EA034692B1

EA034692B1 - Улучшенные транспортные молекулы модулярного антигена и их применение

Info

Publication number: EA034692B1
Application number: EA201691981A
Authority: EA
Inventors: Хорст Розе; Дания Бирте Райхе; Харальд Таммен
Original assignee: Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2020-03-06
Also published as: US20150274790A1; US10919945B2; AU2015239770A1; US20180170978A1; EP3125933B1; CN106132996B; WO2015150243A1; CA2943690A1; CN106132996A; KR20160138283A; TWI705823B; US9920101B2; MX2016012840A; AU2015239770B2; TW201607554A; JP6370398B2; JP2017510268A; EP3125933A1; EA201691981A1; AR100310A1

Abstract

Изобретение относится к (изолированным) рекомбинантным белкам, которые также называются улучшенными молекулами MAT (iMAT), включающим по крайней мере один транслокационный модуль, по крайней мере один нацеливающий модуль и по крайней мере один антигенный модуль, где по крайней мере один остаток цистеина является замещенным с помощью отличного аминокислотного остатка. Такие молекулы iMAT являются полезными, в частности, в качестве вакцин, например, для терапии и/или для профилактики аллергий и/или инфекционных заболеваний и/или для предотвращения передачи инфекционных заболеваний у лошадей. Настоящее изобретение дополнительно относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют такие молекулы iMAT, соответствующим векторам и первичным клеткам и линиям клеток.

Description

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к (изолированным) рекомбинантным белкам, которые также называются улучшенными MAT (iMAT) молекулами, включающим по крайней мере один транслокационный модуль, по крайней мере один нацеливающий модуль и по крайней мере один антигенный модуль, где по крайней мере один остаток цистеина является замещенным с помощью отличного аминокислотного остатка. Молекулы iMAT могут быть получены с помощью существенно сниженных производственных усилий и являются специфическими для вида, безопасными и иммунологически весьма эффективными. Такие (изолированные) рекомбинантные белки являются полезными, в частности, в качестве вакцин, например, для терапии и/или для профилактики аллергий и/или инфекций и/или для профилактики передачи инфекций у лошадей.

Предпосылки создания изобретения

Процессинг антигенов с помощью антиген-презентирующих клеток (APC) происходит двумя путями. Антигены, которые находятся внутри клетки, представляются MHC I (главный комплекс гистосовместимости класса I, MHC класса I) молекулами на поверхности клеток, в то время как внеклеточные антигены представляются MHC II (главный комплекс гистосовместимости класса II, MHC класса II) молекулами на поверхности клетки. Оба механизма инициируют иммунный ответ хозяина на антиген. Путь, который проходит антиген от момента поступления в клетку до презентации на клеточной поверхности в виде MHC II антигена, осуществляется с помощью различных органелл клетки, в частности, через эндоплазматический ретикулум, аппарат Г ольджи, сеть транс-Г ольджи, лизосомы, эндосомы и через компартменты MHC класса II (MIIC). MIIC играют важную роль в опосредованной МНС II презентации антигена. В этих органеллах клетки молекулы МНС II загружаются низкомолекулярными антигенами или протеолитическими фрагментами белков. В этом процессе инвариантна цепь (также называется MHC II гамма-цепью или Ii), которая первоначально является связанной с молекулой MHC II, подвергается протеолитической деградации, и антиген связывается с молекулой MHC II при регуляции различных белков, которые непосредственно или косвенно связываются с MHC II. Эти регуляторные молекулы в организме человека включают в себя, среди прочих, HLA-DM, HLA-DO, LAMP-1, LAMP-2, CD63, CD83 и др. Точная функция этих белков частично все еще является необъяснимой, но многие из них имеют сигнальные последовательности, которые способствуют их транспорту в лизосомы, эндосомы, в сеть транс-Гольджи, MIIC и т.д. Ряд протеаз является вовлеченным в протеолитический процессинг, необходимый для того, чтобы антиген мог быть представлен на молекулах MHC II. Протеазы, которые присутствуют в MIIC, включают, в частности, различных членов семейства катепсина, таких как, например, катепсин S и катепсин L. В отличных от человека видах гомологи молекулы MHC класса II имеют различные аминокислотные последовательности. У лошадей организация системы MHC является подобной таковой у людей с непрерывными участками класса I, III и II (Kelley J. и др., Immunogenetics 2005, 56:683-695).

Концепция обеспечения транспортного молекулы модулярного антигена (MAT) для модуляции иммунных реакций, связанных с ними конструкций, способа и их применения является раскрытой в WO 2004/035793 (эквивалентная заявка США US 2005/0281816). Этот документ описывает полезность молекулы MAT, которая состоит из трех частей, для введения эпитопов антигенов в клетки, определяя, таким образом, иммунный ответ, который подвергается модулияции с помощью такой молекулы MAT. В данном документе описываются различные транслокационные модули, нацеливающие модули, а также антигенные модули. Эта технология и лежащий в ее основе метод позволяют, во-первых, эффективно передавать антигены из внеклеточного пространства во внутриклеточное пространство клетки-мишени, и, во-вторых, обеспечивают возможность для антигенов после поступления их внутрь клетки эффективно достигать клеточных органелл для того, чтобы впоследствии подвергаться процессингу для презентации антигена. Как правило, этот двухэтапный процесс можно использовать для целенаправленной, эффективной модуляции иммунного ответа у субъекта. Использование MAT молекул раскрывается, например, у Martinez-Gomez J.M. и др. [Allergy 2009, 64(1): 172-178]; Rose H. (Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess, 2009, 96, 319-327), а также позднее у Senti G. и др. [J. Allergy Clin. Immunol., 2012, 129(5): 1290-1296]. На основе технологии MAT главный кошачий аллерген Fel d1 подвергали слиянию с транслокационным доменом белка, который имеет происхождение от TAT, и с укороченной инвариантной цепью человека для нацеливания на путь класса II MHC. Иммуногенность оценивали у мышей, в то время как потенциальные проблемы безопасности были оценены с помощью соответствующих тестов на основе реактивности базофилов, полученных от пациентов с аллергией на кошачью шерсть. Было продемонстрировано возможное применение этого модельного соединения. В данном источнике описывается, что ожидается, что молекулы MAT являются более безопасными и более эффективными в отношении индукции желаемого иммунного ответа, а именно снижения чувствительности к антигенам, чем рекомбинантные аллергены или экстракты аллергенов при использовании традиционной специфической для аллергена иммунотерапии (SIT). В недавней публикации Senti G. и др. была описана внутрилимфатическая иммунотерапия для лечения аллергии на кошачью шерсть у людей, которая индуцировала толерантность после трех инъекций. В данном способе было описано первое клиническое исследование для человека при использовании MAT - Fel d1, которое продемонстрировало безопасность и индукцию толерантности к аллергену после осуществления только трех внутрилимфатических

- 1 034692 инъекций. Дополнительные источники уровня техники являются следующими.

Gadermaier G. и др. (Molecular Immunology 2010, 47: 1292-1298) описывает нацеливание стабилизированной цистеином складки Art v1 для иммунотерапии аллергии на пыльцу полыни. Авторы использовали подходы генной инженерии для нацеливания посттрансляционных модификаций Art v1 с целью создания гипоаллергенной молекулы: (i) дисульфидные мостики домена дефенсина были разорваны с помощью сайт-направленного мутагенеза, и (ii) полученные мутантные конструкции экспрессировали в E.coli для получения негликозилированных белков. Тем не менее, задача заключалась только в манипуляциях с трехмерной складкой домена дефенсина Art v1 для устранения IgE-связывания (т.е. создание гипоаллергенной молекулы) путем замены единичных остатков цистеина на серин при сохранении интактными (т.е. немодифицированными) эпитопов, которые распознаются T-клетками (даже если таковые содержат остатки цистеина).

Доклад о работе третьего Havemeyer семинара по аллергенным заболеваниям лошадей (Holar, Iceland, June 2007, Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008, 126: 351-361) был сфокусирован на иммунологических и генетических аспектах гиперчувствительности к укусам насекомых (IBH) и рецидивирующей обструкцией дыхательных путей (RAO). На этом семинаре обсуждались новые подходы для осуществления SIT против IBH, в частности использование вирусных векторов или вакцинации белками при использовании аллергенов, слитых с молекулами модулярных транслокационных антигенов (MAT).

В ежегодных отчетах SIAF 2010 и 2011 гг. Crameri R. сообщает о применении MAT технологии для вакцинации подверженных IBH лошадей.

Однако основные проблемы возникали при производстве и изготовлении MAT молекул, описанных в уровне техники. В частности, стандартные способы, используемые при разработке процесса выделения и очистки (DSP) при изготовлении MAT молекул с применением надлежащей существующей производственной практики (GMP), не могут быть применены. Не удалось очистить гомогенные молекулярные виды MAT молекулы, что, очевидно, связано с их аномальными физико-химическими свойствами.

Некоторые известные способы очистки не могут быть применены (см., пример 5 в данном описании) при использовании MAT молекул, описанной в предшествующем уровне техники, несмотря на то, что исследовали различные принципы разделения (например, гель-фильтрационная хроматография, ВЭЖХ с обратной фазой). Способы, применяемые для определения чистоты рекомбинантных белков, в целом включают хроматографическое разделение, например, ВЭЖХ с обратной фазой и электрофоретическое разделение (например, капиллярный электрофорез, зональный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, SDS-ПАГЭ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях). Кроме того, эти аналитические методы не могут быть использованы для MAT молекул без специфической для молекулы адаптации. Для оценки чистоты должна быть разработана адаптированная специфическая SDS-ПАГЭ процедура исследования. Такая процедура исследования включает приготовление образца с восстанавливающим агентом и додецилсульфатом лития (LDS) и нагревание до 75°C, что приводит к получению множественных, воспроизводимых четких полос после электрофоретического разделения. Окрашивание при использовании синего красителя Кумасси приводит к линейному количественному поведению (денситометрия) в гелях. С помощью моноклонального антитела, которое позволяет осуществлять обнаружение модуля аллергена в молекуле MAT, проявляли основную полосу и несколько слабых полос. Все полосы мигрировали воспроизводимым образом до того же положения, что и в исходном геле, также после повторной загрузки второго геля с вырезанными полосами первого геля. Удивительно, но во всех этих полосах с кажущейся более низкой и более высокой молекулярной массой MAT молекулы полной длины были идентифицированы путем вырезания полос из геля, их переваривания трипсином и последующего анализа с помощью масс-спектрометрии (наноЖХ/ЭРИ-МС-МС). Из этих экспериментов можно сделать вывод о нетипичном, аномальном поведении различных вариантов фолдинга MAT молекул в SDS-ПАГЭ (гелевый сдвиг). Кроме того, во всех партиях MAT молекул могут быть обнаружены многомерные формы белка, которые было трудно отделить от мономерных форм.

Например, для экономических аспектов, а также для нормативных требований, необходимо улучшить (i) процесс изготовления MAT молекул и (ii) их пригодность для стандартных аналитических способов определения чистоты. Кроме того, для адаптации MAT молекул к специфическим целевым видам, таким как лошади, требуется адаптация иммунологического нацеливания в рамках технологии MAT.

Кроме того, MAT молекулы легко используются при аллергиях, которые вызываются известным основным аллергеном (например, аллергии на кошачью шерсть у людей, вызываемые Fel d1). Тем не менее, является сложным использовать MAT молекулы предшествующего уровня техники в клинических условиях, таких как аллергии, при которых, например, как известно, участвуют различные не реагирующие перекрестно аллергены, но важность таких аллергенов для стимуляции аллергии неизвестна (т.е. основные аллергены не известны).

Задача, которая лежит в основе изобретения, представляет собой улучшенные MAT молекулы, которые являются полезными в качестве активных агентов в фармацевтической композиции, такой как вакцина, которая преодолевает проблемы, существующие в области техники.

- 2 034692

Раскрытие изобретения

Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT), включающей:

(i) по крайней мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, (ii) по крайней мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида нацеливание молекулы iMAT на клеточные органеллы, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или загрузку MHC молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, и (iii) по крайней мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по крайней мере от одного полного или частичного эпитопа, по крайней мере одного антигена, предпочтительно по крайней мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая характеризуется тем, что, по крайней мере, в антигенной(ых) модуле(ях) по крайней мере один остаток цистеина является замещенным с помощью отличного аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина и/или аспарагиновой кислоты.

Предпочтительным является, когда по крайней мере в одном антигенном модуле все остатки цистеина являются замещенными с помощью отличного аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина и/или аспарагиновой кислоты. Более предпочтительно, когда в полной молекуле iMAT все остатки цистеина являются замещенными с помощью отличного аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина и/или аспарагиновой кислоты.

Предпочтительно, когда не все остатки цистеина являются замещенными с помощью отличного аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина и/или аспарагиновой кислоты, и даже некоторое количество остатков цистеина остается в цельной молекуле iMAT.

Предпочтительным является, когда все такие модули являются ковалентно связанными друг с другом, необязательно с помощью дополнительного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними, необязательно, всеми из таких, как первый, второй и/или третий модули.

Более предпочтительно, когда все такие модули являются ковалентно связанными друг с другом и никакого(их) дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) не присутствует между двумя или более соседними модулями из таких, как первый, второй и/или третий модули, вообще.

В другом аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения вакцины, или иммуногенной композиции, или фармацевтической композиции, включающей (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрыто или заявлено в данном изобретении.

В другом аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данном изобретении, или вакцины, или иммуногенной композиции, или фармацевтической композиции, как раскрыто или заявлено в данном изобретении, для применения в способе профилактики и/или терапии одной или более аллергий у лошадей, предпочтительно гиперчувствительности на укус насекомого (IBH), крапивницы и/или рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO). Соответствующие способы профилактики и/или лечения лошадей, которые в этом нуждаются, и применение для получения фармацевтической композиции/лекарственного средства для профилактики и/или лечения лошадей также предназначены, чтобы находиться в пределах объема настоящего изобретения.

В другом аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данном изобретении, или вакцины, или иммуногенной композиции, или фармацевтической композиции, как раскрыто или заявлено в данном изобретении, для применения в способе профилактики и/или терапии одного или более инфекционных заболеваний у лошадей, и/или предотвращения передачи одного или более инфекционных заболеваний у лошадей, и/или предотвращения передачи одного или более инфекционных заболеваний у лошадей переносчиками, предпочтительно питающимися кровью мухами, мошками, клещами и/или комарами, более предпочтительно Rhodococcus pneumonia, удушения, африканской чумы лошадей, вируса лихорадки Западного Нила, дерматофитии и/или паразитов пищеварительного тракта и/или других органов и/или криптоспоридиоза, гельминтов и/или их препатентных этапов развития. Соответствующие способы профилактики и/или лечения лошадей, которые в этом нуждаются, и применение для получения фармацевтической композиции/лекарственного средства для профилактики и/или лечения лошадей также предназначены, чтобы находиться в пределах объема настоящего изобретения.

В дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения нуклеиновой кислоты, которая кодирует (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрыто или заявлено в данном изобретении.

В дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена

- 3 034692 путем обеспечения вектора, включающего по крайней мере одну нуклеиновую кислоту, как раскрыто или заявлено в данном изобретении.

Еще в одном дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения первичной клетки или линии клеток, включающей по крайней мере одну нуклеиновую кислоту, как раскрыто или заявлено в данном изобретении, и/или по крайней мере один вектор, как раскрыто или заявлено в данном изобретении.

Неожиданно было обнаружено, что молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, как раскрыто или заявлено в данном изобретении, обладают физико-химическими и/или иммунологическими характеристиками, которые обеспечивают им преимущества по сравнению с MAT молекулами в соответствии с уровнем техники.

(i) Замена по крайней мере одного остатка цистеина, предпочтительно всех остатков цистеина, с помощью отличного аминокислотного остатка в антигенном(ых) модуле(ях), предпочтительно цельной молекулы iMAT, которая является выбранной in silico так, чтобы не нарушать стабильность заключительной iMAT молекулы, обеспечивает молекулу iMAT в соответствии с настоящим изобретением, которая неожиданно является приемлемой для применения стандартных процедур очистки для биофармацевтических средств, а также для стандартных аналитических способов.

(ii) Предпочтительная непосредственная ковалентная связь модулей молекулы iMAT, т.е. первого транслокационного модуля, второго нацеливающего модуля и третьего антигенного модуля, без какихлибо дополнительных спейсерных модулей между указанными модулями, т.е. при полном отсутствии дополнительных спейсерных модулей между двумя или более соседними модулями, такими как первый, второй и/или третий модуль, осуществляет свой вклад в получение дополнительных к указанным в (i) улучшенных характеристик молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением: такие молекулы iMAT, которые считаются более жесткими в отношении трехмерной структуры и, следовательно, не способны образовывать конформационные эпитопы IgE, являются еще более гипоаллергенными - они практически не имеют аллергенности, которая может быть обнаружена, как показано в примере 2, приведенном в данной заявке.

(iii) Предпочтительное присутствие (n) (квази) N-терминальной His-метки приводит к получению молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, которая может использоваться в качестве суррогатных маркеров для мониторинга иммунитета и/или длительности иммунитета, поскольку такой модуль метки, необязательно, вместе с одним или более соседними аминокислотными остатками из транслокационного модуля может использоваться для индукции специфического сигнала, который определяется иммунологически (например, антитело) у целевого субъекта, т.е. является специфическим для генерической структуры молекулы iMAT (см. пример 1 в данной заявке). Кроме того, присутствие такого модуля метки может быть использовано для разделения белков в образце, который включает молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, например, при использовании цинк- или кобальтзаряженных твердых носителей и, следовательно, дополнительно повышает возможность получения молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением при отсутствии агрегации в процессе очистки.

(iv) По крайней мере один нацеливающий модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является специфическим для вида, т.е. в случае предполагаемого применения таких молекул iMAT к лошадями, выбирается лошадиный модуль нацеливания, например инвариантная цепь лошади. С помощью такого специфического для вида нацеливания могут быть успешно достигнуты оптимизированные характеристики молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением в отношении к связыванию молекул MHC класса II.

(v) По крайней мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой аллерген. Таковой может быть получен из плесени (грибов и/или их спор), пыльцы, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий), предпочтительно из пыльцы с деревьев, трав, травянистых растений, амброзии и/или пыльцы растений крестоцветных Brassicaceae и/или грибов и/или их спор из родов Aspergillus, Alternaria, Botrytis, Cercospora, Cladosporium, Curvularia, Drechslera, Eurotium, Helminthosporium, Epicoccum, Erysiphe/oidium, Fusarium, Lichtheimia, Nigrospora, Penicillium, Periconia, Peronospora, Polythrincium, Saccharopolyspora (ранее также назывались Faenia или Micropolyspora), Thermoactinomyces, Stemphylium, Torula и/или клещей (или их фекалий) рода Acarus, Glycophagus, Tyrophagus, Dermatophagoides. По крайней мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением более предпочтительно представляет собой аллерген Culicoides. Аллерген выбирается в соответствии со следующими критериями: когда основные аллергены, вызывающие аллергию у пациентов, являются неизвестными, то по крайней мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран с помощью биоинформационного подхода, как описано иллюстративно и подробно изложено в примерах 6 и 7 в данной заявке. Таким образом, могут быть получены улучшенные молекулы MAT, которые могут быть использованы в качестве вакцин, в частности, например, для лечения и/или для профилактики аллергии у лошадей. По крайней мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением также может представлять собой антиген патогена, который принимает участие в одном или нескольких инфекционном(ых) заболевании(ях). Таковые могут иметь происхожде-

- 4 034692 ние от родов Rhodococcus, Streptococcus, Orbivirus, Flavivirus, Trichophyton, Microsporum, Cryptosporidium и/или Strongylus. По крайней мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением может также представлять собой антиген переносчика, который является вовлеченным в передачу одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий), например компоненты слюны Culicoides, Culex и/или Ixodes. Таким образом, могут быть получены улучшенные молекулы МАТ, которые могут быть использованы в качестве вакцин, например, для терапии и/или для профилактики и/или предотвращения передачи инфекционных заболеваний у лошадей.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает (изолированные) рекомбинантные белки, которые демонстрируют улучшенную растворимость, которые являются легко пригодными для хроматографических методов разделения и которые демонстрируют улучшенную стабильность.

Кроме того, (изолированные) рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно демонстрируют высокие активности и эффективности в индукции желаемых иммунологических эффектов, а именно преимущественное специфическое для вида модулирование иммунного ответа на аллергены у субъекта, предпочтительно у лошади. Например, с помощью этих способов становится возможным лечение и ослабление симптомов IBH у пораженных животных семейства лошадиных.

Подробное описание изобретения

Перед тем как варианты осуществления в соответствии с настоящим изобретением будут описаны подробно, следует отметить, что, как используется в данной заявке и в приложенных пунктах формулы, сингулярные формы какой-либо и данный включают в себя ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют те же значения, которые обычно понятны среднему специалисту в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все приведенные диапазоны и значения могут варьировать в в пределах от 1 до 5%, если не указано иное, или иным образом не является известным специалисту в данной области техники, поэтому термин приблизительно, как правило, опускается в описании и формуле изобретения. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, могут быть использованы в практике или при испытании настоящего изобретения, предпочтительные способы, устройства и материалы будут описаны далее. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в данную заявку в качестве ссылки с целью описания и раскрытия веществ, наполнителей, носителей и методик, как описано в публикациях, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Ничто в данной заявке не должно быть истолковано как допущение того, что изобретение не имеет права датировать такое раскрытие задним числом на основании предшествующего изобретения.

Термины изолированный рекомбинантный белок, рекомбинантный белок и/или улучшенная молекула MAT (iMAT) используются попеременно в описании данного изобретения. Все они имеют идентичное значение.

Термин модуль в описании настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, например к части, блоку или фрагменту полипептида, обычно коротким аминокислотным/пептидным последовательностям, которые имеют определенную функцию.

Термин первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, позволяющую осуществлять транслокацию (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT), из внеклеточного пространства внутрь клеток в данной заявке также взаимозаменяемо может быть сформулирован как транслокационный модуль или последовательность транслокации, и в контексте настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, которая способствует транспорту молекулы переносчика, например аминокислотной последовательности, пептида, полипептида, белка и веществ других классов, таких как нуклеиновые кислоты или фармацевтически активные ингредиенты (API), внутрь клеток, в частности эукариотических клеток, более конкретно клеток, которые экспрессируют молекулы MHC класса II на своей поверхности и/или молекулы MHC класса I на своей поверхности, как является известным в литературе.

С помощью присутствия транслокационного модуля является возможным способствовать поступлению указанной молекулы переносчика в клетки.

Аминокислотные последовательности, полезные в качестве транслокационных модулей, описываются в уровне техники. Например, US 7653866 раскрывает несколько полезных последовательностей транслокации, включающих HIV-tat молекулу или белок VP22, который имеет происхождение от вируса простого герпеса. Этот принцип содействия поступлению данной целевой молекулы внутрь клеток описывается в ряде различных исследований в соответствующей патентной и непатентной литературе. Кроме того, приемлемые последовательности транслокации включают последовательности гомеопротеина, последовательности лейциновых застежек или обогащенные лизином и обогащенные аргинином последовательности, а также различные другие последовательности белков или полипептидов, которые секретируются, несмотря на отсутствие сигнальной последовательности секреции. Особенно полезными являются вирусные пептидные последовательности, например белок активатора транскрипции HIV (HIV tat). Последовательность Tat или Tat пептид были описаны в уровне техники, включая их различные мо

- 5 034692 дификации. Все вариации, которые описаны в уровне техники для пептидных последовательностей Tat, являются в общем случае приемлемыми в качестве транслокационных модулей. Другие примеры включают VP22 пептид, а также пептиды Antennapedia (сложный локус, в котором локализованы гомеозисные мутации), имеющие происхождение от гомеотического белка антеннапедия Drosophila. Кроме того, могут использоваться другие гомеопротеины. Различные примеры приемлемых гомеопротеинов описываются в уровне техники. Кроме того, могут использоваться белки лейциновых застежек, подобные человеческому cFos-(139-164), или человеческому cJun-(252-279). Кроме того, обогащенные аргинином и/или обогащенные лизином пептиды являются приемлемыми в качестве транслокационных модулей, включая последовательности, подобные HIV-1 rev (34-50), или другие пептиды, которые имеют происхождение от вирусов или дрожжей. Конечно, пептиды, обогащенные полиаргинином и/или полилизином, могут быть получены синтетически. Указанные обогащенные полиаргинином и/или полилизином пептиды могут включать дополнительные аминокислоты. Предпочтительные примеры описываются в соответствующем уровне техники.

