Biochem., 25, 7834-39 (1986); Samols und Hu, Protides Biol. Fluids, 34, 263-66 (1986); Syin et al., J. Biol: Chem., 261, 5473-79 (1986); Ciliberto et al., Nucleic Acids Res., 15, 5895 (1987); Hu et al., J. Biol. Chem., 263, 1500-1504 (1988); Whitehead et al., Biochem. J., 266, 283-90 (1990). Um pentameres natives CRP zu erhalten, sollten eukaryontische Wirtszellen, bevorzugt Säugerwirtszellen verwendet werden. Siehe Samols und Hu, Protides Biol. Fluids, 34, 263-66 (1986); Hu et al., J. Biol. Chem., 263, 1500-1504 (1988). Durch rekombinante DNA-Techniken könnte somit natives CRP in großen Mengen hergestellt werden und danach wie vorstehend beschrieben in mCRP überführt werden. Es wäre jedoch günstig, über eine direkte Methode zur Herstellung von mCRP oder eines Moleküls mit den biologischen Aktivitäten von mCRP zu verfügen, mittels rekombinanter DNA-Techniken.
Wie vorstehend angemerkt, wurde festgestellt, daß das primäre Translationsprodukt von CRP mRNA (prä-CRP) neo-CRP Antigenizität exprimiert. Demgemäß könnte mCRP durch Auswahl von Bedingungen, so daß die CRP-Untereinheiten in der Wirtszelle nicht zu pentamerem, nativem CRP zusammengesetzt werden, hergestellt werden. Dies kann erreicht werden durch Expression eines genomischen CRP-Klons oder eines cDNA-CRP-Klons in einem prokaryontischen Wirt. Siehe Samols und Hu, Prot. Biol. Fluids, 34, 263-66 (1986).
Bei dem Versuch, mCRP auf diese Weise herzustellen, haben die Anmelder herausgefunden, daß das Produkt eines in Escherichia coli exprimierten CRP cDNA- Klons aus Aggregaten von CRP-Untereinheiten und/oder präCRP- und CRP- Fragmenten sowie freien CRP-Untereinheiten und/oder präCRP besteht. Dieses cDNA-Produkt ist extrem unlöslich und seine Reinigung hat sich als problematisch herausgestellt. Insbesondere haben die Anmelder herausgefunden, daß ein erheblicher Anteil der Aggregate in diesen Präparationen durch kovalente Vernetzung gebildet werden, und solche vernetzte Aggregate müssen verworfen werden, wodurch die Ausbeuten erheblich verringert werden.
Es wäre daher höchst wünschenswert, wenn man in der Lage wäre, eine mutierte CRP-Untereinheit oder ein mutiertes präCRP-Molekül mit den biologischen Aktivitäten von mCRP herzustellen, das aber weniger zur Bildung kovalent vernetzter Aggregate neigt als das nicht-mutierte Protein, um die Verarbeitung und Reinigung einfacher und effizienter zu gestalten. Die vorliegende Erfindung stellt mutierte Proteine mit diesen Eigenschaften bereit, und diese mutierten Proteine können, wie nachstehend weiter beschrieben, durch ortsgerichtete (site-directed) Mutagenese einer CRP-cDNA oder eines genomischen CRP-Klons hergestellt werden.
Agrawal et al., FASEB J., 6, 1427a (1992) berichten über die Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese eines CRP cDNA-Klons, um die strukturellen Determinanten der Phosphorylcholin-Bindungsstelle von CRP zu untersuchen. Es wurden acht mutierte rekombinante CRPs hergestellt: Tyr40 4 Phe; GIu42 4 Gln; Tyr4 → 4 Phe und Glu42 → 4 Gln; Lys57→ 4 Gln; Arg58→ 4 Gly; Lys57 → 4 Gln und Arg58 → Gly; Trp67 → 4 Lys; und Lys57 → 4 Gln, Arg58 → 4 Gly und Trp67 → 4 Lys. Die Autoren mutmaßten, daß Trp67 für die Struktur der Phosphorylcholin-Bindungsstelle von CRP kritisch ist, daß Lys57 und Arg58 ebenfalls an der Bildung dieser Bindungsstelle beteiligt sind, und daß das Tetrapeptid 39-Phe-Tyr-Thr-Glu nur eine geringe oder keine Rolle bei der Bildung dieser Bindungsstelle spielt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein mutiertes Protein bereit, welches die gleiche Aminosäuresequenz wie eine nicht-mutierte CRP-Untereinheit oder ein nichtmutiertes präCRP hat, außer daß mindestens eine Aminosäure der nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder des nicht-mutierten präCRP deletiert ist, mindestens eine Aminosäure der nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder des nicht-mutierten präCRP gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, mindestens eine Aminosäure zu der nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder dem nicht-mutierten präCRP hinzugefügt ist, oder eine Kombination solcher Änderungen durchgeführt worden ist. Die eine oder mehreren hinzugefügten, deletierten und/oder ausgetauschten Aminosäuren sind derart ausgewählt, daß das mutierte Protein weniger zur Bildung kovalent vernetzter Aggregate neigt als die nicht-mutierte CRP-Untereinheit oder das nichtmutierte präCRP. Das mutierte Protein weist auch mindestens eine der biologischen Aktivitäten von mCRP auf.
Die Erfindung stellt weiterhin ein DNA-Molekül, welches für das erfindungsgemäße mutierte Protein kodiert, und einen Vektor zur Expression des mutierten Proteins bereit. Der Vektor umfaßt eine für ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein kodierende DNA-Sequenz, die operativ mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft ist.
Weiterhin wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die transformiert worden ist, so daß sie DNA, die für ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein kodiert, enthält. Die für das mutierte Protein kodierende DNA ist operativ mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen mutierten Proteins bereit. Das Verfahren umfaßt das Kultivieren einer Wirtszelle, die transformiert worden ist, so daß sie DNA, die für ein mutiertes Protein kodiert, enthält. Die für das mutierte Protein kodierende DNA ist operativ mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft. Das Kultivieren findet unter Bedingungen statt, die eine Expression des mutierten Proteins gestatten.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Verwendung des erfindungsgemäßen mutierten Proteins bereit. Insbesondere haben die erfindungsgemäßen mutierten Proteine mindestens eine der biologischen Aktivitäten von mCRP und können so verwendet werden, wie mCRP verwendet würde. Beispielsweise binden die erfindungsgemäßen mutierten Proteine aggregiertes Immunglobulin und Immunkomplexe. Sie können daher wie mCRP zur Entfernung von aggregiertem Immunglobulin und Immunkomplexen aus Fluiden, zur Quantifizierung von Immunkomplexen und zur Senkung der Gehalte von Immunkomplexen in einem Säuger, bei dem Bedarf dafür besteht, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine können auch zur Behandlung von viralen Infektionen, bakteriellen Infektionen, endotoxischem Schock und Krebs verwendet werden.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Vorrichtung zur Entfernung von aggregiertem Immunglobulin und Immunkomplexen aus Fluiden bereit. Die Vorrichtung umfaßt eine Festoberfläche, an die ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein gebunden ist. Die Vorrichtung umfaßt auch ein Gehäusemittel für die Festoberfläche, so daß das Fluid mit der Festoberfläche in Kontakt gebracht werden kann.
Die Erfindung stellt auch ein Kit zur Quantifizierung von Immunkomplexen bereit. Das Kit umfaßt einen Behälter eines oder mehrerer erfindungsgemäßer mutierter Proteine.
Schließlich stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine erfindungsgemäßes mutiertes Protein in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und einem bilderzeugenden Mittel, umfassend ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein, das markiert ist, um den Nachweis von Immunkomplexen oder Krebszellen in einem Säuger zu ermöglichen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1A ist ein Diagramm einer Serie von Polymerase-Kettenreaktionen, die zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen mutierten Proteins verwendet wurden.
Fig. 1 B ist eine Restriktionskarte von Plasmid pIT4.
Die Fig. 2A und 2B erläutern die Herstellung von Plasmid pIT3.
Die Fig. 3A-D sind Elutionsprofile von Materialien, die einer Chromatographie über eine Q-Sepharose Fast FlowR Säule (Pharmacia) unterzogen worden waren.
Fig. 3A ist natives CRP, Fig. 3B ist mCRP, Fig. 3C ist rekombinantes Wildtyp- CRP und Fig. 3D ist ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein.
Fig. 4 ist ein mit Coomassie-Blau angefärbtes PhastGelR (Pharmacia) SDS-PAGE Gel.
Die Fig. 5A-B sind Graphen der Ergebnisse von ELISA-Assays zum Nachweis der Gegenwart von antigenen Determinanten von nativem CRP und mCRP auf rekombinantem Wildtyp-CRP.
Die Fig. 5C-D sind Graphen der Ergebnisse von ELJSA-Assays zum Nachweis der Gegenwart von antigenen Determinanten von mCRP auf rekombinantem Wildtyp-CRP und einem erfindungsgemäßen mutierten Protein, welche beide mittels Chromatographie über eine Q-Sepharose Fast FIowR Säule gereinigt worden waren.
Die Fig. 6A-B sind Graphen der Ergebnisse von ELISA-Assays zum Nachweis der Bindung von aggregiertem IgG und monomerem IgG.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER DERZEIT BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine haben im Vergleich zu einer nichtmutierten CRP-Untereinheit oder einem nicht-mutierten präCRP mindestens eine Aminosäure hinzugefügt, deletiert oder ausgetauscht. Die mutierten Proteine können jedoch im Vergleich zu einer nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder einem nichtmutierten präCRP mehrere Aminosäureänderungen aufweisen. Beispielsweise können die mutierten Proteine im Vergleich zu einer nicht-mutierten CRP- Untereinheit oder einem nicht-mutierten präCRP mehrere Aminosäurehinzufügungen, mehrere Aminosäuredeletionen, mehrere Aminosäureaustausche oder eine Kombination von Aminosäurehinzufügungen, -deletionen oder -austauschen aufweisen.
Die eine oder mehreren hinzugefügten, deletierten und/oder ausgetauschten Aminosäuren sind derart ausgewählt, daß das mutierte Protein weniger zur Bildung kovalent vernetzter Aggregate neigt als die nicht-mutierte CRP-Untereinheit oder nichtmutiertes präCRP. Geeignete Aminosäureänderungen umfassen die Deletion oder den Austausch mindestens eines, bevorzugt aller Cysteine in einer nichtmutierten CRP-Untereinheit oder einem nicht-mutierten präCRP. CRP-Untereinheiten enthalten zwei Cysteine und präCRPs enthalten drei Cysteine, und es wird angenommen, daß manche diese Cysteine intermolekulare Disulfidbrücken ausbilden, wodurch sie zur Bildung kovalent vernetzter Aggregate beitragen. Daher werden wünschenswert eines oder bevorzugt beide dieser Cysteine deletiert oder ausgetauscht. Wenn die Cysteine gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden, werden sie bevorzugt gegen Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin oder Methionin ausgetauscht, aber es kann jede Aminosäure verwendet werden. Am meisten bevorzugt ist der Austausch gegen Alanin.
Lysin und derivatisierte Lysinreste können ebenfalls zu einer intermolekularen kovalenten Vernetzung beitragen. Dementsprechend können geeignete Aminosäureänderungen auch die Deletion oder den Austausch mindestens eines der Lysine in einer nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder einem nicht-mutierten präCRP umfassen.
Als ein Ergebnis der in ihnen vorhandenen Aminosäureänderungen sind die erfindungsgemäßen mutierten Proteine einfacher, mil: erheblich höheren Ausbeuten, zu reinigen als nicht-mutierte CRP-Untereinheiten oder nicht-mutierte präCRPs. Das Endprodukt liegt auch mit deutlich höherer Reinheit vor als das mit nicht-mutierten CRP-Untereinheiten oder nicht-mutierten präCRPs erhaltene, mit erheblich weniger Aggregaten und Fragmenten (siehe z. B. Beispiel 1).
Nicht alle der Aminosäurehinzufügungen, -deletionen und -austausche müssen zu der verringerten Wahrscheinlichkeit, kovalent vernetzae Aggregate auszubilden, beitragen, solange die kombinierte Wirkung aller dieser Änderungen eine Verringerung von intermolekularer kovalenter Vernetzung ist. Beispielsweise können die rekombinanten DNA-Manipulationen, die zur Erzeugung der mutierten Proteine verwendet werden, auf eine Hinzufügung von Aminosäuren an den Amino- oder Carboxy-terminalen Enden der CRP-Untereinheit hinauslaufen. Dies ist akzeptabel, solange diese Aminosäuren nicht zur Erzeugung kovalent vernetzter Aggregate beitragen (siehe z. B. Beispiel 1). Zusätzlich können manche der Aminosäureänderungen für andere Zwecke durchgeführt werden. Beispielsweise ist es erwünscht, Aminosäureänderungen durchzuführen, welche die Löslichkeit des resultierenden mutierten Proteins in wäßrigen Lösungen erhöhen, da ein besser lösliches mutiertes Protein leichter zu reinigen und zu bearbeiten ist. Geeignete Aminosäureänderungen zur Erhöhung der Löslichkeit umfassen die Deletion einer oder mehrerer hydrophober Aminosäuren, den Austausch einer oder mehrerer hydrophober Aminosäuren gegen geladene Aminosäuren, das Hinzufügen einer oder mehrerer geladener Aminosäuren, oder eine Kombination dieser Änderungen. Aus den oben angegebenen Gründen kann es jedoch erwünscht sein, das Hinzufügen von Lysinresten zu vermeiden. Wäßrige Medien umfassen Wasser, Salzlösung, Puffer, Kulturmedien und Körperfluide.
Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine weisen auch mindestens eine der biologischen Aktivitäten von mCRP auf. Wie hierin verwendet bezieht sich "biologische Aktivität" auf andere Eigenschaften von rnCRP als dessen physikalische und chemische Eigenschaften. Die biologischen Aktivitäten von mCRP umfassen dessen Fähigkeit, aggregiertes immunglobulin und Immunkomplexe zu binden, was die Verwendung von mCRP zur Entfernung von aggregiertem Immunglobulin und von Immunkomplexen aus Fluiden (wie etwa Antikörperreagenzien und Körperfluiden), zur Quantifizierung von Immunkomplexen und zur Senkung der Gehalte von Immunkomplexen in einem Säuger, bei dem Bedarf dafür besteht, gestattet. Die biologischen Aktivitäten von mCRP umfassen auch dessen Wirksamkeit bei der Behandlung von viralen Infektionen, bakteriellen Infektionen, endotoxischem Schock und Krebs.