В предпочтительном варианте осуществления по крайней мере один транслокационный модуль включает (предпочтительно состоит из) аминокислотную последовательность, которая не состоит из полной белковой последовательности, как иллюстрируется выше, но вместо этого содержит минимальную последовательность, которая все еще остается функциональной, т.е. такой, которая является способной эффективно содействовать поступлению в клетки. Приемлемые минимальные последовательности, например, представляют собой аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1.

В другом предпочтительном варианте осуществления по крайней мере один транслокационный модуль включает (предпочтительно состоит из) HIV-tat, VP22 и/или Antennapedia или их частичные последовательности, при условии, что такой по крайней мере один транслокационный модуль является функциональным в качестве модуля для транслокации из внеклеточного пространства внутрь клеток.

Термин второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять видоспецифическое внутриклеточное нацеливание (изолированного) рекомбинантного белка предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT), на клеточные органеллы, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или загрузку MHC молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, в данной заявке также взаимозаменяемо называется нацеливающим модулем или нацеливающей последовательностью, и в контексте настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, которая позволяет осуществлять/способствует внутриклеточному транспорту (изолированных) рекомбинантных белков, как раскрывается и заявлено в данной заявке, к таким клеточным органеллам, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или загрузку MHC молекул антигенами.

В частности, такие клеточные органеллы включают эндоплазматический ретикулум, аппарат Г ольджи, сеть транс-Гольджи, лизосомы, эндосомы и компартменты MHC класса II. Такие внутриклеточные органеллы являются вовлеченными в такие процессы, как, например, транспорт и/или процессинг антигенов, получение и/или загрузка молекул МНС II антигенами или процессированными антигенами, и/или транспорт молекул МНС II, нагруженных такими антигенами, на свою поверхность.

Ряд последовательностей является известным в уровне техники. Примечательный пример полезных нацеливающих последовательностей включает инвариантную цепь молекулы МНС класса II, которая также является известной как Ii инвариантная цепь или МНС II гамма-цепь. Различные варианты инвариантной цепи описываются в патентной и непатентной литературе.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения инвариантная цепь является выбранной из видов, у которых иммунный ответ должен подвергаться модулированию, и/или из видов, у которых молекула iMAT должна быть нацеленной на внутриклеточное пространство.

Например, для семейства лошадиных, таких как лошади, предпочтительная инвариантная цепь является выбранной из лошадиной инвариантной цепи, включающей, предпочтительно состоящей из, аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 или ее фрагмент, при условии, что фрагменты поддерживают ее функцию транспорта внутрь клетки. Такие предпочтительные фрагменты представляют собой аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 15 и/или 16.

Другие приемлемые примеры для нацеливания последовательностей включают лизосомальные мембранные белки, которые включают последовательности, приемлемые в качестве нацеливающих модулей. Существует ряд мембранных белков, которые образуются в лизосомах и имеют последовательности мотивов, которые позволяют осуществлять нацеливание на лизосому. Эти группы белков включают, среди прочих, lamp 1, lamp 2, lamp 3, limp II и lap. Кроме того, белки тетраспанина являются известными в уровне техники в качестве нацеливающих модулей. Дополнительные белки можно обнаружить в эндосомальных/лизосомальных компартментах, эти белки демонстрируют свойства нацеливания. Специалист в данной области техники знает, как определить приемлемые нацеливающие последовательности соответственно.

В другом предпочтительном варианте осуществления по крайней мере один нацеливающий модуль включает, предпочтительно состоит из, инвариантную цепь лошади, и предпочтительно состоит из одной или более из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 15, 16.

- 6 034692

Термин третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по крайней мере от одного полного или частичного эпитопа, по крайней мере одного антигена, предпочтительно по крайней мере одного аллергена, определяющего специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такого (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT) (у субъекта, предпочтительно представителя семейства лошадиных), который в данной заявке также взаимозаменяемо упоминается как антигенный модуль или антигенная последовательность, в контексте настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, которая позволяет модулировать иммунный ответ против эпитопа/антигена и определяет специфичность иммунного ответа у субъекта, предпочтительно у лошади.

В этом контексте такой(ие) антигенный(ые) модуль(и) включает(ют) по крайней мере один остаток цистеина, который является замещенным с помощью отличного аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина и/или аспарагиновой кислоты. Таким образом, иммунный ответ отличается от иммунного ответа субъекта, предпочтительно лошади, который подвергается воздействию при использовании неизмененной аминокислотной последовательности антигена.

Не существует никаких ограничений, связанных с антигенами на основе данного способа. Этот способ может быть использован, например, для активации иммунной системы субъекта против патогенных микроорганизмов, таких как, например, вирусы, бактерии, грибы, паразиты, простейшие и т.д., т.е. в самом общем виде, в качестве вакцины. Кроме того, этот способ может быть использован не только непосредственно против таких патогенных микроорганизмов, но и для активации иммунной системы хозяина для предотвращения передачи трансмиссивных заболеваний, включающих заболевания, которые вызываются вирусами, бактериями, грибами, паразитами, простейшими и т.д. Кроме того, этот способ может использоваться для активации иммунной системы против дегенеративных клеток, таких как, например, опухолевые клетки и т.д. Тем не менее, он также может быть использован, с другой стороны, для десенсибилизации иммунной системы субъекта против аллергенов, таких как, например, пищевые аллергены, аллергены из плесени (грибов и/или их спор), пыльцы, шерсти животных, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий), токсинов насекомых и т.д., или для целенаправленного подавления иммунной системы, например, если присутствуют аутоиммунные реакции, такие как, например, артрит, ревматизм, диабет, СКВ (системная красная волчанка) и т.д., а также для подавления реакций отторжения трансплантата. Дополнительные расстройства, которые не были упомянуты и которые являются связанными с иммунной реакцией, которая является слишком сильной или слишком слабой, точно так же можно лечить с помощью молекул iMAT, как раскрыто и заявлено в данной заявке.

Является возможным использовать в качестве антигенных модулей для целей настоящего изобретения, в принципе, все типы антигенов, способных модулировать иммунный ответ. Как антигены, которые в настоящее время являются известными, так и антигены, которые будут обнаружены в будущем, являются приемлемыми. В некоторых случаях антигены могут быть также такими, которые не приводят к иммунному ответу при использовании обычных способов иммунизации, известных в данной области техники в настоящее время, но которые при использовании нового способа, описанного в настоящем изобретении, приводят к иммунному ответу у субъекта. Кроме того, термин антиген включает антигенные фрагменты, содержащие антигенную детерминанту/антигенные детерминанты, который(ые) также является(ются) известным(и) как эпитоп(ы). Таким образом, антигенный модуль представляет собой всю молекулу, например белок, или представляет собой часть молекулы, т.е. ее фрагмент, такой как пептид, охватывающий по крайней мере одну антигенную детерминанту или эпитоп. По крайней мере одна антигенная детерминанта или эпитоп способны вызывать иммунный ответ, направленный против антигена. Эпитоп может содержать одну или более чем одну аминокислоту или пептид или другую структуру, способную вызывать иммунный ответ, такую как структуры сахаров, фосфорилированных аминокислот и т.д., или их комбинации. Антиген может представлять собой детерминанту непрерывного типа (т.е. такой, который не зависит от конформации, например, представлен в нативных и денатурированных белках) или детерминанту прерывистого типа (т.е. такой, который зависит от конформации, например, представлен только в нативной, свернутой форме, но не присутствует в денатурированных белках). Можно использовать не только белки и пептиды, но и структуры сахаров, липидов, например липополисахариды, липотейхоевые кислоты и другие компоненты бактериальных мембран (CD1b, например, связывает структуры сахаров и липиды), нуклеиновые кислоты, такие как, например, ДНК, содержащие мотивы CpG, различные органические вещества, такие как, например, латекс или фармацевтически активные вещества, такие как антиген, для целей настоящего изобретения. Антиген может быть получен из всех возможных жизненных форм, таких как, например, люди, животные, растения, грибы, паразиты, одноклеточные или многоклеточные микроорганизмы, вирусы и другие формы жизни. Антигены могут быть выделены из биологического материала, могут быть получены в виде рекомбинантных антигенов или получены путем синтеза, например путем пептидного синтеза. Синтетически полученные антигены могут представлять собой вещества, которые встречаются в природе, или те, которые не встречаются в природе, но могут быть получены путем химического синтеза. Примеры веществ, которые не встречаются в природе, но которые, однако, пригодны в качестве антигена при некоторых обстоятельствах, напри

- 7 034692 мер синтетически полученные вещества, которые присутствуют в лекарственных средствах, или синтетические пептиды, включающие аминокислотные последовательности, которые не встречаются в природе, или пептидомиметики и т.д. Встречающиеся в природе, или синтетические, или рекомбинантные антигены могут быть модифицированы с помощью молекулярной биологии, ферментативных, химических и/или других способов для того, чтобы придать им свойства, которые являются более выгодными для конкретного варианта применения. Эти полезные свойства, в частности, могут представлять собой большую или меньшую активность в качестве антигена, более широкое или более специфическое действие в качестве антигена, лучшую растворимость в гидрофильных или гидрофобных растворителях, большую способность к проникновению антигенных модулей для клеточных мембран, для мембран органелл, для гематоэнцефалического барьера и т.д., более высокий или более низкий период полураспада in vivo или in vitro, более низкую или более высокую токсичность, лучшую способность к выявлению антигена in vivo или in vitro после применения антигена в виде молекулы iMAT и т.д. Кроме того, для целей настоящего изобретения является возможным объединить множество антигенов в одном модуле антигена. Для этого является возможным для идентичных антигенов присутствовать в количестве более чем одна копия в антигенном модуле, или является возможным, например, для различных вариантов одного и того же антигена, чтобы они были объединены в антигенном модуле. Комбинация антигенов, например антигена 1, и других антигенов, например антигена 2, в антигенном модуле также является возможной и т.д. Дополнительные комбинации, такие как, например, антиген 1 в количестве более чем одна копия, и антигена 2 в единственном количестве, также могут быть объединены в антигенном модуле и т.д. Также дополнительно является возможным для одного или нескольких различных и/или одного или более одинаковых антигенных модулей присутствовать в молекуле iMAT. Является возможным, в принципе, для всех возможных комбинаций одного или множества, чтобы присутствовали идентичные или измененные копии антигенов, которые имеют происхождение от одного или более различных антигенов, которые будут объединены для целей настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте реализации антигенный модуль включает по крайней мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по крайней мере от одного антигена, где такой антиген представляет собой аллерген. По крайней мере один эпитоп может вызывать иммунный ответ против аллергена, в соответствии с чем эпитоп может содержать одну или более чем одну структуру, например пептид, способный вызвать иммунный ответ. Эпитоп может представлять собой непрерывный эпитоп или прерывистый эпитоп аллергена. Эпитопы предпочтительно могут состоять по крайней мере из восьми аминокислот в длину, предпочтительно по крайней мере десяти аминокислот в длину, более предпочтительно по крайней мере 13 аминокислот в длину. Антигенный модуль включает по крайней мере один полный или частичный эпитоп, а также может содержать два или более полных или частичных эпитопа, которые могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Кроме того, антигенный модуль может включать дополнительные аминокислотные последовательности, примыкающие по крайней мере к одному полному или частичному эпитопу. Эпитоп может представлять собой существующий в природе эпитоп или может быть модифицированным эпитопом, который либо модифицирован в своей аминокислотной последовательности, либо при использовании одной или более посттрансляционных модификаций.

В одном варианте реализации по крайней мере один третий антигенный модуль включает по крайней мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по крайней мере от одного антигена патогена, вовлеченного в одно или более инфекционное(ые) заболевание(я). Таковой может иметь происхождение от родов Rhodococcus, Streptococcus, Orbivirus, Flavivirus, Trichophyton, Microsporum, Cryptosporidium и/или Strongylus. По крайней мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением может также представлять собой антиген переносчика, который является вовлеченным в передачу одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий), например компоненты слюны Culicoides, Culex и/или Ixodes.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществленния по крайней мере один третий антигенный модуль включает по крайней мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение от, по крайней мере, одного аллергена, который вызывает одну или более аллергию(ий) у лошадей. Такой может представлять собой по крайней мере один полный или частичный эпитоп по крайней мере одного аллергена, который имеет происхождение от плесени (грибов и/или их спор), пыльцы, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий), предпочтительно от пыльцы деревьев, трав, травянистых растений, амброзии и/или пыльцы растений крестоцветных Brassicaceae и/или грибов и/или их спор из родов Aspergillus, Alternaria, Botrytis, Cercospora, Cladosporium, Curvularia, Drechslera, Eurotium, Helminthosporium, Epicoccum, Erysiphe/oidium, Fusarium, Lichtheimia, Nigrospora, Penicillium, Periconia, Peronospora, Polythrincium, Saccharopolyspora (ранее также назывались Faenia или Micropolyspora), Thermoactinomyces, Stemphylium, Torula и/клещей (или их фекалий) рода Acarus, Glycophagus, Tyrophagus, Dermatophagoides.

В предпочтительном варианте осуществления такой предпочтительно представляет собой по крайней мере один полный или частичный эпитоп по крайней мере одного аллергена, который имеет происхождение от насекомых, которые питаются кровью, более предпочтительно от рода Culicoides.

- 8 034692

Примеры аллергенов рода Culicoides являются представленными на фиг. 1, которая идентифицирует виды, аллерген и номер доступа UniProt (обновление базы данных UniProt 2013_09).

В дополнительном предпочтительном варианте реализации такой по крайней мере один аллерген представляет собой Cul n4, Cul o1, Cul o2, Cul o3, Cul o4 и/или Cul o7 аллерген. Предпочтительные специфические последовательности антигенных модулей представляют собой аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 18, 19.

Термин иммунный ответ, который модулируется путем (...) или, взаимозаменяемо, иммуномодуляторный иммунный ответ в связи с (изолированным) рекомбинантным белком и/или молекулой iMAT в контексте настоящего изобретения относится к иммуногенным и/или толерогенным иммунным ответам.

Термин аллерген в контексте настоящего изобретения относится к типу антигена, который относится к типу антигена, который в нативной форме вызывает слишком энергичный иммунный ответ, при котором иммунная система отбивает все выявленные угрозы, которые иначе были бы безвредны для субъекта. Как правило, эти виды реакций приводят к фенотипу, известному как аллергии. Различные типы аллергенов являются описанными в предшествующем уровне техники, включая пищевые продукты, лекарственные препараты, продукты животного происхождения, природные или синтетические материалы. Предпочтительно белок считается аллергеном в том случае, когда он вызывает в нативной форме специфический IgE ответ по крайней мере у пяти субъектов, предпочтительно лошадей. Во избежание сомнения, аллерген в связи с по крайней мере одним третьим антигенным модулем, включающим по крайней мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по крайней мере от одного аллергена уже не нуждается в том, чтобы находиться в нативной форме, которая также является предпочтительной, другими словами, термин аллерген в контексте настоящего изобретения также явным образом относится к ненативным аминокислотным последовательностям в составе молекул iMAT, как описано и заявлено в данной заявке, и которые уже не вызывают специфического IgE ответа по крайней мере у пяти субъектов, предпочтительно лошадей.

Термин эпитоп, который в данной заявке также взаимозаменяемо упоминается как антигенная детерминанта, в контексте настоящего изобретения относится к части антигена, которая распознается иммунной системой, либо B-клетками, либо T-клетками. Эпитопы являются представленными на поверхности антигенпрезентирующих клеток с помощью молекул MHC, с которым они являются связанными.

Термин субъект, который в данной заявке также взаимозаменяемо упоминается как индивидуум и/или организм, в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к лошадям.

Термин лошадиные, который в данной заявке также взаимозаменяемо упоминается как лошадь, в контексте настоящего изобретения включает в себя любого члена рода Equus. Он охватывает, например, любую лошадь, пони и/или осла, таксономические обозначения Equus ferus и/или Equus caballus, и/или подвиды Equus ferus caballus. Лошадиные, например, могут представлять собой домашнюю лошадь.

Термины пептид и белок используются как эквиваленты в контексте настоящего изобретения. Пептид или белок для целей настоящего изобретения означает ковалентное соединение по крайней мере двух аминокислот посредством пептидной связи. Термин аминокислота и термин аминокислотный остаток используются в качестве эквивалентов в настоящей заявке, т.е. смысл этих двух терминов одинаковый. Термины аминокислота/аминокислотный остаток и пептид/белок используются в настоящей заявке в форме максимально широкого определения.

В связи с этим термин рекомбинантный белок относится к полипептиду, который может быть получен с помощью генной инженерии и путем экспрессии в эукариотических или прокариотических системах. Кроме того, указанный термин охватывает полипептиды, полученные искусственным путем (например, с помощью твердофазного синтеза).

Как используется в данной заявке, термин отличный аминокислотный остаток относится к известному аминокислотному остатку, кроме цистеина, если не указано иное. Например, указанный остаток аминокислоты может представлять собой природный аминокислотный остаток, такой как серин или изолейцин.

Как используется в данной заявке, термин линейная форма относится к белкам в соответствии с настоящим изобретением, у которых отсутствует вторичная структура. Такие белки часто предполагаются как такие, которые обладают неупорядоченной конформацией, в которой единственная закрепленная взаимосвязь представляет собой соединение смежных аминокислотных остатков посредством пептидной связи.

В предпочтительном варианте осуществления (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрыто или заявлено в данной заявке, присутствует в мономерной форме и/или линейной форме.

Как используется в данной заявке, термин лечение относится к введению (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрывается и заявлено в данной заявке, и/или соответствующих вакцин и/или иммуногенных композиций, и/или фармацевтических композиций для того, чтобы получить желательные клинические результаты, включая профилактическое и/или терапевтическое лечение.

- 9 034692

Как используется в данной заявке, термин иммунотерапия относится к терапевтическому и/или профилактическому лечению субъекта, например, путем профилактической и/или терапевтической вакцинации.

Как используется в данной заявке, термин переносчик в связи с передачей одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) относится к живому организму и в данной заявке попеременно используется с термином биологический переносчик, биологический носитель и/или носитель заболевания, таким как мухи, мошки, клещи и/или комары, которые питаются кровью.

Кроме того, является возможным и предпочтительным, чтобы (изолированный) рекомбинантный белок, как описано и заявлено в данном изобретении, дополнительно содержал по крайней мере один tag модуль. То есть является возможным и предпочтительным, чтобы один или несколько различных и/или идентичные tag модулей являлись частью (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данной заявке. Tag модули могут представлять собой короткие пептиды, которые часто включают вплоть до 20 аминокислот или функциональных групп, которые не состоят из аминокислот, такие как, например, биотин или дигоксигенин. Приемлемые tag модули включают в себя хорошо известную и предпочтительную His-метку, содержащую последовательность гистидина в количестве от 4 до 12, или более предпочтительно непосредственно соседние остатки гистидина, предпочтительно 5, 6 или 7 последовательных остатков гистидина. Другие приемлемые модули включают в себя HA-метку, FLAG-метку, GST-метку или Strep-метку. Несмотря на то, что метка может присутствовать в любом месте (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данной заявке, в предпочтительном варианте осуществления модуль метки присутствует на N-терминальном конце и/или на C-терминальном конце (изолированного) рекомбинантного белка.

Модули метки являются полезными для изоляции (изолированных) рекомбинантных белков, как описано и заявлено в данной заявке, и дополнительно позволяют обнаруживать присутствие таких (изолированных) рекомбинантных белков in vitro или in vivo. Кроме того, модуль метки, необязательно, вместе с одним или несколькими соседними аминокислотными остатками из соседнего модуля, или линкер, который разделяет друг от друга различные модули, может быть использован для того, чтобы индуцировать специфический иммунологически определяемый сигнал (например, антитело) у субъекта, представляющего интерес, который может быть использован в качестве суррогатного маркера иммунитета и/или длительности иммунитета. Иммунотерапии при использовании (изолированных) рекомбинантных белков, как описано и заявлено в данной заявке, вызывает специфический для антигена, предпочтительно специфический для аллергена, иммунный ответ у исследуемых субъектов, который является качественно неотличимым от естественного иммунного ответа после воздействия существующих в природе антигенов, предпочтительно аллергенов. Таким образом, антитела, связывающиеся с антигенным модулем, являются непригодными в качестве суррогатного маркера эффективности индуцированного молекулой iMAT иммунного модулирующего эффекта. Это препятствие может быть устранено путем определения уникального специфического для антигена иммунологического сигнала, полученного с помощью Cтерминального и/или N-терминального модуля метки необязательно вместе с соседними аминокислотными остатками. Следовательно, является возможным обеспечить подходящие суррогатные маркеры.

В предпочтительном варианте реализации (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрывается и заявлено в данной заявке, дополнительно включает по крайней мере один модуль метки, предпочтительно по крайней мере одну His-метку, где такой по крайней мере один модуль метки предпочтительно представляет собой N-терминальный и/или С-терминальный конец (изолированного) рекомбинантного белка, более предпочтительно N-терминальный конец после одного остатка метионина.

Кроме того, модули (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрывается и заявлено в данной заявке, в частности, по крайней мере один транслокационный модуль, по крайней мере один нацеливающий модуль и по крайней мере один антигенный модуль могут необязательно быть разделены одним или более спейсерными модулями, расположенными по крайней мере между двумя такими модулями.

Спейсерные модули могут представлять собой, в частности, пептидные последовательности или органические молекулы. Многочисленные спейсерные молекулы, которые могут быть использованы для целей данного изобретения, являются известными в области техники. Кроме того, также является возможным использовать для целей данного изобретения спейсерные молекулы, которые могут быть усовершенствованы или раскрыты в будущем. Приемлемые спейсерные модули представляют собой, среди прочих, пептидные спейсеры, поперечно-сшивающие агенты, природные или синтетические полимеры, такие как, например, нуклеиновые кислоты, замещенные или незамещенные углеводороды и подобные им.

Соединение может осуществляться как за счет ковалентных (предпочтительно), так и нековалентных связей. Спейсерные модули имеют задачу, в частности, разделения различных модулей (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данной заявке, друг от друга в пространстве таким образом, что они не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга с точки зрения их функциональных возможностей. Модули (изолированного) рекомбинантного белка для целей настоящего изобретения могут быть соединены одним или несколькими спейсерными модулями, которые могут подвергаться расщеплению с помощью химических и/или ферментативных реакций, например протеаза- 10 034692 ми. Таким образом, можно разделить модули (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данном изобретении, которые соединены спейсерными модулями, друг от друга, по мере необходимости.

Однако в предпочтительном варианте реализации, в частности, когда антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по крайней мере от одного полного или частичного эпитопа, по крайней мере одного антигена, который представляет собой по крайней мере один аллерген, никаких таких дополнительных спейсерных модулей, т.е. никаких модулей между двумя или более соседними модулями такого первого, второго и/или третьего модулей не присутствует вообще.

Любое желательное изменение размещения индивидуальных модулей (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрывается и заявлено в данной заявке, является в общем случае возможным. Каждый модуль может присутствовать один или более раз в (изолированном) рекомбинантном белке. Минимальное требование представляет собой присутствие по крайней мере одного транслокационного модуля, по крайней мере одного нацеливающего модуля и по крайней мере одного антигенного модуля. Дополнительные модули, такие как модули метки, спейсерные модули и т.д., могут факультативно присутствовать, но это не является обязательным. Все модули могут присутствовать один или несколько раз в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Если модули присутствуют более чем один раз, то они могут присутствовать в виде идентичных копий или в виде различных версий модуля в каждом случае в единственном экземпляре или более чем в одном экземпляре. Также является возможным для совершенно разных модулей одного и того же класса модулей, например модуля His-метки и модуля биотиновой метки, присутствовать в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Оба модуля функционально осуществляют одну и ту же задачу (модуль метки) в (изолированном) рекомбинантном белке, но не должны иметь ничего общего с точки зрения их молекулярной структуры.

В предпочтительном варианте реализации является возможным, чтобы две или более копий одного из модулей являлись присутствующими в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. То есть могут присутствовать две или более копий идентичных или различных антигенных модулей. В качестве альтернативы (изолированный) рекомбинантный белок может содержать два различных антигенных модуля для модулирования иммунного ответа у субъекта.

Две или более идентичные копии антигенного модуля в рекомбинантном белке могут, например, вызывать улучшенный иммунный ответ на такой релевантный антиген. Два или более различных антигенных модуля могут, например, соединяться в один (изолированный) рекомбинантный белок для того, чтобы модулировать одновременно иммунный ответ на два или более различных антигена. Два или более различных транслокационных модулей могут использоваться в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Например, Tat последовательность и VP22 последовательность могут служить для того, чтобы сделать транслокацию более эффективной, поскольку транслокация (изолированного) рекомбинантного белка потом осуществляется эффективно в более широком спектре различных типов клеток или типов тканей. Также является возможным, например, использовать два или более модулей метки в одном (изолированном) рекомбинантном белке, например, His-метку и FLAG-метку, в соответствии с этим, например His-метка используется для рекомбинантного белка, а, например, FLAG-метка служит для определения (изолированного) рекомбинантного белка. Является возможным также использовать два или более различных модулей в одном (изолированном) рекомбинантном белке, например последовательность из инвариантной цепи молекулы MHC II и дополнительный нацеливающий модуль группы манноза 6-фосфата. Например, инвариантная цепь действует в качестве нацеливающего модуля на MIIC, а группа маннозаы 6-фосфата опосредует нацеливание на липосому. Таким образом, является возможным повышать эффективность презентации антигена или ряда различных эпитопов антигена, презентированного с помощью антиген-презентирующих клеток в целом. Кроме того, молекула iMAT в соответствии с настоящим изобретением может охватывать две или более различных инвариантных цепей, которые имеют происхождение от идентичных или различных видов, позволяя, таким образом, использовать белки в соответствии с настоящим изобретением у различных видов.

Положение отдельных модулей в (изолированных) рекомбинантных белках, как раскрывается и заявлено в данной заявке, также можно варьировать по желанию, до тех пор, пока присутствуют по крайней мере один транслокационный модуль, по крайней мере один нацеливающий модуль и по крайней мере один антигенный модуль. Также возможно для всех или некоторых из модулей в (изолированном) рекомбинантном белке, например, присутствовать не в виде линейного последовательного расположения модулей, а в виде круговой или разветвленной структуры модуля, либо в форме дендримеров, либо в виде комбинации линейной и/или разветвленной и/или круговой и/или дендритной части молекулы. Существуют ряд коммерческих поставщиков экспрессионных векторов, поставляющих специфические векторы, которые делают возможным получение круговых слитых белков с помощью таких механизмов, как, например, IMPACT™-TWIN система от New England Biolabs, Beverly, MA, США. Разветвленные модули могут быть получены путем синтеза, например, пептидов, в которых, начиная от полиШ-лизина

- 11 034692 новый остаток лизина присоединен к каждой свободной аминогруппе каждого из последующих остатков лизина. Таким образом, можно создать пептидную структуру с практически любой степенью разветвленности. Впоследствии является возможным синтезировать, например, транслокационные модули и/или нацеливающие модули на разветвленной основной структуре пептида. Дополнительные модули также могут быть соединены на линейной, круговой или разветвленной основной структуре пептида путем лигирования белка. Кроме того, можно ввести группы биотина, например, в пептид основной структуры в процессе синтеза пептида, а модули затем могут быть присоединены к этим группам биотина с помощью, например, стрептавидина, системы Strep метки или с помощью системы PinPoint™ (соответственно, IBA GmbH, Gottingen, Германия и Promega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, США). Модули, присоединенные таким путем, затем соединяются с помощью нековалентных связей с основной структурой пептида.

В предпочтительном варианте реализации (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрывается и заявлено в данной заявке, включает, предпочтительно состоит из, одну или более аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 21, 22, 23.

(Изолированные) рекомбинантные белки, как раскрывается и заявлено в данной заявке, являются особенно полезными в способе, который, в частности, относится к терапии и/или профилактике у лошадей, страдающих от гиперчувствительности к укусам насекомых (IBH) и/или крапивницы.

Гиперчувствительность на укус насекомого может быть вызвана в ином случае безвредной слюной насекомого, ядом, частями тела, выделениями или секретами, которые вызывают системные реакции у субъектов. На самом деле, IBH представляет собой аллергическое заболевание кожи лошадей, которое вызывает страдание у лошадей и проявляется как хронический рецидивирующий сезонный аллергический дерматит, который часто вызывается укусами насекомых рода Culicoides, которые встречаются в различных районах земного шара. Сообщается о распространении IBH по всему миру с различными наименованиями, такими как дерматоз Свита, летний зуд, летняя экзема, дерматит Кассена, дерматит Квинсленда, сезонный дерматит или гиперчувствительность к Culicoides. Подверженные заболеванию субъекты чешутся и находятся в состоянии тревоги, а также интенсивно чешут и кусают себя. Типичным клиническим признаком является зуд, образование волдырей на месте укуса насекомого, которые могут мокнуть, вызывать образование струпьев, корки и отшелушивание кожи. Продолжительное расчесывание и покусывание приводят, в частности, к выпадению шерсти и повреждению кожи, иногда с кровотечением открытых ран. Иногда может возникать вторичная бактериальная инфекция. Кроме того, не является редкостью для лошадей вычесывание их гривы и верхней части хвоста. В долгосрочной перспективе может произойти утолщение кожи и потеря пигментации волос. Наиболее часто поражаются грива и хвост; тем не менее, лошади с тяжелыми признаками могут иметь повреждения на больших площадях всего тела. Диагностика основывается на клиническом исследовании и типичных, сезонно возникающих симптомах.

Мало что известно о патофизиологии IBH у лошадей. Как предполагается, у этих животных существуют значительные отличия аллергии с проявлениями в коже по сравнению с другими видами. Таким образом, и их ответ на лечение отличается, например, антагонисты рецепторов гистамина не в состоянии улучшить клинические симптомы (Olsen и др. Vet. J. 2011, 187: 347-351). Также специфическая для аллергена иммунотерапия (SIT) безуспешно использовалась ранее для лечения лошадей с IBH (Ginel и др., Vet. Derm. 2014, 25: 29-e10).

Для того чтобы решить эту медицинскую проблему по крайней мере один антигенный модуль в предназначенном для лечения IBH (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке, выбирают из группы недавно обнаруженных аллергенов, изолированных от мошек различных видов рода Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae).

Кроме того, страдающие от IBH лошади имеют в 7,1 раз повышенный риск возникновения и страдания от крапивницы [Kehrli D. и др., J. Vet. Intern. Med. 2015, 29(1): 320-326]. Крапивница, которая также является известной как уртикарная сыпь или как крапивная лихорадка, характеризуется дискретными вздутиями, возникающими на коже. Это могут быть круглые очаги, кольцеобразные поражения, напоминающие по форме подкову, или такие, которые имеют другие необычные формы. Большинство случаев представляют собой рецидивирующую, внезапно возникающую крапивницу, которая спонтанно разрешается в течение 24-48 ч или нескольких дней.

Существует хорошее доказательство того, что существует опосредованный IgE аллергический компонент, вовлеченный в крапивницу. Однако патофизиология до сих пор является плохо изученной. Непосредственными запускающими сигналами у предрасположенного субъекта могут быть укусы насекомых или клещей, пищевые реакции, реакции на лекарственные препараты, постельные принадлежности, химические вещества и т.д., например, у лошадей, страдающих от IBH, и/или у тех, которые иным образом предрасположены к повышенной чувствительности к экологическим кожным аллергенам. Таким образом, успешная иммунотерапия, например, направленная против IBH, может уменьшить повторное возникновение крапивницы у таких субъектов.

В дополнительном воплощении (изолированные) рекомбинантные белки, как раскрывается и заявлено в данной заявке, являются, в частности, полезными в способе для специфически направленной те- 12 034692 рапии и/или профилактики у лошадей, страдающих от рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO).

Рецидивирующая обструкция дыхательных путей (RAO) у лошадей, респираторное заболевание, которое является подобным астме у человека, является одним из наиболее часто диагностируемых состояний, которое затрагивает легкие лошадей среднего возраста и старых лошадей во всем мире. Оно также называется эмфиземой легких или хроническим бронхитом/бронхиолитом, или на более ранних стадиях хронической обструктивной болезнью легких. Когда они присутствуют в течение лета, когда, например, лошади находятся на пастбище, то используются термины обструктивная болезнь легких, ассоциированная с летним пастбищем, или RAO, ассоциированная с летним пастбищем.

RAO представляет собой аллергическое заболевание немедленной гиперчувствительности 1-го типа, которое вовлекает типичную последовательность событий, которые начинаются с реактивных антител, главным образом, IgE, что приводит к дегрануляции тучных клеток, приводящих к образованию гистамина и других химических медиаторов, которые, действуя вместе, вызывают воспаление дыхательных путей и обратимую обструкцию дыхательных путей. Клинические признаки, наблюдаемые в период обострения, могут быть очень серьезными и включают непереносимость физических нагрузок, кашель, выделения из носа и увеличение дыхательных усилий в состоянии покоя. Диагностические процедуры, такие как измерение функции легких, анализ газов крови или бронхоальвеолярного смыва, может предоставить дополнительную информацию о болезни. Обычное лечение включает в себя только паллиативное лечение (например, бронходилататоры и/или кортикостероиды), но в настоящее время не существует какого-либо лечения причины (Leclere и др. Respirology 2011, 16: 1027-1046, Pirie, Equine Vet. J. 2014, 46: 276-288).

В последнее время лечение при использовании белка весом 10 кДа (CC10) клеток Clara было утверждено как эффективное для защиты или как такое, которое может быть полезным в качестве пассивной иммунотерапии у лошадей, страдающих от RAO. CC10 является одним из членов семейства противовоспалительных защитных белков, которые продуцируются преимущественно в эпителии дыхательных путей человека и животных. Изобретение описано в US 2014/0105906.

RAO представляет собой комплексное заболевание, однако воздействие переносимых по воздуху аллергенов играет ключевую роль в его этиологии. Клиническая ремиссия обычно достигается за счет устранения воздействия аэроаллергенов. Несмотря на это, главные антигены, которые принимают участие в запуске RAO, четко не определены до сих пор. Многочисленные потенциальные агенты присутствуют, например, в органической пыли, будь-то у лошадей, которых содержат в конюшне, главным образом, обычная или сенная пыль, или у лошадей, которые пребывают на пастбище при дополнительном участии пыльцы (Leclere и др. Respirology 2011, 16: 1027-1046, Pirie, Equine Vet. J. 2014, 46: 276-288).

Антигенный модуль молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран с помощью биоинформационного подхода, как описано иллюстративно и подробно продемонстрировано в примерах 6 и 7 в данной заявке. Посредством этого молекулы iMAT могут оказаться полезными, в частности, в качестве вакцин, например, для лечения и/или профилактики RAO у субъектов, предпочтительно лошадей.

В дополнительном варианте осуществления (изолированные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в данной заявке, являются, в частности, полезными в способе, специфически направленном на терапию и/или профилактику у лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызванных бактериями.

Rhodococcus equi представляет собой почвенные патогенные актиномицеты, которые вызывают легочные и внелегочные пиогрануломатозные инфекции -лошадиный родококкоз. Молодые жеребята являются особенно восприимчивыми и у них развивается угрожающая жизни легочная болезнь. Также иногда наблюдается язвенный энтероколит, остеомиелит и септический артрит. Многие стратегии иммунизации были испробованы, чтобы предотвратить родококкоз в жеребят, но они имели ограниченный успех. Лечение при использовании антибиотиков является непоследовательно эффективным, а также дорогим, и недавние исследования выявили появление устойчивых к антибиотикам штаммов.

Инфекция в основном передается путем вдыхания находящейся в воздухе пыли, несущей патоген. При попадании в организм хозяина R. equi поглощается локальными макрофагами, в частности альвеолярными макрофагами в легких, после ингаляции. Патоген распространяется с медленным прогрессирующим снижением функции легких, что делает сложной раннюю клиническую диагностику. Ранние клинические симптомы часто заключаются только в легкой лихорадке, изредка кашле или незначительном увеличении частоты дыхания, которые могут быть не очевидными, если жеребята не подвергаются уходу и обработке. Кроме того, диагностика не так проста - в настоящее время рекомендуемый инструмент для мониторинга ферм с эндемической R. equi пневмонией представляет собой анализ концентраций лейкоцитов в крови и культивирование бактерий из транстрахеальных смывов с последующей идентификации R. equi с помощью ПЦР или цитологического исследования таких материалов (van Bargen, K. and Haas, A. FEMS Microbiol Rev. 2009, 33: 870-891, Vazquez-Boland, J.A. и др., Vet. Microbiol. 2013, 167: 9-33).

Для того чтобы решить эту медицинскую проблему, по крайней мере один антигенный модуль в

- 13 034692 предназначенном для лечения родококкоза (изолированном) рекомбинантном белке, как описано и заявлено в данном изобретении, может быть выбран из антигенов, которые имеют происхождение от R. equi, например ассоциированного с вирулентностью белка A (VapA), иммунодоминантного экспрессируемого на поверхностности липопротеина или других поверхностных белков. Он также может представлять собой такой, который имеет происхождение от инфицированных R. equi фагов. Улучшенные молекулы MAT могут быть сделаны полезными специально в качестве вакцин, например, для лечения и/или профилактики родококкоза у лошадей. Лечение может включать введение молекулы iMAT жеребенку и/или также может включать в себя обработку беременной кобылы в соответствии с настоящим изобретением.

Мыт (удушье) также представляет собой один из примеров инфекции у лошадей. Мыт характеризуется образованием абсцесса лимфатических узлов головы и шеи, вызванного Streptococcus equi, и представляет собой одно из наиболее часто диагностируемых инфекционных заболеваний у лошадей, таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке новых профилактических вакцин.

Еще в одном варианте осуществления (изолированные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в данном изобретении, являются, в частности, полезными в способе, в частности, направленном на терапию и/или профилактику у лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызванных вирусами.

Африканская чума лошадей (AHS) представляет собой высокоинфекционное и смертельное заболевание. Она обычно поражает лошадей, мулов и ослов. Инфекция вызывается вирусом рода Orbivirus, принадлежащего к семейству Reoviridae. AHS непосредственно не является контагиозным, но, как известно, распространяется насекомыми-переносчиками, в основном Culicoides, а также Culex, Anopheles и Aedes, или передается клещами (например, Hyalomma или Rhipicephalus), как было описано. На сегодняшний день не существует эффективного лечения для AHS, при этом приблизительно 90% зараженных лошадей умирают, главным образом, из-за дыхательной недостаточности в течение 24 ч инфекции. Таким образом, контроль заболевания зависит от профилактической вакцинации.

Вирус Западного Нила (WNV) представляет собой вирус с положительной одноцепочечной РНК, который передается москитами и сгруппирован в пределах серокомплекса вируса японского энцефалита Flavivirus в семействе Flaviviridae. WNV является возбудителем синдрома заболевания также известного под названием лихорадки Западного Нила. Птицы являются природным источником, и WNV поддерживается в природе в цикле передачи москиты - птицы - москиты. Тем не менее, когда лошади инфицируются, то это часто остается незамеченным. Лошади умирают или подвергаются эвтаназии из-за тяжелых неврологических симптомов, в том числе пареза, атаксии, опрокидывания и мышечной фасцикуляции, другие демонстрируют легкий -тяжелый полиэнцефаломиелит. Диагностика и подтверждение WNV инфекции может быть сделана непосредственно путем идентификации вируса или опосредованно путем исследования на наличие антител в клинических образцах. Однако его идентификация, как правило, затруднена по причине короткой продолжительности и низкого уровня виремии у лошадей.

В дополнительном варианте осуществления изобретения (изолированные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в данном изобретении, являются, в частности, полезными в способе, специфически направленном на предотвращение передачи инфекционных заболеваний у лошадей, с помощью переносчиков, например мух, которые питаются кровью, мошек, клещей и/или комаров.

Патогены доставляются в кожу хозяина, который представляет собой млекопитающее, вместе со слюной членистоногих, которая содержит широкий спектр биологически активных молекул. Эти компоненты слюны способны изменять гемостаз и иммунные реакции и могут осуществлять свой вклад в способность патогена вызывать инфекцию. Наличие инфекционных микроорганизмов в слюнных железах членистоногих, которые питаются кровью, изменяет состав слюны, пример вызывает изменения в концентрации апиразы или антитромбиназы у инфицированных москитов. Эти антигены или другие являются хорошо приспособленными для использования в антигенном модуле молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением и могут быть полезными в качестве вакцины, в частности, для активации иммунной системы хозяина, чтобы предотвратить передачу инфекционных патогенов переносчиками у лошадей.

В дополнительном варианте осуществления изобретения (изолированные) рекомбинантные белки, как раскрывается и заявлено в данной заявке, являются, в частности, полезными в способе, специфически направленном на терапию и/или профилактику у лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызванных грибами.

Дерматомикоз или лишай представляет собой грибковую инфекцию волос и поверхностных слоев ороговевших клеток кожи, которая возникает у животных и человека. Несколько видов рода Microsporum или рода Trichophyton, принадлежащих к группам зоофильных и геофильных дерматофитов, могут вызывать клинические инфекции у животных. Разнообразные поверхностные антигены грибов и/или их споры являются приемлемыми для того, чтобы использоваться в антигенном модуле молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением и могут быть полезными, в частности, в качестве вакцин, например, для терапии и/или для профилактики дермотомикоза у лошадей.

В дополнительном варианте осуществления изобретения (изолированные) рекомбинантные белки, как раскрывается и заявлено в данной заявке, являются, в частности, полезными в способе, специфически

- 14 034692 направленном на терапию и/или профилактику у лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызванных паразитами.

Паразиты, поражающие лошадей, являются повсеместно распространенными и клинически значимыми по всему миру. Основными паразитарными угрозами для здоровья лошадей являются Cyathostomins, Parascaris equorum, Anoplocephala perfoliata и Strongylus vulgaris. О повышении уровня устойчивости к гельминтам у паразитов лошадей сообщается во всем мире. Для простейших, например, Cryptosporidium несколько препаратов последовательно подавляют размножение паразита у хозяина. В основном, поражаются жеребята, и исход зависит от врожденных и адаптивных иммунных реакций.

Антигены, имеющие происхождение от взрослых паразитов, а также от паразитов в препатентной стадии развити, являются еще одним примером для использования в антигенном модуле молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, и могут быть полезными, в частности, в качестве вакцин, например, для терапии и/или для профилактики паразитарной инфекции у лошадей.

В частности, в случае модулирования иммунного ответа у лошадей по крайней мере один нацеливающий модуль предпочтительно представляет собой инвариантную цепь лошади, более предпочтительно одну или более аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOS: 2, 15, 16.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения (изолированный) рекомбинантный белок, как описано и заявлено в данной заявке, присутствует в мономерной форме, поскольку, например, рекомбинантно введенные аллергены имеют тенденцию к образованию агрегатов, в частности, если получены при использовании телец включения. Путем замены по крайней мере одного, предпочтительно всех цистеиновых остатков во всей последовательности (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно путем замены на серин, лейцин, изолейцин и/или аспарагиновую кислоту, можно предотвратить образование межмолекулярных дисульфидных связей, устраняя, таким образом, любую агрегацию, в частности, любое неестественное образование межмолекулярных и/или внутримолекулярных связей. То есть (изолированный) рекомбинантный белок, будучи полностью лишенным остатков цистеина, не подвергается агрегации. Следовательно, такой белок легко подвергается экспрессии и демонстрирует улучшенные нацеливание и MHC презентацию.

Кроме того, такие свободные от цистеина варианты, например аллергены, в которых остатки цистеина в аминокислотной последовательности аллергенов дикого типа были мутированы по отдельности или в комбинациях, обладают пониженной IgE реактивностью по сравнению с соответствующими аллергенами дикого типа и в то же время существенно сохраняют реакционную способность по отношению к T-лимфоцитам и, таким образом, являются гипоаллергенными.

Таким образом, изобретение относится к таким гипоаллергенным вариантам аллергенов, вызывающим, например, IBH у лошадей, причем в таких вариантах остатки цистеина аллергенов дикого типа были подвергнуты мутации по отдельности или в комбинации.

Кроме того, наличие модуля метки для разделения белков в образце, включающем в себя молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, например, при использовании твердого носителя на основе заряженного цинка или кобальта, дополнительно улучшает возможность получения гибридных белков без агрегации в процессе очистки. Как правило, модуль метки включает в себя полигистидиновую метку из пяти-шести последовательных остатков гистидина.

(Изолированные) рекомбинантные белки, как раскрывается и заявлено в данной заявке, являются полезными в фармацевтической композиции. Например, (изолированные) рекомбинантные белки предназначены для применения в вакцине. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает вакцинные композиции, которые содержат один или более (изолированных) рекомбинантных белков, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Такая вакцинная композиция может использоваться с терапевтической целью и/или для профилактики у лошадей, которые страдают от гиперчувствительности на укус насекомого (IBH), крапивницы и/или рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO), инфекционных заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами, например Rhodoccus pneumonia, удушья, африканской чумы лошадей, вируса лихорадки Западного Нила, дерматомикоза и/или паразитов пищеварительного тракта или других органов, например криптоспоридиоза, гельминтов и/или их периода препатентной стадии. Кроме того, этот способ может быть использован не только против таких патогенных микроорганизмов, но также может активировать иммунную систему хозяина, чтобы предотвратить передачу переносчиками, например мухами, которые питаются кровью, мошками, клещами и/или комарами.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается вакцина для субъектов, таких как лошади, для лечения и/или предотвращения IBH, вызванного в ответ на укусы насекомых, например Culicoides, мошками и/или другими насекомыми, которые питаются кровью. Кроме того, успешная иммунотерапия против IBH может привести к снижению в целом гиперчувствительности к кожным аллергенам окружающей среды и, таким образом, может уменьшить возникновение рецидива крапивницы у таких предрасположенных субъектов.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечиваются вакцины для субъектов, таких как лошади, для лечения и/или профилактики RAO, которое вызвано ответом, например, на плесень (грибы и/или их споры), пыльцу, домашнюю пыль или амбарных клещей (и/или их фекалии).

- 15 034692

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечиваются вакцины для субъектов, таких как лошади, для лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний, которые вовлекают, например, роды Rhodococcus, Streptococcus, Orbivirus, Flavivirus, Trichophyton, Microsporum, Cryptosporidium и/или Strongylus. Кроме того, может обеспечиваться вакцина для активации иммунной системы хозяина, чтобы предотвратить передачу заболевания переносчиками, например Culicoides, Culex и/или Ixodes и/или другими насекомыми, которые питаются кровью.

Фармацевтическая композиция, например, в форме вакцины на основе (изолированных) рекомбинантных белков предпочтительно предназначена для сублингвального введения, подкожных и/или внутрикожных инъекций, раствора для инъекций в лимфатические узлы и/или для введения через слизистые оболочки, в частности через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта или дыхательной системы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции вводят парентерально.

Молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться как фармацевтический препарат или как вакцина для модификации, например, аллергических расстройств. Например, гиперчувствительность на укус насекомого (IBH) может подвергаться лечению с помощью таких молекул iMAT.

Низкие количества (от 1 до 1000 мкг, относящиеся к весу исключительно одного или более антигенных модулей) рекомбинантно полученных молекул iMAT, включающих аллергены IBH, вызывающие аллергию на укусы насекомых, таких как из рода Culicoides, которые, например, вводят от 1 до 5 раз подкожно, интрадермально или непосредственно в лимфатический узел, индуцируют сильный и длительный иммунный ответ у лошадей, что ведет к улучшению клинических симптомов.

В одном предпочтительном варианте осуществления молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации, по крайней мере, с одним адъювантом. Адъювант включает в себя, но не ограничиваются такими как один или несколько из следующих: квасцы, БЦЖ, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, липидные эмульсии, липиды или полимерные нано- или микросферы, мицеллы, липосомы, сапонин, липид A или дипептид, бактериальные продукты, хемокины, цитокины и гормоны, хитозан, крахмал, альгинат, производные целлюлозы (например, этилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза), нуклеиновые кислоты или конструкции нуклеиновой кислоты. Один или более из этих компонентов могут быть добавлены для усиления или модификации иммунного ответа. В качестве альтернативы молекулу iMAT можно вводить без адъюванта, либо в водной форме.

Молекулы iMAT можно вводить в дозе от приблизительно 1 до 1000 мкг (эта и последующие дозы относятся к весу исключительно одного или более антигенного модуля) и более предпочтительно в дозе от приблизительно 10 до приблизительно 100 мкг и еще более предпочтительно в дозе от приблизительно 20 до приблизительно 50 мкг, хотя оптимальная доза может варьировать в зависимости от вводимого антигена, предпочтительно аллергена, веса субъекта, иммунной системы субъекта и так далее. Эффективное лечение во многих случаях может быть достигнуто при использовании одного введения. В некоторых вариантах осуществления обработка включает в себя от 1 до 15 введений. В предпочтительных вариантах осуществления обработка включает в себя от 1 до 5 введений и более предпочтительно от 1 до 3 введений. Для начальных этапов лечения введения могут быть периодическими, например в течение курса нескольких дней, один или два раза в месяц или год или несколько раз в год. Для поддержания иммунного ответа введения могут осуществляться с интервалом от нескольких месяцев до нескольких лет.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения (изолированные) рекомбинантные белки, как раскрывается и заявлено в данной заявке, являются предназначенными для введения в лимфатические узлы. В процессе непосредственного введения в лимфатический узел соответствующий лимфатический узел может быть визуализирован во время процедуры инъекции, например, с помощью ультразвука, для того, чтобы контролировать местоположение иглы и изменения в лимфатических узлах, такие как опухание. Инъекции в нижнечелюстные, подмышечные, паховые и/или подколенные лимфатические узлы является предпочтительными благодаря легкости ультразвукового определения местоположения и инъекции.