Beispielsweise wurde herausgefunden, daß die erfindungsgemäßen mutierten Proteine aggregiertes Immunglobulin und Immunkomplexe binden können. Die Bindung des aggregierten Immunglobulins oder von Immunkomplexen kann bewirkt werden durch direkte Zugabe eines mutierten Proteins zu einem Fluid, welches aggregiertes Immunglobulin oder Immunkomplexe enthält, oder es kann zunächst ein mutiertes Protein an einem Festphasenträger immobilisiert werden, bevor es mit dem das aggregierte Immunglobulin oder Immunkomplexe enthaltenden Fluid in Kontakt gebracht wird. Wenn das mutierte Protein an einen Festphasenträger gebunden ist, können bei Verwendung für diagnostische Assays Fluide statisch mit dem immobilisierten mutierten Protein inkubiert werden, oder es können bei Verwendung zur therapeutischen Behandlung, um in einem Körperfluid vorhandene Immunkomplexe zu binden, in einer Vorrichtung außerhalb des Körpers Fluide dynamisch über das immobilisierte mutierte Protein geführt werden.
Geeignete Festphasenträgermaterialien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können aus Harz auf Agarose-Basis, Polyacrylamid, Polymethyl methacrylat, Polycarbonat, Polysulfon, Polyacrylonitril, Polyethylen, Polypropylen, Latex, Dextran, Glas, Nylon, Polyvinylalkohol, Gelen, Ton, Cellulosederivaten, und jedem anderen hydrophoben oder hydrophilen Polymermaterial sein. Der Festphasenträger kann in Form von Kugeln vorliegen, zur Verwendung in einer Säule, kann in Form der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorliegen, kann in Form einer Hohlfasermembran vorliegen oder kann andere Formen annehmen, wie nachstehend ausgeführt. Säulen und Festphasenmaterialien sind in den Vereinigten Staaten kommerziell erhältlich von Bio Rad Laboratories (Richmond, CA), Pierce Chemical Co. (Rockford, IL), Pall Biosupport (Glen Cove, NY), Micro Membranes (Newark, NJ), Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala, Schweden) und anderen.
Das mutierte Protein kann durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung an dem Festphasenträger immobilisiert werden. Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen an Festphasenträgern sind in der Technik gut bekannt. Beispielsweise können mutierte Proteine an Festphasenträgern immobilisiert werden durch einfaches Inkubieren des mutierten Proteins mit dem Festphasenträger, wobei das mutierte Protein adsorbiert wird.
Um eine maximale Bindung von aggregiertem Immunglobulin oder Immunkomplexen an das mutierte Protein sicherzustellen, kann ein Verknüpfungsmittel verwendet werden, um die Anheftung des mutierten Proteins an Polymermaterialien zu sichern. Das mutierte Protein kann kovalent oder nicht-kovalent an der Oberfläche des Polymermaterials mit dem Verknüpfungsmittel immobilisiert werden. Bei dieser Erfindung werden Verknüpfungsmittel vor Zugabe des mutierten Proteins als Bestandteil der Polymerfeststoffoberfläche eingebaut oder darauf derivatisiert. Die Verknüpfungsmittel sind herkömmlich, sie umfassen Dümidester, Carbodiimid, Perjodat, Alkylhalogenide, Dimethylpimelimidat und Dimaleimide [Siehe Blait, A. H., und Ghose, T. I., J. Immunol. Methods, 59 : 129 (1983); Blair, A. H., und Ghose, T. I., Cancer Res., 41 : 2700 (1981); Gauthier et al., J. J. Expr. Med., 156 : 766-777 (1982)].
Die Konjugation des mutierten Proteins an das Verknüpfungsmittel erfordert im allgemeinen anfangs eine Modifikation von Protein-Aiminosäure-R-Gruppen oder des Vernetzungsmittel oder von beiden. Derartige Modifikationen können dazu dienen, R- Gruppen (z. B. Carbodümid-O-Acyl Harnstoff, Intermediatbildung mit Asparaginsäure-, Glutaminsäure- und C-terminalen Carboxylresten) selektiv zu aktivieren, um eine Reaktion mit geeigneten verfügbaren funktionellen Gruppen des Mittels (Amingruppen im Falle von Carbodiimid) zu ermöglichen. Modifikationen können auch die Einführung eines neuen reaktiven Rests beinhalten (z. B. N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)propionat), was Pyridyldithiogruppen an epsilon-Aminoresten von Lysin einführt. Dies ermöglicht die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen Protein und Verknüpfungsmittel. In manchen Fällen werden bifunktionelle Kopplungsmittel eingesetzt, welche Brücken zwischen den Protein-R-Gruppen und dem fraglichen Verknüpfungsmittel ausbilden.
Die mutierten Proteine können verwendet werden zur Entfernung von aggregiertem Immunglobulin oder Immunkomplexen aus Fluiden, die zur Forschung, in therapeutischen Verfahren oder in diagnostischen Tests verwendet werden, z. B. Lösungen, enthaltend monoklonale Antikörper, Antiseren, derivatisierte Reagenzien, intravenöses Gammaglobulin oder isolierte Blutkomponenten. Die Gegenwart von aggregiertem Immunglobulin in derartigen Fluiden kann erwartet werden aufgrund von Bearbeitungsschritten, die zur Herstellung dieser Fluide verwendet werden, wie etwa eine Wärmebehandlung von Antiseren zur Inaktivierung von Komplement. Das mutierte Protein kann zur Entfernung von aggregierten oder komplexierten Immunglobulinen aus solchen Fluiden an einen Festphasenträger gebunden sein. Geeignete Festphasenträger sind die vorstehend beschriebenen und das mutierte Protein ist auf die vorstehend beschriebenen Arten an sie gebunden. Alternativ kann das mutierte Protein solchen Fluiden direkt zugesetzt werden, um die aggregierten oder komplexierten Immunglobuline zu entfernen.
Erfindungsgemäße mutierte Proteine können auch zur Entfernung von Immunkomplexen aus Körperfluiden, wie etwa Gesamtblut oder Plasma, verwendet werden, durch in Kontakt Bringen des Fluids mit dem mutierten Protein. Das mutierte Protein kann dem Körperfluid direkt zugesetzt werden oder kann an einem Festphasenträger immobilisiert werden und danach mit dem Körperfluid in Kontakt gebracht werden. Geeignete Festphasenträger sind die vorstehend beschriebenen und das mutierte Protein ist auf die vorstehend beschriebenen Arten an sie gebunden.
Anhaltend hohe Gehalte von Immunkomplexen können in Erkrankungen wie etwa Krebs, Autoimmunerkrankungen, Arthritis und Infektionen angetroffen werden. Die fortgesetzte Gegenwart von Immunkomplexen im Kreislauf und ihre Ablagerung in Geweben trägt zu einer eingeschränkten Funktion des Immunsystems und entzündlicher Pathologie bei. Dementsprechend sollte eine Verringerung des Gehalts von Immunkomplexen günstig sein. Siehe Theofilopoulos et al., Adv. Immunol., 28, 90-220 (1979); Theofilopoulos et al., Immunodiagnostics on Cancer, Seite 896 (1979).
Für eine derartige therapeutische Verwendung kann das mutierte Protein mit dem Körperfluid in Kontakt gebracht werden durch Führen des Bluts, Plasma oder anderen Fluids durch eine extrakorporale Vorrichtung mit einem Festphasenträger, der mit dem mutierten Protein beschichtet ist. Die Vorrichtung wird auch ein Gehäusemittel für den Festphasenträger aufweisen, so daß das Fluid das an den Festphasenträger gebundene mutierte Protein kontaktieren kann. Das Blut, Plasma oder andere Körperfluid wird dynamisch durch die Vorrichtung zirkuliert, so daß die darin enthaltenen Immunkomplexe gebunden und entfernt werden, wie z. B. in herkömmlichen Plasmapherese- und Hämodialysetechniken. Die Fluide können in den Körper rückgeführt werden, wodurch die Erfordernis für Blutaustauschtherapie entfällt.
Der Festphasenträger und das Gehäusemittel der exarakorporalen Vorrichtung können aus jedem biokompatiblem Material sein. Beispielsweise kann der Festphasenträger eine Membranoberfläche, Kugeln auf Agarose-Basis, oder Hohlfasern sein, die mit dem mutierten Protein beschichtet ist bzw. sind. Die extrakorporale Vorrichtung kann eine mit Kugeln gepackte Säule oder ein Zylinder, der eine Hohlfasermembran umgibt, sein. Die Vorrichtung kann auch geeignete Schläuche umfassen, um einen Patienten an sie anzuschließen, und eine Pumpe, um die Passage des Fluids durch die Vorrichtung und zurück zum Patienten zu unterstützen, und um den Eintritt von Luft in das System zu verhindern. Insbesondere können in der Praxis der vorliegenden Erfindung herkömmliche Plasmapheresevorrichtungen verwendet werden, wobei man sie derart modifiziert, daß sie einen Festphasenträger enthalten, auf dem mutiertes Protein immobilisiert ist. Siehe z. B. Randerson et al., Art. Organs, 6 43-49 (1982); Smith et al., Cleve Clin. 2, 51, 135-142 (1984); Nilsson et al., Plasma Ther. Transfus. Technol., 5, 127-134 (1984); Nilsson et al., in Affinity Adsorption of Inhibitors, Seiten 223-241 (Hrsg. Hoyer, 1984); Liberti, "Development Of A Universal Immune Specific Filtration Device (Blood Filter)", präsentiert in Opportunities In The Oncology Marketplace; Mittelman et al., Seminars in Hematology, 26, 15-18 (1989); US-Patent Nr. 4,432,871, erteilt am 21. Februar 1984; US-Patent Nr. 4,551,435, erteilt am 5. November 1985; US-Patent Nr. 4,614,513, erteilt am 30. September 1986, die alle herkömmliche Plasmapheresevorrichtungen beschreiben.
Für eine therapeutische Verwendung muß die Vorrichtung sterilisiert werden. Sterilisierung kann in herkömmlicher Weise wie etwa mittels Dampf, Hitze, Spülen mit Ethylenoxid oder Bestrahlung bewirkt werden.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Immunkomplexen, umfassend das in Kontakt Bringen der Immunkomplexe mit einem erfindungsgemäßen mutierten Protein, so daß die Immunkomplexe an das mutierte Protein binden. Das mutierte Protein kann direkt zu Fluiden, welche die Immunkomplexe enthalten, zugegeben werden um Immunkomplexe in den Fluiden nachzuweisen oder zu quantifizieren. Alternativ kann das mutierte Protein auf einem Festphasenträger immobilisiert werden, bevor es mit Immunkomplexe enthaltenden Fluiden in Kontakt gebracht wird. Das mutierte Protein kann auch direkt zu Zellen oder einer Gewebeprobe, mit Immunkomplexen darauf, zugegeben werden, und ein markiertes mutiertes Protein kann einem Säuger gespritzt werden, so daß es sich in Bereichen des Säugerkörpers anreichert, in denen Immunkomplexe angetroffen werden, wie etwa Entzündungsbereichen.
Geeignete Materialien für Festphasenträger sind die vorstehend beschriebenen und mutiertes Protein wird auf die vorstehend beschriebenen Arten auf ihnen immobilisiert. Für diagnostische Assays umfassen geeignete Festphasenträger die herkömmlich für Immungssays verwendeten. Beispielsweise kann der Festphasenträger Testgefäße, die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, Latexkugeln, Glaskugeln, andere Kugeln, Filterpapier, Glasfaser-Filterpapier, oder Eintauchstäbchen aus beispielsweise Polycarbonat, Polysulfon oder Latex sein.
Zum Nachweis oder der Quantifizierung der Immunkomplexe kann markiertes mutiertes Protein verwendet werden. Die in der Erfindung geeigneten Markierungen sind die in der Technik bekannten, wie etwa Enzym, fluoreszierende, biolumineszierende, chemilumineszierende und radioaktive Markierungen und Biotin.
Alternativ können die Immunkomplexe unter Verwendung herkömmlicher Immungssay-Techniken durch Zugabe einer markierten Komponente, die an die Immunkomplexe bindet, nachgewiesen oder quantifiziert werden. Geeignete markierte Komponenten umfassen herkömmliche, in Immungssays verwendete Reagenzien. Beispielsweise könnten markierte Antikörper, die gegen das Immunglobulin oder das in den Immunkomplexen vorhandene Antigen gerichtet sind, verwendet werden, oder es könnte markiertes Protein A, das an den Fc-Teil von Immunglobulinen bindet, verwendet werden. Die verwendeten Markierungen sind die vorstehend beschriebenen.
Geeignete herkömmliche Immungssay-Techniken umfassen Agglutination, Radioimmungssays, Enzymimmungssays und Fluoreszenzassays. Beispielsweise können Latexkugeln mit dem mutierten Protein beschichtet werden, zur Verwendung in Agglutinationsassays, oder Eintauchstäbchen, zur Verwendung in qualitativen oder semiquantitativen Immungssays. Enzymverknüpfte 1 mmunsorbensassays (EIA, enzyme-linked immuno sorbent assay) sind bevorzugt, da sie ein Mittel zur sensitiven Quantifizierung der Gehalte von Immunkomplexen bereitstellen. Im allgemeinen kann jede Immungssay-Technik verwendet werden, die eine feststellbare Eigenschaftsänderung hervorruft.
Unabhängig von dem auch immer verwendeten Assay können die spezifischen Konzentrationen von Reagenzien, die Inkubationsternperaturen und -zeiten sowie andere Assaybedingungen variiert werden, um Immunkomplexe in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Konzentration der Immunkomplexe in der Probe, der Art der Probe und dergleichen nachzuweisen oder zu quantifizieren. Der Fachmann ist durch routinemäßiges Ausprobieren in der Lage, für jede Bestimmung operative und optimale Assaybedingungen zu ermitteln. Da Körperfluide aus Säugern normalerweise Immunkomplexe enthalten, wird ein Vergleich der Gehalte von Immunkomplexen in einer Testprobe aus einem Säuger mit den in Normalen aufgefundenen Gehalten durchgeführt werden müssen, um Gehalte von Immunkomplexen zu identifizieren, die eine Erkrankung anzeigen.
Ein Testkit zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Immunkomplexen ist ebenfalls Teil der Erfindung. Das Kit umfaßt einen Behälter mit einer Lösung von mutiertem Protein oder an einen Festphasenträger gebundenes mutiertes Protein. Die Festphasenträger sind die vorstehend beschriebenen Typen und das mutierte Protein ist wie vorstehend beschrieben daran gebunden. Der Behälter könnte somit eine Flasche sein, die eine Lösung von mutiertem Protein enthält, ein mit mutiertem Protein beschichtetes Eintauchstäbchen, das in einer Schutzverpackung eingeschlossen ist, eine Flasche, die mit mutiertem Protein beschichtete Latexkugeln enthält, oder eine Mikrotiterplatte, deren Vertiefungen mit mutiertem Protein beschichtet sind.
Das mutierte Protein kann markiert sein, wenn es zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Immunkomplexen verwendet werden soll. Alternativ kann das Kit weiterhin einen Behälter umfassen, der eine markierte Komponente enthält, welche den Nachweis oder die Quantifizierung der Immunkomplexe durch Bindung an die Immunkomplexe oder an das mutierte Protein gestattet. Geeignete markierte Komponenten wurden vorstehend beschrieben.
Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine können einem Säuger verabreicht werden um den Gehalt von Immunkomplexen in dem Säuger zu verringern. Es wird angenommen, daß bei Einbringen des mutierten Proteins in ein die Immunkomplexe enthaltendes Körperfluid des Säugers die löslichen Immunkomplexe an physikalischer Größe zunehmen und präzipitieren (aus der Lösung ausfallen) oder andersartig modifiziert werden, wodurch ihre Entfernung durch Phagozyten verstärkt wird. Zur Verringerung des Gehalts von Immunkomplexen in einem Säuger wird dem Säuger eine wirksame Menge eines mutierten Proteins durch Injektion, bevorzugt durch intravenöse Injektion verabreicht.
Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine können auch zur Behandlung von viralen Infektionen verwendet werden. Sie können zur Behandlung jedes Typs von viralen Infektionen, wie etwa von Retroviridae-Infektionen verwendet werden. Die Retroviridae sind eine Familie von kugelförmigen umhüllten RNA-Viren, die drei Subfamilien umfaßt: Oncovirinae, Spurmavirinae und Lentivirinae. Hull et al., Virology: Directory & Dictionary of Animal. Bacterial and Plant Viruses, Seite 191 (Stockton Press 1989). Die Replikation beginnt mit reverser Transkription von Virus- RNA zu DNA, welche in die chromosomale DNA des Wirts integriert wird. Id. Endogene Onkoviren sind unter Wirbeltieren weit verbreitet und sind mit vielen Erkrankungen assoziiert. Id. Die Lentiviren umfassen HIV-1 und SIV. Fauci, Science 239, 617-622 (1988).
Zur Behandlung von viralen Infektionen in einem Säuger wird dem Säuger eine wirksame Menge eines mutierten Proteins verabreicht. Das mutierte Protein wird dem Säuger bevorzugt verabreicht, bevor die Infektion zu ernsthaft ist. Am meisten bevorzugt wird das mutierte Protein beim ersten Anzeichen einer viralen Infektion oder prophylaktisch denjenigen verabreicht, die einem Risiko ausgesetzt sind, virale Infektionen zu entwickeln. Beispielsweise kann das mutierte Protein prophylaktisch Blutern oder Chirurgiepatienten verabreicht werden, die Blut empfangen könnten, das mit einem Virus wie etwa HIV-1 oder Hepatitis kontaminiert ist. Natürlich kann ein mutiertes Protein einem Säuger verabreicht werden, der bereits an einer viralen Infektion leidet.
Das mutierte Protein wird dem Säuger, der an einer viralen Infektion leidet, im allgemeinen durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) verabreicht. Bevorzugt wird intravenöse Injektion verwendet. Das mutierte Protein kann in einem Fluid oder eingekapselt in Liposomen injiziert werden. Das mutierte Protein kann auch topisch, z. B. auf eine Wunde oder einen anderen Infektionsort, aufgebracht werden. Schließlich sollte es möglich sein, das mutierte Protein mittels eines Sprays zur Behandlung respiratorischer Infektionen zu verabreichen.
Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine können auch zur Behandlung bakterieller Infektionen, insbesondere Infektionen gramnegativer Bakterien, und von endotoxischem Schock verwendet werden. Endotoxine sind die Lipopolysaccharid- Komponenten der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, die viele der widrigen systemischen Reaktionen und schwerwiegenden Folgeerscheinungen bei Blutvergiftung und gramnegativer Bakteriämie auslösen.
Zur Behandlung einer bakteriellen Infektion oder von endotoxischem Schock in einem Säuger wird dem Säuger eine wirksame Menge eines mutierten Proteins verabreicht. Das mutierte Protein wird dem Säuger bevorzugt verabreicht, bevor dis bakterielle Infektion zu ernsthaft wird und septischer Schock oder endotoxischer Schock ausgebildet worden ist. Am meisten bevorzugt wird das mutierte Protein beim ersten Anzeichen einer bakteriellen Infektion oder prophylaktisch denjenigen verabreicht, die einem Risiko ausgesetzt sind, bakterielle Infektionen zu entwickeln. Beispielsweise kann das mutierte Protein prophylaktisch Chirurgiepatienten oder Intensivpatienten verabreicht werden, die einem Risiko ausgesetzt sind, bakterielle Infektionen zu entwickeln. Natürlich kann ein mutiertes Protein einem Säuger verabreicht werden, der bereits an einer bakteriellen Infektion leidet oder bereits an septischem Schock oder endotoxischem Schock leidet.
Das mutierte Protein wird dem Säuger, der an einer bakteriellen Infektion oder endotoxischem Schock leidet, im allgemeinen durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) verabreicht. Bevorzugt wird es durch intravenöse Injektion verabreicht. Das mutierte Protein kann in einem Fluid oder eingekapselt in Liposomen verabreicht werden. Das mutierte Protein kann auch topisch, z. B.. auf eine Wunde oder einen anderen Infektionsort, aufgebracht werden und es sollte möglich sein, das mutierte Protein mittels eines Sprays zur Behandlung respiratorischer Infektionen zu verabreichen.
Schließlich können die erfindungsgemäßen mutierten Proteine zur Behandlung von Krebs verwendet werden. Es wird erwartet, daß die erfindungsgemäßen mutierten Proteine zur Behandlung einer Reihe von Krebsarten, umfassend aber nicht beschränkt auf Adenokarzinom, Lymphom, Fibrosarkom und Leukämie, und zur Verringerung der Metastasierung verwendet werden können. Das mutierte Protein sollte dem Säuger verabreicht werden, wenn die Gegenwart von Krebszellen in dem Säuger zum ersten Mal nachgewiesen worden ist.
Zur Behandlung von Krebs wird das mutierte Protein dem Säuger bevorzugt durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) verabreicht. Das mutierte Protein kann in einem Fluid oder eingekapselt in Liposomen verabreicht werden.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die Dosis an mutiertem Protein, die einem Säuger zur therapeutischen Behandlung verabreicht werden muß, in Abhängigkeit von dem Säuger, der das mutierte Protein empfangen wird, dem Grund für die Verabreichung des mutierten Proteins (z. B. zur Verringerung des Gehalts von Immunkomplexen, zur Behandlung einer viralen Infektion, zur Behandlung einer bakteriellen Infektion, zur Behandlung von endotoxischem Schock, zur Behandlung von Krebs), der Schwere der Erkrankung des Säugers, dem Verabreichungsweg, und der Identität aller anderen Arzneimittel, die dem Säuger verabreicht werden, variiert. Es ist ebenfalls offensichtlich, daß die Gabe von mehr als einer Dosis des mutierten Proteins notwendig sein kann.
Effektive Dosierungen und Zeitpläne zur Verabreichung des mutierten Proteins können empirisch bestimmt werden und die Durchführung solcher Bestimmungen gehört zum Fachwissen. Eine Dosis von etwa 5 ug bis etwa 150 mg mutiertes Protein pro kg Körpergewicht, bevorzugt von etwa 100 ug bis etwa 20 mg pro kg wird zur Verringerung des Gehalts von Immunkomplexen" der Behandlung einer viralen Infektion, der Behandlung einer bakteriellen Infektion, der Behandlung von endotoxischem Schock oder der Behandlung von Krebs wirksam sein. Zur Behandlung von Krebs beträgt die Dosis am meisten bevorzugt von etwa 2 mg bis etwa 10 mg pro kg. Im allgemeinen ist eine Dosis zur Behandlung einer bakteriellen Infektion oder von endotoxischem Schock ausreichend. Zur Verringerung des Gehalts von Immunkomplexen, der Behandlung von viralen Infektionen und der Behandlung von Krebs werden im allgemeinen mehrere Dosen erforderlich sein. Wenn mehrere Dosen erforderlich sind, beträgt der Zeitabstand zwischen den Dosen bevorzugt von etwa 1 Tag bis etwa 7 Tage. Zur Behandlung von Krebs werden die mehreren Dosen bevorzugt in einem Abstand von etwa 1 bis etwa 3 Tagen verabreicht. Die Verabreichung des mutierten Proteins sollte fortgesetzt werden bis der Gehalt von Immunkomplexen wieder auf einen normalen Wert zurückgegangen ist oder bis die Gesundheit des Säugers wiederhergestellt ist.
Das mutierte Protein wird dem Säuger in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind gut bekannt. Geeignete Träger zur Verabreichung des erfindungsgemäßen mutierten Proteins umfassen beispielsweise Fluide wie etwa Wasser, Salzlösung und Puffer. Außer bei Verwendung zur Verringerung des Gehalts von Immunkomplexen kann das mutierte Protein auch in Liposomen eingekapselt verabreicht werden [siehe Deodhar et al., Cancer Research, 42, 5084-5088 (1982); Thombre et al., Cancer Immunol. Immunother., 16, 145-150 (1984); Barna et al., Cancer Research, 44, 305-310 (1984)]. Zur Behandlung von Krebs werden die mutierten Proteine bevorzugt in Liposomen eingekapselt verabreicht. Der Begriff "Liposom" bezieht sich auf jede sackartige oder hohle Vesikelstruktur, die zum Einkapseln eines mutierten Proteins in der Lage ist, und umfaßt multilamellare Vesikel, unilarnellare Vesikel und Schattenzellen von roten Blutzellen. Verfahren zur Herstellung von Liposomen und zum Einkapseln von Molekülen in ihnen sind in der Technik gut bekannt. Bevorzugt sind die Liposomen, die mutiertes Protein enthalten, durch Extrusion gebildete unilamellare Vesikel, welche hergestellt werden können, wie von MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta, 1061, 297-301 (1991) beschrieben. Zur topischen Anwendung kann das mutierte Protein gegebenenfalls in Lotionen, Gelen, Cremes etc. eingebaut werden, wie in der Technik bestens bekannt. Es gehört zum Fachwissen, akzeptable und optimale Träger und Verabreichungswege zu bestimmen.
Die mutierten Proteine können dem Säuger alleine oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden. Beispielsweise können die mutierten Proteine zur Behandlung einer bakteriellen Infektion in Kombination mit Antibiotika verabreicht werden oder können zur Behandlung von Krebs mit anderen Antikrebsmitteln verabreicht werden. Effektive Dosierungen und Zeitpläne für die Verabreichung der mutierten Proteine und dieser anderen Arzneimittel zusammen können empirisch ermittelt werden, wie vorstehend ausgeführt. Es wird erwartet, daß bei Verwendung in Kombination, im Vergleich zur individuellen Verwendung, zur Behandlung von Krebs geringere Mengen an mutiertem Protein und Antikrebsmittel (50% oder weniger) verwendet werden können.
Die anderen Krebsmittel, die in Kombination mit den mutierten Proteinen verwendet werden können, umfassen in der Technik bekannte cytotoxische chemotherapeutische Verbindungen wie etwa Thiotepa, Busulfan, Cyclophosphamid, Methotrexat, Cytarabin, Bleomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Melphalan, Mercaptopurin, Vinblastin und 5-Fluoruracil. Andere geeignete chemotherapeutische Verbindungen sind in Krakoff, CA-A Cancer Journal For Clinicians, 41 : 264-278 (1991) aufgeführt. Die Funktion von cytotoxischen Mitteln besteht üblicherweise in einer Zerstörung von Zellen und/oder einer Verhinderung ihrer Multiplikation und somit sind sie zur Behandlung von Krebs geeignet. Das andere Antikrebsmittel kann auch ein Immunadjuvans oder Cytokin sein. Immunadjuvantien und Cytokine, auch als "Modifikatoren einer biologischen Antwort" bezeichnet, sind in der Technik bekannt. Im allgemeinen sind derartige Moleküle zur Sitimulation oder Verstärkung von Abwehrmechanismen des Wirts geeignet und sind daher in einer Antikrebstherapie geeignet. Beispiele von Immunadjuvantien oder Cytokinen, die verabreicht werden können, umfassen Interferon(e), Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF), Tumornekrosefaktor (TNF), Hormone wie etwa Steroide, und Interleukine wie etwa iL-1, IL-2 und IL-6.
Die mutierten Proteine können auch als bilderzeugende Mittel zum Nachweis von Immunkomplexen oder Krebszellen in vivo verwendet werden. Dazu wird einem Säuger ein markiertes mutiertes Protein injiziert, und es wird sich in Bereichen anreichern, in denen Immunkomplexe abgelagert worden sind (wie etwa Entzündungsbereichen), oder in Bereichen, in denen Krebszellen lokalisiert sind. Alternativ kann ein nicht-markiertes mutiertes Protein injiziert werden. Danach wird ein markiertes Material injiziert, welches an das mutierte Protein bindet, und dieses markierte Material bindet an das mutierte Protein in Bereichen, in denen es lokalisiert ist. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von bilderzeugenden Mitteln und geeignete Markierungen für sie sind in der Technik gut bekannt.
Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine können durch Expression einer für sie kodierenden DNA in transformierten Wirtszellen hergestellt werden. DNA, die für ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein kodiert, kann durch in vitro Mutagenese eines genomischen CRP-Klons oder eines CRP cDNA-Klons hergestellt werden oder kann chemisch synthetisiert werden.
Wie im einleitenden Beschreibungsteil diskutiert, sind genomische Klone und cDNA- Klone, die für CRP aus Mensch, Maus und Kaninchen kodieren, isoliert worden. Die Homologie zwischen den CRP-Aminosäuresequenzen aus unterschiedlichen Spezies ist erheblich. Beispielsweise beträgt die Sequenzhomologie zwischen CRPs aus verschiedenen Säugerspezies zwischen etwa 50 bis etwa 80%. Hu et al., Biochem., 25, 7834-39 (1986); Whitehead et al., Biochem. J., 266, 283-90, (1990); Kilpatrick und Volanakis, Immunol. Res., 10, 43-53 (1991). Angesichts der erheblichen Homologie zwischen CRPs aus unterschiedlichen Spezies können leicht Sonden hergestellt werden, so daß genomische Klone und cDNA-Klone, die für CRPs aus anderen Spezies kodieren, isoliert werden können. Methoden zur Herstellung derartiger Sonden und zur Isolierung genomischer Klone und cDNA- Klone sind gut bekannt. Siehe z. B. Lei et al., J. Biol. Chem., 260, 13377-83 (1985); Woo et al., J. Biol. Chem., 260, 13384-88 (1985); Hu et al., Biochem., 25, 7834-39 (1986); Hu et al., J. Biol. Chem., 263, 1500-1504 (1988); Whitehead et al., Biochem. J., 266, 283-90, (1990).
Unter Verwendung eines der bekannten Klone oder eines neu isolierten Klons kann unter Verwendung herkömmlicher und gut bekannter in vitro Mutagenese-Techniken DNA hergestellt werden, die für ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein kodiert. Besonders bevorzugt ist site-directed Mutagenese unter Verwendung von Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR). Siehe Beispiel 1. Die nachstehenden Literaturstellen beschreiben weitere site-directed Mutagenese- Techniken, die zur Herstellung von DNA, die für ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein kodiert, verwendet werden können: Current Protocols in Molecular Bioloav, Kapitel 8, (Hrsg. Ansubel, 1987); Smith & Gilliam, Genetic Engineering Principles And Methods, 3, 1-32 (1981); Zoller & Smith, Nucleic Acids Res., 10, 6487-6500 (1982); Zoller et al., Methods Enzymol., 100, 468-500 (1983); Zoller & Smith, DNA, 3, 479-88 (1984); Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4642-46 (1984); Bio/Technology, Seiten 636-39 (Juli 1984); Botstein et al., Science, 229, 1193 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol., 154, 367-82 (1987).