В данной области техники является известным, что некоторые (>20) идентифицированные белки в слюне насекомых, которые питаются кровью, вызывают IgE реактивность и патологические кожные реакции у лошадей [Schaffartzik, Veterinary Immunology and Immunopathology 2012, 147: 113-126; Allergome (www.allergome.org)]. Таким образом, ожидается, что лечение может быть успешным только, если большинство соответствующих аллергенов включены в лекарственные средства для специфической иммунотерапии. Тем не менее, неожиданно было обнаружено, что только 1, 2, 3 или 4 такие молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, каждая из которых включает различные антигенные модули, например, слюны насекомого или мозаичной конструкции исключительно эпитопов, являются достаточными для индукции иммуномодуляции и/или клинического улучшения у пораженных субъектов, если такие молекулы iMAT вводят от 1 до 5 раз подкожно, интрадермально и/или непосредственно в лимфатический узел.

- 16 034692

В предпочтительном варианте осуществления используется одна молекула iMAT, и она является достаточной для индукции терапевтического эффекта и/или предотвращения развития гиперчувствительности на укус насекомого (IBH), крапивницы и/или рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO) у лошадей.

В другом предпочтительном варианте осуществления используется комбинация 2, 3 или 4 молекул iMAT с помощью одновременного, последовательного и/или хронологически смещенных совместных введений.

В предпочтительном варианте осуществления используется одна молекула iMAT, и она является достаточной для индукции терапевтического эффекта и/или предотвращения развития, и/или предотвращения передачи инфекционных заболеваний у лошадей, например Rhodoccus pneumonia, удушья, африканской чумы лошадей, вируса лихорадки Западного Нила, дерматомикоза и/или паразитов пищеварительного тракта или других органов, например криптоспоридиоза, гельминтов и/или их периода препатентной стадии. Кроме того, этот способ может быть использован не только против таких патогенных микроорганизмов, но также может активировать иммунную систему хозяина, чтобы предотвратить передачу переносчиками, например мухами, которые питаются кровью, мошками, клещами и/или комарами.

В зависимости от термодинамической оценки (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данной заявке, его стабильность зависит от мутации цистеина, в частности замены различным(и) аминокислотным(и) остатком(ами). Например, это может быть замена Cys на Ser. Однако стабильность может быть выше при использовании отличного от Ser аминокислотного остатка для того, чтобы достичь желаемой стабильности и растворимости. То есть в то время как первый выбор может представлять собой замену цистеина на Ser, в случае нестабильности аминокислотный остаток, отличный от Ser, должен заменить Cys.

Для того чтобы выбрать аминокислотные остатки для стабилизации в качестве замены для остатков цистеина в целевых последовательностях, выбирают трехэтапный подход.

1. Моделирование третичной структуры целевого белка, включая терминальные гексагистидиновые метки, последовательность iMAT и первичную аминокислотную последовательность белка, который представляет интерес. Моделирование может осуществляться при использовании нативной последовательности и включать замены цистеина.

2. Итеративное определение стабильности белка на основе точечных замен, таких как замена остатка цистеина отличным аминокислотным остатком, например Ser и/или Ile, и категоризация для определения стабилизирующих замен путем анализа всех доступных трехмерных структур.

3. Повторное моделирование стабилизированной структуры и подтверждение стабильности путем повторения этапов 1 и 2.

Трехмерные белковые структуры имеют решающее значение для понимания функции белка на молекулярном уровне и представляют большой интерес для рациональной разработки многих различных типов биологических экспериментов, таких как сайт-направленный мутагенез. Тем не менее, количество структурно охарактеризованных белков является малым по сравнению с числом известных белковых последовательностей. Можно идентифицировать гомологичный белок с известной структурой (матрица) для данной последовательности белка (целевая последовательность). В этих случаях моделирование гомологии оказалось способом выбора для создания надежной 3П-модели белка из его первичной аминокислотной последовательности. Модель построения гомологии включает четыре основных этапа: (1) идентификация структурной(ых) матрицы(матриц), (2) выравнивание целевой последовательности и структуры(структур) матриц(матрицы), (3) построение модели и (4) качественная оценка модели. Эти этапы могут повторяться до достижения удовлетворительного результата моделирования. В тех случаях, когда точная модель гомологии не может быть определена, используются вычислительные подходы для определения структуры белка из первичной структуры (аминокислотные последовательности). De novo или ab initio способы основываются на физических принципах и пытаются имитировать процесс сворачивания. Такие способы должны исследовать большое количество конформаций и требуют очень точных энергетических функций для идентификации структур в глобальном минимуме свободной энергии. Многие способы используют комбинацию этих описанных принципов.

Доступность вычислительных средств обеспечивает достаточно точные оценки влияния аминокислотных замен на стабильность белков и имеет решающее значение в широком диапазоне применений. В частности, такие инструменты имеют потенциал стимулирования и поддержания белковой инженерии и конструкторских проектов, посвященных созданию модифицированных белков.

Стабильность белка можно рассматривать с точки зрения термодинамической стабильности белка, которая быстро и обратимо развертывает и свертывает белок. В этих случаях стабильность белка представляет собой разницу в свободной энергии Гиббса между свернутым и развернутым состояниями. Единственными факторами, влияющими на стабильность, являются относительные свободные энергии свернутого и развернутого состояний. Чем больше и более позитивна разница свободной энергия фол- 17 034692 динга, тем более стабильным является белок для денатурации. Разница свободной энергии фолдинга, как правило, является небольшой, порядка 5-15 ккал/моль для глобулярного белка. Тем не менее, с другой стороны, стабильность белка можно рассматривать как свойство белка, чтобы выдерживать высокие температуры или условия растворения. Это связано с термодинамической стабильностью, а также с обратимостью или необратимостью свертывания/развертывания (кинетическая стабильность).

Для прогнозирования термодинамических изменений стабильности, вызванных точечными заменами в белках, несколько различных подходов могут быть применены для изучения воздействия таких замен на структуру и функции белков [Pires D.E. и др., Bioinformatics 2014, 30(3): 335-342]. Такие подходы могут быть широко классифицированы на те, которые стремятся понять влияние замен в аминокислотной последовательности белка самого по себе, и те, которые используют обширную структурную информацию. Подходы, основанные на структуре, как правило, пытаются спрогнозировать либо направление изменения стабильности белка при заменах, либо фактическую величину свободной энергии (AAG).

Результаты для каждого конкретного белка и его соответствующих моделей подвергаются статистическому анализу с точки зрения количества возникновений специфических замен при использовании балльной системы, которая нивелирует замену, которая основывается на возникновениях в используемых моделях и изменении свободной энергии стабильности белка (AAG), определяя тем самым наиболее дестабилизирующие остатки (если таковые имеются) в структуре, в которую они вводятся, и возможные замены. Показатель рассчитывается путем определения самой низкой AAG (AAG<0) в каждом положении, которое представляет интерес, в каждой модели и назначения соответствующих линейных значений и кумулятивных значений AAG для каждого потенциального положения замены, и результаты потом оцениваются для определения согласованности между моделями.

Поскольку расчетные модели белка обладают различными свойствами (вероятность предсказания правильной трехмерной структуры), весовой коэффициент может применяться для того, чтобы установить приоритеты результатов, полученных от более точных моделей. Остаток, который имеет значимое (на основе AAG) дестабилизирующее влияние (если таковой имеется), заменяется; получают новые модели и повторно подвергают их итеративному анализу до тех пор, пока не будет достигнуто устойчивое состояние. Кроме того, генерируемые модели оцениваются путем анализа xyz координат с помощью анализа главного компонента для определения потенциальных структурных неправильных фолдингов из-за замены аминокислот в специфических положениях.

Еще в одном дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения способа идентификации аминокислотных замен в предварительно определенной аминокислотной последовательности, позволяющего осуществлять стабилизацию такой предварительно определенной аминокислотной последовательности, который включает следующие этапы:

(i) моделирование трехмерной/третичной структуры целевой предварительно определенной аминокислотной последовательности;

(ii) итеративное определение стабильности белка на основе точечных замен, таких как замена остатков цистеина отличным аминокислотными остатками, предпочтительно остатками серина и/или изолейцина, и категоризации на основе изменений свободной энергии стабильности белка (AAG) для определения стабилизирующих замен путем анализа всех доступных трехмерных/третичных структур, (iii) повторное моделирование замещенной трехмерной/третичной структуры аминокислотной последовательности и подсчет ее стабильности путем повторения (ii) и (iii) до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное состояние.

Еще в одном дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данной заявке, где полная или частичная аминокислотная последовательность стабилизирована с помощью способа идентификации аминокислотных замен в предварительно определенной аминокислотной последовательности, как раскрыто или заявлено в данной заявке (см. пример 5 в данной заявке).

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает примеры аллергенов рода Culicoides, идентифицирующих виды, аллерген и депозитный номер UniProt (обновление базы данных UniProt 2013_09);

фиг. 2 - SDS-ПАГЭ MAT-Fel d1 (IVN201) при восстанавливающих условиях; A) исходный SDSПАГЭ (10 мкг белка на дорожку, окрашивание по Кумасси) и B) SDS-ПАГЭ с полосами, которые были вырезаны из геля A и повторно загружены на SDS-ПАГЭ (окрашивание серебром);

фиг. 3 - SDS-ПАГЭ для Fel d1 при восстанавливающих условиях; NuPAGE® 4-12% Bis-Tris гель. Дорожки: 1) маркер: SeeBlue Plus2 предварительно окрашенный стандарт; 2) 5 мкг Fel d1; 3) 5 мкг Fel d1;

фиг. 4 - хроматограмму ВЭЖХ с обратной фазой, 0,1% градиент ТФК/ацетонитрил) нативный белок (MAT-Fel d1) без добавок (левая колонка); b) MAT-Fel d1, денатурированный путем прибавления хлорида гуанидина плюс DTT (правая колонка);

фиг. 5 - молекулу MAT-Fel d1 и ее диаграмму гидрофобности Кайт и Дулитл;

фиг. 6 - NuPAGE® SDS-ПАГЭ систему (4-12% Bis-Tris гели, 1xMES буфер для разгона, 35 мин, 200 B). Дорожки: 1) лизоцим, 1 мкг белка окис; 2) белок маркера PageRuler Prestained; 3) MAT-Fel d1 (5 мкг), окисленный при использовании иодацетамида (окис); 4) iMAT-Cul o4 (окис); 5) белок маркера PageRuler

- 18 034692

Prestained; 6) MAT-Fel dl (5 мкг) восстановленный; 7) iMAT-Cul o4 восстановленный; 8) лизоцим восстановленный;

фиг. 7 - хроматограмму ВЭЖХ с обратной фазой 0,1% градиент ТФК/ацетонитрил. Пик показывает нативный (окисленный) белок (iMAT-Cul o4) без добавок;

фиг. 8 - пример дисплея количества совпадений при локальных выравниваниях для выбранных аллергенов Culicoides по сравнению с измеренными сенсибилизациями (см. описание для подробностей). Фигура изображает сравнение между антигенным прогнозированием (светло-серый и правая ось Y) и результатом (темно-серый и левая ось Y) в тесте HRT с точки зрения тяжести (суммарные значения баллов на каждый аллерген) в группе IBH лошадей. Тяжесть описывает степень реакции в анализе в соответствии с полуколичественной шкалой (левая ось Y). Данные прогнозирования масштабируются путем установки высокого балла встречаемости, равного баллу самой высокой степени тяжести;

фиг. 9 - результаты следующих экспериментов: белки и Adju-Phos®, которые инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин при осторожном перемешивании. После инкубации образцы центрифугировали в течение 3 мин и последовательно подвергали анализу с помощью. SDS-ПАГЭ Дорожки 1) белок маркера PageRuler Prestained; 2) супернатант iMAT-Cul o3; 3) осадок iMAT-Cul o3 в моче; 4) супернатант iMAT-Cul o3; 5) осадок iMAT-Cul o3 в моче; 6) пустая дорожка; 7) супернатант iMATCul o2; 8) осадок iMAT-Cul o2 в моче; 9) супернатант iMAT-Cul o2; 10) осадок iMAT-Cul o3 в моче; 11) пустая дорожка; 12) супернатант iMAT-Cul o4; 13) осадок iMAT-Cul о4 в моче; 14) супернатант iMATCul o4; 15) осадок iMAT-Cul o4 в моче; (2, 3, 7, 8, 12, 13 вес./об. замораживание/оттаивание); (4, 5, 9, 10, 14, 15 после процесса двукратного замораживания/оттаивания);

фиг. 10 - анализ высвобождения гистамина (подробности анализа приведены в примере 2) 5 концентраций iMAT-Cul o2 и iMAT-Cul o3 и соответствующие аллергены у полисенсибилизированных лошадей (лошадь 1);

фиг. 11- диаграмму гидрофобности Кайт и Дулитл для молекулы MAT против молекулы iMAT в генерической части соответствующих слитых белков [т.е. без соответствующего антигенного(ых) модуля(ей)]. Индекс гидрофобности показан на оси ординат по отношению к положению аминокислоты по оси X. Положительные числа в индексе указывают на гидрофобность. Сдвиг диаграммы молекулы iMAT в начале диаграммы гидрофобности по отношению к молекуле MAT обусловлен дополнительным присутствием N-терминальной His-метки и одного остатка метионина в молекуле iMAT, а также отсутствием какого-либо спейсерного(ых) модуля(ей);

фиг. 12 - число неслучайных совпадений для каждого пептида длиной 13 аминокислот для Cul o3 (M4X062, SEQ ID NO: 6) в канонической базе данных и их положение в пределах соответствующего белка-предшественника. Ось ординат показывает число совпадений, а ось X - положение аминокислоты в ссылке на белок-предшественник. Вертикальные пунктирные линии указывают на остатки цистеина, пунктирная линия с точками изображает скользящее среднее значение числа неслучайных найденных гомологий, а горизонтальные сплошные линии соответствуют in silico расщепленным пептидам.

Примеры

Приведенные ниже примеры служат для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, но они не должны трактоваться как такие, которые ограничивают объем изобретения, которое раскрыто в данной заявке.

Пример 1. Суррогатный маркер для иммунитета/длительности иммунитета.

Введение (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрывается и заявлено в данной заявке, лошадям вызывает иммунный ответ на аллерген и/или эпитоп, который присутствует в антигенном модуле. Кроме того, модуль C- или N-терминальной метки вместе с соседними аминокислотными остатками из соседнего модуля может быть использован для того, чтобы обнаружить уникальный иммунологический сигнал на специфический продукт (например, образование антител или T-клеточный ответ) у целевого субъекта, который может использоваться в качестве суррогатного маркера иммунитета или длительности иммунитета. Это суррогатный маркер в качестве специфического для лечения иммунологического параметра позволяет осуществлять оценку иммунитета, или модуляции иммунитета, или длительности иммунитета, или длительности иммунной модуляции после введения. Таким образом, конкретный показатель иммунного ответа, который запускается (изолированным) рекомбинантным белком в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой индукцию терминальной метки (необязательно с соседними аминокислотными остатками) специфических антител, таких как IgG антитела. В качестве альтернативы или дополнительно к этому, этот индикатор представляет собой индукцию антител, специфических к соединению спейсера и модуля, как описано и заявлено в данной заявке, или к соединению между двумя модулями.

Пример 2. Гипоаллергенность.

Свежеполученную кровь лошадей, страдающих от IBH, можно использовать для проверки реакционной способности базофилов на (изолированный) рекомбинантный белок/молекулу iMAT, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Это может быть определено с помощью модифицированного метода Кауля [Kaul, S., 1998. Type I allergies in the horse: Basic development of a histamine release test (HRT). Doctoral thesis. Veterinary School Hannover, Германия]. Вкратце, серийные 10-кратные разведения (например,

- 19 034692 в пределах от 10 до 0,001 нМ конечной концентрации аллергена) молекулы iMAT и/или рекомбинантных аллергенов получали в буфере PIPES (AppliChem, Дармштадт, Германия), pH 7,4. Промытые красные и белые клетки крови, полученные из крови при ингибировании коагуляции при использовании Na-ЭДТА, инкубировали с индивидуальными разведениями в течение 1 ч при 37°C. Реакцию останавливали путем инкубации на льду в течение 20 мин и супернатант, содержащий высвобожденный гистамин, собирали из каждого образца после центрифугирования.

Максимальное содержание гистамина получали путем кипячения клеток крови в течение 10 мин на водяной бане (максимальное выделение). Инкубация буфера для высвобождения с промытыми клетками крови служила в качестве отрицательного контроля (спонтанное высвобождение). Концентрацию гистамина определяли при использовании конкурентного радиоиммуноанализа (LDN Нордхорн, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.

В качестве альтернативы еще один тест активации базофилов представляет собой анализ стимуляции клеточного антигена ELISA CAST®, который также можно рассматривать как in vitro тест провокации аллергии. Этот анализ осуществляли в соответствии с инструкциями производителя (Buhlmann Laboratories AG, Allschwil, Швейцария). В анализе CAST® осажденные из крови лейкоциты субъектов с аллергией одновременно примировали с помощью цитокина IL-3 и стимулировали при использовании молекул iMAT и/или рекомбинантных аллергенов. Клетки базофилов наряду с другими вырабатывают аллергический медиатор, сульфидолейкотриен LTC4, и его метаболиты LTD4 и LTE4. Такие свежесинтезированные сульфидолейкотриены (SLT) впоследствии подвергали оценке в тесте ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

Потенциал молекул iMAT в отношении индукции неблагоприятных событий, например провокация анафилаксии как побочного эффекта введения, может быть оценен in vitro с помощью этих анализов путем сравнения эффектов молекулы iMAT (содержащей аллерген) по сравнению с соответствующим рекомбинантным аллергеном, взятым отдельно.

Сниженная дегрануляции базофилов, например выделение гистамина и/или сульфидолейкотриенов, при использовании молекул iMAT по сравнению с рекомбинантным аллергеном указывает на более низкий потенциал для побочных эффектов, т.е. лучший профиль безопасности молекул iMAT.

Указанная HRT (или CAST®) может использоваться в качестве теста in vitro провокации для 1-го типа аллергических реакций у лошадей. Специфическое для аллергена высвобождение гистамина указывает на актуальность соответствующего аллергена для активации базофильных клеток и, таким образом, может быть использовано в качестве количественного параметра для специфической для аллергена сенсибилизации субъекта.

С помощью молекул MAT, описанных в известном уровне техники, гипоаллергенность может быть продемонстрирована по сравнению с соответствующим нативным аллергеном (Fel d1) [Senti G. и др., J. Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296] в анализе стимуляции клеточного аллергена (CAST), а также при использовании внутридермальной и внутрикожной пробы. Количественная разница в чувствительности между аллергеном и молекулой MAT, включающей Fel d1, была 100-, 23- и 16-кратной соответственно. Несмотря на то, что MAT-Fel d1 был явно гипоаллергенным, некоторая аллергенность всетаки сохранялась.

Что касается настоящего изобретения, то была исследована безопасность 2 молекул iMAT, полученных в соответствии с настоящим изобретением, включающих Cul o2 и Cul o3 в антигенном модуле соответственно. Свежевзятую кровь полусенсибилизированных лошадей, страдающих от IBH, использовали в тесте на высвобождение гистамина (HRT), как описано выше.

Как показано на фиг. 10, нативные аллергены вызывали сильное высвобождение гистамина, в то время как неожиданно две различные молекулы iMAT (iMAT-Cul o3 и iMAT-Cul o2) не показали практически никакого ответа вообще.

Таким образом, молекулы iMAT показали заметное превосходство в отношении безопасности по сравнению с молекулами MAT, как описано в предшествующем уровне техники (см. выше).

Можно ожидать, что никаких связанных с аллергеном побочных реакций не будет наблюдаться у лошадей, страдающих от IBH, если они будут подвергаться обработке при использовании указанных молекул iMAT.

Следствие этого удивительного свойства безопасности молекул iMAT, в отличие от молекул MAT, заключается в том, что молекулы iMAT, используемые в качестве десенсибилизирующих белков, могут применяться подобно вакцинам против патогенных микроорганизмов. Нет необходимости в высоких дозировках, как в случае с классическими терапевтическими аллергенами, так как вакцины, включающие молекулы iMAT, не демонстрируют аллергенных свойств в отношении аллергических побочных эффектов. Это не может быть осуществлено при использовании молекулы MAT, описанной в предшествующем уровне техники, так как аллергенность молекулы MAT по сравнению с нативным аллергеном только снижается до определенного уровня. Тем не менее, молекулы MAT все еще остаются аллергенами; молекулы iMAT в отличие от них таковыми не являются. Преимущество этого улучшенного свойства обеспечивает более эффективный режим лечения, который является возможным, например, при использовании трех подкожных или внутрилимфатических инъекций с высоким содержанием биофармацевтического

- 20 034692 препарата (например, 3 раза от 20 мкг до 50 мкг iMAT белка).

Отсутствие аллергенности двух проанализированных молекул iMAT можно объяснить тем, что в отличие от молекулы MAT, описанной в предшествующем уровне техники, не используется никаких аминокислотных остатков линкера [т.е. спейсерного(ых) модуля(ей) между первым, вторым и/или третьим модулем(ями)] для разделения различных модулей в таких MAT молекулах. В предшествующем уровне техники является известным, что сконструированные слитые белки, содержащие два или более функциональных полипептидов, которые соединены с помощью пептидного или белкового линкера, имеют важное значение для функции (например, распознавание эпитопов иммунной системой) таких белков [Klein J.S. и др., Protein Eng Des Sel. 2014, 27(10): 325-330]. Расстояние разделения между функциональными единицами может оказывать влияние на доступность эпитопа и способность связываться с авидностью. Если отсутствующие аминокислотные остатки линкера между модулями, в частности между доменом нацеливания и антигенным модулем, приводят к более жесткой структуре, то конформационные эпитопы аллергенного модуля могут не сформироваться из-за неправильного сворачивания. Поперечное связывание антител на поверхности базофилов (например, IgE) с помощью своих рецепторов с высокой аффинностью является необходимым для того, чтобы вызвать активацию и высвобождение гистамина. Однако неправильно свернутые аллергены могут быть не в состоянии вызвать такое перекрестное связывание. Таким образом, молекула iMAT без линкера не может образовывать конформационные эпитопы IgE, что делает молекулы iMAT неаллергенными.

Пример 3. In silico определение аллергенов/биомаркеров.

Как подробно раскрыто в описании изобретения, основные аллергены, которые вызывают IBH, еще не были описаны - в биоинформационном инжиниринге антигенные модули iMAT для нацеливания на IBH могут быть использованы для оценки in silico релевантности определенных аллергенов (см. пример 6 в данной заявке). Например, как показано на фиг. 8, результаты in silico, а также ex vivo функциональных HRT исследований Cul o3 указывают на то, что Cul o3 представляет собой один из основных аллергенов. Большинство исследованных лошадей, хотя и не все, продемонстрировали четкую повышенную чувствительность к Cul o3. Это является удивительным, так как в других экспериментах, например, проведенных van der Meide и др. (Vet. J. 2014, 200: 31-37), различные рекомбинантные аллергены не могут быть подвергнуты дифференциации в отношении их релевантности по отношению к этой болезни: примерно от 80 до 90% лошадей, страдающих от IBH, показали повышенную чувствительность к каждому из проанализированных аллергенов.

Таким образом, неожиданно в контексте настоящего изобретения можно было бы показать, что Cul o3 (i) фактически является одним из основных аллергенов (т.е. >50% животных были сенсибилизированы) при IBH и (ii) имеет превосходную релевантность по сравнению с другими аллергенами.

Кроме использования в антигенном модуле iMAT, соответствующие аллергены могут также служить для оптимизации успеха лечения до его начала путем исследования силы гиперчувствительности против указанных аллергенов. На протяжении всего курса лечения специфическую для аллергена модуляцию различных компонентов иммунной системы можно контролировать, например изменения в специфических для аллергена титрах IgE и IgG антител может свидетельствовать о терапевтических и/или профилактических эффектах.

Таким образом, in silico обнаруженные аллергены и/или соответствующие специфические для аллергена иммуноглобулины могут быть использованы в качестве диагностических и/или лечебнодиагностических биомаркеров.

Пример 4. Терапевтическая вакцина/профилактика IBH у лошадей.

Одна молекула iMAT или комбинация молекул iMAT, содержащих различные антигенные модули в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для профилактического или терапевтического лечения лошадей, страдающих от или подвергшихся риску укусов насекомых, вызывающих IBH. Лошадям молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в подчелюстной лимфатический узел (Landholt и др., Vet. Rec. 2010, 167: 302-304). При использовании пальпации и/или под контролем УЗИ 25 G игла вводится в лимфатический узел. Инъецируемая молекула iMAT адсорбируется на адъюванте. Адъювант состоит, например, из фосфата алюминия (Adju-Phos®, Brenntag Biosector, Дания). Запасы молекулы iMAT представляли собой замороженный раствор с концентрацией 375 мкг/мл белка во флаконах, каждый из которых содержал 500 мкл, для размораживания перед использованием.

После оттаивания раствора молекулы iMAT 400 мкл раствора смешивали, например, с 200 мкл гелевой суспензии фосфата алюминия. Этот заключительный препарат оставляли при комнатной температуре в течение 60 мин перед внутрилимфатической инъекцией, чтобы обеспечить абсорбцию молекулы iMAT Adju-Phos®. Например, 200 мкл смеси, содержащей 50 мкг молекулы iMAT, переносили в шприц на 500 мкл для инъекции в лимфатический узел. Этот препарат вначале вводили, как правило, на 0-й день, 28-й день и 56-й день в дозе от 20 до 50 мкг молекулы iMAT (по отношению к весу одного или более антигенных модулей) на инъекцию.

На протяжении всего периода лечения и/или после него эффективность терапии или профилактики IBH может быть исследована клинически с помощью количественной, полуколичественный или качест- 21 034692 венной оценки поражений кожи (например, сломанные волоски, алопеция, корки/расчесы и влажные участки). Интенсивность расчесывания/зуд может быть оценена в баллах.

Эти клинические параметры можно сравнить с клиническими симптомами индивидуальной лошади в предыдущих сезонах IBH и/или с тяжестью до начала терапевтического вмешательства. С другой стороны, сравнение с лошадьми, которые страдают от IBH и которые не подвергались обработке или были обработаны при использовании плацебо, может продемонстрировать эффективность лечения и/или профилактики клинических признаков IBH, опосредованных молекулой iMAT.

Свежая кровь, полученная от указанных лошадей, может быть использована в анализе in vitro провокации для 1-го типа аллергических реакций у лошадей, например, при использовании HRT или CAST® (подробнее см. пример 3 выше). Наблюдали уменьшенную дегрануляцию базофилов в ответ на провокацию при использовании определенных аллергенов Culicoides, например высвобождение гистамина и/или сульфидолейкотриенов после введения молекул iMAT по сравнению с ранее назначенной терапией и/или профилактическим эффектом.

В качестве альтернативы или в дополнение к интрадермальному провокационному анализу [Langner и др., Vet. Immunol. Immunopathol 2008, 122 (1-2): 126-37] определенные аллергены Culicoides могут быть использованы у указанных лошадей. Сниженная реакция (немедленная и/или поздняя фаза реактивности) указывает на терапевтический и/или профилактический эффект введения молекулы iMAT.

Кроме того, модуляцию различных компонентов иммунной системы можно контролировать, например изменение титров специфических для аллергена IgE и IgG антител может свидетельствовать о терапевтическом и/или профилактическом эффектах.

Помимо изменений уровня IgE, может быть неожиданно обнаружено увеличение специфического для аллергена IgG при лечении лошадей от IBH при использовании молекулы iMAT. Эти антитела могут блокировать опосредованную IgE анафилаксию in vivo, и, как предполагается, ингибировать не только индуцированное аллергеном высвобождение медиаторов воспаления из базофилов и тучных клеток, а также опосредованную IgE презентацию аллергена T-клеткам. Среди индуцированных молекулами iMAT IgG антител, которые специфически связываются с аллергеном, некоторые специфические для аллергена подтипы, как предполагается, могут играть важную защитную роль, поскольку они конкурируют со специфическими для аллергена IgE антителами и могут предотвратить активацию CD4⁺ Tклеток путем ингибирования опосредованной IgE презентации антигена. Кроме того, подмножество IgG, который секретируется, способствует значительному снижению количества тучных клеток и эозинофилов, что сопровождается уменьшением высвобождения медиаторов воспаления [Senna G. и др., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2011, 11(4): 375-380].

Функциональный анализ блокирования IgG активности сыворотки, как определено путем подавления зависимого от FccRI высвобождения гистамина базофилами [Niederberger V. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101: 14677-14682] и/или ингибирования зависимого от FccRII (CD23) связывания комплексов IgE-аллерген с B-клетками, как оказывается, предлагает лучшее предсказание индивидуального клинического ответа (Wacholz P.A. и др., J. Allergy Clin. Immunol. 2003; 112: 915-922).

Специфическая для аллергена иммунотерапия может модулировать различные компоненты иммунной системы. Клеточные изменения включают в себя уменьшение индуцированной аллергеном пролиферации T-клеток, что указывает на индукцию периферической толерантности в специфических для аллергена T-клетках и уменьшение специфического для антигена Th2-доминирующего иммунного ответа в пользу реакции Th1 с увеличением продукции IFN-γ (Durham S.R. и др., J. Allergy Clin. Immunol. 1996, 97: 1356-1365). Ключевой тип клеток, который отвечает за координацию этого иммунологического переключения, представляет собой гетерогенную популяцию T-клеток, называемых регуляторными Tклетками (T_reg). На клеточном уровне решающим фактором для успешной аллергенной иммунотерапии является периферическая индукция 1-го типа T_reg клеток. Функциональные исследования, которые проводили на T_reg клетках 1-го типа, специфических для узнавания антигенов, показали, что модуляция Th1 и Th2 ответов на T_reg клетки 1-го типа в основном зависит от секреции цитокина IL-10, который имеет иммуносупрессивные свойства. Действительно, IL-10 ингибирует пролиферативный ответ периферических T-клеток против специфических аллергенов и играет центральную роль в индукции T-клеточной анергии (James L.K., Durham S.R., Clin. Exp. Allergy 2008, 38: 1074-1088). In vitro IL-10 усиливает экспрессию регуляторного фактора FoxP3, модулирует функцию эозинофилов и снижает количество провоспалительных медиаторов, которые высвобождаются тучными клетками (Mobs C., и др., Int. Arch. Allergy Immunol. 2008, 147: 171-178).

Другой возможный маркер исключительно хорошей клинической эффективности указанной иммунотерапии, опосредованной молекулами iMAT, представляет собой определение изменения количества или характера специфических для аллергена T-клеток. В соответствии с этим, например, исследование окрашивания Bet v1 тетрамера, уровней и характеристик циркулирующих специфических для пыльцы березы CD4+ T-клеток может потенциально сопоставляться с таковыми до и после SIT (van Overtvelt L. и др., J. Immunol. 2008, 180: 4514-4522). В последнее время трансформирующий фактор роста (TGF)-[1 также был определен в качестве ключевого цитокина в успешном осуществлении SIT. Многие действия могут быть учтены для определения его релевантности, такие как подавление специфических Th1, Th2 и

- 22 034692

Th17 клеток, индукция FoxP3 и супрессорной функции T_reg. Кроме того, TGF-β подавляет экспрессию

FccRI на клетках Лангерганса и подавляет синтез IgE (Akdis C.A., Akdis M.J., Allergy Clin. Immunol. 2009,

123: 735-746).

Пример 5. Сравнение молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением с молекулой MAT уровня техники в соответствии с WO 2004/035793 (эквивалентная заявка США US 2005/0281816).

Для оценки чистоты белка MAT проводили электрофорез в полиакриламидном геле при использовании додецилсульфата натрия (SDS-ПАГЭ) (Thompson J. и др., J. Biol. Chem. 2002, 277: 34310-343). Способ, включающий подготовку образцов в присутствии восстанавливающего агента додецилсульфата лития (LDS) и нагревание при 75°C, приводит к получению воспроизводимых нескольких четких полос после электрофоретического разделения. Окрашивание при использовании Кумасси голубого дает линейные количественные (денситометрия) характеристики гелей, загруженных 200-1000 нг белка. При использовании моноклонального антитела, определяющего аллергенный модуль в молекуле MAT с Fel d1 в качестве аллергенного модуля (MAT-Fel d1), было показано, что основная полоса и 13 мелких полос все содержат белок MAT-Fel d1. Небольшие полосы мигрируют в том же положении, что и на исходном геле, также после повторной загрузки на гель (фиг. 2). Несколько различных методов, таких как различные режимы температуры и прописи состава буфера для подготовки образца перед началом ПАГЭ, обеспечивают получение одного и того же изображения полосы.

Во всех этих полосах наличие белка MAT-Fel d1 полной длины (цельный) и только следов белков клетки-хозяина может быть продемонстрировано после того, как каждую полосу вырезают из геля, переваренного трипсином, и затем подвергают анализу с помощью масс-спектрометрии (нано ЖХ/ЭРИ-МС). Из этих экспериментов можно сделать вывод об аномальной особенности (сдвиг геля), например, различных вариантов сворачивания MAT-Fel d1 в SDS-ПАГЭ. Это означает, что MAT-Fel d1 в анализируемом препарате не является приемлемым в качестве биофармацевтической молекулы, в частности, для клинического и/или коммерческого биофармацевтического производства, так как его чистота не может быть определена с помощью стандартных методов (например, SDS-ПАГЭ), но только с помощью модифицированной процедуры, описанной выше.

В отличие от этого явления сдвига геля MAT-Fel d1 молекулы Fel d1 как таковой не проявляет такую аномальную функцию в SDS-ПАГЭ (фиг. 3, дорожки 2 и 3). Fel d1 демонстрирует одну четкую полосу при ожидаемой молекулярной массе (19,6 кДа).

Еще одну аномальную особенность можно наблюдать при анализе при использовании ВЭЖХ с обратной фазой. Ни одного пика MAT-Fel d1 не наблюдали в данном аналитическом методе (фиг. 4), а также не наблюдали ни одного белка как в нативной конформации, так и в денатурированной форме, индуцированной хаотропными и восстанавливающими условиями. Тем не менее, для GMP сертифицированного биофармацевтического изготовления наличие одной изоформы биомолекулы в продаваемых фармацевтических препаратах является обязательным.

Эти наблюдения в SDS-ПАГЭ и анализе ВЭЖХ с обратной фазой можно объяснить физикохимическими свойствами на основе аминокислотной последовательности. Анализ диаграммы гидрофобности Кайт и Дулитл [Kyte J., Doolittle R.F., Journal of Molecular Biology 1982, 157(1), 105-132] выявил соседние крайние гидрофобные и гидрофильные домены (фиг. 5), которые могут быть ответственны за это аномальное поведение.

В частности, гидрофобный участок нацеливающего домена слитого белка является подобным трансмембранным сегментам мембранных белков, которые являются известными в данной области техники, чтобы вызвать такую аномальную функцию [Rath A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106(6): 1760-1765].

Миграция на SDS-ПАГЭ, которая не коррелируют с молекулярной массой формулы, называемая сдвиг геля, как представляется, является общей для мембранных белков. Это означает, что предписанный метод SDS-ПАГЭ, который представляет собой разделение молекул исключительно в соответствии с их молекулярной массой, независимо от их нативной 2D- или 3D-структуры, не применяется в этих случаях. В приведенной выше работе (PNAS статья) авторы исследуют аномальную подвижность геля для спиральных мембранных белков при использовании библиотеки дикого типа и мутантных последовательностей спираль-петля-спираль (шпилька), которые имеют происхождение от трансмембранных сегментов 3 и 4 муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости человека (CFTR), включая связанные с болезнью фенотипические замены остатков. Они обнаружили, что эти шпильки мигрируют при скоростях от минус 10 до плюс 30% по сравнению с молекулярными массами в соответствии с фактическими формулами на основе SDS-ПАГЭ, и загружали детергент при соотношении от 3,4-10 г SDS/г белка. Кроме того, они показали, что сдвиги мутантных гелей сильно коррелируют с изменениями в загрузочной способности шпильки SDS и со спиральностью шпильки, что свидетельствует о том, что поведение сдвига геля возникает при измененном связывании детергента. В некоторых случаях эта дифференциальная сольватация при использовании SDS может быть результатом замещения контактов белок-детергент контактами белок-белок, что подразумевает тот факт, что связывание детергента и свертывание являются тесно связанными друг с другом.

SDS-ПАГЭ (фиг. 6), а также анализ ВЭЖХ с обратной фазой (фиг. 4 и 7) MAT и iMAT белков вы- 23 034692 явили существенные различия в модели миграции или элюирования соответственно. Окисленные формы MAT-Fel d1 не показал ни одной четкой полосы на геле SDS-ПАГЭ (дорожка 3), но продемонстрировали несколько размытых полос с большими и меньшими кажущимися молекулярными массами, чем фактическое значение 32,2 кДа для MAT-Fel d1. В отличие от этого, молекула iMAT-Cul o4 продемонстрировала одну четкую полосу (M=41,6 кДа) в условиях окисления. Кроме того, хроматограмма ВЭЖХ с обратной фазой показала единственный пик (фиг. 7).

При восстанавливающих условиях молекула MAT-Fel d1 в SDS-ПАГЭ выявила основную полосу, которая мигрировала при приблизительно известной молекулярной массе, но в дополнение к этому вновь возникало несколько минорных полос, описанных на фиг. 2, которые были известны как такие, которые содержат полную последовательность MAT-Fel d1 (фиг. 6, дорожка 6). Это признак, который является характерным для аномальной особенности MAT-Fel d1. В дополнение к этому хроматограмма ВЭЖХ с обратной фазой для MAT-Fel d1 при восстанавливающих условиях (фиг. 4, правый график) демонстрирует по крайней мере 3 различных изотипа MAT-Fel. В противовес этому молекулы iMAT выявляют характеристики, которые, очевидно, являются показательными для единственного изотипа в SDS-ПАГЭ (фиг. 6, дорожка 7), а также в ВЭЖХ с обратной фазой (фиг. 7).

Восстанавливающие условия приводят к расщеплению дисульфидных мостиков в молекуле MAT, и, таким образом, молекулы MAT и iMAT должны вести себя подобным образом при восстанавливающих условиях, если дисульфидные мостики являются ответственными исключительно за аномальные характеристики MAT. Тем не менее, это не так, поскольку аномальный сдвиг геля и появление изоформ в ВЭЖХ с обратной фазой при исследовании молекулы MAT по-прежнему присутствует при восстанавливающих условиях.

Тем не менее, молекула iMAT не проявляет такого сдвига геля и имеет пик в хроматограмме ВЭЖХ с обратной фазой в нативной (окисленной) форме белка. Кроме того, диаграммы гидрофобности Кайт и Дулитл (Kyte, J. and Doolittle, R. 1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157: 105-132) молекул MAT и iMAT практически идентичны на N-терминальном конце, охватывающем последовательность His-метки, TAT и нацеливающего домена (фиг. 11). Таким образом, специалист в данной области техники не будет мотивирован конструировать молекулу MAT в соответствии с известным уровнем техники с остатками цистеина, замещенными другими аминокислотными остатками, с тем, чтобы преодолеть недостатки известного уровня техники.

Три полученные молекулы iMAT были сконструированы в соответствии с процедурами биоинформационного инжиниринга в соответствии с примером 6, приведенным ниже, и получены с помощью рекомбинантной технологии экспрессии в E.coli. Все три молекулы iMAT были стабильными в буфере (20 мМ цитрата, 1М аргинина, pH 6,0), после двукратного замораживания и оттаивания и могут быть адсорбированы на Adju-Phos® (Brenntag, Дания) в качестве адъюванта, так что молекулы iMAT могут быть использованы в качестве вакцины. Эти белки могут быть десорбированы из Adju-Phos® при отсутствии деградации в той же буферной системе (фиг. 9).

Пример 6. Биоинформационный инжиниринг молекулы iMAT для нацеливания на IBH у лошадей.

Для того чтобы, например, эффективно лечить лошадей с аллергической гиперчувствительностью на укус насекомого (IBH) при использовании технологии iMAT, дополнительно является обязательным:

a) выбрать белок Culicoides в качестве модуля аллергена в молекуле iMAT, который представляет собой основной аллерген и, таким образом, имеет высокую распространенность, чтобы вызывать гиперчувствительность у пораженных лошадей и, таким образом, также может быть мишенью для индукции толерантности, и

b) сконструировать молекулу iMAT с указанными основными аллергенами, которая является термодинамически стабильной и может быть эффективно получена при использовании белкового инжиниринга и может подвергаться дополнительному анализу с помощью стандартных способов для того, чтобы обеспечить достаточно высокое качество (то есть, идентичность, чистоту и эффективность).

Для выполнения этих требований был выбран биоинформационный подход к выбору аллергена, подлежащего включению в молекулу iMAT в соответствии с настоящим изобретением. Целью отбора было (i) выбрать один или более аллергенов, которые предполагаются как релевантные для IBH, т.е. чтобы большинство лошадей, страдающих от IBH, подвергалось сенсибилизации в отношении соответствующего аллергена, и (ii) выбрать аллерген с наибольшей вероятностью включения характеристик линейных эпитопов аллергена, т.е. включения большого числа коротких пептидных последовательностей (от 7 до 13 аминокислотных остатков), гомологичных таковым для опубликованных аллергенов.

В настоящее время около 230 белков из Culicoides (Culicoides sonorensis, Culicoides nubeculosus, Culicoides obsoletus), обнаруженные в слюне, являются известными как такие, которые могут потенциально вызвать аллергию у субъектов, например лошадей. Для того чтобы выбрать соответствующие антигены для фармацевтических препаратов, было выбрано сравнение гомологии на основе локальных выравниваний с последовательностями известных аллергенов, отличных от таковых Culicoides. Часто обнаружение эпитопа для распознавания антителом (в основном конформационные эпитопы) достигается за счет функционального анализа (например, микрочипы), а для эпитопов T-клеток (линейные эпитопы) путем подсчета вероятности связывания пептида с MHC молекулами. Терапевтический принцип iMAT техно- 24 034692 логии, среди прочих, основывается на эндоцитозе и деградации под действием кислотно-зависимых протеаз в эндосомах с последующим связыванием классом II MHC и презентацией антигена.

У лошадей характеристики таких систем в настоящее время не полностью изучены, так как разнообразие аллелей лошадиных MHC генов гораздо меньше исследованы по сравнению с системой человека и, таким образом, не являются легко доступными для экспериментов. Кроме того, исследование IBH в качестве аллергии типа I и каузальных аллергенов, которые вызывают симптомы, только недавно началось. Первый белок, охарактеризованный как такой, который обладает активностью аллергена в эффекторных клетках (т.е. базофилах, гранулоцитах) не был описан до 2008 года [Langner и др., Vet Immunol Immunopathol 2008, 122(1-2): 126-137].

Таким образом, другой - не экспериментальный, но биоинформационный -подход был выбран для отбора аллергена, который основывается на локальных поисках гомологии пептидов, которые имеют происхождение от белков Culicoides, по отношению к известным аллергенным белкам, которые не относятся к Culicoides, большинство из которых, как известно, вызывают аллергию у людей. Аминокислотные последовательности белков, которые предполагаются как такие, которые имеют аллергенные свойства, были экспортированы из общедоступных баз данных (например, UNIPROT) и избыточность была определена путем анализа гомологии последовательностей в экспортируемом наборе данных. Высоко гомологичные аналоги последовательности были устранены, и полученные оставшиеся последовательности служили в качестве канонической базы данных последовательностей вероятных допустимых антигенов для последующего анализа. Для определения белков Culicoides с путативно высоким аллергенным потенциалом, белки in silico подвергали расщеплению на пептиды с длиной от 6 до 15 аминокислот со смещением одной аминокислоты.

Проводили последующее попарное выравнивание для каждого белка Culicoides и соответствующих пептидов с базой данных канонических последовательностей. После этого проводили масштабирование полученных при выравнивании совпадений путем установки балла самовыравнивания данного белка Culicoides на уровне единицы и совпадений при выравнивании соответствующих пептидов соответственно. Далее количество соответствий при выравнивании, которые превышали заданный порог, подсчитывали для каждого, и сравнивали пептид путем локального попарного выравнивания для случайно сгенерированных баз данных белковых последовательностей без известных аллергенных свойств, а затем подвергали масштабированию и подсчету. Полученные значения для неаллергического белка вычитали из таких результатов для аллергена, и подсчитывали кумулятивные баллы совпадений для каждого белка Culicoides на основе количества совпадений для всех соответствующих пептидов (фиг. 12). Белки с самыми высокими значениями были выбраны в качестве кандидатов для антигенного модуля iMAT.

Для валидации биоинформационного метода отбора антигена измеряли наличие сенсибилизации против пяти аллергенов Culicoides у 13 лошадей, страдающих от клинически диагностированной IBH. Все отобранные антигены были исследованы при использовании полуколичественного функционального ех vivo эксперимента на основе н специфического для аллергена высвобождения гистамина из базофилов лошади, изолированных из образцов крови (тест высвобождения гистамина = HRT, подробная информация о тесте: смотри пример 2). Рекомбинантные аллергены исследовали в 3 концентрациях, и значение балла для каждого аллергена колебалась от 0 (отсутствие сенсибилизации) до 6 (самый высокий уровень сенсибилизации). Данные, полученные от всех 13 лошадей, были сопоставлены с результатами биоинформационных расчетов (фиг. 8).

Этот анализ демонстрирует превосходную общую корреляцию (r=0,97) между сенсибилизацией (суммарные значения баллов для каждого аллергена группы) и прогнозируемым баллом. Из этого корреляционного анализа мы приходим к выводу, что биоинформационный метод выбора антигена является приемлемым для того, чтобы выбрать соответствующие аллергены Culicoides для антигенного модуля в молекуле iMAT. Таким образом, подверженных IBH лошадей можно лечить с помощью молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, включающей выбранные аллергены, для того, чтобы вызвать толерантность в отношении этих аллергенов с высокой вероятностью у значительной части подгруппы больных субъектов.

Три аллергена были выбраны на основе биоинформационного анализа как такие, которые подлежат включению в три различные молекулы iMAT, т.е. Cul o3, Cul o2 и Cul o4.

Каждый из отобранных аллергенов интегрировали в отдельную iMAT молекулу в качестве антигенного модуля и после этого оптимизировали для термодинамической устойчивости путем итеративного моделирования трехмерной структуры белков и вычисление изменений свободных энергий после замены единичных аминокислот. Физико-химические свойства и стабильность подвергались влиянию путем замены различных аминокислотных остатков в пределах первичной аминокислотной последовательности.

Результаты описанных в данной заявке анализов (поиск антигена и моделирование) были трансформированы в аминокислотные последовательности iMAT, приемлемые для фармакологического производства и применения у лошадей для лечения, например, IBH.

Пример 7. Конструирование мозаичной молекулы iMAT в соответствии с изобретением.

Предполагается, что молекула iMAT в соответствии с изобретением может быть дополнительно

- 25 034692 улучшена, если компонент более чем одного аллергена является включенным в антигенный модуль. Для этой цели можно применять основной принцип описанного выше биоинформационного подхода к отбору (пример 6) иным образом. Вместо отбора полных аллергенов на основе подсчета совпадений пептидов аллергенов, обнаруженных в базе данных аллергенов, только наиболее часто встречающиеся пептиды нескольких из таких аллергенов используются для конструирования антигенного модуля iMAT. Таким образом, такая iMAT молекула состоит из пептидов антигенного модуля, которые имеют происхождение от нескольких аллергенов. Это позволяет расширить спектр одной молекулы iMAT по отношению к ее целевому аллергическому профилю и, таким образом, это является полезным для разработки фармакологического препарата.

Для того чтобы найти короткие пептидные последовательности, которые соответствуют критериям для такого мозаичного iMAT белка, 230 белков из видов Culicoides (Culicoides sonorensis, Culicoides nubeculosus, Culicoides obsoletus), обнаруженные в слюне, были проанализированы путем сравнения гомологии, как описано выше (см. пример 6). Вкратце, in silico расщепленные белки из Culicoides с длиной пептида 6-15 аминокислотных остатков были локально подвергнуты выравниванию с базой данных канонических последовательностей связанных с аллергенами белков и случайным образом сгенерированной базой данных, не связанных с аллергией белков. Определяли ряд отличий существенных гомологий для каждого пептида, найденного в канонической базе данных. Впоследствии каждый пептид подвергали локальному выравниванию со случайным образом сгенерированной базой данных увеличивает втрое размер канонической базы данных, чтобы уменьшить число ложных положительных совпадений. Верхняя часть (например, десятый процентиль) оставшихся гомологий для каждой длины пептида является особенно приемлемой для того, чтобы служить в качестве основы для проведения конструирования мозаичных или гибридных молекул iMAT, которые несут аллерген. Для конструирования мозаичной молекулы iMAT белка выбирали предшественника (например, из списка белков-предшественников, занимающих верхние позиции рейтинга) в качестве каркасного белка для введения пептидов топ рейтинга. При этом удаляется сигнальная пептидная последовательность из каркасного белка, и пептиды топ рейтинга с дополнительными смежными N- или C-терминальными аминокислотами могут встраиваться в исходную последовательность каркасного белка или могут заменять части исходной последовательности каркасного белка. Положение для вставки или замены определяется при использовании подобия или референтного положения пептида в соответствующем белке предшественника. В качестве следующего шага, добавляются His-метка, ТАТ и домен нацеливания. В завершение, остатки цистеина заменяются наиболее стабилизирующими остатками, как описано выше.