DNA, die für ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein kodiert, kann auch durch chemische Synthese hergestellt werden. Methoden zur chemischen Synthese von DNA mit einer spezifischen Sequenz sind in der Technik gut bekannt. Derartige Verfahren umfassen die Phosphoramidit-Methode (siehe z. B. Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981); Mateucci und Caruthers, Tetrahedron Letters, 21, 719 (1980); und Mateucci und Caruthers, J. Amer. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)) und den Phosphotriester-Ansatz (siehe z. B. lto et al., Nucleic Acids Res., 10, 1755-69 (1982)).
Die Erfindung umfaßt auch einen Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes mutiertes Protein kodiert. Die kodierende DNA-Sequenz ist in dem Vektor operativ mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen verknüpft. Methoden um diese operative Verknüpfung zu bewirken, entweder vor oder nach der Insertion der für das mutierte Protein kodierenden DNA in den Vektor, sind in der Technik gut bekannt. Expressionskontrollsequenzen umfassen Promotoren, Aktivatoren, Enhancer, Operatoren, Stop-Signale, Cap-Signale, Polyadenylierungssignale, und andere an der Transkriptionskontrolle beteiligte Signale.
Der Vektor muß einen Promotor und ein Transkriptionsterminationssignal enthalten, die beide operativ mit der DNA-Sequenz verknüpft sind, d. h. der Promotor liegt stromaufwärts der DNA-Sequenz und das Terminationssignal liegt stromabwärts von ihr. Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle Transkriptionsaktivität zeigt und kann von Genen stammen, die für homologe oder heterologe Proteine und entweder für extrazelluläre oder intrazelluläre Proteine kodieren, wie etwa von Amylase, Glycoamylasen, Proteasen, Lipasen, Cellulasen und glycolytischen Enzymen. Ein von T7 RNA-Polymerase erkannter Promotor kann ebenfalls verwendet werden, wenn der Wirt so konstruiert wird, daß er auch das für T7 RNA-Polymerase kodierende Gen enthält. Der Promotor kann stromaufwärts oder stromabwärts liegende Aktivator- oder Enhancersequenzen enthalten. Falls gewünscht kann auch eine stromabwärts des Promotors gelegene Operatorsequenz eingebaut werden.
Der Promotor muß jedoch nicht zu einem natürlich vorkommenden Promotor identisch sein. Er kann aus Teilen von verschiedenen Promotoren zusammengesetzt sein oder kann teilweise oder vollständig synthetisch sein. Ein Leitfaden für die Konstruktion von Promotoren wird durch Promotorstrukturstudien wie etwa denen von Harley und Reynolds, Nucleic Acids Res., 15, 2343-61 (1987) bereitgestellt. Die Positionierung des Promotors relativ zum Transkriptionsstart kann ebenfalls optimiert werden. Siehe Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 760-4 (1979).
Expressionskontrollsequenzen, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, sind gut bekannt. Sie umfassen diejenigen des E. coli lac-Systems, des E. coli trp- Systems, des TAC-Systems und des TRC-Systems, den Major Operator und Promotorregionen aus dem Bakteriophagen Lambda, die Kontrollregion von filamentären einzelsträngigen DNA-Phagen, die Expressionskontrollsequenzen anderer Bakterien, Promotoren, die von Genen abgeleitet sind, welche für Saccharomyces cerevisiae TPI, ADH, PGK und alpha-Faktor kodieren, Promotoren, die von Genen abgeleitet sind, welche für die Aspergillus oryzae TAKA Amylase und A. niger Glycoamylase, neutrale alpha-Amylase und säurestabile alpha-Amylase kodieren, Promotoren, die von Genen abgeleitet sind, welche für Rhizomucor miehei Asparaginsäureproteinase und Lipase kodieren, Maus-Brusttumorpromotor, SV40 Promotor, den Actinpromotor, und andere Sequenzen, welche bekanntermaßen die Expression von Genen prokaryontischer Zellen, eukaryontischer Zellen, deren Viren oder Kombinationen davon kontrollieren.
Der Vektor kann ein selbst-replizierender Vektor oder ein Integrationsvektor sein. Wenn der Vektor selbst-replizierend ist, muß er ein oder mehrere Replikationssysteme enthalten, die dessen Replikation in den Wirtszellen gestatten. Insbesondere sollte der Vektor, wenn die Wirtszelle eine Hefe ist, die Hefe-2u Replikationsgene REP1-3 und einen Replikationsursprung enthalten.
Wenn der Vektor ein selbst-replizierender Vektor ist, ist er bevorzugt ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, so daß hohe Expressionsgehalte erhalten werden. Wie hierin verwendet bedeutet "Plasmid mit hoher Kopienzahl" ein solches, das in etwa 100 oder mehr pro Zelle vorhanden ist. Es sind viele geeignete Plasmide mit hoher Kopienzahl bekannt und sie umfassen Bakterienplasmide wie etwa pUC und Hefeplasmide wie etwa pC.
Alternativ kann ein Integrationsvektor verwendet werden, der die Integration der für die mutierten Proteine kodierenden DNA in das Chromosom der Wirtszelle ermöglicht. Obwohl die Kopienzahl der kodierenden Sequenzen in den Wirtszellen niedriger wäre als bei Verwendung von selbst-replizierenden Vektoren, sind Transformanten, die Sequenzen in ihre Chromosomen integriert haben, im allgemeinen recht stabil.
Der Vektor sollte weiterhin eine oder mehrere Schnittstellen für Restriktionsenzyme umfassen, zur Insertion von DNA-Sequenzen in den Vektor, und enthält bevorzugt eine DNA-Sequenz, die für eine selektierbare oder identifizierbare phänotypische Eigenschaft kodiert, welche sich bei Gegenwart des /ektors in der Wirtszelle ausbildet (einen "Selektionsmarker"). Geeignete Selektionsmarker sind in der Technik bekannt.
Vektoren, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, sind bekannt. Sie umfassen retrovirale Vektoren, Vakzinia-Vektoren, pIJC (wie etwa pUC8 und pUC4K), pBR (wie etwa pBR322 und pBR328), pTZ (wie etwa pTZ18R), pUR (wie etwa pUR288), den Phagen Lambda, YEp Plasmide (wie etwa YEp24), und Derivate dieser Vektoren.
Stromaufwärts der für die mutierten Proteine kodierenden DNA-Sequenzen kann DNA vorhanden sein, welche für eine Signal- oder Signal-Leader-Sequenz kodiert. Eine Signal- oder Signal-Leader-Sequenz ist eine Aminosäuresequenz am Aminoterminus eines Proteins, welche die Sezernierung des an sie gebundenen Proteins aus der Zelle, in der es produziert wird, ermöglicht. Geeignete Signal- und Signal-Leader-Sequenzen sind gut bekannt und umfassen die CRP Präsequenz (siehe den einleitenden Beschreibungsteil), die Hefe-α-Faktor Signalsequenz (siehe US-Patent Nr. 4,546,082 und 4,870,008), das Hefe-BAR1 Sekretionssystem (siehe US-Patent Nr. 4,613,572), die Kluyveromyces lactis Signalsequenz und die Hefe- Invertase Signalsequenz (Stetler et al., Bio/Technology, 7 : 55-60 (1989); Smith et al., Science, 229 : 1219-1229 (1985)). Obwohl sezernierte Proteine häufig einfacher zu reinigen sind, sind die Expressionsgehalte erheblich niedriger als die in Abwesenheit von Sezernierung erhältlichen.
Die chemische Synthese von kodierenden und anderen DNA-Sequenzen ist aus mehreren Gründen bevorzugt. Erstens ist chemische Synthese wünschenswert, weil Codons, die in dem Wirt, in dem die DNA-Sequenz exprimiert werden wird, bevorzugt sind, zur Optimierung der Expression der mutierten Proteine verwendet werden können. Es müssen nicht alle Codons verändert werden, um eine höhere Expression zu erhalten, aber es sollten mehr als 50%, am meisten bevorzugt mindestens 80% der Codons zu Codons, die im Wirt bevorzugt sind, geändert werden.
Die Codonpräferenzen von vielen Wirtszellen, einschließlich E. coli, Hefe, und anderen Prokaryonten und Eukaryonten, sind bekannt. Siehe Maximizing Gene Expression, Seiten 225-85 (Reznikoff & Gold, Hrsg., 1986). Die Codonpräferenzen von anderen Wirtszellen können durch in der Technik bekannte Methoden abgeleitet werden. Insbesondere wird im allgemeinen die nachfolgende Methode verwendet. Zunächst wird die Codonverwendung in Genen, die für etwa ein Dutzend in der vorgesehenen Wirtszelle stark exprimierter Proteine kodieren, bestimmt. Danach wird die Codonverwendung in Genen, die für etwa ein Dutzend in der vorgesehenen Wirtszelle niedrig exprimierter Proteine kodieren, bestimmt. Durch Überprüfung der Ergebnisse werden häufig verwendete und selten verwendete Codons identifiziert. Die in stark exprimierten Genen am häufigsten verwendeten Codons sind bevorzugt. Die in stark exprimierten Genen selten verwendeten oder in niedrig exprimierten Genen verwendeten werden bevorzugt nicht verwendet.
Die Verwendung chemisch synthetisierter DNA gestattet auch die Auswahl von Codons im Hinblick auf die Bereitstellung singulärer oder nahezu singulärer Restriktionsstellen an günstigen Punkten in der Sequenz. Die Verwendung dieser Stellen stellt ein günstiges Mittel zur Konstruktion der synthetischen kodierenden Sequenzen bereit und erleichtert eine schnelle Veränderung der Sequenzen mittels Kassetten-Mutagenese. Zusätzlich können, wenn von dem Messenger RNA (mRNA) Transkript Sekundärstrukturen gebildet werden, welche die Transkription oder Translation beeinträchtigen, diese durch Abänderung der Codonauswahl beseitigt werden.
Chemische Synthese gestattet auch die Verwendung optimierter Expressionskontrollsequenzen mit den für die mutierten Proteine kodierenden DNA- Sequenzen. Auf diese Weise kann optimale Expression der mutierten Proteine erhalten werden. Wie vorstehend angemerkt können beispielsweise Promotoren chemisch synthetisiert und deren Positionierung relativ zum Transkriptionsstart optimiert werden. In ähnlicher Weise kann eine optimierte Ribosomenbindungsstelle und ein Abstandhalter (Spacer) synthetisiert und mit kodierenden Sequenzen verwendet werden, die in Prokaryonten exprimiert werden sollen.
Bei prokaryontischer mRNA umfaßt die Stelle, an der das Ribosom an die Messenger-RNA bindet, eine Abfolge von 3-9 Purinen. Die Konsensus-Sequenz dieses Abschnitts ist 5'-AGGAGG-3', und sie wird häufig als die Shine-Dalgarno Sequenz bezeichnet. Die Sequenz der Ribosomen-Bindungsstelle kann modifiziert werden, um die Expression zu verändern. Siehe Hui und DeBoer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4762-66 (1987). Vergleichsstudien von Ribosomen-Bindungsstellen, wie etwa die Untersuchung von Scherer et al., Nucleic Acids Res., 8 3895-3907 (1987), können eine Orientierung hinsichtlich geeigneter Basenaustausche liefern.
Die Ribosomen-Bindungsstelle liegt 3-12 Basen stromaufwärts des Startcodons (AUG). Der genaue Abstand zwischen der Ribosomen-Bindungsstelle und dem Startcodon der Translation, und die Basensequenz dieser "Spacer" Region beeinflussen die Translationseffizienz und können empirisch optimiert werden. Um die optimale Expression der erfindungsgemäßen mutierten Proteine in Prokaryonten zu erreichen, sollte eine Ribosomen-Bindungsstelle und ein Spacer, die für eine effiziente Translation in der prokaryontischen Wirtszelle sorgen, bereitgestellt werden. Eine bevorzugte Ribosomen-Bindungsstelle und Spacer-Sequenz für optimale Translation in E. coli sind in Springer und Sligar, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8961-65 (1987) und in von Bodman et al., F'roc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9443-47 (1986) beschrieben.
Die Konsensus-Sequenz für die Translationsstartsequenz von Eukaryonten wurde von Kozak (Cell, 44, 283-292 (1986)) mit: C(A/G)CCAUGG bestimmt. Abweichungen von dieser Sequenz, insbesondere in der 3'-Position (A oder G) haben eine ausgeprägte Wirkung auf die Translation einer besonderen mRNA. Praktisch alle stark exprimierten Säugergene verwenden diese Sequenz. Stark exprimierte Hefe mRNAs weichen andererseits von dieser Sequenz ab und verwenden statt dessen die Sequenz (A/Y)A(A/U)AAUGUCU (Cigan und Donahue, Gene, 59, 1-18 (1987)). Diese Sequenzen können empirisch verändert werden um die optimale Sequenz zur Verwendung in einer besonderen Wirtszelle zu ermitteln.
Eine zur Expression eines erfindungsgemäßen mutierten Proteins fähige Wirtszelle kann hergestellt werden durch Transformieren der Zelle mit einem Vektor, der eine für das mutierte Protein kodierende DNA umfaßt. Alternativ kann ein für ein mutiertes Protein kodierendes DNA-Molekül zur Transformation der Wirtszelle verwendet werden. Methoden zur Transformation von Zellen mit Vektoren oder DNA sind in der Technik gut bekannt.
Eine beliebige einer großen Anzahl verfügbarer und gut bekannter Wirtszellen kann in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden. Die Auswahl eines besonderen Wirts hängt ab von einer Reihe von in der Technik anerkannten Faktoren. Diese umfassen beispielsweise Kompatibilität mit dem ausgewählten Expressionsvektor, Toxizität des mutierten, von der DNA-Sequenz kodierten Proteins gegen ihn, Transformationsrate, Expressionseigenschaften, biologische Sicherheit und Kosten. Diese Faktoren müssen gegen die Erkenntnis, daß nicht alle Wirte für die Expression eines besonderen mutierten Proteins gleichsam effekaiv sein mögen, abgewogen werden.
Innerhalb dieser Richtlinien umfassen geeignete Wirte Bakterien (wie etwa E. coli Spezies), Hefen (wie etwa Saccharomyces Spezies) und andere Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere (einschließlich Mensch), oder andere in der Technik bekannte Wirte. Die erfindungsgemäßen mutierten Proteine können hergestellt werden durch Kultivieren der ausgewählten Wirtszelle unter Bedingungen, welche Expression des mutierten Proteins gestatten. Kultivierungsmethoden und Kulturmedien sind in der Technik gut bekannt, aber die Verwendung von angereicherten Medien (anstelle von Minimalmedien) ist bevorzugt, da erheblich höhere Ausbeuten erhalten werden.