В типичном случае этого подхода белок слюны Culicoides sonorensis (номер доступа базы данных UniProt Q66U13) был использован в качестве каркасного белка. Наиболее аллергенная структура внутри белка была определена для того, чтобы сохранить эту часть последовательности. Сигнальный пептид последовательности удаляется, и далее прибавляются последовательности из базы данных UniProt с номерами доступа Q5QBI9, Q5QBK6, Q5QBL6, Q5QBJ4 и Q5QBI2. После этого мозаичный аллерген интегрируют в общую структуру молекулы iMAT. В завершение, остатки цистеина заменяют другими аминокислотными остатками, предпочтительно остатками серина, лейцина, изолейцина и/или аспарагиновой кислоты, которые не снижают стабильности сконструированной молекулы iMAT (слитый белок).

SEQ ID NO: 17 показывает полную последовательность типичной мозаичной (гибридной) молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением [аминокислотный остаток 1: N-терминальный метионин, аминокислотные остатки 2-7: His-метка, аминокислотные остатки 8-18: TAT последовательность, аминокислотные остатки 19-128: домен нацеливания, аминокислотные остатки 129-333: гибридный аллерген (каркасный белок Q66U13 без сигнального пептида и встроенных/замененных последовательностей; встроенные/замененные последовательности: аминокислотные остатки 137-151: Q5QBI9; аминокислотные остатки 155-166: Q66U13; аминокислотные остатки 185-200: Q5QBK6; аминокислотные остатки 215-229: Q5QBL6: аминокислотные остатки 235-250; Q5QBL6; аминокислотные остатки 265-278: Q5QBJ4; аминокислотные остатки 318-333: Q5QBI2; замененные цистеины (серин): 46, 146, 158, 173, 222, 225, 246, 273, 283, 329; замененные цистеины (лейцин): 295; замененные цистеины (изолейцин): 299; замененные цистеины (аспарагиновая кислота): 181].

Пример 8. Терапевтическая вакцина/профилактика рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO) у лошадей.

Одна молекула iMAT или комбинация молекул iMAT, содержащих различные антигенные модули в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для профилактического или терапевтического лечения лошадей, страдающих от или подвергшихся риску RAO и/или от RAO, связанного с летним пастбищем. Лошадям молекулу iMAT в соответствии с настоящим изобретением можно вводить так, как описано в примере 4.

Будут использоваться взрослые лошади с известной историей RAO. До начала лечения лошадей подготавливают, например приучают стоять в стойле в маске, чтобы иметь возможность осуществлять полный медицинский осмотр дыхательных путей, в том числе измерения с помощью пневмотахографа, эндоскопию дыхательных путей и бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для анализа, например, процент

- 26 034692 нейтрофилов в жидкости БАЛ. Осуществляют полный анализ крови и исследуют биохимический профиль, чтобы исключить наличие сопутствующих заболеваний.

Следующие параметры могут быть исследованы для изучения дыхательной системы и для измерения эффективности терапевтического и/или профилактического лечения при использовании молекулы iMAT: изменение переменных функции легких, например частоты дыхания, максимального транспульмонального давления, сопротивления легких, эластичности легких. Кроме того, параметр может быть включен во взвешенную систему клинических показателей, например, также оцениваются клинические баллы дыхательного усилия/подъема живота, выделения из носа и/или раздувание крыльев носа, кашель и/или патологические звуки легких, бронхов и/или трахей.

Таким образом, на протяжении всего периода лечения и/или после него эффективность терапии или профилактики RAO может быть исследована клинически при использовании количественных, полуколичественных или качественных оценок.

Эти клинические параметры можно сравнить с клиническими признаками индивидуальной лошади в предыдущие сезоны и/или с тяжестью до начала терапевтического вмешательства. Альтернативно, сравнение со страдающими от RAO лошадьми, которые не подвергались обработке или были обработаны при использовании плацебо, может продемонстрировать эффективность опосредованного молекулой iMAT лечения и/или профилактики клинических признаков RAO.

Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) и/или свежая кровь, полученная от указанных лошадей, могут быть использованы в in vitro провокационном тесте для 1-го типа аллергических реакций у лошадей, например, при использовании HRT или CAST® (подробнее см. пример 2 и/или Hare и др., Can. J. Vet. Res. 1998; 62: 133-139). Снижение количества легочных тучных клеток и/или дегрануляции базофилов в ответ на провокацию при использовании определенных аллергенов, например, высвобождение гистамина и/или сульфидолейкотриена после лечения с помощью молекулы iMAT, по сравнению с таковым до лечения указывает на терапевтический и/или профилактический эффект.

Альтернативно или дополнительно, применение определенных рекомбинантных аллергенов в интрадермальном провокационном тесте, инъекционной кожной пробе или также специфических для аллергена IgE и/или IgG определений в БАЛ жидкости или сыворотке можно подвергать мониторингу у указанных лошадей (Tilley P. и др., J. Equine Vet. Sci. 2012, 32: 719-727). Сниженный ответ (немедленная и/или замедленная реактивность) и/или изменение титров антитела свидетельствуют о терапевтическом и/или профилактическом эффектах молекулы iMAT, используемой для лечения.

- 27 034692

Ссылки.

(1) Akdis СА, Akdis MJ, Allergy Clin Immunol 2009, 123: 735-746 (2) Allergome (www.allergome.org) (3) Durham SR и др., J Allergy Clin Immunol 1996, 97: 1356-1365 (4) Gadermaier G и др., Molecular Immunology 2010, 47: 1292-1298 (5) Ginel PJ и др., Vet. Dermatol. 2014, 25(1): 29-elO (6) Hare JE и др., Can J Vet Res 1998, 62: 133-139 (7) James LK, Durham SR, Clin Exp Allergy 2008, 38: 1074-1088 (8) Kaul, S., Type I allergies in the horse: Basic development of a histamine release test (HRT). Doctoral thesis. Veterinary School Hannover 1998, Germany (9) Kehrli D et al, J Vet Intern Med 2015, 29(1): 320-326 (10) Kelley J и др., Immunogenetics 2005, 56: 683-695 (11) Klein JS и др., Protein Eng Des Sei 2014, 27(10): 325-330 (12) Kyte J, Doolittle RF, Journal of Molecular Biology 1982, 157(1): 105-132 (13) Landholt GA и др., Vet Rec 2010, 167: 302-304 (14) Langner К и др., Vet Immunol Immunopathol 2008, 122(1-2):126-137 (15) Leclere M и др., Respirology 2011, 16: 1027-1046 (16) Martinez-Gomez JM и др., Allergy 2009, 64(1): 172-178 (17) Mobs С, и др., Int Arch Allergy Immunol 2008, 147: 171-178 (18) Niederberger V и др., Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101: 14677-14682 (19) Olsen L и др., Vet.J. 2011, 187: 347-351 (20) Pires DE и др. Bioinformatics 2014,30(3): 335-342 (21) Pirie RS, Equine Vet J 2014, 46: 276-288 (22) Rath А и др., PNAS 2009, 106(6): 1760-1765 (23) Report of the 3^rd Havemeyer workshop on allergenic diseases of the Horse, Holar, Iceland, June 2007, Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008, 126: 351-361 (24) Rose H, Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess 2009, 96: 319-327 (25) Schaffartzik А и др., Veterinary Immunology and Immunopathology 2012, 147: 113-126 (26) Senna G и др., Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2011, 11(4):375-380 (27) Senti G и др., J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296 (28) SIAF Annual Report 2010 (29) SIAF Annual Report 2011 (30) Tilley P и др., J Equine Vet Sci 2012, 32: 719-727 (31) US 2005/0281816 (32) US 2014/0105906 (33) US 7,653,866 (34) van Bargen, К and Haas, A. FEMS Microbiol Rev 2009, 33: 870-891 (35) van der Meide N и др., Vet J 2014, 200: 31-37 (36) van Overtvelt L и др., J Immunol 2008, 180: 4514-4522 (37) Vazquez-Boland, JA и др., Vet Microbiol 2013, 167: 9-33 (38) Wacholz PA и др., J Allergy Clin Immunol 2003; 112:915-922 (39) WO 2004/035793

- 28 034692

В списке последовательностей

SEQ ID NO: 1 относится к приемлемой минимальной аминокислотной последовательности для одного транслокационного модуля в соответствии с настоящим изобретением, который все еще остается функциональным, т.е. является способным эффективно способствовать поступлению в клетку;

SEQ ID NO: 2 относится к полной аминокислотной последовательности инвариантной цепи лошадей;

SEQ ID NO: 3 относится к полной аминокислотной последовательности Cul n4 аллергена;

SEQ ID NO: 4 относится к полной аминокислотной последовательности Cul o1 аллергена; SEQ ID NO: 5 относится к полной аминокислотной последовательности Cul o2 аллергена; SEQ ID NO: 6 относится к полной аминокислотной последовательности Cul o3 аллергена; SEQ ID NO: 7 относится к Cul n4 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 8 относится к Cul n4 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 9 относится к Cul o1 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 10 относится к Cul o1 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 11 относится к Cul o2 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 12 относится к Cul o2 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 13 относится к Cul o3 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 14 относится к Cul o3 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением;

SEQ ID NO: 15 относится к специфическому фрагменту аминокислотной последовательности инвариантной цепи лошадей с поддерживаемой функцией внутриклеточного транспорта;

SEQ ID NO: 16 относится к специфическому фрагменту аминокислотной последовательности инвариантной цепи лошадей с поддерживаемой функцией внутриклеточного транспорта;

SEQ ID NO: 17 относится к цельной последовательности типичной мозаичной молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением;

SEQ ID NO: 18 относится к полной аминокислотной последовательности Cul o4 аллергена;

SEQ ID NO: 19 относится к полной аминокислотной последовательности Cul o7 аллергена;

SEQ ID NO: 20 относится к Cul o4 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 21 относится к Cul o4 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 22 относится к Cul o7 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением; SEQ ID NO: 23 относится к Cul o7 молекуле iMAT в соответствии с настоящим изобретением.

Все ссылки на документы уровня техники, представленные в данной заявке, а также список последовательностей, сопровождающих данную заявку, являются введенными в данную заявку независимо друг от друга в качестве ссылки во всей своей полноте.

1. Изолированный рекомбинантный белок, содержащий, по крайней мере, первый модуль, который позволяет осуществлять транспорт рекомбинантного белка из внеклеточного пространства внутрь клеток, по крайней мере, второй модуль, который позволяет осуществлять транспорт рекомбинантного белка внутриклеточно к органеллам, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов или нагрузку МНС молекул антигенами, и, по крайней мере, антигенный модуль, который определяет специфичность иммунного ответа, модулированного с помощью рекомбинантного белка у индивидуума, посредством чего эти модули являются связанными ковалентно друг с другом и необязательно содержат спейсерные модули между по крайней мере одним из указанных модулей, где

а) первый модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию из внеклеточного пространства внутрь клеток,

б) второй модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для видов нацеливание рекомбинантного белка внутриклеточно на органеллы, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов или нагрузку МНС молекул антигенами,

в) антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по крайней мере от одного эпитопа антигена, который является аллергеном, в соответствии с чем, по крайней мере, в этом антигенном модуле по крайней мере один остаток цистеина является замененным на серин или отличный аминокислотный остаток в указанном изолированном рекомбинантном белке.

2. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с п.1, где в указанном антигенном модуле или в цельном изолированном рекомбинантном белке все остатки цистеина являются замененными с помощью отличного аминокислотного остатка.

3. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с п.1 или 2, где остатки цистеина являются замененными с помощью остатков серина.

4. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с п.1 или 2, где второй модуль представляет собой инвариантную цепь лошади, подобный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 15, 16, и/или антигенный модуль содержит эпитоп, который имеет происхождение от аллергена, который вызывает аллергию у лошадей.

5. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с п.1 или 2, где антигенный модуль со-

- 29 034692 держит по крайней мере один эпитоп аллергена, который имеет происхождение от насекомых, которые питаются кровью, в частности от подрода Culicoides.

6. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с одним из предыдущих пунктов, где аллерген представляет собой по крайней мере один из Cul n4, Cul o1, Cul o2 или Cul o3 аллергенов.

7. Рекомбинантный белок в соответствии с одним из предыдущих пунктов, который дополнительно содержит модуль метки, подобный His-метке, где модуль метки может присутствовать на Nтерминальном конце и/или C-терминальном конце.

8. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с одним из предыдущих пунктов, где первый модуль представляет собой HIV-tat, VP22 или Antennapedia или их частичную последовательность, которая является функциональной в качестве модуля для транслокации.

9. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с одним из предыдущих пунктов, который находится в форме мономера.

10. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с одним из предыдущих пунктов, который является представленным в линейной форме.

11. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с одним из предыдущих пунктов, включающий или состоящий из любой из последовательностей SEQ ID NO: 7-14.

12. Изолированный рекомбинантный белок в соответствии с одним из предыдущих пунктов для применения в качестве фармацевтической композиции.

13. Изолированный предложенный белок для применения в соответствии с п.12, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой вакцину.

14. Изолированный рекомбинантный белок для применения в соответствии с любым из пп.12, 13, предназначенный для сублингвального применения, подкожной или интрадермальной инъекции, инъекции в лимфатический узел или для введения через слизистую оболочку, в частности через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта или респираторной системы.

15. Нуклеиновая кислота, которая кодирует изолированный рекомбинантный белок в соответствии с любым из пп.1-11.

16. Вектор, который включает, по крайней мере, последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с п.15.

17. Первичные клетки или линия клеток, включающая, по крайней мере, вектор, как заявлено в п. 16, или нуклеиновую кислоту в соответствии с п.15.

18. Способ идентификации аминокислотных замен в предварительно определенной аминокислотной последовательности, позволяющих осуществить стабилизацию указанной предварительно определенной аминокислотной последовательности, включающий этапы:

i) моделирование третичной структуры целевого белка;

ii) итеративное определение стабильности на основе точечных мутаций, подобных замене цистеина на отличный аминокислотный остаток, и классификации для определения стабилизирующих замен путем анализа доступных трехмерных структур;

iii) повторного моделирования новой структуры и подтверждение стабильности путем повторения этапа i) и ii).

19. Способ в соответствии с п.18, где на этапе ii) оценивают изменение свободной энергии свертывания.

20. Способ в соответствии с п.18 или 19, где на этапе ii) количество возникновений специфических замен использует систему подсчета, которая классифицирует замену на основе возниконовений в используемых моделях и изменения свободной энергии стабильности белка AAG.

21. Рекомбинантный белок в соответствии с любым из пп.1-11, который получен с помощью способа в соответствии с любым из пп.18-20.

22. Рекомбинантный белок в соответствии с любым из пп.1-14 для предотвращения и/или терапии гиперчувствительности на укус насекомого у животных, которые представляют собой лошадей.

- 30 034692

Перечень последовательностей <110> БЁРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ВЕТМЕДИКА ГМБХ <120> УЛУЧШЕННЫЕ ТРАНСПОРТНЫЕ МОЛЕКУЛЫ МОДУЛЯРНОГО

АНТИГЕНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> Р01-3045 PCT+FF <150> ЕР14162575.6 <151> 2014-03-31 <160>23 <170> Patentin версия 3.5 <210>1 <211>11 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>1

Туг Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg

510 <210>2 <211>208 <212> Белок <213> Equus caballus <400>2

Met 1

Glu

Asp Gin Arg 5

Asp

Leu lie Ser

Asn His Glu 10

Gin

Vai

Pro 15

He

Leu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Cys

Ser

Arg

Gly

Ala

20

25

30

Leu

Tyr

Thr

Gly

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

Ala

Leu

Ala

Gly

Gin

35

40

45

Ala

Thr

Ala

Tyr

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

Asp

Lys

50

55

60

Leu

Thr

Vai

Thr

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

Met

Lys

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ser

Ala

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

He

Arg

Vai

Ala

Thr

Pro

85

90

95

Met

Leu

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

His

Gly

Pro

Met

100

105

110

Gin

Asn

Ala

Thr

Lys

Tyr

Gly

Asn

Thr

Gin

Asp

His

Vai

Met

His

115

120

125

Leu

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu

Lys

Vai

Tyr

Pro

Gin

Leu

Lys

Gly

130

135

140

Ser

Phe

Gin

Glu

Asn

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Ser

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

145

150

155

160

Asp

Trp

Lys

Vai

Phe

Glu

Asn

Trp

Met

His

Gin

Trp

Leu

Phe

Glu

165

170

175

Met

Ser

Arg

Asn

Ser

Leu

Glu

Lys

Pro

Thr

Gin

Gly

Pro

Thr

Lys

180

185

190

- 31 034692

Glu Pro

Leu 195

Glu

He Glu Asp

Leu Ser Ser 200

Gly Vai

Gly Met 205

Ala

Lys

<21 (

3>

3

<211>

152

<212>

Белок

<213>

Culicoides spec.

<400>

3

Met

Lys

Phe

Pro

Thr

Phe

Leu

He

Leu

Ala

Phe

Leu

Ser

Leu

Tyr

1

5

10

15

lie

Ser

Thr

Ala

Ser

Arg

Lys

His

Phe

Arg

His

Leu

Lys

Arg

20

25

30

lie

Glu

Ala

Asn

Asp

Cys

Pro

Ala

Lys

Asn

Ser

Gly

Thr

Tyr

Gin

35

40

45

Lys

Vai

Cys

Lys

Gin

Leu

Gin

Lys

Tyr

Vai

Leu

Thr

Pro

Asp

50

55

60

Lys

Leu

Gly

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gly

Leu

Gin

Glu

Ala

Asn

Arg

65

70

75

80

Vai

Leu

Thr

Pro

Vai

Ser

Lys

Ser

Asp

Lys

He

Thr

Phe

Asp

He

Vai

85

90

95

Gin

Asn

Cys

Leu

Lys

Asn

Phe

Gin

Vai

Met

Vai

Asn

Lys

His

Asn

Lys

100

105

110

Glu

Ala

Leu

Arg

Lys

Tyr

Arg

Glu

Cys

Lys

Glu

Cys

Phe

Thr

Glu

115

120

125

Vai

Gly

Lys

Glu

Phe

Ser

Ala

Leu

Asp

Lys

Thr

Gly

Vai

Gin

lie

130

135

140

Ala

Glu

Cys

Leu

Asn

Glu

Ser

Leu

145 150 <210> 4 <211> 205 <212> Белок <213> Culicoides spec

<400> 4

Met

Arg

Phe

Ala

Thr

He

Phe

Leu

Ser

Ala

Ser

He

Leu

1

5

10

15

Ser

Thr

Gly

Glu

Ala

Leu

Ala

Lys

He

Asp

Lys

Ser

20

25

30

Met

Pro

Glu

Cys

Leu

Pro

Leu

Pro

Lys

Arg

Ala

Ser

Glu

35

40

45

Cys

Thr

Asn

Gin

Ser

Gly

Phe

Lys

Tyr

Pro

Lys

Thr

Asn

Gin

Cys

50

55

60

Gly

Pro

Vai

Arg

Asn

Gin

Leu

Cys

Gin

Gly

His

Gly

Phe

Thr

65

70

75

80

Leu

Asp

Glu

Cys

Vai

Tyr

Lys

Cys

Tyr

Asp

Tyr

Arg

Lys

Met

Ser

Thr

90 95

- 32 034692

Thr Lys Asn Vai Asp Gly

Cys Asn Lys Ser lie Lys Glu Glu Glu Met

Thr Glu Ala lie Arg Vai Vai

Ser Arg Gly Asp Ser Pro Asp Leu lie

115 120 125

Lys Asp Asn Arg Cys Arg Glu Pro

130 135

Asn Glu Leu Ser Leu Lys Asn Gly

140

Ser Ala Arg Vai Lys Pro Ala Tyr

145 150

Lys Phe Asn Lys Asp Thr Asn Glu

155 160

Cys Vai Ala Met Met Asp Lys Vai

165

Cys Leu Gly Arg Asn Arg Phe Lys

170 175

Thr Lys Glu Glu Cys Vai His Vai

180

Cys Asn Trp Asn Leu Ser Ser Gly

185 190

Arg His Arg His lie Vai Arg Glu

195 200

Ser Asn Ala Lys Gin

205 <210>5 <211>388 <212> Белок <213> Culicoides spec.

<400>5

Met Trp Ser Ser Vai Vai Asn lie

Thr Ala His Leu lie Ser Ala Gin

Asp Ser Pro Leu Asn lie Vai Lys

3540

Asn Asn Asn Gin Asn Asp Phe Asn

5055

Ser His He Met Ala Vai Vai Thr

1015

His Leu He Gin Ala Glu Leu Pro

2530

Glu Phe Asp Asp Asp Gly Arg Asn

Phe Tyr Trp Asn He Pro Ser Phe

Met Cys Ala Gin His Asn lie Thr

70

Phe Thr Asp Met Thr Ser Ser Tyr

80

Asn lie Vai Gin Asn Lys Asp Asp

Lys Trp Arg Gly Asp Lys He Vai

95 lie Leu Tyr Asp Pro Gly Lys Phe

100

Pro Ala Leu Leu Glu His Gin Gly

105 110

Gin Leu Tyr Arg Arg Asn Gly Gly

115 120

Vai Pro Gin Glu Gly Asn Leu Gin

125

Glu His lie Asp lie Leu Ala Glu

130 135

His He Asn Lys Leu He Pro Asp

140

Thr Gin Phe Ser Gly He Gly Vai

145 150

He Asp Phe Glu Ser Trp Arg Pro

155 160

He Phe Arg Gin Asn Ser Gly Vai

165

Leu Gin Pro Tyr Lys Asp Leu Ser

170 175

Tyr Lys

Leu Vai His Arg Asp His Lys

Leu

Trp Asn Arg Lys Arg Vai

180

185

190

Glu

lie

Glu 195

Ala

Ala Arg

Leu

Phe Glu 200

Ala

Ala Gly Arg 205

Thr

Phe

Vai

Glu

Thr

He

Asn

Vai

Ala

Lys

He

Leu

Arg

Pro

Lys

Ala

Lys

Trp

210

215

220

Gly

Tyr

Gly

Phe

Pro

Tyr

Cys

Phe

Asn

Met

Asn

Gly

Ala

Asn

225

230

235

240

Met

Asn

Glu

Asp

Cys

Pro

Ala

Asn

Vai

Lys

Glu

Asn

Asp

Gin

He

245

250

255

Lys

Trp

Leu

Trp

Asp

He

Vai

Asp

Vai

Leu

Pro

Ser

Vai

Tyr

Leu

260

265

270

Asn

Lys

He

Thr

Ser

Ala

Gin

Arg

Vai

Gin

Phe

Vai

Arg

Gly

Arg

275

280

285

Met

Arg

Glu

Gly

Tyr

Arg

Vai

Ala

Lys

Met

Ser

Lys

Ser

Pro

Lys

290

295

300

Pro

Vai

Leu

Ala

Tyr

Leu

Arg

Tyr

Vai

Tyr

Thr

Asp

Thr

Leu

Lys

305

310

315

320

Phe

Leu

Ser

Asn

Glu

Asp

Leu

Lys

Gin

Ala

He

Lys

Vai

Ser

Lys

Glu

325

330

335

Gin

Lys

Ser

Lys

Gly

Met

He

Phe

Trp

Gly

Ser

Tyr

Asp

Vai

Lys

340

345

350

Thr

Lys

Glu

Gin

Cys

He

Asp

Phe

Arg

Lys

Tyr

Vai

Asp

Asn

Leu

355

360

365

Gly

Pro

lie

Vai

Leu

Ala

Asn

Lys

Ser

Pro

Lys

Vai

Leu

Thr

370

375

380

Pro

7X.SEL

Leu

Ala

385 <210>6 <211>261 <212> Белок <213> Culicoides spec.