BEISPIELE

Restriktionsenzyme, die in den nachfolgenden Beispielen verwendet werden, wurden von verschiedenen kommerziellen Quellen bezogen und entsprechend den Herstellerangaben oder unter Verwendung eines Standardpuffersystems (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)) verwendet.

BEISPIEL 1: Herstellung der Cys36→Ala, Cys97→Ala mutierten Untereinheit von C-reaktivem Protein

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines rekombinanten, für eine mutierte Untereinheit von humanem CRP kodierenden DNA-Moleküls, worin die zwei Cysteinreste an den Positionen 36 und 97 (unter Verwendung des Numerierungssystems von Woo et al., J. Biol. Chem., 260, 13384-13388 (1985)) durch Alaninreste ersetzt wurden und am Amino-Terminus ein Methionin angefügt wurde. Dieses Beispiel beschreibt auch die Herstellung von Vektoren, welche das rekombinante DNA-Molekül operativ an Expressionskontrollsequenzen verknüpft enthalten, und die Expression der mutierten CRP-Untereinheiten in Escherichia coli. Schließlich beschreibt dieses Beispiel die Eigenschaften der mutierten humanen CRP-Untereinheit, umfassend insbesondere deren Fähigkeit zur Bindung von aggregiertem Immunglobulin.

A. Austausch der für Cystein-36 und Cystein-97 kodierenden Codons in der kodierenden Sequenz von CRP unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion-Technik

Austausch der für Cystein-36 und Cystein-97 kodierenden Codons in der kodierenden Sequenz für reife humane CRP-Untereinheiten gegen Alanincodons wurde unter Verwendung des Verfahrens von Horton et al., BioTechniques, 8, 528- 535 (1990) bewirkt, das auf der Polymerasekettenreaktion (PCR, Saiki et al., Science, 239, 487-491 (1988)) beruht. Da zwei unabhängige Änderungen vorgesehen waren, wurde das Verfahren modifiziert, so daß es insgesamt fünf PCR Reaktionen umfaßte, wie in Fig. 1A erläutert. Tabelle 1 zeigt die Sequenz der Oligonucleotide, die in den PCR Reaktionen als Primer verwendet wurden. TABELLE 1
Basen in Kursivschrift zeigen Erkennungsstellen von Restriktionsenzymen an. Basen in Fettschrift zeigen mutagenisierte Codons und den ATG Startcodon an. Unterstrichene Basen sind zur CRP cDNA-Sequenz komplementär.
Wie in Fig. 1A gezeigt waren die fünf Reaktionen: (1) Reaktion eines für präCRP kodierenden cDNA-Klons mit den Primern 1 und 2, wobei PCR Produkt A erzeugt wurde; (2) Reaktion eines für präCRP kodierenden cDNA-Klons mit den Primern 3 und 4, wobei PCR Produkt B erzeugt wurde; (3) Reakaion eines für präCRP kodierenden cDNA-Klons mit den Primern 5 und 6, wobei PCR Produkt C erzeugt wurde; (4) Reaktion der Produkte A und B in der Gegenwart der Primer 1 und 4, wobei PCR Produkt D1 erzeugt wurde; und (5) Reaktion der Produkte D1 und C in der Gegenwart der Primer 1 und 6, wobei das Endprodukt D2 erzeugt wurde. D2 kodiert für die reife Sequenz von humaner CRP-Untereinheit (die Präsequenz wurde eliminiert), außer daß am N-Terminus ein zusätzliches Methionin vorhanden ist und daß die Cysteine 36 und 97 gegen Alanine ausgetauscht sind.
Die für humanes präCRP kodierende DNA, die als Ausgangsmaterial für diese PCR Reaktionen verwendet worden war, wurde erhalten durch Verdau von pCRP5 mit EcoRl, wobei lineare (nicht-zirkuläre) DNA erhalten wird. Plasmid pCRPS wurde von Dr. Bruce Dowton und Dr. Harvey Colten von der Washington University School of Medicine, St. Louis, MO erhalten. pCRP5 wurde aus einer Humanleber cDNA-Bank isoliert wie in Tucci et al., J. Immunol., 131, 2416-19 (1983) beschrieben. Die Nukleotidsequenz der cDNA von pCRPS und die Aminosäuresequenz des davon kodierten präCRP sind in Woo et al., J. Biol. Chem., 260, 13384-13388 (1985) angegeben.
Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von VENT Polymerase (New England Biolabs) ausgeführt, um unerwünschte Mutationen aufgrund von fehlerhaftem Baseneinbau zu minimieren, und die PCR Reaktionen wurden unter Verwendung von 20 Zyklen ausgeführt, wobei jeder Zyklus bestand aus: 1 Minute bei 94ºC; 1 Minute bei 37ºC, 42ºC oder 60ºC (die Annealingtemperatur hängt von der Sequenz der Primer ab); und 3 Minuten bei 74ºC. Nach den Amplifikationsschritten wurden die Reaktanten weitere 5 Minuten bei 74ºC inkubiert um die Synthese doppelsträngiger DNA zu vollenden. Die Produkte wurden jeweils mittels Agarose- Gelelektrophorese gereinigt, wie in Horton et al., a.a.O beschrieben. Bei PCR Reaktionen, in denen das Templat aus zwei überlappenden Sequenzen bestand (PCR D1 und PCR D2 in Fig. 1 A), wurden die Reaktanten vor der Durchführung der normalen Amplifikation 4 Zyklen ohne Primer inkubiert, um die Bildung von Vollängentemplat zu ermöglichen.
PCR Produkte wurden mit den Restriktionsendonukleasen Hhal und Nrul (siehe Tabelle 1) verdaut, um zu bestätigen, daß die Produkte die gewünschten Mutationen enthielten.

B. Konstruktion eines Plasmids zur Überexpression der mutierten CRP- Untereinheit

Das PCR Endprodukt D2 wurde mittels Filtration durch eine Centricon 30 Vorrichtung (Amicon, Beverly, MA) konzentriert und danach mit T4 Polynucleotidkinase (Pharmacia, Piscataway, NJ) und T4 DNA-Ligase (New England Biolabs, Inc.) behandelt, wie in Denney et al., Amplifications, 4, 25-26 (1990) beschrieben. Das resultierende Material wurde mit Ndel und Bglll verdaut, um die mutierte für CRP kodierende Sequenz freizusetzen, und die freigesetzte kodierende Sequenz wurde in den Expressionsvektor pETV, der mit Ndel und BamHl verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Promega, Madison, WI) behandelt worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coll DH5α (Gibco BRL Life Technologies, Inc.) verwendet, und Transformanten wurden gescreent mittels Minipräparationen, die wie in Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979) beschrieben, durchgeführt wurden, um das korrekte Plasmid pIT4 zu identifizieren. Eine Restriktionskarte von pIT4 ist in Fig. 1 B gezeigt. Wie in Fig. 1 B gezeigt, steht die mutierte für CRP kodierende Sequenz unter der Kontrolle des T7 Promotor.
Plasmid pETV ist ein Derivat von pET3a. Die Herstellung von pET3a ist in Rosenberg et al., Gene, 56, 125-135 (1987) beschrieben. Plasmid pET3a wurde von Dr. W. Studier, Brookhaven National Laboratory, Upton NY, erhalten. Plasmid pET3a hat zwei Nhel Restriktionsschnittstellen. Eine liegt am 17 Gen 10 Translationsstart, wo die mutierte für CRP kodierende Sequenz insertiert werden sollte. Die zweite Nhel Stelle liegt innerhalb eines von EcoRV Stellen flankierten 190 bp Segments. Diese zweite Nhel Stelle wurde durch Verdau mit EcoRV eliminiert, und das Plasmid wieder zirkularisiert, wobei pETV erhalten wurde. Die vorhergesagte Sequenz an der Verknüpfungsstelle zwischen dem Expressionssystem von pETV und der für eine mutierte CRP-Untereinheit kodierenden Region in pIT4 wurde durch DNA- Sequenzieren wie folgt bestätigt. Plasmid pIT4 wurde mit Xbal und Kpnl verdaut und das relevante Fragment in M13mp18RF (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119 (1985)) subkloniert. Einzelsträngige DNA wurden aus Kulturen erhalten, die M13mp18RF enthielten, und unter Verwendung einer Applied Biosystems Model 370A automatisierten DNA-Sequenziervorrichtung sequenziert, wie von Sanger et al., J. Mol Biol., 94, 441-558 (1975) beschrieben.