<400>6

Met 1

Phe

Arg

He

Cys 5

Leu Phe Thr Vai

Leu Cys Vai Asn 10

Phe

Vai 15

Vai

Ala

Thr

Asp

Phe

Cys

Asp

Arg

Lys

Leu

Cys

Arg

Gin

He

Glu

Pro

20

25

30

Asn

Vai

Tyr

Gin

Asn

He

Pro

His

He

Gly

Cys

Asn

Hi s

Asp

Gly

Arg

35

40

45

Asn

Ser

Pro

Ala

Cys

Pro

Ser

Asp

Ala

Lys

He

Leu

Pro

Met

Ser

Thr

50

55

60

Lys

Arg

Lys

Asn

Leu

He

Leu

Arg

Vai

His

Asn

Arg

Leu

Arg

Asn

Lys

65

70

75

80

Vai

Ala

Leu

Gly

Gin

Leu

Pro

Gly

Tyr

Pro

Lys

Ala

Vai

Arg

Met

Pro

85

90

95

Не

Leu Arg

Trp 100

Asp

Glu

Leu

Ala 105

Tyr

Leu

ZX.1 a. GI u.

Leu 110

Asn Vai

Lys

Gin

Cys

Glu

Met

Lys

His

Asp

Gin

Cys

Arg

Asn

Thr

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Arg

Tyr

Ala

Gly

Gin

Asn

Leu

Ala

Tyr

He

Gly

Lys

Glu

Pro

130

135

140

As η

Ala

Vai

Arg

He

Lys

Thr

Leu

Vai

Arg

Ala

Trp

Phe

Asp

Glu

Tyr

145

150

155

160

Lys

Asp

Ala

Asn

Ser

Phe

He

Asp

Lys

Tyr

Arg

Ser

His

Pro

Asn

165

170

175

Gly

Lys

Ala

He

Gly

His

Phe

Thr

Ala

Met

Vai

Gin

Asp

Arg

Thr

Asp

180

185

190

Thr

Vai

Gly

Cys

Ala

He

Leu

Arg

His

Thr

Lys

Asn

Thr

Tyr

Phe

195

200

205

Leu

Ala

Cys

Asn

Tyr

Ser

Phe

Thr

Asn

Met

Vai

Lys

Asp

Lys

Vai

Tyr

210

215

220

Thr

Arg

Gly

Ala

Lys

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Thr

Gly

Cys

Ser

Pro

225

230

235

240

Vai

Tyr

Lys

Gly

Leu

Cys

Lys

Pro

His

Glu

Tyr

Vai

Asn

Pro

Asp

Pro

245

250

255

Asp

Glu

Asp

Leu

Asp

260 <210>7 <211>258 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>7

Met His His His His His His

Tyr

Gly Arg 10

Lys

Lys Arg

Arg

Gin 15

Arg

1

5

Arg

Met

Glu

Asp

Gin

Arg

Asp

Leu

He

Ser

Asn

His

Glu

Gin

Vai

20

25

30

Pro

He

Leu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

35

40

45

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

A.1 a

Leu

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Ala

Thr

Ala

Tyr

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

65

70

75

80

Asp

Lys

Leu

Thr

Vai

Thr

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

85

90

95

Met

Lys

Leu

Pro

Lys

Ser

Ala

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

He

Arg

Vai

Ala

100

105

110

Thr

Pro

Met

Leu

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

His

Gly

- 35 034692

115 120

125

Arg Arg Lys His Phe Arg His Leu

130 135

Lys Arg He Glu Ala Ala Asn Asp

140

Ser Pro Ala Lys Asn Ser Gly Thr

145 150

Tyr Gin Lys Val Ser Lys Gin Leu

155 160

Gin Lys Tyr Tyr Val Leu Thr Pro

165

Asp Asp Lys Leu Gly Ser Tyr Leu

170 175

Lys Gly Gly Leu Gin Glu Ala Ala

180

Asn Arg Val Leu Thr Pro Val Ser

185 190

Lys Ser Asp Lys lie Thr Phe Asp

195 200

He Val Gin Asn Ser Leu Lys Asn

205

Phe Gin Val Met Val Asn Lys His

210 215

Asn Lys Glu Ala Leu Arg Lys Tyr

220

Arg Glu Ser Lys Lys Glu Ser Phe

225 230

Thr Glu Val Gly Lys Glu Phe Ser

235 240

Ser Ala Leu Asp Lys Thr Gly Val

245

Gin He Ala Glu Ser Leu Asn Glu

250 255

Ser Leu <210>8 <211>258 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>8

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg

Arg Asp Leu He Ser Asn His Glu

Gin Arg Arg Arg Met Glu Asp Gin

15

Gin Val Pro He Leu Gly Gin Arg

30

Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser

40

Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly

Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu

55

Leu Ala Gly Gin Ala Thr Thr Ala

Tyr Phe Leu Phe Gin Gin Gin Gly

70

Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr

80

Ala Gin Asn Leu Gin Leu Glu Lys

Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Ser

95

Ala Lys Pro Val Ser Lys He Arg

100

Val Ala Thr Pro Met Leu Met Gin

105 110

Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser

115 120

His Gly Arg Arg Lys His Phe Arg

125

His Leu Lys Arg He Glu Ala Ala

130 135

Asn Asp Ser Pro Ala Lys Asn Ser

140

- 36 034692

Gly

Thr

Tyr Gin

Lys

Vai 150

Ser

Lys

Gin Leu

Gin Lys 155

Tyr

Vai

Leu 160

Thr

Pro

Asp

Lys

Leu

Gly

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gly

Leu

Gin

Glu

165

170

175

Ala

Asn

Arg

Vai

Leu

Thr

Pro

Vai

Ser

Lys

Ser

Asp

Lys

lie

Thr

180

185

190

Phe

Asp

He

Vai

Gin

Asn

Ser

Leu

Lys

Asn

Phe

Gin

Vai

Met

Vai

Asn

195

200

205

Lys

His

Asn

Lys

Glu

Ala

Leu

Arg

Lys

Tyr

Arg

Glu

Ser

Lys

Glu

210

215

220

Ser

Phe

Thr

Glu

Vai

Gly

Lys

Glu

Phe

Ser

Ala

Leu

Asp

Lys

Thr

225

230

235

240

Gly

Vai

Gin

He

Ala

Glu

Ser

Leu

Asn

Glu

Ser

Leu

His

245

250

255

His His <210>9 <211>310 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>9

Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg

1015

Arg

Arg Met

Glu Asp 20

Gin Arg

Asp Leu He Ser Asn His Glu

Gin

Vai

25

30

Pro

He

Leu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

35

40

45

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

Ala

Leu

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Ala

Thr

Ala

Tyr

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

65

70

75

80

Asp

Lys

Leu

Thr

Vai

Thr

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

85

90

95

Met

Lys

Leu

Pro

Lys

Ser

Ala

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

He

Arg

Vai

Ala

100

105

110

Thr

Pro

Met

Leu

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

Hi s

Gly

115

120

125

Lys

He

Asp

Lys

Ser

Met

Pro

Glu

Ser

Leu

Pro

130

135

140

Leu

Pro

Lys

Arg

Ala

Ser

Glu

Ser

Thr

Asn

Gin

Ser

Gly

Phe

145

150

155

160

Lys

Tyr

Pro

Lys

Thr

Asn

Gin

Ser

Gly

Pro

Vai

Arg

Asn

Gin

Leu

165

170

175

- 37 034692

Ser

Gin

Gly His Gly 180

Gly Phe

Thr

Thr Leu 185

Asp Glu

Ser

Vai 190

Tyr

Lys

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Arg

Lys

Met

Ser

Thr

Lys

Asn

Vai

Asp

Gly

Ser

195

200

205

As η

Lys

Ser

lie

Lys

Glu

Met

Thr

Glu

Ala

lie

Arg

Vai

210

215

220

Ser

Arg

Gly

Asp

Ser

Pro

Asp

Leu

lie

Lys

Asp

Asn

Arg

Ser

Arg

Glu

225

230

235

240

Pro

Asn

Glu

Leu

Ser

Leu

Lys

Asn

Gly

Ser

Ala

Arg

Vai

Lys

Pro

Ala

245

250

255

Туг

Lys

Phe

Asn

Lys

Asp

Thr

Asn

Glu

Ser

Vai

Ala

Met

Asp

Lys

260

265

270

Vai

Ser

Leu

Gly

Arg

Asn

Arg

Phe

Lys

Thr

Lys

Glu

Ser

Vai

His

275

280

285

Vai

Ser

Asn

Trp

Asn

Leu

Ser

Gly

Arg

His

Arg

Hi s

He

Vai

Arg

290

295

300

Glu

Ser

Asn

Ala

Lys

Gin

305 <210>

<211>

<212>

<213>

<400>

Белок

Синтетический пептид

Met Tyr 1

Gly Arg

Lys Lys Arg Arg Gin Arg

Arg

Arg Met

Glu

Asp 15

Gin

5

10

Arg

Asp

Leu

He

Ser

Asn

His

Glu

Gin

Vai

Pro

He

Leu

Gly

Gin

Arg

20

25

30

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

35

40

45

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

Ala

Leu

Ala

Gly

Gin

Ala

Thr

Ala

50

55

60

Tyr

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

Asp

Lys

Leu

Thr

Vai

Thr

65

70

75

80

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Pro

Lys

Ser

85

90

95

Ala

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

He

Arg

Vai

Ala

Thr

Pro

Met

Leu

Met

Gin

100

105

110

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

His

Gly

Lys

He

115

120

125

Asp

Lys

Ser

Met

Pro

Glu

Ser

Leu

Pro

Leu

Pro

Lys

Arg

130

135

140

Ala

Ser

Glu

Ser

Thr

Asn

Gin

Ser

Gly

Phe

Lys

Tyr

Pro

Lys

Thr

145

150

155

160

- 38 034692

Asn Gin

Ser Gly

Pro Val Arg Asn Gin Leu

Ser Gin Gly

His

Gly 175

Gly

165

170

Phe

Thr

Leu

Asp

Glu

Ser

Val

Tyr

Lys

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Arg

Lys

180

185

190

Met

Ser

Thr

Lys

Asn

Val

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Ser

lie

Lys

Glu

195

200

205

Glu

Met

Thr

Glu

Ala

lie

Arg

Val

Ser

Arg

Gly

Asp

Ser

Pro

210

215

220

Asp

Leu

lie

Lys

Asp

Asn

Arg

Ser

Arg

Glu

Pro

Asn

Glu

Leu

Ser

Leu

225

230

235

240

Lys

Asn

Gly

Ser

Ala

Arg

Val

Lys

Pro

Ala

Tyr

Lys

Phe

Asn

Lys

Asp

245

250

255

Thr

Asn

Glu

Ser

Val

Ala

Met

Asp

Lys

Val

Ser

Leu

Gly

Arg

Asn

260

265

270

Arg

Phe

Lys

Thr

Lys

Glu

Ser

Val

His

Val

Ser

Asn

Trp

Asn

Leu

275

280

285

Ser

Gly

Arg

His

Arg

Hi s

lie

Val

Arg

Glu

Ser

AS EL

Ala

Lys

Gin

290

295

300

Hi s

His

305

310

<210>

11

<211>

493

<212> :

Белок

<213> i

Синтетический пептид

<400>

11

Met

His

Tyr

Gly

Arg

Lys

Arg

Gin

Arg

1

5

10

15

Arg

Met

Glu

Asp

Gin

Arg

Asp

Leu

lie

Ser

Asn

His

Glu

Gin

Val

20

25

30

Pro

lie

Leu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

35

40

45

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Phe

Ser

Val

Leu

Val

Ala

Leu

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Ala

Thr

Ala

Tyr

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

65

70

75

80

Asp

Lys

Leu

Thr

Val

Thr

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

85

90

95

Met

Lys

Leu

Pro

Lys

Ser

Ala

Lys

Pro

Val

Ser

Lys

lie

Arg

Val

Ala

100

105

110

Thr

Pro

Met

Leu

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

His

Gly

115

120

125

Gin

His

Leu

lie

Gin

Ala

Glu

Leu

Pro

Asp

Ser

Pro

Leu

Asn

lie

Val

- 39 034692

130 135 140

Lys 145

Glu

Phe

Asp

Asp Gly 150

Arg Asn

Asn

155

Gin Asn

Asp

Phe 160

As η

Phe

Tyr

Trp

Asn

lie

Pro

Ser

Phe

Met

Ser

Ala

Gin

Hi s

Asn

lie

165

170

175

Thr

Phe

Thr

Asp

Met

Thr

Ser

Tyr

Asn

lie

Vai

Gin

Asn

Lys

Asp

180

185

190

Asp

Lys

Trp

Arg

Gly

Asp

Lys

lie

Vai

lie

Leu

Tyr

Asp

Pro

Gly

Lys

195

200

205

Phe

Pro

Ala

Leu

Glu

His

Gin

Gly

Gin

Leu

Tyr

Arg

Asn

Gly

210

215

220

Gly

Vai

Pro

Gin

Glu

Gly

Asn

Leu

Gin

Glu

Hi s

lie

Asp

lie

Leu

Ala

225

230

235

240

Glu

His

lie

Asn

Lys

Leu

lie

Pro

Asp

Thr

Gin

Phe

Ser

Gly

lie

Gly

245

250

255

Vai

lie

Asp

Phe

Glu

Ser

Trp

Arg

Pro

lie

Phe

Arg

Gin

Asn

Ser

Gly

260

265

270

Vai

Leu

Gin

Pro

Tyr

Lys

Asp

Leu

Ser

Tyr

Lys

Leu

Vai

His

Arg

Asp

275

280

285

Hi s

Lys

Leu

Trp

Asn

Arg

Lys

Arg

Vai

Glu

lie

Glu

Ala

Arg

Leu

290

295

300

Phe

Glu

Ala

Gly

Arg

Thr

Phe

Vai

Glu

Thr

lie

Asn

Vai

Ala

305

310

315

320

Lys

lie

Leu

Arg

Pro

Lys

Ala

Lys

Trp

Gly

Tyr

Gly

Phe

Pro

Tyr

325

330

335

Ser

Phe

Asn

Met

Asn

Gly

Ala

Asn

Met

7\.s n.

Glu

Asp

Ser

Pro

Ala

340

345

350

Asn

Vai

Lys

Glu

Asn

Asp

Gin

lie

Lys

Trp

Leu

Trp

Asp

lie

Vai

355

360

365

Asp

Vai

Leu

Pro

Ser

Vai

Tyr

Leu

Asn

Lys

lie

Thr

Ser

Ala

370

375

380

Gin

Arg

Vai

Gin

Phe

Vai

Arg

Gly

Arg

Met

Arg

Glu

Gly

Tyr

Arg

Vai

385

390

395

400

Ala

Lys

Met

Ser

Lys

Ser

Pro

Lys

Pro

Vai

Leu

Ala

Tyr

Leu

405

410

415

Arg

Tyr

Vai

Tyr

Thr

Asp

Thr

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Asn

Glu

Asp

Leu

420

425

430

Lys

Gin

Ala

lie

Lys

Vai

Ser

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Lys

Gly

Met

lie

435

440

445

Phe

Trp

Gly

Ser

Tyr

Asp

Vai

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Ser

lie

Asp

450

460

Phe Arg Lys Tyr Vai Asp Asn Asn

465 470

Leu Gly Pro He Vai Leu Leu Ala

475 480

Asn Asn Lys Ser Pro Lys Vai Leu

485 <210>12 <211>493 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>12

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg

Thr Pro Asn Leu Ala

490

Gin Arg Arg Arg Met Glu Asp Gin

15

Arg Asp Leu lie Ser Asn His Glu

Gin Vai Pro lie Leu Gly Gin Arg

30

Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser

40

Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly

Phe Ser Vai Leu Vai Ala Leu Leu

55

Leu Ala Gly Gin Ala Thr Thr Ala

Tyr Phe Leu Phe Gin Gin Gin Gly

70

Arg Leu Asp Lys Leu Thr Vai Thr

80

Ala Gin Asn Leu Gin Leu Glu Lys

Ala Lys Pro Vai Ser Lys He Arg

100

Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser

115 120

Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Ser

95

Vai Ala Thr Pro Met Leu Met Gin

105 110

His Gly Gin His Leu He Gin Ala

125

Glu Leu Pro Asp Ser Pro Leu Asn

130 135

He Vai Lys Glu Phe Asp Asp Asp

140

Gly Arg Asn Asn Asn Asn Gin Asn

145 150

Asp Phe Asn Phe Tyr Trp Asn He

155 160

Pro Ser Phe Met Ser Ala Gin His

165

Asn He Thr Phe Thr Asp Met Thr

170 175

Ser Ser Tyr Asn He Vai Gin Asn

180

Lys Asp Asp Lys Trp Arg Gly Asp

185 190

Lys He Vai He Leu Tyr Asp Pro

195 200

Gly Lys Phe Pro Ala Leu Leu Glu

205

His Gin Gly Gin Leu Tyr Arg Arg

210 215

Asn Gly Gly Vai Pro Gin Glu Gly

220

Asn Leu Gin Glu His He Asp He

225 230

Leu Ala Glu His He Asn Lys Leu

235 240

He Pro Asp Thr Gin Phe Ser Gly

245

He Gly Vai He Asp Phe Glu Ser

250 255

Trp Arg Pro He Phe Arg Gin Asn

260

Ser Gly Vai Leu Gin Pro Tyr Lys

265 270

Asp Leu Ser Tyr

Lys Leu

Vai His Arg Asp His Lys Leu

Trp

Asn

Arg

275

280

285

Lys

Arg

Vai

Glu

He

Glu

Ala

Arg

Leu

Phe

Glu

Ala

Gly

Arg

290

295

300

Thr

Phe

Vai

Glu

Thr

He

Asn

Vai

Ala

Lys

He

Leu

Arg

Pro

Lys

305

310

315

320

Ala

Lys

Trp

Gly

Tyr

Gly

Phe

Pro

Tyr

Ser

Phe

Asn

Met

Asn

Gly

325

330

335

Gly

Ala

Asn

Met

Asn

Glu

Asp

Ser

Pro

Ala

7\.s el

Vai

Lys

Glu

Asn

340

345

350

Asp

Gin

He

Lys

Trp

Leu

Trp

Asp

He

Vai

Asp

Vai

Leu

Pro

Ser

355

360

365

Vai

Tyr

Leu

Asn

Lys

He

Thr

Ser

Ala

Gin

Arg

Vai

Gin

Phe

Vai

370

375

380

Arg

Gly

Arg

Met

Arg

Glu

Gly

Tyr

Arg

Vai

Al a

Lys

Met

Ser

Lys

385

390

395

400

Ser

Pro

Lys

Pro

Vai

Leu

Ala

Tyr

Leu

Arg

Tyr

Vai

Tyr

Thr

Asp

405

410

415

Thr

Leu

Lys

Phe

Leu

Ser

Asn

Glu

Asp

Leu

Lys

Gin

Ala

lie

Lys

Vai

420

425

430

Ser

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Lys

Gly

Met

He

Phe

Trp

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

Asp

Vai

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Ser

He

Asp

Phe

Arg

Lys

Tyr

Vai

Asp

450

455

460

Asn

Leu

Gly

Pro

He

Vai

Leu

Ala

7X.S EL

Asn

Lys

Ser

Pro

Lys

465

470

475

480

Vai

Leu

Thr

Pro

Asn

Leu

Ala

His

485

490

<21

0>

13

<21

1>

372

<212>

Белок

<213>

Синтетический пептид

<400>

13

Met

His

Tyr

Gly

Arg

Lys

Arg

Gin

Arg

1

5

10

15

Arg

Met

Glu

Asp

Gin

Arg

Asp

Leu

He

Ser

Asn

His

Glu

Gin

Vai

20

25

30

Pro

He

Leu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

35

40

45

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

Ala

Leu

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Ala

Thr

Ala

Tyr

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

- 42 034692

70 7580

Asp Lys Leu Thr Val Thr Ala Gin Asn Leu Gin Leu Glu Lys Leu Arg 85 9095

Met Lys Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Lys He Arg Val Ala 100 105110

Thr Pro Met Leu Met Gin Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly

115 120125

Thr Asp Phe Ser Asp Arg Lys Leu Ser Arg Arg Gin lie Glu Pro Asn

130 135140

Val Tyr Gin Asn lie Pro His He Gly Ser Asn His Asp Gly ArgAsn

145 150 155160

Ser Pro Ala Ser Pro Ser Asp Ala Lys He Leu Pro Met Ser ThrLys

165 170175

Arg Lys Asn Leu lie Leu Arg Val His Asn Arg Leu Arg Asn Lys Val

180 185190

Ala Leu Gly Gin Leu Pro Gly Tyr Pro Lys Ala Val Arg Met Pro He

195 200205

Leu Arg Trp Asp Asp Glu Leu Ala Tyr Leu Ala Glu Leu Asn Val Lys 210 215220

Gin Ser Glu Met Lys His Asp Gin Ser Arg Asn Thr Asp Lys Phe Arg

225 230 235240

Tyr Ala Gly Gin Asn Leu Ala Tyr He Gly Gly Gly Lys Glu Pro Asn 245 250255

Ala Val Arg He Lys Thr Leu Val Arg Ala Trp Phe Asp Glu Tyr Lys 260 265270

Asp Ala Asn Ser Ser Phe He Asp Lys Tyr Arg Ser His Pro Asn Gly

275 280285

Lys Ala He Gly His Phe Thr Ala Met Val Gin Asp Arg Thr Asp Thr

290 295300

Val Gly He Ala He Leu Arg His Thr Lys Asn Thr Tyr Phe PheLeu

305 310 315320

Ala He Asn Tyr Ser Phe Thr Asn Met Val Lys Asp Lys Val TyrThr

325 330335

Arg Gly Ala Lys Ser Ser Ser Lys Ser Arg Thr Gly Ser Ser Pro Val

340 345350

Tyr Lys Gly Leu Ser Lys Pro His Glu Tyr Val Asn Pro Asp Pro Asp

355 360365

Glu Asp Leu Asp

370 <210>14 <2H>372 <212> Белок

- 43 034692 <213> Синтетический пептид <400> 14

Met Туг Gly Arg Lys Lys Arg Arg

5

Gin Arg Arg Arg Met Glu Asp Gin

15

Arg Asp Leu He Ser Asn His Glu

Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser

40

Gin Vai Pro lie Leu Gly Gin Arg

30

Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly

Phe Ser Vai Leu Vai Ala Leu Leu

55

Leu Ala Gly Gin Ala Thr Thr Ala

Tyr Phe Leu Phe Gin Gin Gin Gly

70

Arg Leu Asp Lys Leu Thr Vai Thr

80

Ala Gin Asn Leu Gin Leu Glu Lys

Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Ser

95

Ala Lys Pro Vai Ser Lys lie Arg

100

Vai Ala Thr Pro Met Leu Met Gin

105 110

Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser

115 120

His Gly Thr Asp Phe Ser Asp Arg

125

Lys Leu Ser Arg Arg Gin lie Glu

130 135

His lie Gly Ser Asn His Asp Gly

145 150

Asp Ala Lys He Leu Pro Met Ser

165

Pro Asn Vai Tyr Gin Asn lie Pro

140

Arg Asn Ser Pro Ala Ser Pro Ser

155 160

Thr Lys Arg Lys Asn Leu He Leu

170 175

Arg Vai His Asn Arg Leu Arg Asn

180

Lys Vai Ala Leu Gly Gin Leu Pro

185 190

Gly Tyr Pro Lys Ala Vai Arg Met

195 200

Pro He Leu Arg Trp Asp Asp Glu

205

Leu Ala Tyr Leu Ala Glu Leu Asn

210 215

Vai Lys Gin Ser Glu Met Lys His

220

Asp Gin Ser Arg Asn Thr Asp Lys

225 230

Phe Arg Tyr Ala Gly Gin Asn Leu

235 240

Ala Tyr He Gly Gly Gly Lys Glu

245

Pro Asn Ala Vai Arg He Lys Thr

250 255

Leu Vai Arg Ala Trp Phe Asp Glu

260

Tyr Lys Asp Ala Asn Ser Ser Phe

265 270

He Asp Lys Tyr Arg Ser His Pro

275 280

Asn Gly Lys Ala He Gly His Phe

285

Thr Ala Met Vai Gin Asp Arg Thr

290 295

Asp Thr Vai Gly He Ala He Leu

300

Arg His Thr Lys Asn Thr Tyr Phe

305 310

Phe Leu Ala He Asn Tyr Ser Phe

315 320

- 44 034692

Thr Asn Met Val Lys Asp Lys Val

325

Ser Lys Ser Arg Thr Gly Ser Ser

340

Pro His Glu Tyr Val Asn Pro Asp

355360

His His His His

370 <210>15 <211>110 <212> Белок <213> Equus caballus <400>15

Met Glu Asp Gin Arg Asp Leu He 15

Leu Gly Gin Arg Pro Ala Ala Pro 20

Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu

3540

Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe

5055

Leu Thr Val Thr Ala Gin Asn Leu

6570

Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val 85

Met Leu Met Gin Ala Leu Pro Met

100 <210>16 <211>110 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>16

Met Glu Asp Gin Arg Asp Leu He 15

Leu Gly Gin Arg Pro Ala Ala Pro 20

Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu

3540

Tyr Thr Arg Gly Ala Lys Ser Ser

330 335

Pro Val Tyr Lys Gly Leu Ser Lys

345 350

Pro Asp Glu Asp Leu Asp His His

365

Ser Asn His Glu Gin Val Pro He

15

Glu Arg Lys Cys Ser Arg Gly Ala

30

Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gin

Gin Gin Gin Gly Arg Leu Asp Lys

Gin Leu Glu Lys Leu Arg Met Lys

80

Ser Lys lie Arg Val Ala Thr Pro

95

Glu Gly Leu Ser His Gly

105 110

Ser Asn His Glu Gin Val Pro He

15

Glu Arg Lys Ser Ser Arg Gly Ala

30

Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gin

Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe

55

Gin Gin Gin Gly Arg Leu Asp Lys

Leu Thr Val Thr Ala Gin Asn Leu

70

Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val

Gin Leu Glu Lys Leu Arg Met Lys

80

Ser Lys lie Arg Val Ala Thr Pro

95

- 45 034692

Met Leu Met Gin Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly

100 105110 <210>17 <211>333 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>17