C. Expression und Reinigung der mutierten CRP-Untereinheit

Plasmid pIT4 wurde zur Transformation von E. coll BL21 (DE3) (Herstellung beschrieben in Studier et al., J. Mol. Biol., 189, 113-130 (1986)), welcher das Phage T7 RNA Polymerasegen unter Expressionskontrolle des IacUVS Operator und Promotor enthält, verwendet. Kompetente E. coli BL2I (DE3) wurden von Novogen, Madison, WI erhalten. Transformanten wurden auf LI3-Medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972)), enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, selektiert.
Für Experimente im Kleinmaßstab wurden transformierte Zellen bei 37ºC in M9ZB- Medium (Studier et al., J. Mol. Biol., 189, 113-130 (1986)), enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, angezogen. Zehri-Liter Kulturen wurden in einer New Brunswick Microgen SF-116 Fermentiervorrichtung in 2YT-Medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972)) plus 0,4% (w/v) Glucose und 100 ug/ml Ampicillin bei 37ºC mit Belüftung unter Verwendung von Druckluft mit einer Rate von 10 Litern pro Minute angezogen.
Synthese der T7 RNA Polymerase und demnach der mutierten CRP-Untereinheit wurde mit 1 mM (Endkonzentration) Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG, Boehringer Mannheim) induziert, sobald die Zelldichte ODsoo = 4 erreicht hatte. Die Zellen wurden 3 Stunden nach Induktion geerntet durch rasches Vermischen der Kultur mit einem gleichen Volumen Eis, Konzentrieren der Zellen durch Filtration unter Verwendung einer Millipore Pellicon Vorrichtung, die mit einer 0,5 um Durapore Membran ausgestattet war, und 20-minütiges Zentrifugieren der Zellen bei 10.000 UpM in einem Beckman JA10 Rotor.
Die geernteten Zellen wurden in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 5 mM EDTA (40 g in 500 ml), suspendiert und mittels 3 Durchgängen durch einen Manton-Gaulin Homogenisator bei 10.000 psi aufgebrochen. Der Extrakt wurde 20 Minuten bei 2ºC mit 8.000 UpM in einem Beckman JA10 Rotor zentrifugiert. Das Pellet, das die unlöslichen mutierten CRP-Untereinheiten enthielt, wurde zweimal mit 20 ml des gleichen Puffers, enthaltend 0,5% (v/v) Triton X-100 (Bio-Rad) gewaschen und anschließend 20 Minuten bei 9.000 Upm in einem JA18 Rotor zentrifugiert, um das lösliche Material zu entfernen.
Etwa 5-6 mg des endgültigen Pellets wurden in 50-70 ml 8 M ultrareinem Harnstoff (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, resuspendiert und über Nacht bei 4ºC unter Mischen inkubiert, um die mutierten CRP-Untereinheiten zu solubilisieren (dieses Material wird hierin nachfolgend als die "mutiertes rCRP-Einschlußkörper-Präparation" bezeichnet). Danach wurde dieses Material mit 10 mM Tris-HOI, pH 7,5-8,0, auf eine Endkonzentration von 6 M Harnstoff verdünnt und dann mit 6 ml pro Minute auf eine Säule, enthaltend 40 cm³ Q-Sepharose Fast FlowR Anionenaustauschharz (Pharmacia) aufgetragen. Gebundene Materialien wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten unter Verwendung von 10 mM Tris-HOI, pH 7,5-8,0, enthaltend 6 M Harnstoff und 1 M NaCl, eluiert. Die Absorption bei 280 nm wurde unter Verwendung eines BioPilotR automatischen Chromatographiesystems (Pharmacia) gemessen und es wurde ein Elutionsprofil erhalten.
Zum Vergleich wurden auch natives CRP, mCRP und das primäre Translationsprodukt eines CRP cDNA-Klons (nachstehend hierin "Wildtyp rCRP") über Q-Sepharose Fast FlowR chromatographiert. Natives CRP, mCRP und WildtyprCRP wurden wie folgt hergestellt und chromatographiert.
Natives CRP wurde durch Calcium-abhängige Affinitätschromatographie unter Verwendung von Phosphorylcholin-substituiertem BioGeIR A 0,5 m (ein Harz auf Agarosebasis, erhalten von BioRad Laboratories) aus Pleural- oder Bauchwasserfluid isoliert, wie beschrieben von Volanakis et al. [J. Immunol., 113, 9- 17 (1978)] und modifiziert von Potempa et al. [Mol. Immunol., 24, 531-41 (1987)]. In kurzen Worten wurde das Pleural- oder Bauchwasserfluid über die Phosphorylcholinsubstituierte Säule geleitet und das CRP wurde binden gelassen. Danach wurde die Säule ausgiebig mit 75 mM Tris-HCl-gepufferter Salzlösung (pH 7,2), enthaltend 2 mM CaCl&sub2;, gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm weniger als 0,02 betrug. Das CRP wurde mit 75 mM Tris, 7,5 mM Citrat-gepufferter Salzlösung (pH 7,2) eluiert. Diese hohe Tris-Konzentration reduziert signifikant unspezifisch adsorbierte Proteine, die affinitätsgereinigte CRP-Präparationen häufig kontaminieren. CRP-enthaltende Fraktionen wurden zusammengegeben, drei- bis fünffach mit entionisiertem Wasser verdünnt, an Q-Sepharose Fast FlowR Ionenaustauschharz adsorbiert, und danach mit einem linearen Salzgradienten von 0-1 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, eluiert. CRP-enthaltende Fraktionen wurden zusammengegeben und wieder mit Calcium versetzt, auf 2-5 mM CaCl&sub2; (durch Zugabe einer geeigneten Menge einer 1 M Lösung), und auf eine unsubstituierte BiogelR A 0,5 m Säule aufgetragen um restliche Serumamyloid P Komponente (SAP) zu entfernen. Danach wurde das CRP unter Verwendung von Ultrafiltration (Amicon; PM30 Membran) unter 10-20 psi Stickstoff auf 1 mg/ml eingeengt. Zur Bestimmung der Konzentration wurde ein CRP- Extinktionskoeffizient (mg/ml) von 1,98 verwendet. Danach wurde das konzentrierte CRP ausgiebig gegen 10 mM Tris-HCl-gepufferte Salzlösung, pH 7,2, enthaltend 2 mM CaCl&sub2;, dialysiert. Diese Präparation erzeugte bei SDS-PAGE Elektrophorese eine einzige Mr-Bande bei 23.000 und war zu mehr als 99% frei von SAP, IgG und allen anderen auf antigene Wirkung getesteten Proteinen.
Für die Q-Sepharose Fast FlowR Säule wurden 5 ml der endgültigen konzentrierten CRP-Lösung, enthaltend 5 mg gereinigtes natives CRP, in etwa 30 ml 10 mM Tris- HCl, pH 7,4, verdünnt, und die resultierende Lösung wurde mit 6 ml pro Minute auf die Q-Sepharose Fast Flow Säule aufgetragen. Gebundenes Material wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten unter Verwendung von 10 mM Tris-HOI, pH 7,4, enthaltend 1 M NaCl, eluiert. A280 wurde unter Verwendung des BioPilotR automatischen Chromatographiesystems gemessen.
Zur Herstellung von mCRP wurde gereinigtes natives CRP, hergestellt wie vorstehend beschrieben, eine Stunde bei 37ºC in einer Konzentration von 1 mg/ml in 8 M ultrareinem Harnstoff in der Gegenwart von 10 mM EDTA inkubiert. Für die Q- Sepharose Fast FIowR Säule wurden 6 ml dieses Materials, enthaltend 6 mg des mCRP, in etwa 30 ml 10 mM Tris-HCJ, pH 7,5-8,0, enthaltend 6 M ultrareinen Harnstoff, verdünnt, und die resultierende Lösung wurde mit 6 ml pro Minute auf die Q-Sepharose Fast FIowR Säule aufgetragen. Gebundenes Material wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten unter Verwendung von 10 mM Tris-HOI, pH 7,5-8,0, enthaltend 6 M Harnstoff und 1 M NaCl, eluiert. A&sub2;&sub8;&sub0; wurde unter Verwendung des BioPilotR automatischen Chromatographiesystems gemessen.
Das Wildtyp rCRP wurde durch Expression von pIT3 in E. coli BL21 (DE3) hergestellt. Plasmid plT3 wurde hergestellt durch Spaltung von pCRPS mit Mscl und Bglll (siehe Fig. 2A). Danach wurde pETV mit Nhel und BamHl gespalten, und die verdauten pETV und pCRP5 wurde gemischt und ligiert (siehe Fig. 2A). Dieses Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli Stamm DH5α verwendet, und Kolonien, die das gewünschte Expressionsplasmid pIT3 enthielten, wurden identifiziert, jeweils wie vorstehend für pIT4 beschrieben. Plasmid pIT3 kodiert für eine CRP-Untereinheit mit der Sequenz der nicht-mutierten humanen CRP- Untereinheit, außer daß sie am N-Terminus das Peptid Met Ala Ser aufweist (siehe Fig. 2B). E, coli BL21 (DE3) wurde mit pIT3 transformiert und kultiviert, wie vorstehend für pIT4 beschrieben. Die Kulturen wurden induziert, die Zellen wurden geerntet und ein das Wildtyp rCRP enthaltendes Pellet wurde erhalten, jeweils wie vorstehend beschrieben. Etwa 7,4 mg des Pellets wurden in 50-70 ml 8 M Harnstoff in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, resuspendiert und über Nacht bei 4ºC unter Mischen inkubiert (dieses Material wird nachfolgend hierin als die "Wildtyp rCRP Einschlußkörper-Präparation" bezeichnet). Die solubulisierte Einschlußkörper- Präparation wurde durch Filterpapier geführt, um nicht-solubilisierte Festbestandteile zu entfernen. Danach wurde dieses Material mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, auf eine Endkonzentration von 6 M ultrareinem Harnstoff verdünnt und dann mit 6 ml pro Minute auf die Q-Sepharose Fast FlowR Säule aufgetragen. Gebundene Materialien wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 6 M Harnstoff und 1 M NaCl, eluiert. A280 wurde unter Verwendung des BioPilotR Systems gemessen.
Die von dem BioPilotR System erzeugten Elutionsprofile für natives CRP, mCRP, Wildtyp rCRP und die mutierten CRP-Untereinheiten sind in den Fig. 3A-D gezeigt. Das BioPilotR System war derart programmiert, daß die jeweils verwendeten Salzgradienten direkt verglichen werden konnten.
Wie in Fig. 3A gezeigt ergab natives CRP nur einen signifikanten Elutionspeak. Seine Elutionsdauer betrug 47,76 Minuten. Dieser Peak wurde gegen 25 mM Tris- HCl, 0,15 M NaCl, 2 mM CaCl&sub2;, pH 7,4, dialysiert und danach für Tests, wie im nächsten Abschnitt beschrieben, unter Verwendung von Amicon-Filtration auf etwa 1 mg/ml eingeengt. Das konzentrierte Material aus dem Peak wird hierin nachstehend als "natives CRPQ" bezeichnet.
Fig. 3B zeigt das Elutionsprofil für mCRP. Die Elutionsdauer des Hauptpeaks betrug 36,18 Minuten. Dieser Peak wurde gegen Puffer mit niedriger Ionenstärke (25 mM Tris-HOI, 0,015 M NaCl, pH 7,4) dialysiert und danach unter Verwendung von Amicon-Filtration eingeengt, und wurde wie im nächsten Abschnitt beschrieben getestet. Das konzentrierte Material aus dem Peak wird hierin nachstehend als "mCRPQ" bezeichnet. Die im nächsten Abschnitt beschriebenen Tests bestätigten, daß das Material in dem Peak mCRP war. Somit eluiert mCRP deutlich früher aus Q- SepharoseR (etwa 11,5 Minuten früher) als natives ORP.
Fig. 3C zeigt das Elutionsprofil für Wildtyp rCRP. Der Hauptpeak eluierte bei 34,55 Minuten, einer Elutionsdauer, die nahezu identisch zu der von mCRP und deutlich verschieden von der Elutionsdauer von nativem CRP ist. Das Protein im Hauptpeak wurde gegen Puffer mit niedriger Ionenstärke dialysiert und danach für weitere Tests wie im nächsten Abschnitt beschrieben unter Verwendung von Amicon-Filtration eingeengt. Das konzentrierte Material aus dem Peak wird hierin nachstehend als "Wildtyp rCRPQ" bezeichnet.
Fig. 3D zeigt schließlich das Elutionsprofil für die mutierten CRP-Untereinheiten. Der Hauptpeak eluierte bei 34,55 Minuten, einer Elutionsdauer, die praktisch identisch zu der von Wildtyp rCRP und mCRP und deutlich verschieden von der von nativem CRP ist. Der Hauptpeak wurde gegen Puffer mit niedriger Ionenstärke dialysiert und danach für weitere Tests wie im nächsten Abschnitt beschrieben unter Verwendung von Amicon-Filtration eingeengt. Das konzentrierte Material aus dem Peak wird hierin nachstehend als "mutiertes rCRPQ" bezeichnet.
Proteine können aus der Q-Sepharose Fast FlowR Säule auch mit einem NaCl- Stufengradienten (von 0,1 bis 1,0 M NaCl) eluiert werden. Wenn das rekombinante mutierte CRP-Protein auf der Säule gefahren wurde und mit einem Stufengradienten eluiert wurde, zeigten die A&sub2;&sub8;&sub0;-Ablesungen, daß der Großteil des Proteins mit 0,1 - 0,2 M NaCl von der Säule eluiert wurde. Wenn natives CRP auf der Säule gefahren wurde und mit einem Stufengradienten eluiert wurde, zeigten die A&sub2;&sub8;&sub0;-Ablesungen, daß der Großteil des Proteins mit 0,4 M NaCl eluierte.