Met 1	His His His	His His His 5	Tyr	Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg
10	15
Arg	Arg Met Glu	Asp Gin Arg	Asp	Leu He Ser	Asn His Glu Gin Vai
	20			25	30
Pro	He Leu Gly	Gin Arg Pro	Ala	Ala Pro Glu	Arg Lys Ser Ser Arg
	35		40		45
Gly	Ala Leu Tyr	Thr Gly Phe	Ser	Vai Leu Vai	Ala Leu Leu Leu Ala
	50	55			60
Gly	Gin Ala Thr	Thr Ala Tyr	Phe	Leu Phe Gin	Gin Gin Gly Arg Leu
65		70		75	80
Asp	Lys Leu Thr	Vai Thr Ala	Gin	Asn Leu Gin	Leu Glu Lys Leu Arg
		85		90	95
Met	Lys Leu Pro	Lys Ser Ala	Lys	Pro Vai Ser	Lys He Arg Vai Ala
	100			105	110
Thr	Pro Met Leu	Met Gin Ala	Leu	Pro Met Glu	Gly Leu Ser His Gly
	115		120		125
Ala	Arg Vai Lys	Lys Asn Asp	Pro	Leu Pro Gly	Ala Thr Vai Gly Gly
	130	135			140
Tyr	Ser Gly Gly	Asp Leu Vai	Ser	Glu Arg Ala	Ser Vai Ser Vai Lys
145		150		155	160
Lys	Gly Gly Tyr	Lys Tyr Asn	Ala	Gin Ala Asn	Arg Ser Vai Tyr Asp
		165		170	175
Ser	Arg Asn Phe	Asp Pro Gly	Lys	Glu Phe Leu	Lys Leu Vai Leu Tyr
	180			185	190
Phe	Lys Ser Lys	Asp Phe Lys	Asn	Arg Lys Trp	Asp Glu Arg Glu Lys
	195		200		205
Asn	Asn Lys Asn	Met Asp Pro	Vai	Lys Asn Gin	Ala Gin Ser Gly Ser
	210	215			220
Ser	Trp Ala Phe	Ala Pro Vai	Pro	Ser Arg Ser	Tyr Thr Leu Ala Glu
225		230		235	240
Gin	Glu Leu Vai	Asp Ser Glu	Thr	Thr Ser He	Lys Gly Leu Lys Met
		245		250	255
Ser	Ala Arg Arg	Ser Leu Asn	Pro	Arg Leu Gly	Phe Arg Gly Gly Trp
	260			265	270
Ser	Thr Thr Gly	Asn Thr Leu	Ser	Asn Vai Ser	Leu Gly Arg Asn Arg

- 46 034692

- 47 034692

He Vai Ser Phe Vai Ala Lys Vai Gly Cys Asp Ala Gly Phe Pro Ser 245 250255

Gly Tyr Ala Arg Vai Ser Ser Phe Arg Asn Trp He Thr Gin Asn Met 260 265270

Asn <210>19 <211>159 <212> Белок <213> Culicoides spec <400>19

Met 1

Lys

Phe

Ser

Vai 5

Ser

Lys

Leu Ser Leu 10

Leu Leu

Cys

He

Thr 15

He

Leu

Cys

He

Cys

Phe

Ala

Thr

Ala

Pro

Gin

Trp

Gin

He

Ser

Glu

20

25

30

Leu

Ser

Glu

Gin

Ser

Asn

Vai

He

Lys

Cys

Ser

Asn

Glu

Asn

. Phe

35

40

45

Gly

He

Tyr

Lys

Glu

Leu

Cys

Gin

Phe

Leu

Lys

He

Tyr

He

• Lys

50

55

60

Ala

Pro

Asp

Glu

Asp

Leu

Gly

Ser

Tyr

Leu

Arg

Gly

Leu

Gin

. Ser

65

70

75

80

Ala

Asn

Arg

Leu

Asp

Pro

Thr

Vai

Thr

Leu

Pro

Lys

Asn

. Thr

85

90

95

Leu

Lys

Asn

Vai

Glu

Asp

Cys

Met

Lys

Asn

Phe

Gin

Ala

Vai

He

Asn

100

105

110

Glu

Tyr

Asn

Vai

Ala

Leu

Lys

Tyr

Gin

Glu

Cys

Asp

Gly

Gin

115

120

125

Cys

Ala

Lys

Gin

Ala

Gly

Gin

Leu

Phe

Glu

Asn

Asp

Ala

Ser

Lys

Thr

130

135

140

Ala

Gly

Arg

Met

Gly

Asp

Cys

He

Vai

Ser

Leu

Ala

Leu

His

145

150

155

<210> :

20

<2H>

383

<212> :

Белок

<213>

Синтетический пептид

<400> :

20

Met

His

Tyr

Gly

Arg

Lys

Arg

Gin

Arg

1

5

10

15

Arg

Met

Glu

Asp

Gin

Arg

Asp

Leu

He

Ser

Asn

Hi s

Glu

Gin

Vai

20

25

30

Pro

He

Leu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

35

40

45

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

Ala

Leu

Ala

55 60

- 48 034692

Gly 65

Gin Ala

Thr

Ala 70

Tyr Phe

Leu

Phe Gin Gin 75

Gin

Gly

Arg

Leu 80

Asp

Lys

Leu

Thr

Vai

Thr

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

85

90

95

Met

Lys

Leu

Pro

Lys

Ser

Ala

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

He

Arg

Vai

Ala

100

105

110

Thr

Pro

Met

Leu

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

His

Gly

115

120

125

Al a

Asp

His

Gin

Ser

Gin

Lys

Ala

Vai

Ala

Vai

Pro

Ser

Tyr

Thr

Tyr

130

135

140

Arg

Pro

Ser

Thr

Lys

He

Gly

Ala

Pro

Ala

Phe

Ser

His

145

150

155

160

Gin

Phe

Pro

Trp

Gin

Ala

Ser

He

Thr

Vai

Thr

Ala

Ser

Gly

Asp

165

170

175

Trp

Ser

Leu

Ser

Gly

Ser

Leu

He

Ser

Arg

Lys

Hi s

Vai

Leu

180

185

190

Thr

Ala

His

Ser

Thr

Lys

Gly

Leu

Ser

Phe

Thr

He

Gly

Leu

195

200

205

Gly

Ser

Asn

Thr

Arg

Asn

Arg

Pro

Ala

Vai

Thr

Vai

Ala

Lys

Ser

210

215

220

Lys

Thr

Glu

His

Pro

Lys

Tyr

Asn

Pro

Glu

Ser

Leu

Ala

Asn

Asp

Vai

225

230

235

240

Ser

He

Thr

Leu

Ser

Leu

Asn

Vai

Asn

Leu

Asn

He

Lys

245

250

255

Vai

He

Ser

Leu

Ala

Asn

Ser

Gly

He

Gly

Thr

Leu

Vai

Asn

Arg

Asn

260

265

270

Ala

Phe

Vai

Ser

Gly

Tyr

Gly

Lys

Thr

Ser

Glu

Gly

Ser

275

280

285

Asn

Thr

Leu

Asn

Tyr

Leu

Ser

Met

Arg

Leu

He

Ser

Asn

Ser

Asp

Ser

290

295

300

Tyr

Lys

Vai

Phe

Gly

Pro

Gin

He

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Vai

305

310

315

320

Ala

Arg

Ser

Vai

His

Lys

Asn

Vai

Ser

Gly

Asp

Ser

Gly

325

330

335

Pro

Leu

Vai

He

Lys

Arg

Asn

Gly

Asn

Tyr

Vai

Gin

Vai

Gly

He

Vai

340

345

350

Ser

Phe

Vai

Ala

Lys

Vai

Gly

Ser

Asp

Ala

Gly

Phe

Pro

Ser

Gly

Tyr

355

360

365

Ala

Arg

Vai

Ser

Phe

Arg

Asn

Trp

He

Thr

Gin

Asn

Met

Asn

370 375 380 <210> 21 <211> 383

- 49 034692 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400> 21

Met Туг 1

Gly

Arg Lys Lys 5

Arg

Gin

Arg Arg Arg Met Glu Asp

Gin

10

15

Arg

Asp

Leu

He

Ser

Asn

His

Glu

Gin

Vai

Pro

He

Leu

Gly

Gin

Arg

20

25

30

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

35

40

45

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

Ala

Leu

Ala

Gly

Gin

Ala

Thr

Ala

50

55

60

Туг

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

Asp

Lys

Leu

Thr

Vai

Thr

65

70

75

80

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Pro

Lys

Ser

85

90

95

Ala

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

He

Arg

Vai

Ala

Thr

Pro

Met

Leu

Met

Gin

100

105

110

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

His

Gly

Ala

Asp

His

Gin

Ser

Gin

115

120

125

Lys

Ala

Vai

Ala

Vai

Pro

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Arg

Pro

Ser

Thr

Lys

130

135

140

He

Gly

Ala

Pro

Ala

Phe

Ser

His

Gin

Phe

Pro

Trp

Gin

Ala

145

150

155

160

Ser

He

Thr

Vai

Thr

Ala

Ser

Gly

Asp

Trp

Ser

Leu

Ser

Gly

165

170

175

Gly

Ser

Leu

He

Ser

Arg

Lys

His

Vai

Leu

Thr

Ala

His

Ser

Thr

180

185

190

Lys

Gly

Leu

Ser

Phe

Thr

He

Gly

Leu

Gly

Ser

Asn

Thr

Arg

Asn

195

200

205

Arg

Pro

Ala

Vai

Thr

Vai

Ala

Lys

Ser

Lys

Thr

Glu

His

Pro

Lys

210

215

220

Tyr

Asn

Pro

Glu

Ser

Leu

Ala

Asn

Asp

Vai

Ser

He

Thr

Leu

Ser

225

230

235

240

Leu

Asn

Vai

Asn

Leu

Asn

He

Lys

Vai

He

Ser

Leu

Ala

Asn

245

250

255

Ser

Gly

He

Gly

Thr

Leu

Vai

Asn

Arg

Asn

Ala

Phe

Vai

Ser

Gly

Tyr

260

265

270

Gly

Lys

Thr

Ser

Glu

Gly

Ser

Asn

Thr

Leu

Asn

Tyr

Leu

275

280

285

Ser

Met

Arg

Leu

lie

Ser

Asn

Ser

Asp

Ser

Tyr

Lys

Vai

Phe

Gly

Pro

290

295

300

Gin

He

Tyr

Ser

Thr

Leu

Ser

Ala

Vai

Ala

Arg

Ser

Vai

His

- 50 034692

305

310

315

320

Lys

Asn

Vai

Ser

Gly

Asp

Ser

Gly

Pro

Leu

Vai

He

Lys

Arg

325

330

335

Asn

Gly

Asn

Tyr

Vai

Gin

Vai

Gly

He

Vai

Ser

Phe

Vai

Ala

Lys

Vai

340

345

350

Gly

Ser

Asp

Ala

Gly

Phe

Pro

Ser

Gly

Tyr

Ala

Arg

Vai

Ser

Phe

355

360

365

Arg

Asn

Trp

He

Thr

Gin

Asn

Met

Asn

His

370

375

380

<21

0>

22

<211>

263

<212>

Белок

<213>

Синтетический пептид

<400>

22

Met

His

Tyr

Gly

Arg

Lys

Arg

Gin

Arg

1

5

10

15

Arg

Met

Glu

Asp

Gin

Arg

Asp

Leu

He

Ser

Asn

His

Glu

Gin

Vai

20

25

30

Pro

He

Leu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ala

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Arg

35

40

45

Gly

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Phe

Ser

Vai

Leu

Vai

Ala

Leu

Ala

50

55

60

Gly

Gin

Ala

Thr

Ala

Tyr

Phe

Leu

Phe

Gin

Gly

Arg

Leu

65

70

75

80

Asp

Lys

Leu

Thr

Vai

Thr

Ala

Gin

Asn

Leu

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

85

90

95

Met

Lys

Leu

Pro

Lys

Ser

Ala

Lys

Pro

Vai

Ser

Lys

He

Arg

Vai

Ala

100

105

110

Thr

Pro

Met

Leu

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Met

Glu

Gly

Leu

Ser

His

Gly

115

120

125

Ala

Pro

Gin

Trp

Gin

He

Ser

Glu

Leu

Ser

Glu

Gin

Ser

Asn

Vai

He

130

135

140

Lys

Ser

Asn

Glu

Asn

Phe

Gly

He

Tyr

Lys

Glu

Leu

Ser

Gin

145

150

155

160

Phe

Leu

Lys

He

Tyr

He

Lys

Ala

Pro

Asp

Glu

Asp

Leu

Gly

Ser

165

170

175

Tyr

Leu

Arg

Gly

Leu

Gin

Ser

Ala

Asn

Arg

Leu

Asp

Pro

180

185

190

Thr

Vai

Thr

Leu

Pro

Lys

Asn

Thr

Leu

Lys

Asn

Vai

Glu

Asp

Ser

Met

195

200

205

Lys

Asn

Phe

Gin

Ala

Vai

He

Asn

Glu

Tyr

Asn

Vai

Ala

Leu

Lys

210

215

220

- 51 034692

Lys Tyr Gin Glu Ser Asp Gly Gin Ser Ala Lys Gin Ala Gly Gin Leu

225 230 235240

Phe Glu Asn Asp Ala Ser Lys Thr Ala Gly Arg Met Gly Asp Ser He

245 250255

Val Ser Leu Ala Ala Leu His

260 <210>23 <2H>263 <212> Белок <213> Синтетический пептид <400>23

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Met Glu Asp Gin

1015

Arg Asp Leu He Ser Asn His Glu Gin Val Pro He Leu Gly Gin Arg

2530

Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly

4045

Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gin Ala Thr Thr Ala

5560

Tyr Phe Leu Phe Gin Gin Gin Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr

70 7580

Ala Gin Asn Leu Gin Leu Glu Lys Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys 85 9095

Ala Lys Pro Val Ser Lys He Arg Val Ala Thr Pro Met Leu Met

100 105110

Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly Ala Pro Gin Trp Gin lie

115 120125

Ser Glu Leu Ser Glu Gin Ser Asn Val He Lys Ser Ser Asn Glu Asn

130 135140

Asn Phe Gly lie Tyr Lys Glu Leu Ser Gin Phe Leu Lys Lys lie Tyr

145 150 155160

He Lys Ala Pro Asp Glu Asp Leu Gly Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu

165 170175

Gin Ser Ala Ala Asn Arg Leu Leu Asp Pro Thr Val Thr Leu Pro Lys

180 185190

Asn Thr Leu Lys Asn Val Glu Asp Ser Met Lys Asn Phe Gin Ala Val

195 200205

He Asn Glu Tyr Asn Val Val Ala Leu Lys Lys Tyr Gin Glu Ser Asp

210 215220

Gly Gin Ser Ala Lys Gin Ala Gly Gin Leu Phe Glu Asn Asp Ala Ser

225 230 235240

Lys Thr Ala Gly Arg Met Gly Asp Ser He Val Ser Leu Ala Ala Leu 245 250255

His His His His His His His

260

Claims

1. Улучшенная транспортная молекула модулярного антигена MAT (iMAT), включающая:

(i) по крайней мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, где по меньшей мере один первый модуль выбран из группы, состоящей из i) аминокислотной последовательности HIV-tat (белок активатора транскрипции HIV), VP22 и/или Antennapedia или их частичной последовательности, при условии, что такой по меньшей мере один первый модуль является функциональным в качестве модуля для транслокации молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, ii) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1;

(ii) по крайней мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку MHC молекулы антигенами, где такой по меньшей мере один второй модуль выбран из группы, состоящей из i) инвариантной цепи, выбранной из видов, у которых иммунный ответ должен подвергаться модулированию, и/или из видов, у которых молекула iMAT должна быть нацеленной на внутриклеточное пространство, ii) инвариантной цепи молекул MHC класса II (также известной как инвариантной цепи Ii или MHC II гамма-цепи), iii) лошадиной инвариантной цепи, содержащей аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 или ее фрагментов, при условии, что такие фрагменты сохраняют их внутриклеточную транспортную функцию; и (iii) по крайней мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по крайней мере от одного полного или частичного эпитопа по крайней мере одного антигена, предпочтительно по крайней мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, который отличается тем, что в цельной молекуле iMAT все остатки цистеина являются замещенными с помощью отличного аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина и/или аспарагиновой кислоты.

2. Молекула iMAT по п.1, где все такие модули являются ковалентно связанными друг с другом с помощью дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними модулями, такими как первый, второй и/или третий модуль.

3. Молекула iMAT по п.1, где все такие модули являются ковалентно связанными друг с другом и где никакого(никаких) дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними модулями, такими как первый, второй и/или третий модули, не присутствует вообще.

4. Молекула iMAT по любому из пп.1-3, где по крайней мере один второй модуль включает инвариантную цепь лошади и предпочтительно состоит из одной или более аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 15, 16.

5. Молекула iMAT по любому из пп.1-4, где по крайней мере один антигенный модуль включает по крайней мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по крайней мере от одного аллергена, который вызывает аллергию у лошадей, предпочтительно по крайней мере одного полного или частичного эпитопа по крайней мере одного аллергена, который имеет происхождение от насекомых, которые питаются кровью, более предпочтительно из рода Culicoides, и/или по крайней мере одного полного или частичного эпитопа по крайней мере одного аллергена, который имеет происхождение от плесени (грибы и/или их споры), пыльцы, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий), предпочтительно от пыльцы деревьев, трав, травянистых растений, амброзии и/или пыльцы растений крестоцветных Brassicaceae, и/или грибов и/или их спор из родов Aspergillus, Alternaria, Botrytis, Cercospora, Cladosporium, Curvularia, Drechslera, Eurotium, Helminthosporium, Epicoccum, Erysipheloidium, Fusarium, Lichtheimia, Nigrospora, Penicillium, Periconia, Peronospora, Polythrincium, Saccharopolyspora (ранее также назывались Faenia или Micropolyspora), Thermoactinomyces, Stemphylium, Torula, и/клещей (или их фекалий) рода Acarus, Glycophagus, Tyrophagus, Dermatophagoides.

6. Молекула iMAT по п.5, где такой по крайней мере один антиген, предпочтительно по крайней мере один аллерген представляет собой Cul n4, Cul o1, Cul o2, Cul o3, Cul o4 и/или Cul o7 аллерген.

7. Молекула iMAT по любому из пп.1-4, где по крайней мере один антигенный модуль включает по крайней мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по крайней мере от одного антигена патогена, который вызывает одно или более инфекционное(ых) заболевание(ий) у лошадей, предпочтительно по крайней мере одного полного или частичного эпитопа по крайней мере одного антигена, который имеет происхождение от рода Rhodococcus, Streptococcus, Oorbivirus, Flavivirus, Trichophyton, Microsporum, Cryptosporidium и/или Sstrongylus, где предпочтительно по крайней мере один антигенный модуль может также представлять собой антиген переносчика, который является вовлеченным в передачу одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей, более предпочтительно компоненты слюны Culicoides, Culex и/или Ixodes.

8. Молекула iMAT по любому из пп.1-7, которая дополнительно включает по крайней мере один модуль метки, предпочтительно по крайней мере одну His-метку, где такой по крайней мере один модуль

- 53 034692 метки предпочтительно присутствует на N-терминальном конце и/или C-терминальном конце, более предпочтительно один модуль метки, предпочтительно одной His-метки, присутствует на Nтерминальном конце после одного остатка метионина.

9. Молекула iMAT по любому из пп.1-8, которая присутствует в мономерной форме и/или в линейной форме.

10. Молекула iMAT по любому из пп.1-9, которая включает, предпочтительно состоит из одной или более аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 21, 22, 23.

11. Вакцина, которая включает молекулу iMAT по любому из пп.1-10.

12. Иммуногенная композиция, которая включает молекулу iMAT по любому из пп.1-10.

13. Фармацевтическая композиция, которая включает молекулу iMAT по любому из пп.1-10.

14. Применение молекулы iMAT по любому из пп.1-10 в способе профилактики и/или терапии одной или более аллергии(ий) у лошадей, предпочтительно гиперчувствительности на укус насекомого (IBH), крапивницы и/или рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO).

15. Применение вакцины по п.11 в способе профилактики и/или терапии одной или более аллергии(ий) у лошадей, предпочтительно гиперчувствительности на укус насекомого (IBH), крапивницы и/или рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO).

16. Применение иммуногенной композиции по п.12 в способе профилактики и/или терапии одной или более аллергии(ий) у лошадей, предпочтительно гиперчувствительности на укус насекомого (IBH), крапивницы и/или рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO).

17. Применение фармацевтической композиции по п.13 в способе профилактики и/или терапии одной или более аллергии(ий) у лошадей, предпочтительно гиперчувствительности на укус насекомого (IBH), крапивницы и/или рецидивирующей обструкции дыхательных путей (RAO).

18. Применение молекулы iMAT по любому из пп.1-10 в способе профилактики и/или терапии одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращения передачи одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращение передачи одним или более переносчиками, предпочтительно питающимися кровью мухами, мошками, клещами и/или комарами, более предпочтительно Rhodococcus pneumonia, удушения, африканской чумы лошадей, вируса лихорадки Западного Нила, дерматофитии и/или паразитов пищеварительного тракта и/или других органов и/или криптоспоридиоза, гельминтов и/или их препатентных стадий развития.

19. Применение вакцины по п.11 в способе профилактики и/или терапии одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращения передачи одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращение передачи одним или более переносчиками, предпочтительно питающимися кровью мухами, мошками, клещами и/или комарами, более предпочтительно Rhodococcus pneumonia, удушения, африканской чумы лошадей, вируса лихорадки Западного Нила, дерматофитии и/или паразитов пищеварительного тракта и/или других органов и/или криптоспоридиоза, гельминтов и/или их препатентных стадий развития.

20. Применение иммуногенной композиции по п.12 в способе профилактики и/или терапии одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращения передачи одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращение передачи одним или более переносчиками, предпочтительно питающимися кровью мухами, мошками, клещами и/или комарами, более предпочтительно Rhodococcus pneumonia, удушения, африканской чумы лошадей, вируса лихорадки Западного Нила, дерматофитии и/или паразитов пищеварительного тракта и/или других органов и/или криптоспоридиоза, гельминтов и/или их препатентных стадий развития.

21. Применение фармацевтической композиции по п.13 в способе профилактики и/или терапии одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращения передачи одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) у лошадей и/или предотвращение передачи одним или более переносчиками, предпочтительно питающимися кровью мухами, мошками, клещами и/или комарами, более предпочтительно Rhodococcus pneumonia, удушения, африканской чумы лошадей, вируса лихорадки Западного Нила, дерматофитии и/или паразитов пищеварительного тракта и/или других органов и/или криптоспоридиоза, гельминтов и/или их препатентных стадий развития.

22. Нуклеиновая кислота, которая кодирует изолированную молекулу по любому из пп.1-10.

23. Вектор, который включает по крайней мере одну нуклеиновую кислоту по п.22.

24. Первичная клетка или линия клеток, которая включает по крайней мере одну нуклеиновую кислоту по п.22.

25. Первичная клетка или линия клеток, которая включает по крайней мере один вектор по п.23.