D. Charakterisierung der aus der Q-Sepharose Fast FIowR Säule eluierten Fraktionen

Die Peaks aus der Q-Sepharose Fast Flow Säule wurden mittels Dot-Blot, Western- Blot, SDS-PAGE und ELISA analysiert. Manchmal wurden auch Einschlußkörper- Präparationen von Wildtyp rCRP und mCRP getestet. Natives CRP und mCRP wurden manchmal als Kontrollen verwendet. Die Präparation aller dieser Materialien ist im vorhergehenden Abschnitt beschrieben.

1. Dot-Blot Assays

Nach einer Modifikation des Verfahrens von Zhang, J. Immunol., 138, 575 (1987) wurden Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH) 30 min in TBS (25 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,4) eingeweicht, und überschüssiger Puffer wurde mit Filterpapier entfernt. Die Membranen wurden danach in eine Bio-DotTM Mikrofiltrationsvorrichtung (Bio-Rad) eingepaßt. Aliquots (50 ul) der verschiedenen Testproteine in einer Konzentration von 5 ug/ml wurden punktförmig auf die Membran aufgetragen, über Nacht bei 4ºC inkubiert und danach vakuumfiltriert um die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen zu entfernen. Blockierlösung (100 ul 1% BSA in TBS) wurde zu den Vertiefungen zugegeben und es wurde 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und durch die Membran vakuumfiltriert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit TBS, enthaltend 1% BSA und 0,05% Tween 20 gewaschen (TBS-Waschpuffer). Monoklonaler Antikörper (mAb) aus Maus 3H12 und Antiserum LP3-HRP wurden zugegeben und es wurde 30 min bei RT inkubiert, gefolgt von Waschen. Der monoklonale Antikörper 3H'12 wurde unmarkiert verwendet und die Blots wurden entwickelt durch Zugabe von mit Meerrettich- Peroxidase markiertem anti-Maus IgG F(ab')&sub2; aus Kaninchen (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), 30-minütige Inkubation bei RT, Zugabe von Peroxidasesubstrat 4-Chlor-2-naphthol (Bio-Rad) in 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, enthaltend Methanol und H&sub2;O&sub2;, und nach Herstellerangaben (Bio-Rad) hergestellt, und 30-minütige Inkubation bei RT zur Farbentwicklung. LP3-HRP war mit Meerrettich-Peroxidase markiert, und die Blots wurden entwickelt durch Zugabe von 4-Chlor-2-naphthol, gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei RT zur Farbentwicklung.
Der monoklonale Antikörper 3H12 ist ein IgG Antikörper, welcher für eine antigene Determinante spezifisch ist, die auf mCRP aber nicht auf nativem CRP angetroffen wird. Seine Herstellung und Eigenschaften sind in der veröffentlichten PCT- Anmeldung WO 91/00872 und in Ying et al., J. Immunol., 143, 221-228 (1989) beschrieben. Antiserum LP3 ist ein Antiserum, das hergestellt wird durch Immunisierung einer Ziege mit mCRP in komplettem Freund Adjuvans, und danach Affinitätsreinigung des geernteten Antiserums durch Passage über eine Cyanbromidaktivierte, mit mCRP substituierte BioGeiR Säule. Das resultierende affinitätsgereinigte anti-neoCRP Antiserum LP3 war monospezifisch für die neo- Antigenizität, welche von mCRP aber nicht von nativem CRP exprimiert wird. LP3 war mit Meerrettich-Peroxidase markiert wie von Potempa et al., Molec. Immunol., 24, 531-541 (1987) beschrieben.
Die Dot-Blots zeigten, daß mCRP, mCRPQ, Wildtyp rCRPQ und mutiertes rCRPQ mit dem monoklonalen Antikörper 3H 12 und dem monospezifischen anti-neoCRP LP3- HRP reagierten, was anzeigt, daß alle diese Materialien antigene Determinanten exprimieren, welche auf mCRP aber nicht auf nativem CRP angetroffen werden. Natives CRP und natives CRPQ reagierten wie erwartet nicht mit den Antikörpern 3H12 und LP3-HRP.

2. Western-Blot

Die Peaks wurden auch mittels Western-Blot analysiert. Zur Durchführung des Western-Blots wurde mit 5-10 ul der Peak-Konzentrate eine Elektrophorese unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen auf 12% SDS-PAGE Gelen durchgeführt. Nach Elektrophorese wurde Protein unter Verwendung des JKA Biotech (Dänemark) Semidry Electroblotter auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Das weitere Vorgehen war gleich wie vorstehend für den Dot-Blot beschrieben, außer daß 3 mAbs aus Maus (3H12, 2C10 und 8C10) verwendet wurden. Die Farbe wurde entwickelt, wie im vorhergelhenden Abschnitt für 3H12 beschrieben.
Der monoklonale Antikörper 3H12 ist vorstehend beschrieben. Der monoklonale Antikörper 8C10 reagiert mit einer Determinante, die nur auf mCRP angetroffen wird, während 2C10 mit einer Determinante reagiert, die sowohl auf nativem CRP als auch auf mCRP angetroffen wird. Die Herstellung und Eigenschaften von 2C10 und 8C10 sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 91/00872 und in Ying et al., J. Immunol., 143, 221-228 (1989) beschrieben.
Die Ergebnisse des Western-Blots zeigten, daß mCRP, mCRPQ, Wildtyp rCRPQ und mutiertes rCRPQ mit allen drei mAbs reagierten, was anzeigt, daß alle diese Materialien antigene Determinanten exprimieren, welche auf mCRP angetroffen werden. Natives CRP und natives CRPQ reagierten mit mAb 2C10, aber nicht mit mAb 3H12 und 8C10, was bestätigt, daß diese Materialien natives CRP waren und daß die Antikörper reagierten wie erwartet.
Die Ergebnisse des Western-Blots zeigten auch, daß das Material, das in mutiertem rCRPQ (dem erhaltenen Hauptpeak bei Chromatographie der mutierten CRP- Untereinheiten über Q-Sepharose Fast FlowR) vorwiegend vorhanden war, freie, monomere Untereinheiten waren. Es waren etwas Multimere und Fragmente vorhanden, die mit den für mCRP-Determinanten spezifischen Antikörpern reaktiv waren, aber die Anzahl derartiger unerwünschter Banden war erheblich geringer als für Wildtyp rCRPQ beobachtet. Dies deutet darauf hin, daß durch Austausch der Cysteinreste in einer CRP-Untereinheit das resultierende rekombinante Produkt effizienter verarbeitet werden kann, wobei ein reineres, besser definiertes Produkt erhalten wird.

3. SDS-PAGE

Die Peak-Konzentrate wurden auf PhastGelR SDS-PAGE Gelen (Pharmacia) laufen gelassen. Es wurde ein Gradient von 8-25% Acrylamid verwendet. Nach Ablauf der Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie Blau angefärbt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. In Fig. 4 enthält die Bahn 1 mCRP. Es wurde eine einzige Bande mit einem Molekulargewicht von annähernd 27.000 erhalten.
Bahn 2 enthält die Einschlußkörper-Präparation von mutiertem rCRP. Es ist zu bemerken, daß 2 Hauptbanden auftreten, eine davon an annähernd der gleichen Position wie die einzige mGRP-Bande (Mr etwa 27.OC10). Von dieser Bande wurde mittels Western-Blot Analyse verifiziert, daß sie mit für mCRP-Determinanten spezifischen Antikörpern Antigen-reaktiv ist.
Bahn 3 enthält mutiertes rCRPQ (die Einschlußkörper-Präparation von mutiertem rCRP, die über Q-Sepharose Fast FlowR chromatographiert worden war). Es ist zu bemerken, daß nur eine Hauptbande mit einem Molekulargewicht von annähernd 27.000 erhalten wurde, dem Molekulargewicht der gewünschten freien mutierten CRP-Untereinheiten. Wie ersichtlich ist, gibt es erheblich weniger Banden im Vergleich zu der Einschlußkörper-Präparation von mutiertem rCRP (Bahn 2), und wurden die Mengen der verbliebenen Kontaminationen, insbesondere der einen Hauptkontamination mit einem Mr von unter 18.000, erheblich verringert. Die Reinheit der mutierten CRP-Untereinheit wurde somit durch das einstufige Q- Sepharose Chromatographieverfahren erheblich verbessert.
Bahn 4 enthält die Einschlußkörper-Präparation von Wildtyp rCRP. Wie ersichtlich ist, sind zahlreiche Proteinbanden vorhanden. Die Bande bei etwa 80% der Laufstrecke ist die freie, intakte Wildtyp rCRP-Untereinheit (Mr etwa 27.000). Es ist zu bemerken, daß dies nicht die Hauptbande ist, da die Bande am Ende der Laufstrecke eine höhere Intensität aufweist.
Bahn 5 enthält Wildtyp rCRPQ (die Einschlußkörper-Präparation von Wildtyp rCRP, die über Q-Sepharose Fast FlowR chromatographiert worden war). Wie ersichtlich ist, sind im Vergleich zu der Einschlußkörper-Präparation, die nicht chromatographiert worden war (Bahn 4), immer noch zahlreiche Banden vorhanden. Tatsächlich treten mehrere neue Banden auf (bei Molekulargewichten von annähernd 45.000 und 14.000), deren Identität unbekannt ist, und die Intensität mancher Banden hat zugenommen. Somit wurde bei der Reinigung von Wildtyp rCRP durch Verwendung der Q-Sepharose Fast FIowR Säule keine Verbesserung erreicht. Die Bande bei etwa 80% der Laufstrecke ist die freie Untereinheit. Diese Bande und viele der anderen Banden waren in Western-Blot Analyse mit den für mCRP-Determinanten spezifischen Antikörpern reaktiv. Dies deutet darauf hin, daß der Großteil des nach Chromatographie von Wildtyp rCRP Präparationen über die Q-Sepharose Fast FlowR Säule erhaltenen Proteins Wildtyp rCRP ist, daß aber Probleme mit Multimerisierung und Fragmentierung auftreten.
Bahn 6 enthält vorgefärbte BioGelR Molekulargewicht-Standards (BioRad). Von oben nach unten haben diese Banden annähernde Molekulargewichte von 106.000, 80.000, 49.500, 32.500, 27.500 und 18.500.

4. ELISA

Schließlich wurde ein ELISA durchgeführt, um die Bindung von für natives CRP und mCRP spezifischen Antikörpern an die Materialien in den aus den Q-Sepharose Fast FIowR Säulen eluierten Peaks nachzuweisen. Für mCRP und rekombinante CRP Präparationen wurde ein Direktbinde-ELISA verwendet. Für native CRP Präparationen wurde ein Ligandenabfang-ELISA verwendet.
Im direkten ELISA wurden 100 ul jedes Testproteins (5 ug/ml) in 50 mM Natriumbicarbonat-Puffer (pH 9,5) in die Vertiefungen von Nung Polystyrolplatten (Scientific Supply, Shiller Park, IL) eingebracht und 2 h bei 37ºC oder über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit TBS (25 mM Tris-HOI, 0,15 M NaCl, pH 7,4), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA), (TBS-A), 60-120 min bei 37ºC blockiert. Die Vertiefungen wurden mit TBS, enthaltend 0,05% Tween 20, (TBS- Waschpuffer), gewaschen. Antikörper wurden mit TBS-A reihenverdünnt, und 100 ul Aliquots wurden zu den Zellen zugegeben und es wurde 60 min bei 37ºC inkubiert, gefolgt von Waschen. Peroxidase-konjugiertes anti-Maus IgG aus Kaninchen (Southern Biotech) in TBS-A wurde 60 min bei 37ºC zu den Vertiefungen zugegeben.
Nach Waschen wurden 100 ul ABTS-Substrat (2-2'-Azino-bis(3-ethylbenzylthiazolin- 6-sulfonsäure, Sigma Chemical Co.) pro Vertiefung zugegeben und es wurde etwa 5- 15 min bei RT inkubiert. Die Platten wurden abgelesen auf eine Absorption bei 414 nm unter Verwendung einer TitertekR Multiskan Plattenablesevorrichtung (Flow Laboratories, Helsinki, Finnland).
Für den Ligandenabfang-ELISA wurden Platten 2 h bei 37ºC oder über Nacht bei 4ºC mit 100 fr/Vertiefung PC-KLH (5 ug/ml) in Bicarbonatpuffer inkubiert. Vertiefungen wurden blockiert mit TBS-A, enthaltend 2 mM CaCl&sub2;, wie vorstehend beschrieben. Nach dem Blockieren wurden 100 ul/Vertiefung natives CRP (5 ug/ml) in TBS-A, enthaltend 2 mM CaCl&sub2;, zugegeben und es wurde 60 min bei 37ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurde der restliche Assay durchgeführt wie vorstehend beschrieben, außer daß in allen Puffern 2 mM CaCl&sub2; vorhanden war. PC-KLH ist Phosphorylcholin (PC) -substituiertes Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). Es wurde hergestellt durch Inkubation von KLH (Sigma Chemical Co.) mit Paranitrophenylphosphorylcholin (Sigma Chemical Co.), diazotisiert wie von Chesebro und Metzger, Biochemistry, 11, 766 (1972) beschrieben. Die letzte Derivatisierung ergab 28-52 Mol PC pro 1 · 10&sup5; Mr von KLH.
Die Ergebnisse dieser ELISAs sind in den Fig. 5A-D gezeigt. Fig. 5A zeigt die Reaktivität von mCRP, der Wildtyp rCRP Einschlußkürperpräparation und von nativem CRP mit mAb 3H12. Wie erwartet reagierte rnAb 3H12 mit mCRP aber nicht mit nativem CRP. Die Wildtyp rCRP Einschlußkörperpräparation reagierte auch wie mCRP und nicht wie natives CRP, was darauf hindeutet, daß das von mAb 3H12 erkannte mCRP-Epitop (das Carboxy-terminale Octapeptid der CRP-Untereinheit) auf Wildtyp rCRP exprimiert wird.
Fig. 5B zeigt die Reaktivität von mCRP, der Wildtyp rCRP Einschlußkörperpräparation und von nativem CRP mit mAb 1 D6. Der monoklonale Antikörper 1 D6 ist spezifisch für eine antigene Determinante, die nur auf nativem CRP angetroffen wird. Seine Herstellung und Eigenschaften sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 91/00872 und in Ying et al., J. Immunol., 143, 221-228 (1989) beschrieben. Wie erwartet reagierte mAb 1 D6 mit nativem CRP, aber nicht mit mCRP. Wie gezeigt reagierte die Wildtyp rCRP Einschlußkörperpräparation wie mCRP nicht mit mAb 1D6, was darauf hindeutet, daß das von mAb 1D6 erkannte native CRP-Epitop auf Wildtyp rCRP nicht exprimiert wird.
Fig. 5C zeigt die Reaktivität von mCRP, Wildtyp rCRP0 und mutiertem CRPQ mit mAb 8C10. Der monoklonale Antikörper 8C10 reagiert mit einem nur auf mCRP angetroffenen Epitop, reagiert aber mit einem unterschiedlichen Epitop auf mCRP als mAb 3H12. Für diesen ELISA wurde jedes Testprotein derart eingestellt, daß 1000 ng Protein auf der ersten Vertiefung der ELISA-Polystyrolplatte immobilisiert wurden. Die Testproteine wurden danach reihenverdünnt, so daß immer weniger Protein pro Vertiefung immobilisiert wurde. Die pro Vertiefung immobilisierte Proteinmenge ist an der Abszisse des Graphen in Fig. 5C angegeben. Wie gezeigt reagierten sowohl Wildtyp rCRPQ als auch mutiertes rCRPQ in einer ähnlichen Weise wie mCRP mit mAb 8C10. Dies legt nahe, daß die rekombinanten Proteine ein 8C10-spezifisches Epitop exprimieren, welches zu dem auf mCRP angetroffenen ähnlich ist.
Fig. 5D zeigt die Reaktivität von mCRP, Wildtyp rCRPQ und mutiertem rCRPQ mit affinitätsgereinigtem, für neo-CRP Antigenizität spezifischem Antiserum LP3-HRP. Für diesen ELISA wurde jedes Testprotein derart eingestellt, daß 1000 ng Protein auf der ersten Vertiefung der ELISA-Polystyrolplatte immobilisiert wurden. Die Testproteine wurden danach reihenverdünnt, so daß immer weniger Protein pro Vertiefung immobilisiert wurde. Die pro Vertiefung immobilisierte Proteinmenge ist an der Abszisse des Graphen in Fig. 5D angegeben. Wie gezeigt reagierten sowohl Wildtyp rCRPQ als auch mutiertes rCRPQ in einer ähnlichen Weise wie mCRP mit anti-neoCRP LP3-HRP aus Ziege. Dies legt nahe, daß die rekombinanten Proteine antigenisch sehr ähnlich zu mCRP sind.

E. Bewertung der biologischen Aktivität der mutierten CRP-Untereinheiten

Schließlich wurde ein ELISA durchgeführt, um Bindung von aggregiertem IgG an das Material in den aus den Q-Sepharose Fast FlowR Säulen eluierten Peaks nachzuweisen. Eine Bindung an aggregierte Immunglobuline und Immunkomplexe ist eine wichtige Eigenschaft von mCRP, welche dessen Verwendung zur Entfernung von aggregierten Immunglobulinen und Immunkomplexen aus Fluiden und zur Quantifizierung von Immunkomplexen ermöglicht. Dieser ELISA wurde wie folgt durchgeführt.
Einhundert Mikroliter jedes Testproteins (10 ug/ml) in 10 mM Natriumbicarbonatpuffer (pH 9,5) wurden in die Vertiefungen von Polystyrol- Mikrotiterplatten eingebracht und 2 h bei 37ºC oder über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden 60-120 min bei 37ºC mit TBS-A blockiert. Die Vertiefungen wurden mit TBS-Waschpuffer gewaschen. Danach wurden 100 ul aggregiertes humanes IgG oder monomeres IgG in TBS-A in variierenden Konzentrationen zugegeben und es wurde 60 min bei 37ºC inkubiert. Humanes Immunglobulin (U. S. P.-GammaR, Armour Pharmaceutical Co.) wurde in Puffer bei pH 9,0 auf 20 mg/ml verdünnt und durch etwa 30-minütiges Erwärmen auf 63ºC aggregiert. Nichtaggregiertes monomeres IgG wurde von dem aggregierten IgG abgetrennt mittels Molekülsieb-Chromatographie unter Verwendung von BioGeIR A 1.5 m in 25 mM Tris- HCl, 0,3 M NaCl, pH 7,4, bei 4ºC. Nach Inkubation von monomerem oder aggregiertem IgG auf mit Testprotein beschichteten Vertiefungen wurden die Vertiefungen mit TBS-Waschpuffer gewaschen und 100 ul Peroxidase-konjugiertes anti-human IgG F(ab')&sub2; aus Ziege (Cappel, Durham, NC) in TBS-A wurde zu den Vertiefungen zugegeben und es wurde 60 min bei 37ºC inkubiert. Nach Waschen wurden 100 ul ABTS-Substrat pro Vertiefung zugegeben und es wurde 5-15 min bei RT inkubiert. Die Platten wurden auf eine Absorption bei 414 nm unter Verwendung einer TitertekR Multiskan Plattenablesevorrichtung abgelesen.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 6A-B gezeigt. Wie in Fig. 6A gezeigt, band die Einschlußkörperpräparation von Wildtyp rCRP aggregiertes IgG, aber kein monomeres IgG. Ihre Reaktivität war ähnlich zu der von mCRP. Fig. 6B zeigt, daß sowohl Q-Sepharose-fraktioniertes Wildtyp rCRPQ als auch mutiertes rCRPQ aggregiertes IgG, aber kein monomeres IgG banden. Somit reagierten sowohl rekombinantes Wildtyp CRP als auch mutiertes rekombinantes CRP hinsichtlich ihrer Fähigkeit, selektiv aggregiertes Immunglobulin zu binden, funktionell wie mCRP. Da aggregiertes Immunglobulin ein Standardmodell für Immunkomplexe ist, weisen diese Ergebnisse auch darauf hin, daß die erfindungsgemäßen mutierten Proteine Immunkomplexe binden, und sie in der Gegenwart von monomerem Immunglobulin selektiv binden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(1) ANMELDER:
(A) NAME: Immtech International, Inc.
(B) STRASSE: 3110, 20 North Wacker Drive
(C) ORT: Chicago
(D) BUNDESLAND:Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL:60606
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Mutiertes Protein und Methoden und Materialien zu dessen Herstellung und Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: EP-94909837.0
(B) ANMELDETAG:24-FEB-1994
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GAAGCGCCAC AGTGAAGGCT 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

TTGTCGCGAT GTGTACTGG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

GGCGAGATCT GAGGTACCTT CAGG 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: zirkulär

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

TTT GGC CAG ACA 12
Phe Gly Gln Thr
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Claims

1. Mutiertes Protein, welches die gleiche Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz einer nicht-mutierten Untereinheit von C-reaktivem Protein (CRP) oder eines nicht-mutierten präCRP hat, außer daß

(i) mindestens eine Aminosäure der nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder des nicht-mutierten präCRP deletiert ist, oder

(ii) mindestens eine Aminosäure der nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder des nicht-mutierten präCRP gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, oder

(iii) mindestens eine Aminosäure zu der nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder dem nicht-mutierten präCRP hinzugefügt ist, oder

(iv) eine Kombination solcher Änderungen durchgeführt worden ist,

wobei die eine oder mehreren hinzugefügten Aminosäuren, die eine oder mehreren deletierten Aminosäuren und die eine oder mehreren ausgetauschten Aminosäuren derart ausgewählt sind, daß das mutierte Protein weniger zur Bildung kovalent vernetzter Aggregate neigt als die nicht-mutierte CRP- Untereinheit oder das nicht-mutierte präCRP,

wobei das mutierte Protein auch mit einem für neo-CRP Antigenizität spezifischen Antikörper reagiert und mindestens eine der biologischen Aktivitäten von modifiziertem CRP aufweist.

2. Mutiertes Protein nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der Cysteine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit oder des nicht-mutierten präCRP deletiert oder gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist.

3. Mutiertes Protein nach Anspruch 1, wobei die eine oder mehreren hinzugefügten Aminosäuren, die eine oder mehreren deletierten Aminosäuren und die eine oder mehreren ausgetauschten Aminosäuren weiterhin derart ausgewählt sind, daß das mutierte Protein in wäßrigen Medien besser löslich ist als die nicht-mutierte CRP-Untereinheit oder das nicht-mutierte präCRP.

4. Mutiertes Protein nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der Lysine des nicht-mutierten präCRP oder der nicht-mutierten CRP-Untereinheit deletiert oder gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist.

5. Mutiertes Protein, welches die gleiche Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz einer nicht-mutierten Untereinheit von C-reaktivem Protein (CRP) hat, außer daß

(i) mindestens eine Aminosäure der nicht-mutierten CRP-Untereinheit deletiert ist, oder

(ii) mindestens eine Aminosäure der nicht-mutierten CRP-Untereinheit gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, oder

(iii) mindestens eine Aminosäure zu der nicht-mutierten CRP-Untereinheit hinzugefügt ist, oder

(iv) eine Kombination solcher Änderungen durchgeführt worden ist,

wobei die eine oder mehreren hinzugefügten Aminosäuren, die eine oder mehreren deletierten Aminosäuren und die eine oder mehreren ausgetauschten Aminosäuren derart ausgewählt sind, daß das mutierte Protein weniger zur Bildung kovalent vernetzter Aggregate neigt als die nicht-mutierte CRP- Untereinheit,

6. Mutiertes Protein nach Anspruch 5, wobei mindestens eines der Cysteine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit deletiert oder gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist.

7. Mutiertes Protein nach Anspruch 6, wobei mindestens eines der Cysteine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit gegen eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alanin, Glycin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin und Threonin, ausgetauscht ist.

8. Mutiertes Protein nach Anspruch 7, wobei mindestens eines der Cysteine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit gegen ein Alanin ausgetauscht ist.

9. Mutiertes Protein nach Anspruch 6, wobei alle Cysteine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit deletiert oder gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind.

10. Mutiertes Protein nach Anspruch 9, wobei alle Cysteine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit gegen eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alanin, Glycin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin und Threonin, ausgetauscht sind.

11. Mutiertes Protein nach Anspruch 10, wobei alle Cysteine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit gegen Alanine ausgetauscht sind.

12. Mutiertes Protein nach Anspruch 5, wobei mindestens eines der Lysine der nicht-mutierten CRP-Untereinheit deletiert oder gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht ist.

13. DNA-Molekül, kodierend für das mutierte Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

14. Vektor zur Expression des mutierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend für das mutierte Protein kodierende DNA, operativ mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft.

15. Wirtszelle, die transformiert ist, so daß sie DNA enthält, welche für das mutierte Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert, wobei die für das mutierte Protein kodierende DNA operativ mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft ist.

16. Verfahren zur Herstellung des mutierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die transformiert ist, so daß sie DNA enthält, welche für das mutierte Protein kodiert, wobei die für das mutierte Protein kodierende DNA operativ mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft ist, wobei das Kultivieren unter Bedingungen erfolgt, welche eine Expression des mutierten Proteins gestatten.

17. In vitro Verfahren zur Bindung von aggregiertem Immunglobulin oder Immunkomplexen, das bzw. die in einem Fluid enthalten sind, umfassend das in Kontakt Bringen des aggregierten Immunglobulins oder der Immunkomplexe mit dem mutierten Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

18. In vitro Verfahren zur Entfernung von aggregiertem Immunglobulin oder Immunkomplexen aus einem Fluid, umfassend das in Kontakt Bringen des aggregierten Immunglobulins oder der Immunkomplexe mit dem mutierten Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

19. In vitro Verfahren zur Quantifizierung von Immunkomplexen, umfassend das in Kontakt Bringen der Immunkomplexe mit dem mutierten Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

20. Vorrichtung zur Entfernung von aggregiertem Immunglobulin oder Immunkomplexen aus einem Fluid, umfassend:

das mutierte Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, an eine Festoberfläche gebunden, und

ein Gehäusemittel für die Festoberfläche, so daß das Fluid mit der Festoberfläche in Kontakt gebracht werden kann.

21. Kit zur Quantifizierung von Immunkomplexen, umfassend einen Behälter des mutierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das mutierte Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

23. Verwendung eines mutierten Proteins nach einen der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung des Gehalts von Immunkomplexen in einem Säuger.

24. Verwendung eines mutierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Säuger.

25. Verwendung eines mutierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer bakteriellen Infektion in einem daran erkrankten Säuger.

26. Verwendung eines mutierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von endotoxischem Schock in einem Säuger.

27. Verwendung eines mutierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs in einem Säuger.

28. Mutiertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das markiert ist.